EnzimasN

Enzimas de assimilao de nitrognio em plantasAS GDH GS-GOGAT NH4+

Sonia Regina de Souza Elvia Mariam Lis Martinez Stark Manlio Silvestre Fernandes

Souza, S.R., Stark, E.M.L.M. e Fernandes, M.S.

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ENZIMAS DE ASSIMILAODE NITROGNIO EM PLANTASSONIA REGINA DE SOUZA ELVIA MARIAM LIS MARTINEZ STARK MANLIO SILVESTRE FERNANDES

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Enzimas de Assimilao de Nitrognio em Plantas

Ficha TcnicaCopyright 2002 Souza, S.R., Stark, E.M.L.M. e Fernandes, M.S. Os direitos desta edio so reservados aos autores, no sendo permitida sua reproduo, no todo ou em parte, por qualquer meio. Qualquer interessado poder solicitar aos autores, via Internet ([email protected]), o envio gratuito do arquivo para impresso do contedo desta obra. Coordenao editorial Manlio S. Fernandes e Alberto M. T. Magalhes Editorao e produo Artware Projetos Culturais Ilustraes Sonia R. Souza Ilustrao da capa Manlio S. Fernandes Reviso de texto Angela Portocarrero


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sta publicao integra uma srie dedicada s Cincias Agrrias, desenvolvida por professores da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Pretendemos oferecer a estudantes e pesquisadores, parte de um vasto conhecimento que se acumula nas gavetas das universidades brasileiras, por falta de incentivo publicao.

E

Apresentao

Publicizar o conhecimento produzido e sistematizado no espao acadmico nossa meta.

Assim, com o apoio fundamental de patrocinadores, poderemos produzir livros desde a sua concepo, criao e editorao, at a impresso e distribuio. Exemplares com acabamento de qualidade sero doados s instituies pblicas de ensino e pesquisa ligadas s Cincias Agrrias e serviro, tambm, como memria institucional dos patrocinadores. Estaremos, ainda, disponibilizando em arquivo digital o contedo de cada edio. Ser preciso apenas enviar um e-mail de solicitao aos autores, proporcionando uma interao privilegiada entre profissionais e/ou estudantes para compartilhar temas de interesse comum. Esperamos contribuir para a construo de um novo cenrio editorial cientfico, incentivando a produo de nossos professores e democratizando o acesso ao livro. Os Editores

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SumrioINTRODUO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7CAPTULO 1

REDUO1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4

DO NITRATO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Nitrato Redutase (NR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Estrutura Quaternria da NR . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Caractersticas Funcionais da NR . . . . . . . . . . . . . 10 Localizao da NR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Gerao de Poder Redutor e Funcionamento da NR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2.5 Controle da Atividade da NR . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3 Nitrito Redutase (NiR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.1 Caractersticas funcionais da NiR . . . . . . . . . . . . . 16 1.3.2 Localizao da NiR e Gerao de Poder Redutor . 16 1.4 Regulao da Reduo do Nitrato . . . . . . . . . . . . . 17

CAPTULO 2

ASSIMILAO2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2

DO

AMNIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Glutamina Sintetase (GS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Isoformas e Localizao da GS . . . . . . . . . . . . . . . 21 Caractersticas da GS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Fontes de Energia para a GS . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Glutamato Sintase (GOGAT) . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Isoformas e Localizao da GOGAT . . . . . . . . . . . 24 Fonte de Poder Redutor para a Fd-GOGAT e NADH-GOGAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25


7

2.4 Glutamato Desidrogenase (GDH) . . . . . . . . . . . . 25 2.4.1 Localizao da GDH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.5 Asparagina Sintetase (AS) e Aspartato Aminotransferase (AspAT) . . . . . . . . . . 26 2.5.1 Asparagina Sintetase (AS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.5.2 Aspartato Aminotransferase (AspAT) . . . . . . . . . . 28

VISO GERALCAPTULO 3

DO

METABOLISMO

DE

NITROGNIO 29

PRINCIPAIS PROCESSOS DE ASSIMILAO DE NITROGNIO . . . . . . . . . . . . . . . . 303.1 3.2

3.3CAPTULO 4

Assimilao do N-Primrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Reassimilao do N-Fotorrespiratrio . . . . . . . . . . 30 Assimilao do N-Reciclado . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

