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TIAGO FALCÃO EUBANK EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA (PDT) EM SUPERFÍCIES ACRÍLICAS COM BIOFILME Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre Profissional na área de Lasers em Odontologia. Orientador: Prof. Dr. Anderson Zanardi de Freitas Co-orientador: Prof. Dr. Renato Araujo Prates 2012
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TIAGO FALCAtildeO EUBANK
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINAcircMICA (PDT) EM SUPERFIacuteCIES ACRIacuteLICAS COM BIOFILME
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre Profissional na aacuterea de Lasers em Odontologia
Orientador Prof Dr Anderson Zanardi de Freitas Co-orientador Prof Dr Renato Araujo Prates
2012
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AGRADECIMENTOS
Agrave minha famiacutelia minha matildee Marieunice a meu pai Antocircnio Vicente (in memorian)
aos meus irmatildeos Ricardo e Milene meus cunhados Jean e Patriacutecia e demais
familiares que permanecem unidos e fortalecidos
Aos meus sogros Antocircnio e Leila cunhados e esposas Diogo e Manuela Daniel
e Rebeca por todo estiacutemulo dado
Agrave minha querida esposa Marina e agrave minha futura filha Isadora que estimularam
nesta batalha educacional com muita paciecircncia e carinho
Ao Prof Dr Anderson Zanardi de Freitas meu orientador pelo apoio ao tema
escolhido e toda orientaccedilatildeo
Ao Prof Dr Renato Araujo Prates meu co-orientador pela dedicaccedilatildeo e apoio de
supra importacircncia para realizaccedilatildeo deste trabalho
A Profa Drordf Martha Simotildees Ribeiro de Dra Denise Zezell pelos ensinamentos
dados
Aos amigos e colaboradores MSc Claudio Suzuki e Dra Ilka Tiemy Kato que
ajudaram muito no laboratoacuterio durante a realizaccedilatildeo deste estudo
Aos colegas e amigos do Curso Mestrado Profissionalizante em Lasers na
Odontologia
Aos primos Cristiana e Eduardo e aos amigos Andreacute Luiz e Karime que me
ajudaram e me acolheram nos dias em Satildeo Paulo
A todos os professores professoras e funcionaacuterios do Instituto de Pesquisas
Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) e da Faculdade de Odontologia da Universidade
de Satildeo Paulo do Laboratoacuterio Especial em Lasers na Odontologia (LELO) pela
dedicaccedilatildeo e ensinamentos ao longo do curso
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EFEITOS DA TERAPIA FOTODINAcircMICA (PDT) EM SUPERFIacuteCIES ACRIacuteLICAS
COM BIOFILME
Tiago Falcatildeo Eubank
RESUMO
Avaliamos o efeito da terapia fotodinacircmica em superfiacutecies de acriacutelico como de
proacuteteses dentaacuterias e placas de hawley contendo ceacutelulas de Candida albicans em
suspensatildeo e em biofilme e interpretada por OCT ndash Tomografia de Coerecircncia
Oacuteptica O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano inicialmente incubadas com soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente com cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans Observou-se reduccedilatildeo
microbiana do blastoacuteporo de C albicans na PDT apoacutes 6 minutos e principalmente
9 minutos de irradiaccedilatildeo com potecircncia de 100 mW na concentraccedilatildeo de Azul de
Metileno a 50 microM e 70 microM Posteriormente nas concentraccedilotildees de FS 1 mM 05
mM e 005 mM realizamos irradiaccedilotildees em biofilme de C albicans com fluecircncias
de 80 120 160 Jcm2 que resultou em 4 6 e 8 min Houve inalteraccedilatildeo do
conteuacutedo do biofilme apoacutes a irradiaccedilatildeo com todas as condiccedilotildees testadas Os
resultados sugerem que a PDT pode ser um importante mecanismo de reduccedilatildeo
fuacutengica em acriacutelicos e a OCT como teacutecnica de interpretaccedilatildeo em tempo real
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EFFECTS OF PHOTODYNAMIC THERAPY ON BIOFILM FORMED ON
ACRYLIC SURFACE
Tiago Falcatildeo Eubank
ABSTRACT
We evaluated the effect of photodynamic therapy in acrylic surfaces such as
dentures and plates Hawley containing Candida albicans cells in suspension and
in biofilm and interpreted by OCT ndash Optical Coherence Tomography The biofilm
was formed on the surface of 96 wells flat bottomed initially incubated with fetal
bovine serum (FBS) and then with approximately 5x105 cells of C albicans A
microbial reduction of the blastopore form of C albicans was observed following 6
minutes and 9 minutes of laser irradiation with output power P=100 mW
associated with 50 and 70 microM methylene blue Photosensitizer concentrations
from 005 to 1 mM were tested under laser irradiation of 80 120 160 Jcm2 which
resulted in fluences of 4 6 and 8 min on C albicans biofilm There were no killing
effects on biofilm content after irradiation However it could be observed on OCT
images that the biofilm structure was unstructured during the irradiation The
results suggest that PDT can be an important tool to break biofilm structure and it
can reduce cell population in suspensions In addition OCT is an advanced
technique to monitor changes on biofilm architecture during antimicrobial tests
and it can achieve real time data
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SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
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LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
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INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
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imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
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colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
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OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
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REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
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concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
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cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
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2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
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empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
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e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
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MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
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C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
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proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
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Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
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36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
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43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
1
2
AGRADECIMENTOS
Agrave minha famiacutelia minha matildee Marieunice a meu pai Antocircnio Vicente (in memorian)
aos meus irmatildeos Ricardo e Milene meus cunhados Jean e Patriacutecia e demais
familiares que permanecem unidos e fortalecidos
Aos meus sogros Antocircnio e Leila cunhados e esposas Diogo e Manuela Daniel
e Rebeca por todo estiacutemulo dado
Agrave minha querida esposa Marina e agrave minha futura filha Isadora que estimularam
nesta batalha educacional com muita paciecircncia e carinho
Ao Prof Dr Anderson Zanardi de Freitas meu orientador pelo apoio ao tema
escolhido e toda orientaccedilatildeo
Ao Prof Dr Renato Araujo Prates meu co-orientador pela dedicaccedilatildeo e apoio de
supra importacircncia para realizaccedilatildeo deste trabalho
A Profa Drordf Martha Simotildees Ribeiro de Dra Denise Zezell pelos ensinamentos
dados
Aos amigos e colaboradores MSc Claudio Suzuki e Dra Ilka Tiemy Kato que
ajudaram muito no laboratoacuterio durante a realizaccedilatildeo deste estudo
Aos colegas e amigos do Curso Mestrado Profissionalizante em Lasers na
Odontologia
Aos primos Cristiana e Eduardo e aos amigos Andreacute Luiz e Karime que me
ajudaram e me acolheram nos dias em Satildeo Paulo
A todos os professores professoras e funcionaacuterios do Instituto de Pesquisas
Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) e da Faculdade de Odontologia da Universidade
de Satildeo Paulo do Laboratoacuterio Especial em Lasers na Odontologia (LELO) pela
dedicaccedilatildeo e ensinamentos ao longo do curso
3
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINAcircMICA (PDT) EM SUPERFIacuteCIES ACRIacuteLICAS
COM BIOFILME
Tiago Falcatildeo Eubank
RESUMO
Avaliamos o efeito da terapia fotodinacircmica em superfiacutecies de acriacutelico como de
proacuteteses dentaacuterias e placas de hawley contendo ceacutelulas de Candida albicans em
suspensatildeo e em biofilme e interpretada por OCT ndash Tomografia de Coerecircncia
Oacuteptica O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano inicialmente incubadas com soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente com cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans Observou-se reduccedilatildeo
microbiana do blastoacuteporo de C albicans na PDT apoacutes 6 minutos e principalmente
9 minutos de irradiaccedilatildeo com potecircncia de 100 mW na concentraccedilatildeo de Azul de
Metileno a 50 microM e 70 microM Posteriormente nas concentraccedilotildees de FS 1 mM 05
mM e 005 mM realizamos irradiaccedilotildees em biofilme de C albicans com fluecircncias
