DISSERTAÇAO CLEBERSOn

CLEBERSON RIBEIRO

SISTEMAS DE DEFESA CONTRA ESTRESSES OXIDATIVOS

EM DOIS CULTIVARES DE ARROZ (Oryza sativa L.) COM

TOLERNCIA DIFERENCIAL AO ALUMNIO

Dissertao apresentada Universidade

Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Vegetal, para obteno do ttulo de Magister Scientiae.

VIOSA MINAS GERAIS - BRASIL

2007

Ficha catalogrfica preparada pela Seo de Catalogao e Classificao da Biblioteca Central da UFV

T Ribeiro, Cleberson, 1980- R484s Sistemas de defesa contra estresses oxidativos em dois 2007 cultivares de arroz (Oryza sativa L.) com tolerncia diferencial ao alumnio / Cleberson Ribeiro. Viosa, MG, 2007. x, 49f. : il. ; 29cm. Inclui apndice. Orientador: Jos Cambraia. Dissertao (mestrado) - Universidade Federal de Viosa. Referncias bibliogrficas: f. 33-43. 1. Fisiologia vegetal. 2. Stress (Fisiologia). 3. Arroz - Efeito do alumnio. 4. Induo enzimtica. 5. Antioxidan- tes. I. Universidade Federal de Viosa. II.Ttulo. CDD 22.ed. 571.2

CLEBERSON RIBEIRO

SISTEMAS DE DEFESA CONTRA ESTRESSES OXIDATIVOS

EM DOIS CULTIVARES DE ARROZ (Oryza sativa L.) COM

TOLERNCIA DIFERENCIAL AO ALUMNIO

Dissertao apresentada Universidade

Federal de Viosa, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Vegetal, para obteno do ttulo de Magister Scientiae.

Aprovada: 8 de maro de 2007

______________________________ Prof. Paulo Henrique P. Peixoto

(Co-Orientador)

____________________________ Prof. Marco Aurlio P. e Silva

______________________________ Prof. Marco A. Oliva Cano

(Co-Orientador)

______________________________ Prof. Juraci Alves de Oliveira

______________________________ Prof. Jos Cambraia

(Orientador)

ii

Aos meus queridos pais, Cleber Ribeiro e

Marilda de Ftima Gomes Ribeiro e aos

meus irmos Cleber Junior e Keila:

MINHA HOMENAGEM

A minha amada esposa Karla

Veloso Gonalves Ribeiro:

OFEREO E DEDICO

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus por mais esta oportunidade.

Universidade Federal de Viosa - UFV e ao Departamento de Biologia

Vegetal por proporcionarem condies para o desenvolvimento deste trabalho.

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

pelo apoio financeiro.

Ao Professor Jos Cambraia pela orientao, pelos ensinamentos e pela

amizade, e por seu exemplo de profissionalismo e competncia.

Aos Professores Paulo Henrique Pereira Peixoto e Marco Antonio Oliva Cano

pelo aconselhamento e incentivo.

Aos Professores Juraci Alves de Oliveira, Marco Aurlio Pedron e Silva, Rolf

Pushmann, Raimundo Santos Barros e Fbio Murilo da Matta pela colaborao.

Ao amigo e companheiro de bancada, lcio com quem compartilhei buscas,

dvidas e descobertas e que tanto me ajudou.

Aos funcionrios, Monteiro, Carlos (Charles), Carlos Raimundo, Geraldo

(Marreco), Jos Antonio, Reginaldo, Oswaldo, Maria Mercs, e Cssia, e em

especial, ao Beringh, pela enorme demonstrao de boa vontade e pela ajuda

imprescindvel em todas as etapas do trabalho.

Aos amigos de curso Carol Mller, Elaine, Gabriela, Kelly, Otvia, Raphaela,

Alan, Brulio, Cludio, Eduardo, Ricardo Montanari, Ana Maria Mapelli, Matheus,

Marcelo Guimares, Rony e Valdir pela ajuda e amizade.

s minhas cunhadas Karine, Kamila e Flvia e aos meus amigos Talles, Hugo

e Ricardinho pela grande torcida.

Ao meu sogro Lilico e a minha sogra Dorinha, meu sincero agradecimento.

E aos demais amigos e familiares que contriburam para realizao deste

trabalho.

iv

BIOGRAFIA

Cleberson Ribeiro, filho de Cleber Ribeiro e Marilda de Ftima Gomes

Ribeiro, nasceu na cidade de Juiz de Fora, MG, no dia 13 de julho de 1980.

Em janeiro de 2005, graduou-se em Cincias Biolgicas na Universidade

Federal de Juiz de Fora - UFJF.

Em maro do mesmo ano, iniciou o curso de Mestrado em Fisiologia Vegetal,

na Universidade Federal de Viosa - UFV.

v

SUMRIO

RESUMO...................................................................................................................................... vii

ABSTRACT................................................................................................................................... ix

1 INTRODUO.......................................................................................................................1

2 MATERIAL E MTODOS ...................................................................................................9

2.1 Obteno das Plantas e Aplicao dos Tratamentos com Alumnio .................................9

2.2 Avaliao do Efeito do Alumnio Sobre o Crescimento ....................................................9

2.3 Avaliao do Efeito do Al Sobre os Sistemas de Defesa Antioxidativos das Plantas ......10

2.3.1 Avaliao do Efeito do Al Sobre a Atividade de Enzimas do Sistema

Antioxidativo das Plantas .....................................................................................10

2.3.1.1 Obteno dos Extratos Enzimticos brutos.....................................................10

2.3.1.2 Determinao da Atividade das Superxido Dismutases (SODs)...................11

2.3.1.3 Determinao da Atividade das Catalases (CATs)..........................................11

2.3.1.4 Determinao da Atividade das Peroxidases (POXs) .....................................11

2.3.1.5 Determinao da Atividade das Peroxidases do Ascorbato (APXs)...............12

2.3.1.6 Determinao da Atividade das Redutases da Glutationa (GRs)....................12

2.3.1.7 Determinao da Atividade das Peroxidases da Glutationa (GPXs)...............13

2.3.2 Avaliao do Efeito do Al Sobre a Concentrao de Metablitos do

Sistema Antioxidativo das Plantas .........................................................................13

2.3.2.1 Determinao das Concentraes de Ascorbato e Desidroascorbato .............13

2.3.2.2 Determinao da Concentrao de Glutationa Total .......................................14

2.4 Determinao de Protenas ..............................................................................................15

2.5 Delineamento Experimental e Anlise Estatstica...........................................................15

3 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................................16

3.1 Efeito do Alumnio Sobre o Crescimento em Comprimento e sobre a Produo

de Massa Seca. .................................................................................................................16

3.2 Efeito do Alumnio sobre os Sistemas de Defesa Antioxidativos ...................................18

3.2.1 Efeito do Alumnio Sobre o Sistema de Defesa Enzimtico..................................18

3.2.2 Efeito do Alumnio Sobre o Sistema de Defesa No-Enzimtico..........................27

4 CONCLUSES .......................................................................................................................32

5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................................33

6 APNDICE..............................................................................................................................44

vi

LISTA DE FIGURAS

Pgina

Figura 1. Efeito do alumnio sobre o crescimento da raiz seminal e das folhas de

dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias............. 16

Figura 2. Efeito do alumnio sobre a produo de massa seca nas razes e nas

folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante

dez dias............................................................................................................. 18

Figura 3. Atividade das superxido dismutases (SODs) nas razes e nas folhas de

dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias............. 19

Figura 4. Atividade das catalases (CATs) nas razes e nas folhas de dois

cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias ..................... 20

Figura 5. Atividade das peroxidases (POXs) nas razes e nas folhas de dois

cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. .................... 22

Figura 6. Atividade das peroxidases do ascorbato (APXs) nas razes e nas folhas

de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias......... 23

Figura 7. Atividade das redutases da glutationa (GRs) nas razes e nas folhas de

dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias.............. 25

Figura 8. Atividade das peroxidases da glutationa (GPXs) nas razes e nas folhas


Figura 9. Concentrao de ascorbato total, ascorbato reduzido, desidroascorbato e

razo ascorbato reduzido/desidroascorbato nas razes e nas folhas de

dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias.............. 28

Figura 10. Concentrao de glutationa total (GSH+GSSG) nas razes e nas folhas


vii

RESUMO

RIBEIRO, Cleberson, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, maro de 2007. Sistemas de defesa contra estresses oxidativos em dois cultivares de arroz (Oryza sativa L.) com tolerncia diferencial ao alumnio. Orientador: Jos Cambraia. Co-Orientadores: Marco Antnio Oliva Cano e Paulo Henrique Pereira Peixoto.

Os efeitos do alumnio (Al) sobre o crescimento e sobre os sistemas de defesa

antioxidativos enzimticos e no-enzimticos envolvidos na eliminao dos

intermedirios reativos de oxignio (ROIs) foram avaliados em dois cultivares de

arroz: Fernandes (CNA-1158) e Maravilha (CNA-6843-1) com tolerncia diferencial

ao Al. As plantas, cultivadas em soluo nutritiva, pH 4,0, foram tratadas com Al nas

concentraes de 0 e 1 mM, durante dez dias. A exposio das plantas ao Al no

afetou o crescimento no cultivar Fernandes, enquanto, no Maravilha, redues

significativas foram observadas nos parmetros de crescimento avaliados. Nas razes

dos dois cultivares, a presena do Al aumentou a atividade das enzimas catalases

(CATs), peroxidases (POXs), redutases da glutationa (GRs) e peroxidases da

glutationa (GPXs). A atividade das superxido dismutases (SODs) aumentou apenas

nas razes do cultivar Fernandes, no sendo modificada para o cultivar Maravilha.

