Dissertação - Priscila Crespo Garcia

i

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

PROGRAMA DE MESTRADO EM FISIOTERAPIA

PRISCILA CRESPO GARCIA

EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS SINÁPTICAS E

ESTRUTURAIS NO SISTEMA NERVOSO DE RATOS

SUBMETIDOS A DIFERENTES MODALIDADES DE

EXERCÍCIO FÍSICO

SÃO PAULO

2012

i


EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS SINÁPTICAS E

ESTRUTURAIS NO SISTEMA NERVOSO DE RATOS

SUBMETIDOS A DIFERENTES MODALIDADES DE

EXERCÍCIO FÍSICO

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo, como requisito para obtenção do título de Mestre, sob orientação da Profa. Dra. Raquel S. Pires

SÃO PAULO

2012

iii


Expressão de proteínas sinápticas e estruturais no sistema nervoso

de ratos submetidos a diferentes modalidades de exercício físico

Dissertação apresentada ao

Programa de Mestrado em

Fisioterapia da Universidade

Cidade de São Paulo, como

requisito para obtenção do título

de Mestre

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Mestrado, em sessão

pública realizada a ......../........../............., considerou

( ) Aprovada ( ) Reprovada

Examinadora:.........................................................................................................

Profa. Renata Hydee Hasue Vilibor

Universidade de São Paulo

Examinadora:.........................................................................................................

Profa. Dra Sandra Regina Alouche

Universidade Cidade de São Paulo

Presidente:.............................................................................................................

Profa. Dra Raquel Simoni Pires

Universidade Cidade de São Paulo

iv

Aos meus amados pais,

meus irmãos Gil e Sheila e,

principalmente ao meu marido

Marcelo e minha filha Ana Julia,

pelo amor incondicional, pelo apoio,

ou simplesmente por existirem!

v

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais pelo grande amor, apoio, preocupações,

incentivos, nunca deixando que a distância nos afastassem.

Aos meus irmãos, pelo simples fato de me amarem do meu

jeito.

Ao meu marido lindo que tanto amo, pelo sempre apoio,

incentivo, por estar ao meu lado me ajudando, dando seu amor

em todos os momentos.

À minha filha Ana Julia, que chegou e transformou a minha

vida, me enchendo de alegrias todos os dias, dando seu amor

incondicional, fazendo de mim uma pessoa melhor.

À minha orientadora Profa. Raquel, pelo ingresso nesse

“novo mundo”, me proporcionando muitos ensinamentos, pela

paciência e amizade.

Ao Prof. Britto, por nos abrir as portas para a pesquisa, pelos

ensinamentos, contribuições e paciência.

Às professoras Sandra Alouche e Sandra Freitas, pelos

ensinamentos, sugestões e companheirismo.

À Carol, por estar ao meu lado desde o princípio, disposta a

me ensinar, me ajudando, pela paciência e carinho, além da

grande amizade.

Ao Adilson, sempre disposto a ajudar, sempre alegre,

tornando os dias de trabalho mais felizes.

À Ana, pelo companheirismo, sugestões e ensinamentos.

A todo pessoal do laboratório da USP, pelo acolhimento e por

estarem sempre dispostos a ajudar.

vi

Aos amigos da turma de mestrado da UNICID, em especial à

Bianca, pelos momentos de companheirismo.

A Ariane, pela amizade incondicional, que devido a

correria do dia a dia e de muito trabalho eu quase nunca vejo,

mas fará sempre parte da minha vida.

E a Deus, por permitir que eu tenha ao meu lado todas essas

pessoas, que fazem de mim uma pessoa muito feliz, pela benção e

proteção.

OBRIGADA!

vii

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES.................................................................................................... ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................xi

RESUMO............................................................................................................................. xii

ABSTRACT ........................................................................................................................ xiv

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 16

1.1. Neuroplasticidade e Exercício ............................................................................ 16

1.2. Marcadores de Plasticidade Sináptica................................................................ 19

1.3. Estruturas Encefálicas: Caracterização Anátomo-funcional................................ 21

1.3.1. Córtex Motor....................................................................................................... 21

1.3.2. Estriado.............................................................................................................. 22

1.3.3. Cerebelo............................................................................................................. 24

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 25

3. OBJETIVOS................................................................................................................... 26

3.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 26

3.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 26

4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................... 26

4.1. Animais .............................................................................................................. 26

4.2. Desenho experimental........................................................................................ 27

4.2.1. Protocolo de Exercício em Esteira de Intensidade Moderada...........................27

4.2.2. Protocolo de Exercício Acrobático .........................................................................28

4.3. Análise Comportamental .................................................................................... 29

4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica ....................................................................... 30

viii

4.5. Protocolo de “Immunoblotting”............................................................................ 32

4.6. Análise Estatística .............................................................................................. 33

5. RESULTADOS............................................................................................................... 34

5.1. Análise Comportamental .................................................................................... 34

5.1.1. Performance Motora .................................................................................... 34

5.1.2. Desempenho Comportamental no Rotarod .................................................. 34

5.2. Expressão de Proteínas ..................................................................................... 35

5.2.1. Córtex Motor ..............................................................................................................37

5.2.2. Estriado........................................................................................................ 42

5.2.3. Cerebelo .....................................................................................................................47

6. DISCUSSÃO.................................................................................................................. 52

6.1. Comportamento.................................................................................................. 52

6.2. Mudanças nas proteínas estruturais e sinápticas ............................................... 53

6.2.1. Córtex Motor ................................................................................................ 53

6.2.2. Estriado........................................................................................................ 56

6.2.3. Cerebelo ...................................................................................................... 58

6.2.4. Circuitos núcleos da base-tálamo-cortical X cerebelo-tálamo-cortical .......... 60

7. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 61

8. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 62

ANEXO I ............................................................................................................................. 73

ANEXO II ............................................................................................................................ 74

ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Imagem digital da esteira ergométrica adaptada para ratos.....................27

Figura 2 – Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as

atividades acrobáticas................................................................................................28

Figura 3 – Aparelho Rotarod utilizado para realização da análise comportamental..29

Figura 4 - Desempenho dos ratos no treinamento de exercícios acrobáticos avaliado

pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no circuito por

semana.......................................................................................................................33

Figura 5 – Tempo de permanência no aparelho Rotarod avaliado no início do

treinamento (I), 2 semanas após (M) e ao final do treinamento (F)...........................34

Tabela 1 – Níveis de proteínas estruturais e sinápticas nos diferentes tipos de

exercício.....................................................................................................................35

Figura 6 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína associada ao

microtúbulo – 2 (MAP2) no córtex motor....................................................................37

Figura 7 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a expressão de

neurofilamentos (NF) no córtex motor........................................................................38

Figura 8 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinapsina I

(SYS) no córtex motor................................................................................................39

Figura 9 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinaptofisina

(SYP) no córtex motor................................................................................................40


microtúbulo – 2 (MAP2) no estriado...........................................................................42


neurofilamentos (NF) no estriado...............................................................................43


(SYS) no estriado.......................................................................................................44

x


(SYP) no estriado.......................................................................................................45


microtúbulo – 2 (MAP2) no cerebelo..........................................................................47


neurofilamento (NF) no cerebelo................................................................................48


(SYS) no cerebelo......................................................................................................49


(SYP) no cerebelo......................................................................................................50

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

- AC: Exercício Acrobático

- AE: Ambiente Enriquecido

- BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo

- Cb: Cerebelo

- CG: Camada Granular

- CM: Camada Molecular

- DLS: Estriado Dorsolateral

- DMS: Estriado Dorsomedial

- EE: Exercício em Esteira

- EG: Externamente Guiado

- EV: Exercício Voluntário

- GluR: Receptor de Glutamato

- GPe: Globo Pálido Externo

- GPi: Globo Pálido Interno

- IF: Filamentos Intermediários

- IG: Internamente Guiado

- LTP: Potenciação a Longo Prazo

- MAP: Proteína Associado ao Microtúbulo

- MF: Microfilamento de Actina

- MT: Microtúbulo

- NB: Núcleos da Base

- NF: Neurofilamento

- NT: Neurotransmissor

- SED: Sedentário

- SYP: Sinaptofisina

- SYS: Sinapsina

xii

RESUMO

Introdução: Diversos tipos de exercícios físicos com seus diferentes protocolos são

capazes de promover várias mudanças plásticas no sistema nervoso. No entanto,

não há ainda muita clareza quanto às respostas plásticas dependentes de proteínas

estruturais e sinápticas em regiões motoras quando comparados dois tipos

diferentes de exercício físico, um envolvendo tarefas motoras complexas e outro

envolvido com tarefas rítmicas e automáticas. O objetivo do estudo foi avaliar a

expressão das proteínas sinapsina I (SYS), sinaptofisina (SYP), MAP2 (proteína

associada ao microtúbulo – 2) e neurofilamentos (NF) em regiões do córtex motor,

estriado e cerebelo de ratos adultos submetidos a exercício físico realizado em

esteira de intensidade moderada (EE) e exercício acrobático (AC). Além disso, foi

analisado o comportamento motor e equilíbrio de ratos dos diferentes grupos.

Métodos e Resultados: Esse estudo utilizou-se de ratos adultos machos, Wistar, os

quais foram separados em 3 grupos: controle-sedentário (n=15), EE (n=20) e AC

(n=20). No grupo EE os ratos treinaram em uma esteira com velocidade máxima de

0,6 Km/h por 40 minutos, 3 vezes por semana por 4 semanas. No grupo AC, os ratos

passaram 5 vezes pelo circuito que era composto por diversos obstáculos, 3 vezes

por semana durante 4 semanas. Na análise comportamental foi utilizado o sistema

“Rotarod”. Além disso, foi analisada a performance motora dos ratos do grupo AC

através do registro do tempo de passagem pelo circuito acrobático. Para analisar a

expressão das proteínas no córtex motor, estriado e cerebelo foram utilizadas as

técnicas de imuno-histoquímica e “immunoblotting”, e os dados submetidos à análise

estatística utilizando o teste ANOVA e o pós-teste de Tukey quando apropriado.

Adotou-se o nível de significância de 5%. A análise comportamental dos animais

revelou aumento significativo do tempo de permanência no Rotarod somente nos

grupos EE e AC, a partir da segunda semana de treinamento e que permaneceu até

o final das 4 semanas. Quanto a performance motora, após 4 semanas de

treinamento acrobático, os animais mostraram uma redução estatisticamente

significante do tempo necessário para atravessar todo o circuito. Em nossos

resultados, ratos do grupo AC mostraram aumento significante de MAP2 e SYP no

córtex motor, das quatro proteínas no estriado e de SYS no cerebelo. Por outro lado,

xiii

ratos do grupo EE apresentaram aumento significativo de SYS e SYP no córtex

motor, NF68, SYS e SYP no estriado e MAP2, NF e SYS no cerebelo, além de

redução significativa de NF no córtex motor e na camada molecular do cerebelo.

Assim, as principais alterações ocorridas no grupo AC foram vistas nas áreas

envolvidas nos circuitos núcleos da base-tálamo-corticais, enquanto que no grupo

EE as alterações foram vistas nas regiões envolvidas no circuito cerebelo-tálamo-

cortical. Conclusão: Nossos dados sugerem que o exercício realizado em esteira e

o exercício acrobático modulam proteínas sinápticas e estruturais nas áreas

encefálicas de forma distinta, desempenhando um importante papel na plasticidade

exercício-dependente em regiões motoras do encéfalo.

Palavras chave: Exercício físico, proteínas estruturais, proteínas sinápticas,

exercício acrobático, exercício em esteira, circuitos neurais motores

xiv

ABSTRACT

Aim: Several types of physical exercise with different protocols are able to promote

plastic changes in the nervous system. The relationship of these plastic responses to

structural and synaptic proteins in motor regions of the brain are less understood.

The aim of this study was to evaluate the expression of the proteins synapsin I

(SYS), synaptophysin (SYP), microtubule-associated proteins 2 (MAP2) and

neurofilaments (NF) in the motor cortex, striatum and cerebellum of adult rats

subjected to moderate intensity treadmill exercise (EE) and acrobatic exercise (AC).

In addition, we analyzed the motor behavior and balance of rats of the different

groups. Methods and results: Adult male Wistar rats, were separated into 3 groups:

control-sedentary (n=15), EE (n=20) and AC (n=20). EE rats trained on a treadmill

with a top speed of 0.6km/h for 40 minutes, 3 times a week for 4 weeks. In the AC

group, the rats covered 5 times a circuit which was composed by several obstacles,

three times a week for 4 weeks. For behavioral analyses we used the “Rotarod”

system. In addition, in the AC group we analyzed the performance of the rats, by

recording the time of passage through the acrobatic circuit. The expression of

proteins in the motor cortex, striatum and cerebellum was analysed by

immunohistochemical and immunoblotting techniques, and the data subjected to

statistical analysis using one-way ANOVA with Tukey post hoc test when appropriate.

The significance level used was 5%. Behavioral analysis showed a significant

increase in time spent on the rotarod only in groups EE and AC, from the second

week of training through the end of 4 weeks. As of the motor performance, acrobatic

animals showed a statistically significant reduction of time needed to traverse the

circuit, from 2 – 4 weeks of training. Our results also showed that rats from the AE

group showed a significant increase of MAP2 and SYP in the motor cortex, of all four

proteins in the striatum and of SYS in the cerebellum. On the other hand, the rats

from the TE group exhibited a significant increase of SYS and SYP in the motor

cortex, of NF68, SYS and SYP in the striatum, and of MAP2, NF and SYS in the

cerebellum, whereas NF was decreased in the motor cortex and molecular layer of

the cerebellar cortex. Thus, the main changes in the AC group were seen in areas

involved in basal nuclei-thalamic-cortical circuits, whereas in group EE the main

xv

changes were seen in the regions involved in cerebellar-thalamic-cortical circuits.

Conclusion: Our data suggest that exercise on a treadmill and acrobatic exercise

differentially modulate synaptic and structural proteins in different brain areas, playing

an important role in exercise-dependent plasticity in motor regions of the brain.

Keyword: physical exercise, structural proteins, synaptic proteins, acrobatic

exercise, treadmill exercise.

16

1. INTRODUÇÃO

1.1. Neuroplasticidade e Exercício

Inúmeros estudos mostram a capacidade do sistema nervoso central em mudar

sua estrutura e função, como resultado da interação de indivíduos com o seu meio.