de 80 120 160 Jcm2 que resultou em 4 6 e 8 min Houve inalteraccedilatildeo do
conteuacutedo do biofilme apoacutes a irradiaccedilatildeo com todas as condiccedilotildees testadas Os
resultados sugerem que a PDT pode ser um importante mecanismo de reduccedilatildeo
fuacutengica em acriacutelicos e a OCT como teacutecnica de interpretaccedilatildeo em tempo real
4
EFFECTS OF PHOTODYNAMIC THERAPY ON BIOFILM FORMED ON
ACRYLIC SURFACE
Tiago Falcatildeo Eubank
ABSTRACT
We evaluated the effect of photodynamic therapy in acrylic surfaces such as
dentures and plates Hawley containing Candida albicans cells in suspension and
in biofilm and interpreted by OCT ndash Optical Coherence Tomography The biofilm
was formed on the surface of 96 wells flat bottomed initially incubated with fetal
bovine serum (FBS) and then with approximately 5x105 cells of C albicans A
microbial reduction of the blastopore form of C albicans was observed following 6
minutes and 9 minutes of laser irradiation with output power P=100 mW
associated with 50 and 70 microM methylene blue Photosensitizer concentrations
from 005 to 1 mM were tested under laser irradiation of 80 120 160 Jcm2 which
resulted in fluences of 4 6 and 8 min on C albicans biofilm There were no killing
effects on biofilm content after irradiation However it could be observed on OCT
images that the biofilm structure was unstructured during the irradiation The
results suggest that PDT can be an important tool to break biofilm structure and it
can reduce cell population in suspensions In addition OCT is an advanced
technique to monitor changes on biofilm architecture during antimicrobial tests
and it can achieve real time data
5
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
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33
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20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
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Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
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23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
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27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
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34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
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32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
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36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
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44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
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48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
2
AGRADECIMENTOS
Agrave minha famiacutelia minha matildee Marieunice a meu pai Antocircnio Vicente (in memorian)
aos meus irmatildeos Ricardo e Milene meus cunhados Jean e Patriacutecia e demais
familiares que permanecem unidos e fortalecidos
Aos meus sogros Antocircnio e Leila cunhados e esposas Diogo e Manuela Daniel
e Rebeca por todo estiacutemulo dado
Agrave minha querida esposa Marina e agrave minha futura filha Isadora que estimularam
nesta batalha educacional com muita paciecircncia e carinho
Ao Prof Dr Anderson Zanardi de Freitas meu orientador pelo apoio ao tema
escolhido e toda orientaccedilatildeo
Ao Prof Dr Renato Araujo Prates meu co-orientador pela dedicaccedilatildeo e apoio de
supra importacircncia para realizaccedilatildeo deste trabalho
A Profa Drordf Martha Simotildees Ribeiro de Dra Denise Zezell pelos ensinamentos
dados
Aos amigos e colaboradores MSc Claudio Suzuki e Dra Ilka Tiemy Kato que
ajudaram muito no laboratoacuterio durante a realizaccedilatildeo deste estudo
Aos colegas e amigos do Curso Mestrado Profissionalizante em Lasers na
Odontologia
Aos primos Cristiana e Eduardo e aos amigos Andreacute Luiz e Karime que me
ajudaram e me acolheram nos dias em Satildeo Paulo
A todos os professores professoras e funcionaacuterios do Instituto de Pesquisas
Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) e da Faculdade de Odontologia da Universidade
de Satildeo Paulo do Laboratoacuterio Especial em Lasers na Odontologia (LELO) pela
dedicaccedilatildeo e ensinamentos ao longo do curso
3
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINAcircMICA (PDT) EM SUPERFIacuteCIES ACRIacuteLICAS
COM BIOFILME
Tiago Falcatildeo Eubank
RESUMO
Avaliamos o efeito da terapia fotodinacircmica em superfiacutecies de acriacutelico como de
proacuteteses dentaacuterias e placas de hawley contendo ceacutelulas de Candida albicans em
suspensatildeo e em biofilme e interpretada por OCT ndash Tomografia de Coerecircncia
Oacuteptica O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano inicialmente incubadas com soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente com cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans Observou-se reduccedilatildeo
microbiana do blastoacuteporo de C albicans na PDT apoacutes 6 minutos e principalmente
9 minutos de irradiaccedilatildeo com potecircncia de 100 mW na concentraccedilatildeo de Azul de
Metileno a 50 microM e 70 microM Posteriormente nas concentraccedilotildees de FS 1 mM 05
mM e 005 mM realizamos irradiaccedilotildees em biofilme de C albicans com fluecircncias
de 80 120 160 Jcm2 que resultou em 4 6 e 8 min Houve inalteraccedilatildeo do
conteuacutedo do biofilme apoacutes a irradiaccedilatildeo com todas as condiccedilotildees testadas Os
resultados sugerem que a PDT pode ser um importante mecanismo de reduccedilatildeo
fuacutengica em acriacutelicos e a OCT como teacutecnica de interpretaccedilatildeo em tempo real
4
EFFECTS OF PHOTODYNAMIC THERAPY ON BIOFILM FORMED ON
ACRYLIC SURFACE
Tiago Falcatildeo Eubank
ABSTRACT
We evaluated the effect of photodynamic therapy in acrylic surfaces such as
dentures and plates Hawley containing Candida albicans cells in suspension and
in biofilm and interpreted by OCT ndash Optical Coherence Tomography The biofilm
was formed on the surface of 96 wells flat bottomed initially incubated with fetal
bovine serum (FBS) and then with approximately 5x105 cells of C albicans A
microbial reduction of the blastopore form of C albicans was observed following 6
minutes and 9 minutes of laser irradiation with output power P=100 mW
associated with 50 and 70 microM methylene blue Photosensitizer concentrations
from 005 to 1 mM were tested under laser irradiation of 80 120 160 Jcm2 which
resulted in fluences of 4 6 and 8 min on C albicans biofilm There were no killing
effects on biofilm content after irradiation However it could be observed on OCT
images that the biofilm structure was unstructured during the irradiation The
results suggest that PDT can be an important tool to break biofilm structure and it
can reduce cell population in suspensions In addition OCT is an advanced
technique to monitor changes on biofilm architecture during antimicrobial tests
and it can achieve real time data
5
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
3
EFEITOS DA TERAPIA FOTODINAcircMICA (PDT) EM SUPERFIacuteCIES ACRIacuteLICAS
COM BIOFILME
Tiago Falcatildeo Eubank
RESUMO
Avaliamos o efeito da terapia fotodinacircmica em superfiacutecies de acriacutelico como de
proacuteteses dentaacuterias e placas de hawley contendo ceacutelulas de Candida albicans em
suspensatildeo e em biofilme e interpretada por OCT ndash Tomografia de Coerecircncia
Oacuteptica O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano inicialmente incubadas com soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente com cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans Observou-se reduccedilatildeo
microbiana do blastoacuteporo de C albicans na PDT apoacutes 6 minutos e principalmente
9 minutos de irradiaccedilatildeo com potecircncia de 100 mW na concentraccedilatildeo de Azul de
Metileno a 50 microM e 70 microM Posteriormente nas concentraccedilotildees de FS 1 mM 05
mM e 005 mM realizamos irradiaccedilotildees em biofilme de C albicans com fluecircncias
de 80 120 160 Jcm2 que resultou em 4 6 e 8 min Houve inalteraccedilatildeo do
conteuacutedo do biofilme apoacutes a irradiaccedilatildeo com todas as condiccedilotildees testadas Os
resultados sugerem que a PDT pode ser um importante mecanismo de reduccedilatildeo
fuacutengica em acriacutelicos e a OCT como teacutecnica de interpretaccedilatildeo em tempo real
4
EFFECTS OF PHOTODYNAMIC THERAPY ON BIOFILM FORMED ON
ACRYLIC SURFACE
Tiago Falcatildeo Eubank
ABSTRACT
We evaluated the effect of photodynamic therapy in acrylic surfaces such as
dentures and plates Hawley containing Candida albicans cells in suspension and
in biofilm and interpreted by OCT ndash Optical Coherence Tomography The biofilm
was formed on the surface of 96 wells flat bottomed initially incubated with fetal
bovine serum (FBS) and then with approximately 5x105 cells of C albicans A
microbial reduction of the blastopore form of C albicans was observed following 6
minutes and 9 minutes of laser irradiation with output power P=100 mW
associated with 50 and 70 microM methylene blue Photosensitizer concentrations
from 005 to 1 mM were tested under laser irradiation of 80 120 160 Jcm2 which
resulted in fluences of 4 6 and 8 min on C albicans biofilm There were no killing
effects on biofilm content after irradiation However it could be observed on OCT
images that the biofilm structure was unstructured during the irradiation The
results suggest that PDT can be an important tool to break biofilm structure and it
can reduce cell population in suspensions In addition OCT is an advanced
technique to monitor changes on biofilm architecture during antimicrobial tests