METABOLISMO DO NITROGNIO DURANTE A FASE REPRODUTIVA . . . . . . . . . . . . . . 34Redistribuio de Nitrognio durante a Fase Reprodutiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 4.1.1 Glutamato e Glutamina durante a Senescncia . . . 37 4.2 Enzimas de Assimilao de Nitrognio durante a Senescncia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4.3 Papel da Glutamato Desidrogenase (GDH) no Metabolismo do Nitrognio . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.1

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS . . . . . . . . . . . . . . . 42

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9

s vegetais superiores podem absorver nitrognio tanto na forma ntrica quanto na amoniacal. Entretanto, a assimilao de nitrognio somente ocorre na forma reduzida. Aps ser absorvido, o N-oxidado (na forma de nitrato, NO3-) sofrer reduo a amnio (NH4+), atravs do sistema formado pelas enzimas nitrato redutase-nitrito redutase (NR-NiR). Uma vez na forma reduzida de NH4+, o nitrognio precisa ser incorporado em esqueleto de carbono (assimilado), pois txico, no podendo, portanto, acumular no tecido vegetal. A assimilao do NH4+ em esqueleto de carbono utiliza o sistema enzimtico glutamina sintetase-glutamato sintase (via GS-GOGAT) e tambm pode ocorrer atravs das enzimas glutamato desidrogenase (GDH) e asparagina sintetase (AS). A GDH e a AS parecem ter papel expressivo, quando em nveis txicos de amnio, ficando o sistema GS-GOGAT como o principal, atuando em condies nas quais a planta no esteja sob estresse.

O

Introduo

10



11

C APTULO 1

REDUO

DO

NITRATO

1.1 - INTRODUO

O nitrato a principal fonte de nitrognio para a maioria das plantas, especialmente para os cereais e culturas granferas, usadas como fonte de alimento em grande parte do mundo (Campbell, 1988). Uma vez absorvido pela planta, a converso de nitrato a amnio ocorre em duas etapas, atravs de uma reduo que requer oito eltrons. O nitrognio passa do estado de oxidao (+5) para (-3):

Figura 1. Reduo do nitrato atravs das enzimas nitrato redutase (localizada no

citossol) e nitrito redutase (localizada no cloroplasto) e coenzimas associadas

Primeiro, ocorre a reduo de nitrato a nitrito (NO2-) com o uso de dois eltrons, transferidos da coenzima NADH ou NADPH e catalisada pela enzima nitrato redutase (NR). Em seguida, o nitrito reduzido a amnio, atravs da enzima nitrito redutase, com transferncia de seis eltrons doados pela ferredoxina reduzida.1.2 - NITRATO REDUTASE (NR)

Nitrato redutase (EC 1.6.6.1) a primeira enzima na via de reduo de nitrato pelas plantas e representa, a etapa limitante e reguladora deste processo (Beevers e Hageman, 1969; Campbell, 1988 e 1999). Esta enzima considerada um fator limitante para o crescimento, desenvolvimento e produo de protena em plantas e outros organismos que utilizam nitrato como fonte de nitrognio (Solomonson e Barber, 1990).

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1.2.1 - Estrutura Quaternria da Nitrato Redutase

Em estudos com Chlorela, Howard e Solomonson (1982) evidenciaram que NR um homotetrmero formado por dois dmeros simtricos. Cada tetrmero ativo, em baixas concentraes da enzima, dissocia-se em dmeros ativos, sem que ocorra perda significativa de atividade, sugerindo que a associao/dissociao no exerce papel na regulao da atividade da enzima.1.2.2 - Caractersticas Funcionais da Nitrato Redutase

A NR considerada uma enzima dependente de nucleotdeospiridina (Guerrero et al., 1981). Os dois eltrons utilizados na reduo de NO3- a NO2- pela NR so fornecidos por: NADH ou NADPH, sendo que o NADH o principal doador de eltrons para a NR na maior parte das plantas superiores e algas eucariticas, enquanto que somente os fungos utilizam NADPH. Entretanto, algumas plantas superiores (arroz, milho, cevada, soja) e algumas espcies de algas podem utilizar tanto o NADH quanto o NADPH como doador de eltrons para a NR, sendo chamadas de plantas NAD(P)H-NRs biespecficas (Kleinhofs e Warner, 1990). Todas as NRs eucariticas contm trs grupos prostticos na proporo estequiomtrica de 1:1:1, por subunidade: flavina adenina dinucleotideo (FAD), citocromo b557 e cofator molibdnio=MoCo (complexo de molibdnio associado com a pterina, formando complexo molibdopterina). As junes entre as subunidades prostticas MoCo e FAD so stios de controle da atividade NR atravs de fosforilao/defosforilao e da ligao da protena 14-3-3 de transduo de sinal. O fluxo de eltrons na NR (segundo Kleinhofs e Warner, 1990) ocorre da seguinte maneira:NAD(P)H FAD Citocromo b557 - MoCo NO31.2.3. - Localizao da Nitrato Redutase

