EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE DEFESA ... · Esforça-te, e tem bom ânimo; não...
Transcript of EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE DEFESA ... · Esforça-te, e tem bom ânimo; não...
Universidade de São Paulo
Faculdade de odontologia de Ribeirão Preto
Priscila Cristina de Paula
EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE
DEFESA – ESTUDO EXPERIMENTAL
Ribeirão Preto
2013
I n t r o d u ç ã o | 2
Priscila Cristina de Paula
EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE
DEFESA – ESTUDO EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de mestre em Biologia Oral.
Orientadora: Profa. Dra. Marilena Chinali Komesu
Versão Corrigida
Ribeirão Preto
2013
I n t r o d u ç ã o | 3
Autorizo a reprodução e divulgação do teor total ou parcial deste trabalho por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central do Campus USP - Ribeirão Preto
De Paula, Priscila Cristina
Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa– estudo experimental. Ribeirão Preto, 2013.
94 p. : il. ; 30cm
Versão corrigida da Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Biologia Oral. A versão original se encontra disponível na Biblioteca da Unidade sede do Programa.
Orientadora: Komesu, Marilena Chinali
1. Dislipidemia. 2. Colesterol. 3. Doença periodontal.
I n t r o d u ç ã o | 4
FOLHA DE APROVAÇÃO
Priscila Cristina de Paula
Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa – estudo experimental
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre.
Área de Concentração: Biologia Oral
Aprovado em: ____/____/2013
Banca Examinadora:
1) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________________
Julgamento: __________________Assinatura: ___________________________________
2) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________________
Julgamento: __________________Assinatura: ___________________________________
3) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________________
Julgamento: _________________Assinatura: _____________________________________
I n t r o d u ç ã o | 5
Dedicatória
I n t r o d u ç ã o | 6
Dedico a meus pais, Mário e Cidinha que renunciaram muitos
sonhos para possibilitar a mim os caminhos do conhecimento.
A minha irmã Natália, pelo incentivo, paciência, e por seus
ensinamentos. Sua ajuda foi fundamental para realização desse
trabalho.
Ao meu noivo Wesley, por sua compreensão, por suas palavras
que sempre me confortaram nos momentos difíceis.
Vocês são muito importantes para mim, amo vocês!!
I n t r o d u ç ã o | 7
Agradecimentos
I n t r o d u ç ã o | 8
A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força
interior para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas
incertas e me suprir em todas as minhas necessidades.
À Profa. Dra. Marilena Chinali Komesu, por me conceder a
oportunidade de realizar este trabalho sob sua orientação, pela
paciência e seus ensinamentos que contribuíram para meu aprendizado.
Ao Programa de Pós-graduação em Reabilitação Oral da
Faculdade de odontologia de Ribeirão Preto, e seus docentes, pela
oportunidade e ensinamentos que contribuíram para minha formação.
Aos técnicos Edna, Gilberto e Kleber, que ao longo desses dois
anos tornaram-se grandes amigos.
À técnica Adriana pela ajuda na realização da parte
experimental.
Ao Prof. Dr. Osvaldo de Freitas por ceder o espaço de seu
laboratório para realização de parte desse trabalho.
Aos amigos e companheiros de laboratório Alan e Cristiano, pelos
ensinamentos e pela ajuda nos experimentos.
A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Reabilitação
Oral, pela amizade e companheirismo.
I n t r o d u ç ã o | 9
À CAPES, que contribuiu financeiramente para a realização
desse trabalho.
I n t r o d u ç ã o | 10
Epígrafe
I n t r o d u ç ã o | 11
Esforça-te, e tem bom ânimo; não temas, nem te espantes, porque o Senhor, teu Deus, é contigo por onde quer que andares.
Josué 1:9
I n t r o d u ç ã o | 12
Resumo
I n t r o d u ç ã o | 13
De Paula, PC. Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa – estudo experimental. Ribeirão Preto, 2013. 94pp. Dissertação (Mestrado pelo Programa: Reabilitação Oral- Área de concentração: Biologia Oral). Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
RESUMO
A dislipidemia é geralmente caracterizada pela presença de níveis alterados e/ou elevados de colesterol total plasmático, LDL, triglicerídeos e de HDL. Em muitos casos, a dislipidemia está também associada à obesidade, embora o indivíduo possa apresentar alterações de colesterol sem ser obeso. São encontrados na literatura trabalhos clínicos que mostram uma clara relação entre doença periodontal e dislipidemia, sendo essa relação também demonstrada em outras situações de inflamação e infecção. No entanto, embora existam sugestões de que a relação inversa também possa ser verdade, algumas limitações observadas nos estudos não nos permitem assegurar que a doença sistêmica (dislipidemia) poderia estar alterando a resposta inflamatória (doença periodontal). Sendo assim o objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento do epitélio gengival e a resposta inflamatória em ratos wistar, em condição de dislipidemia experimental. A dislipidemia foi induzida pela adição de colesterol à ração dos animais, e a inflamação local induzida por aplicação de LPS (lipopolissacarídeo bacteriano- E. coli). Foram avaliados fatores locais (infiltrado inflamatório na região gengival) e aspectos sistêmicos (níveis séricos de mediadores da resposta inflamatória IL-6, IL-1β e TNF-α, e proteínas envolvidas na regulação da resposta inflamatória: SLPI e leptina). Nos animais com dislipidemia os resultados da análise histológica mostraram um aumento dos parâmetros inflamatórios (edema, infiltrado inflamatório, pavimentação leucocitária e hiperemia), principalmente na 4°semana de aplicação do LPS. As citocinas analisadas e a leptina, moléculas pró-inflamatórias, estavam mais elevadas nos animais com dislipidemia, já o SLPI, envolvido na redução do dano causado pela inflamação, estava reduzida nesses animais em relação aos animais sem dislipidemia que também receberam aplicações de LPS. Diante de nossos resultados, concluímos que a dislipidemia pode alterar a resposta inflamatória à infecção. Palavra Chave: dislipidemia, doença periodontal, colesterol.
I n t r o d u ç ã o | 14
Abstract
I n t r o d u ç ã o | 15
De Paula, PC. Effect of dyslipidemia on defense capability- experimental study. Ribeirão Preto, 2013. 94pp. Dissertação (Mestrado pelo Programa: Reabilitação Oral- Área de concentração: Biologia Oral). Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
ABSTRACT
Dyslipidemia is characterized by elevated or altered levels of plasma total cholesterol, LDL, HDL and triglycerides. In many cases, dyslipidemia is associated with obesity, although individuals may present altered levels of cholesterol without being obese. Studies have shown an interrelationship between periodontal disease and dyslipidemia. There are, in the literature studies showing a clear relationship between periodontal disease and dyslipidemia, which is also demonstrated in other situations of inflammation and infection. However, although there are suggestions that the inverse relationship can also be true, some limitations observed in the studies did not allow us to ensure that systemic alteration (dyslipidemia) could be influencing the inflammatory response (periodontal disease). Therefore, the objective of this study was to evaluate the behavior of the gingival epithelium and inflammatory response in wistar rats under conditions of experimental dyslipidemia. Dyslipidemia was induced by increasing the amount of cholesterol in the diet of animals, and local inflammation was induced by the application of LPS (E-coli lipopolissacarídeo). We assessed local factors (inflammatory infiltrate in the gingival area), and systemic aspects (inflammatory mediators levels as IL-6, IL-1β and TNF-α) and the plasma levels of proteins involved in the regulation of inflammatory response (SLPI and leptin). In animals with dyslipidemia histopathological analysis showed an increased level of inflammatory parameters (edema, inflammatory infiltrate, leukocyte margination and hyperemia), particularly in the 4th week after LPS application. Cytokines and leptin presented higher plasma levels in animals with dyslipidemia, but SLPI, considered a molecule involved in tissue protection, mostly in situations of inflammation or infection, was reduced in these animals compared to their controls. Our results allow us to conclude that dyslipidemia may alter the inflammatory response to infection. Keywords: dyslipidemia, periodontal disease, cholesterol
I n t r o d u ç ã o | 16
Sumário
I n t r o d u ç ã o | 17
Sumário
1.1 Introdução .................................................................................................. 22
1.2 Doença Periodontal ....................................................................................... 25
1.3 Doença Periodontal e Dislipidemia ............................................................... 28
2. Proposição ....................................................................................................... 35
2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................. 35
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 35
3. Material e Método .......................................................................................... 37
3.1 Animais .......................................................................................................... 37
3.2 Preparação da ração com acréscimo de colesterol ........................................ 37
3.3 Indução da Inflamação Gengival ................................................................... 38
3.4 Protocolos Experimentais .............................................................................. 38
3.5 Coleta de amostras ......................................................................................... 39
3.6 Quantificação de lipídios e lipoproteínas ....................................................... 40
3.7 Técnica Histológica ........................................................................................ 41
3.8 Análises laboratoriais .................................................................................... 44
3.8.1 Elisa Indireto ................................................................................................. 45
3.8.2 Elisa Sanduíche ......................................................................................... 47
3.9 Análise Estatística ........................................................................................ 49
4. Resultados ....................................................................................................... 51
4.1 Avaliação do peso dos animais ....................................................................... 51
4.2 Avaliação dos lipídios .................................................................................. 52
4.3 Avaliação dos lipídios durante a indução da infecção ................................... 54
4.4 Análise Histopatológica .................................................................................. 58
4.5 Avaliação dos mediadores inflamatórios ....................................................... 60
4.5.1 IL-1β .......................................................................................................... 60
I n t r o d u ç ã o | 18
4.5.2 IL-6 ............................................................................................................. 61
4.5.3TNF-α .......................................................................................................... 61
4.5.4 SLPI ............................................................................................................ 62
4.5.5 Leptina ....................................................................................................... 63
5.0 Discussão ...................................................................................................... 66
6.0 Conclusão ....................................................................................................... 76
7.0 Referências Bibliográficas .......................................................................... 78
8.0 Anexo .............................................................................................................. 94
I n t r o d u ç ã o | 19
Lista de figuras
I n t r o d u ç ã o | 20
Lista de Figuras
Figura 1 - Estrutura da lipoproteína ............................................................................. 24
Figura 2 - Apresentação histopatológica do tecido gengival saudável ........................ 42
Figura 3 - Apresentação histopatológica do tecido gengival com inflamação ............ 43
Figura 4 - Parâmetros inflamatórios ............................................................................ 44
Figura 5 - Controle de Peso ......................................................................................... 51
Figura 6 - Quantificação de LDL e HDL ..................................................................... 52
Figura 7 - Quantificação do colesterol total, triglicérides e VLDL ............................. 53
Figura 8 - Quantificação de HDL durante inflamação ................................................ 54
Figura 9 - Quantificação de LDL durante inflamação ................................................. 55
Figura 10 - Quantificação de Colesterol Total durante inflamação ............................. 56
Figura 11 - Quantificação de VLDL durante a inflamação ......................................... 57
Figura 12 - Quantificação de triglicérides durante inflamação .................................... 57
Figura 13 - Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior .. 58
Figura 14 - Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região anterior .... 59
Figura 15 - Quantificação de IL-1β .............................................................................. 60
Figura 16 - Quantificação de IL-6 ................................................................................ 61
Figura 17 - Quantificação de TNF-α ........................................................................... 62
Figura 18 - Quantificação de SLPI .............................................................................. 63
Figura 19 - Quantificação de Leptina .............................................................................. 64
I n t r o d u ç ã o | 21
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 22
1. Introdução
Desde a década passada o sobrepeso e a obesidade têm crescido a proporções 1
pandêmicas, afetando principalmente os países desenvolvidos (Sowers et al., 2011). Esse 2
fato se mostra associado à diminuição da atividade física somado ao desbalanço alimentar, 3
o que faz com que a prevalência da obesidade esteja tornando-se uma ameaça à saúde 4
pública (Wang e Peng, 2011; de Alcântara et al., 2012) . 5
No Brasil o excesso de peso e a obesidade aumentaram nos últimos seis anos 6
segundo levantamento realizado pelo Ministério da Saúde. De acordo com o estudo, a 7
proporção de pessoas acima do peso no Brasil avançou de 42,7%, em 2006, para 48,5%, 8
em 2011. No mesmo período, o percentual de obesos subiu de 11,4% para 15,8% 9
(Ministério da Saúde, 2012). 10
O acúmulo de tecido adiposo é um fator de risco para muitas doenças crônicas, e 11
está intimamente ligado à síndrome metabólica que é caracterizada por um grupo de 12
alterações, incluindo a resistência à insulina, hipertensão e a dislipidemia, que 13
compreendem os principais fatores de risco para diabetes tipo II, doenças cardiovasculares 14
e cerebrovasculares (Nesbitt et al., 2010; Wang et al., 2011; Gray et al., 2011). 15
A dislipidemia é caracterizada pela presença de níveis elevados ou anormais 16
de lipídios e/ou lipoproteínas no sangue (Scardina et al., 2011; Siasos et al., 2011). 17
Embora ainda não esteja clara a proporção de indivíduos obesos que desenvolva a 18
dislipidemia, essa alteração é considerada a mais importante comparada a outras 19
manifestações presentes na obesidade (Wang e Peng, 2011). 20
Apesar da estreita ligação entre obesidade e dislipidemia, alguns indivíduos 21
obesos não desenvolve essa alteração metabólica (Goossens e Blaak, 2012), e também nem 22
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 23
todos os indivíduos com dislipidemia são obesos, demonstrando que a associação 1
obesidade e dislipidemia não é obrigatória (De Alcântara Neto et al., 2012). A 2
susceptibilidade ao desenvolvimento da dislipidemia esta relacionada à prática de maus 3
hábitos alimentares (De Alcântara Neto et al., 2012), exceto em indivíduos que sofrem da 4
má absorção do colesterol devido a alterações genéticas - hipercolesterolemia familiar. 5
Hipercolesterolemia Familiar é uma patologia de origem genética, autossômica 6
dominante (forma mais grave). É caracterizada essencialmente, pelo aumento dos níveis 7
plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), devido à deficiência na depuração 8
dessa lipoproteína, por possuir alteração genética nos receptores ou na própria estrutura das 9
apoproteínas que compõem a membrana da LDL (Futema et al., 2012). 10
Embora o colesterol em excesso seja visto como um vilão para a saúde, a presença 11
equilibrada dessa molécula é vital para o organismo, pois constitui a peça fundamental para 12
a produção de vários hormônios, para síntese de sais biliares, vitamina D, além de fazer 13
parte da estrutura da membrana celular (da silva et al., 2007 ). 14
Grande parte do colesterol que o indivíduo necessita é sintetizada pelo próprio 15
organismo, sendo necessário obter apenas uma pequena quantidade pela alimentação 16
(Lupattelli et al., 2012). 17
Por ser uma molécula hidrofóbica, o colesterol é transportado pelo sangue através 18
de lipoproteínas, que são associações de lipídios e proteínas. A lipoproteína possui um 19
núcleo hidrofóbico formado pelo colesterol esterificado e por triacilgliceróis, envolvido 20
por uma monocamada de fosfolipídios (organizados com a parte polar voltada para o meio 21
aquoso e a parte apolar para o interior), de proteínas denominadas apoproteínas, e pelo 22
colesterol livre, que por ser uma molécula anfipática encontra-se entre os fosfolípides da 23
monocamada (Siasos et al., 2011). 24
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 24
Figura1- Estrutura da lipoproteína. (Imagem extraída do site: http://biocolesterol.blogspot.com.br/2010_11_01_archive.html#).