and it can achieve real time data
5
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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4
EFFECTS OF PHOTODYNAMIC THERAPY ON BIOFILM FORMED ON
ACRYLIC SURFACE
Tiago Falcatildeo Eubank
ABSTRACT
We evaluated the effect of photodynamic therapy in acrylic surfaces such as
dentures and plates Hawley containing Candida albicans cells in suspension and
in biofilm and interpreted by OCT ndash Optical Coherence Tomography The biofilm
was formed on the surface of 96 wells flat bottomed initially incubated with fetal
bovine serum (FBS) and then with approximately 5x105 cells of C albicans A
microbial reduction of the blastopore form of C albicans was observed following 6
minutes and 9 minutes of laser irradiation with output power P=100 mW
associated with 50 and 70 microM methylene blue Photosensitizer concentrations
from 005 to 1 mM were tested under laser irradiation of 80 120 160 Jcm2 which
resulted in fluences of 4 6 and 8 min on C albicans biofilm There were no killing
effects on biofilm content after irradiation However it could be observed on OCT
images that the biofilm structure was unstructured during the irradiation The
results suggest that PDT can be an important tool to break biofilm structure and it
can reduce cell population in suspensions In addition OCT is an advanced
technique to monitor changes on biofilm architecture during antimicrobial tests
and it can achieve real time data
5
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
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empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
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C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
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9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
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10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
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13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
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42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
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Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
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48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
5
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO07
2 OBJETIVO10
3 REVISAtildeO DE LITERATURA11
4 MATERIAIS E MEacuteTODO17
5 RESULTADOS22
6DISCUSSOtildeES27
7 CONCLUSOtildeES30
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS31
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
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28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
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30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
6
LISTA DE SIGLAS EOU ABREVIATURAS
cm - Centimetro
AM ndash Fotossensibilizador Azul de Metileno
FOUSP - Faculdade de Odontologia da Universidade de Satildeo Paulo
g - Gramas
GaAlAs - Arsenieto de Gaacutelio-Alumiacutenio
IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares
J - Joule
Jcm2
mJ - Mili-Joule
mm - Miliacutemetros
mW - mili-Watt
nm - Nanometro
W - Watts
Wcm2
TPI ndash tempo de preacute irradiaccedilatildeo
7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
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22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
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23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
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32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
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7
INTRODUCcedilAtildeO
Os Aparelhos Ortodocircnticos Removiacuteveis (AOR) satildeo do tipo dento-muco-
suportados e na maioria dos casos tecircm a funccedilatildeo de ancoragem suporte
retenccedilatildeo e podem ter funccedilatildeo ativa Os AOR satildeo dispositivos destinados a
interferir nas maacutes oclusotildees e em 1902 CA Hawley utilizou o aparelho palatal
removiacutevel que apresenta acriacutelico em sua estrutura com o objetivo de conter
dentes previamente movimentados ortodocircnticamente Ainda hoje a placa de
contenccedilatildeo de Hawley tem esse uso mas muitas modificaccedilotildees foram introduzidas
para transformaacute-la num aparelho ativo (VELLINI 2011)
As desarmonias do sistema estomatognaacutetico quando bem diagnosticados
podem ser corrigidas com o uso dos AOR e esta correccedilatildeo depende de um bom
conhecimento das potencialidades mecacircnicas controle de utilizaccedilotildees e
conhecimento das limitaccedilotildees da teacutecnica de movimentaccedilatildeo Portanto o profissional
deve conhecer bem as estruturas anatocircmicas morfologia histologia
neurofisiologia da regiatildeo aleacutem de apresentar experiecircncia cliacutenica Um dos desafios
da utilizaccedilatildeo da Placa de Hawley eacute a possibilidade de agregaccedilatildeo de biofilme na
sua estrutura acriacutelica o que pode gerar infecccedilotildees bacterianas e fuacutengica pelo
acuacutemulo e colonizaccedilatildeo de patoacutegenos que podem colocar em risco a sauacutede do
paciente Dentre as condiccedilotildees infecciosas podemos citar a hiperplasia palatal e
gengival candidiacutease halitose e acometimentos sistecircmicos em pacientes
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
8
imunodeprimidos como HIVAIDS e submetidos a tratamentos de radioterapia e
quimio-teraacutepicos (NEVILLE 2009)
O fungo Candida spp principalmente da espeacutecie C albicans encontra-se
em cerca de 60 do hospedeiro humano como comensal nos tratos digestivo e
vaginal Logo a candidose oral eacute denominaccedilatildeo dada quando a C albicans
representa uma infecccedilatildeo fuacutengica oportunista na cavidade oral ocasionado por
proacuteteses natildeo higienizadas e mal adaptadas resultando em palato eritematoso
hiperplasia gengival odor feacutetido e dor sintomaacutetica (ASSAD 2004)
A Estomatite de dentadura eacute a forma mais comum de candidose oral com
incidecircncia global de 11-65 em pacientes portadores de proacutetese total Esta
doenccedila eacute caracterizada por diferentes graus de inflamaccedilatildeo da mucosa Embora
possa haver comprometimento sistecircmico fatores locais tambeacutem desempenham
um importante papel na etiologia desta doenccedila como o aumento da idade da
proacutetese trauma de proacutetese desgaste contiacutenuo da proacutetese e maacute higienizaccedilatildeo No
entanto a interface proacutetese-palatal oferece um nicho ecoloacutegico propiacutecio para
colonizaccedilatildeo fuacutengica e bacteriana por causa do ambiente relativamente
anaeroacutebico e aacutecido Espeacutecies fuacutengicas de Candida spp tem alta afinidade por
aderir a superfiacutecies e colonizar acriacutelico como C glabata C dubliniensis C
krusei C tropicalis e C albicans sendo esta uacuteltima a mais comumente descrita
(MIMA 2011)
Os tratamentos convencionais para a candidose incluem os derivados
poliecircnicos como a nistatina que apresenta comprovada eficaacutecia contra C
albicans Este faacutermaco estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito desta forma
a pomada toacutepica eacute bastante empregada A anfotericina B de uso parenteral eacute um
derivado poliecircnico reservado para casos sistecircmicos graves e possui efeitos
9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
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33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
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38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
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9
colaterais como febre calafrios naacuteusea diminuiccedilatildeo da funccedilatildeo renal com
elevaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de ureacuteia e creatinina e reduccedilatildeo dos niacuteveis de potaacutessio
(NEVILLE 2009)
Poreacutem novas teacutecnicas estatildeo sendo pesquisadas como a terapia
fotodinacircmica (PDT) na qual ceacutelulas-alvo satildeo coradas com um fotossensibilizador
(FS) e irradiadas por luz de comprimento de onda ressonante ao FS (GONZALES
2011) Esse processo fotoquiacutemico gera espeacutecies reativas de oxigecircnio como
peroacutexidos radicais hidroxila acircnions superoacutexido e oxigecircnio singleto o que resulta
em um meacutetodo bastante eficaz para eliminar diferentes patoacutegenos incluindo
microrganismos resistentes a antimicrobianos Eacute uma teacutecnica que sugere
aplicaccedilatildeo in vivo em infecccedilotildees localizadas de pouca profundidade Apresenta
baixo custo baixa toxicidade comprovada ao azul de metileno simplicidade de
uso e diminuiccedilatildeo de probabilidade de recorrecircncia infecciosa (PEREIRA 2009)
A Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica eacute uma teacutecnica eficaz com resposta
uniforme numa zona larga do espectro capaz de interpretar imagens em tempo
real O seccionamento eacute semelhante agrave bioacutepsia de tecidos bioloacutegicos comum em
citologia que eacute comum referirem OCT como bioacutepsia oacuteptica (ROSA 2010)
O paradoxo de um biofilme de infecccedilotildees crocircnicas eacute que algumas vezes natildeo
haacute resposta agrave terapia antimicrobiana mesmo quando causada por patoacutegeno que
natildeo eacute resistente ao agente antimicrobiano A explicaccedilatildeo simples eacute que o agente
natildeo consegue efetivamente alcanccedilar algumas ceacutelulas in vivo resultando em
recidiva da infecccedilatildeo Desta forma um efeito combinado entre agentes