Independente do tratamento aplicado e da parte da planta analisada, a atividade das

peroxidases do ascorbato (APXs) foi sempre maior no cultivar Fernandes. Nas

folhas, o Al no alterou a atividade de nenhuma das enzimas no cultivar Fernandes,

exceto a das POXs que sofreu reduo. No cultivar Maravilha, por outro lado, as

atividades das SODs, POXs e GPXs foram reduzidas na presena de Al. Dentre as

enzimas estudadas, as SODs, APXs e GPXs nas razes e as CATs, POXs, APXs nas

folhas, exibiram resposta consistente com a tolerncia diferencial ao Al apresentada

pelos dois cultivares de arroz estudados. Nos dois cultivares, o teor de ascorbato

(AA) aumentou nas folhas e o de desidroascorbato (DHA) reduziu nas razes, em

resposta ao tratamento com Al. O teor da forma reduzida (AA) foi muito mais

elevado nas folhas, na qual a relao AA/DHA atingiu valores 30 vezes maiores que

nas razes. Nas razes, o cultivar Fernandes apresentou menores teores de AA, porm

maior atividade das APXs, enquanto no cultivar Maravilha foi observado o oposto,

viii

demonstrando o importante papel desse metablito como substrato para a reao

catalisada pelas APXs. A concentrao de glutationa total, tambm, parece ser

importante no sistema de defesa no enzimtico, mas provavelmente seria necessrio

discriminar entre as suas formas, reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), para entender

seu papel como substrato das enzimas antioxidativas. De modo geral, as atividades

dos sistemas de defesa antioxidativos enzimtico e no-enzimtico, tanto nas razes

como nas folhas dos dois cultivares, indicaram ter o cultivar Fernandes mecanismos

de defesa mais eficientes no combate aos ROIs produzidos durante o tratamento com

Al.

ix

ABSTRACT

RIBEIRO, Cleberson, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, March of 2007. Defense systems against oxidative stresses in two rice cultivars (Oryza sativa L.) with differential tolerance to aluminum. Adviser: Jos Cambraia. Co-Advisers: Marco Antnio Oliva Cano and Paulo Henrique Pereira Peixoto.

Aluminum (Al) effects on the growth and enzymatic and non-enzymatic

antioxidative mechanisms involved in the scavenging of reactive oxygen species

(ROIs) in two rice cultivars: Fernandes (CNA-1158) and Maravilha (CNA-6843-1)

with differential tolerance to Al were studied. The plants, grown in pH 4.0 nutrient

solution, for ten days in nutrient solution, pH 4,0, were treated with Al 0 and 1 mM

for ten days. Exposure to Al did not affect growth in Fernandes cultivar, while in

Maravilha cultivar significant reductions were observed in the evaluated growth

parameters. Aluminum increased the activities of the enzymes, catalases (CATs),

peroxidases (POXs), glutathione reductases (GRs) and glutathione peroxidases

(GPXs) in the roots of both cultivars. The activity of superoxide dismutases (SODs),

however, increased only in the roots of the Fernandes cultivar, while in Maravilha

cultivar it remained unchanged. Independent of the applied treatment and of the plant

analyzed, the activity of the ascorbate peroxidases (APXs) was always larger in

Fernandes cultivar. In the leaves, Al did not change any enzyme activity in

Fernandes cultivar, except the POXs activity which reduced. In Maravilha cultivar,

on the other hand, SODs, POXs and GPXs activities reduced in the presence of Al.

Among the studied enzymes, SODs, APXs and GPXs in the roots and of CATs,

POXs and APXs in the leaves, showed responses to Al treatment consistent with the

differential tolerance to Al of these two rice cultivars. Ascorbate (AA) contents

increased in the leaves and dehydroascorbate (DHA) decreased in the roots, in

response to the Al treatment in both cultivars. The reduced form (AA) content was

much higher in the leaves, where the AA/DHA ratio reached values thirty times

larger times than in the roots. In the roots, Fernandes cultivar showed lower AA

contents, but higher APXs activity and the Maravilha cultivar the opposite, indicating

an important role of this metabolite as substrate for the reaction catalyzed by APXs.

x

Total glutathione contents, also, seem be important to the non-enzymatic defense

system of both cultivars, but probably will be necessary to discriminate between

reduced (GSH) and oxidized (GSSG) form to understand the role of this substance in

sustaining antioxidative enzyme activities. In general, the activity of the

antioxidative system, enzymatic and non-enzymatic, both in roots and leaves, were

suggestive of having Fernandes cultivar a more efficient defense mechanism to the

ROIs produced by Al treatments.

1

1. INTRODUO

O arroz (Oryza sativa) um dos mais importantes cereais, sendo o principal

alimento para mais de 2 bilhes de pessoas na sia, frica e Amrica Latina

(DEMIRAL & TRKAN, 2005). Entre as culturas de importncia econmica, o

arroz tem sido considerado uma das mais tolerantes a nveis txicos de alumnio

(FERREIRA et al., 1995). Segundo SIVAGURU et al. (1992), existe entre os

cultivares de arroz ampla variao quanto tolerncia ao alumnio, sendo que alguns

so seriamente afetados por altas concentraes deste metal (FAGERIA &

CARVALHO, 1982). A compreenso do mecanismo de tolerncia do arroz ao Al

poder resultar na identificao dos genes ligados tolerncia e, possivelmente, de

gentipos ainda mais tolerantes (NGUYEN et al., 2001).

O alumnio (Al) o metal mais abundante e o terceiro elemento mais comum

na superfcie da terra (KOCHIAN, 1995), correspondendo a aproximadamente 7% da

massa total do planeta (DELHAIZE & RYAN, 1995). A toxidez do alumnio em

plantas considerada um dos principais fatores que limitam a produtividade das

plantas em solos cidos (GONALVES et al., 2000; BARCEL &

POSCHENRIEDER, 2002). As regies tropicais e subtropicais contam com cerca de

60% dos solos cidos do mundo (KOCHIAN et al., 2004). Apenas no Brasil, mais de

500 milhes de hectares so cobertos por solos cidos que ocupam aproximadamente

2/3 da rea total do pas (VITORELLO et al., 2005).

Em solos com valores de pH prximos neutralidade, o Al pode ser

encontrado em formas insolveis, geralmente no txicas s plantas. Porm, em

solos mais cidos (pH

2

produo (ECHART & CAVALLI-MOLINA, 2001; FREITAS et al., 2006). Por

estas razes, a obteno de cultivares tolerantes ou resistentes a nveis txicos de Al

torna-se uma estratgia altamente desejvel para a produo de culturas

economicamente importantes em solos cidos (FAGERIA & CARVALHO, 1982;

FERREIRA et al., 1999; FREITAS et al., 2006).

Apesar dos numerosos trabalhos, os mecanismos fisiolgicos da tolerncia

das plantas ao Al ainda no esto totalmente conhecidos. Porm, sabe-se que a regio

do pice radicular o alvo primrio da ao fitotxica do Al (RYAN et al., 1992).

Este metal, ao ser absorvido, tende a se acumular, preferencialmente, no pice da

raiz, promovendo a inibio da diviso celular e, conseqentemente, do alongamento

radicular (KOCHIAN, 1995). Outros sintomas causados ao sistema radicular pelo

estresse do Al incluem redues no peso de massa seca, no nmero e no

comprimento das razes, freqentemente associados ao aumento no raio mdio e no

volume radicular (SIVAGURU & PALIWAL, 1993). Isso resulta em reduo na

absoro de gua e nutrientes minerais (CALBO & CAMBRAIA, 1980;

MENDONA et al., 2003), com efeitos nas taxas fotossintticas e respiratrias

(OHKI, 1986), promovendo severas perdas em crescimento e produtividade.

Poucos trabalhos tm relacionado os efeitos do Al sobre a parte area das

plantas. Segundo RYAN et al. (1993), na parte area, as plantas demonstram os

danos causados pelo Al somente aps maior tempo sob estresse, danos esses que

parecem ser conseqncia daqueles que ocorrem nas razes (MATSUMOTO et al.,

1976). O estresse causado pelo Al pode modificar a translocao de nutrientes para a

parte area das plantas, provocando o aparecimento de clorose (CHANG et al., 1998)

e necrose foliar (NGUYEN et al., 2003). Em alguns casos, estes sintomas

assemelham-se aos das deficincias de fsforo, clcio ou nitrognio (ROUT et al.,

2001). Esses fatos foram observados por MENDONA et al. (2003) e por FREITAS

et al. (2006) que, trabalhando com diferentes cultivares de arroz submetidos ao

estresse de Al, evidenciaram alteraes nas concentraes dos macronutrientes na

parte area das plantas.

A carga eltrica positiva permite que o Al3+ reaja com numerosos stios nas

clulas, alvos potenciais de injria, incluindo a parede celular, o citoesqueleto, o

ncleo e a membrana plasmtica (KOCHIAN et al., 2004). Segundo WAGATSUMA

et al. (1995), a membrana plasmtica parece ser o alvo primrio dos danos

3

provocados pelo Al. Na parede celular o Al pode se ligar aos grupos carboxlicos das

pectinas e das protenas diminuindo a extensibilidade (DELHAIZE & RYAN, 1995).

J na membrana plasmtica, a ligao do Al aos lipdios e s protenas atua inibindo

o transporte de nutrientes e acarretando distrbios no metabolismo celular

(EMMANUEL & PETER, 1995). Alm disso, o Al pode alterar a permeabilidade das

membranas em decorrncia de modificaes na fluidez e na densidade da bicamada

lipdica (ZHAO et al., 1987) assim como no aumento da sntese de calose

(WISSEMEIER et al., 1992).

A peroxidao de lipdios outro processo induzido nas membranas celulares

pelo Al. Os danos peroxidativos decorrem principalmente da deteriorao oxidativa

de cidos graxos insaturados das membranas pela ao de intermedirios reativos de

oxignio (ROIs) presentes no interior das clulas (SCANDALIOS, 1993). Esses

ROIs so considerados subprodutos inevitveis do metabolismo aerbico e, nas

plantas, so produzidos principalmente nas mitocndrias (MLLER, 2001), nos

cloroplastos (FOYER & NOCTOR, 2000) e, em peroxissomos (DEL RIO et al.,

2002). Os intermedirios reativos de oxignio incluem oxignio singleto (1O2),

perxido de hidrognio (H2O2), radical superxido (O2 -) e radical hidroxila (HO)

(SCANDALIOS, 1993; MITTLER, 2002). Alguns autores acreditam que o acmulo

de Al nos tecidos vegetais, por si s, no cause a peroxidao de lipdios

(BOSCOLO et al., 2003). No entanto, este processo intensamente acelerado em

presena de Fe2+ (CAKMAK & HORST, 1991; YAMAMOTO et al., 2001). A

explicao para esse fenmeno est relacionada ocorrncia da reao Harber-

Weiss, na qual ons Fe2+ interagem com radicais superxido e com o perxido de

hidrognio, dando origem ao radical hidroxila, considerado o mais potente oxidante

celular, o que provocaria aumento da peroxidao dos lipdios nas membranas

celulares (SCANDALIOS, 1993).