As lipoproteínas são classificadas de acordo com sua densidade, e são conhecidas pelas 1
siglas em inglês: HDL (High Density Lypoprotein- lipoproteína de alta densidade), LDL (Low 2
Density Lypoprotein- lipoproteína de baixa densidade), IDL (Intermediate Density 3
Lipoprotein- lipoproteína de densidade intermediária), VLDL (Very Low Density Lypoprotein - 4
muito baixa densidade), e os quilomicros (molécula que possui menor densidade, comparada 5
com as demais lipoproteínas) (Gowdy et al., 2012). 6
A dislipidemia é caracterizada por uma alteração da quantidade de lipídios circulantes 7
no sangue, que incluem o aumento de colesterol total, triglicerídeos, LDL e diminuição de 8
HDL (Gowdy et al., 2012). 9
Valores de colesterol total acima de 200 mg/dl têm sido repetidamente correlacionado 10
ao desenvolvimento de doenças vasculares periféricas e coronarianas (Sangwan et al., 2013). E 11
o elevado nível de LDL plasmático pode levar ao desenvolvimento da aterosclerose (Katz et 12
al., 2002). 13
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 25
Estudos também mostram que o HDL poderia exercer efeitos diversos que vão além 1
do transporte reverso do colesterol, incluindo propriedades anti-inflamatórias, anti-oxidativas e 2
anticoagulante. (Haas e Mooradian, 2011; G et al., 2011 ). 3
Os sinais e sintomas clínicos do aumento de colesterol aparecem geralmente na vida 4
adulta, embora já se saiba que as lipoproteínas podem estar aumentadas no plasma desde a 5
infância ou adolescência. Apesar de subclínico, o aumento de colesterol pode atuar como um 6
fator de risco para processos patológicos, e hoje se aconselha a prevenção dessa alteração em 7
crianças com tendência a obesidade, hipercolesterolemia ou hipertrigliceridemia (Raitakari et 8
al., 2003; Li et al., 2004; Peebles, 2008, Avis et al., 2009; Zappalla e Gidding, 2009). 9
Atualmente, a relação entre os níveis de colesterol e a inflamação tornou-se foco de 10
estudo em vários trabalhos (Feingold et. al., 1992; Sattar et al., 2003; Toms et al., 2010; 11
Sangwan et al., 2013). Pesquisadores observaram que pacientes portadores de doenças 12
inflamatórias, entre elas artrite reumatóide e doença periodontal possuíam elevadas taxas de 13
colesterol e seus derivados (exceto HDL) (Toms et al., 2011; Nisar et al., 2012). 14
1.1. Doença Periodontal
A doença periodontal é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por uma 15
resposta de tipo Th1 (Katz et al., 2002), é considerada uma das infecções crônicas mais 16
frequentes em seres humanos, que acomete os tecidos gengivais e a estrutura de suporte dos 17
dentes, podendo levar a perda do elemento dental (Ekuni et al., 2005; Pussinen et. al., 2007; 18
Andriankaja et al., 2010) . Atualmente é classificada levando em consideração medidas 19
clínicas, incluindo a presença e gravidade de bolsas periodontais, perda de inserção clínica, e a 20
extensão da perda óssea alveolar (Kretschmar et al. 2012). 21
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 26
As principais bactérias associadas com o início da doença periodontal são 1
predominantemente bactérias gram-negativas anaeróbias e espiroquetas, entre elas 2
Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia e 3
Treponema denticola (Kretschmar et al., 2012; Laugisch et al., 2012) . 4
Embora as bactérias orais, toxinas, enzimas e metabolitos sejam os principais fatores 5
causais do início do processo inflamatório, a resposta inflamatória do hospedeiro também é 6
importante, principalmente na progressão da doença (Ozdemir et al., 2012). Apesar de ser uma 7
inflamação do tecido bucal, a doença periodontal pode provocar inúmeras alterações sistêmicas 8
(Iacopino e Cutler, 2000). 9
Tomofuji, et al. (2006) concluíram que a doença periodontal pode causar danos 10
celulares em estruturas distantes como cérebro, coração e rins devido a liberação de espécies 11
oxigênio-reativas levando à peroxidação dos lipídios da membrana celular. 12
Vários mediadores inflamatórios são liberados na doença periodontal, entre eles as 13
citocinas, que são pequenas proteínas solúveis produzidas pelas células. Esses mediadores 14
desempenham um papel importante em numerosas funções biológicas, incluindo a regulação 15
da resposta inflamatória e imunológica (Callard et al.,1999; Mattuella et al., 2012). 16
As citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 17
(IL-6) e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) desempenham um papel importante na 18
patogênese da doença periodontal (Monteiro et al., 2009). Essas citocinas possuem papeis que 19
se interligam no processo inflamatório. A IL-1β influencia mais de 90 genes, tais como genes 20
de outras citocinas (TNF-α e IL-6), receptores de citocinas, reagentes de fase aguda, fatores de 21
crescimento, enzimas de remodelação de tecidos, genes que transcrevem componentes da 22
matriz extracelular e moléculas de adesão (Boch et al., 2001; Wei et al., 2004). 23
IL-1β é um dos ativadores celulares mais potentes e multifuncionais. É produzida 24
principalmente por monócitos / macrófagos, células NK (natural killer) e células B, além de 25
outras células, tais como fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais, que também podem 26
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 27
produzir essa citocina após estimulação. A atividade biológica da IL-1β é extremamente 1
diversa, com foco sobre a ativação de proteínas de fase aguda, prostaglandinas, outras 2
citocinas, a indução da síntese de colágeno e colagenase e reabsorção óssea (Mengel et al., 3
2002). 4
TNF-α age no processo de migração de células de defesa, induzindo a expressão de 5
moléculas de adesão e de citocinas, entre elas IL-1β e IL-6, que são citocinas quimiotáticas 6
envolvidas na migração de células para locais de infecção e inflamação, além disso, promove 7
reabsorção de osso alveolar e perda de inserção de tecido conjuntivo na doença periodontal 8
(Kindle et al., 2006; Kim, 2010). 9
A IL-6, um polipeptídio de pequeno tamanho, aproximadamente 26 KDa (Kilodalton), 10
foi originalmente identificado como um fator diferenciador das células B, mas é hoje 11
reconhecido como uma citocina multifuncional que está associada à regulação da resposta 12
imunológica, hematopoiese e resposta inflamatória (Kishimoto, 2010; Mihara et al., 2012; 13
Nibali et al.,2012; Smolen et al., 2012). 14
A IL-6 é produzida por uma variedade de células, tais como monócitos, fibroblastos, 15
osteoblastos, e células vasculares endoteliais, em resposta aos agentes inflamatórios (Souza et 16
al. 2008), sendo por isso um importante marcador inflamatório. Atua tanto na resposta imune 17
inata como na adaptativa, e estimula a síntese de proteínas de fase aguda, como a proteína C-18
reativa (Tonet et al., 2008). 19
A atividade da IL-6 no processo inflamatório é considerada complexa, uma vez que atua 20
como citocina pró-inflamatória (estimulando a produção de proteínas da fase aguda, induzindo 21
a febre e a angiogênese) e também como citocina anti-inflamatória (diminuindo o recrutamento 22
de neutrófilos) (Crosntein, 2007). 23
A IL-6 é considerada uma citocina de transição entre as fases aguda e crônica da 24
inflamação, ou até mesmo uma citocina de transição entre a resposta imunológica inata e 25
adquirida (Xing et al., 1998; Jones, 2005). Altos níveis de IL-6 podem ser observados em 26
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 28
muitas doenças inflamatórias crônicas e mesmo em doenças auto-imunes (Wong et al., 2006; 1
Rose-John et al., 2006; Mihara et al., 2012). 2
Estudos mostram aumento de IL-6 associado ao desenvolvimento de doença periodontal 3
crônica, perda de ligamento periodontal e do osso alveolar (Nibali et al., 2012). 4
1.2. Doença Periodontal e Dislipidemia
Vários estudos apontam para uma relação positiva entre a doença periodontal e os níveis 5
plasmáticos de colesterol total, LDL e triglicérides. Muitos desses estudos sugerem que a 6
doença periodontal seria um fator de risco para a dislipidemia (Memon et al., 1993; Doxey et 7
al.,1998). 8
A liberação de citocinas no processo inflamatório parece alterar o metabolismo dos 9
lipídios (Feingold et al., 1992; Cutler et al.,1999; Iacopino e Cutler, 2000). Por exemplo, a 10
doença periodontal está associada à níveis elevados de IL-6, TNF-α e IL-1β, essas citocinas 11
atuam sobre a lipoproteína lipase, que é uma enzima responsável pela degradação 12
principalmente de triglicérides e LDL, levando à redução da depuração dessas moléculas, o 13
que justifica a presença de níveis elevados de triglicerídeos e LDL em pacientes com doença 14
periodontal (Feingold et al., 1992; Nurmohamed e Dijkmans, 2009; Bullon et al., 2009; Nisar 15
et al., 2012). 16
Wolfe, et al. (1985) demonstraram que em situação de sepsis ocorre um aumento do 17
VLDL hepático, provavelmente devido ao aumento da síntese de ácidos graxos no fígado, além 18
de um aumento da lipólise no tecido adiposo (Bullon et al., 2009). 19
Segundo Fentoglu, et al.(2008) e Iacopino e Cutler (2000), TNF-α e IL-1β exercem 20
efeitos sobre o metabolismo lipídico pois, essas citocinas estimulam a produção de outras 21
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 29
citocinas, o que desvia a utilização de aminoácidos envolvidos no metabolismo dos lipídios, 1
resultando no aumento dos lipídios no sangue. 2
Além disso, TNF-α parece induzir o aumento dos níveis de colesterol hepático por 3
aumentar a atividade da enzima HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A 4
redutase), a qual participa da síntese de colesterol no fígado (Bullon et al., 2009). 5
Pejcic, et al. (2011) em seu estudo concluíram que o controle da doença periodontal 6
em pacientes portadores de dislipidemia alterou os nos níveis lipídicos, houve uma redução do 7
colesterol total, LDL, triglicérides, e aumento de HDL. 8
São muitos os estudos que relatam a presença de alterações na distribuição de 9
lipoproteínas (redução dos níveis de HDL, e alterações nos níveis de LDL), como 10
consequência de episódios inflamatórios (Cutler et al., 1999; Fentoglu et al., 2009; Fentoglu et 11
al., 2011; Pejcic, 2011). No entanto, alguns pesquisadores levantam a hipótese de que essa 12
relação (dislipidemia e inflamação) também pode ocorrer de forma inversa, ou seja, a 13
dislipidemia instalada deixaria o organismo mais suscetível ao desenvolvimento de infecções 14
(Chu et al., 1999). 15
O delineamento de um estudo para analisar esta relação nem sempre é simples, 16
devido a vários fatores que podem interferir em ambas as situações, como o histórico de 17
desenvolvimento do início das doenças (o que se desenvolveu primeiro: dislipidemia ou 18
inflamação), além do envolvimento de outras comorbidades, (diabetes, doenças 19
cardiovasculares, obesidade, entre outras) que frequentemente acompanham o histórico da 20
dislipidemia (Nurmohamed e Dijkmans, 2009; Fentoglu et al., 2011). 21
Pode-se destacar alguns trabalhos que focam essa relação (dislipidemia causando 22
inflamação), como o trabalho de Van Halm, et al. (2007), que utilizou amostras de doadores de 23
um banco de sangue, os quais posteriormente desenvolveram artrite reumatóide. Foi observado 24
que esses pacientes em comparação com o controle, tinham colesterol total superior em 4%, 25
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 30
HDL inferior em 9% e níveis 17% maiores de triglicérides. Esses níveis de lipídios foram 1
observados pelo menos dez anos antes do aparecimento de sintomas da artrite reumatóide. 2
Pacientes com artrite reumatóide e níveis elevados de colesterol quando tratados com 3
sinvastatina (medicamento com ação antilipêmica, um inibidor específico da enzima HMG-4
CoA redutase), apresentaram além de uma redução no nível de colesterol, também da atividade 5
da doença inflamatória (artrite reumatóide). No entanto, não está claro se a redução na 6
atividade da doença inflamatória é devido ao efeito antilipêmico ou apenas relacionada ao 7
efeito anti-inflamatório já conhecido da sinvastatina (Van Halm et al., 2007; Dalcico et al., 8
2012). 9
Fentoglu, et al. (2011), em seu estudo clínico, ao comparar pacientes saudáveis com 10
pacientes com dislipidemia, concluiu que a média dos parâmetros periodontais como índice de 11
placa, nível de inserção clínica, profundidade de sondagem e sangramento gengival estavam 12
maiores em pacientes com dislipidemia. 13
Várias explicações vêm sendo levantadas na busca de possíveis respostas. Para alguns 14
autores os pacientes com perfil lipídico deteriorado podem estar mais susceptíveis a doenças 15
inflamatórias, isto é, uma ou mais lipoproteína poderia ter um papel regulatório na inflamação 16
(Van Halm et al., 2007; Fentoglu et al., 2008). 17
Alguns estudos demonstraram que a dislipidemia causa disfunção da parede de 18
pequenos vasos e também no processo inflamatório e imunológico, o que pode levar à 19
produção alterada de resposta a diferentes injúrias (Ishikawa et al.,2004). 20
Scardina, et al. (2011) mostraram alteração da microcirculação no tecido periodontal 21
de humanos com hipercolesterolemia, e Maglakilidze, et al. (2005) mostraram alterações 22
morfológicas e funcionais das células gengivais e na microcirculação em coelhos 23
hipercolesterolêmicos. Outros estudos apontam que danos na função endotelial associados a 24
dislipidemia são produzidos principalmente por alterações nos níveis de LDL (Stokes et al., 25
2002); e a hiperlipidemia provoca alteração da função dos leucócitos (Krause et al., 1992); e 26
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 31
que essas alterações poderiam acelerar a progressão das doenças periodontais. (Stokes et al., 1
2002; Krause et al., 1992). 2
Além disso, parece que a dislipidemia pode alterar a capacidade de ativação dos 3
linfócitos B e T, e impedir a resposta do hospedeiro contra fungos, bactérias e vírus. A 4
dislipidemia inibe a migração das células dendríticas e provoca uma superestimulação dos 5
macrófagos que leva a uma deficiência da sua atuação como célula apresentadora de antígeno, 6
sendo que esses macrófagos alterados também estariam associados a deficiências de 7
cicatrização e aumento do dano da doença periodontal (Ludewig et al., 2001; Shamshiev et al., 8
2007; Martens et al., 2008). 9