Dependendo das características do meio e do estilo de vida, as alterações plásticas

podem ser reforçadas ou degradadas1.

A vivência em ambiente enriquecido (AE) há décadas vem sendo utilizada para

avaliar a existência de alterações plásticas que ocorrem no sistema nervoso1-7. Em

um cenário laboratorial, um ambiente é “enriquecido” em relação à condição padrão

onde os animais são alojados. No AE os animais são mantidos em gaiolas maiores

e em grupos, com oportunidade de uma interação social dentro de um ambiente

complexo que varia ao longo do período do experimento. Este ambiente pode conter

túneis, rampas, plataformas, brinquedos em geral e a alimentação é trocada de

lugar com frequência. Além disso, a esses animais são dadas oportunidades de

execução de um exercício físico voluntário realizado em rodas contidas nas

gaiolas8. A exposição a essa condição pode levar a mudanças neuronais estruturais

como aumento na arborização dendrítica, aumento na densidade dos espinhos

dendríticos, aumento de matriz extracelular e até uma diminuição da gliose4, 5. O AE

também é capaz de estimular a neurogênese em regiões do hipocampo e gerar

mudanças distintas nos sistemas de neurotransmissores, sendo observado aumento

da liberação de dopamina e acetilcolina no córtex pré-frontal de ratos adultos e

aumento de glutamato e GABA no hipocampo de ratos envelhecidos1-3, 9.

Vários modelos de exercícios vêm sendo desenvolvidos em estudos com

animais a fim de simular os exercícios físicos realizados por seres humanos.

Estudos comprovam que, independente do tipo de treinamento físico, estes são

capazes de promover melhoras no aprendizado, na memória e plasticidade10-16.

Esses modelos de exercícios físicos em animais têm protocolos que incluem

diferentes intensidades, frequência de treinamento contínua e intermitente,

realizados em um período de curta e longa duração11. Dentre os estudos utilizando

treinamento físico, os tipos mais utilizados são o exercício voluntário (EV), exercício

em esteira (EE) e/ou exercício acrobático (AC)4, 11, 12, 17-22.

17

O EV é assim chamado pois os animais correm de forma espontânea dentro de

uma roda, sendo motivados a executá-lo por si só, e não em reposta a qualquer

manipulação externa. Neste tipo de exercício é observado que alguns ratos correm

vários quilômetros por dia, enquanto outros pouco se envolvem com esta atividade.

É um exercício executado geralmente de forma intermitente, com curtos períodos de

alta a baixa intensidade durante um período de 12 horas noturnas11, 23. O EV

executado tanto a curto, quanto a longo prazo, tem um grande impacto no encéfalo

e no comportamento de animais. A maioria desses estudos analisa a

neuroplasticidade ocorrida em áreas relacionadas à aprendizagem e memória. O

uso de EV mostrou alterações como sinaptogênese no cerebelo de ratos adultos24,

neurogênese14, 25-27, aumento do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e

seu receptor TrkB21, de genes associados à plasticidade sináptica e excitabilidade

celular e de MAP Kinase no hipocampo28, 29, no cerebelo e córtex30 e alterações na

atividade de neurotransmissores no córtex frontal31. Além disso, outros estudos

mostram que este tipo de exercício promove aumento de proteínas sinápticas

(sinapsina I e sinaptofisina) em áreas como o hipocampo32 e o neocórtex13,

ressaltando a importância deste tipo de exercício em áreas relacionadas à

memória13, 31.

O EE é um método comum de treinamento utilizado pelos pesquisadores que

investigam adaptações fisiológicas causadas pelo exercício. Este tipo de

treinamento é muito utilizado devido sua simplicidade e eficácia e onde vários

animais podem treinar ao mesmo tempo. É um exercício chamado de exercício

forçado, pois os animais o executam de acordo com as determinações do

pesquisador, que estabelece a velocidade, inclinação e tempo de treinamento11.

Alguns pesquisadores classificam esse tipo de exercício como uma tarefa

externamente guiada (EG) onde estímulos visuais, auditivos e/ou proprioceptivos

são dados para a realização do movimento33. Este tipo de treinamento tem se

mostrado também capaz de promover mudanças no sistema nervoso. Vários

estudos mostram que o exercício em esteira a curto e a longo prazo pode induzir

mudanças na expressão dos receptores de glutamato do tipo AMPA (GluR1-3) no

córtex sensório-motor, estriado e cerebelo22, neurogênese em regiões do

hipocampo em ratos envelhecidos34, 35, e proliferação de astrócitos e angiogênese

no córtex e estriado, onde autores sugerem que essa indução de astrocitose e

18

angiogênese provocada pelo exercício promove uma relação entre células

endoteliais/astrócitos, modificando a função da barreira hemato-encefálica dentro da

unidade neurovascular36. Além disso, o EE após curto período de treinamento foi

capaz de provocar alterações em proteínas estruturais e sinápticas em estruturas

como estriado, cerebelo, hipocampo, substância negra e córtex motor, mostrando

ajustes na eficiência sináptica e remodelamento neuronal12.

Estudos recentes têm focado a aprendizagem motora associada ao treinamento

acrobático17, 20, 21, 37-41. Este tipo de exercício consiste em uma sequência de tarefas

destinadas a incentivar a resolução de problemas e coordenação. Nesse tipo de

exercício há a necessidade de um início voluntário do movimento, necessitando de

um planejamento de como este pode ser executado. Tarefas relacionadas como

este tipo de movimentos, são assim chamadas de tarefas internamente guiadas

(IG)33. Exercícios acrobáticos como aprender a atravessar vários tipos de obstáculos

com diferentes tamanhos de superfície e graus de instabilidade diferem de exercício

voluntário e executado em esteira, já que estes são rítmicos e repetitivos. O AC

promove alterações em proteínas neuronais como MAP2 e sinaptofisina38, aumento

de BDNF e seu receptor21, sinaptogênese em regiões do cerebelo e córtex motor24,

40, 42, 43, além de alterações comportamentais, como redução do tempo de realização

das tarefas, indicando um aumento substancial na aquisição das habilidades

motoras40.

As adaptações que o exercício causa no sistema nervoso têm implicações

também na prevenção e tratamento do declínio cognitivo associado ao

envelhecimento e em distúrbios neurológicos, como doença de Alzheimer, doença

de Parkinson, acidente vascular isquêmico e lesões medulares.

O exercício físico produz um efeito protetor, atenuando o declínio mental

decorrente do envelhecimento mostrando que em animais envelhecidos há melhora

da memória espacial, aumentando a neurogênese e suprimindo a apoptose no giro

denteado 34, 35, 44.

Exercícios também mostram um potencial na plasticidade neural em animais

induzidos a um modelo de Alzheimer, levando ao aumento da neurogênese no

hipocampo desses animais, sugerindo ser de grande valia para a estimulação da

função cognitiva em casos da doença de Alzheimer45, 46.

19

Em um modelo experimental de doença de Parkinson, o exercício físico foi

capaz de provocar menores déficits após a lesão, além de levar a maior

sobrevivência de neurônios dopaminérgicos na região nigroestriatal em comparação

aos animais lesados sedentários, demonstrando que o exercício físico melhora os

sintomas motores e déficits neuroquímicos em modelos animais de Parkinson47.

Diversos estudos têm mostrado que diferentes modalidades de exercício físico

geram um mecanismo de neuroproteção, promovendo redução da apoptose no

hipocampo48, 49 e aumento da sinaptogênese no córtex motor39 de ratos pós-lesão

encefálica, além de facilitar a recuperação funcional pós-lesão medular37, 50.

1.2. Marcadores de Plasticidade Sináptica

Estudos comportamentais têm demonstrado que a realização de exercício físico

requer a síntese de proteínas e é provável então que algumas das proteínas

sintetizadas durante o exercício físico estejam envolvidas com a plasticidade

estrutural e funcional38. Estudos recentes deram início a uma sequência de

pesquisas que avaliam o envolvimento de proteínas sinápticas, como sinapsina I e

sinaptofisina, e de proteínas responsáveis pela estrutura neuronal, na plasticidade

do sistema nervoso decorrente de exercício físico12, 13, 38, 51.

As sinapsinas representam uma família de quatro fosfoproteínas expressas

principalmente em neurônios, onde são associadas a vesículas sinápticas em

praticamente todos os terminais nervosos do sistema nervoso central e periférico.

São elas: sinapsina Ia e Ib (chamadas de sinapsina I) e sinapsina IIa e IIb (chamada

de sinapsina II)52, 53. As sinapsinas regulam a liberação de neurotransmissores (NT)

pelos terminais nervosos. A sinapsina I é a mais abundante de todas as

fosfoproteínas neuronais e quando desfosforilada encontra-se ligada à vesícula

sináptica, ancorando-a ao citoesqueleto do terminal nervoso. A condução do

impulso nervoso estimula a fosforilação da sinapsina I, soltando-se da vesícula,

deixando-a disponível para exocitose e liberação de neurotransmissores53. A

fosforilação da sinapsina I está envolvida em vários mecanismos dependentes de

Ca2+ que regulam a liberação de NT. Alguns NT estimulam ou inibem a fosforilação

da sinapsina I ligando-se a receptores pré-sinápticos, alterando, portanto, as

concentrações de Ca2+. Esta proteína está envolvida com a regulação da formação

20

de sinapses em vários estágios do desenvolvimento neuronal, regulando a

maturação estrutural e funcional das sinapses. Portanto, a sinapsina I tem um papel

importante na organização da estrutura do terminal nervoso52, 54.

A sinaptofisina é uma glicoproteína responsável pela biogênese e ancoragem

das vesículas sinápticas no terminal sináptico e resgate de proteínas dessas

vesículas por endocitose, o que é importante para uma neurotransmissão rápida e

eficiente32. O aumento de sinaptofisina pode indicar a formação de vesículas

sinápticas, podendo significar um aumento de vesículas nas sinapses já existentes,

ou a formação de novos terminais nervosos55-57.

O citoesqueleto neuronal é composto por três estruturas interligadas: os

microfilamentos de actina (MFs), os microtúbulos (MTs) e filamentos intermediários

(IFs). O diâmetro dos IFs (10nm) é “intermediário” entre microfilamentos (6nm) e

filamentos de miosina (15nm)58. Os neurofilamentos (NF) são filamentos

intermediários de neurônios, compostos por três tipos de proteínas: NF-L ou NF68,

NF-M ou NF160 e NF-H ou NF200 (polipeptídeos com pesos moleculares baixo,

médio e alto, respectivamente) que formam obrigatoriamente heteropolímeros,

sendo necessária a co-polimerização do NF68 com pelo menos uma das

subunidades mais pesadas em roedores58, 59.

Os NFs representam um dos principais componentes do citoesqueleto

neuronal59-61. A síntese e o transporte axonal de neurofilamentos têm um papel

importante no controle do calibre axonal em grandes fibras nervosas mielinizadas.

Este conceito é baseado em diversas características de um nervo normal, tais

como: i) os NFs são os elementos mais numerosos do citoesqueleto, ii) a densidade

do NF permanece constante ao longo de uma ampla gama de calibres, e iii) o

número de NFs correlaciona-se diretamente com a área axonal. O controle do

calibre axonal tem importantes implicações funcionais visto que o tamanho do

calibre axonal é um dos determinantes da velocidade da condução nervosa61. Eles

também contribuem para as propriedades dinâmicas do citoesqueleto neuronal

durante diferenciação, crescimento, regeneração e orientação axonal58, 61. Além

disso, os NF, em conjunto, agem para formar e manter a forma da célula e facilitar o

transporte de partículas e organelas no citoplasma58, 61, 62. Embora os NFs tenham

uma importante função, ainda há poucos estudos demonstrando a expressão de

NFs frente a exercícios físicos.

21

Por outro lado, perturbações em seu metabolismo e organização são

frequentemente associadas com várias doenças neurodegenerativas, incluindo

esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer e doença de Charcot-

Marie-Tooth58, 63-65.

Os microtúbulos e suas proteínas associadas (MAPs) têm papel fundamental no

desenvolvimento de axônios e dendritos. No encéfalo adulto, MAP2a e MAP2b são

as MAPs mais abundantes no dendritos. A MAP2 pode desempenhar múltiplas

funções, incluindo a nucleação e estabilização dos microtúbulos e possíveis

microfilamentos, o transporte de organelas dentro de axônios e dendritos, bem

como a fixação de proteínas reguladoras, tais como proteínas quinases, que podem

ser importantes para a transdução de sinal. Assim, as MAPs participam do processo

de crescimento e arborização dendrítica, remodelamento dendrítico pós-lesão e

estabelecimento e manutenção da sinaptogênese66, 67.

1.3. Estruturas Encefálicas: Caracterização Anátomo-funcional

As regiões encefálicas analisadas neste trabalho, córtex motor, cerebelo e

estriado, foram escolhidas por serem áreas motoras envolvidas, de uma forma

geral, com coordenação, equilíbrio e planejamento e/ou execução de movimentos,

que sofrem influência direta dos efeitos do exercício físico.

1.3.1. Córtex Motor

O córtex cerebral apresenta-se organizado em seis camadas numeradas de I a

VI, como descrito por Lorente de Nó em 194268. Estas camadas são compostas

basicamente por três tipos celulares: células granulares ou estreladas

(interneurônios); células fusiformes e células piramidais (de onde se originam fibras

eferentes do córtex cerebral), variando apenas a quantidade de cada uma na região

analisada. Nas camadas I, II e III encontramos fibras de associação, na IV estão as

fibras aferentes, na V temos células que dão origem às fibras eferentes, chamadas

também de células de Betz na área motora primária, isto é, que deixam o córtex

cerebral indo para o tronco encefálico, medula espinal e núcleos da base, e na VI

22

temos as fibras que partem desta zona em direção ao tálamo68. Em nosso estudo a

camada V foi selecionada por gerar a principal eferência cortical no contexto motor.