Embora muitos dos efeitos txicos do Al sobre o funcionamento e o

crescimento das plantas tenham sido descritos, pouco se conhece sobre os

mecanismos de resistncia das plantas a este metal. Segundo KOCHIAN (1995), os

mecanismos de tolerncia ao Al podem ser classificados em dois grupos: os de

tolerncia externa e os de tolerncia interna. Nos mecanismos de tolerncia externa,

o Al seria excludo do pice radicular por diferentes processos, incluindo a sua

imobilizao nas paredes celulares, a permeabilidade seletiva das membranas, a

4

formao de barreira de pH induzida pela planta na rizosfera, bem como pela

liberao de cidos orgnicos para o apoplasto e rizosfera. Neste ltimo caso, os

principais cidos exsudados seriam o ctrico e o mlico, os quais se ligariam ao Al

formando complexos estveis que dificultariam a absoro deste metal pela planta

(DELHAIZE & RYAN, 1995; MA et al., 2001). Dentre os mecanismos de tolerncia

interna so citados a complexao do Al por vrias substncias quelantes, como por

exemplo, cidos orgnicos, seguido de sua compartimentalizao nos vacolos e a

ligao do Al a certas protenas (KASAI et al., 1992; TAYOR et al., 1997).

Outra hiptese, que tem sido recentemente testada, a possibilidade da

tolerncia ao Al estar relacionada capacidade das plantas suportarem o estresse

oxidativo induzido pelo Al. Nveis txicos deste elemento podem induzir a produo

de ROIs (YAMAMOTO et al., 2002) ativando genes que codificam a sntese ou a

ativao de enzimas relacionadas ao sistema de defesa antioxidativo das plantas

(EZAKI et al., 2000). Alguns desses genes, induzidos pelo Al, podem codificar

enzimas como a glutationa S-transferase, a peroxidase e a superoxido dismutase,

sugerindo forte relao entre o estresse causado pelo Al e o metabolismo

antioxidativo (CAKMAK & HORST, 1991; RICHARDS et al., 1998). Essas enzimas

antioxidativas atuariam sobre os ROIs produzidos durante o estresse

(SIMONOVICOV et al., 2004), minimizando ou evitando seus danos sobre a

atividade celular (BREUSEGEM et al., 2001).

As plantas, em maior ou menor grau, esto adaptadas a conviverem com

certos nveis de ROIs. Quando, porm, os ROIs se acumulam nos tecidos, tornam-se

txicos, podendo levar as clulas morte (RESENDE et al., 2003). Em funo disso,

as plantas desenvolveram estratgias para manter constantes os nveis destes ROIs no

interior das clulas (APEL & HIRT, 2004), utilizando para isso mecanismos de

defesa enzimticos e, ou no enzimticos (SCANDALIOS, 1993). Dentre as enzimas

que participam dos sistemas de defesa das plantas destacam-se as catalases (CATs),

as superxido dismutases (SODs), as peroxidases (POXs), as peroxidases do

ascorbato (APXs), as peroxidases da glutationa (GPXs) e as redutases da glutationa

(GRs). Dentre os metablitos que podem ser importantes nos sistemas de defesa no-

enzimticos destacam-se o ascorbato (AA), o monodesidroascorbato (MDHA), a

glutationa reduzida (GSH), o -tocoferol e os carotenides (MITTLER, 2002).

5

As enzimas SODs e CATs formam um dos mais importantes sistemas de

defesa das plantas contra os ROIs, removendo, respectivamente, os radicais

superxido (O2 -) e perxido de hidrognio (H2O2), evitando, desta forma, a

produo do radical hidroxila (HO), gerado pelas reaes Haber-Weiss

(CAKMAK & HORST, 1991; ASADA, 1992; SCANDALIOS, 1993).

As SODs so metaloenzimas responsveis pela dismutao do radical

superxido em perxido de hidrognio e oxignio molecular (ASADA et al., 1974;

GIANNOPOLITIS & RIES, 1977). Em plantas superiores as SODs apresentam-se na

forma de trs isoenzimas, classificadas de acordo com o on metlico presente no

grupo prosttico: Mn-SOD, Cu/Zn-SOD e Fe-SOD (SCANDALIOS, 1993; ASADA,

1999; ARORA et al., 2002). Essas isoenzimas esto distribudas em diferentes

compartimentos celulares: a Fe-SOD encontrada principalmente nos cloroplastos, a

Mn-SOD nas mitocndrias e peroxissomos e a Cu/Zn-SOD nos cloroplastos, citossol

e, possivelmente, no espao extracelular (ALSCHER et al., 2002).

O H2O2, formado espontaneamente pela dismutao do radical superxido

(O2 ) ou pela reao catalisada pelas SODs, eliminado do metabolismo celular por

ao das enzimas CATs, APXs e POXs (ARORA et al., 2002). Assim, o balano

entre as atividade das SODs, APXs, CATs e POXs no metabolismo celular crucial

para a manuteno dos nveis de steady state do radical O2 e H2O2 (MITLER,

2002).

As CATs so enzimas tetrmeras, contendo um grupo heme-protico em cada

subunidade (HORVTH et al., 2002), que convertem o perxido de hidrognio em

gua e oxignio molecular (MLLER, 2001). As CATs esto, predominantemente,

localizadas nos peroxissomos, no sendo encontradas nos cloroplastos (HAVIR &

McHALE, 1987; RESENDE et al., 2003). O H2O2 produzido nos cloroplastos, por

essa razo, eliminado por reaes peroxidativas envolvendo as enzimas APXs

(NAKANO & ASADA, 1981; ASADA, 1992; ARORA et al., 2002). Segundo

MITTLER (2002), as diferentes afinidades das APXs (alta afinidade, M) e das

CATs (baixa afinidade, mM) pelo H2O2 sugerem a existncia de duas classes de

enzimas eliminadoras de H2O2 do interior das clulas. As APXs seriam responsveis

pela modulao fina dos ROIs, ao passo que as CATs seriam responsveis pela

remoo do excesso de ROIs durante o estresse.

6

As POXs so enzimas capazes de oxidar vrios substratos na presena de

H2O2 ou de hidroperxidos orgnicos (ASADA, 1992). As peroxidases esto

amplamente distribudas nas clulas, sendo encontradas no apenas associadas s

paredes celulares, mas, tambm, s membranas celulares, organelas, vacolos e

citoplasma (SIEGEL, 1993). Pouco se conhece sobre os mecanismos indutivos das

POXs causados por metais, mas sabe-se que o aumento na atividade dessas enzimas

uma resposta de defesa maioria dos metais que podem causar danos ou apenas

perturbar o metabolismo normal dos vegetais (FANG & KAO, 2000). A atividade

das POXs, como parte do sistema antioxidativo das plantas, depende do tipo de metal

causador do estresse, da espcie analisada, do rgo envolvido e do estdio de

desenvolvimento das plantas (HEGEDS et al., 2001). Alm de uma distribuio

mais ampla nas clulas do que as CATs, as POXs apresentam menor massa

molecular (35 kDa), permitindo mobilidade mais rpida dentro dos diversos

compartimentos celulares onde a sua ao requerida (SIEGEL, 1993).

Dois importantes compostos no processo antioxidativo, o ascorbato e a

glutationa, so requeridos como doadores de eltrons para que alguns sistemas de

defesa enzimticos possam atuar eliminando os ROIs do interior das clulas. A

sntese de ascorbato ocorre em mitocndrias, enquanto a de glutationa pode ocorrer

nos cloroplastos e, ou no citossol (NOCTOR & FOYER, 1998). Estes metablitos

encontram-se em alta concentrao no interior das clulas, estando distribudos no

citossol, mitocndria, peroxissomos, apoplasto e, principalmente, no interior dos

cloroplastos (MITTLER, 2002). Enzimas do sistema antioxidativo das plantas, ao

interagirem com as formas reduzidas destes dois compostos, proporcionam excelente

mecanismo de eliminao dos ROIs (CREISSEN et al., 1999). Segundo SMIRNOFF

et al. (2001) e DIPIERRO et al. (2005), o ascorbato tem sido classificado como

componente chave do sistema antioxidativo das plantas, estando relacionado aos

estresses bitico e abitico. Para ARORA et al. (2002), a glutationa, por atuar na

regenerao do ascorbato e, tambm, por combater os ROIs, de fundamental

importncia para as plantas. A manuteno da concentrao de ascorbato e de

glutationa, em plantas submetidas determinada condio de estresse, envolve

complexa interao entre sntese, degradao, transporte e armazenamento no

interior das clulas (FOYER & NOCTOR, 2000).

7

As APXs utilizam especificamente o ascorbato como doador de eltrons na

reao de eliminao de H2O2, protegendo as clulas contra os danos oxidativos e

fotoxidativos deste tipo de ROI (ASADA, 1992). Estas enzimas so encontradas,

principalmente, nos cloroplastos e no citossol (ARORA et al., 2002), podendo,

tambm, estar associadas s mitocndrias, peroxissomos e ao apoplasto (MITTLER,

2002).

As GRs so enzimas dependentes de NAD(P)H que catalisam a reduo da

glutationa oxidada (GSSG), formando duas molculas de glutationa reduzida (GSH)

(SCHAEDLE & BASSHAM, 1977; CARLBERG & MANNERVIK, 1985).

Portanto, estas enzimas apresentam importante funo na proteo contra o estresse

oxidativo, pois sustentam nveis elevados de GSH no interior das clulas (FOYER et

al., 1994). As GRs podem participar do Ciclo Ascorbato-Glutationa, o qual j foi

identificado em cloroplastos (FOYER & HALLIWELL, 1976), citossol (NOCTOR

& FOYER, 1998), peroxissomos e mitocndrias (JIMENEZ et al., 1997; MITTOVA

et al., 2004). Neste ciclo, participam quatro enzimas: as APXs, as GRs, a redutase do

desidroascorbato (DHAR) e a redutase do monodesidroascorbato (MDHAR). As

GRs fornecem GSH que ser utilizada como substrato pela enzima DHAR para

regenerao do ascorbato. Esse composto, tambm, pode ser regenerado pela

MDHAR utilizando NAD(P)H como agente redutor da reao. Desta forma, na

presena de ascorbato, as APXs podem eliminar o H2O2 do interior das clulas.