É conhecido que apoproteína A-I (Apo A-I) presente na superfície da HDL pode 10
inibir a resposta inflamatória ao impedir a ligação de células T com macrófagos abolindo 11
posteriormente a liberação de citocinas inflamatórias, além de inibir moléculas de adesão 12
(Hyka et al, 2001; Van Halm et al., 2007; Bullon et al., 2008). Desta forma, a redução dessa 13
lipoproteína poderia deixar o organismo desequilibrado frente às infecções. 14
Animais com deficiência de apoproteína E (Apo E) (consequentemente 15
apresentam aumento de colesterol) têm suprimida a resposta imunológica do tipo Th1, 16
favorecendo a resposta do tipo Th2, assim a resposta mediada por anticorpos ficaria mais 17
eficiente que a defesa celular (Nazzal et al., 2010). 18
Existem evidências de que a hipercolesterolemia, e não apenas a obesidade, estaria 19
associada a um aumento da expressão de moléculas de adesão e geração de espécies oxigênio-20
reativas, e também que monócitos e neutrófilos com hiperativação apresentariam resposta 21
inflamatória exagerada ao LPS- lipopolissacarídeo bacteriano (Craig et al., 1994; VanderPoll 22
et al., 1995; Stokes et al., 2002). 23
Juntamente com a liberação de citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular 24
gengival, as células epiteliais secretam inibidores de proteases para proteger o tecido de danos 25
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 32
excessivos, entre essas inibidoras destaca-se o SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) 1
(Kretschmar et al., 2012). 2
O SLPI regula a atividade de várias proteases liberadas no sitio da inflamação. A 3
elastase é umas das proteases liberada por neutrófilos, e desempenha um papel importante na 4
destruição do tecido conjuntivo que está associada aos estágios iniciais do processo 5
inflamatório (Uitto et al., 1996; Ujiie et al., 2007). 6
As fases iniciais da doença periodontal são relacionadas com níveis elevados de 7
SLPI na região local, nesse momento o organismo secreta uma grande quantidade desse 8
inibidor na tentativa de impedir a degradação do tecido pelas proteases. Sua presença na região 9
inflamada também está relacionada à sua ação antimicrobiana, anti-inflamatória e de 10
cicatrização. No entanto, nas fases terminais da doença periodontal (destruição avançada, perda 11
da função) o SLPI está reduzido, provavelmente devido à sua degradação pelas proteases 12
catepsina L, cisteínas bacterianas (gingipains) e devido à interação na formação do complexo 13
com elastase (Kantyka et al., 2009; Pateel et al., 2010). 14
Em animais, foi observado que a IL-1β e TNF-α induzem a liberação de leptina 15
(Vanderpoll et al., 1991). A proteína leptina é produzida, predominantemente, pelos 16
adipócitos e posteriormente lançada para a corrente sanguínea. Exerce diferentes respostas no 17
hipotálamo, com o objetivo de balancear a ingestão alimentar e o gasto energético levando a 18
homeostase. Tem sido implicada na regulação de vários mecanismos biológicos, entre os quais 19
a reprodução, a resposta imune e inflamatória, a hematopoiese, a angiogênese e a formação 20
óssea, no entanto seu papel mais relevante, diz respeito a regulação da ingestão alimentar e a 21
homeostasia energética (Karthikeyan e Pradeep, 2007; Farooqui et al., 2012). 22
A leptina atua na regulação do balanço de th1/th2, além de modular a produção de 23
citocinas a partir de monócitos/macrófagos, aumentando a liberação de TNF-α e IL-6 24
(Vanderpoll et al., 1991). Baixo nível desse hormônio é associado com a diminuição do 25
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 33
número de linfócitos T e supressão da resposta dessa célula quando ativada. Ao mesmo tempo, 1
provoca uma hiper-resposta do sistema monócito / macrófago (Vanderpoll et al., 1991). 2
Alguns autores relatam que os níveis de leptina são aumentados por estímulos 3
inflamatórios, tais como LPS e citocinas (Faggioni et al., 1998; Arnalich et al., 1999; Finck e 4
Johnson, 2000) . No entanto, em humanos esse achado ainda é questionável, pois as 5
conclusões são conflitantes (Vanderpoll et al., 1991; Johnson e Serio, 2001; Karthikeyan e 6
Pradeep, 2007) . 7
Embora ainda não seja possível estabelecer com segurança se as alterações das 8
lipoproteínas são causa ou consequência na sua relação com a doença periodontal, já existem 9
trabalhos que admitem uma “via de mão dupla” para essa relação, ou seja, a doença local 10
(doença gengival) exacerba a doença sistêmica (dislipidemia), e ao mesmo tempo, a doença 11
sistêmica predispõe, ou aumenta o grau de desenvolvimento da doença local (Cutler e 12
Iacopino, 2003; Fentoglu et al., 2011; Scardina et al., 2011). 13
Introdução
I n t r o d u ç ã o | 34
Proposição
I n t r o d u ç ã o | 35
2. Proposição
2.1. Objetivos Gerais:
• Avaliar a resposta inflamatória na presença de dislipidemia induzida pela dieta.
2.2. Objetivos Específicos:
• induzir dislipidemia nos animais através de uma ração com aumento de colesterol,
• desenvolver inflamação gengival com aplicação de LPS (lipopolissacarídeo bacteriano),
• avaliar a resposta inflamatória
o realizando análise histológica local,
o quantificando mediadores inflamatórios: IL-1 β, IL-6 e TNF-α;
• quantificar a presença plasmática da proteína SLPI (secretory leucocyte protease
inhibitor)
• quantificar os níveis do hormônio leptina durante a inflamação
Proposição
I n t r o d u ç ã o | 36
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 37
3. Material e Método
3.1. Animais
Para esse estudo foram obtidos no Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da 1
Universidade de São Paulo, 40 ratos machos (Rattus Norvegicus albino, variedade wistar) com 2
aproximadamente 40 gramas de peso corporal. Os animais foram mantidos no biotério da 3
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto- USP, em caixas acrílicas coletivas (cinco ratos por 4
caixa), em ambiente com temperatura controlada (24 ºC ± 1 ºC) e ciclo claro-escuro de 12 horas 5
(ciclo claro se iniciando às sete horas da manhã), com água filtrada e comida ad libitum. 6
3.2. Preparo da ração com acréscimo de colesterol
Foi adicionado 1% (em peso) de colesterol em pó (colesterol 95%, SIGMA®) e 20% em 7
peso de óleo de soja (Liza ®) na ração padrão, baseado nos trabalhos de Badimon, et al. (1990) e 8
Fani, et al. (1988) com algumas modificações. A ração padrão foi moída, e a ela foram 9
adicionadas o colesterol, o óleo de soja e água (para facilitar a homogeneização da mistura), a 10
massa formada foi passada em uma máquina para ser comprimida e os pellets formados. A ração 11
foi mantida em estufa a 56°C por dois dias para evaporação do excesso de água. 12
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 38
3.3. Indução da Inflamação Gengival
Os animais foram anestesiados com tribomoetanol (2,2,2- tribomoethanol, SIGMA®) 1
administrado via intraperitoneal na dose de 25mg/100g de peso corporal. Depois de anestesiados, 2
os animais receberam 3µl de injeção intra-gengival com solução de LPS (LPS - Escherichia coli 3
- SIGMA® 0111:b4) diluído em PBS (Phosphate buffered saline) 10mg/ml, na região palatina 4
de incisivos (região anterior) e 1° molares superiores direito e esquerdo (região posterior), duas 5
vezes na semana (com intervalo de três dias) de acordo com o protocolo de Aquino, et al.(2009a). 6
A aplicação foi realizada com agulha de calibre 26G½ acoplada a uma seringa plástica descartável 7
de 1ml, e com ajuda de uma espátula para afastar a língua dos animais. 8
3.4. Protocolos Experimentais
Os procedimentos do protocolo experimental foram aprovados pelo comitê de ética para 9
uso de animais em laboratório do Campus de Ribeirão Preto da universidade de São Paulo e estão 10
em conformidade com os princípios universais para o uso de Animais em Pesquisa e no Ensino – 11
Protocolo sob n° 10.1.1484.53.4, aprovado em 02/03/2011 (Anexo A). 12
Os animais foram divididos da seguinte forma: 13
Grupo I – 20 animais, receberam a ração com acréscimo de colesterol 14
Grupo II - 20 animais, receberam a ração padrão 15
Ambos os grupos foram mantidos no biotério tendo livre acesso à respectiva ração por 16
oito semanas. Após esse período, cinco animais de cada grupo (animais controle, sem inflamação) 17
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 39
foram submetidos à eutanásia para análise de lipoproteínas, e o restante foi subdividido para 1
receber as aplicações de LPS, da seguinte maneira: 2
1 semana de aplicação: 5 animais de cada grupo ( I e II)
2 semanas de aplicação: 5 animais de cada grupo( I e II)
4 semanas de aplicação: 5 animais de cada grupo( I e II)
3.5. Coleta de Amostras
Ao final do período de cada tratamento os animais foram mantidos em jejum durante 12 3
horas. Após isso, foram pesados para dosagem de anestésico e submetidos à eutanásia com uma 4
sobredose anestésica. No momento da eutanásia removeu-se 10 mililitros de sangue através de 5
punção cardíaca, com agulha 21G1 acoplada a uma seringa plástica descartável de 10ml. O 6
plasma sanguíneo foi obtido por centrifugação do sangue total. Parte do plasma foi utilizado 7
imediatamente após a coleta para avaliação das lipoproteínas, e o restante foi aliquotado em 8
criotubos e estocados à –80°C para posterior análise. A maxila dos animais foi removida, fixada e 9
descalcificada para análise histológica (ver adiante a descrição detalhada). 10
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 40
3.6. Quantificação de Lipídios e Lipoproteínas
Do sangue colhido e centrifugado, utilizou-se o soro para avaliação de colesterol total, 1
HDL, LDL, VLDL e triglicérides por meio de Kits (LABTEST DIAGNÓSTICA ®), utilizando 2
um sistema enzimático colorimétrico para reação de ponto final, mensurado pelo 3
espectrofotômetro de absorbância. 4
Avaliação do colesterol total – A colheita de amostras para medição do colesterol total 5
deve ser padronizada, uma vez que podem existir efeitos significativos nos resultados se as 6
amostras são colhidas de forma diferente (posição, garroteamento). Além disso, a variação 7
biológica do colesterol pode decorrer da variação biológica das lipoproteínas transportadoras de 8
colesterol, sendo o LDL a que apresenta maior diversidade de medidas. Os animais tiveram 9
padronização dos procedimentos e métodos para a colheita de sangue, e todos os procedimentos 10
foram realizados de acordo com as especificações do fabricante. Mesmo nessas condições, o 11
fabricante dos kits (LABTEST DIAGNÓSTICA ®), informa que pode ocorrer uma variação 12
intrínseca de até 11,6%. 13
Avaliação do LDL – Os valores para LDL foram calculados baseados na Equação de 14
Friedewald: LDL (mg/dl) = colesterol total – HDL + (triglicérides/5 ou VLDL). 15
Avaliação do HDL - Para essa lipoproteína também foi utilizado o Kit LABTEST 16
DIAGNÓSTICA®. Para o HDL segundo o fabricante, pode ocorrer uma variação biológica 17
normal em torno de 7,5%, uma vez que a concentração dessa lipoproteína de alta densidade 18
também sofre influência de fatores como dieta recente, variações de peso corporal, atividades 19
físicas e outros hormônios. Os efeitos dessa variação podem ser controlados até certo ponto por 20
meio da padronização das condições de preparo e colheita das amostras, o que foi realizado nos 21
experimentos aqui descritos. 22
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 41
Avaliação do VLDL – O VLDL foi calculado como 1/5 do valor encontrado para os 1
triglicerídeos. 2
Avaliação dos triglicerídeos – A concentração de triglicérides é influênciada por 3
hábitos dietéticos recentes, variações de peso corporal e exercício físico, então os valores dos 4
triglicérides em um mesmo individuo são bastante variáveis. Embora os animais tenham sido 5
deixados em jejum durante 12 horas antes da coleta do sangue, existe uma considerável variação 6
biológica, podendo existir diferenças de cerca de 21% em medições repetidas num mesmo 7
individuo (segundo orientações do fabricante dos kits). Dessa forma, os valores obtidos para todas 8
as lipoproteínas neste trabalho foram utilizados apenas para uma comparação entre os grupos, e 9
não como avaliação especifica de qualquer dos lipídios séricos. 10
3.7. Técnica Histológica
A peça colhida (maxila) foi imersa em uma solução de formalina 1/10 em água destilada 11
e deixada fixar por 24 horas. Para a descalcificação da peça foi utilizado uma solução de citrato de 12
sódio (a 20% em água destilada) + ácido fórmico (solução a 50% ou ½ em água destilada) 13
segundo protocolo descrito por Behmer, et al. (1975). A cada dois dias foi feita a troca da 14
solução, tendo sido, em média, realizadas 3 trocas (período de aproximadamente uma semana) ou 15
até que a peça apresentasse a necessária descalcificação. Após a descalcificação as peças foram 16
desidratadas por uma série crescente de alcoóis e embebidas em parafina. 17
Dos blocos obtidos foram feitos cortes de 6µm de espessura, sendo selecionado um corte 18
a cada 10, totalizando dois cortes por animal, os quais foram colocados sobre lâmina de vidro e 19
corados com hematoxilina e eosina (H&E) para análise histológica das regiões que receberam a 20
aplicação de LPS (região palatina de incisivos e de 1°molar superior bilateral). 21
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 42
O grau de inflamação na área gengival foi caracterizado levando em consideração a 1
presença de células de defesa (neutrófilos e linfócitos), edema, pavimentação leucocitária e 2
hiperemia. O grau de inflamação foi padronizado da seguinte forma: Ø = sem inflamação; + = 3
inflamação leve; e ++ = inflamação severa. A analise histológica foi realizada por dois 4
avaliadores que não sabiam a qual grupo pertencia a amostra analisada. Foram analisados, em 5
cada região, cinco campos, onde cada campo poderia receber no máximo dois sinais positivos 6
(++), sendo que a somatória final de 10 sinais positivos nos cinco campos refletia 100%. 7
A análise histológica foi realizada com microscópio de luz comum (NIKON®). 8
Pode- se observar nas figuras 2 e 3 exemplos de região do epitélio gengival saudável 9
(sem inflamação) e da região que recebeu as aplicações de LPS, respectivamente, onde 10
posteriormente foi realizada a análise histopatológica. 11
Figura 2 – Apresentação histopatológica do tecido gengival saudável. H&E, Aumento 200x. Sulco gengival da região de incisivo superior.