antimicrobianos e terapia fotodinacircmica resultaria em estrateacutegia eficaz no combate
de patoacutegenos que permanecem resistentes (VERA 2011)
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
10
OBJETIVO
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da terapia fotodinacircmica
antimicrobiana na inativaccedilatildeo de biofilme de C albicans formado sobre placa de 96
poccedilos e comparar com a inativaccedilatildeo deste fungo em suspensatildeo
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
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48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
11
REVISAtildeO DE LITERATURA
1 - Meacutetodos quiacutemicos de controle de microrganismos
CATAtildeO et al em 2007 propuseram um estudo para avaliar
comparativamente trecircs substacircncias empregadas na higienizaccedilatildeo quiacutemica de
proacuteteses totais A amostragem constou de 93 proacuteteses provenientes de 54
pacientes portadores de dentaduras dupla ou simples As peccedilas foram
submetidas agrave evidenciaccedilatildeo do biofilme para posterior imersatildeo nas substacircncias
quiacutemicas avaliadas grupo 1- hipoclorito de soacutedio a 225 2- perborato de soacutedio e
3- clorexidina a 2 aos quais foram aplicados escores poacutes-evidenciaccedilatildeo e poacutes-
higienizaccedilatildeo para quantificar o biofilme e avaliar a sua remoccedilatildeo apoacutes cada
meacutetodo quiacutemico Estas anaacutelises foram realizadas por dois avaliadores
previamente calibrados os quais efetuaram um estudo comparativo entre os
casos Concluiu-se que o grupo do hipoclorito obteve maior eficaacutecia na remoccedilatildeo
do biofilme e que nenhum meacutetodo isolado consegue eliminar todo o biofilme da
superfiacutecie das proacuteteses
A Candida albicans eacute um organismo comensal e estaacute presente no ser
humano sem causar infecccedilotildees coexistindo com o hospedeiro Pode colonizar o
trato intestinal oral vaginal respiratoacuterio urinaacuterio sanguiacuteneo aleacutem de outras
partes do corpo (NEVILLE 2009)
Em 2007 UCAR et al realizaram um estudo in vitro para avaliar a
efetividade de agentes quiacutemicos na eliminaccedilatildeo de C albicans sobre proacuteteses de
dentadura Os agentes hipoclorito de soacutedio a 2 aacutecido aceacutetico a 5 peroacutexidos
alcalinos gluconato de clorexidina a 012 foram testados e os autores
12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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12
concluiacuteram que todos os agentes de desinfecccedilatildeo foram efetivos na eliminaccedilatildeo da
C albicans
Embora as infecccedilotildees nas mucosas sejam a forma de doenccedila mais comum
as infecccedilotildees sistecircmicas provocadas por esta levedura aumentaram
particularmente em doentes com o sistema imunoloacutegico comprometido em
particular doentes infectados com o viacuterus HIV (CHANDRA 2001)
Em 2007 PIRES et al reportaram que diversas substacircncias antiseacutepticas
tecircm sido utilizadas juntamente aos procedimentos mecacircnicos rotineiros de higiene
oral com base em seus efeitos antimicrobianos Neste estudo avaliou-se in vitro
a eficiecircncia antimicrobiana de um enxaguatoacuterio bucal contendo TriclosanGantrez
e bicarbonato de soacutedio em comparaccedilatildeo a controles positivos e negativos
Linhagens de Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Actinomyces viscosus e
Bacillus subtilis foram testadas Os resultados mostraram que a soluccedilatildeo teste
inibiu o crescimento de microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos da
saliva dos voluntaacuterios bem como das linhagens padratildeo
Para YEacuteVENES et al 2009 enxaguatoacuterios contendo clorexidina parecem
ser os mais eficazes agentes quiacutemicos para controle de placa em uma
concentraccedilatildeo de 012 ou 020 Este estudo teve por objetivo comparar a
eficaacutecia do gel de clorexidina a 01 com enxaguatoacuterios contendo 012 e
005
MOREIRA et al em 2009 avaliaram a atividade antimicrobiana de
antisseacutepticos bucais sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 115442 Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus ATCC
6538 e sobre bacteacuterias obtidas de uma amostra de saliva de 10 indiviacuteduos Foram
analisados enxaguatoacuterios com os seguintes antisseacutepticos gluconato de
clorexidina a 012 por cento gluconato de clorexidina a 02 por cento cloreto de
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
13
cetilpiridiacutenio com e sem fluacuteor timol triclosan com fluacuteor A teacutecnica utilizada foi por
difusatildeo em agar meacutetodo da placa com orifiacutecio com incubaccedilatildeo a 37ordm C em
aerobiose e microaerofilia Apoacutes incubaccedilatildeo observou-se a presenccedila ou a
ausecircncia de halo de inibiccedilatildeo de crescimento em torno dos orifiacutecios A formaccedilatildeo de
halo demonstrou atividade antimicrobiana Nos enxaguatoacuterios com timol e com
fluacuteor associado ao xilitol natildeo foi evidenciada atividade sobre as bacteacuterias
utilizadas Os outros enxaguatoacuterios apresentaram eficaacutecia sobre as bacteacuterias
com exceccedilatildeo dos que continham cloreto de cetilpiridiacutenio que natildeo apresentaram
atividade sobre Pseudomonas aeruginosa e do enxaguatoacuterio com malva
associada ao fluacuteor e xilitol sem atividade sobre P aeruginosa S mutans e
bacteacuterias da saliva Os enxaguatoacuterios com triclosan com fluacuteor peroacutexido de
hidrogecircnio e clorexidina foram os mais efetivos de acordo com o diacircmetro dos
halos de inibiccedilatildeo formados e a metodologia utilizada Este estudo vem a sugerir
que substacircncias antisseacutepticas podem constituir-se em opccedilatildeo complementar para
o controle do biofilme dental
Em 2010 BORGES et al analisaram 40 placas de Petri com meio de
cultura de aacutegar sangue com seguintes microorganismos Staphylococus aureus
Candida albicans Enterrococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Avaliou-se
neste estudo o Periogard o CEPACOL Plax Classic e o ORAL-B O Periogard
com aacutelcool e o sem aacutelcool apresentaram os melhores resultados sugerindo que
os enxaguatoacuterios sem aacutelcool natildeo tecircm a mesma eficaacutecia antimicrobiana
comparada aos enxaguatoacuterios com aacutelcool
A nistatina estaacute disponiacutevel na forma de suspensatildeo para bochechos e
pomada na primeira ao ser deglutida pode causar naacuteusea e vocircmito dessa forma
que a pomada toacutepica eacute bastante empregada (NEVILLE 2009)
14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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34
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32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
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14
2-Terapia Fotodinacircmica
Agentes quiacutemicos antibacterianos satildeo cada vez mais usados em regimes
profilaacuteticos e terapecircuticos segundo WILSON 2004 Bacteacuterias e microacutebios podem
ser sensibilizados por um fotossensibilizador como Azul de Metileno (AM) Azul de
Toluidina Lipopolissacaacutedeo (PLS) A Terapia Fotodinacircmica eacute uma abordagem
para doenccedilas periodontais infecccedilotildees de canais radiculares doenccedilas cariogecircnicas
e fuacutengicas
MAISCH 2006 relatou os princiacutepios fundamentais e aplicaccedilotildees cliacutenicas da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Busca delinear novas aplicaccedilotildees que podem tornar-
se uacutetil no futuro na praacutetica cliacutenica O aumento na resistecircncia a antibioacuteticos em todo
o mundo tem impulsionado a pesquisa para o desenvolvimento de novas
estrateacutegias antimicrobianas doenccedilas cutacircneas infecccedilotildees repetidas na qual a
terapia fotodinacircmica tende a ser eficaz em cicatrizaccedilatildeo de feridas O uso do
fotossensibilizador e luz como um agente antimicrobiano contra microrganismos
da doenccedila periodontal deve igualmente constituir um atrativo meacutetodo de
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias orais A PDT antimicrobiana pode ser uma opccedilatildeo
terapecircutica alternativa na praacutetica cliacutenica dependendo da farmacocineacutetica e o
tempo de iluminaccedilatildeo
KONOPKA et al em 2007 descreveu a funcionalidade da PDT tambeacutem
conhecido Terapia Fotodinacircmica que envolve o uso de corante fotoativo
(Fotossensibilizador) que eacute ativado pela exposiccedilatildeo agrave luz de um
comprimento de onda especiacutefico na presenccedila de oxigecircnio
BEVILACQUA et al em 2007 investigaram o efeito da terapia
fotodinacircmica (PDT) com azul de toluidina (TBO) O agente sensibilizador
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
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23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
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34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
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31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
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38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
15
empregado com a adiccedilatildeo de um diodo emissor de luz (LED) na viabilidade de
ceacutelulas de Streptococcus mutans em condiccedilotildees ideais e controladas em uma
cultura plantocircnica Crescimento de Streptococcus mutans eacute o primeiro passo no
desenvolvimento da caacuterie dentaacuteria A PDT tem grande aplicabilidade na
odontologia a luz e corantes promovem a morte celular de uma forma natildeo
invasiva reduzindo o tempo de tratamento e ganhando em eficiecircncia O LED