Portanto, este ciclo considerado um importante mecanismo de defesa contra os

ROIs (HUANG et al., 2005b).

As GPXs utilizam GSH como substrato da reao, podendo catalisar a

reduo de perxido de hidrognio, hidroperxidos orgnicos ou hidroperxidos

lipdicos (ASADA, 1992; ESHDAT et al., 1997). A GSH utilizada nesta reao pode

ser fornecida pelas GRs, fechando assim o Cliclo Glutationa-Peroxidase (APEL &

HIRT, 2004).

Alguns autores sugerem que o aumento na razo entre as formas reduzidas e

oxidadas destes compostos, ascorbato/desidroascorbato (AA/DHA)

(KAMPFENKEL et al., 1995) e glutationa reduzida/glutationa oxidada (GSH/GSSG)

(FOYER & NOCTOR, 2005) so bons indicadores para se analisar a capacidade de

eliminao dos ROIs. As enzimas DHAR, MDHAR e GRs so importantes para a

regenerao das formas reduzidas do ascorbato e da glutationa, resultando no

8

aumento nas razes (AA/DHA) e (GSH/GSSG), permitindo a formao de um

eficiente mecanismo de remoo dos ROIs do interior das clulas (CAKMAK,

1994).

A ao de vrios agentes estressantes, biticos e abiticos, resulta na

produo e no acmulo de ROIs. As plantas possuem sistemas de defesa

antioxidativos necessrios proteo de suas clulas contra os danos causados por

esses ROIs. Atualmente, sabe-se que o Al um elemento que produz estresse

oxidativo nas plantas, modificando o metabolismo vegetal atravs da alterao no

estado de oxido-reduo dos componentes celulares, tendo como conseqncia o

aumento na produo de ROIs (TAMS et al., 2006). Pouco se conhece sobre o

efeito do Al na produo de ROIs, mas sabe-se que este metal pode ativar os

sistemas de defesa das plantas no combate aos radicais livres. CAKMAK & HOST

(1991) e MERIGA et al. (2004) observaram que o aumento na produo dos ROIs,

induzido pelo Al, proporcionou mudanas nas atividades de determinadas enzimas,

como, por exemplo, as SODs e POXs. Estes autores sugerem que o acrscimo na

atividade destas enzimas pode minimizar os efeitos adversos dos ROIs sobre a

peroxidao de lipdios, contribuindo, assim, para a manuteno da integridade das

membranas. DIPIERRO et al. (2005), encontraram elevada atividade das APXs em

tecidos vegetais tratados com Al, o que seria induzido em resposta ao incremento nos

nveis de H2O2 no interior das clulas. NGUYEN et al. (2005), analisando o sistema

de defesa no-enzimtico das plantas, sugerem que a interao entre o ascorbato e a

glutationa constitui importante mecanismo de defesa antioxidativo no combate ao

H2O2 formado durante o estresse com Al. Recentemente TAMS et al. (2006)

observaram que o Al induziu a expresso de genes relacionados sntese das

enzimas GPXs, POXs, GRs e DHAR.

Os resultados da literatura sugerem que os mecanismos de atuao dos

sistemas de defesa enzimticos e no-enzimticos, bem como as interaes entre

eles, so fundamentais para melhor entendimento da tolerncia diferencial das

plantas ao Al. Em funo disso, o presente trabalho teve como objetivo estudar os

efeitos do alumnio sobre o crescimento e sobre os sistemas de defesa antioxidativos,

enzimticos e no-enzimticos, em plantas de dois cultivares de arroz com tolerncia

diferencial a este metal.

9

2. MATERIAL E MTODOS

2.1. OBTENO DAS PLANTAS E APLICAO DOS TRATAMENTOS COM

ALUMNIO Nos experimentos foram utilizados dois cultivares de arroz (Oryza sativa L.)

com tolerncia diferencial ao Al: Fernandes (CNA-1158) e Maravilha (CNA-6843-

1), considerados tolerante e sensvel ao Al, respectivamente (FAGERIA &

CARVALHO, 1982; FAGERIA et al., 1988), fornecidos pelo Centro Nacional de

Pesquisa de Arroz e Feijo, de Goinia, GO.

As sementes, selecionadas quanto ao tamanho e forma, foram tratadas com

cido sulfrico (H2SO4) 98% (v/v), por 1 minuto. Em seguida foram lavadas em gua

de torneira e esterilizadas superficialmente com hipoclorito de sdio 3% (v/v) por 15

minutos, sendo lavadas, novamente, em gua corrente e em gua desmineralizada. A

seguir, foram colocadas para germinar em cartuchos de papel germiteste,

acomodados em vasos de 1,6 L contendo soluo nutritiva de Clark (CLARK, 1975),

pH 4,0, com um tero da fora inica original, sob aerao contnua.

Nove dias aps a semeadura, as plntulas foram selecionadas quanto

uniformidade de tamanho e forma e transplantadas para vasos opacos, contendo 1,8

L de soluo nutritiva de Clark (CLARK, 1975), pH 4,0 e submetidas aos

tratamentos com Al nas concentraes de 0 e 1,0 mM, aplicados na forma de AlCl3, durante dez dias. O pH da soluo nutritiva foi ajustado diariamente para 4,0, pela

adio de HCl 0,1 N ou NaOH 0,1 N, sendo as solues nutritivas renovadas a cada 5

dias.

O cultivo das plantas, tanto na fase preliminar quanto durante a aplicao dos

tratamentos, foi sempre realizado em sala de crescimento com temperatura

controlada para 25 1C, sob irradincia de cerca de 230 mol m-2 s-1 e fotoperodo

de 16 horas.

2.2. AVALIAO DO EFEITO DO ALUMNIO SOBRE O CRESCIMENTO

Plntulas dos dois cultivares de arroz, obtidas conforme descrito no item 2.1,

foram colhidas, lavadas em gua corrente e enxaguadas em gua desmineralizada.

Depois de medido o comprimento da maior raiz e das folhas, o material vegetal foi

10

colocado para secar em estufa convencional, a 80C at obteno de peso constante,

para avaliao da massa seca.

2.3. AVALIAO DO EFEITO DO ALUMNIO SOBRE OS SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDATIVOS DAS PLANTAS

2.3.1. Avaliao do efeito do alumnio sobre a atividade de enzimas do sistema

antioxidativo das plantas

Plntulas dos dois cultivares de arroz, obtidas conforme descrito no item 2.1,

foram colhidas, lavadas em gua corrente e enxaguadas em gua desmineralizada.

Amostras de razes e de folhas foram retiradas para o preparo dos extratos

enzimticos brutos.

2.3.1.1. Obteno dos extratos enzimticos brutos Os extratos enzimticos brutos para as determinaes das atividades das

catalases (CATs), das peroxidases (POXs), das peroxidases do ascorbato (APXs), das

superxidos dismutases (SODs) e das peroxidases da glutationa (GPXs), foram

obtidos pela macerao de 0,3 g de tecido vegetal em N2 lquido, seguida da adio

de 2 mL de meio de homogeneizao, da filtrao atravs de quatro camadas de gaze

e da centrifugao a 12.000 xg por 15 minutos, a 4oC. No caso das redutases da

glutationa (GRs) utilizou-se apenas 0,2 g de tecido vegetal por 2 mL de meio de

homogeneizao. Os meios de homogeneizao foram: 1) Tampo fosfato de

potssio 0,1 M, pH 6,8, cido etilenodiaminotetractico (EDTA) 0,1 mM, fluoreto de

fenilmetilsulfnico (PMSF) 1 mM e polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1% (p/v)

(PEIXOTO et al., 1999), para as enzimas CATs, POXs, APXs e SODs; 2) Tampo

Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, EDTA 1 mM e MgCl2 10 mM (NAGALAKSHMI &

PRASAD, 2001) para as GPXs; 3) Tampo fosfato de potssio 0,1 M, pH 7,5, EDTA

1 mM, DTT 2 mM, PMSF 1 mM e PVPP 1%, para as GRs (CARLBERG &

MANNERVIK, 1985).

11

2.3.1.2. Determinao da atividade das superxido dismutases (SODs, EC 1.15.1.1)

A atividade das superxido dismutases foi determinada pela adio de 30 L

do extrato enzimtico bruto foliar e de raiz a 2,97 mL de um meio de reao

constitudo de tampo de fosfato de sdio 50 mM, pH 7,8, contendo metionina 13

mM, azul de p-nitro tetrazlio (NBT) 75 M, EDTA 0,1 mM e riboflavina 2 M

(DEL LONGO et al., 1993). A reao foi conduzida a 25C numa cmara de reao

sob iluminao de uma lmpada fluorescente de 15 W, mantida no interior de uma

caixa fechada. Aps 5 min de exposio luz, a iluminao foi interrompida e a

formazana azul produzida pela fotorreduo do NBT foi medida a 560 nm

(GIANNOPOLITIS & RIES, 1977). A absorbncia a 560 nm, de um meio de reao

exatamente igual ao anterior, mas mantido no escuro, por igual tempo, serviu de

branco e foi subtrado da leitura da amostra que recebeu iluminao. Uma unidade

das SODs foi definida como a quantidade da enzima necessria para inibir em 50% a

fotorreduo do NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971).

2.3.1.3. Determinao da atividade das catalases (CATs, EC 1.11.1.6) A atividade das catalases foi determinada pela adio de 100 L do extrato

enzimtico bruto de raiz e de 100 L do extrato enzimtico foliar diludo 1:5, a 2,9

mL de um meio de reao constitudo de tampo de fosfato de potssio 50 mM, pH

7,0 e H2O2 12,5 mM (HAVIR & McHALE, 1987). O decrscimo na absorbncia a

240 nm, temperatura de 25C, foi medido durante o primeiro minuto de reao,

sendo, a atividade das CATs determinada com base na inclinao da reta no intervalo

de 0,2 a 0,4 minuto, aps o inicio da reao. A atividade enzimtica foi calculada

utilizando-se o coeficiente de extino molar de 36 M-1 cm-1 (ANDERSON et al.,

1995) e o resultado expresso em mol min-1 mg-1 protena.