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 43
Figura 3 – Apresentação histopatológica do tecido gengival com inflamação. H&E, Aumento 200x. Sulco gengival da região de incisivo superior.
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 44
Observe abaixo, exemplos de presença de edema, hiperemia, pavimentação leucocitária e 1
infiltrado celular inflamatório. (Figura 4). 2
Figura 4 – Parâmetros inflamatórios. Presença de edema (áreas claras), células características de inflamação aguda (polimorfonucleares). Observe também vasos com característica de pavimentação vascular leucocitária e vasos hiperêmicos. Hematoxilina e Eosina, aumento 400X.
3.8. Análises Laboratoriais
As dosagens foram realizadas pelo teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent 3
Assay). Sendo que as citocinas, IL-6, IL-1β e TNF-α foram avaliadas através do ELISA tipo 4
sanduíche, e o SLPI e a Leptina foram dosadas através de ELISA indireto. 5
Células de defesa →
Edema →
↑Pavimentação
leucocitária
← Hiperemia
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 45
3.8.1. ELISA INDIRETO
SLPI
Para a dosagem de SLPI foi utilizado o anticorpo primário rabbit polyclonal antibody 1
anti-SLPI of mouse origin (Santa Cruz®), e como anticorpo secundário foi utilizado goat anti-2
rabbit igG-HRP (SC-2004- Santa Cruz®). 3
Não foi utilizada proteína recombinante para curva padrão (os resultados foram obtidos 4
pela comparação entre as densidades ópticas das amostras). 5
As amostras do soro puro dos animais foram depositadas 100µl/poço em duplicata e 6
incubadas overnight à temperatura de 4°C. 7
Realizou-se a lavagem da placa com 200µl/poço com PBS. O bloqueio da placa foi 8
realizado, utilizando-se como tampão de bloqueio ovalbumina a 10% (SIGMA®-albumin from 9
chicken egg whites) em PBS, 200µl/poço, durante duas horas à 37°C. Após o bloqueio realizou-se 10
uma lavagem com PBS (200µl/poço) e foi adicionado anticorpo primário diluído 200 vezes, em 11
tampão de bloqueio, 100µl/poço, incubando-se duas horas em temperatura ambiente. Após 12
incubação, foram feitas duas lavagens com PBS, e adicionou-se anticorpo secundário goat anti-13
rabbit igG-HRP (SC-2004- Santa Cruz®), diluído 1000 vezes em ovalbumina a 10% e depositado 14
100µl por poço, incubando-se 60 minutos à temperatura ambiente. Após esse processo, quatro 15
lavagens foram realizadas, e adicionou-se substrato 2,2’-azino-Bis 3-Ethylbenzthiazoline-6-16
sulfonic Acid (ABTS - SIGMA®) e ABTS enhancer diluído 11X em ABTS liquid substrate 17
(SIGMA®), 100µl/poço, incubou-se por aproximadamente 30 minutos. Como stop solution foi 18
utilizado SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% (100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa 19
foi lida em leitora de microplaca (thermoplate-TP-Reader®) à 405nm. 20
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 46
LEPTINA
Para a dosagem de Leptina foi usado com padrão a recombinant Rat Leptin 1
(peprotech®), e como anticorpo de detecção biotinylated goat anti-rat leptin [1,0µg/ml] 2
(peprotech®). 3
O padrão e as amostras do soro dos animais (diluídas ½ em PBS) foram depositados 4
100µl/poço em duplicata e incubados overnight à temperatura ambiente. 5
O bloqueio da placa foi realizado utilizando-se como tampão de bloqueio PBS +1% BSA 6
(bovine serum albumin - SIGMA®), 300µl/poço, durante duas horas em temperatura ambiente. 7
Após o bloqueio foi realizada uma lavagem (PBS+ 0,05% de tween-20), 300µl/poço. Foi 8
adicionado o anticorpo de detecção diluído (0,1% de BSA+ 0,05% tween-20 em PBS), 9
100µl/poço, incubando-se por duas horas em temperatura ambiente. Após incubação, foram 10
realizadas quatro lavagens. Foi adicionado 100µl/poço de avidina-HRP (peprotech®) diluída 1/ 11
2000, mantido por 30 minutos em temperatura ambiente. Após esse processo quatro lavagens 12
foram realizadas, e adicionou-se substrato ABTS (SIGMA®) e ABTS enhancer diluído 11X em 13
ABTS liquid substrate (SIGMA®), 100µl/poço, incubou-se por aproximadamente 40 minutos. 14
Como stop solution foi utilizado SDS a 1%(100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa foi 15
lida em leitora de microplaca (thermoplate-TP-Reader®) à 405nm. 16
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 47
3.8.2. ELISA SANDUÍCHE
Para a dosagem das citocinas IL-6 e IL-1β foram utilizados kits da Peprotech®, e para 1
dosagem de TNF-α o kit da Abnova® seguindo as orientações dos fabricantes, descritas abaixo. 2
Foi utilizado como padrão de IL-1β: recombinant rat IL-1β+2.2mg BSA+11.0mg D-3
mannitol (Peprotech®) [3 ng/ml]; como anticorpo de captura: antigen-affinity purified rabbit 4
anti-rat IL-1β (Peprotech®) [2µg/ml]; e anticorpo de detecção : biotinylated antigen-affinity 5
purified rabbit anti-rat IL-1β (Peprotech®)[0,5µg/ml]. 6
Para detecção da IL-6 utilizou-se como padrão: recombinant Rat IL-6 + 2.2mg BSA + 7
11.0mg D-mannitol ( Peprotech®) [5ng/ml]; o anticorpo de captura: antigen-affinity purified goat 8
anti-Rat IL-6 + 0.5mg D-mannitol (Peprotech®) [1,0µg/ml]; e para o anticorpo detecção foi 9
utilizado biotinylated antigen-affinity purified goat anti-Rat Il-6 + 0.5mg D-mannitol 10
(Peprotech®) [0,25µg/ml]. 11
O padrão utilizado para detecção de TNF-α: rat TNF-α standard lyphilized 5000 pg/ml 12
(Abnova®); o anticorpo de captura polyclonal antibody to rat TNF-α (Abnova®) já presente na 13
placa; e como anticorpo de detecção: biotin-conjugated anti-rat TNF-α polyclonal antibody 14
(Abnova®). 15
Para detecção de IL-1β e IL-6 a placa de ELISA foi sensibilizada com anticorpo de 16
captura (2µg/ml) diluído em PBS e adicionou-se 100µl/poço. A placa foi incubada overnight em 17
temperatura ambiente. Após isso os poços foram lavados quatro vezes com tampão de lavagem 18
(0.05% tween-20 SIGMA®, em PBS) 300µl/poço. A placa foi incubada em temperatura ambiente 19
por uma hora com 300µl/poço de tampão de bloqueio (1% de BSA em PBS). Em seguida, quatro 20
lavagens. Após este tratamento a placa recebeu as amostras puras em duplicata (soro dos animais) 21
e o padrão foi diluído (0,05% de tween 20 em 0.1% de BSA em PBS) de 3ng/ml a 0 ng/ml. A 22
placa foi incubada por duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação, repetiram-se as 23
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 48
lavagens (quatro vezes). A placa em seguida recebeu o anticorpo de detecção (0,25µg/ml), 1
100µl/poço. Após incubação por mais duas horas os poços foram lavados (quatro vezes) e 2
receberam 100µL de avidina-HRP diluída 2000 vezes (0,05% de tween 20 em 0.1% de BSA em 3
PBS). A placa foi mantida em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a placa foi 4
lavada para receber o substrato ABTS (SIGMA®) e incubou-se por aproximadamente 30 minutos. 5
Para bloqueio da reação foi usado como stop solution SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% 6
(100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa foi lida em leitora de microplaca (thermoplate-7
TP- Reader®) à 405nm. 8
A placa para detecção de TNF-α foi fornecida no kit, sensibilizada com anticorpo 9
primário polyclonal antibody to rat TNF-α. Os poços foram lavados duas vezes com 400 µl/poço 10
de tampão de lavagem (1% de tween 20 em PBS disponibilizado pelo kit abnova ®), em seguida 11
foi adicionado em duplicata o padrão rat TNF-α (diluída 1:2 em diluente fornecido pelo kit 12
abnova®) de 2,5ng/ml a 0,0ng/ml. As amostras foram diluídas também em diluente 1:2 e 13
adicionadas em duplicata 100µl/poço. Foi adicionado 50µl/poço de Biotin -Conjugate diluída 14
1:100 em tampão de ensaio (1% de tween 20 em PBS) e a placa foi então incubada por duas horas 15
em temperatura ambiente. Após a incubação foram realizadas quatro lavagens. Adicionou-se 16
streptavidin-HRP (diluída 1:100 em tampão de ensaio) 100µl/poço incubados por uma hora em 17
temperatura ambiente. Após a incubação foram repetidas as lavagens (quatro vezes) e adicionado 18
100µl/poço de TMB substrate Solution (Tetramethyl-benzidine presente no kit Abnova®) 19
incubados por aproximadamente 10 minutos e com stop solution (1M Acido Fosfórico) 20
100µl/poço, foi realizado o bloqueio da reação. A placa foi lida em leitor de microplaca 21
(thermoplate-TP- Reader®) à 620nm conforme orientações do fabricante. 22
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 49
3.9. Análise Estatística
Para a análise estatística utilizou-se o software GraphPad InStat 5.00 para Windows 1
(1992-2007 GraphPad Software, Inc, San Diego, USA). 2
Após realização de teste de normalidade, concluiu-se que os resultados eram compostos 3
de dados não paramétricos e, portanto, utilizou-se a comparação de duas médias utilizando o teste 4
de Mann-Withney. Consideraram-se para as análises, intervalos de confiança de 95% e valores de 5
p significantes quando iguais ou inferiores a 0,05. 6
Material e Método
I n t r o d u ç ã o | 50
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 51
4. Resultados
4.1. Avaliação do peso dos animais
A pesagem dos animais foi realizada a cada duas semanas durante oito semanas iniciais 1
(antes da aplicação de LPS). Os animais que receberam ração especial (com aumento de 2
colesterol) não apresentaram aumento de peso significante em relação aos animais que receberam 3
ração padrão. 4
Figura 5- Controle de Peso. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). A pesagem dos animais foi realizada a cada duas semanas durante oitos semanas (antes da aplicação de LPS). Teste Mann Whitney.
0
100
200
300
400
500
2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas
Gra
ma
s
Controle de Peso
ração padrão
ração especial
Resultados
4.2. Avaliação dos Lipídio
Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas, 1
apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o 2
grupo de animais que receberam 3
A ração com acréscimo de colesterol ca4
como obsevado na figura 6. 5
Figura 6- Quantificação de LDL e HDL. especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa*p<0.05; **p<0.01.
0
10
20
30
40
50
60
ração padrão
mg
/dl
tempos experimentais
LDL
Lipídio s
Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas,
apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o
de animais que receberam ração padrão.
A ração com acréscimo de colesterol causou um aumento de LDL e diminuição do HDL,
Quantificação de LDL e HDL. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de
tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
ração padrão ração especial
tempos experimentais
LDL
0
10
20
30
40
50
60
ração padrão
mg
/dl
tempos experimentos
HDL
I n t r o d u ç ã o | 52
Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas,
apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o
usou um aumento de LDL e diminuição do HDL,
(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de
tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
ração especial
tempos experimentos
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 53
Os valores de colesterol total, triglicérides e VLDL não apresentaram diferença 1
estatística entre os grupos (figura 7). 2
0
20
40
60
80
100
ração padrão ração especial
mg
/dl
grupos experimentais
Colesterol total
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ração padrão ração especial
mg
/dL
grupos experimentais
Triglicérides
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 54
Figura 7- Quantificação do colesterol total, triglicérides e VLDL. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney.
0
5
10
15
20
ração padrão ração especial
mg
/dl
grupos experimentais
VLDL
Resultados
4.3. Avaliação dos Lipídio
HDL
Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que 1
receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos 2
animais que receberam ração padrão3
Figura 8. Quantificação de HDL durante a inflamaçãocolesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterolalimentaram de ração com acréscimoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª*p<0.05; **p<0.01.
0
10
20
30
40
50
60
70
1°semana
mg
/dl
Lipídio s durante a indução de infecção
Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que
receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos
que receberam ração padrão.
durante a inflamação. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS
alimentaram de ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPSacréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três
períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
2°semana 4°semana ração padrão ração especial
grupos experimentais
HDL
I n t r o d u ç ã o | 55
Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que
receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos
(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de
), ração especial+LPS (animais que se ração padrão+LPS (animais que se
acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
ração especial
Resultados
0
10
20
30
40
50
1°semana
mg
/dl
LDL
Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais 1
com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com 2
animais que receberam ração padrão e LPS. 3
Figura 9. Quantificação de LDL durante a inflamação.colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais qalimentaram com ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em trêperíodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.
Colesterol total, triglicérides e VLDL
Não foi observada relação direta entre as medidas de colesterol total4
e a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela 5
infecção induzida. 6
Da mesma forma, triglicérides e VLDL7
ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação8
2°semana 4°semana ração padrão ração especial
tempos experimentais
LDL
Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais
com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com
animais que receberam ração padrão e LPS.
durante a inflamação. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais q
m ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em trê
(após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
Colesterol total, triglicérides e VLDL
relação direta entre as medidas de colesterol total
a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela
Da mesma forma, triglicérides e VLDL foram observados aumentados em animais com
ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação
I n t r o d u ç ã o | 56
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
ração especial
Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais
com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com
Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se
m ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em três
(após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa
relação direta entre as medidas de colesterol total, VLDL, triglicérides
a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela
observados aumentados em animais com
ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação com aumento de
Resultados
0
20
40
60
80
100
120
1°semana
mg
/dl
colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição 1
desses lipídios e lipoproteínas.2
Figura 10- Quantificação de colesterol totalcolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitneysignificativa *p<0.05.