utilizado neste estudo tinha potecircncia de 116 mW sua energia foi de 12 J e
fluecircncia de 218 cm2 Cem por cento das bacteacuterias foram mortas apoacutes irradiaccedilatildeo
com LED e TBO Concluiu-se que a PDT foi eficiente em matar os
microrganismos e evitar a formaccedilatildeo de biofilmes
PEREIRA et al em 2009 avaliaram o efeito antimicrobiano da PDT em
biofilmes formados por C albicans (GI) S aureus (GII) e S mutans (GIII)
isolados e em associaccedilotildees (GIV-VII) Os biofilmes foram formados em discos de
resina acriacutelica esterilizados imersos em caldo de infusatildeo com 5 de sacarose
inoculados com a suspensatildeo microbiana e incubados por 5 dias Apoacutes o periacuteodo
de incubaccedilatildeo os discos foram lavados com soluccedilatildeo fisioloacutegica esterilizada para
remover as ceacutelulas natildeo-aderidas Foram avaliados os efeitos do
fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentraccedilatildeo de 01 mgmL por 5
min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s Concluiu-se que a PDT pode ser uma
abordagem uacutetil no controle de biofilmes bucais
3 ndash Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica OCT
A OCT prevecirc uma resoluccedilatildeo axial e lateral no ar de 60 μm As imagens
geradas tecircm 1 Mpixel (2000x512) correspondendo a um alcance lateral de 6 mm
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
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13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
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36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
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36
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51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
16
e uma profundidade axial de 15 mm permitindo avaliar a qualidade e a
profundidade atingida pela irradiaccedilatildeo laser (SANTOS 2009)
Em 2011 SHARMA realizou uma revisatildeo de Literatura a respeito da
Terapia Fotodinacircmica (PDT) Relata a importacircncia dos estudos em modelos de
ratos em patoacutegenos sensiacuteveis a luz e anaacutelise da infecccedilatildeo e tratamento em tempo
real com Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica (OCT)
Em 2010 ROSA descreve o funcionamento da OCT e ilustra a
aplicabilidade do mesmo principalmente na oftalmologia Na praacutetica os sistemas
OCT satildeo um pouco mais complexos que a simples montagem de Michelson
sendo necessaacuterio atender a questotildees especiacuteficas ligadas agrave utilizaccedilatildeo de sistemas
oacutepticos com resposta espectral uniforme numa zona larga do espectro e agrave
necessidade de adquirir imagens em tempo real Comum em citologia referirem
OCT como bioacutepsia oacuteptica de tecidos bioloacutegicos
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
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13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
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51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
17
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Microrganismo e cultivo
Os experimentos foram conduzidos com amostras da levedura patogecircnica
Candida albicans (ATCC90028) gentilmente cedida do estoque do Laboratoacuterio de
Leveduras Patogecircnicas do ICB-USP e armazenada no laboratoacuterio de
Fotoprocessos Natildeo Teacutermicos em Biociecircncias sob temperatura de -80oC em meio
de cultura liacutequido com 6 de glicerol
As ceacutelulas foram crescidas em placas de Petri contendo 6 mL de caldo
Sabouraud (Sb) e novamente incubada (24h a 370C)
Crescimento de biofilme de C albicans
O biofilme foi formado na superfiacutecie de placas de microtitulaccedilatildeo de 96
poccedilos de fundo plano Os poccedilos receberam 150microL de soro fetal bovino (SFB) e
foram incubados por 24h a 370C para formar uma peliacutecula proteacuteica Decorrido
este periacuteodo o SFB foi removido e 200microL de meio de cultura caldo Sb contendo
aproximadamente 5x105 ceacutelulas de C albicans foi adicionado aos poccedilos As
placas foram incubadas em estufa agrave 370C
Tabela 1 - PDT em suspensatildeo de ceacutelulas - Experimento com os grupos
irradiados
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
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36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
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36
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51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
18
C albicans crescida em caldo sabouraud (Sb) foi centrifugada e lavada
com soluccedilatildeo tampatildeo de fosfato (PBS) com pH ajustado em 72 e por fim foram
suspensas em PBS A transmitacircncia da suspensatildeo (546nm) foi ajustada a 70
que corresponde a concentraccedilatildeo de aproximadamente 1x106 unidades
formadoras de colocircnias (ufcmL) A suspensatildeo foi dividida em 4 grupos
experimentais (Tabela 1) a) Grupo controle sem aplicaccedilatildeo de laser (L) ou
fotossensibilizador (FS) (L-FS-) b) grupo sem irradiaccedilatildeo e com AM (L-FS+) ou
seja tempo de irradiaccedilatildeo igual a 0 c) grupo laser (L+FS-) irradiado por 9min sem
AM e d) grupo PDT (L+FS+) Este grupo foi subdividido para avaliaccedilatildeo de
diferentes paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2
em uma aacuterea de 03 cm2 e variando-se as fluecircncias de 60120180 Jcm2 (Tabela
2) que resultou em 3 6 e 9 min de irradiaccedilatildeo Para tanto foi utilizado um laser de
diodo InGaAl (Photolase III DMC Satildeo Carlos Brasil) com comprimento de onda
de =660 nm de emissatildeo contiacutenua e potecircncia ajustada em 100mW
Tabela 2 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
L+ = 60 Jcm2 3rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 180 Jcm2 9rsquo
Tabela 3 - Concentraccedilotildees do AM
A soluccedilatildeo de azul de metileno foi preparada pela diluiccedilatildeo do poacute (Sigma
Ltda Poole UK) em aacutegua destilada na concentraccedilatildeo de 10 mM Este estoque foi
filtrado em uma membrana esteacuteril (022microm Milipore Satildeo Paulo Brasil) O
fotossensibilizador foi diluiacutedo e adicionado agrave suspensatildeo microbiana para
AM - 50 microM
AM - 70 microM
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
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33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
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37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
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44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
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48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
19
proporcionar concentraccedilotildees finais de 50 e 70 microM (Tabele 3) Sua aplicaccedilatildeo foi
atraveacutes de pipeta calibrada sobre a C albicans aguardou-se o TPI de 10
minutos removeu-se cuidadosamente o AM para posteriormente realizar a
terapia fotodinacircmica
Tabela 4 - PDT em biofilme de ceacutelulas
Quatro grupos experimentais (Tabela 4) compostos por 3 amostras em
cada grupo foram divididos em Grupo controle (L-FS-) grupo sem irradiaccedilatildeo e
com AM (L-FS+) grupo AM (L-FS+) grupo Laser (L+FS-) grupos submetidos agrave
PDT (L+FS+) O grupo L+FS+ foi subdividido para avaliaccedilatildeo de diferentes
paracircmetros de irradiaccedilatildeo com intensidade constante de 333 mWcm2 em uma
aacuterea de 03cm2 e variando-se as fluecircncias de 80 120 160 Jcm2 (Tabela 5) que
resultou em 4 6 e 8 min de irradiaccedilatildeo A regiatildeo da superfiacutecie do poccedilo onde o
biofilme foi formado possui aacuterea de 03cm2 e o feixe laser foi ajustado em arranjo
oacuteptico para iluminar toda esta superfiacutecie O biofilme foi incubado com AM em
concentraccedilotildees de 50 500 e 1000 microM (Tabela 6) A concentraccedilatildeo mais alta foi
testada com tempos de preacute-irradiaccedilatildeo (TPI) iguais a 0 e 10 min
GRUPOS SIGLAS
Controle L-FS-
AM L-FS+
L L+FS-
L+ AM L+FS+
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
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Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
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5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
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10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
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47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
20
Tabela 5 - Fluecircncias e tempo de irradiaccedilatildeo
Tabela 6 - Concentraccedilotildees do AM
Anaacutelise Microbioloacutegica
Apoacutes a irradiaccedilatildeo os poccedilos contendo tanto biofilme quanto blastoacuteporo
foram desestruturados mecanicamente com o movimento de remoccedilatildeo e inserccedilatildeo
200 microL de PBS pH72 em cada poccedilo e entatildeo aliacutequotas de 20 microL foram colhidas e
submetidas agrave diluiccedilatildeo seriada em placas de microtitulaccedilatildeo de 96 poccedilos para
fornecer concentraccedilotildees de 10-1 a 10-4 vezes do original Cada diluiccedilatildeo foi
plaqueada em duplicata em placas de Petri com agar Sb que foram incubadas
por 24h a 37ordmC para permitir a formaccedilatildeo de colocircnias
As colocircnias foram contadas nas diluiccedilotildees pertinentes e o resultado foi
convertido em unidades formadoras de colocircnia (UFC)mL para a anaacutelise dos
dados
L+ = 80 Jcm2 4rsquo
L+ = 120 Jcm2 6rsquo
L+ = 160 Jcm2 8rsquo
AM ndash 50 microM
AM ndash 500 microM
AM ndash 100 microM
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