2.3.1.4. Determinao da atividade das peroxidases (POXs, EC 1.11.1.7) A atividade das peroxidases nos tecidos do sistema radicular e foliar foi

determinada pelo mtodo de KAR & MISHRA (1976). Alquotas de 100 L do

12

extrato enzimtico diludo 1:20, tanto de raiz quanto de folhas, foram adicionados a

2,9 mL de uma mistura de reao constituda de tampo de fosfato de potssio 25

mM, pH 6,8, pirogalol 20 mM e H2O2 20 mM. O acrscimo na absorbncia a 420

nm, temperatura de 25C, foi medido durante o primeiro minuto de reao pela

produo de purpurogalina, sendo, a atividade das POXs determinada com base na

inclinao da reta no intervalo de 0,2 a 0,4 minuto, aps o inicio da reao. A

atividade enzimtica foi calculada utilizando-se o coeficiente de extino molar de

2,47 mM-1 cm-1 (CHANCE & MAEHLEY,1955) e o resultado expresso em mol

min-1 mg-1 protena.

2.3.1.5. Determinao da atividade das peroxidases do ascorbato (APXs, EC 1.11.1.11) A atividade das peroxidases do ascorbato foi determinada de acordo com o

mtodo de NAKANO & ASADA (1981), porm modificado por KOSHIBA (1993).

Alquotas de 100 L do extrato enzimtico bruto de raiz e de 100 L do extrato

enzimtico foliar diludo 1:5, foram adicionados a 2,9 mL de um meio de reao

constitudo de tampo de fosfato de potssio 50 mM, pH 6,0, cido ascrbico 0,8

mM e H2O2 1 mM. O decrscimo na absorbncia a 290 nm, temperatura de 25C,

foi medido durante o primeiro minuto de reao, sendo, a atividade das APXs

determinada com base na inclinao da reta no intervalo de 0,2 a 0,4 minuto, aps o

inicio da reao. A atividade enzimtica foi calculada utilizando-se o coeficiente de

extino molar de 2,8 mM-1 cm-1 (NAKANO & ASADA, 1981) e o resultado

expresso em mol min-1 mg-1 protena.

2.3.1.6. Determinao da atividade das redutases da glutationa (GRs; EC 1.6.4.2)

A atividade das redutases da glutationa foi determinada pela adio de 100

L de extrato enzimtico bruto de raiz e de folhas a 0,9 mL de um meio de reao

constitudo de tampo fosfato de potssio 0,1 M, pH 7,5, EDTA 1 mM, GSSG 1 mM

e NADPH 0,1 mM (em tampo TRIS-HCl 0,5 mM, pH 7,5), segundo CARLBERG

& MANNERVIK (1985). O decrscimo na absorvncia a 340 nm, temperatura de

30C, foi medido no primeiro minuto sendo, a atividade das GRs determinada com

13

base na inclinao da reta no intervalo de 0,2 a 0,8 minuto, aps o inicio da reao. A

atividade enzimtica foi calculada utilizando-se o coeficiente de extino molar de

6,22 mM-1 cm-1 (FOYER & HALLIWELL, 1976) e o resultado expresso em nmol

min-1 mg-1 protena.

2.3.1.7. Determinao da atividade das peroxidases da glutationa (GPXs, EC

1.11.1.9)

A atividade das peroxidases da glutationa foi determinada pela adio de 100

L do extrato enzimtico bruto de raiz e de 100 L extrato enzimtico foliar diludo

1:5, a 0,9 mL de um meio de reao constitudo de tampo de fosfato de potssio 50

mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, NaCl 0,114 M, GSH 1 mM, NADPH 0,2 mM, H2O2 0,25

mM e 1 unidade de redutase da glutationa (NAGALAKSHMI & PRASAD, 2001). O

decrscimo na absorvncia a 340 nm, temperatura de 30C, foi medido no primeiro

minuto de reao sendo, a atividade das GPXs determinada com base na inclinao

da reta no intervalo de 0,3 a 0,6 minuto, aps o inicio da reao. A atividade

enzimtica foi calculada utilizando-se o coeficiente de extino molar de 6,22 mM-1

cm-1(ANDERSON & DAVIS, 2004) e o resultado expresso em nmol min-1 mg-1

protena.

2.3.2. Avaliao do efeito do alumnio sobre a concentrao de metablitos do

sistema antioxidativo das plantas

2.3.2.1. Determinao das concentraes de ascorbato (AA) e desidroascorbato

(DHA)

Os teores de ascorbato reduzido (AA) e desidroascorbato (DHA) foram

determinados como descrito por KAMPFENKEL et al. (1995). Para isso, 0,4 g de

tecido radicular e 0,3 g de tecido foliar foram homogeneizados em 2,0 mL de cido

tricloroactico (TCA) 6% (p/v), e centrifugado a 15.000 g, por 5 min. Todas as

etapas necessrias ao processo de extrao foram conduzidas a 4C.

14

Alquotas de 900 L do extrato bruto de raiz e de 200 L do extrato bruto

foliar foram utilizadas nas anlises. O teor de ascorbato total (AA + DHA) foi

determinado aps reduo do DHA pelo ditiotreitol (DTT). Para isso, aos extratos

brutos foram adicionados 200 L de DTT 10 mM (dissolvido em tampo fosfato de

sdio 0,2 M, pH 7,4) e 400 L de tampo fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,4. A mistura

foi incubada a 42C, por 15 min. Subseqentemente, acrescentaram-se mistura 200

L de N-etilmaleimida 0,5% (p/v) e 1,0 mL de TCA 10% (p/v), para o extrato foliar

e 200 L de TCA 50% (p/v) para o extrato da raiz, 800 L de H3PO4 42% (v/v), 800 L de 2,2-dipiridil 4% (p/v) (dissolvido em etanol 70 %) e 400 L de FeCl3 3% (p/v), perfazendo volume final de 4 mL. Aps agitao vigorosa, a mistura foi

incubada a 42C, por 40 min. Em seguida a reao foi paralisada em banho de gelo e

a absorvncia da mistura determinada a 525 nm.

O ascorbato reduzido (AA) foi determinado como descrito anteriormente,

sendo o DTT e o N-etilmaleimida omitidos e substitudos por 600 L de tampo fosfato de sdio 0,2 M, pH 7,4. O DHA foi calculado pela diferena entre o

ascorbato total e o ascorbato reduzido. A concentrao de AA foi determinada por

meio de curva de calibrao utilizando-se padres autnticos de cido ascrbico,

sendo o resultado expresso em mol g-1 massa fresca.

2.3.2.2. Determinao da concentrao de glutationa total (GSH+GSSG)

Amostras de 0,3 g de massa fresca de razes ou folhas foram trituradas em N2

lquido, seguido da adio de 2 mL de meio de homogeneizao constitudo de HCl

0,1M contendo EDTA 1 mM (ANDERSON, 1985). Depois de filtrado atravs de

quatro camadas de gaze, o homogeneizado foi centrifugado a 12.000xg por 15

minutos a 4oC.

A alquotas de 200 L do extrato bruto de raiz e do extrato foliar diludo 1:5,

foram adicionados 200 L de tampo de fosfato de sdio 125 mM, contendo EDTA 6,3 mM, pH 7,5, 500 L de NADPH 0,3 mM e 100 L de DTNB [cido 5,5 ditio-bis (2-nitrobenzico)] 6 mM. Aps incubao a 30C, por 5 minutos, adicionaram-se

10 L de redutase da glutationa (50 U mL-1) e determinou-se a absorbncia a 412 nm durante 1 minuto. A inclinao da reta foi tomada no intervalo de 0,2 a 0,8 minuto,

aps o inicio da reao e a concentrao de glutationa determinada por meio de curva

15

de calibrao, utilizando-se padres autnticos de glutationa reduzida. Os resultados

foram expressos em nmol g-1 massa fresca.

2.4. DETERMINAO DE PROTENAS

Os teores de protenas dos extratos enzimticos foram determinados pelo

mtodo de LOWRY et al. (1951), utilizando BSA como padro.

2.5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANLISE ESTATSTICA

Os tratamentos foram dispostos no delineamento de blocos casualizados, em

esquema fatorial (2x2): dois cultivares de arroz (Fernandes e Maravilha) e dois nveis

de Al (0 e 1 mM), com trs repeties.

Os resultados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA), sendo as

mdias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. As analises foram

efetuadas utilizando o programa estatstico SAEG, da Fundao Arthur Bernardes,

da Universidade Federal de Viosa, verso 9.0. Os resumos da analise de varincia

so mostrados no apndice.

16

3. RESULTADOS E DISCUSSO

3.1 Efeito do Alumnio sobre o crescimento em comprimento e sobre a produo

de massa seca.

A exposio das plntulas ao Al resultou em redues significativas tanto no

comprimento da maior raiz (raiz seminal) quanto no comprimento das folhas, apenas

no cultivar Maravilha, considerado sensvel a este on (Figura 1). J o cultivar

Fernandes, considerado tolerante ao Al, no sofreu qualquer alterao no

crescimento das duas partes da planta.

Raiz Seminal Folhas

0

10

20

30

40

Maravilha Fernandes Maravilha Fernandes

Com

prim

ento

(cm

)

ControleAl 1 mM

Bb

Ab

AaAa

Aa Aa

Ab Bb

Figura 1: Efeito do alumnio sobre o crescimento da raiz seminal e das folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM, durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

As redues no comprimento da raiz seminal e das folhas do cultivar

Maravilha em resposta ao tratamento com Al foram de 27% e 9%, respectivamente.

JUSTINO et al. (2006) trabalhando com estes mesmos cultivares, mas utilizando

concentrao de 0,5 mM de Al durante 21 dias, obtiveram resultados praticamente

idnticos. Naquele trabalho, o cultivar Maravilha sofreu reduo de 26% no

comprimento da maior raiz e 10% nas folhas, enquanto o cultivar Fernandes no

sofreu nenhum efeito significativo do Al. Aparentemente, a menor concentrao

utilizada por JUSTINO et al. (2006) foi compensada pelo aumento no tempo de

exposio ao Al.