2°semana 4°semana ração padrão ração especial
tempos experimentais
Colesterol total
colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição
s e lipoproteínas.
Quantificação de colesterol total durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney
I n t r o d u ç ã o | 57
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
ração especial
colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se
padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente
Resultados
0
5
10
15
20
1°semana
mg
/dl
0
20
40
60
80
100
1°semana
mg
/dl
Figura 11. Quantificação de VLDLcolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em trperíodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, dsignificativa *p<0.05; **p<0.0 .
Figura 12. Quantificação de triglicéridescolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitneysignificativa *p<0.05; **p<0.01.
2°semana 4°semana ração padrão ração especial
grupos experimentais
VLDL
2°semana 4°semana ração padrão ração especial
tempos experimentais
Triglicérides
. Quantificação de VLDL durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em trperíodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, d
Quantificação de triglicérides durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney
I n t r o d u ç ã o | 58
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
ração especial
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
ração especial
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se
padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se
padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente
Resultados
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1°semana
% d
e in
fla
ma
ção
4.4. Análise Histopatológica
Os resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível 1
observar diferença estatística entre as áreas analisadas 2
padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores: 3
grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos 4
animais tratados com dieta hipercole5
análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para 6
avaliação do processo inflamatório. A inflamação7
dados podem ser obsevados nos gráficos 8
Figura 13- Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior. acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colestede LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.
semana 2°semana 4°semana ração padrão
tempos experimentais
Região Posterior
4.4. Análise Histopatológica
s resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível
observar diferença estatística entre as áreas analisadas (região de dentes anteriores: grupo ração
padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores:
grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos
animais tratados com dieta hipercolesterolêmica, houve um aumento dos valores obtidos na
análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para
avaliação do processo inflamatório. A inflamação foi então, considerada de maior intensidade.
ser obsevados nos gráficos 13 e 14.
Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colestede LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.
I n t r o d u ç ã o | 59
ração especial +LPS
ração padrão+LPS
ração padrão
s resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível
(região de dentes anteriores: grupo ração
padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores:
grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos
sterolêmica, houve um aumento dos valores obtidos na
análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para
considerada de maior intensidade. Os
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,
Resultados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1°semana
% d
e in
fla
ma
ção
Figura 14 - Avaliação histopatológica do processo acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05
semana 2°semana 4°semana ração padrão
tempos experimentais
Região Anterior
Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região anterior. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam
LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,
mente significativa *p<0.05.
I n t r o d u ç ã o | 60
ração especial+LPS
ração padrão+LPS
ração padrão
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam
LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 61
0
200
400
600
800
1000
1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão
pg
/ml
tempos experimentais
IL-1 β
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
4.5. Avaliação dos mediadores inflamatórios
4.5.1. IL-1 ββββ
Nos períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 semanas), não houve diferença estatística dos 1
níveis de IL-1β entre o grupo de animais que recebeu a ração rica em colesterol e o grupo que 2
recebeu a ração padrão. A quantidade de IL-1β nas amostras de plasma dos animais que 3
receberam apenas ração padrão não foi detectada pelo teste ELISA, como obsevado na figura 15. 4
Figura 15- Quantificação de IL-1β. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de IL-1β foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey.
Resultados
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
1ª semana
pg
/ml
4.5.2. IL-6
Após os períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 1
diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com 2
colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como 3
obsevado na figura 16. 4
Figura 16- Quantificação de IL-6. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa **p<0.01.
4.5.3. TNF-αααα
O resultado obtido para avaliação do TNF5
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos 6
períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol 7
1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão
tempos experimentais
IL-6
Após os períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 semanas) os níveis de IL
diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com
colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como
Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de ILem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
obtido para avaliação do TNF-α está representado pela leitura dada em
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos
períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol
I n t r o d u ç ã o | 62
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
semanas) os níveis de IL-6 apresentaram
diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com
colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais
rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de IL-6 foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
está representado pela leitura dada em
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos
períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol
Resultados
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
1ª semana
DO
(d
en
sid
ad
e ó
pti
ca)
apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na 1
figura 17. 2
Figura 17- Quantificação de TNF-α. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.
4.5.4. SLPI
Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em 3
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2° 4
semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apres5
menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 6
1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão
tempos experimentais
TNF- αααα
apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na
Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de TNFem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2°
semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apres
menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura
I n t r o d u ç ã o | 63
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais
rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de TNF-α foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em
densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2°
semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apresentou leituras
menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 18.
Resultados
Figura 18- Quantificação de SLPI. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.
4.5.5. Leptina
Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina 1
apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo 2
que recebeu ração com colesterol apresentou 3
comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 14
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
1ª semana
DO
(d
en
sid
ad
e ó
pti
ca)
**
Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de SLPI foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina
apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo
que recebeu ração com colesterol apresentou níveis maiores (nos períodos
comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 1
1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão
tempos experimentais
SLPI
ração padrão+LPS
ração especial +LPS
ração padrão
I n t r o d u ç ã o | 64
(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS
(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de SLPI foi realizada
em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente
Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina
apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo
níveis maiores (nos períodos 2° e 4° semana),
comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 19.
ração padrão+LPS
ração especial +LPS
ração padrão
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 65
Figura 19- Quantificação de Leptina. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de leptina foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão
µg
/ml
tempos experimentais
Leptina
ração padrão+LPS
ração especial+LPS
ração padrão
*
*
Resultados
I n t r o d u ç ã o | 66
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 67
5.0. Discussão
A literatura mostra que pacientes portadores de doenças inflamatórias como, por 1
exemplo, a doença periodontal, apresentam elevadas taxas de colesterol (Miyazawa et al., 2012; 2
O’Rourke et al., 2012 ), e existem indícios de que a liberação de citocinas no processo 3
inflamatório pode alterar o metabolismo dos lipídios (McNeely et al., 1995; Homma et al., 2004; 4
Genco et al., 2005). Existem também alguns trabalhos mostrando que níveis elevados de 5
colesterol no organismo podem predispor o desenvolvimento de alterações inflamatórias (Van 6
Halm et al., 2007; Fentoglu et al., 2009). 7
Sabe-se que a dislipidemia pode ser desenvolvida pela dieta inadequada (principalmente 8
quando associada ao sedentarismo), ou por predisposição genética (Fentoglu et al., 2009). 9
Uma alimentação inadequada, como a alta ingestão de gorduras animais, pode acarretar 10
um acúmulo de colesterol no organismo. Em nosso estudo a dislipidemia foi induzida nos animais 11
pelo fornecimento de uma ração com aumento de colesterol. 12
Os animais que tiveram livre acesso à ração com acréscimo de colesterol tiveram 13
aumento de LDL (36,24 mg/dl) e redução de HDL (35,90 mg/dl) quando comparados com os 14
animais do grupo que recebeu ração padrão (LDL -18,48mg/dl, e HDL - 42,87mg/dl). 15
Quanto aos demais lipídios (colesterol total, triglicérides e VLDL) não houve diferença 16
estatística entre o grupo que recebeu a ração com colesterol e o grupo ração padrão. Segundo 17
Tomofuji, et al. (2006), o período de 8 semanas de ingestão rica em colesterol é um período muito 18
curto para elevar triglicérides séricos nos animais. Além disso, existem vários trabalhos que 19
apontam que os ratos wistar são resistentes ao aumento de colesterol pela dieta (Rudling e 20
Angelin, 1993; Ness e Gertz, 2004; Lindsey et al., 2011). 21
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 68
Os resultados mostram que a ração provocou dislipidemia, já que essa alteração pode 1
ser caracterizada por aumento do colesterol LDL e redução de colesterol HDL (Arquivos 2
Brasileiros de Cardiologia, 2007; Hersberger et al., 2011). 3
A obesidade, que tem como um dos parâmetros indicativos o excesso de peso, está 4
associada a um estado de inflamação crônica sistêmica, que promove hiperatividade do sistema 5
imunológico e libera mediadores inflamatórios no organismo (Genco et al., 2005; O’Rourke et 6
al., 2012). Os animais, tratados com a ração com aumento de colesterol não apresentaram 7
aumento significativo de peso em relação aos alimentados com ração padrão. Yamamoto, et al. 8
(2010), em seu estudo também não observou aumento de peso significativo no grupo de 9
animais com ingestão de ração com colesterol pelo período de 8 semanas. Essa observação 10
afasta a hipótese de que os animais estavam obesos e ser essa a causa dos níveis alterados de 11
citocinas inflamatórias. 12
A doença periodontal é uma doença infecciosa causada principalmente por bactérias 13
gram-negativas, que provoca um aumento local e sistêmico de mediadores pró-inflamatórios 14
(Page et al., 1991; Nakajima et al., 2010). 15
Embora os microorganismos sejam considerados agentes etiológicos da doença 16
periodontal, as proteínas mediadoras da inflamação parecem ser as principais responsáveis pela 17
destruição dos tecidos periodontais. Estudos mostram que, pacientes com doença periodontal 18
apresentam níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias no soro e no tecido, tais como IL-1β, 19
IL-6 e TNF-α (Gorska et al., 2003; Pradeep et al., 2009). 20
Várias evidências sugerem que o TNF-α tem um potencial para induzir a degradação 21
do tecido conjuntivo e reabsorção óssea alveolar, além de regular a liberação de IL-1β, que 22
desempenha um papel no inicio e progressão da inflamação (Wei et al., 2004; Kindle et al., 23
2006; Garlet et al., 2010). 24
Vários métodos têm sido usados para induzir a doença periodontal em ratos de forma 25
a avaliar a patogênese da doença e seus possíveis tratamentos, no entanto, não há um modelo 26
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 69
único que reflita todas as características da doença periodontal humana (Klausen, 1991; 1
Guerkan et al., 2009). 2
A doença periodontal pode ser induzida pela manipulação dietética (dieta a base de 3
fibras que pode traumatizar o epitélio devido a mecânica da mastigação e facilitar a penetração 4
de bactérias) (Robinson et al., 1991), introdução de microorganismos patogênicos (Jordan et 5
al., 1972, Fiehn et al., 1992), colocação de uma ligadura, que funciona como um sítio de 6
colonização bacteriana (Klausen, 1991), ou por injeção de toxinas bacterianas como o LPS 7
(lipopolissacarídeo) (Klausen, 1991, Llavaneras et al., 1999, Yamamoto et al., 2010). 8
O LPS (lipopolissacarídeo) é um constituinte da parede celular de praticamente todos 9
os microrganismos subgengivais Gram-negativos (Garrison e Nichols, 1989; Ramamurthy, 10
2002). Estas moléculas provocam permeabilidade vascular, infiltração de leucócitos 11
polimorfonucleares, causando edema (Page, 1991) e liberação de mediadores inflamatórios 12
como as IL-1, IL-6, IL-8, fator de necrose tumoral (Lindemann et al., 1988, Agarwal et al., 13
1995) e prostaglandinas (Garrison et al., 1988, Garrison e Nichols, 1989 ), como subsequente 14
ativação dos osteoclastos (Jiang et al., 2002). 15
Embora a bactéria E. coli não seja uma bactéria periodontopatogênica o efeito 16
inflamatório que ela acarreta no tecido gengival é semelhante ao desenvolvido por bactérias 17
presentes na placa subgengival (Miyauchi et al., 2001; Ramamurthy, 2002; Ekuni et al., 2003). 18
Esse modelo de indução de doença periodontal permite que inflamação permaneça por um 19
período mais extenso quando comparada, por exemplo com o método de ligadura (de Aquino 20
et al., 2009b). 21
A região inflamada é caracterizada por infiltrado de células de defesa, edema, 22
pavimentação leucocitária e hiperemia. Na análise histológica confirmou-se que esses 23
parâmetros estavam presentes nos animais que receberam as aplicações de LPS, demonstrando 24
o quadro de inflamação instalado. 25
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 70
Durante a 1ª e 2ª semana os animais com dislipidemia apresentaram grau de 1