As áreas motoras do córtex cerebral são subdivididas em área motora primária e

em várias áreas pré-motoras (áreas motoras secundárias). A área motora primária é

responsável por executar o movimento e as outras por planejar o movimento,

participando de padrões de movimento mais complexos69. A capacidade de

reorganização funcional do córtex cerebral não se limita ao desenvolvimento e pode

ser demonstrada em um cérebro já maduro. A redistribuição das representações

sensoriais e motoras dentro do córtex cerebral de adultos tem sido demonstrada em

resposta a uma variedade de manipulações experimentais40, 70-72. Além disso, a

reorganização parece ser um processo contínuo. Estudos têm mostrado que há

mudanças no número de sinapses40, 43 e da eficiência sináptica73 no córtex motor

em associação com as mudanças nas representações do movimento no mapa

cortical40, 72. Outros pesquisadores demonstraram que a combinação de lesão

cerebral e exercício acrobático levam a incremento da sinaptogênese, onde animais

treinados apresentavam mais sinapses por neurônios na camada V do córtex

cerebral comparado aos outros grupos do estudo39.

1.3.2. Estriado

Os núcleos da base (NB) são responsáveis pela maioria dos programas motores

de rotina, além de participarem da formação de memória e aprendizado74. São

constituídos por quatro estruturas, sendo elas: estriado (acumbens, caudado e

putâmen), globo pálido (interno - GPi e externo GPe), substância negra (parte

compacta e reticulada) e núcleo subtalâmico. O estriado por sua vez, ao excluirmos

o polo anterior onde se localiza o núcleo acumbens, é subdividido pela cápsula

interna em caudado e putâmen, formando uma estrutura chamada neoestriado,

porém didaticamente encontramos referência como apenas estriado75. O estriado é

composto por vários tipos celulares, porém cerca de 90 ou 95% deles são neurônios

com espinhos dendríticos e projeções GABA-érgicas, que são alvos importantes da

aferência cortical e representam a única fonte de eferências dos NB76.

As conexões dos NB são baseadas em duas vias estriado-palidais distintas.

Uma via direta que projeta informações do estriado para o GPi e dele para o tálamo,

23

enquanto a via indireta projeta as informações para o GPe, núcleo subtalâmico, GPi

e tálamo. O GPi é considerado o principal núcleo de saída dos NB. Fibras eferentes

do tálamo enviam suas projeções para o córtex. A via direta pode promover uma

retroalimentação “positiva” e a via indireta uma retroalimentação “negativa” no

circuito entre os NB, tálamo e córtex. Essas vias eferentes (NB-tálamo-cortical) têm

efeitos opostos nos núcleos de saída dos NB e, consequentemente, nos alvos

talâmicos desses núcleos. A ativação da via direta desinibe o tálamo, aumentando a

atividade talamocortical, enquanto que a ativação da via indireta inibe os neurônios

talamocorticais. Assim, a via direta facilita o movimento e a via indireta inibe o

movimento. Essas vias estriatais são afetadas de forma distintas por projeções

dopaminérgicas proveniente da substância negra. A via direta possui receptores

dopaminérgicos D1, que facilita a transmissão, e a via indireta possui receptores D2,

que reduzem a transmissão. Desta forma, ativação das aferências dopaminérgicas

provocam o mesmo efeito, reduzindo a inibição dos neurônios talamocorticais e

facilitam os movimentos iniciados pelo comando do córtex76, 77. Alguns estudos

sugerem que os circuitos estriatais e os processos envolvidos durante as fases

precoces e tardias de aprendizagem de habilidade podem ser diferentes. Como por

exemplo, o estriado dorsomedial ou associativo (DMS – homólogo ao caudado em

primatas) que recebe aferências principalmente da áera motora suplementar e

córtex pré-frontal, sendo preferencialmente envolvido nas fases iniciais de

aprendizagem visuomotora. Por outro lado, o estriado dorsolateral ou sensório-

motor (DLS – homólogo ao putâmen em primatas), recebe aferências do córtex

sensório-motor e é principalmente ativado nas aquisições de comportamento

habituais e automáticas78.

Tarefas que são internamente guiadas (IG), ou seja, movimento iniciados

voluntariamente, são principalmente processadas pelo circuito NB-tálamo-cortical

com recrutamento do circuito cerebelo-tálamo-cortical33. Lewis e colaboradores

observaram em seu estudo que portadores de doença de Parkinson tem uma

ativação não adequada (ou pouca ativação) do circuito NB-tálamo-cortical ao

realizar tarefas IG33.

24

1.3.3. Cerebelo

O cerebelo foi escolhido para ser analisado neste estudo por estar envolvido na

manutenção do equilíbrio, tônus muscular e postura, além da coordenação dos

movimentos79.

O cerebelo de mamíferos é formado por córtex cerebelar (substância cinzenta

externa), substância branca interna e por núcleos cerebelares profundos, que

representam suas principais estruturas de saída. Ele pode ser dividido de acordo

com o desenvolvimento evolutivo ou sua funcionalidade. Funcionalmente ele é

dividido em: vestibulocerebelo, espinocerebelo e cerebrocerebelo, as quais recebem

aferências distintas, projetando-se para diferentes partes dos sistemas motores

através dos núcleos profundos. O córtex cerebelar é formado por três camadas

distintas: molecular, das células de Purkinje e granular. A disposição celular em

cada uma dessas camadas é a mesma em todos os lobos, diferindo somente na

procedência das vias aferentes e no destino das vias eferentes80, 81.

A camada molecular é basicamente uma área de sinapses e nela se encontram

além das fibras paralelas, os dendritos das células de Purkinje (formando sinapses

com as fibras trepadeiras), os dendritos das células de Golgi, as células em cesto e

estreladas, todos fazendo sinapses com as fibras paralelas. A camada das células

de Purkinje é composta de células grandes dispostas ao longo da borda superior,

próximo à camada molecular. Estas células constituem a eferência do córtex

cerebelar82.

Já na camada granular, encontramos as células granulares cerebelares, que

representa o tipo de neurônio mais numeroso no encéfalo83. Seus axônios

ascendem para a camada molecular e se bifurcam formando as fibras paralelas que

fazem sinapses excitatórias com as células de Purkinje84. Nesta camada temos

também as células inibitórias de Golgi tipo II que se localizam na parte superior da

camada, apresentando ramos dendríticos por todas as camadas do córtex

cerebelar, porém mais extensos na camada molecular84.

As duas aferências para o cerebelo são excitatórias e compostas pelas fibras

musgosas e trepadeiras. As fibras musgosas, maior fonte de aferências do cerebelo,

têm origem em núcleos do tronco encefálico e neurônios medulares que dão origem

ao trato espinocerebelar, conduzindo então informações sensoriais periféricas, além

25

de informações do córtex cerebral, e fazem sinapses excitatórias com dendritos das

células granulares na camada granular. As células granulares agem diretamente

sobre as células de Purkinje via fibras paralelas80.

A origem das fibras trepadeiras se dá no núcleo olivar inferior e formação

reticular medial, que recebem aferências do córtex cerebral, núcleo rubro e medula

espinal80. Estas conduzem informações sômato-sensórias, visuais e do córtex

cerebral. As sinapses das fibras trepadeiras ocorrem entre o soma e os dendritos

das células de Purkinje, podendo modular o efeito das fibras musgosas, por serem

muito potentes. Tanto as fibras musgosas como as trepadeiras enviam colaterais

para os neurônios dos núcleos cerebelares. Desta forma, os neurônios dos núcleos

cerebelares recebem aferências excitatórias das fibras musgosas e trepadeiras e

inibitórias das células de Purkinje. As informações aferentes provêm de receptores

da pele, olho, sistema vestibular, músculos e articulações. Após passar pelas

células de Purkinje, a informação segue para os núcleos cerebelares profundos,

para então seguir seu destino pelas vias eferentes cerebelares80.

De uma forma geral, o circuito cerebelo-tálamo-cortical (Cb-tálamo-cortical) é

organizado pelas fibras musgosas e trepadeiras, que transportam eferências do

cerebelo através de uma alça excitatória principal que passa pelos núcleos

profundos. Essa alça é modulada por uma alça lateral que passa pelo córtex

cerebelar85. Esse circuito fornece ao córtex motor informações sobre os movimentos

em andamento, além da velocidade e da força desse movimento77.

Enquanto os circuitos NB-tálamo-corticais são principalmente ativados em

tarefas que são IG, as tarefas externamente guiadas (EG), ou seja, tarefas

orientadas por estímulos visuais ou auditivas são principalmente processadas nos

circuitos Cb-tálamo-corticais, com recrutamento do circuito NB-tálamo-cortical33.

2. JUSTIFICATIVA

A neuroplasticidade que ocorre no sistema nervoso de animais e humanos

frente a diferentes tipos de exercícios físicos foram descritos por diversos autores

que revelaram mudanças distintas em diferentes áreas encefálicas. Além disso,

muitos desses estudos têm demonstrado o papel dos diferentes tipos de exercícios

físicos sobre funções cognitivas, tais como memória de curto e longo prazo. No

26

entanto, não há ainda muita clareza quanto às respostas plásticas dependentes de

proteínas estruturais e sinápticas em regiões motoras quando comparados dois

tipos diferentes de exercício físico, um envolvendo tarefas motoras complexas (AC)

e outro envolvido com tarefas rítmicas e automáticas (EE).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

- Avaliar a expressão das proteínas neuronais em regiões encefálicas de ratos

adultos submetidos a diferentes tipos de exercícios, em paralelo com a análise do

comportamento motor desses ratos.

3.2. Objetivos Específicos

- Avaliar a expressão de proteínas sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) e de

proteínas estruturais (MAP2 e neurofilamentos) em animais submetidos ao exercício

em esteira e acrobáticos e compará-los aos sedentários.

- Analisar se as respostas plásticas nas regiões do córtex motor, cerebelo e

estriado são distintas entre os diferentes tipos de exercícios.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Animais

Foram utilizados nesse estudo 55 ratos machos, adultos (2 meses), da linhagem

Wistar fornecidos pelo biotério central do Instituto de Ciências Biomédicas da USP.

Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura constante de 23oC e.ciclo

claro/escuro invertido artificialmente de 12/12h, com alimentação e água ad libitum.

Antes do início do treinamento físico os animais ficaram 15 dias na sala para

adaptação de ciclo invertido 86, 87. Este estudo foi conduzido de acordo com os

Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pela COMISSÃO DE ÉTICA EM

27

EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL (CEEA) do ICB/USP em 21/05/2010, protocolo

registrado sob nº 60 nas fls. 87 do livro 2 para uso de animais de experimentação.

4.2. Desenho experimental

Inicialmente, todos os animais foram colocados para correr na esteira por 5

minutos a uma velocidade que variou de 0,3 a 0,5 Km/h por dois dias para

selecionarmos os animais corredores evitando o emprego do choque elétrico e

assim minimizando o estresse11. Destes, 16 animais não correram e foram divididos

nos grupos sedentário e AC. Os 39 animais restantes foram divididos

aleatoriamente em três grupos, totalizando: exercício em esteira de intensidade

moderada (EF, n=20), exercício acrobático (AC, n=20) e sedentário (SED, n=15).

Os animais sedentários permaneceram no mesmo ambiente que os exercitados.

4.2.1. Protocolo de Exercício em Esteira de Intensidade Moderada

Os animais foram adaptados ao exercício por 15 minutos durante 2 dias, sendo

iniciado a uma velocidade de 0,3 km/h com incrementos de velocidade da esteira de

0,1 km/h a cada 5 minutos. Desta forma, ao fim deste período de adaptação, os

animais estavam a uma velocidade de 0,5 km/h.

Os animais foram treinados em uma esteira ergométrica programável (KT 3000

– IMBRAMED) adaptada para ratos (Figura 1). A esteira é constituída de 8 raias de

acrílico transparente pintadas de preto em sua extremidade anterior. A parte anterior

mais escura das raias propicia um ambiente para o qual os ratos são atraídos

durante o treinamento, evitando a necessidade de choques elétricos para induzir

seu deslocamento. Entretanto, em momentos em que os ratos permanecessem por

muito tempo no fundo da raia era dado um estímulo manual para que retornassem a

atividade.

O treinamento consistiu de corrida em esteira durante 40 minutos a

aproximadamente 60% do VO2 máximo12,22. O protocolo de treinamento foi

realizado 3x/semana, por 4 semanas, iniciado a 0,4 km/h com incrementos da

velocidade da esteira de 0,1 km/h a cada 1 minuto, apenas para o aumento da

velocidade ser gradativo. Assim, com 2 minutos a velocidade foi de 0,6 km/h,

28

velocidade na qual o animal correu por 38 minutos. O horário do início do

treinamento foi o mesmo para todos os grupos, ou seja, entre as 11 e 13 horas,

acontecendo no período ativo do animal87.

Figura 1. Imagem digital da esteira ergométrica adaptada para ratos.

4.2.2. Protocolo de Exercício Acrobático

Inicialmente os ratos passaram por um período de adaptação à tarefa motora

que consistiu em passar 2 vezes por todo o circuito em 2 dias seguidos. O

treinamento acrobático consistiu em atravessar um circuito constituído pelos

obstáculos: gangorra, barreiras verticais, ponte de cordas paralelas, traves paralelas

de madeira roliça, pontes de madeira roliça e corda, como mostra a Figura 2. O

circuito foi baseado no utilizado por Kleim e colaboradores40 e localizado a uma

altura de 1,50m do chão. O treinamento foi realizado três dias alternados por

semana e com 5 repetições desse circuito por dia, até completar 4 semanas de

treinamento. Quando necessário foram dados estímulos manuais leves no trem

posterior dos animais como forma de estímulo para percorrer todo o caminho. Foi

registrado o tempo necessário para cada rato percorrer cada passagem pelo

circuito43, 88. Após o término das cinco passagens de cada animal pelo circuito, todos

os obstáculos e plataformas foram limpos com etanol 70%.

29

Figura 2. Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as

atividades acrobáticas.

4.3. Análise Comportamental

As análises comportamentais foram realizadas antes do início do

treinamento, na segunda semana e na última semana de treinamento nos 3

grupos estudados. Foi utilizado como instrumento de análise o “Rotarod”, que

permite avaliar alterações da coordenação motora e do equilíbrio89, 90. Este

aparelho foi projetado inicialmente para realizar medidas de déficits neurológicos

em roedores, e é o teste mais comumente utilizado para função motora dos

ratos89, 90. Este aparelho consiste em 4 cilindros de 7 cm de diâmetro, separados

por raias, que giram com uma velocidade que aumenta progressivamente a

cada 30 segundos. Após a queda dos ratos sobre a plataforma, o cronômetro

pára, gravando o tempo em que o animal permaneceu sobre o aparelho.