(a) Localizao Intracelular da Nitrato Redutase NRs de plantas superiores, algas e fungos so consideradas enzimas solveis localizadas no citossol (Kleinhofs e Warner, 1990; Hageman e Bellow, 1990; Dalling et al., 1972). Em milho, NR foi encontrada,


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exclusivamente, no citossol das clulas do mesfilo foliar (Vaughn e Campbell, 1988), enquanto que, em folhas de espinafre, foi encontrada NR no cloroplasto (Kamachi et al., 1987). Embora muitas evidncias apontem para a localizao citosslica, foi identificada em razes de milho e cevada uma forma de NR ligada membrana plasmtica, tambm envolvida na reduo de nitrato (Ward et al., 1988, 1989). (b) Localizao da NR em rgos e Tecidos NR encontrada em muitas plantas e rgos, principalmente quando nitrato a fonte de nitrognio. A atividade da NR pode ocorrer no citossol tanto de razes como de folhas (Hageman e Bellow, 1990), sendo que, normalmente, a atividade da enzima nitrato redutase alta nas folhas. Segundo Campbell (1990), algumas plantas tm pouca ou nenhuma atividade da NR nas folhas, estando a atividade presente nas razes. NR pode tambm ser encontrada em um tipo de clula particular, como ocorre em folhas de plantas C4, onde NR est localizada somente nas clulas da bainha vascular (Campbell, 1990).1.2.4 - Gerao do Poder Redutor e Funcionamento da NR

Nitrato reduzido a nitrito pela enzima nitrato redutase, atravs da reao:NADH + H+ + NO3- NAD+ + NO2- + H2ONR

Simultaneamente, NADH oxidado a NAD+. A NR transfere um on hidreto (H ) do NADH e um prton (H+) para o NO3-, produzindo o NO2- (Hageman e Bellow, 1990). Supondo que a NR esteja localizada no citossol, a fonte primria de energia para a regenerao do NADH (forma reduzida) seria proveniente da oxidao de acares (Beevers e Hageman, 1967, 1980). Na figura 2 pode ser visto que o NADH citosslico, provavelmente, deriva da atividade da gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase citoplasmtica, que produz NADH atravs da oxidao do gliceraldeido 3-fosfato a 1,3 bisfosfoglicerato na via glicoltica (Klepper et al., 1971; Stryer, 1996; Nelson e Cox, 2000). Em tecidos

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Figura 2. Origem do poder redutor (NADH) utilizado pela nitrato redutase

fotossintetizantes o poder redutor requerido para a atividade da NR parece ser derivado do NADPH produzido nos cloroplastos pela etapa luminosa da fotossntese. Como pode ser observado na figura 3 atravs de sistemas especiais de transporte de eltrons entre o cloroplasto e o citossol, os eltrons do NADPH reduzem o NAD+ citoplasmtico a NADH, que desta maneira poder ser usado pela NR e outras reaes de reduo do citossol (Hageman e Bellow, 1990; Oaks e Yamaya, 1990).1.2.5 - Controle da Atividade da Nitrato Redutase

(a) Influncia do Nitrato e da Luz na Atividade da Nitrato Redutase Nitrato considerado um indutor da sntese da NR. Numerosos estudos comprovaram aumento da atividade da nitrato redutase (NRA) aps nitrato ser fornecido s plantas (Deckard et al., 1973; Fernandes e Freire, 1976; Haba et al., 2001; Hernandez et al., 1974; Elrich e Hageman, 1973; Oaks et al., 1982). Campbell (1988) observou em milho que, aps adio de nitrato a atividade da NR da planta aumenta rapidamente por algumas horas e