inflamação semelhante ao dos animais saudáveis. Porém, quando os mesmos parâmetros foram 2
observados em um tempo maior de exposição ao agente patogênico (na 4°semana de aplicação 3
do LPS) notou-se um aumento do grau de inflamação nos animais com dislipidemia, sugerindo 4
que a dieta com alto teor de colesterol tem maior efeito na cronicidade do processo 5
inflamatório da gengiva. Estes achados estão de acordo com o trabalho de Tomofuji, et al. 6
(2005, 2006), no qual observaram que ratos com inflamação gengival induzida por aplicação 7
tópica de agentes inflamatórios por 4 semanas (LPS de E. coli e proteases extraída de 8
Streptomyces griseus) e alimentados por oito semanas com uma dieta rica em colesterol, 9
apresentaram uma resposta inflamatória maior comparado ao grupo ração padrão+LPS. 10
A ingestão de uma dieta rica em colesterol pode aumentar a formação de espécies 11
reativas de oxigênio (ROS), que aumenta a peroxidação lipídica causando danos teciduais 12
(Wilson et al., 1999; Balkan et al., 2002; Homma et al., 2004; Sudhahar et al., 2006; Afonso 13
et al., 2013). O estresse oxidativo está envolvido na patogênese de muitas doenças, entre elas a 14
doença periodontal (Wei et al., 2004). O organismo libera espécies reativas de oxigênio como 15
forma de defesa contra os patógenos, e o desequilíbrio entre essas moléculas e as 16
antioxidativas pode levar a uma maior destruição tecidual (Wei et al., 2004). 17
Sendo assim, é provável que o estresse oxidativo produzido pela dieta rica em 18
colesterol somado àquele causado pela presença de bactérias periodontopatogênicas, tenha um 19
efeito importante na progressão da doença periodontal, potencializando a liberação de 20
mediadores inflamatórios no tecido periodontal, causando maior inflamação tecidual 21
(Tomofuji et al., 2006). 22
Os resultados do presente estudo estão de acordo com esses dados, mostrando que a 23
dieta com aumento de colesterol agravou o quadro inflamatório nos animais, principalmente 24
quando o período de exposição é maior. 25
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 71
Numerosos estudos (Henninger et al., 1997; Kimura et al., 1997; Stokes et al., 2002) 1
têm demonstrado que a hipercolesterolemia provoca alteração na microvasculatura, refletida na 2
ativação de células endoteliais, recrutamento de leucócitos, rolamento e aderência, e também a 3
ativação do fator de agregação plaquetária (PAF). 4
Segundo Kim et al. 1991, uma dieta com acréscimo de colesterol aumenta a 5
deposição de lipídios em vários órgãos, o que resulta em um aumento nos níveis de moléculas 6
inflamatórias sistêmicas circulatórias, tais como proteína C-Reativa (Warnberg et al., 2004). 7
Dessa forma, uma dieta rica em colesterol pode, de forma indireta, aumentar a circulação de 8
moléculas inflamatórias, e aumentar a inflamação induzida por agentes patogênicos 9
bacterianos (Tomofuji et al., 2005). 10
O aumento de células inflamatórias no periodonto em resposta ao LPS bacteriano 11
libera mediadores químicos como as citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6 (Ramamurthy, 2002), que 12
podem regular positivamente as metaloproteínases (MMPs), e a síntese de proteinases por 13
macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos (Birkedalhansen et al., 1993) levando a 14
destruição tecidual e óssea no foco da inflamação. 15
As citocinas, que são pequenas proteínas solúveis, e transmitem informações de uma 16
célula para outra (Callard et al., 1999), são potentes estimuladoras da expressão da molécula de 17
adesão celular em células endoteliais, e também são importantes para a etapa de migração das 18
células imunes recrutadas para o foco da inflamação (Sattar et al., 2003; Kindle et al., 2006; 19
Garlet et al., 2010). 20
Em estudos avaliando o nível de IL1-β e TNF-α em animais tratados com uma dieta 21
hiperlipidêmica durante oito semanas e aplicações de LPS por quatro semanas foi observada 22
um aumento dessas citocinas comparada ao grupo ração padrão+LPS (controle) (Tomofuji et 23
al., 2006; Yamamoto et al., 2010). No presente estudo os resultados foram semelhantes, o 24
nível de TNF-α encontrado nos animais com o quadro de inflamação foi maior naqueles que 25
apresentavam dislipidemia (1° e 2° semana). O nível de IL-1β também foi maior em alguns 26
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 72
períodos, apesar de não ser estatisticamente significativo quando comparado ao grupo ração 1
padrão+LPS. 2
Uma das explicações de como a dislipidemia, induzida nos animais, poderia estar 3
predispondo a um grau maior de inflamação seria a hipótese mostrada por Hyka et al., (2001), 4
que demonstraram a capacidade de apolipoproteína AI (apo AI), presente na lipoproteína 5
HDL, em inibir a resposta inflamatória. A apo AI impede a ligação entre monócitos e linfócitos 6
T, impedindo ativação do linfócito, e a liberação de TNF-α e IL1-β. Além disso, o colesterol 7
HDL inibe a expressão de VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) e a ICAM-1 8
(intercellular adhesion molecule) (Ashby et al., 1998) que são moléculas com um importante 9
papel na migração de células inflamatórias da corrente sanguínea até o foco da inflamação. 10
Dessa forma, parece que o HDL apresenta ação anti-inflamatória, e sua redução no organismo 11
reflete de forma negativa na contenção da resposta inflamatória. 12
No presente estudo, entre os animais com inflamação induzida, aqueles que 13
apresentavam perfil dislipidêmico foram os que apresentavam maiores níveis de IL-1β e TNF-14
α, sendo que o nível de HDL estava diminuído em todos os períodos de tratamento (1°semana: 15
27,69 mg/dl; 2°semana: 37,63mg/dl, 4°semana: 32,94mg/dl) em comparação aos animais do 16
grupo ração padrão+LPS (1°semana: 43,64mg/dl; 2°semana: 52,36mg/dl, 4°semana: 17
42,29mg/dl). Assim estes dados corroboram com a ideia de que o nível de HDL reduzido pode 18
contribuir na elevação do nível de citocinas pro- inflamatórias como IL1-β e TNF-α (Hyka et 19
al., 2001; Franco et al., 2011). 20
A IL-6 é uma citocina pró-inflamatória importante envolvida na regulação da resposta 21
do hospedeiro à infecção e lesão no tecido (Marchetti et al., 2012), além de ser uma citocina 22
fundamental para a regulação do metabolismo ósseo, pois está envolvida no processo de 23
reabsorção óssea, e inibição da formação de osso (Moreira et al.,2007). O nível de expressão 24
de IL-6 tem sido associado com a gravidade da doença periodontal (Moreira et al., 2007). 25
Estudos mostram que a expressão prolongada de IL-6 leva a apoptose de neutrófilos e suprime 26
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 73
a infiltração dessas células na área da inflamação, além disso, leva a retenção e ativação de 1
células mononucleares de defesa na área da inflamação, contribuindo para a cronicidade do 2
processo inflamatório (Hurst et al., 2001; Kaplanski et al. 2003; Gabay, 2006, Rose- John et 3
al.,2006; Fonseca et al.,2009). 4
É possível notar que durante todo o período de tratamento com o agente inflamatório 5
o nível de IL-6 estava aumentado nos animais com dislipidemia quando comparado com 6
animais que consumiram ração padrão. 7
A combinação da dieta com alto teor de colesterol e agentes patogênicos bacterianos 8
elevaram TNF- α e IL-6 sistêmico de forma mais expressiva do que em animais com dieta 9
normal, desta forma, esta liberação aumentada, pode exacerbar a destruição do periodonto na 10
doença periodontal. 11
O SLPI é expresso por células epiteliais e tem a função de impedir danos excessivos 12
ao tecido, causados pelas enzimas proteolíticas durante a inflamação. Estudos realizados com 13
camundongos deficientes de SLPI mostraram outras funções dessa proteína, como por 14
exemplo, antagonizar toxinas bacterianas como LPS, suprimir a produção de metaloproteinases 15
e induzir a síntese de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 (McNeely et al., 1995). 16
No presente estudo, nos animais que consumiram a ração padrão, foi observado que 17
durante os estágios iniciais da inflamação os níveis de SLPI apresentaram-se elevados, e que 18
durante os estágios seguintes do experimento houve uma redução dessa molécula. Nakamura, 19
et al. 2003 e Pateel, et al. 2010, também observaram que nos estágios iniciais do doença 20
periodontal, o SLPI está aumentada, e é encontrada em nível reduzido ao longo do processo 21
inflamatório nos estágios em que há um agravamento da doença. 22
Em nosso estudo os animais com dislipidemia, diante da inflamação provocada pelo 23
LPS, tiveram níveis de SLPI reduzidos em todos os períodos experimentais, sugerindo que 24
nesses animais existe um comprometimento na liberação do SLPI. 25
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 74
A dislipidemia parece reduzir os níveis de SLPI, contribuindo para que o organismo 1
esteja mais susceptível à maior agressividade da infecção (Yin et al., 2010), o que corrobora 2
com nossos resultados, pois em animais com dislipidemia, onde o nível de SLPI é reduzido, o 3
grau de inflamação (refletido pelo nível de citocinas e análise histopatológica) é maior do que 4
nos animais saudáveis. 5
A leptina é uma proteína não glicosilada de 16 kDa, codificada pelo gene ob. É 6
sintetizado principalmente por adipócitos e desempenha um papel importante na controle do 7
peso corporal por regular a ingestão de alimentos e liberação de energia, devido a suas ações 8
sobre o hipotálamo (Zhang et al., 1994). 9
Vários estudos sugerem que a proteína leptina pode estar envolvida na regulação da 10
resposta imune em roedores e humanos (Farooqi et al., 2002; De Rosa et al., 2006; Lago et al., 11
2008). Durante episódios inflamatórios foi observado que a leptina atua na defesa do 12
hospedeiro, pois sua ausência contribui substancialmente para a mortalidade e enfraquece a 13
resposta imune local e sistêmica (Tschoep et al., 2010). 14
A leptina contribui para a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a fagocitose por 15
macrófagos (Ahima e Flier, 2000; Karthikeyan e Pradeep, 2007). A presença da leptina e de 16
seu receptor OB-R na mucosa oral e nas glândulas salivares sugere que essa proteína é também 17
de grande importância para as doenças que afetam a cavidade oral (Kim et al.,2010). 18
Em nosso estudo, durante os períodos de aplicações do LPS o nível de leptina de 19
ambos os grupos, estavam elevados comparado ao nível basal, o que sugere que o processo 20
inflamatório elevou o nível de leptina no soro. A detecção da leptina foi progressivamente 21
aumentada de forma proporcional ao tempo de exposição ao agente inflamatório, semelhante 22
ao trabalho de Karthikeyan e Pradeep, (2007), onde eles observaram que o nível de leptina no 23
soro de pacientes, aumentou à medida que a doença periodontal progrediu. Estudos sugerem 24
que a leptina em um nível equilibrado participa da defesa do organismo (Karthikeyan e 25
Pradeep, 2007; Farooqui et al., 2012). Foi observado em nosso estudo que, em animais com 26
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 75
dislipidemia esse hormônio juntamente com mediadores inflamatórios é expresso em um nível 1
elevado quando comparado ao nível basal. Essa observação, assim como a avaliação dos 2
receptores da leptina merecem mais estudos. 3
Discussão
I n t r o d u ç ã o | 76
Conclusão
I n t r o d u ç ã o | 77
6.0. Conclusão
De acordo com os resultados, foi possível concluir que: 1
1. é possível induzir dislipidemia em ratos wistar utilizando-se ração com acréscimo de 2
colesterol; 3
2. a indução da inflamação foi realizada na gengiva dos animais, e mostrou importantes 4
diferenças entre os grupos observados; 5
3. tanto a análise histológica local quanto a avaliação dos mediadores inflamatórios 6
séricos mostraram que principalmente a inflamação crônica está com intensidade 7
aumentada em animais com dislipidemia. 8
4. o SLPI, importante protetor celular e tecidual está com presença diminuída em 9
animais com dislipidemia; 10
5. existe um aumento da detecção de leptina em animais com dislipidemia, no entanto, 11
esse resultado preliminar merece maiores estudos com relação ao: 12
a) efeito de uma quantidade aumentada dessa proteína livre na corrente 13
sanguínea e, 14
b) avaliação da condição dos seus receptores nos tecidos bucais e das 15
consequências dessas situações. 16
Conclusão
I n t r o d u ç ã o | 78
Referências Bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 79
7.0 Referências Bibliográficas
Afonso MS, de O Silva AM, Carvalho EB, et. al. Phenolic compounds from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) attenuate oxidative stress and reduce blood cholesterol concentrations in diet-induced hypercholesterolemic rats. Nutr Metab (Lond) . 2013; 10(1):19.
Agarwal S, Baran C, Piesco NP, Quintero JC, Langkamp HH, Johns LP, Chandra CS. Synthesis of proinflammatory cytokines by human gingival fibroblasts in response to lipopolysaccharides and interleukin-1 beta. J Periodontal Res.1995; 30(6):382–389.
Ahima RS, Flier JS. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab.2000;11(8):327-32.
Andriankaja OM, Sreenivasa S, Dunford R, DeNardin E. Association between metabolic syndrome and periodontal disease. Aust Dent J. 2010;55(3):252-9.
Arnalich F, López J, Codoceo R, Jim nez M, Madero R, Montiel C. Relationship of plasma leptin to plasma cytokines and human survivalin sepsis and septic shock. J Infect Dis. 1999;180(3):908-11.
Ashby DT, Rye KA, Clay MA, Vadas MA, Gamble JR, Barter PJ. Factors influencing the ability of HDL to inhibit expression of vascular cell adhesion molecule-1 in endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol.1998;18(9):1450-5.
Avis HJ, Vissers MN, Wijburg FA, Kastelein JJP, Hutten BA. The use of lipid-lowering drug therapy in children and adolescents. Curr Opin Investig Drugs. 2009;10(3):224-31.
Badimon JJ, Badimon L, Fuster V. Regression of atherosclerotic lesions by high-density-lipoprotein plasma fraction in the cholesterol-fed rabbit. J Clin Invest.1990;85(4):1234-1241.
Balkan J, Oztezcan S, Aykac-Toker G, Uysal M. Effects of added dietary taurine on erythrocyte lipids and oxidative stress in rabbits fed a high cholesterol diet. Biosci Biotechnol Biochem. . 2002;66(12):2701-5.
Behmer AO, Tolosa EMC, Freitas Neto AG de. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. EDART, Livraria Editora Ltda., Editora da Universidade de São Paulo, 150pp.,
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 80
1975.
Birkedalhansen H, Moore WGI, Bodden MK, Windsor LJ, Birkedalhansen B, Decarlo A, et al. Matrix metalloproteinases - a review. Crit Rev Oral Biol Med.1993;4(2):197-250.
Boch JA, Wara-aswapati N, Auron PE. Interleukin 1 signal transduction - Current concepts and relevance to periodontitis. J Dent Res.2001;80(2):400-7.
Boone LR, Brooks PA, Niesen MI, Ness GC. Mechanism of resistance to dietary cholesterol. J Lipids. 2011;2011:101242.
Bullon P, Morillo JM, Ramirez-Tortosa MC, Quiles JL, Newman HN, Battino M. Metabolic syndrome and periodontitis: is oxidative stress a common link? J Dent Res. 2009;88(6):503-18.
Callard R, George AJT, Stark J. Cytokines, chaos, and complexity. Immunity. 1999;11(5):507-13.
Chu XH, Newman J, Park P, Nares S, Ordonez G, Iacopino AM. In vitro alteration of macrophage phenotype and function by serum lipids. Cell Tissue Res.. 1999;296(2):331-7.
Craig TE, Jackson RL, Ohlweiler DF, Ku G. Multiple lipid oxidation products in low density lipoproteins induce interleukin-1 beta release from human blood mononuclear cells. J Lipid Res.1994;35(3):417-427.
Cronstein BN. Interleukin-6--a key mediator of systemic and local symptoms in rheumatoid arthritis. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2007;65(1):S11-5.
Cutler CW, Iacopino AM. Periodontal disease: links with serum lipid/ triglyceride levels? Review and new data. J Int Acad Periodontol. 2003;5(2):47-51.
Cutler CW, Shinedling EA, Nunn M, Jotwani R, Kim BO, Nares S, Iacopino AM. Association between periodontitis and hyperlipidemia: cause or effect? J Periodontol. 1999 Dec;70(12):1429-34.