17

MERIGA et al. (2004) trabalhando com dois cultivares de arroz, Pusa

Basmati (tolerante) e Vikas (sensvel), diferentemente dos resultados observados

neste trabalho, observaram redues tanto no comprimento das folhas como das

razes nos dois cultivares tratados com alumnio. Todavia, as redues no cultivar

sensvel foram sempre maiores do que no tolerante. Vrios autores, trabalhando com

estresse de alumnio em outras espcies, como trigo (RYAN et al. 1992), abbora

(DIPIERRO et al. 2005), sorgo (OHKI 1987) e cevada (SIMONOVICOV et al.

2004), tambm encontraram efeitos diferenciais do Al em cultivares mais sensveis e,

ou mais tolerantes ao Al. Eles, tambm, relatam, semelhana do que se observou

neste experimento, ter ocorrido maior inibio no crescimento das razes em relao

ao das folhas.

Independente da presena de Al e da parte da planta analisada, o crescimento

do cultivar Fernandes foi sempre maior do que o do cultivar Maravilha (Figura 1).

Na ausncia de Al, os comprimentos da raiz seminal e das folhas do cultivar

Fernandes foram cerca de 17% e de 23% maiores que do cultivar Maravilha,

respectivamente. Como na presena de Al os crescimentos das razes e das folhas

foram reduzidos apenas no cultivar Maravilha esta diferena se ampliou ainda mais,

chegando a 32% e a 29%, respectivamente. Dados como estes justificam a maior

tolerncia do cultivar Fernandes ao Al, fato j demonstrado em soluo nutritiva

(FAGERIA & CARVALHO, 1982).

A exposio ao Al tambm provocou redues significativas na massa seca

das duas partes da planta apenas no cultivar Maravilha (Figura 2). Na presena de Al,

este cultivar apresentou reduo de massa seca de 63% e 50% nas razes e nas folhas,

respectivamente. As massas secas, tanto de razes como de folhas, semelhana do

observado em termos de comprimento, foram sempre maiores no cultivar Fernandes

do que no Maravilha. Neste caso, entretanto, as diferenas foram ainda maiores,

atingindo valores de 83% para as razes e de 76% para as folhas.

Trabalhando com os mesmos cultivares de arroz, MENDONA et al., (2005),

JUSTINO et al., (2006) e ALVES (2005) obtiveram resultados semelhantes aos

apresentados acima, ainda que, cada autor tenha trabalhado com diferentes

concentraes de Al e, ou com diferentes tempos de exposio ao estresse.

18

Razes Folhas

0

30

60

90

120


Mas

sa S

eca

(mg

plan

ta-1 )

ControleAl 1 mM

Bb

Bb

Aa Aa

AaAa

Ab

Ab

Figura 2: Efeito do alumnio sobre a produo de massa seca nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

3.2. EFEITO DO ALUMNIO SOBRE OS SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDATIVOS

3.2.1. Efeito do alumnio sobre o sistema de defesa enzimtico A atividade das superxido dismutases (SODs) nas razes no foi

estatisticamente modificada no cultivar Maravilha, mas aumentou cerca de 15% no

Fernandes em resposta ao Al (Figura 3). Nas folhas, o cultivar Maravilha, quando

tratado com Al, apresentou decrscimo de 11% na atividade das SODs, enquanto

para o cultivar Fernandes no se observou diferena estatstica entre os tratamentos.

Vrios autores, trabalhando com estresse de Al, observaram aumentos na

atividade das SODs em razes de outras espcies vegetais, como em soja (CAKMAK

& HORST, 1991), sorgo (PEIXOTO et al., 1999), cevada (SIMONOVICOV et al.,

2004) e, em outros cultivares de arroz (MERIGA et al., 2004). Segundo estes

autores, os aumentos na atividade das SODs minimizam os efeitos adversos dos

radicais superxidos sobre as membranas, contribuindo assim, para a manuteno da

integridade celular. Segundo LIN & KAO (2000), as SODs podem ter papel

importante na reduo da peroxidao de lipdios, atuando de forma a preservar o

metabolismo celular da ao dos radicais O2 .

19

Razes Folhas

0

2

4

6

8


Ativ

idad

e da

s SO

Ds

(USO

D m

in-1 m

g-1 pr

ote

na)

ControleAl 1 mM

BaAaAa

Aa

Aa AaAa Ba

Figura 3: Atividade das superxido dismutases (SODs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

As SODs fazem parte da primeira linha de defesa contra os intermedirios

reativos de oxignio (ROIs), eliminando o radical superxido (O2 ) do metabolismo

celular (ALSCHER et al., 2002). Todavia, quando a sua eliminao no total, parte

das molculas do radical superxido pode ser utilizada como substrato em reaes

Haber-Weiss para, juntamente com o H2O2, originar o radical hidroxila (HO). Este

radical considerado o mais potente oxidante celular sendo, provavelmente, o

responsvel pela peroxidao de lipdios nas membranas e pela destruio de vrias

macromolculas, causando srios danos aos componentes celulares (SCANDALIOS,

1993). A atividade das SODs , portanto, fundamental para a manuteno da

concentrao do radical O2 em nveis que no causem danos ao metabolismo

celular. DIONISIO-SESE & TOBITA (1998) e HUANG & GUO (2005a),

trabalhando com cultivares de arroz apresentando tolerncia diferencial ao estresse

salino e ao frio, respectivamente, observaram decrscimo na atividade das SODs nas

folhas dos cultivares sensveis. Eles concluram que a reduo na atividade dessa

enzima teve como conseqncia o aumento da peroxidao de lipdios, provocando

srios danos integridade das membranas.

O cultivar Fernandes mostrou melhor resposta frente ao Al em termos de

atividade das SODs, no s porque aumentou a atividade dessa enzima nas razes,

mas, tambm, porque no sofreu efeito do Al nas folhas. O aumento na atividade das

20

SODs observado nas razes do cultivar Fernandes, na presena do Al, pode

representar, portanto, um mecanismo de defesa antioxidativo mais eficiente neste

cultivar. Todavia, esse aumento na atividade das SODs, tambm resulta em

incremento nos nveis de H2O2 (LEE et al., 2001), que podem se difundir para vrios

compartimentos onde outras enzimas eliminadoras de H2O2 so ativadas e passam a

atuar (MITTLER et al., 2004).

A atividade das catalases (CATs) aumentou significativamente nas razes dos

dois cultivares de arroz tratados com Al (Figura 4). O aumento na atividade dessa

enzima no cultivar Maravilha foi de 30%, enquanto no cultivar Fernandes foi de 19%

em relao ao tratamento controle. Apesar disso, tal como observado para as SODs,

os cultivares tambm no diferiram quanto atividade dessa enzima nem na ausncia

e nem na presena de Al.

A atividade das CATs nas folhas no foi influenciada significativamente pelo

Al em nenhum dos cultivares (Figura 4). A atividade dessa enzima no cultivar

Fernandes, entretanto, foi, em mdia, 29% maior que no cultivar Maravilha.

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Figura 4: Atividade das catalases (CATs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

As CATs apresentam baixa afinidade por H2O2 (MITTLER, 2002). Em

funo disso, o aumento na atividade das CATs tem sido relacionado produo de

H2O2 em condies de estresse oxidativo, quando a capacidade de eliminao de

21

H2O2 pela ao de outras enzimas, como as POXs e APXs, superada (FOYER et

al., 1994 e MITTLER, 2002). Os aumentos na atividade das CATs, observados nas

razes dos dois cultivares tratados com Al, indicam que tal fato pode ter ocorrido

nessa parte da planta. KUO & KAO (2003), trabalhando com arroz submetido ao

estresse por Al tambm encontraram aumento na atividade das CATs em resposta ao

acrscimo nos nveis de H2O2, mostrando, de modo direto, que esta resposta

realmente pode acontecer.

Nas folhas, apesar do cultivar Fernandes ter apresentado maior atividade das

CATs, a atividade dessa enzima no foi significativamente aumentada pelo Al. Esse

resultado sugere que o cultivar Fernandes, mesmo na ausncia de Al, pode suportar

em seus tecidos nveis mais elevados de H2O2 e, ou est bioquimicamente melhor

equipado para eliminar este tipo de intermedirio reativo de oxignio.

A atividade combinada das CATs e das SODs, pode ter contribudo para

remoo do excesso de ROIs produzidos durante o estresse causado pelo Al nas

razes dos dois cultivares. Para alguns autores, essas duas enzimas consistem na

primeira linha de defesa no combate aos ROIs (SCANDALIOS, 1993; MITTLER,

2002). GHANATI et al. (2005) trabalhando com razes de Camellia sinensis

submetidas ao Al, tambm encontraram aumento nas atividades das SODs e das

CATs. Segundo esses autores, o H2O2 formado como produto da reao catalisada

pelas SODs pode ter aumentado a atividade das CATs. Entretanto, alguns autores

no encontraram relao entre a atividade dessas enzimas (CAKMAK & HORST ,

1991; LIN & KAO, 2000).

Na ausncia de Al, a atividade das peroxidases (POXs) foi similar nas razes

dos dois cultivares (Figura 5). O tratamento das plantas com Al, aumentou a

atividade das POXs nos dois cultivares. No cultivar Maravilha o aumento foi de

31% e no cultivar Fernandes de 25%, passando o primeiro a ter atividade enzimtica

13% maior que o segundo.

A atividade das POXs nas folhas foi cerca de 10 vezes menor que nas razes

(Figura 5). Na ausncia de Al, a atividade enzimtica no cultivar Fernandes foi 26%

superior encontrada no cultivar Maravilha (Figura 5). Como os dois cultivares

sofreram reduo similar na atividade das POXs com o tratamento das plantas com

Al, a atividade dessas enzimas permaneceu mais elevada nas folhas do cultivar

Fernandes.

