Avaliação da exposição do consumidor à Listeria monocytogenes ...
Listeria monocytogenes para Utilização em Métodos...
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Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec Núcleo de Biotecnologia Marcelo Mendonça Médico Veterinário Doutor em Biotecnologia Pós-doutorando em Biotecnologia Produção de Anticorpos Monoclonais contra Listeria monocytogenes para Utilização em Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – Leite Belo Horizonte - 21/03/2013
Transcript of Listeria monocytogenes para Utilização em Métodos...
Universidade Federal de Pelotas
Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec
Núcleo de Biotecnologia
Marcelo Mendonça Médico Veterinário
Doutor em Biotecnologia
Pós-doutorando em Biotecnologia
Produção de Anticorpos Monoclonais contra
Listeria monocytogenes para Utilização em
Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos
Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – Leite
Belo Horizonte - 21/03/2013
Definição do Problema
Listeria spp. – 8 espécies
Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi
L. marthii, L. rocourtiae (Graves et al., 2010; Leclercq et al., 2010)
Características
Causador da Listeriose
L. monocytogenes – Humanos e Animais
L. ivanovii – Animais, casos esporádicos em Humanos (Guillet et al., 2010)
Bacilo Gram-positivo
Anaeróbico facultativo
Multiplicação (1°C a 45°C)
Ubiquitário
Todar, 2009
Presença de L. monocytogenes nos Alimentos
• Leite e seus derivados
• Produtos cárneos
• Vegetais e frutas (minimamente processados)
• Peixes e frutos do mar
Orgãos de fiscalização - deteminam “Zero Tolerance”
Prontos para consumo - Ready-to-eat (RTE) foods
Definição do Problema
•123 pessoas
• 25 mortes
(CDC, 2011)
Metodologia convencional utilizada para detecção em alimentos
LEB FRASER
OXFORD
PALCAM TSA-YE
30ºC / 24h 37ºC / 48h
Fermentação de carboidratos
Catalase Motilidade
-hemólise
Farber e Daley, 1995
Pré-enriquecimento enriquecimento
37ºC / 24 a 48h 37ºC / 24h
7 dias
24 – 48h
24h
Método de Diagnóstico para L. monocytogenes
5 – 10 dias
Mais dias!
Definição do Problema
Métodos rápidos de diagnóstico de L. monocytogenes - Desejáveis
Técnicas de Imunoensaios
Alta sensibilidade, Especificidade e Reprodutíveis
Anticorpos Monoclonais (MAbs)
MAbs são imunoglobulinas secretadas por clones de células
(hibridomas) que são obtidas através da fusão in vitro de linfócitos B
produtores de anticorpos com células de mieloma (Linfócitos B tumorais)
Solução do Problema e Diferencial
4 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria spp.
• MAb anti-proteína p30 - 3F8
Reconhece exclusivamente o gênero Listeria
• MAbs anti-InlA - 2D12, 3B7 e 4E4
Maior reatividade com Internalina A nativa
7 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria monocytogenes
Após 6 Fusões Celulares – Listeria MAbs
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
ELISA indireto
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot
MAb 2D12 anti-InlA de Listeria monocytogenes
1. L. monocytogenes F4244
2. L. marthii
3. Staphylococcus aureus
4. Bacillus subtilis
5. Salmonella typhimurium
6. Bacillus thuringiensis
7. E. coli O157:H7
8. Lactococcus lactis
9. Enterococcus aerogenes
10. Lactobacillus paracasei
11. Klebsiella pneumoniae
12. Enterococcus faecalis
Western blot
Revelado com DAB
MAb-3F8 anti-Listeria spp. – Proteína de 30 kDa (p30) Reação com L. monocytogenes e L. marthii
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
35
27
Separação Imunomagnética Immunomagnetic Separation (IMS)
Separação e concentração do microrganismo alvo
Ligação dos anticorpos em esferas magnetizadas
Fonte: Bhunia, 2008
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
MAb-2D12 (InlA)
MAb-3F8 (p30 - gênero Listeria)
Dynabeads anti-Listeria (Invitrogen)
MAb-2D12 (InlA)
108 a 103 UFC/mL
Diferença na captura
entre anticorpos
Eficiência de captura com
diferentes [ ] em PBS
Separação Imunomagnética (IMS) Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Queijo de Cabra - artificialmente contaminado
L. monocytogenes 4b
L. innocua
~ 1 UFC/g
16 h a 37oC
10 g de Alimento
+ 90 mL Caldo Fraser
10 mL
IMS
Contagem em Placa
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Biossensor de Fibra Óptica
Formato Sanduíche
Captura e Detecção
Fibras de poliestireno - 5 cm
Sinal em tempo real
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Imunoseparação Magnética seguido por Sensor de Fibra Óptica