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Figura 3. Origem do NADPH para o funcionamento da nitrato redutase em tecidos

fotossintetizantes. Transportadores localizados nas membranas cloroplsticas permitem que os equivalentes redutores, gerados pela fotossntese, possam ser utilizados nas reaes citosslicas

ento o nvel de atividade da enzima retorna para um valor estacionrio. Estes resultados indicam o clssico modelo de induo enzimtica pelo substrato. Estudos de Campbell e Smarrelli (1986) comprovaram que a NR sintetizada de novo quando nitrato aplicado em plantas superiores. Segundo Heimer e Filner (1971); Jackson et al. (1973); Ferrari et al. (1973), h dois reservatrios (pools) de nitrato separados espacialmente: Reservatrio indutor ou metablico (de curta durao, ligado regulao do nvel da NR). Reservatrio substrato ou de reserva (de existncia mais longa, ligado ao suprimento de substrato). Ferrari et al. (1973) verificaram em clulas de tabaco que o NO3acumulado no pool substrato podia ser utilizado pela planta, no entanto era incapaz de substituir o NO3- do pool indutor em sua capacidade de induzir sntese de novo de NR ou aumentar a atividade da NR j existente. Excesso de nitrato no citoplasma (pool indutor)

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passa rapidamente para o vacolo (pool de reserva), atravs de um canal inico no tonoplasto (Satter e Moran, 1988; Hedrich e Schroeder, 1989). Segundo Siddiqi et al. (1989), o fornecimento de nitrognio exgeno pode restaurar o fluxo de nitrato no citoplasma e assim aumentar a atividade da NR. Entretanto, o aumento da NRA pode ser o resultado da ativao de formas inativas ou de reserva da enzima. Para determinar se a NR presente est na forma inativa ou de reserva, o extrato de material vegetal deve ser analisado quanto presena da protena-NR. Enquanto, os mtodos bioqumicos no so bastante sensveis para detectar pequenas quantidades de NR nos tecidos, os mtodos imunoqumicos so adequadamente sensveis. Sommers et al. (1983), utilizando imunoeletroforese (NR em agarose contendo anticorpos especficos para NR), observaram que o aumento da atividade da NR em plantas induzidas por nitrato corresponde a um aumento da protena-NR. Estes resultados indicam que o nitrato induz a sntese de novo da apo-protena NR. Posteriormente, quando o nitrato foi removido das plantas, a NRA e a protena-NR diminuram, demonstrando aparentemente que a NR no permanece quando o sinal nitrato para a induo removido. Deste modo, o gene para NR tem sua transcrio induzida pelo substrato da enzima, o nitrato. H aumento de at 100 vezes no nvel de RNA mensageiro para NR (RNAm-NR) em minutos. Entretanto, para a mxima induo da produo de RNAm-NR as plantas necessitam de luz ou uma fonte de carbono reduzido (como a sacarose). Parece que o nitrato desencadeia a expresso do gene para NR (e provavelmente para genes relacionados, como da nitrito redutase), enquanto que a luz influencia o nvel de expresso desses genes, alm de fornecer energia para a reao. Em milho foi verificado que a induo da protena-NR inativa ocorreu em resposta a luz, na presena de baixos nveis de nitrato, no entanto, a expresso total da atividade enzimtica requereu altos nveis de nitrato (Oaks et al., 1988). Segundo Remmler e Campbell (1986), quando plantas de milho induzidas por nitrato foram tranferidas da luz para o escuro, a atividade da NR atingiu nveis baixos, em um perodo de 12 horas. No escuro


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o nitrato direcionado para o pool de reserva, nos vacolos, devido deficincia de poder redutor produzido na fotossntese. Em um curto perodo aps a transferncia das plantas da luz para o escuro, a protena-NR no diminuiu, embora a atividade da NR tenha diminudo em 30%. A atividade da NR foi restabelecida com o retorno das plantas a luz. Esses resultados indicam um mecanismo de inativao reversvel e reativao para a regulao da NRA, que acontece atravs da fosforilao reversvel da protena NR em resposta a ciclos de luz e escuro. Uma vez no escuro, ocorre fosforilao que inativa a NR, quando exposta novamente luz, h defosforilao e a NR se torna ativa (Buchanan et al., 2000; Haba et al., 2001). A regulao da atividade da NR por fosforilao/defosforilao, depende da ligao reversvel da protena de transduo de sinal 14-3-3 (Buchanan et al., 2000). Quando no escuro ou em condies de baixo CO2, a NR fosforilada por protenas quinases, em um resduo de serina localizado entre as subunidades prostticas MoCo e FAD. A NR fosforilada ainda ativa. No entanto, a seguir ocorre a ligao da protena 14-3-3, na regio fosforilada da NR, tornando-a inativa. O complexo formado pela NR fosforilada e a protena 14-3-3 mais rapidamente degradado do que a NR livre. Se a NR liberada da protena 14-3-3, uma fosfatase pode remover o fosfato, ativando a NR. Este mecanismo reversvel permite o rpido controle da atividade da enzima NR, em condies que no favoream a assimilao de nitrato, como por exemplo quando h limitao de luz ou fonte de carbono. (b) Outros Fatores que Afetam a Atividade da Nitrato Redutase A atividade da NR tambm pode ser controlada por outros fatores. De acordo com Solomonson e Barber (1990), pode ocorrer inativao reversvel da NR quando ela reage com certos compostos, como hidroxilamina ou radicais superxido, sob condies redutoras. A reativao pode ocorrer pela exposio a sistemas oxidantes tais como luz azul, flavina ou oxignio. Outros moduladores incluem protenas inativadoras, como as encontradas em arroz, que parecem se ligar especificamente nitrato redutase, e as proteases que tm alta especificidade pela NR.