30

http://www.ugobasile.com/catalogue/product/47700_rat_rota_rod.html

Figura 3: Aparelho Rotarod utilizado para realização da análise comportamental

Os encéfalos de 35 dos 55 ratos foram processados pelo método de

“immunoblotting” e os dos outros 20 animais analisados pela técnica de imuno-

histoquímica.

4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica

Os animais dos 3 grupos foram anestesiados com ketamina (100mg/Kg) e

xilazina (25mg/Kg) por via intraperitonial e submetidos à perfusão transcardíaca,

com solução salina 0,9%, seguida de solução fixadora constituída de

paraformaldeído 2% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (PB 0,1M, pH 7,4). Após a

perfusão, os encéfalos foram coletados e armazenados em paraformaldeído 2%,

durante 4 horas. Após este período, o material foi transferido para uma solução

crioprotetora de sacarose a 30% em PB 0,1M. Após 36 horas, os tecidos foram

cortados em uma espessura de 30µm em um micrótomo deslizante de

congelamento.

Os cortes histológicos foram colocados em placa de cultivo, em solução

crioprotetora, e mantidos em freezer a -20ºC até o momento do procedimento de

imuno-histoquímica. Cortes contendo o córtex motor, o estriado e o cerebelo foram

selecionados e submetidos à metodologia de imuno-histoquímica com anticorpos

31

primários específicos para detecção de sinapsina I (anticorpo policlonal de coelho

dirigido contra proteína SYS – Chemicon, Temecula, CA, EUA), na concentração

1:1000, sinaptofisina (anticorpo policlonal de coelho contra proteína SYP –

DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) na concentração 1:1000, MAP2 (anticorpo

monoclonal de camundongo dirigido contra a proteína MAP2 – Chemicon,

Temecula, CA, EUA), na concentração 1:1000 e neurofilamentos (anticorpo

monoclonal de camundongo dirigido contra NF’s – Zymed Laboratories, San

Francisco, CA, EUA) na concentração de 1:2000. Como o anticorpo dirigido contra

NF (PAN) reconhece região homóloga dos três neurofilamentos, NF68, NF160 e

NF200, não foi possível distinguí-los com a imuno-histoquímica, mas apenas

quando analisados pela técnica de “immunoblotting”.

A imuno-histoquímica foi processada da seguinte forma: os cortes selecionados

foram lavados em tampão fosfato (PB 0,1M) por três vezes de 10 minutos, depois

incubados com anticorpos primários específicos para os anticorpos citados acima

diluídos em PB com 0,3% de Triton X-100 e 5% de soro normal do animal em que

foi feito o anticorpo secundário e mantido por um período de 14 a 18 horas à

temperatura ambiente (24ºC).

Os cortes foram então novamente lavados em PB 0,1M à temperatura ambiente

e incubados por duas horas com anticorpo secundário biotinilado anti-coelho feito

em cabra para anti-SYS, anti-coelho feito em burro para o anti-SYP, anti-

camundongo feito em cabra para o anti-NF e anti-camundongo feito em burro para o

anti-MAP2, diluídos a 1:200 em PB contendo 0,3% de Triton-X-100. Após nova série

de lavagens à temperatura ambiente, os cortes foram colocados por duas horas em

uma solução contendo o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC ELITE kit,

Vector Labs.). Após nova série de lavagens, os cortes foram imersos num meio

contendo 3-3’diaminobenzidina (DAB- Sigma-Aldrich) 0,05% em tampão fosfato

0,1M por cerca de 5 minutos. A seguir foram acrescentados 3 ml de solução de

H2O2 a 0,3% em água destilada, mantendo-se os cortes neste banho sob agitação

constante até que a reação fosse evidenciada. Atingida a imunorreatividade

desejada com a coloração marrom clara, os cortes foram removidos da solução com

DAB e imersas em tampão PB 0,1M. Depois de nova série de lavagens em tampão

fosfato 0,1M com o objetivo de parar a revelação e remoção do excesso de

reagente, os cortes foram montados sobre lâminas de vidro gelatinizadas e

32

colocadas em placa quente. Após secarem, foram hidratadas em água destilada por

1 minuto, banhadas em solução de tetróxido de ósmio 0,1% por 15–30 segundos,

desidratadas por uma série de álcoois em concentrações crescentes, com Hemo-De

(Fisher) e cobertas com lamínulas, tendo como meio de montagem o Permount

(Sigma). A análise qualitativa do material e as quantificações por densitometria

foram realizadas com a utilização do microscópio óptico (E1000, Nikon) acoplado à

câmera digital e programa Nikon Imaging Software ACT-U.

A análise da densidade óptica relativa foi realizada em 4 animais de cada grupo.

Para cada animal analisamos 4 cortes dos quais foram capturados 8 campos do

córtex motor e do cerebelo, e 12 campos do estriado. As regiões do córtex foram as

M1 e M2, sendo analisada a camada V e suas imediações. No estriado foram

analisados campos das regiões dorsomedial e dorsolateral. E por fim, foi

selecionada a região paramediana do cerebelo, onde foi analisado as camadas

molecular e granular do córtex cerebelar.

As imagens foram analisadas utilizando o programa Image J (NIH).

4.5. Protocolo de “Immunoblotting”

Os animais dos 3 grupos foram decapitados e as áreas do encéfalo a serem

avaliadas foram rapidamente coletadas, congeladas em nitrogênio líquido e

armazenadas a -80ºC até o uso. As amostras foram homogeneizadas a 4ºC em

tampão de extração (Tris pH 7,4 100mM, EDTA 10mM, PMSF 2nM e aprotinina

0,01mg/ml). Os homogenatos foram centrifugados por 20 minutos a 12.000 rpm em

uma centrífuga refrigerada a 4ºC. O sobrenadante foi separado do “pellet”, uma

pequena amostra deste foi utilizada para determinação do conteúdo proteico, e o

restante tratado com tampão Laemmli contendo DTT 100mM91, fervido em banho-

maria por 5 minutos e armazenado. O conteúdo proteico do material isolado dos

diferentes grupos de animais foi dosado pelo método de Bradford (Amresco, U.S.A.) 92. Quantidades equivalentes a 100 microgramas de proteínas das amostras

armazenadas em Laemmli foram submetidas a separação por eletroforese com

corrente constante de 25mA em géis de acrilamida de 6,5% e 8% contendo dodecil

sulfato de sódio SDS (Bio-Rad, EUA). Após a separação eletroforética, as proteínas

foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Millipore, 0,2um de

33

diâmetro) de acordo com a técnica descrita por Towbin et al. 93. Após bloqueio com

leite desnatado (Molico, Nestlé) 5% em tampão Tris-Salina (Tris 10mM e NaCl

0,15M, pH 7,5) por 2 horas, as membranas foram incubadas com os mesmos

anticorpos utilizados na imuno-histoquímica, além do anticorpo contra β-actina

(1:10.000). Em seguida, as membranas foram lavadas com Tris-Salina e incubadas

por 2 horas com um anticorpo secundário marcado com peroxidase (Amersham

Biosciences) ou biotinilados (Vector Laboratories, Burlingame), diluído a 1:10000 ou

1:1000 em solução bloqueadora, respectivamente. O excesso de conjugado foi

removido com mais um ciclo de lavagens e os antígenos foram revelados com

solução de avidina-biotina-peroxidase, para os anticorpos biotinilados (ABC, Vector

Laboratories, Burlingame) por 1 hora. Para os anticorpos secundários marcados

com peroxidase, as membranas foram reveladas utilizando o Kit ECL (Amersham

Biosciences) de quimioluminescência. As membranas foram então incubadas com

solução “stripping” por 20 minutos à temperatura ambiente e um anticorpo contra β-

actina (Sigma, St.Louis, MO, EUA) foi utilizado como controle para quantificar a

concentração da proteína total aplicada nos géis. As bandas foram escaneadas e

analisadas quanto à densidade óptica da imunorreatividade utilizando o programa

Image J (National Institutes of Health/USA). Dos dados obtidos realizou-se uma

razão entre a densidade óptica de cada uma das proteínas estruturais (MAP2 e

NF68) e sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) com a β-actina, e estes dados foram

então submetidos às análises estatísticas. Os dados representados nos gráficos

foram normalizados pelo grupo controle/sedentário que assumimos ser 1, ou seja,

100%.

4.6. Análise Estatística

Os dados de densidade óptica relativa e níveis relativos de proteína obtidos

foram submetidos à análise estatística com o uso do software GraphPad Prism 5. As

comparações entre os grupos foram conduzidas a partir do teste ANOVA para

medidas repetidas, seguida do pós-teste de Tukey quando a análise de variância

apresentou diferença estatisticamente significante. Os dados estão apresentados

em termos de média e erro padrão. Para todos os testes, o nível de significância

assumido foi de p≤0,05.

34

5. RESULTADOS

5.1. Análise Comportamental

5.1.1. Performance Motora

Após 4 semanas de treinamento de exercício acrobático, os animais registraram

uma redução significativa do tempo necessário para executar todo o circuito

(p<0,001) (Figura 4). A redução significativa foi registrada a partir da segunda

semana de treinamento e persistiu até o final das 4 semanas.

Figura 4. Desempenho dos ratos no treinamento de exercícios acrobáticos avaliado

pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no circuito

por semana. ***p<0,001.

5.1.2. Desempenho Comportamental no Rotarod

De acordo com a avaliação feita pelo Rotarod (Figura 5) os ratos pertencentes

aos grupos de exercício na esteira, exercício acrobático e sedentários mostraram

padrões semelhantes de coordenação motora no início do estudo. Pode-se observar

ainda que após 2 semanas de treinamento os grupos EE e AC obtiveram um

35

aumento significativo (p<0,05 e p<0,03, respectivamente) no tempo de permanência

no aparelho quando comparado aos seus valores iniciais, e este aumento persistiu

até o final da quarta semana (p<0,01). Já o grupo controle não apresentou diferença

no tempo de permanência no Rotarod nos três momentos de análise. Ao final do

período de treinamento os grupos AC e EE permaneceram por um tempo

significativamente maior no aparelho que os ratos sedentários (p<0,05), revelando

uma melhora no desempenho quanto ao equilíbrio e coordenação motora. Não foi

observada diferença estatisticamente significante entre os grupos treinados.

Figura 5. Tempo de permanência no aparelho Rotarod avaliado no início do

treinamento (I), 2 semanas após (M) e ao final do treinamento (F). *p<0,05, **p<0,03

e ***p<0,001.

5.2. Expressão de Proteínas

Alguns dados de “immunoblotting” corroboram com os da imuno-histoquímica e

outros não (tabela 1). Deve-se ressaltar que a técnica de imuno-histoquímica

permite uma análise dos tipos e localização das estruturas imunorreativas,

selecionando camadas específicas do córtex e subdivisões medial e lateral do

estriado, enquanto a de “immunoblotting” analisa o conteúdo proteico de toda a

estrutura removida do encéfalo, podendo assim diluir as mudanças obtidas numa

região específica de uma determinada estrutura.

36

32

35

37


Quanto às proteínas estruturais, a imunorreatividade produzida pelo anticorpo

MAP2 se apresentou ao longo das neurópilas, em forma difusa por toda a camada V

do córtex motor primário e secundário dos animais estudados (Figura 6). Análise da

densidade óptica relativa nessa região cortical revelou um aumento estatisticamente

significante de imunorreatividade no grupo AC em relação aos outros dois grupos

(Figura 6).

Os dados de “immunoblotting” corroboram com esses resultados, mostrando um

aumento dos níveis proteicos no grupo AC. Nesta região, os NFs foram expressos

em processos e corpos celulares, sendo identificado também um decréscimo

estatisticamente significativo da densidade óptica relativa no grupo treinado em

esteira em relação ao grupo AC (Figura 7). Os dados de “immunoblotting” revelaram

uma diminuição estatisticamente significante nos níveis proteicos dos NFs 160 e 200

no grupo EE em relação aos outros dois grupos. Já o nível de expressão de NF68

no córtex não mostrou alteração significativa entre os grupos (Figura 7).

A SYS e SYP são expressas de forma difusa, revelando uma marcação

citoplasmática, além dos corpos celulares (Figuras 8 e 9). No grupo EE, observamos

um aumento estatisticamente significante da densidade óptica relativa de SYS em

relação ao outros dois grupos (Figura 8).

Já a densidade óptica relativa de SYP mostrou-se significativamente aumentada

tanto no grupo AC quanto no grupo EE comparada ao grupo controle (Figura 9).

Entretanto, os dados de “immunoblotting” não revelaram alteração significativa

dessas duas proteínas sinápticas entre os grupos estudados (Figuras 8 e 9).

42

5.2.2. Estriado

No estriado dos três grupos estudados, a proteína MAP2 foi expressa ao longo

da neurópila de forma difusa por toda extensão rostro-caudal e médio-lateral (Figura

10). A imunorreatividade para MAP2 no estriado apresentou um aumento

estatisticamente significativo na região dorsomedial do grupo AC em relação ao

outros grupos, e na região dorsolateral em relação ao EE (Figura 10). Estes dados

corroboram com os dados de “immunoblotting”, onde houve um aumento

estatisticamente significante da expressão de MAP2 no grupo AC em relação ao

grupo EE e ao grupo controle (Figura 10).

Já a proteína NF apresentou uma marcação de forma puntiforme e agrupada em

regiões onde possivelmente há a passagem de feixes nervosos (Figura 11). A

densidade óptica relativa de NF mostrou-se similar nos três grupos do estudo. Os

dados do “immunoblotting” demonstraram que o nível proteico de NF68 aumentou

significativamente nos grupos AC e EE comparado aos animais sedentários (Figura

11). NF’s com pesos moleculares de 160 e 200 KDa não foram detectadas nesta

estrutura.

As proteínas sinápticas SYS e SYP nesta região mostraram um padrão de

marcação puntiforme e difusa por todo o estriado (Figuras 12 e 13). A densidade

óptica relativa de SYS mostrou-se significativamente aumentada na região

dorsomedial dos grupos AC e EE comparados com o grupo controle. Enquanto, na

região dorsolateral os três grupos apresentaram níveis semelhantes de SYS (Figura

12). Já os dados de “immunoblotting” não revelaram alterações estatisticamente

significantes entre os grupos treinados e controle (Figura 12).

Quanto à SYP, os dados de imuno-histoquímica revelaram um aumento

estatisticamente significante na região dorsomedial no grupo AC em relação ao

grupo controle e na região dorsolateral esse aumento foi observado no grupo EE em

relação aos outros dois grupos (Figura 13). Dados de “immunoblotting” revelaram um

aumento significativo do nível de SYP no grupo AC em relação ao controle (Figura

13).