MAb-2D12 marcado Cy-5
InlA de L. monocytogenes
Tempo Total da IMS + Fibra Óptica
Aproximadamente 21 horas
Queijo de Cabra - artificialmente contaminado
Co-cultivo L.monocytogenes e L. innocua
IMS seguido de ensaio com Fibra Óptica
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Potencial de mercado
Potencial de mercado Diferenciais propostos em nossos estudos em comparação aos outros:
Brasil gastou mais de 1 bilhão de reais entre 2008 e 2010 com importação de
anticorpos monoclonais (Reis et al. 2011)
A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos
Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada - UFPel demonstraram-se
altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de
pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano
Utilização de MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de
identificação de L. monocytogenes pode ser reduzidos para 48h ou menos
Desenvolvimento e implementação de plataformas de testes rápidos para
detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos
recombinantes previamente produzidos e caracterizados na UFPel
Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar outras plataformas,
que poderão ser empregadas no desenvolvimento de métodos rápidos de
diagnóstico para outras enfermidades importantes
Equipe de colaboradores – Listeria MAbs
Primeira e Segunda Parte do Projeto – Produção dos anticorpos e plataformas
• Prof. José Antonio Guimarães Aleixo (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)
• Prof. Wladimir Padilha da Silva (Microbiologia de Alimentos)
• Prof. Arun K. Bhunia - Purdue University/USA (Imunologia e Biologia Molecular)
• Prof. Fabricio Rochedo Conceição (Imunologia e Biologia Molecular)
• Profa. Ângela Nunes Moreira (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)
Segunda Parte do Projeto – Produção das plataformas
• Prof. Odir Antonio Dellagostin (Biologia Molecular e Bioinformática)
• Prof. Alan John Alexander McBride (Biologia Molecular e Proteômica)
• Mestrando Gustavo Schmidt Garcia Moreira (Imunologia e Bioinformática )
• Doutoranda Karla Sequeira Mendonça (Microbiologia e Biologia Molecular)
Slides Extras
Fusão Celular
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Extrato total
proteínas de L. monocytogenes
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Listeria monocytogenes expressando GFP
MAb-2D12 anti-rInlA
Mendonça et al. 2012 – BMC Microbiology
Modified Oxford
MAb- 2D12
BHI Plates
Dynabeads
MAb-3F8
MAb-2D12 Dynabeads
IMS
Queijo
MAb-3F8
> 105 UFC.mL-1
Fibra Óptica – 103 UFC.mL
0
1
2
3
4
5
6
MAb-2D12 MAb-3F8 Dynal
cap
ture
(%
)
BHI
MOX
Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Queijo de cabra artificialmente contaminado
PCR quantitativo em tempo real
Amplificação do gene hly de L. monocytogenes
L. monocytogenes
+
L. innocua
Revelado com DAB
2D12 - InlA
100
75
37
25
3F8 - p30
L.m
on
oc
yto
gen
es
F42
44
L.
inn
oc
ua
F42
48
L.
ma
rth
ii
L.
we
lsh
ime
ri
7.5% SDS-PAGE
E. c
oli O
15
7:H
7
Dois MAbs juntos
Identificação específica
Gênero e espécie
Western blot
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Imunofluorescência MAb 2D12
Anti-InlA
L. monocytogenes
4b (F4244)
L. monocytogenes
4b (F4244)
L. monocytogenes
4d (19117) L. monocytogenes
4d (19117)
L. innocua 6a L. innocua 6a
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
1/2
a (
V7)
1/2
b (
F4260)
1/2
c (
7644)
3a (
19113)
3b (
254
0)
3c (
2479)
4a (
19114)
4b (
F4244)
4c (
19116)
4d (
19117)
4ab (
murr
ay)
7 (
1323)
4e (
19118)
SDS-PAGE 10% - Western blot PVDF
35
27
MAb-3F8 anti-Listeria spp. Reação com todos os sorotipos de L. monocytogenes
Revelado com DAB (3,3'-Diaminobenzidine)
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot
Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Salsichas tipo hotdog artificialmente contaminado
L. monocytogenes 4b e/ou L. innocua
PCR quantitativo em tempo real
Amplificação do gene hly de L. monocytogenes
10 g de hotdog + 90 mL Fraser
Plaqueado
em agar BHI
Após IMS
Após entrar no organismo e vencer a
barreira intestinal
Fígado
Baço
Cérebro
Placenta
Baixa morbidade - Alta mortalidade
Taxa de mortalidade: 30% da população suscetível
População de risco:
Indivíduos imunocomprometidos
Mulheres grávidas
Idosos e crianças
Adultos saudáveis (imunocompetentes)
LISTERIOSE
Septicemia, Meningite, Meningoencefalite
Aborto
Natimorto
Nascimento criança doente