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Guerrero et al. (1981) deduziram que amnio (ou um produto de seu metabolismo) exerce papel crucial na regulao do nvel de NR (e NiR) em diferentes organismos, atravs de seu efeito negativo na sntese da enzima ativa. Parece que vrios tipos de mecanismos de controle, ainda no bem esclarecidos, esto envolvidos neste aspecto da ao do NH4+ sobre a nitrato redutase.1.3 - NITRITO REDUTASE (NiR)

O produto da reao da nitrato redutase, o nitrito (NO2-), txico, devendo, portanto, ser prontamente metabolizado. A reduo do NO2a amnio ocorre pela ao da enzima nitrito redutase (NiR). A nitrito redutase formada por dois monmeros, apresentando o domnio de ligao da ferredoxina reduzida em uma das extremidades e quatro centros Fe-S e Siroheme no monmero adjacente, onde ocorre a reduo do nitrito.1.3.1 - Caractersticas Funcionais da Nitrito Redutase

A enzima nitrito redutase transfere seis eltrons de seis tomos de ferredoxina reduzida (Fd red) para o nitrito, produzindo amnio (Beevers e Hageman, 1980):NO2- + 6Fdred + 8H+ NH4+ + 2H2O + 6FdoxNiR

Durante o processo de reduo, 3H+ so adicionados ao sistema metablico. Em tecidos fotossintetizantes (cloroplastos), a ferredoxina reduzida produzida atravs da fotofosforilao, enquanto que em tecidos no fotossintetizantes (plastdios) ou no escuro, a ferredoxina reduzida gerada a partir do NADPH, proveniente da via das pentoses-fosfato, por ao da enzima ferredoxina NADP+ redutase.1.3.2 - Localizao da NiR e Gerao de Poder Redutor

Nas folhas das plantas superiores NiR est localizada nos cloroplastos (Hewitt, 1975; Rathman e Das, 1974; Wallsgrave et al., 1979). A fonte direta de eltrons para reduo do NO2- a amnio nos tecidos foliares a ferredoxina reduzida. Nos cloroplastos (presena de luz) a ferredoxina reduzida diretamente atravs da cadeia de transporte de eltrons da fotossntese (Canvin e Atkins, 1974).


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Nas clulas radiculares NO2- reduzido a amnio pela NiR localizada nos plastdeos, de maneira anloga a que acontece no tecido foliar. Entretanto, a NiR e a ferredoxina da raiz so similares, mas no idnticas s formas encontradas na folha. Como no pode ser produzida diretamente, atravs da fotossntese, a ferredoxina que ser utilizada pela NiR presente nas razes (escuro) reduzida pelo NADPH, gerado no catabolismo de carboidratos radiculares (Oaks e Hirel, 1985), atravs da via das pentoses-fosfato.

Figura 4. Produo de ferredoxina reduzida nas reaes fotossntticas (luz) ou no escuro (via pentose-fosfato) para o funcionamento da nitrito redutase (NiR) e produo de NADH para a nitrato redutase (NR)

1.4 - REGULAO

DA

REDUO

DE

NITRATO

A regulao da reduo de nitrato pela mudana na atividade das enzimas envolvidas no processo importante para a assimilao de nitrognio. O nvel de NiR em diferentes clulas e tecidos muito maior do que o de NR; desta maneira, acumulao de nitrito raramente observada (Guerrero et al., 1981). Portanto, a etapa mais provvel de controle da reduo de nitrato a reduo de nitrato a nitrito mediado pela NR e no a reduo de nitrito a amnia atravs da NiR.