47

5.2.3. Cerebelo

No cerebelo dos três grupos de animais estudados foi observado que ambas as

proteínas estruturais apresentaram um padrão citoplasmático de marcação nas

células de Purkinje (Figura 14 e 15). Processos axonais e dendríticos ao longo das

camadas granular e molecular revelaram-se imunorreativos para MAP2 e NF. A

camada molecular do grupo EE mostrou um aumento significativo da densidade

óptica relativa de MAP2 quando comparada com os outros dois grupos (Figura 14).

Já a expressão de MAP2 na camada granular foi semelhante nos três grupos

estudados. Os dados de “immunoblotting” também demonstraram um aumento

estatisticamente significativo da expressão de MAP2 no grupo EE comparado aos

grupos controle e AC (Figura 14).

A análise da expressão de NF no grupo EE mostrou um aumento significativo da

densidade óptica relativa na camada granular e uma diminuição estatisticamente

significante na camada molecular em relação ao grupo controle (Figura 15). Dados

de “immunoblotting” não mostraram alterações de NF68 e NF160 entre os grupos do

estudo (Figura 15). NF200 não foi detectado nesta região.

As proteínas sinápticas no cerebelo dos grupos estudados mostraram um padrão

puntiforme de imunorreatividade entre as células de Purkinje, em aglomerados

difusos na camada molecular e esparsos na camada granular (Figura 16 e 17). Na

camada granular o grupo EE mostrou um aumento estatisticamente significante da

intensidade de marcação de SYS em relação ao grupo controle. Já na camada

molecular este aumento aconteceu nos grupos EE e AC quando comparados ao

grupo controle (Figura 16). Dados de “immunoblotting” não revelaram alterações

significativas de SYS entre os três grupos estudados (Figura 16).

A expressão de SYP nas camadas granular e molecular não apresentou

alterações estatisticamente significantes entre os grupos. O mesmo aconteceu com

os níveis relativos desta proteína demonstrados pelo “immunoblotting”, não havendo

alterações entre os grupos do estudo (Figura 17).

52

6. DISCUSSÃO

6.1. Comportamento

Uma característica que define a aprendizagem de uma habilidade motora é a

melhora do desempenho do comportamento aprendido38. Isto pode ser observado

nos ratos pertencentes ao grupo acrobático, que após o final da segunda semana de

treinamento já mostraram um decréscimo significativo no tempo necessário para

passar por todo o circuito e que permaneceu até o final do treinamento. Esta

redução do tempo de passagem pelo circuito também foi observada em outros

estudos com diferentes protocolos de treinamento. Kleim e colaboradores24

treinaram ratos adultos jovens por 30 dias consecutivos, 5 repetições pelo circuito

por dia e ao décimo dia observaram redução significativa do tempo gasto para a

realização dessa tarefa. Já no estudo realizado por Klintsova e colaboradores21, os

ratos treinaram por 1, 3, 5 ou 7 dias consecutivos com 3 repetições pelo circuito e

mostraram decréscimo progressivo e significativo após o quinto dia de treinamento.

Os estudos anteriores21, 24 mostraram que esta redução do tempo foi reflexo de uma

diminuição progressiva do número de erros (falha na colocação das patas, perda

aparente do controle motor) durante a passagem no circuito. A diminuição do tempo

gasto para percorrer o circuito observado no nosso estudo e nos citados acima pode

ser atribuída às mudanças comportamentais, tais como diminuição de hesitações e

dos estímulos manuais, sugerindo que os animais passaram pela fase de adaptação

a uma nova tarefa e estão caminhando para a etapa seguinte de consolidação e

aprendizado motor.

Além da performance motora avaliada neste estudo também foram avaliadas as

alterações de coordenação motora e equilíbrio nos ratos após os diferentes tipos de

treinamento utilizando o Rotarod. Os nossos dados revelaram que antes do início do

treinamento os ratos dos 3 grupos mostraram um padrão semelhante de

coordenação motora avaliado pelo Rotarod, e somente os ratos pertencentes ao

grupo de exercício na esteira de intensidade moderada e acrobático mostraram, a

partir da segunda semana, um aumento do tempo de permanência no aparelho. Os

ratos treinados tanto na esteira como em acrobacias mostraram que, após a

segunda semana de treinamento, obtiveram uma melhora de sua coordenação

53

motora e equilíbrio observado pelo aumento no tempo de permanência no Rotarod e

este aumento persistiu até o final das 4 semanas de treinamento. Estes dados

sugerem que as realizações de exercícios físicos sejam de caráter rítmico ou

complexo mostrou-se suficiente para desencadear uma melhora da coordenação

motora e equilíbrio. Entretanto, era de se esperar que os ratos submetidos a

exercícios acrobáticos permanecessem por mais tempo sobre o Rotarod, visto que

esses exercícios demandam maior coordenação motora e equilíbrio para serem

executados. Porém, observamos que não houve diferença entre os grupos treinados

neste quesito. Uma possível explicação para isto seria que o treinamento em esteira

privilegie uma atividade motora rítmica favorecendo a permanência desses animais

sobre o aparelho e, além disso, o Rotarod incrementa sua velocidade somente a

cada trinta segundos, não promovendo grandes instabilidades para os animais.

Assim, uma das limitações na avaliação comportamental foi o uso do aparelho

Rotarod que não se mostrou sensível o suficiente para avaliar possíveis diferenças

significativas entre os grupos treinados.

6.2. Mudanças nas proteínas estruturais e sinápticas

Exercício físico, independente da modalidade, foi capaz de promover mudanças

na expressão de proteínas sinápticas e estruturais nas áreas encefálicas estudadas

aqui. Diferentes tipos de exercícios (esteira e acrobático) promoveram mudanças

distintas tanto em relação às proteínas quanto às estruturas estudadas. Esses dados

reforçam a idéia de que o sistema nervoso é um órgão dinâmico com capacidade de

adaptar-se estruturalmente e funcionalmente frente a diferentes demandas motoras.

A análise dos resultados mostrou que animais treinados por 4 semanas,

independente do tipo de exercício, apresentaram maior aumento na expressão de

proteínas estruturais em relação a proteínas sinápticas.


No córtex motor, as proteínas estruturais apresentaram respostas distintas frente

aos diferentes tipos de treinamento. O exercício acrobático promoveu um aumento

54

da proteína MAP2 em relação aos outros dois grupos, enquanto o EE alterou a

expressão de NFs, reduzindo o seu nível, quando comparado ao grupo controle e ao

grupo AC. A expressão destas proteínas não foi diferente diante das duas técnicas

de análise, “immunoblotting” e imuno-histoquímica. Considerando que a proteína

estrutural MAP2 participa do crescimento da arborização dendrítica, estabelecimento

e manutenção da sinaptogênese, o aumento dessa proteína no córtex motor

primário e secundário no grupo AC sugere um remodelamento estrutural,

evidenciando um aumento na arborização dendrítica e um aumento da área de

contato sináptico numa região envolvida com o planejamento de movimentos mais

complexos. Derksen e colaboradores38 também demonstraram um aumento de

MAP2 nos animais treinados por 1, 3, 5 e 7 dias em quatro diferentes circuitos

acrobáticos progressivamente mais difíceis, mas esse aumento não estava

relacionado ao aumento da complexidade da tarefa. Estudos com mapeamento

cortical demonstraram que após treinamentos de novas habilidades motoras em

ratos e primatas ocorreu uma expansão da área cortical envolvida com os

movimentos utilizados para a realização dessas tarefas71, 72. O aumento da

expressão de MAP2 no córtex motor frente ao treinamento acrobático pode estar

envolvido no crescimento da árvore dendrítica e estabelecimento de novas sinapses,

resultando num aumento da área cortical envolvida no controle dessa atividade

motora.

Os animais do grupo EE apresentaram uma redução de NFs no córtex motor

quando comparado aos outros dois grupos estudados, com ambas técnicas

empregadas. Se considerarmos que esse tipo de exercício é facilmente aprendido e

automatizado, não havendo a necessidade de grande recrutamento desta região e

sim de outras áreas encefálicas12, 94, torna-se compreensível que a diminuição da

expressão de NFs no córtex motor faz parte do remodelamento axonal dos

neurônios dessa área. Além disso, de acordo com Holschneider e Maarek95, uma

possível atenuação da ativação do córtex motor em períodos mais tardios pode

ocorrer devido a habituação ao exercício. Ferreira e colaboradores12 já haviam

demonstrado uma redução do nível da expressão de NFs em animais que realizaram

exercício em esteira, porém após um curto prazo de treinamento (3 dias).

55

A expressão das proteínas sinápticas SYS e SYP no córtex motor dos animais

AC e EE não apresentou mudanças em relação aos animais sedentários quando

analisados pela técnica de “immunoblotting”; entretanto, quando analisadas pelo

método de imuno-histoquímica, observamos aumento significativo de SYS e SYP no

grupo EE e de SYP no grupo AC. Discrepâncias como essas são encontradas na

literatura, e a explicação mais plausível estão nas diferentes características das

metodologias empregadas. A ausência de mudanças nas expressões das proteínas

sinápticas corrobora com alguns estudos prévios12, 13 e são diferentes de outros que

mostraram um aumento da densidade sináptica no córtex motor de ratos treinados39,

40, 72, 96. O treinamento acrobático diário por 6 semanas não afetou a expressão dos

níveis de SYP no córtex motor de ratos adultos analisado pelo método de ELISA13;

da mesma forma, no estudo de Ferreira e colaboradores12, dados de

“immunoblotting” não mostraram alteração na expressão de proteínas sinápticas no

córtex motor de ratos treinados em esteira por um curto prazo de tempo (3, 7 e 15

dias). O fato de não encontrarmos mudanças dessas proteínas sinápticas frente a

esses dois tipos de treinamento pode ser devido ao método de análise empregado,

que quantifica estas proteínas por toda a estrutura, não sendo capaz de detectar

mudanças pré-sinápticas como as mostradas pelos outros estudos que utilizaram

análises morfológicas. Os nossos dados de imuno-histoquímica, revelando aumento

da expressão de SYS e SYP no córtex motor dos animais treinados, foram obtidos

com análises de densidade óptica relativa na camada V. Esses dados corroboram

com vários estudos que mostraram um aumento de sinapses por neurônio na

camada V em ratos que realizavam exercício acrobático comparados aos animais

controle39, 40, 72, 96, sugerindo que o treinamento acrobático foi capaz de induzir

sinaptogênese e potenciação sináptica em áreas corticais envolvidas com o

planejamento dessa atividade motora. Além disso, os nossos dados mostram que o

EE também induziu um possível aumento na eficiência sináptica na camada V do

córtex motor, decorrente do aumento da expressão das proteínas SYS e SYP nessa

região.

As respostas plásticas distintas desencadeadas pelos dois tipos de exercício

físico no córtex motor (M1 e M2), caracterizada por aumento da arborização

dendrítica e sinaptogênese na camada V no grupo AC e remodelamento axonal

56

gerado pela diminuição de NF com possível melhora simultânea da eficiência

sináptica na camada V no grupo EE sugere que o exercício acrobático necessitou de

um maior envolvimento do córtex motor tanto no planejamento dessas habilidades

complexas (ativação da área motora suplementar, M2) quanto na execução

(ativação da área motora primária, M1), enquanto o EE, de característica rítmica e

automática, necessitou somente da ativação da área motora primária (M1) para a

execução motora.

6.2.2. Estriado

Os exercícios físicos do tipo AC e EE promoveram alterações na expressão das

proteínas estruturais e sinápticas do estriado. Em relação às proteínas estruturais, o

treinamento AC induziu um aumento da expressão de MAP2 e NF68, enquanto o EE

aumentou somente NF68 no estriado, revelando um remodelamento dendrítico e

axonal, além do possível estabelecimento da sinaptogênese. O estriado é uma

estrutura encefálica envolvida tanto com a fase inicial do aprendizado de novas

habilidades e sequências motoras, como com a automatização dessas habilidades

motoras numa fase mais tardia77, 97. Sendo assim, esse padrão distinto de aumento

das proteínas estruturais entre o grupo AC e EE parece dar suporte aos diferentes

papéis exercidos pelo estriado na aquisição de uma habilidade motora complexa

exigida no treinamento acrobático e de consolidação ou automatização de uma

atividade motora rítmica presente na corrida em esteira78.

Nossos dados das proteínas sinápticas dos grupos AC e EE, obtidos pelo

método de “immunoblotting”, não demonstraram mudanças na expressão da SYS no

estriado dos animais treinados. Entretanto, o exercício acrobático foi capaz de

aumentar significativamente a expressão de SYP após 4 semanas treinamento. O

aumento de SYP no estriado pode ser decorrente do aumento de liberação de

glutamato que está diretamente relacionado à fosforilação da SYP, sugerindo uma

possível potenciação de longo prazo (LTP)98. A ausência de mudanças na

expressão de SYS no estriado do grupo EE é discordante do obtido por Ferreira e

colaboradores12 que demonstraram um aumento de SYS após 3 e 7 dias de

treinamento e retornando a níveis basais no décimo quinto dia de treinamento.

57

Esses dados parecem sugerir um maior envolvimento da SYS nos momentos inicias

de treinamento.

A imuno-histoquímica revelou um aumento da SYS e SYP nas regiões

dorsomedial e dorsolateral dos animais treinados, diferentemente dos dados de

“immunoblotting”. Esta discordância parece ser devida às diferentes formas de

reconhecimento e ligação dos anticorpos aos seus epítopos. Entretanto, esse

possível aumento da eficiência sináptica nessas regiões do estriado induzida pelo

treinamento de habilidades motoras estão de acordo com o incremento do potencial

excitatório pós-sináptico observados nos registros eletrofisiológicos do estriado de

camundongos submetidos a realização de habilidades motoras78.