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Figura 5: Atividade das peroxidases (POXs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

Em razes de soja tratadas com Al foi observado aumento na atividade das

POXs, principalmente aps exposio prolongada das plantas a este metal e sob

concentraes mais elevadas de Al (CAKMAK & HORST, 1991). O mesmo

aconteceu nas razes de dois cultivares de arroz, um sensvel e outro tolerante, aps

exposio a 80 M de Al, durante 24 h (MERIGA et al., 2004). Todavia, aps este perodo, o estresse excedeu a capacidade das plantas tolerarem aos ROIs produzidos.

Os autores sugeriram que as POXs atuam como eficiente mecanismo de combate aos

ROIs, podendo minimizar os efeitos adversos dessas molculas sobre a peroxidao

de lipdios e, desta forma, contribuir para a manuteno da integridade das

membranas. No presente experimento, mesmo com dez dias de exposio ao Al, a

atividade das POXs, nas razes, foi maior nas plantas que receberam tratamento do

que nas plantas dos controles, mostrando que os dois cultivares eram muito mais

tolerantes que os utilizados por MERIGA et al. (2004). A resposta das POXs,

tambm no indicou ter havido produo de ROIs alm das capacidades das clulas

dos dois cultivares de destru-los enzimtica, reduzindo, assim, os possveis danos

causados s membranas celulares.

Dentre as enzimas analisadas por SIMONOVICOV et al. (2004), as POXs

foram as que apresentaram maior atividade durante o estresse com Al. Segundo estes

autores, isto se deve grande importncia das POXs para o sistema de defesa

23

antioxidativo das plantas no combate a peroxidao de lipdios. No presente trabalho,

as POXs, juntamente com as CATs, foram s enzimas que apresentaram as maiores

atividades. Estas duas enzimas, aparentemente, contriburam de modo mais eficiente

para a remoo de maiores quantidades de H2O2 do interior das clulas. Para

SIEGEL (1993), as POXs apresentam maior importncia na remoo do H2O2 do que

as CATs. Segundo este autor, as POXs, em funo de sua menor massa molecular,

apresentariam maior mobilidade difusional que as CATs, o que as tornariam mais

eficientes na destruio dos perxidos formados. Resultados que corroboram esta

idia foram obtidos por BOSCOLO et al. (2003) que, em razes de milho tratadas

com Al, encontraram maior degradao do H2O2 pelas POXs do que pelas CATs.

Nas razes a atividade das ascorbato peroxidases (APXs) no foi modificada

pelo tratamento com Al em nenhum dos cultivares (Figura 6). A atividade das APXs,

entretanto, foi cerca de 18% mais elevada no cultivar Fernandes nessa parte da

planta, independente da presena de Al. A atividade das APXs nas folhas, foi cerca

de 4 vezes menor que nas razes e, tambm, no foi modificada pela presena de Al

(Figura 6). Nas folhas, a atividade dessa enzima foi 13% mais elevada no cultivar

Fernandes, independente do tratamento com Al.

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Figura 6: Atividade das peroxidases do ascorbato (APXs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

24

Apesar do contedo de H2O2 no ter sido avaliado no presente trabalho, a

maior atividade apresentada pelas APXs no cultivar Fernandes pode indicar que este

cultivar possui maior potencial para a remoo do H2O2 do interior das clulas do

que o cultivar Maravilha. O maior consumo do H2O2 nos tecidos do cultivar

Fernandes pelas APXs, deve estar contribuindo para menor formao do radical

hidroxila e, assim, reduzir os danos causados ao metabolismo deste cultivar. WANG

et al. (1999) sugeriram que a maior expresso dos genes responsveis pela ativao

das APXs, pode aumentar a proteo das plantas contra o estresse oxidativo.

Segundo MIZUNO et al. (1998), o acmulo de nveis txicos de H2O2 em

tecidos vegetais, causados por diferentes tipos de estresses pode resultar em ao

combinada das CATs e das APXs, no sentido de proteger as clulas das plantas da

ao dos perxidos. No entanto, estas duas enzimas apresentam diferentes afinidades

por H2O2. As APXs apresentam alta afinidade por este radical (faixa de M), sendo,

provavelmente, responsveis pela modulao fina nos nveis dos ROIs (MITTLER,

2002). Embora a atividade das APXs no tenha sido alterada significativamente em

resposta ao tratamento das plantas com Al, essas enzimas podem ter contribudo com

a eliminao do H2O2 do interior das clulas, principalmente nas razes, nas quais

maiores atividades destas enzimas foram encontradas.

Nas razes, a atividade das GRs foi estatisticamente similar nas plantas

controles dos dois cultivares de arroz (Figura 7). Na presena de Al, a atividade

destas enzimas aumentou na mesma intensidade nos dois cultivares. Nas folhas, a

atividade das GRs no apresentou alteraes significativas entre os tratamentos e os

cultivares no diferiram entre si.

Em folhas de arroz estressadas por ferro, FANG et al. (2001) observaram

aumento na atividade das GRs. Em razes de arroz, contudo, DEMRAL et al. (2005)

encontraram reduo na atividade destas enzimas durante o estresse salino. Portanto,

a atividade das GRs depende no apenas do tipo de estresse mas, tambm, do rgo

analisado, do tempo de exposio ao estresse e do estgio de desenvolvimento das

plantas, conforme sugere CARDOSO et al. (2002).

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Figura 7: Atividade das redutases da glutationa (GRs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

Aumentos na atividade das GRs tambm foram encontrados durante os

estresses com cobre (CUYPERS et al., 2000), hdrico (SRIVALLI et al., 2003) e

salino (HUANG et al., 2005). Segundo estes autores, os aumentos na atividade das

GRs resultam em incrementos no teor de GSH e em decrscimos no teor de GSSG no

interior das clulas. Estes autores ainda evidenciaram que a GSH, produzida na

reao catalisada pelas GRs, pode ser utilizada na regenerao do ascorbato.

DIPIERRO et al. (2005), trabalhando com Al, verificaram aumentos na atividade das

GRs, seguido por aumentos no teor de ascorbato, o que estes autores sugeriram ter

ocorrido pela ao das enzimas participantes do ciclo ascorbato-glutationa. Portanto,

as GRs apresentam importante funo no metabolismo antioxidativo das plantas, pois

alm de auxiliarem na manuteno de nveis constantes de GSH no interior das

clulas, as GRs tambm podem participar da regenerao do ascorbato pela ao das

enzimas presentes no ciclo ascorbato-glutationa.

Apesar dos nveis de GSH e GSSG no terem sido avaliados isoladamente no

presente trabalho, alguns autores sugerem que as GRs so responsveis pelo aumento

na razo GSH/GSSG durante os estresses (FOYER & NOCTOR, 2005). Aumentos

nessa razo foram evidenciados em plantas sob estresse em baixa temperatura

(ANDERSON et al., 1992) e por metal pesado (CUYPERS et al., 2000).

26

Nas razes, a atividade das GPXs, que era muito prxima nas plantas controle

dos dois cultivares, aumentou 12% no cultivar Maravilha e 28% no cultivar

Fernandes. Na presena de Al, portanto, a atividade das GPXs no cultivar Fernandes

ficou cerca de 24% maior do que no cultivar Maravilha, discriminando os cultivares

quanto resposta ao Al. Nas folhas, as plantas do controle exibiram atividade das

GPXs similares, mas aps tratamento com Al observou-se reduo de 10% na

atividade enzimtica, apenas para o cultivar Maravilha. Apesar disso, os cultivares

no diferiram entre si na presena ou na ausncia de Al (Figura 8).

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Figura 8: Atividade das peroxidases da glutationa (GPXs) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

A atividade das GPXs tambm aumentou na raiz de Scenedesmus bijugatus

durante a induo de estresse com cobre (NAGALAKSHMI & PRASAD, 2001).

Segundo estes autores, as GPXs fazem parte do grupo de enzimas que combatem o

H2O2 formado durante o estresse oxidativo. No entanto, assim como foi verificado

no presente trabalho, em funo de sua baixa atividade enzimtica (nmol) em

comparao as atividades das CATs e POXs (mol), as GPXs provavelmente

contriburam apenas para a eliminao de pequena frao do H2O2 do interior das

clulas. Portanto, as GPXs parecem no ser as principais enzimas responsveis pela

eliminao do H2O2 do metabolismo das plantas, sendo, neste caso, as CATs e

27

POXs as enzimas mais eficientes nesse processo, conforme sugerido por FOYER &

NOCTOR (2005).

Todavia, as GPXs podem participar do ciclo glutationa-peroxidase, no qual

elas so capazes de eliminar o H2O2 utilizando GSH como substrato da reao. A

reao catalisada pelas GRs pode regenerar a GSH que ser novamente utilizada

pelas GPXs (APEL & HIRT, 2004). No presente trabalho foi verificado que, na

presena de Al, as razes dos dois cultivares apresentaram aumentos na atividade das

GPXs e das GRs, portanto, esse ciclo pode ser importante no combate aos ROIs

produzidos em plantas de arroz.

3.2.2. Efeito do alumnio sobre o sistema de defesa no enzimtico

As folhas apresentaram uma concentrao de ascorbato total cerca de 11

vezes mais elevada do que nas razes (Figura 9). Nesta parte da planta, a forma

reduzida do ascorbato (AA) correspondeu, em mdia, a 96% do ascorbato total. J

nas razes, esta forma do ascorbato contribuiu com cerca de 40%, enquanto a forma

oxidada (DHA) correspondeu a 60% do ascorbato total.

Nas razes, o tratamento com Al no modificou a concentrao de AA, mas

reduziu a concentrao de DHA, provocando, por conseqncia, reduo na

concentrao de ascorbato total e aumento na relao AA/DHA nos dois cultivares

(Figura 9). Nas folhas, diferentemente das razes, o tratamento com Al no modificou

a concentrao de DHA, mas aumentou a concentrao de AA, provocando, por

conseqncia, aumento na concentrao de ascorbato total e tambm aumento na

relao AA/DHA nos dois cultivares.

A concentrao de AA nos tecidos vegetais depende de enzimas do ciclo

ascorbato-glutationa (NOCTOR & FOYER, 1998). No presente trabalho, a

concentrao de AA mostrou, como esperado, relao inversa com a atividade das

enzimas APXs (Figura 6). Assim, na raiz do cultivar Fernandes, a atividade das

APXs foi cerca de 18% maior, enquanto a concentrao de AA foi em media 50%

menor em comparao ao cultivar Maravilha. Nas folhas, em que a concentrao de

AA foi 27 vezes maior que nas razes, a atividade das APXs foi relativamente baixa e

apesar do tratamento com Al ter aumentado a concentrao de AA, ela no foi

estatisticamente diferente entre os cultivares (Figura 9).