4 BETTANIN FERNANDA COUTINHO-NETO MAURIacuteCIO D HOMEM-DE-MELLO PAULA Estudo teoacuterico sobre a formaccedilatildeo de diacutemeros de azul de metileno Sociedade Brasileira de Quiacutemica34 ed 2010
5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
21
Anaacutelise Morfoloacutegica por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica
Amostras de ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo foram introduzidas em
placa de petri esteacuteril e fechada para anaacutelise de leitura oacuteptica durante PDT das
mesmas
Foi usado no experimento o OCT (OCT930SR Thorlabs EUA) com
emissatildeo em ʎ=930 nm e potecircncia de 2 mW de resoluccedilatildeo lateral e longitudinal no
ar de 62μm Foi feita uma anaacutelise morfoloacutegica do experimento com 2000 X 512
pixels com iacutendice de refraccedilatildeo de 135 preacute-irradiaccedilacirco de 10 minutos e
posteriormente removido o excesso de Azul de Metileno O aparelho de coerecircncia
oacuteptica emitiu um sinal intenso inicialmente e fez a leitura da mudanccedila dos iacutendices
de refraccedilatildeo da aacutegua e do ar originado pela reflexatildeo O iacutendice de refraccedilatildeo da
profundidade foi de 130 Desta forma os dados foram analisados e interpretados
pelo Labview (desenvolvido pelo Prof Anderson Zanardi de Freitas do Centro de
Lasers e Aplicaccedilotildees IPEN CNEN-SP)
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
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23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
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29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
22
RESULTADOS
1 - Crescimento microbiano nos grupos controle
O crescimento das ceacutelulas de C albicans em suspensatildeo e em biofilme
mostrou-se eficientes Mantiveram acima de 105 ufcmL assegurando uma
importante teacutecnica para futuros estudos in vitro A irradiaccedilatildeo com o laser na
ausecircncia do fotossensibilizador natildeo provocou nenhuma alteraccedilatildeo de morte
celular como esperado e tambeacutem nenhum outro efeito detectaacutevel na metodologia
empregada
Figura 1ndash A) placa de 96 poccedilos utilizada para a formaccedilatildeo do biofilme e B)
Biofilme de C albicans corado com azul de metileno na concentraccedilatildeo de 1 mM
O biofilme foi formado na superfiacutecie acriacutelica de placas de microtitulaccedilatildeo de
96 poccedilos de fundo plano contendo inicialmente soro fetal bovino (SFB) e
posteriormente cerca de 5x105 ceacutelulas de C albicans permanecendo com
caracteriacutesticas micro e macroscoacutepicas semelhantes em todas as amostras
assegurando uma anaacutelise e quantificaccedilatildeo dos resultados obtidos
15m
A B
23
O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
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3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
4 BETTANIN FERNANDA COUTINHO-NETO MAURIacuteCIO D HOMEM-DE-MELLO PAULA Estudo teoacuterico sobre a formaccedilatildeo de diacutemeros de azul de metileno Sociedade Brasileira de Quiacutemica34 ed 2010
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9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
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10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
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48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
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O fotossensibilizador azul de metileno natildeo apresentou toxicidade nos
paracircmetros empregados
Efeito da PDT em suspensatildeo de C albicans
A irradiaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com fotossensibilizador
promoveu reduccedilatildeo microbiana nas duas concentraccedilotildees testadas 50 microM e 70 microM
Com 70 microM natildeo foi possiacutevel verificar inativaccedilatildeo ateacute atingir 6 min poreacutem natildeo
foram recuperadas ceacutelulas viaacuteveis apoacutes 9 min Na concentraccedilatildeo de 50 microM foi
possiacutevel observar uma leve tendecircncia de inativaccedilatildeo apoacutes 3 min e depois de 6 min
houve 1 log de reduccedilatildeo Novamente apoacutes 9 min foi observada completa
inativaccedilatildeo das ceacutelulas de C albicans
Figura 2 - Inativaccedilatildeo de C albicans em suspensatildeo com concentraccedilotildees de 50 microM
e 70 microM Barras de erros satildeo os desvios padratildeo
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
4 BETTANIN FERNANDA COUTINHO-NETO MAURIacuteCIO D HOMEM-DE-MELLO PAULA Estudo teoacuterico sobre a formaccedilatildeo de diacutemeros de azul de metileno Sociedade Brasileira de Quiacutemica34 ed 2010
5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
24
Figura 3 ndash Fraccedilatildeo de sobrevivecircncia de C albicans em biofilme com tempo de preacute-
irradiaccedilatildeo de 10 minutos e 0 minuto ambos com concentraccedilatildeo de 1 mM Haacute
aumento de ceacutelulas apoacutes o tempo de irradiaccedilatildeo de 6 minutos
A terapia fotodinacircmica nas condiccedilotildees testadas com 1 mM e dentro
dos limites da metodologia empregada natildeo promoveu inativaccedilatildeo das ceacutelulas
fuacutengicas organizadas em biofilme Mesmo depois de 8 min de irradiaccedilatildeo nenhum
efeito pode ser observado (figura 3)
As ceacutelulas submetidas agrave PDT com fotossensibilizador AM a 005mM e
05mM e TPI de 10 minutos natildeo foram inativadas Neste experimento nenhuma
reduccedilatildeo microbiana ocorreu apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
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6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
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Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
25
Figura 4 ndash Accedilatildeo da PDT sobre o nuacutemero de ceacutelulas de C albicans em biofilme
com concentraccedilotildees de 005 mM e 05 mM de Azul de Metileno Os dados
representam a contagem meacutedia e as barras satildeo o desvio padratildeo Observa-se
aumento do nuacutemero de ceacutelulas apoacutes 6 minutos
Tomografia por coerecircncia oacuteptica
Foi possiacutevel obter imagens estruturais do biofilme por tomografia por
coerecircncia oacuteptica Na figura 5 podemos observar imagens antes durante e apoacutes a
irradiaccedilatildeo Observe que a estrutura do biofilme foi alterada e o iacutendice de refraccedilatildeo
se altera com o tempo de irradiaccedilatildeo
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
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Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
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11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
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47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
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49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
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50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
26
Figura 5 ndash Imagem obtida por de Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica de biofilme
durante o processo de PDT em onde A) Biofilme iacutentegro e sem realizaccedilatildeo de
PDT B) desorganizaccedilatildeo do biofilme apoacutes 4 min de irradiaccedilatildeo e C) biofilme
desorganizado apoacutes 8 min de irradiaccedilatildeo A barra representa 150 microm
Nas imagens analisadas por Tomografia de Coerecircncia Oacuteptica foi identificada
inicialmente a estrutura do biofilme sem alteraccedilatildeo estrutural com os limites bem
definidos e organizados Apoacutes o periacuteodo de irradiaccedilatildeo de 4 minutos evidencia-se
a perda da organizaccedilatildeo da membrana celular da C albicans bem provaacutevel pelo
iniacutecio da terapia fotodinacircmica Aos 8 minutos a PDT torna-se mais efetiva tem-se
a desorganizaccedilatildeo do biofilme
A B C
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
4 BETTANIN FERNANDA COUTINHO-NETO MAURIacuteCIO D HOMEM-DE-MELLO PAULA Estudo teoacuterico sobre a formaccedilatildeo de diacutemeros de azul de metileno Sociedade Brasileira de Quiacutemica34 ed 2010
5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
27
DISCUSSOtildeES
A candidose bucal pode afetar a qualidade de vida e dificultar a
alimentaccedilatildeo devido agrave presenccedila de sangramento exsudaccedilatildeo sensaccedilatildeo de
queimaccedilatildeo dor halitose gosto desagradaacutevel e secura da boca Aleacutem disso a
infecccedilatildeo por Candida spp eacute de difiacutecil controle devido agrave sua natureza multifatorial
e ao pequeno nuacutemero de drogas disponiacuteveis para seu tratamento (MAEKAWA
2010)
Biofilme satildeo estruturas microbianas caracterizadas por ceacutelulas seacutesseis que
estatildeo ligadas agraves superfiacutecies naturais ou abioacuteticas e incorporada numa matriz de
substacircncia polimeacuterica extracelular tais como glicoproteiacutenas e polissacariacutedeos e
seu desenvolvimento em estudos in vitru eacute viaacutevel e utilizado em diversos estudos
(GONZALES 2011) O crescimento acentuado de ceacutelulas de C albicans apoacutes
periacuteodo de PDT sugere-se alteraccedilatildeo de teacutecnica durante metodologia
Os antimicrobianos auxiliam a remoccedilatildeo quiacutemica do biofilme poreacutem o uso
prolongado de tais agentes pode levar agrave seleccedilatildeo de espeacutecies resistentes A
estrutura do biofilme e as caracteriacutesticas das ceacutelulas que o constituem conferem
resistecircncia aos agentes antimicrobianos Desta forma vecirc-se a necessidade de se
desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana
capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme (ZAMBRANA 2009) O uso
combinado de agente antimicrobiano e PDT podem ser sugeridos para
tratamentos adversos
O tempo de preacute-irradiaccedilatildeo corresponde ao tempo decorrido entre a
aplicaccedilatildeo do fotossensibilizador no alvo e a ativaccedilatildeo por luz Eacute um ponto criacutetico
para o sucesso da PDT uma vez que se o fotossensibilizador natildeo estiver
proacuteximo ao alvo sua ativaccedilatildeo pela luz iraacute resultar na formaccedilatildeo de espeacutecies
toacutexicas em local natildeo desejado A morfologia microbiana pode variar com as
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
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ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
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10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
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17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
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21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
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22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
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26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
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Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
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36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
28
espeacutecies causando diferenccedilas na localizaccedilatildeo do fotossensibilizador O tempo
necessaacuterio para absorccedilatildeo do corante antes da iluminaccedilatildeo eacute importante para o
sucesso na PDT Nas aplicaccedilotildees da PDT antimicrobiana espera-se que o corante
se una ao microrganismo ou chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular
e neste periacuteodo o fotossensibilizador natildeo sofra degradaccedilatildeo antes da ativaccedilatildeo pela
fonte de luz (AMARAL 2010) Logo a inserccedilatildeo e remoccedilatildeo do AM devem ser com
muita cautela
O fotossensibilizador azul de metileno tem accedilatildeo antimicrobiana quando
adequadamente irradiado e pode promover a fotoinativaccedilatildeo de microrganismos
(PRATES et al 2009 SUZUKI et al 2009) Poreacutem em contato com o biofilme
pode desencadear um comportamento de dimerizaccedilatildeo que muda as
propriedades oacutepticas deste FS e pode reduzir sua capacidade de
fotossensibilizaccedilatildeo por desativaccedilatildeo de estados excitados quando irradiado em
660nm (USACHEVA 2003 a e b) Desta forma que neste estudo diferentes
paracircmetros foram testados para identificaccedilatildeo do melhor resultado
Vaacuterias possibilidades de reduccedilatildeo microbiana podem ser usadas como
agentes quiacutemicos antimicrobianos accedilatildeo mecacircnica e terapia fotodinacircmica
Podendo neste uacuteltimo resultar numa desorganizaccedilatildeo do biofilme e desta forma
auxiliar no tratamento antimicrobiano assim como na accedilatildeo mecacircnica da
escovaccedilatildeo dental (UCAR 2007)
A educaccedilatildeo em sauacutede tem como objetivo maior causar uma mudanccedila de
atitude do paciente em relaccedilatildeo aos haacutebitos com a sauacutede bucal que eacute alcanccedilada
atraveacutes da criaccedilatildeo ou mudanccedila de percepccedilatildeo do paciente A motivaccedilatildeo humana eacute
muito complexa e estaacute baseada numa combinaccedilatildeo de expectativas ideais e
atitudes que manteacutem e regulam o comportamento de higiene Um fundamento
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
alteraccedilotildees que a terapia promove em biofilme
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
4 BETTANIN FERNANDA COUTINHO-NETO MAURIacuteCIO D HOMEM-DE-MELLO PAULA Estudo teoacuterico sobre a formaccedilatildeo de diacutemeros de azul de metileno Sociedade Brasileira de Quiacutemica34 ed 2010
5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
32
Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
29
baacutesico de controle de placa dental e subsequumlente biofilme bucal (DITTERICH
2007)
30
CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
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ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
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12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
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18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
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20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
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22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
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27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
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Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
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Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
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50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
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CONCLUSOtildeES
A PDT em ceacutelulas de C albicans organizadas em biofilme mostrou-se
ineficaz nos paracircmetros testados No entanto a terapia deste fungo em
suspensatildeo mostrou-se eficiente
Embora natildeo ter sido observado a inativaccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme a PDT
promoveu a desorganizaccedilatildeo desta estrutura
A OCT mostra-se importante teacutecnica para identificaccedilatildeo em tempo real das
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REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 ASSAD ROBERLEY ARAUJO Estudo da Prevalecircncia de Cacircndida spp e de outras Variaacuteveis Relacionada agrave Estomatite Proteacutetica em pacientes geriaacutetricos Institucionalizados Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Odontologia Estomatologia Curitiba 2004
2 BERTOLINI GIULIO REDDI ELENA GATTA MATILDE BURLINI CLAUDIA JORI GIULIO Factors influencing the Haematoporphyrin-sensitized Photoinactivation of Candida albicans Jounal of General Microbiology1989
3 BEVILACQUA I M NICOLAU S KHOURI A BRUGNERA G R TEODO-RO RA ZAcircNGARO MTT The Impact of Photodynamic Therapy on the Viability of Streptococcus mutans in a Planktonic Culture
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5 BORGES AacuteLVARO HENRIQUE PEDRO FAacuteBIO LUIS DE MIRANDA SEMENOFF TEREZA DELLE VEDOVE PORTO ALESSANDRA NOGUEIRA SEMENOFF-SEGUNDO ALEX BUZELLE SAMYRA LOPES Antimicrobial effectiveness of different trademarks mouthwashes with and without alcohol against different organisms in vitro study Rev odonto cienc2010
6 BLISS JOSEPH M BIGELOW CHAD E FOSTER THOMAS H HAIDARIS CONSTANTINE G Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Photofrin Antimicrobial Agents and Chemotherapy2004
7 CATAtildeO CARMEM DOLORES DE SAacute RAMOS IRMA NEUMA COUTINHO SILVA NETO JOSEacute MOREIRA DA DUARTE SYLVANA MARIA ONOFRE BATISTA ANDREacute ULISSES DANTAS DIAS ALEXANDRE HENRIQUE DE MOURA Eficiecircncia de substacircncias quiacutemicas na remoccedilatildeo de biofilme em proacuteteses total Rev odontol UNESP2007
8 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA GIESSELMAN BENJAMIN R JESUacuteS-
ANDINO FRANCISCO J DE FOSTER THOMAS MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTATINE G Inhibition of electron transport chain assembly and function promotes photodynamic killing of Candida J Photochem Photobiol B 2010
9 CHABRIER-ROSELLOacute YEISSA FOSTER THOMAS H PEacuteREZ-NAZARIO NELISSA MITRA SOUMYA HAIDARIS CONSTANTINE G
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Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
10 DEMIDOVA TATIANA N HAMBLIN MICHAEL R Efect of Cell-Photosensitizer Binding and Cell Density on Microbial Photoinactivation Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
11 DI POTO ANTONELLA SBARRA MARIA S PROVENZ GIULIO VISAI LIVIA SPEZIALE PIETRO The effect of photodynamic treatment combined with antibiotic action or host defence mechanisms on Staphylococcus aureus biofilms2009
12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
14 FREITAS ANDERSON ZANARDI DE FREITAS Caracterizaccedilatildeo de tecidos
bioloacutegicos atraveacutes de tomografia por coerecircncia oacuteptica Tese apresentada como um dos requisitos para obtenccedilatildeo de Grau de Doutor em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear ndash Materiais 2007
15 GALINDO DE C MELO C B DE MORAES L J ROCHA R G Pla-nejamento cliacutenico integrado adequaccedilatildeo do meio bucal J Bras Clin Odontol Int - Ediccedilatildeo Especial 2006
16 GERALDO DEBORA SOARES Aderecircncia bacteriana agrave superfiacutecie de esmalte dental irradiado por lasers com paracircmentros para prevenccedilatildeo de caacuterie Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Paulo2009
17 GONZALES FERNANDA PEREIRA MAISCH TIM Photodinamic Inactiva-tion for Controlling Candida Albicans InfectionsFungal Biology2011
18 YEacuteVENES ISMAEL ALVAREZ SONIA RIVERA JARA MIGUEL NEIRA
WOLFENSON PAULA MASS SMITH LJUBICA PETRASIC Comparison of mouthrinses containing chlorhexidine and other active agents with chlorhexidine mouthrinse-gel effects on de novo plaque formation Rev odonto ciecircncia2009
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19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
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29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