Os dados de imuno-histoquímica apresentados aqui sugerem uma reorganização

estrutural e funcional do estriado dorsal dependente do tipo de atividades motoras

treinadas. Estudos realizados em primatas e roedores demonstraram envolvimento

de diferentes circuitos do estriado durante a fase inicial e a tardia do aprendizado de

uma habilidade motora78, 99. No nosso estudo observamos que o treinamento de

atividades motoras complexas no circuito acrobático induziu aumento de MAP2, SYS

e SYP na região dorsomedial do estriado; já o EE, que requer um padrão motor

rítmico e automático, promoveu aumento de SYS na região dorsomedial e de SYP

na região dorsolateral do estriado. O padrão de reorganização estrutural e funcional

do estriado demonstrado neste trabalho corrobora com estudos anteriores que

sugerem um papel funcional distinto para essas regiões dorsomedial e dorsolateral

com base na origem das suas aferências corticais, córtex de associação e sensório-

motor, respectivamente78, 99. Portanto, o estriado dorsomedial (homólogo ao

caudado em primatas) parece estar preferencialmente envolvido nos estágios iniciais

do aprendizado de habilidades motoras, enquanto o dorsolateral (homólogo ao

putâmen em primatas) parece estar envolvido com a consolidação e automatização

motora78, 99.

Desta forma, os nossos achados com o treinamento acrobático sugerem que a

região dorsomedial do estriado está envolvida com o controle de ações motoras

complexas e dirigida a um alvo, e a dorsolateral do estriado, modificada pelo EE,

envolvida com respostas motoras habituais e automáticas.

58

Ao notarmos que também há uma alteração de menor proporção, mas

mostrando um aumento de MAP2 na região dorsolateral também no grupo AC,

sugerimos que, por se tratar de um treinamento realizado a longo prazo, a região

relacionada a automatização motora, também já comece a sofrer alterações,

tornando-os automáticos. Apesar de somente os dados de “immunoblotting”

evidenciaram alterações de NF68 no estriado, podemos concluir que ambos os tipos

de treinamento conseguiram promover um remodelamento, causando um possível

aumento do diâmetro axonal. Vários estudos também mostraram outras alterações

plásticas nesta região provocadas pela realização de EE e AC a curto e/ou a longo

prazo, como aumento de astrócitos, angiogênese36, da neurotransmissão

dopaminérgica89, e de receptores de glutamato do tipo AMPA (subunidade GluR1)22.

6.2.3. Cerebelo

As maiores alterações encontradas nessa estrutura foram provocadas pela

realização de exercícios em esteira de intensidade moderada, quando comparada

ao exercício acrobático. Os dados de “immunoblotting” mostraram um aumento na

expressão de MAP2 no grupo EE e, quando analisadas separadamente as camadas

molecular e granular pela técnica de imuno-histoquímica, observamos que o

acréscimo no nível de expressão de MAP2 ocorreu na camada molecular. Esse

aumento de MAP2 na camada molecular, local onde são encontrados os dendritos

das células de Purkinje, das células de Golgi e das células em cestos e estreladas,

mostra que este tipo de exercício é capaz de gerar um aumento da arborização

dendrítica, aumentando a área de contato sináptico destas células com as fibras

trepadeiras e musgosas. Black e colaboradores88 observaram que ratos submetidos

a exercício em esteira por 30 dias consecutivos promoveram um aumento do fluxo

sanguíneo no córtex cerebelar do lóbulo paramediano. Este aumento da área de

ativação do córtex cerebelar pode ser devido a um aumento de sinapses que estão

ocorrendo nesse local. Nossos dados mostram que o aumento de MAP2 provocado

pelo EE pode ser um dos substratos estruturais responsáveis por essa maior

ativação.

59

A outra proteína estrutural, NF, mostrou alterações induzidas pelo EE apenas

quando analisamos sua expressão nas camadas específicas (CM e CG), e não na

estrutura como um todo (“immunoblotting”). Mudança na expressão de NF no

cerebelo observada por “immunoblotting” foi observada após curto período de

treinamento em esteira retornando aos níveis controle após 15 dias12. Já dados de

imuno-histoquímica revelaram aumento de NF na camada granular do lóbulo

paramediano do cerebelo do grupo EE, demonstrando uma restruturação axonal

com um possível aumento no calibre e/ou extensão dos axônios nessa região.

Portanto, o emprego de diferentes técnicas pôde demonstrar que o EE foi capaz de

promover alterações desta proteína, quando realizado tanto a curto como a longo

prazo.

A alteração da proteína sináptica sinapsina I também só foi evidenciada com a

técnica de imuno-histoquímica. Um aumento da expressão dessa proteína foi

observado nos grupos AC e EE, sendo essas alterações vistas na camada molecular

no grupo AC e nas camadas granular e molecular no grupo EE. Um aumento desta

proteína também foi observado com outro protocolo de EE, quando ratos foram

submetidos a EE por 7 e 15 dias consecutivos12. Como a SYS está envolvida na

liberação de neurotransmissores no terminal nervoso, esta alteração pode então

sugerir uma maior eficiência sináptica nesta região. Estudos mostraram que o

exercício acrobático é capaz de promover sinaptogênese24, 42, 88, como observado

por Kleim e colaboradores, onde animais submetidos a 30 dias consecutivos de

acrobacias apresentaram um aumento do número de sinapses por célula de

Purkinje24. Nossos dados mostraram um aumento da densidade óptica relativa

apenas de SYS na camada molecular no grupo AC, não sendo suficiente para apoiar

os achados obtidos por Kleim e colaboradores24. Uma possível explicação para isto

é que as metodologias de análise empregadas foram distintas e, além disso, a

frequência de treinamento utilizada por Kleim e colaboradores24 foi de 30 dias

consecutivos, quando o nosso foi 3 vezes por semana durante um mês. Entretanto,

esse possível aumento da eficiência sináptica na camada molecular cerebelar do

grupo acrobático pode ser decorrente da intensa coordenação motora necessária

para realização destas tarefas acrobáticas.

60

Nossos dados mostram então que o exercício realizado em esteira, que é um

exercício rítmico, automatizado, conseguiu provocar uma grande ativação no

cerebelo, seja através de sinaptogênese, observada pelo aumento de proteínas

estruturais, como também pelo aumento da eficiência sináptica sugerida pelo

aumento de SYS.

6.2.4. Circuitos núcleos da base-tálamo-cortical X cerebelo-tálamo-

cortical

Nossos dados demonstram que modalidades diferentes de exercícios físicos

promovem mudanças distintas em regiões que estão presentes nos circuitos

motores. O exercício acrobático, que requer maior atenção, planejamento e

orientação, necessitando de um início voluntário para realização do movimento

(tarefa internamente guiada - IG) produziu mudanças plásticas estruturais e

funcionais no circuito núcleos da base-tálamo-cortical como um substrato para a

aquisição de uma nova e complexa habilidade motora. Por outro lado, o exercício

realizado em esteira, que é composto por movimentos rítmicos já aprendidos e

automatizados, guiados externamente, produziu mudanças no circuito cerebelo-

tálamo-cortical.

Holschneider e colaboradores77 mostraram que a realização de exercício em

esteira por 6 semanas promove aumento do fluxo sanguíneo em áreas

correspondente ao circuito cerebelo-tálamo-cortical. Lewis e colaboradores33

propuseram que os circuitos núcleos da base-tálamo-cortical e cerebelo-tálamo-

cortical trabalham em equilíbrio, e durante a realização de tarefas IG há uma

dominância na ativação do circuito núcleos da base-tálamo-cortical e um pequeno

recrutamento do circuito cerebelo-tálamo-cortical. Quando a tarefa é externamente

guiada ou automática, por outro lado, ocorre a predominância do circuito cerebelo-

tálamo-cortical com recrutamento do circuito núcleos da base-tálamo-cortical33.

Podemos observar nos nossos dados que as alterações sofridas pelas proteínas

estruturais e sinápticas no cerebelo, estriado e córtex motor mostraram-se de acordo

com essa organização neural proposta por Lewis33, onde as maiores alterações

ocorridas no grupo AC foram vistas nas áreas presentes do circuito núcleos da base-

61

tálamo-cortical, enquanto que no grupo EE foram vistas nas regiões presentes do

circuito cerebelo-tálamo-cortical. Porém, os nossos dados parecem sugerir o início

de uma maior ativação do circuito cerebelo-tálamo-cortical no grupo AC após longo

período de treinamento revelado pelo aumento do MAP2 no estriado dorsolateral e

SYS na camada molecular do cerebelo. A somatória dessas informações podem

indicar a passagem da fase de adaptação de uma nova habilidade motora para a

consolidação desta aprendizagem.

7. CONCLUSÃO

Nossos dados mostram que as diferentes modalidades de exercícios

empregadas neste estudo foram capazes de gerar respostas comportamentais e

neurais. O exercício acrobático promoveu aumento das proteínas estruturais e

sinápticas no córtex motor e estriado, suportando o envolvimento dessas regiões no

processo de aprendizagem de novas habilidades motoras. O exercício em esteira,

por outro lado, promoveu alterações mais difusas, aumentando a expressão de

proteínas sinápticas e estruturais no córtex motor, estriado e cerebelo. Esses

resultados confirmam que o tipo de exercício é um fator determinante de quais

regiões encefálicas são mais afetadas e sugerem que as diferentes proteínas estão

relacionadas com esta plasticidade. O entendimento da relação entre os diferentes

tipos de exercícios, mecanismos neurais da plasticidade e mudanças no

comportamento motor podem facilitar na determinação de possíveis intervenções

terapêuticas.

62

8. REFERÊNCIAS

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73

ANEXO I

74

ANEXO II

Artigo submetido

75

Different protocols of physical exercise produce

different effects on synaptic and structural proteins in

motor areas of the rat brain

Priscila C. Garcia1, Caroline C. Real2, Ana F. B. Ferreira2, Sandra R. Alouche1, Luiz R.

G. Britto2, Raquel S. Pires1

Physical Therapy Graduate Program, City University of São Paulo, São Paulo, SP,

Brazil; 2Department of Physiology and Biophysics, Institute of Biomedical Sciences,

University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.

Corresponding author:

Raquel S. Pires Laboratory of Neuroscience and Motor Activity Physical Therapy Graduate Program City University of São Paulo R. Cesário Galeno, 448/475 São Paulo, SP 03071-000, Brazil Phone: 55-11-2178-1479 E-mail address: [email protected]

76

ABSTRACT

The plastic brain responses generated by the training with acrobatic exercise (AE) and

with treadmill exercise (TE) may be different. We evaluated the protein expression of

synapsin I (SYS), synaptophysin (SYP), microtubule-associated protein 2 (MAP2) and

neurofilaments (NF) by immunohistochemistry and Western blotting in the motor cortex,

striatum and cerebellum of rats subjected to TE and AE. Adult male Wistar rats were divided

into 3 groups: sedentary (Sed) (n=15), TE (n=20) and AE (n=20). The rats were trained 3

days/week for 4 weeks on a treadmill at 0.6 Km/h, 40 min/day (TE), or moving through a

circuit of obstacles 5 times/day (AE). The rats from the TE group exhibited a significant

increase of SYS and SYP in the motor cortex, of NF68, SYS and SYP in the striatum, and of

MAP2, NF and SYS in the cerebellum, whereas NF was decreased in the motor cortex and

molecular layer of the cerebellar cortex. On the other hand, the rats from the AE group

showed a significant increase of MAP2 and SYP in the motor cortex, of all four proteins in the

striatum, and of SYS in the cerebellum. In conclusion, AE induced changes in the expression

of synaptic and structural proteins mainly in the motor cortex and striatum, which may

underlie part of the learning of complex motor tasks. TE, on the other hand, promoted more

robust changes of structural proteins in all three regions, especially in the cerebellum, which

is involved in learned and automatic tasks.

Keywords: treadmill exercise; acrobatic exercise; synaptic plasticity; structural plasticity;

striatum; cerebellum; motor cortex.

77

1. INTRODUCTION

Exercise induces several positive effects in the central nervous system of humans

(Dustman et al., 1990; Lupinacci et al., 1993) and animals (Ferreira et al., 2010; Ferreira et

al., 2011; Kleim et al., 1996; Kleim et al., 1997; Real et al., 2010), such as improvement of

learning, memory and plasticity (Lambert et al., 2005; van Praag et al., 1999a; Vaynman et

al., 2006), increased neuronal activation (Holschneider et al., 2007; Lewis et al., 2007) and

neurogenesis (Ferreira et al., 2011; van Praag et al., 1999a; van Praag et al., 1999b).

Changes of neurotransmitters and their receptors (Del Arco et al., 2007b; Real et al., 2010)

and of the expression of genes related to synaptic plasticity (Ferreira et al., 2010; Molteni et

al., 2002), which are responsible for changing the number, structure and function of neurons

(Ang et al., 2006; van Praag et al., 1999a), have also been observed.

Voluntary, treadmill and acrobatic exercise (VE, TE and AE, respectively) induce distinct

plastic responses in different brain regions (Kleim et al., 2002; Klintsova et al., 2004;

Vaynman et al., 2006). Studies using electron microscopy have shown that animals

submitted to all three of these modalities presented plastic changes in the cerebellum and

motor cortex. In the cerebellum, for example, there was an increase of the number of

synapses of parallel fibers and Purkinje cells and an increased number of synapses per

Purkinje cell, higher in the AE than the VE. This increase persisted with time (Black et al.,

1990; Kleim et al., 1997; Kleim et al., 1998b). Furthermore, it was observed that the AE

group completed the designated tasks in less time, indicating a substantial gain of motor

abilities (Kleim et al., 1996; Kleim et al., 2002).

A series of studies have focused on the participation of synaptic (Ferreira et al., 2010;

Lambert et al., 2005; Vaynman et al., 2004) and structural proteins (Derksen et al., 2007;

Ferreira et al., 2010; Ferreira et al., 2011) in exercise-induced plastic changes. Microtubule-

associated protein 2 (MAP2) and synaptophysin (SYP) have been studied after short-term

AE and increases of SYP have been observed in the motor cortex, possibly related to the

first 5 days of learning a motor skill. MAP2 changes, on the other hand, did not seem to

increase according to the duration or difficulty of the acrobatic training (Derksen et al., 2007).

Other authors have also reported increases of NF68, SYS and SYP in the striatum after

short-term TE, which was accompanied by increases of SYS and NF68 in the cerebellum

and a decrease followed by increase of NFs in the motor cortex (Ferreira et al., 2010).

Learning a new motor skill can induce dendritic reorganization, synaptogenesis and

changes of synaptic morphology, which requires protein synthesis (Derksen et al., 2007).