Dalcico R, de Menezes AM, Deocleciano OB, Oriá RB, Vale ML, Ribeiro RA, de C Brito GA. Protective Mechanisms of Simvastatin in Experimental Periodontal Disease. J Periodontol. 2012; 26.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 81
Da Silva SMCS, et. al. Tratado de Alimentação, Nutrição & Dietoterapia. Capítulo 3- Bioquímica e Metabolismo dos lípides. Editora Roca, 1° edição, São Paulo,1122 pp., 2007.
de Alcântara Neto OD, Silva Rde C, Assis AM, Pinto Ede J. Factors associated with dyslipidemia in children and adolescents enrolled in public schools of Salvador , Bahia. Rev Bras Epidemiol. 2012;15(2):335-45.
de Aquino SG, Guimaraes MR, Stach-Machado DR, da Silva JA, Spolidorio LC, Rossa C Jr. Differential regulation of MMP-13 expression in two models of experimentally induced periodontal disease in rats. Arch Oral Biol . 2009(a) Jul;54(7):609-617.
de Aquino SG, Manzolli Leite FR, Stach-Machado DR, Francisco da Silva JA, Spolidorio LC, Rossa C, Jr. Signaling pathways associated with the expression of inflammatory mediators activated during the course of two models of experimental periodontitis. Life Sci. 2009(b);84(21-22):745-754.
De Rosa V, Procaccini C, La Cava A, Chieffi P, Nicoletti GF, Fontana S, et al. Leptin neutralization interferes with pathogenic T cell autoreactivity in autoimmune encephalomyelitis. J Clin Invest.2006; 116(2): 447-55.
Doxey DL, Nares S, Park B, Trieu C, Cutler CW, Iacopino AM. Diabetes-induced impairment of macrophage cytokine release in a rat model: potential role of serum lipids. Life Sci. 1998;63(13):1127-36.
Ekuni D, Tomofuji T, Yamanaka R, Tachibana K, Yamamoto T, Watanabe T. Initial apical migration of junctional epithelium in rats following application of lipopolysaccharide and proteases. J Periodontol. 2005;76(1):43-8.
Ekuni D, Yamamoto T, Yamanaka R, Tachibana K, Watanabe T. Proteases augment the effects of lipopolysaccharide in rat gingiva. J Periodontal Res.2003;38(6):591-6.
Feingold KR, Staprans I, Memon RA, Moser AH, Shigenaga JK, Doerrler W, et al. Endotoxin rapidly induces changes in lipid-metabolism that produce hypertriglyceridemia - low-doses stimulate hepatic triglyceride production while high-doses inhibit clearance. J Lipid Res. 1992;33(12):1765-76.
Faggioni R, Fantuzzi G, Fuller J, Dinarello CA, Feingold KR, Grunfeld C. IL-1 beta mediates leptin induction during inflammation. Am J Physiol.1998;274(1):R204-R8
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 82
Fani K, Debons AF, Jimenez FA, Hoover EL. Cholesterol-induced atherosclerosis in the rabbit - effect of dimethyl-sulfoxide on existing lesions. J Pharmacol Exp Ther. 1988;244(3):1145-1149.
Franco AG, Sandri S, Campa A. High-density lipoprotein prevents ;SAA-induced production of TNF-α in THP-1 monocytic cells and peripheral blood mononuclear cells. Mem inst Oswaldo Cruz.2011;106(8):986-992.
Farooqui AA, Farooqui T, Panza F, Frisardi V. Metabolic syndrome as a risk factor for neurological disorders. Cell Mol Life Sci. 2012;69(5):741-62.
Farooqi IS, Matarese G, Lord GM, Keogh JM, Lawrence E, Agwu C, et al. Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. J Clin Invest. 2002;110(8):1093-103
Fentoğlu Ö, Bozkurt FY. The Bi-Directional Relationship between Periodontal Disease and Hyperlipidemia. Eur J Dent. 2008;2(2):142-6.
Fentoğlu Ö, Köroğlu BK, Hicyilmaz H, Sert T, Özdem M, Sütcü R, et al. Pro-inflammatory cytokine levels in association between periodontal disease and hyperlipidaemia. J Clin Periodontol. 2011;38(1):8-16.
Fentoğlu Ö, Oz G, Tasdelen P, Uskun E, Aykac Y, Bozkurt FY. Periodontal Status in Subjects With Hyperlipidemia. J Periodontol. 2009;80(2):267-73.
Fiehn NE, Klausen, B, Evans RT. Periodontal bone loss in Porphyromonas gingivalis-infected specific pathogen-free rats after pre-inoculation with endogenous Streptococcus sanguis. J Periodontal Res.1992; 27: 609–614.
Finck BN, Johnson RW. Tumor necrosis factor (TNF)-alpha induces leptin production through the p55 TNF receptor. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2000;278(2):R537-R43.
Fonseca JE, Santos MJ, Canhão H, Choy E. Interleukin-6 as a key player in systemic inflammation and joint destruction. Autoimmun Rev. 2009;8(7):538-542.
Futema M, Plagnol V, Whittall RA, Neil HAW, Humphries SE, Simon Broome Register G, et al. Use of targeted exome sequencing as a diagnostic tool for Familial Hypercholesterolaemia. J Med Genet. 2012;49(10):644-9.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 83
G HB, Rao VS, Kakkar VV. Friend Turns Foe: Transformation of Anti-Inflammatory HDL to Proinflammatory HDL during Acute-Phase Response. Cholesterol. 2011;274629.
Gabay C. Interleukin-6 and chronic inflammation. Arthritis Res Ther . 2006;8
Garlet GP. Destructive and Protective Roles of Cytokines in Periodontitis: a re-appraisal from host defense and tissue destruction viewpoints. J dent Res. 2010; 89(12); 1349-1363.
Garrison SW, Holt SC, Nichols FC. Lipopolysaccharide-stimulated PGE2 release from human monocytes. Comparison of lipopolysaccharides prepared from suspected periodontal pathogens. J Periodontol. 1988; 59(10):684–687.
Garrison SW, Nichols FC. LPS elicited secretory responses in monocytes: altered release of PGE2 but not IL-1 beta in patients with adult periodontitis. J Periodontal Res. 1989; 24(2):88–95.
Genco RJ, Grossi SG, Ho A, Nishimura F, Murayama Y. A proposed model linking inflammation to obesity, diabetes, and periodontal infections. J Periodontol. 2005;76(11):2075-2084.
Giannopoulou C, Defelice R, Andersen E, Cimasoni G. Synthesis of alpha-2-macroglobulin in human gingiva - a study of the concentration of macroglobulin and albumin in gingival fluid and serum. Arch Oral Biol. 1990;35(1):13-6.
Goossens GH, Blaak EE. Adipose tissue oxygen tension: implications for chronic metabolic and inflammatory diseases. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2012;15(6):539-46.
Gorska R, Gregorek H, Kowalski J, Laskus-Perendyk A, Syczewska M, Madalinski K. Relationship between clinical parameters and cytokine profiles in inflamed gingival tissue and serum samples from patients with chronic periodontitis. J Clin Periodontol. 2003;30:1046–52.
Gowdy KM, Fessler MB. Emerging roles for cholesterol and lipoproteins in lung disease. Pulm Pharmacol Ther. 2012;15.
Gray LJ, Yates T, Davies MJ, Brady E, Webb DR, Sattar N, et al. Defining Obesity Cut-Off Points for Migrant South Asians. Plos One. 2011;6(10).
Guerkan A, Emingil G, Nizam N, Doganavsargil B, Sezak M, Kuetuekcueler N, et al.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 84
Therapeutic Efficacy of Vasoactive Intestinal Peptide in Escherichia coli Lipopolysaccharide-Induced Experimental Periodontitis in Rats. J Periodontol. 2009;80(10):1655-64.
Haas MJ, Mooradian AD. Inflammation, high-density lipoprotein and cardiovascular dysfunction. Curr Opin Infect Dis . 2011;24(3):265-72.
Henninger DD, Gerritsen ME, Granger DN. Low-density lipoprotein receptor knockout mice exhibit exaggerated microvascular responses to inflammatory stimuli. Circ Res. 1997;81(2):274-81.
Hersberger M. Dyslipidemias in children and adolescents. Clin Biochem. 2011. 44(7):507-508.
Homma Y, Kondo Y, Kaneko M, Kitamura T, Nyou WT, Yanagisawa M, Yamamoto Y, Kakizoe T. Promotion of carcinogenesis and oxidative stress by dietary cholesterol in rat prostate. Carcinogenesis. 2004;25(6):1011-1014.
Hurst SM, Wilkinson TS, McLoughlin RM, et al. IL-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity . 2001;14(6):705-14.
Hyka N, Dayer JM, Modoux C, Kohno T, Edwards CK 3rd, Roux-Lombard P, Burger D. Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha by blocking contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood. 2001;97(8):2381-9.
Iacopino AM, Cutler CW. Pathophysiological relationships between periodontitis and systemic disease: Recent concepts involving serum lipids. J Periodontol. 2000;71(8):1375-84.
Ishikawa M, Stokes KY, Zhang JH, Nanda A, Granger DN. Cerebral microvascular responses to hypercholesterolemia: roles of NADPH oxidase and P-selectin. Circ Res. 2004;94(2):239-244.
Jiang Y, Mehta CK, Hsu TY, Alsulaimani FF. Bacteria induce osteoclastogenesis via an osteoblast-independent pathway. Infect Immun. .2002;70(6), 3143–3148.
Johnson RB, Serio FG. Leptin within healthy and diseased human gingiva. J Periodontol. 2001;72(9):1254-7.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 85
Jones SA. Directing transition from innate to acquired immunity: defining a role for IL-6. J Immunol. 2005 Sep 15;175(6):3463-8.
Jordan HV, Keyes PH, Bellack S. Periodontal lesions in hamsters and gnotobiotic rats infected with actinomyces of human origin. J Periodontal Res. 1972; 7:21–28.
Kantyka T, Latendorf T, Wiedow O, Bartels J, Glaeser R, Dubin G, et al. Elafin is specifically inactivated by RgpB from Porphyromonas gingivalis by distinct proteolytic cleavage. Biol Chem. 2009;390(12):1313-20.
Kaplanski G, Marin V, Montero-Julian F, Mantovani A, Farnarier C. IL-6: a regulator of the transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation. Trends Immunol. 2003;24(1):25-59.
Karthikeyan BV, Pradeep AR. Gingival crevicular fluid and serum leptin: their relationship to periodontal health and disease. J Clin Periodontol. 2007;34(6):467-72.
Katz J, Flugelman MY, Goldberg A, Heft M. Association between periodontal pockets and elevated cholesterol and low density lipoprotein cholesterol levels. J Periodontol. 2002;73(5):494-500.
Kim KS, Kano K, Kasama T, Ishii Y, Yamashita H, Seyama Y. Effects of cholesterol feeding on corneal dystrophy in mice. Biochim Biophys Acta. 1991;1085(3):343-349
Kim SJ. Leptin potentiates Prevotella intermedia lipopolysaccharide - induced production of TNF-alpha in monocyte-derived macrophages.J Periodontal Implant Sci. 2010;40(3):119-124.
Kimura M, Kurose I, Russell J, Granger DN. Effects of fluvastatin on leukocyte-endothelial cell adhesion in hypercholesterolemic rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17(8):1521-6.
Kindle L, Rothe L, Kriss M, Osdoby P, Collin-Osdoby P. Human microvascular endothelial cell activation by IL-1 and TNF-alpha stimulates the adhesion and transendothelial migration of circulating human CD14(+) monocytes that develop with RANKL into functional osteoclasts. J Bone Miner Res. 2006;21(2):193-206.
Kishimoto T. IL-6: from its discovery to clinical applications. Int Immunol . 2010;22(5):347-452.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 86
Klausen B. Microbiological and immunological aspects of experimental periodontal disease in rats: a review article. J Periodontol. 1991; 62: 59–73.
Krause S, Pohl A, Pohl C, et al. Ex vivo investigation of blood monocyte and platelet behaviour in pigs maintained on an atherogenic diet. Exp Toxicol Pathol. 1992;44(3):144-146.
Kretschmar S, Yin L, Roberts F, London R, Flemmig TT, Arushanov D, et al. Protease inhibitor levels in periodontal health and disease. J Periodontal Res. 2012;47(2):228-35.
Lago R, Gomez R, Lago F, Gomez-Reino J, Gualillo O. Leptin beyond body weight regulation - Current concepts concerning its role in immune function and inflammation. Cell Immunol. 2008;252(1-2):139-45.
Laugisch O, Schacht M, Guentsch A, Kantyka T, Sroka A, Stennicke HR, et al. Periodontal pathogens affect the level of protease inhibitors in gingival crevicular fluid. Mol Oral Microbiol. 2012;27(1):45-56.
Li SL, Liu XL, Okada T, Iwata F, Hara M, Harada K. Serum lipid profile in obese children in China. Pediatr Int. 2004;46(4):425-428.
Lindemann RA, Economou J S, Rothermel H. Production of interleukin-1 and tumor necrosis factor by human peripheral monocytes activated by periodontal bacteria and extracted lipopolysaccharides. J Dent Res. 1988; 67(8):1131–1135
Llavaneras A, Golub LM, Rifkin BR, Heikkilä P, Sorsa T, Teronen O, et al. CMT-8/clodronate combination therapy synergistically inhibits alveolar bone loss in LPS-induced periodontitis. Ann N Y Acad Sci. 1999, jun 878:671–674.
Ludewig B, Jäggi M, Dumrese T, et al. Hypercholesterolemia exacerbates virus-induced immunopathologic liver disease via suppression of antiviral cytotoxic T cell responses. J Immunol. 2001;166(5):3369-3376.
Lupattelli G, Pirro M, Siepi D, Mannarino MR, Roscini AR, Vaudo G, et al. Non-cholesterol sterols in different forms of primary hyperlipemias. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2012;22(3):231-236.
Maglakelidze N, Galogre A, Tsagareli Z. Functional-morphologic aspects of changes of mucosal gingival microcirculatory bed vessels in experimental gingivitis against the background of hypercholesterolemia. Georgian Med News. 2005;(121):71-74.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 87
Marchetti E, Monaco A, Procaccini L, Mummolo S, Gatto R, Tete S, et al. Periodontal disease: the influence of metabolic syndrome. Nutr Metab (Lond). 2012;9(1):88.
Martens GW, Arikan MC, Lee J, Ren F, Vallerskog T, Kornveld H. Hypercholesterolemia impairs immunity to tuberculosis. Infect Immun. 2008; 76(8): 3464-3472.
Mattuella LG, Campagnaro MB, Vargas AE, Xavier LL, Oppermann RV, Chies JA, Miranda LA. Plasma cytokines levels in aggressive and chronic periodontitis. Acta Odontol Scand. 2012 Sep 4.