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49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
31
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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Photomedicine and Laser Surgery Vol 252007
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29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
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35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
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ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
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HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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Sensitivity of Candida albicans Germ Tubes and Biofilms to Photofrin-Mediated Phototoxicity Antimicrobial Agents and Chemotherapy2005
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12 DITTERICH RAFAEL GOMES PORTERO PRISCILA PAIVA PILATTI
GIBSON LUIZ SANTOS FAacuteBIO ANDREacute Oral care habits and the role of motivation in mechanic control of dental biofilm Cliacuten-CientiacutefRecife2007
13 DOVIGO LIacuteVIA NORDI PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA
GARCIA ADRIANO CYNTHIA SANCHEZ BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Photodynamic Inactivation of four Candida species induced by photogem Brazilian Journal of Microbiology412010
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24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
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28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
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30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
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33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
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37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
33
19 KOMERIK NULGUL In vivo Killing of porphyromonas gingivalis by Toluidine Blue Mediated Photosensitization in na Animal ModelAmerican Society for Microbiology2003
20 KONOPKA KRYSTYNA GOSLINSKI TOMASZ Photodynamic Therapy in DentistryJ Dent Res2007
21 BLISS JOSEPH FOSTER CONSTANTINE G Susceptibility of Candida
Species to Photodynamic Effects of Antimicrobial Agents And
Chemotherapy2004
22 LEE SEONKYUNG ISABELLE MARTIN E GABALLY-KINNEY KRISTIN
L POGUE BRIAN W DAVIS STEVEN J Dual-channel imaning system for singlet oxygen and photosensitizer for PDT Biomedical Optics Express 2011
23 LIMA ADRIANA GRACETTO AUGUSTO C GEROLA ADRIANA P HIOKA NOBORU BONACIN JULIANO A BAPTISTA MAURIacuteCIO S MACHADO ANTOcircNIO E H RODRIGUES MAacuteIRA R CODOGNOTO LUacuteCIA OLIVEIRA HUEDER P M DE Fotofiacutesica do Azul de Metileno induzidos por auto-agregaccedilatildeo causada por misturas de solventesSociedade Brasileira de Quiacutemica33 ed2010
24 MAEKAWA LILIAN EIKO BRIGHENTI FERNANDA LOURENCcedilAtildeO LAMPING ROBERTA OLIVEIRA LUCIANE DIAS DE MARCACCI SIDNEY KOGA-ITO CRISTIANE YUMI Atividade antimicrobiana de enxaguatoacuterios bucais sem aacutelcool agrave base de clorexidina sobre Candida albicans Rev Odonto UNESP Araraquara2010
25 MAISCH TIM Anti-microbial photodynamic therapy useful in the future
Lasers Med Sci2006
26 MARINHO SANDRA APARECIDO A Efeito da Terapia Fotodinacirc-mica(PDT) sobre culturas de Candida sp E de ceacutelulas epiteliais estudo in vitro2006
27 MIMA EWERTON GARCIA DE OLIVEIRA PAVARINA ANA CLAacuteUDIA RIBEIRO DANIELA GARCIA DOVIGO LIVIA NORDI VERGANI CARLOS EDUARDO BAGNATO VANDERLEI SALVADOR Effectiveness of Photodynamic Therapy for the Inactivation of Candida spp On Dentures In Vitru Study Photomedicine and Laser Surgery Volume X Number X 2011
28 MIZUNO KAZUE ZHIYERNTAYEV TIMUR HUANG LIYI KHALIL SARWAT NASIM TEGOS GEORGE P GALI HARIPRASAD JAHNKE WHARTON TIM HAMBLIN MICHAEL R Antimicorbial Photodynamic Therapy with Functio-nalized Fullerenes Quantitative Structure-activity Relationships J Nanomed Nanotechnol2011
34
29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
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50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
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29 MOREIRA ANA CRISTINA AZEVEDO PEREIRA MARLUS HENRIQUE QUEIROZ PORTO MARIANA RIBEIRO ROCHA LEANDRO ANTONIO PALMEIRA DA NASCIMENTO BRUNO CAMPOS ANDRADE PEacuteRICLES MAIA Avaliaccedilatildeo in vitro da atividade antimicrobiana de antisseacutepticos bucaisRev ciecircnc meacuted biol2009
30 NEVILLE BRAD W Patologia Oral e Maxilofacial 3 ed2009
31 OLIVEIRA JANE REZENDE PARADELLA THAIacuteS CACHUTEacute REGO MARCOS AUGUSTO KOGA-ITO CRISTIANE YUMI JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO Evaluation of microbial adherence and superficial roughness of chemically activated acylic resin after cycling with different disinfectant solutions Cienc Odonto Bras2007
32 PELOI LS SOARES RAFAEL R S BIONDO CARLOS E G SOUZA VAGNER R HIOKA NOBORU KIMURA ELZA Photodynamic effect of light-emitting diode light on cell growth inhibition induced by methylene blueBiosci2008
33 PEREIRA CRISTIANE APARECIDA Efeitos da terapia fotodinacircmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans Apresentada a Universidade Estadual Paulista Faculdade de Odontologia de Satildeo Joseacute dos Campos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Satildeo Joseacute dos Campos2009
34 PIRES JULIANA RICO ROSSA JUNIOR CARLOS PIZZOLITTO ANTONIO CARLOS In vitro antimicrobial efficiency of a mouthwash containing triclosangantrez and sodium bicarbonateBraz oral res2007
35 PRATES RENATO ARAUJO SILVA ERIQUES G DA SUZUKI LUIS C
PAULA CLAUDETE R RIBEIRO MARTHA S Light Parameters Influence Cell Viability in Antifungal Photodynamic Therapy in a Fluence and Rate Fluence-Dependent Manner Laser Physics2009
36 PRATES RENATO ARAUJO Avaliaccedilatildeo dos Efeitos da Terapia
Fotodinacircmica Antimicrobiana sobre leveduras patogecircnicas Dissertaccedilatildeo de Doutorado e Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2010
37 ROSA CARLA CARMELO Bioacutepsia Oacuteptica OCTINESC-Porto Faculdades de Ciecircncias Universidade do Porto2010
38 SANTOS MOISEacuteS OLIVERIRA DOS GOULART VIVIANE PEREIRA
ROSSI WAGNER DE FREITAS ANDERSON ZANARDI CORREA PAULO ROBERTO SAMAD RICARDO ELGUL JUacuteNIOR NILSON DIAS VIEIRA ZEZELL DENISE MARIA Skin ablation using high intensity femtosecond laser IPEN 2009
39 SHARMA SULBHA K DAI TIANHONG KHARKWAL GITIKA B
HUANG YING-YING HUANG LIYI DE ARCE VIDA J BIL TEGOS
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GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
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50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
35
GEORGE P HAMBLIN MICHAEL R Drug Discovery of Antimicrobial Photosensitizers Using Animal ModelsCurrent Pharmaceutical Design 2011
40 SELITRENNIKOFF CLAUDE P Antifungal Proteins Applied and Environmental Microbiology2001
41 SILVA PAULO MAURIacuteCIO BATISTA DA Efeito antimicrobiano das soluccedilotildees desinfetantes sobre biofilmes de C albicans em resinas acriacutelicas termopolimerizaacuteveis Apresentada a Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Odontologia de Bauru para obtenccedilatildeo do grau de Mestre Bauru sn 2009
42 SOUKOS NIKOLAOS MULHOLLAND STEPHEN SOCRANSKY SIGMUND S DOUKAS APOSTOLOS G Photodestruction of Human Dental Plaque BacteriaEnhancement of the Photodynamic Effect by Photomechanical Waves in an Oral Biofilm Model Lasers in Surgery and Medicine2003
43 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO Desenvolvimento de biofilme formado por
Cacircndida albicans in vitru para estudo da terapia fotodinacircmicaDissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Nuclear-MateriaisIPEN2009
44 SUZUKI LUIS CLAacuteUDIO PRATES RENATO ARAUJO RAELE MARCUS PAULO FREITAS ANDERSON ZANARDI DE RIBEIRO MARTHA SIMOtildeES Real time optical coherence tomography monitoring of Candida albicans biofilm in vitru during photodynamic treatment Nuclear and Energy Research Institute (IPEN)2009
45 UCAR ADRIANA BARROETA ROJAS GLADYS DE MEacuteNDEZ BALLESTER ANTONIO LELIS Accioacuten de agentes quiacutemicos em la eliminacioacuten de cacircndida albicans sobre proacutetesis dentales Acta Odontoloacutegica Venezuolanav 45 n0 22007
46 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL A The role of the methylene blue and toluidine blue monomers and dimers in the photoinactivation of bacteria Journal of Photochemistry end Photobiology 2003
47 USACHEVA MARINA N TEICHERT MATTHEW C BIEL MERRILL
AThe Interaction of Lipopolysaccharides With Phenothiazine Dyes Lasers in Surgery and Medicine 2003
48 VELLINI FLAacuteVIO ORTODONTIA DIAGNOacuteSTICO E PLANEJAMENTO 6 edArtes Meacutedicas2011
49 VERA D MARIANO A HAYNES MARK H BALL ANTHONY R DAI D ASTRACAS CHRISTOS TIANHONG KELSO MICHAEL J HAMBLIN MICHAEL R TEGOS GEORGE P Strategies to potenciate antimicrobial photoinactivitionby overcoming resistant phenotypes Photochemistry and Photobiology 2011
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
36
50 ZAMBRANA JEacuteSSICA RABELO MINA PEREIRA CRISTIANE APARECIDA COSTA ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA JUNQUEIRA JULIANA CAMPOS JORGE ANTONIO OLAVO CARDOSO In vitru photosensitization of isolated and associated biofilms formed by Candida albicans Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans Rev Odonto Satildeo Joseacute dos Campos 2006
51 ZANIN IRIANA CARLA JUNQUEIRA GONCcedilALVES REGINALDO BRUNO JUNIOR ALDO BRUGNERA HOPE CHRISTOPHER KEITH PRATTEN JONATHAN Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy an in vitro study Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005