Training rats on a novel motor task can be an effective option to study the brain motor

78

circuits in response to learning. A distinction has been made between tasks that require a

high amount of attentional guidance (skilled training, internally guided) and those that do not

(overlearned, automatic, and externally guided), and each has been linked with different

patterns of functional brain activation and recruitment of different motor circuits (Adkins et al.,

2006; Holschneider et al., 2007). In addition, it is becoming increasingly recognized that no

single exercise paradigm is likely to fulfill all therapeutic needs (Cotman and Berchtold,

2007).

Various exercise protocols have been used to study its beneficial effects, such as

acrobatic exercise, wheel running, and treadmill exercise of low to high intensity, continuous

or intermittent, and of short and long duration (Ferreira et al., 2010; Kleim et al., 1997; Real

et al., 2010). Enriched environments have also been used, and all these modalities have the

purpose of investigating specific exercise-induced plastic changes that occur in different

brain regions (Del Arco et al., 2007a; Mora et al., 2007). We evaluated here if TE and AE

could change structural and synaptic proteins in the same fashion in different motor areas of

the rat brain. This could be used to help understanding how different regions of the brain

contribute to the motor learning process triggered by different exercise modalities and how

this could contribute to the development of therapeutic strategies.

2. RESULTS

2.1. Balance and Coordination

Using the Rotarod to evaluate motor skills, we observed that all groups presented the

same level of motor skills in the initial evaluation. On the second week of training, we could

observe that both exercise groups significantly increased the time spent on the Rotarod (AE:

p<0.01; TE: p<0.001) and this increase persisted until the fourth week of training (AE:

p<0.05; TE: p<0.001) (Fig. 1). We did not observe, however, differences between the two

exercise modalities used here in this evaluation.

2.2. Acrobatic Performance

After 4 weeks of AE, the animals presented a significant reduction of the time necessary

to complete the AE task (p<0.01) (Fig. 1). This reduction was observed after the second

week of AE training and persisted for all evaluation periods until the end of the 4 weeks of

training. We also observed that the animal hesitated less from one obstacle to the other and

consequently less manual guidance was used.

79

2.3. Protein Expression

Protein expression of MAP2, NF, SYS and SYP in the three brain regions studied here

was evaluated using immunohistochemistry and Western blotting. The results of these

analyses are summarized in Table 1 and described in detail below.

Table 1 about here.

2.3.1. Motor Cortex

In the motor cortex, the staining for MAP2 was present along the neuropil throughout

layer V of the primary and secondary motor cortices, with a significantly higher intensity of

staining in the AE group (p<0.03). The staining of NFs, on the other hand, was observed

along the neuropil and perikarya and was significantly less intense in the TE group in relation

to the AE group (p<0.05). Protein analysis of the motor cortex corroborated with the

immunohistochemistry findings, as we observed increased levels of MAP2 after AE (p<0.03)

and decreased levels of NF160 and NF200 after TE (p<0.001 and p<0.03, respectively) with

no changes for NF68 (Fig. 2).

Figure 2 about here.

The staining for SYS and SYP exhibited a cytoplasmic pattern throughout the motor

cortex and we observed higher intensity of staining of SYS in the TE group (p<0.03),

whereas a higher intensity of staining of SYP was observed in both exercised groups

(p<0.03). Protein analysis, however, did not show any changes of synaptic proteins in the

motor cortex (Fig. 3).


2.3.2. Striatum

In the striatum, we observed staining for MAP2 along the neuropil throughout the rostro-

caudal striatum, especially in the medial region. The intensity of the staining for MAP2 was

higher in the dorsomedial striatum of the AE group (p<0.03) and also in the dorsolateral

striatum in relation to the TE group (p<0.05). As for the staining of NFs, we observed a

punctate pattern gathered in bundles where axons pass throughout the region, with no

differences among the groups. Protein analysis of the striatum revealed increases of MAP2

and NF68 protein levels after AE (p<0.03 and p<0.05, respectively), whereas TE increased

only NF68 protein levels (p<0.001) (Fig. 4).


80

The staining for SYS and SYP in this region exhibited a diffuse punctate pattern of

staining throughout the striatum. The intensity of staining for SYS was significantly higher in

the dorsomedial striatum in both exercised groups (p<0.03). As for the staining of SYP, the

intensity was significantly higher in the dorsomedial striatum of the AE group (p<0.05) and in

the dorsolateral striatum of the TE group (p<0.03). The protein analysis of these synaptic

proteins revealed increases only of SYP after AE (p<0.05), whereas SYS remained

unchanged. (Fig. 5).


2.3.3. Cerebellum

In the cerebellum, we observed a cytoplasmic pattern of staining of the Purkinje cells for

both MAP2 and NFs. On the granular and molecular layers we observed staining along the

axons and dendrites. This staining of neuropil and perikarya was observed throughout the

cerebellum. The dendrites immunoreactive for MAP2 were in the innermost region of the

molecular layer, proximal to the Purkinje cell dendrites, and extend diffusely throughout the

molecular layer, where we observed a higher intensity of staining in the TE group (p<0.03).

The staining for NFs was also diffusely distributed in the granular layer, where we observed a

higher intensity of staining in the TE (p<0.05), and in the molecular layer, where we observed

a lower intensity of staining in the TE group (p<0.05). Protein analysis of the cerebellum

revealed an increase of MAP2 levels after TE (p<0.001), whereas NF68 levels remained

unchanged and AE did not produce changes of either protein in this region (Fig. 6).


As for the synaptic proteins studied, we observed a punctate pattern of staining for both

SYS and SYP among the Purkinje cells, and a diffusely distributed staining along the

molecular layer. Little staining was observed in the granular layer. We were able to observe

higher intensity of staining for SYS in the granular layer of the TE group (p<0.03) and in the

molecular layer of both AE and TE groups (p<0.03). Protein analysis, however, did not show

any changes for either synaptic protein in the cerebellum (Fig. 7).


3. DISCUSSION

Our results show that, independently of the modality, physical exercise was able to

induce improvement of motor skills and changes of protein expression in the motor brain

81

areas studied here. However, these changes were distinct for treadmill and acrobatic

exercise, varying according to the brain region and proteins studied.

3.1. Behavioral analysis

Both AE and TE groups increased the time spent on the Rotarod, starting in 2 weeks of

exercise, whereas the sedentary group did not increase its scores. This suggests

improvement of coordination and balance of these rats in response to AE and TE and this

improvement persisted until the end of the exercise protocols. Since acrobatic exercises

demand more motor skills, such as balance and coordination, we expected the AE group to

spend more time on the Rotarod than the TE group. However, this did not happen, as the TE

group presented the same scores as the AE group. We hypothesize that, since the treadmill

is a rhythmic activity similar to the cylinders of the Rotarod, and the speed increments of the

Rotarod happen only every 30 seconds, this might not have caused enough instability.

Therefore, the Rotarod evaluation might not have been sensitive enough to differentiate the

balance and coordination improvements caused by the treadmill and acrobatic exercise.

One of the characteristics that define learning of a motor ability is the improvement of

performance to complete the learned task/behavior (Derksen et al., 2007). We observed

evidence of further motor learning of our AE rats, as they were able to complete the acrobatic

circuit in less time and with less hesitation 2 weeks after the beginning of the protocol. This

reduction of the time necessary to complete an acrobatic circuit has also been observed by

other groups using different training protocols. Kleim et al (1998) trained young adult rats for

30 consecutive days, during which the rats repeated the circuit task 5 times each day and by

the 10th day of training they were able to observe a reduction of the time necessary to

complete this task. Klintsova et al (2004), however, trained their rats for 1, 3, 5 or 7

consecutive days, during which the rats repeated the circuit task 3 times each day, and

observed that the time necessary to complete the task progressively decreased after the 5th

day of training. Furthermore, these previous studies have shown that the reduction of the

time necessary to complete an acrobatic circuit is due to the progressive reduction of the

number of mistakes along the circuit (misplacement of the paws, deficient motor control)

(Kleim et al., 1998b; Klintsova et al., 1998).

3.2. Changes in protein expression

The present study also showed that the different types of exercise training induced

distinct changes of MAP2, NFs, SYS and SYP in the various brain regions studied. In

addition, we could also observe that the structural proteins underwent more general changes

82

in all brain regions studied, as we could find changes in protein levels by Western blotting,

whereas the changes of synaptic proteins were detected more frequently by

immunohistochemistry, as these were only focal changes. It is noteworthy, that these two

methods offered complementary data facilitating a global comprehension.

3.2.1. Motor cortex

Our results in the cortex showed increased MAP2 and SYP after AE and decreased

levels of NF160 and NF200, and increased SYS and SYP after TE.

Increased MAP2 has also been observed by other groups in regions such as the

hippocampus after short-term treadmill exercise (Ferreira et al., 2011) and the motor cortex

after different types of acrobatic training (Derksen et al., 2007). In the latter study, the

authors evaluated the expression of MAP2 in the motor cortex of adult rats submitted to 4

different acrobatic circuits of increasing complexity for 1, 3, 5 and 7 days. They observed that

MAP2 protein levels increased, although there was no correlation between the protein levels

and the complexity of the circuit. Studies of new motor skill learning exhibited a significant

increase in mean area of movement representations (Kleim et al., 1998a) and increased

synaptic density within the rodent motor cortex (Jones et al., 1999). Increased MAP2 and

SYP in the motor cortex after acrobatic training can be involved in dendritic arborization

growing and synaptogenesis that are consistent with an expansion and higher activation of

motor cortex in association with motor skill learning.

There is still scarce data on changes of neurofilaments in response to exercise (Ding et

al., 2006; Ferreira et al., 2010; Ferreira et al., 2011). We did, however, observe decreased

protein levels of NF160 and NF200 after TE in the motor cortex. Ferreira et al. (2010)

observed decreased levels of NF68 e NF160 after 3 days and increased levels of NF68 after

15 days of treadmill exercise in the motor cortex and brainstem (specifically the reticular

formation). Since treadmill exercise should be automated relatively fast and should stimulate

other brain regions (Holschneider and Maarek, 2008), this is in accordance with decreased

NF expression that support a possible attenuation of the motor cortex activation occurred at

a later time due to habituation. On the other hand, increased SYS and SYP in the motor

cortex after TE was observed only by immunohistochemistry, that was able to detect focal

changes. Both SYS and SYP are associated to neurotransmitter release and are responsible

for the formation and anchoring of synaptic vesicles, as well as contributing to a fast and

efficient neurotransmission (Vaynman et al., 2006).

In summary, increased MAP2 and SYP in the motor cortex after AE and decreased NFs

and increased SYS and SYP after TE could be interpreted as a distinct cortical

83

reorganization influenced by different types of motor activity. AE induced an increased

plasticity possibly due to the fact that this region is involved in the planning and execution of

complex movements (M2 and M1, respectively). TE, on the other hand, which is a rhythmic

and automatic activity, may need mainly the primary motor cortex (M1) activation to be

executed.

3.2.2. Striatum

Moderate treadmill exercise, as well as protocols designed to promote learning of a new

motor skills are widely used to demonstrate plastic changes in the striatum (Ferreira et al.,

2010; Lambert et al., 2005; Meeusen et al., 1997) and other regions of the rodent brain

(Kleim et al., 2002; Klintsova et al., 1998; Real et al., 2010). The present study showed that

both exercise protocols used here induced more robust changes of structural proteins then

synaptic proteins in the striatum. AE increased MAP2 and NF68, whereas TE increased

NF68 in the striatum. It is noteworthy that MAP2 and NF68 have important functions in the

brain, as NF68 ensures structural support to axons and MAP2 participates in the growth and

branching of dendrites, establishing and maintaining synaptogenesis (Sanchez et al., 2000).

Some studies suggested that the striatum is involved in initial phases of motor task learning

and in later phases of movement automation (Miyachi et al., 2002; Yin, 2010). Thus, the

differential pattern of the expression between AE and TE may support these distinct striatum

roles in the acquisition of complex motor skill and consolidation or automation of the rhythmic

motor activity, respectively.

The only change of synaptic protein observed by protein analysis was an increase of

SYP after AE in the striatum. We did, however, observe local immunostaining increases of

SYS and SYP in both exercised groups studied. In the striatum, we could observe increased

SYP expression in the dorsomedial striatum (involved in complex motor control and learning

of motor tasks) after AE and in the dorsolateral striatum (involved in consolidation and motor

automation) (Miyachi et al., 2002; Yin, 2010) after TE, whereas SYS increased after AE and

TE only in the dorsomedial striatum. Both SYS and SYP are associated to neurotransmitter

release and are responsible for the formation and anchoring of synaptic vesicles, as well as

they contribute to a fast and efficient neurotransmission (Vaynman et al., 2006). Other

studies have observed changes of the levels of SYS after different exercise protocols. After

short-term treadmill exercise, increased SYS levels are observed in the striatum (Ferreira et

al., 2010). SYS has also been shown to increase after voluntary exercise. Vaynman et al.

(2006) have observed increased SYS levels after 3 days of wheel running and that the

84

neurotrophic factor BDNF is directly involved in the exercise-dependent regulation of SYS

and SYP.

Finally, the differential pattern of structural and synaptic protein expression induced by

AE and TE in the striatum corroborates with previous studies that have shown distinct

functional roles of the dorsomedial (or associative) striatum and dorsolateral (or

sensorimotor) striatum, based on their major inputs (Yin, 2010).

3.2.3. Cerebellum

Our results showed that the cerebellum was influenced almost exclusively by TE,

resulting in increases of MAP2 protein levels, and higher staining for NFs and SYS, with the

only effect of AE being an increased pattern of staining of SYS restricted to the molecular

layer. Black et al. (1990) have shown that TE rats had a greater density of blood vessels in

the molecular layer than did either AC or inactive animals, suggesting that increased synaptic

activity elicited compensatory angiogenesis. Our results showed an increase of MAP2

protein levels and increased staining for SYS induced by TE, which can be substrates for an

intense synaptic activity observed in the cerebellar molecular layer (Black et al., 1990).

However, neither of the present exercise protocols induced changes of NF protein levels in

the cerebellum, even though we could observe an increased staining pattern in the granular

layer and decreased staining pattern in the molecular layer after TE. This might suggest that

the NF68 response is more important after shorter periods of exercise (Ferreira et al., 2010),

and that after 30 days this protein has already returned to control levels.

Electron microscopy studies have also shown that animals trained for 30 consecutive

days on a complex motor learning task had increased number of synapses per Purkinje cell

within the cerebellar cortex (Black et al., 1990; Kleim et al., 1997). These studies showed an

increased pattern of staining for SYS in the molecular layer after AE, that can be interpreted

as increased synaptic efficiency in this region due to its participation in balance and motor

coordination.