McNeely TB, Dealy M, Dripps DJ, Orenstein JM, Eisenberg SP, Wahl SM. Secretory leukocyte protease inhibitor - a human saliva protein exhibiting anti-human-immunodeficiency-virus-1 activity in-vitro. J Clin Invest. 1995;96(1):456-64.
Mengel R, Bacher M, Flores-de-Jacoby L. Interactions between stress, interleukin-1 beta, interleukin-6 and cortisol in periodontally diseased patients. J Clin Periodontol. 2002;29(11):1012-1022.
Memon RA; Grunfeld C; Moser AH, Feingold KR. Tumor necrosis factor mediates the effects of endotoxin on cholesterol and triglyceride metabolism in mice. Endocrinology. 1993;132(5):2246-2253.
Mihara M, Hashizume M, Yoshida H, Suzuki M, Shiina M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 2012;122(4):143-159.
Ministério da Saúde [Internet]. Portal da Saúde; Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/portalsaude/noticia/4718/162/quase-metade-da-populacao-brasileira-esta-acima-do-peso.html. Acessado em agosto/2012.
Miyauchi M, Sato S, Kitagawa S, Hiraoka M, Kudo Y, Ogawa I, et al. Cytokine expression in rat molar gingival periodontal tissues after topical application of lipopolysaccharide. Histochem Cell Biol. 2001;116(1):57-62.
Miyazawa H, Tabeta K, Miyauchi S, Aoki-Nonaka Y, Domon H, Honda T, et al. Effect of Porphyromonas gingivalis infection on post-transcriptional regulation of the low-density lipoprotein receptor in mice. Lipids Health Dis. 2012;11.
Monteiro AM, Jardini MAN, Alves S, Giarnpaoli V, Aubin ECQ, Figueiredo Neto AM, et al.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 88
Cardiovascular Disease Parameters in Periodontitis. J Periodontol. 2009;80(3):378-388.
Moreira PR, Lima PM, Sathler KO, Imanishi SA, et al. Interleukin-6 expression and gene polymorphism are associated with severity of periodontal disease in a sample of Brazilian individuals. Clin Exp Immunol . 2007;148(1):119-126.
Nakajima T, Honda T, Domon H, et al. Periodontitis associated up-regulation of systemic inflammatory mediator level may increase the risk of coronary heart disease. J Periodontal Res. 2010;45(1):116-122.
Nakamura A, Mori Y, Hagiwara K, Suzuki T, Sakakibara T, Kikuchi T, et al. Increased susceptibility to LPS-induced endotoxin shock in secretory leukoprotease inhibitor (SLPI)-deficient mice. J Exp Med. 2003;197(5):669-674.
Nazzal D, Therville N, Yacoub-Youssef H, et al. Apolipoprotein E-deficient mice develop an anti – Chlamydophila pneumoniae T helper 2 response and resist vascular infection. J Infect Dis. 2010;202(5):782-790.
Nesbitt MJ, Reynolds MA, Shiau H, Choe K, Simonsick EM, Ferrucci L. Association of periodontitis and metabolic syndrome in the Baltimore Longitudinal Study of Aging. Aging Clin Exp Res. 2010;22(3):238-242.
Ness GC, Gertz KR. Hepatic HMG-CoA reductase expression and resistance to dietary cholesterol. Exp Biol Med (Maywood). 2004;229(5):412-416.
Nibali L, Fedele S, D'Aiuto F, Donos N. Interleukin-6 in oral diseases: a review. Oral Dis. 2012;18(3):236-43
Nisar A, Rasheed U, Aziz W, Farooqi AZ. Prevalence of Dyslipidemias in Autoimmune Rheumatic Diseases. J Coll Physicians Surg Pak. 2012;22(4):235-239.
Nurmohamed MT, Dijkmans BAC. Dyslipidaemia, statins and rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2009;68(4):453-455.
O’Rourke RW. Inflammation, obesity, and the promise of immunotherapy for metabolic disease. Surg Obes Relat Dis. 2012.Aug:2.
Ozdemir H, Kara MI, Erciyas K, Ozer H, Ay S. Preventive effects of thymoquinone in a rat periodontitis model: a morphometric and histopathological study. J Periodontal Res.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 89
2012;47(1):74-80.
Page RC. The role of inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontal-disease. J Periodontal Res. 1991;26(3):230-242.
Pateel D, Seema H, Kale A. Pateel D, Seema H, Kale A. Role of salivary leukocyte proteas inhibitor in periodontal disease progression. J Indian Soc Periodontol. 2010; 14(2):109-113.
Peebles R. Adolescent obesity: etiology, office evaluation, and treatment. Adolesc Med State Art Rev. 2008;19(3):380-405.
Pejcic A, Kesic L, Brkic Z, Pesic Z, Mirkovic D. Effect of Periodontal Treatment on Lipoproteins Levels in Plasma in Patients with Periodontitis. South Med J. 2011;104(8):547-552.
Pradeep AR, Hadge P, Chowdhry S, Patel S, Happy D. Exploring the role of Th1 cytokines: interleukin-17 and interleukin-18 in periodontal health and disease. J Oral Sci. 2009;51(2):261–266
Pussinen PJ, Paju S, Mantyla P, Sorsa T. Serum microbial- and host-derived markers of periodontal diseases: A review. Curr Med Chem. 2007;14(22):2402-2412.
Raitakari OT, Juonala M, Kahonen M, Taittonen L, Laitinen T, Maki-Torkko N, et al. Cardiovascular risk factors in childhood and carotid artery intima-media thickness in adulthood - The Cardiovascular Risk in Young Finns Study. JAMA . 2003;290(17):2277-2283.
Ramamurthy NS, Rifkin BR, Greenwald RA, et al. Inhibition of matrix metalloproteinase-mediated periodontal bone loss in rats: A comparison of 6 chemically modified tetracyclines. J Periodontol. 2002;73(7):726-734.
Robinson M, Hart D, Pigott GH. The effects of diet on the incidence of periodontitis in rats. Lab Anim .1991; 25:247-253.
Rose-John S, Scheller J, Elson G, Jones SA. Interleukin-6 biology is coordinated by membrane-bound and soluble receptors: role in inflammation and cancer. J Leukoc Biol. 2006;80(2):227-236.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 90
Rudling M, Angelin B. Loss of resistance to dietary cholesterol in the rat after Hypophysectomy: Importance of the presence of growth hormone for hepatic low density lipoprotein-receptor expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(19):8851-8855.
Sangwan A, Tewari S, Singh H, Sharma RK, Narula SC. The Association between Psoriasis and Dyslipidemia: A Systematic Review. J Periodontol. 2013; 84(1):3-12.
Sattar N, McCarey DW, Capell H, McInnes IB. Explaining how "high-grade" systemic inflammation accelerates vascular risk in rheumatoid arthritis. Circulation . 2003;108(24):2957-63.
Scardina GA, Pisano T, Cacioppo A, Messina P. Periodontal Alteration of the Microcirculation and Hypercholesterolemia: A Possible Correlation? South Med J. 2011;104(2):116-120.
Shamshiev AT, Ampenberger F, Ernst B, Rohrer L, Marsland BJ, Kopf M. Dyslipidemia inhibits Toll-like receptor-induced activation of CD8alpha-negative dendritic cells and protective Th1 type immunity. J Exp Med. 2007;204(2):441-452.
Siasos G, Tousoulis D, Oikonomou E, Zaromitidou M, Stefanadis C, Papavassiliou AG. Inflammatory Markers in Hyperlipidemia: From Experimental Models to Clinical Practice. Curr Pharm Des. 2011;17(37):4132-4146.
Smolen JS, Avila JC, Aletaha D. Tocilizumab inhibits progression of joint damage in rheumatoid arthritis irrespective of its anti-inflammatory effects: disassociation of the link between inflammation and destruction. Ann Rheum Dis. 2012;71(5):687-93.
Sociedade Brasileira de Cardiologia. I Diretriz Brasileira de Hipercolesterolemia Familiar (HF). Arq Bras Cardiol . 2012;99(2 Supl. 2):1-28
Souza JRM, Oliveira RT, Blotta MHSL, Coelho OR. Níveis séricos de interleucina-6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18) e proteína-C reativa (PCR) na síndrome coronariana aguda sem supradesnivelamento do ST em pacientes com diabete tipo 2. Arq Bras Cardiol. 2008;90(2):94-99.
Sowers JR, Whaley-Connell A, Hayden MR. The Role of Overweight and Obesity in the Cardiorenal Syndrome. Cardiorenal Med. 2011;1(1):5-12.
Sudhahar V, Kumar SA, Varalakshmi P. Role of lupeol and lupeol linoleate on lipemic–oxidative stress in experimental hypercholesterolemia. Life Sci. 2006; 78(12):1329-1335.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 91
Stokes KY, Cooper D, Tailor A, Granger DN. Hypercholesterolemia promotes inflammation and microvascular dysfunction: role of nitric oxide and superoxide. Free Radic Biol Med 2002; 33(8):1026-1036.
Toms TE, Panoulas VF, Smith JP, Douglas KMJ, Metsios GS, Stavropoulos-Kalinoglou A, et al. Rheumatoid arthritis susceptibility genes associate with lipid levels in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2011;70(6):1025-32.
Toms TE, Symmons DP, Kitas GD. Dyslipidaemia in rheumatoid arthritis: the role of inflammation, drugs, lifestyle and genetic factors. Curr Vasc Pharmacol. 2010;8(3):301-26.
Tonet AC, Karnikowski M, Moraes CF, Gomes L, Karnikowski MGO, Cordova C, et al. Association between the-174 G/C promoter polymorphism of the interleukin-6 gene and cardiovascular disease risk factors in Brazilian older women. Braz J Med Biol Res. 2008;41(1):47-53.
Tomofuji T, Azuma T, Kusano H, Sanbe T, Ekuni D, Tamaki N, et al. Oxidative damage of periodontal tissue in the rat periodontitis model: Effects of a high-cholesterol diet. Febs Letters. 2006;580(15):3601-3604.
Tomofuji T, Kusano H, Azuma T, Ekuni D, Yamamoto T, Watanabe T. Effects of a high-cholesterol diet on cell behavior in rat periodontitis. J Dent Res. 2005;84(8):752-756.
Tschoep J, Nogueiras R, Haas-Lockie S, Kasten KR, Castaneda TR, Huber N, et al. CNS Leptin Action Modulates Immune Response and Survival in Sepsis. J Neurosci. 2010;30(17):6036-6047.
Ujiie Y, Oida S, Gomi K, Arai T, Fukae M. Neutrophil elastase is involved in the initial destruction of human periodontal ligament. J Periodontal Res. 2007;42(4):325-330.
Uitto VJ, Nieminen A, Coil J, Hurttia H, Larjava H. Oral fluid elastase as an indicator of periodontal health. J Clin Periodontol. 1996;23(1):30-37.
Van Halm VP, Nielen MMJ, Nurmohamed MT, van Schaardenburg D, Reesink HW, Voskuyl AE, et al. Lipids and inflammation: serial measurements of the lipid profile of blood donors who later developed rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007;66(2):184-8.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 92
Vanderpoll T, Braxton CC, Coyle SM, Boermeester MA, Wang JC, Jansen PM, et al. Effect of hypertriglyceridemia on endotoxin responsiveness in humans. Infect Immun. 1995;63(9):3396-3400.
Vanderpoll T, Romijn JA, Endert E, Borm JJJ, Buller HR, Sauerwein HP. Tumor-necrosis-factor mimics the metabolic response to acute infection in healthy humans. Am J Physiol. 1991;261(4):E457-E65.
Wang H, Peng D-Q. New insights into the mechanism of low high-density lipoprotein cholesterol in obesity. Lipids Health Dis. 2011;10.
Wang S, Xu L, Jonas JB, You QS, Wang YX, Yang H. Prevalence and Associated Factors of Dyslipidemia in the Adult Chinese Population. Plos One. 2011;6(2).
Warnberg J, Moreno LA, Mesana MI, et. al. Inflammatory mediators in overweight and obese Spanish adolescents. The AVENA Study. Int J Obes Relat Metab Disord. 2004; 28(3):S59-S63
Wilson SH, Best PJM, Lerman LO, Holmes DR, Richardson DM, Lerman A. Enhanced coronary vasoconstriction to oxidative stress product, 8-epi-prostaglandinF(2 alpha), in experimental hypercholesterolemia. Cardiovasc Res. 1999;44(3):601-7.
Wei PF, Ho KY, Ho YP, Wu YM, Yang YH, Tsai CC. The investigation of glutathione peroxidase, lactoferrin, myeloperoxidase and interleukin-1β in gingival crevicular fluid: implications for oxidative stress in human periodontal diseases. J Periodontal Res. 2004;39(5):287-93.
Wolfe RR, Shaw JHF, Durkot MJ. Effect of sepsis on VLDL kinetics - responses in basal state and during glucose-infusion. Am J Physiol. 1985;248(6):E732-E40.
Wong PK, Quinn JM, Sims NA, Van Nieuwenhuijze A, Campbell IK, Wicks IP. Interleukin-6 modulates production of T lymphocyte-derived cytokines in antigen-induced arthritis and drives inflammation-induced osteoclastogenesis. Arthritis Rheum . 2006;54(1):158-68.
Xing Z, Gauldie J, Cox G, Baumann H, Jordana M, Lei XF, Achong MK. IL-6 is an antiinflammatory cytokine required for controlling local or systemic acute inflammatory responses. J Clin Invest. 1998;101(2):311-320.
Yamamoto T, Tomofuji T, Tamaki N, Ekuni D, Azuma T, Sanbe T. Effects of topical application of lipopolysaccharide and proteases on hepatic injury induced by high-cholesterol
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 93
diet in rats. J Periodontal Res. 2010;45(1):129-135.
Yin L, Swanson B, An J, et. al. Differential effects of periopathogens on host protease inhibitors SLPI, elafin, SCCA1, and SCCA2. J oral Microbiol . 2010.May 4.
Zhang Y, Proenca R, Maffei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature.1994; 372 (6505):425-432.
Zappalla FR, Gidding SS. Lipid Management in Children. Endocrinol Metab Clin North Am. 2009;38(1):171-183.
IV Diretriz Brasileira Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose Departamento de Aterosclerose da Sociedade Brasileira de Cardiologia. Arq Bras Cardiol . - Volume 88, Suplemento I, Abril 2007.
Referências bibliográficas
I n t r o d u ç ã o | 94
Anexo
I n t r o d u ç ã o | 95
8.0. Anexo
Anexo A – Ofício do comitê de ética no uso de animais
Anexo