28

Ascorbato Total

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0,4

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Maravilha Fernandes

ControleAl 1 mM

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AaBa

Ascorbato (AA)

0

0,2

0,4

0,6

Maravilha Fernandes

(m

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-1 m

assa

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Ascorbato (AA)

0

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Maravilha Fernandes

BaAa

BaAa

Desidroascorbato (DHA)

0

0,3

0,6

0,9

Maravilha Fernandes

(m

ol g

-1 m

assa

fres

ca)

Ba

Aa

Ba

Aa

Desidroascorbato (DHA)

0

0,15

0,3

0,45

Maravilha Fernandes

Aa AaAa

Aa

AA / DHA

0

0,3

0,6

0,9

1,2

Maravilha Fernandes

Aa

Bb

AbBa

AA / DHA

0

10

20

30

Maravilha Fernandes

Ba

Aa

Ba

Aa

Figura 9: Concentrao de ascorbato total, ascorbato reduzido, desidroascorbato e razo ascorbato reduzido/desidroascorbato nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

A reao catalisada pelas APXs tem como produto o radical

monodesidroascorbato (MDHA), o qual pode sofrer dismutao espontnea

originando o radical desidroascorbato (DHA) (NOCTOR & FOYER, 1998). O fato

Razes Folhas

29

de o nvel de DHA no sistema radicular de ambos cultivares submetidos ao estresse

com Al ter diminudo significativamente em relao ao controle indica que a

redutase do desidroascorbato (DHAR) est ativa, recuperando o AA e transformando

a glutationa reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSG). Outro indicativo de que

isto pode estar acontecendo foi o aumento na atividade das GRs observado no

sistema radicular do dois cultivares submetidos ao estresse com Al (Figura 7). Este

aumento na atividade das GRs indica que o sistema opera no sentido de recuperar um

dos substratos da DHAR, que o GSH. Outra explicao plausvel para a reduo

nos nveis de DHA seria pela reao catalisada pela enzima redutase do

monodesidroascorbato (MDHAR) dependente de NAD(P)H, que utiliza diretamente

o MDHA como substrato da reao (NOCTOR & FOYER, 1998). A confirmao

destas hipteses teria sido possvel pela determinao das atividades das enzimas

DHAR e MDHAR o que, todavia, no foi feito neste experimento. MITTOVA et al.

(2004) trabalhando com razes de tomate submetidos ao estresse salino, encontraram

aumentos na atividade da enzima MDHAR e decrscimos na concentrao de DHA.

Segundo estes autores, redues na atividade da MDHAR podem ser responsveis

por baixa capacidade na regenerao dos nveis de ascorbato. Trabalhando com

cobre, CUYPERS et al. (2000) observaram aumento na regenerao de ascorbato e

no consumo de DHA. Segundo estes autores, o estresse causado pelo cobre induziu

aumento na atividade das enzimas MDHAR e DHAR seguido por aumento na

atividade das GRs. Para FOYER et al. (1994), a reduo do MDHA pela enzima

MDHAR representa o principal mecanismo de regenerao do ascorbato em clulas

vegetais. Com relao s folhas, a concentrao de DHA, nos dois cultivares, no

apresentou diferenas significativas entre os tratamentos (Figura 9).

A razo entre a forma reduzida (AA) e a forma oxidada (DHA) do ascorbato

fornece excelente relao para o entendimento dos processos de eliminao dos ROIs

(MITTLER, 2002). O aumento nesta razo foi evidenciado na raiz e nas folhas dos

dois cultivares submetidos ao estresse com Al (Figura 9). NGUYEN et al. (2005)

trabalhando com eucalipto submetido ao estresse com Al observaram decrscimo

nessa razo, que segundo os autores, foi ocasionado pelo aumento na concentrao

de DHA. No entanto, no presente trabalho, os aumentos na relao AA/DHA

resultaram da reduo na concentrao de DHA nas razes e do aumento na

concentrao de AA nas folhas.

30

Com base nos resultados, verificou-se que o cultivar Fernandes apresentou

maior eficincia na utilizao do ascorbato do que o cultivar Maravilha. Os

resultados evidenciaram que nas razes do cultivar Fernandes ocorreu forte

integrao entre a enzima APXs e a concentrao de AA. Portanto, esse cultivar

apresenta um eficiente mecanismo de defesa contra os ROIs, o que pode conferir

maior tolerncia ao Al.

Na ausncia de Al, a concentrao de glutationa total foi 30% maior nas

razes do cultivar Fernandes (Figura 10). Na presena deste on, o cultivar Maravilha

apresentou aumento de 50% na concentrao deste metablito, enquanto no cultivar

Fernandes no se observou efeito significativo. Nas folhas, no houve diferena

significativa entre os tratamentos e entre os cultivares (Figura 10).

Razes Folhas

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Glu

tatio

na T

otal

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ca)

ControleAl 1 mM

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AaAa

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Figura 10: Concentrao de glutationa total (GSH+GSSG) nas razes e nas folhas de dois cultivares de arroz, tratados com Al 0 e 1 mM durante dez dias. Mdias seguidas pela mesma letra maiscula, entre os nveis de Al para o mesmo cultivar, e pela mesma letra minscula, entre cultivares para o mesmo nvel de Al, no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

A sntese e o acmulo de glutationa nos tecidos vegetais pode aumentar em

resposta a vrios tipos de estresses (FOYER et al., 2001). O aumento observado na

raiz do cultivar Maravilha, aparentemente est relacionado importante funo da

glutationa no combate aos ROIs. A sntese deste composto envolve duas enzimas: a

sintetase da -glutamilcsteina (-GCS) e a sintetase da glutationa (GSH-S) (NOCTOR et al., 2002). Apesar destas enzimas no terem sido avaliadas neste

31

experimento, outros autores, trabalhando com estresse oxidativo, encontraram

aumentos na atividade da -GCS seguidos de aumentos na concentrao de glutationa total (CREISSEN et al., 1999; NAGALAKSHMI & PRASAD, 2001).

Portanto, no presente trabalho, o estresse causado pelo Al nas razes do cultivar

Maravilha, pode ter ativado as enzimas relacionadas com a sntese de glutationa.

Segundo ANDERSON (1985), a forma reduzida da glutationa (GSH)

responsvel por mais de 99% da glutationa total presente no interior das clulas.

Portanto, aumentos na concentrao de glutationa total sugerem acrscimos na

concentrao da forma reduzida de glutationa. As enzimas GRs e GPXs esto

diretamente envolvidas com a concentrao de GSH no interior das clulas (APEL &

HIRT, 2004). No presente trabalho, a atividade das GRs e das GPXs, aumentou nas

razes dos dois cultivares na presena de Al (Figura 7 e 8). A primeira enzima pode

ter contribudo para o aumento na concentrao da GSH, que conseqentemente

levaria ao aumento na atividade da segunda enzima, visto que a GSH substrato

imediato da reao catalisada pelas GPXs. Portanto, um controle fino entre a

biossntese de glutationa e a atividade das enzimas GRs e GPXs pode contribuir para

a manuteno do metabolismo das plantas, a fim de remover os ROIs do interior das

clulas.

32

4. CONCLUSES

Neste trabalho foram avaliados os efeitos do Al sobre o crescimento e sobre

os sistemas de defesa antioxidativos, enzimticos e no-enzimticos, em plantas de

dois cultivares de arroz com tolerncia diferencial ao Al, sendo um tolerante

(Fernandes: CNA-1158) e outro sensvel (Maravilha: CNA-6843-1) a esse metal.

A tolerncia diferencial dos dois cultivares de arroz ao Al foi confirmada com

base nos parmetros de crescimento em comprimento e na produo de massa seca,

tanto das razes como das folhas. A exposio ao Al no acarretou nenhum efeito nas

variveis de crescimento do cultivar Fernandes, enquanto, no cultivar Maravilha,

redues significativas foram observadas nas duas variveis analisadas.

Nas razes dos dois cultivares, a presena do Al aumentou a atividade das

enzimas CATs, POXs, GRs e GPXs. J a atividade das SODs aumentou apenas nas

razes do cultivar Fernandes, no sendo modificada no cultivar Maravilha. Nas

folhas, o Al no alterou a atividade de nenhuma das enzimas no cultivar Fernandes,

exceto a das POXs que sofreu reduo. No cultivar Maravilha, por outro lado, as

atividades das enzimas SODs, POXs e GPXs sofreram reduo na presena de Al.

Independente do tratamento aplicado e da parte da planta analisada, a atividade das

peroxidases do ascorbato (APXs) foi sempre maior no cultivar Fernandes.

Dentre as enzimas estudadas, as SODs, APXs e GPXs nas razes e as CATs,

POXs, APXs nas folhas, exibiram resposta consistente com a tolerncia diferencial

ao Al apresentada pelos dois cultivares de arroz estudados. De modo geral, as

diferentes atividades das enzimas do sistema antioxidativo, tanto nas razes como nas

folhas dos dois cultivares, suportam a idia de ter o cultivar Fernandes melhor

mecanismo de defesa enzimtico sobre os ROIs produzidos durante o tratamento

com Al.

A concentrao de glutationa total e, principalmente, de ascorbato,

demonstrou interao entre os sistemas de defesa enzimtico e no-enzimtico para o

cultivar Fernandes, reforando a idia de ter este cultivar melhor mecanismo de

defesa no combate aos ROIs produzidos durante o estresse com Al. Portanto, a maior

eficincia dos mecanismos indutivos de combate ao estresse oxidativo apresentada

pelo cultivar Fernandes confirma que este cultivar apresenta maior tolerncia ao Al

que o cultivar Maravilha.

33

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALVES, R.M.M. Produo, acmulo e exsudao de cidos orgnicos em dois

cultivares de arroz (Oryza sativa L.), submetidos a nveis txicos de alumnio.

Viosa, MG: UFV. 2005. 77p. Tese (Doutorado em Fisiologia Vegetal)

Universidade Federal de Viosa, 2005.

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