3.3. Motor training and functional circuits

The present study showed that the different types of exercise training induced distinct

changes on the motor circuitries analysed. AE increased MAP2 and SYP in the motor cortex

and increased MAP2, NF68, SYS and SP in the striatum, suggesting that this type of

exercise targeted the basal ganglia-thalamic-cortical circuit in detriment of the cerebellum.

On the other hand, the cerebellum-thalamic-cortical circuit was influenced almost exclusively

85

by TE, resulting in increases of MAP2, NFs and SYS in the cerebellum, with the only effect of

AE being an increased pattern of staining for SYS, restricted to the molecular layer. A

distinction has been made between tasks that require a high amount of attentional guidance

(i.e. skilled training) and those that do not (overlearned, automatic, or endurance based), and

each has been linked with different patterns of functional brain activation (Adkins et al.,

2006). Lewis et al. (2007) stated that for internally guided movements, such as acrobatic

exercises, there is a predominant activation of basal ganglia-thalamic-cortical circuits. As

learning progresses, movements are refined and become automatic, therefore with an

externally guided control, and there is a predominant activation of cerebellar-thalamic-cortical

circuits, which would be the case of treadmill exercise. These circuits work together in

balance and are more or less activated depending on the task (Lewis et al., 2007). Other

authors support this theory, such as Holschneider et al. (2007), who showed that treadmill

exercise for 6 weeks increases cerebral blood flow in areas of the cerebellar-thalamic-cortical

circuit. Furthermore, the increase of SYS in the molecular layer of the cerebellar cortex after

AE possibly suggests the beginning of a shift to a predominantly activated cerebellar-

thalamic-cortical circuit, since the acrobatic circuit may become automatic after 30 days of

training.

4. CONCLUSION

Our results show that both exercise modalities induce improvements of motor behavior

and plasticity. Acrobatic exercise induced increases of structural and synaptic proteins in the

motor cortex and striatum, supporting the involvement of these regions in the process of

learning new skills. Treadmill exercise, on the other hand, produced a more diffuse effect,

increasing structural and synaptic proteins in the motor cortex, striatum and cerebellum.

These results confirm that the type of exercise is a determining factor of which brain regions

are more affected and suggest that different proteins participate in the underlying plasticity,

even when the behavioral outcome is the same. The understanding of the relationship

between these different types of exercise, mechanisms of neural plasticity, and changes in

motor behavior may facilitate the development of more effective rehabilitation interventions.

5. EXPERIMENTAL PROCEDURES

5.1. Animals

86

Male 2 month-old Wistar rats weighing ca. 250 g (obtained from the Animal Facility of the

Institute of Biomedical Sciences of the University of São Paulo) were housed in groups in

standard polyethylene cages with food and water ad libitum, room temperature of 23oC and a

12/12h light-dark inverted cycle (Holmes et al., 2004). Animals were randomly divided into

three groups: treadmill exercise (TE) (n=20), acrobatic exercise (AE) (n=20) and sedentary

(Sed) (n=15). All protocols were approved by the Ethics Committee for Animal Research of

the University of São Paulo and experimental procedures were performed in accordance with

the guidelines of the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA) and the animal

care guidelines of the National Institutes of Health (NIH/USA).

5.2. Evaluation of balance and coordination

Before the rats went through their designated exercise modality, an initial evaluation of

motor skills was conducted. This evaluation was then repeated after 2 weeks and then again

after 4 weeks of the exercise period for all three groups. We chose to use a Rotarod, as this

instrument allows us to evaluate balance and coordination (Brooks and Dunnett, 2009). The

Rotarod was initially designed to measure neurologic deficits in rodents and represents the

most commonly used instrument to test motor function in rats (Brooks and Dunnett, 2009).

The rats are placed on top of the 4 individual cylinders (7cm-diameter) which rotate at a

progressively increasing speed (increments every 30 seconds). Once the rat falls from the

cylinder, it lands on a pressure-sensitive platform which records how long the rat stayed on

the cylinder.

5.3. Acrobatic exercise protocol

An acrobatic circuit was built based on what was used by Black et al. (1990), which

constituted of the following obstacles placed at a height of 1.5m from the ground: see-saw,

balance beams, rope ladder, thin dowels and rope bridge. All animals went through a two-

day adaptation period to the acrobatic task during which they passed through the entire

circuit twice each day. The acrobatic task was performed 3 times a week for a period of 4

weeks during which the rats were allowed 5 trials each day. When necessary, rats were

gentle guided manually to continue to next obstacle. The time spent to complete the task on

each trial was recorded (Black et al., 1990; Kleim et al., 1996). Platforms and bridges were

cleaned with 70% ethanol after each rat completed its session.

5.4. Treadmill exercise protocol

87

All animals went through a two-day adaptation period to a treadmill (KT 3000 –

IMBRAMED, Brazil, adapted for rats) during which they were allowed to explore the

equipment and the treadmill was turned on for only 15 minutes at low speeds (0.3 to 0.5

km/h). This procedure has the purpose of excluding animals which are intolerant to the

treadmill and refuse to run, providing a homogenous group of rats for the TE group. These

rats exercised for 40 minutes a day, 3 times a week at 10m/min (0.6 km/h) in the middle of

the active cycle (between 11am and 1pm), whereas the sedentary group remained in the

cages near the treadmill. The inverted cycle and this period of training were used to avoid the

development of internal desynchronization, similar to the effect observed in night-shift

workers, which was previously detected in rats that exercised during their light cycle

(Salgado-Delgado et al., 2008).

5.5. Immunohistochemistry

5.5.1. Tissue processing

After the exercise period, the animals (4 animals per group) were deeply anesthetized

(ketamine, 20mg/100g of body weight; xylazine, 2mg/100g, i.m.) and perfused transcardially

with 300mL of 0.1M phosphate buffered saline (PBS) followed by 300mL of 2%

paraformaldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer (PB), pH 7.4. The brains were then

removed and post-fixed for 4 hours in the same fixative at 4oC and cryoprotected with a 30%

sucrose solution (in PB) for 48 hours at 4oC. Coronal sections (30µm) were cut on dry ice

using a sliding microtome (Leica SM 2000R – Nussloch, Germany). Sections were stored in

PB at 4ºC until use.

5.5.2. Immunostaining

Free-floating sections were stained with a series of antibodies, namely rabbit polyclonal

anti-SYS (1:1000) (Chemicon, Temecula, USA), rabbit polyclonal anti-SYP (1:250)

(DakoCytomation, Glostrup, Denmark), mouse monoclonal anti-NFs (PAN, recognizing

68kDa, 160kDa and 200kDa neurofilaments) (1:2000) (Zymed Laboratories, San Francisco,

CA, USA) and mouse monoclonal anti-MAP2 (1:1000) (Chemicon, Temecula, USA). All

antibodies are routinely used by several laboratories. The secondary antibodies were

biotinylated goat anti-rabbit antisera for SYS, donkey anti-rabbit antisera for SYP, donkey

anti-mouse antisera for MAP2 (all from Jackson Immuno Research Lab., West Grove,

Pennsylvania, USA) and a goat anti-mouse antiserum for NFs (Vector, Burlingame, CA,

USA). The primary antibodies were diluted in PB with 0.3% Triton X-100 and 5% normal goat

serum (for anti-SYS and anti-NFs) or normal donkey serum (for anti-SYP and anti-MAP2)

88

and the sections were incubated overnight (14-20 h) at room temperature (ca. 24oC). After

washing the sections with PB (3 x 10 min), they were incubated with the corresponding

secondary antibodies, which were all diluted 1:200 in PB with 0.3% Triton X-100 for 2 hours

at room temperature. Following additional washes (3 x 10 min), the sections were incubated

with the avidin-biotin-peroxidase complex (ABC Elite kit, Vector Labs., Burlingame, CA, USA)

for 2 hours at room temperature. Labeling was developed with 0.05% diaminobenzidine

tetrahydrochloride (DAB) and 0.03% (final concentration) hydrogen peroxide in PB. To

confirm the specificity of the antibodies, a separate set of sections from each group was

incubated only with the secondary antibodies, a condition in which no staining was present.

After the staining procedure, the sections were mounted on glass slides and the staining was

intensified with 0.05% osmium tetroxide in water. They were then dehydrated and

coverslipped using Permount (Fisher, Pittsburg, PA, USA). The region of interest were

identified based on a stereotaxic atlas (Paxinos and Watson, 2005) and the corresponding

images captured using a Nikon DMX1200 digital camera and quantified by using integrated

optical density, normalized to the background optical density, measured in the same way in

the same section with the aid of Image J (NIH/USA). For primary (M1) and secondary (M2)

motor cortex we analyzed 8 areas of 540.000 µm2 of the motor cortex for each rat between

the planes designated as bregma 2.52-1.56. For the striatum we analyzed 12 areas of

300.000 µm2 from dorsomedial and dorsolateral areas for each rat between bregma 1.80-

0.36, and in the cerebellum we analyzed the cerebellar cortex (paramedian lobule) in 8 areas

of 160.000 µm2 for each rat.

5.6. Western blotting

The animals (12 animals per group) were decapitated and regions of interest were

quickly collected, frozen in liquid nitrogen and stored at -70oC until use. The tissue was then

homogenized at 4ºC in extraction buffer (Tris, pH 7.4, 100 mM; EDTA 10 mM; PMSF 2 mM;

aprotinin 0.01 mg/ml). The homogenates were centrifuged at 12,000 rpm (15294g)

(Eppendorf Centrifuge 5804R – Westbury, NY, USA) at 4oC for 20 min, and the protein

concentration of the supernatant was determined using a protein assay kit (Bio-Rad,

Hercules, CA, USA) (Bradford, 1976). The material was stored in a sample buffer (Tris/HCl

125mM, pH 6.8; 2.5% (p/v) SDS; 2.5% 2-mercaptoethanol, 4mM EDTA and 0.05%

bromofenol blue) (Laemmli, 1970) at -70ºC until starting the assays. Samples containing

100µg of total proteins in Laemmli buffer were boiled for 5 min and separated by 6.5% and

8% acrylamide SDS gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) at 25mA (Laemmli, 1970) and

89

electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes (Millipore, Temecula, CA, USA)

at 100 V for 80 min using a Trans-Blot cell system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The

membranes were then blocked for 2 hours at room temperature with PBS containing 0.05 %

Tween-20 (TTBS) and 5 % non-fat milk, and incubated overnight at 4°C with the same

primary antibodies used for immunohistochemistry at a concentration of 1:1000. The

membranes were then incubated for 2 hours with anti-rabbit-HRP IgG for SYS and SYP, and

anti-mouse-HRP IgG for NFs and MAP2 (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)

diluted 1:10,000 in TTBS with 1% non-fat milk. The probed proteins were developed by using

a chemiluminescent kit (ECL, Amersham Biosciences, NJ, USA). The membrane was then

incubated for 30 min at room temperature with stripping buffer and an anti-β-actin antibody

(Sigma, St. Louis, MO, USA) was used to quantify β-actin as a loading control. The bound

antibodies were visualized using radiographic films which were placed in contact with the

membranes, then developed and fixed. The quantification of band intensity was performed

with Image J (NIH Image). Subsequently, the normalized data were treated to evaluate

protein changes in the experimental structures in relation to the controls.

5.7. Statistical analysis

Data are expressed as the mean ±SEM. Statistical analyses were performed using one-

way ANOVA with Tukey post-hoc test for behavioral, immunohistochemistry and Western

blotting data. The significance level used was 5%.

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by FAPESP and CNPq (R.S.P.; L.R.G.B.). The authors would

like to thank Adilson S. Alves for helping with experimental protocols. C.C.R. and A.F.B.F.

are the recipients of fellowships from FAPESP.

90

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94

FIGURES AND LEGENDS

Fig. 1 - Behavioral evaluation. (A) See-saw, balance beams rope ladder and thin dowels as

examples of the obstacles of the acrobatic circuit. (B) Evaluation of the acrobatic

performance considering the recorded time to complete the acrobatic circuit each week. (C)

Balance and coordination evaluation using the Rotarod considering the time spent on the

equipment on the first day (0W), on the second week (2W) and on the forth week (4W) of the

protocols.

95

Fig. 2 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat motor cortex. Digital

images of coronal sections of the motor cortex stained for MAP2 and NFs. Mean ratio of

MAP2 and NFs integrated density data in the motor cortex (M1 and M2) in relation to the

background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin and NF68/β-actin,

NF160/β-actin, NF200/β-actin (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary

group (normalized) and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE:

treadmill exercise; Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF:

neurofilaments; NF68: 68kDa neurofilament; NF160: 160kDa neurofilament; NF200: 200kDa

neurofilament; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).

Fig. 3 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat motor cortex. Digital images

of coronal sections of the motor cortex stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and

SYP integrated density data in the motor cortex (M1 and M2) in relation to the background

optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin densitometry

(N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized) and typical

immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise; Sed:

sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (**p<0.03).

96

Fig. 4 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat striatum. Digital images of

coronal sections of the striatum stained for MAP2 and NF68. Mean ratio of MAP2 and NF68

integrated density data in the dorsomedial and dorsolateral striatum in relation to the

background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin and NF68/β-actin

densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized)

and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise;

Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF: neurofilaments; NF68: 68kDa

neurofilament; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).

97

Fig. 5 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat striatum. Digital images of

coronal sections of the striatum stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and SYP

integrated density data in the dorsomedial and dorsolateral striatum in relation to the

background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin

densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized)

and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise;

Sed: sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05;

**p<0.03).

98

Fig. 6 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat cerebellum. Digital images

of coronal sections of the cerebellar cortex stained for MAP2 and NFs. Mean ratio of MAP2

and NFs integrated density data in the granular and molecular layer in relation to the

background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin, NF68/β-actin and

NF160/β-actin densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group

(normalized) and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill

exercise; Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF: neurofilaments;

NF68: 68kDa neurofilament; NF160: 160kDa neurofilament; IHC: immunohistochemistry

(*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).

99

Fig. 7 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat cerebellum. Digital images

of coronal sections of the cerebellar cortex stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and

SYP integrated density data in the granular and molecular layer in relation to the background

optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin densitometry

(N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized) and typical

immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise; Sed:

sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05;

**p<0.03;).

Dissertação - Priscila Crespo Garcia

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