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Beevers e Hageman (1969) concluram que a NR o ponto lgico para a regulao do input de N-reduzido para o organismo. Segundo Campbell (1999), a NR est sujeita a um complexo mecanismo de regulao, tanto transcripcional como traducional e ps-traducional. O nvel de NR flutua em resposta a mudanas nas condies ambientais, que por sua vez tambm afetam o influxo de nitrato e a gerao de energia e poder redutor nas clulas, fenmenos estes que influenciam o metabolismo em geral e, conseqentemente, o crescimento e o desenvolvimento das plantas.


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C APTULO 2

ASSIMILAO2.1 - INTRODUO

DO

AMNIO

Antes de 1970, acreditava-se que o amnio era incorporado em aminocidos, via aminao redutiva direta do -cetoglutarato, atravs de uma nica enzima: a glutamato desidrogenase (GDH-EC.1.4.1.3). Embora a glutamina sintetase (GS-EC.6.3.1.2) fosse conhecida, ela no era considerada importante na formao de alfa amino-N, porque o nitrognio era assimilado na posio amida da glutamina. Entretanto, em 1971, Tempest et al. (1971) descobriram uma nova enzima em bactria, que catalisava a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o -cetoglutarato, resultando na produo de duas molculas de glutamato. Esta enzima foi chamada glutamato sintase (GOGAT=glutamato oxo-glutarato amnio transferase), (NADHGOGAT-EC.1.4.1.13) e era dependente de nucleotdeo-piridina. Em cloroplastos de plantas superiores, Lea e Miflin (1974) demonstraram a existncia de uma GOGAT diferente da encontrada em bactria, que era dependente de ferredoxina reduzida e no operava com nucleotdeos de piridina, chamada Fd-GOGAT, e que catalisava a reao similar da NADH-GOGAT:-cetoglutarato + L-glutamina + Fdred 2L-glutamato + Fdox

O significado da descoberta da GOGAT que, em cooperao com a GS, ela fornece uma rota alternativa para a sntese lquida de glutamato a partir de amnio e -cetoglutarato. Este sistema foi chamado via GS-GOGAT (Miflin e Lea, 1977). Amnio inicialmente incorporado em glutamato formando glutamina (o N incorporado est na posio amida da glutamina) via GS e ento transferido para a posio alfa do -cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato pela ao da GOGAT. Uma caracterstica distintiva da via GS-GOGAT de assimilao primria de amnio (figura 5) sua natureza cclica, onde glutamato ao mesmo tempo aceptor e produto da assimilao. Aps a descoberta da via GS-GOGAT, verificou-se que a enzima GDH no tinha o papel principal na assimilao de nitrognio em

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Figura 5: Esquema representativo da via GS-GOGAT de assimilao de amnio

(Fdox = ferredoxina oxidada e Fdred = ferredoxina reduzida)

plantas superiores, estando provavelmente ligada a situaes que produzam excesso de NH4+ ou durante a senescncia (Miflin e Lea, 1977; Kuman e Abrol, 1990; Lancien et al., 2000). Diversas evidncias apontam a GS como a principal enzima na assimilao de NH4+: GS tem menor KM para o NH4+ do que a GDH (GS: KM = 2-50M vs 56 mM para a GDH), portanto, mesmo em baixas concentraes de NH4+ a GS ativa (Rathnan et al., 1976; Lea e Miflin, 1977). Glutamina o primeiro produto formado quando se usa nitrognio marcado (NH4+ ou NO3-) (Arima, 1979; Yoneyama e Kumazawa, 1974; Magalhes et al., 1990). Inibidores de GS bloqueiam a assimilao de NH4+ (Rhodes et al., 1980).2.2 - GLUTAMINA SINTETASE (GS)

A enzima glutamina sintetase (GS) incorpora NH4+ formando glutamina, atravs da ligao do NH4+, ao grupo carboxlico do glutamato, usando energia fornecida pelo ATP (Hageman e Bellow, 1990), como pode ser observado no esquema a seguir:NH4+ + L-glutamato + ATP L-glutamina + ADP + Pi

GS a enzima chave na assimilao primria de nitrognio em plantas (Miflin e Lea, 1977), o que tem sido confirmado por experimentos, como os de arroz, nos quais, quando se forneceu 15NH4+, observou-se que a glutamina era o primeiro produto formado (Yoneyama e Kumazawa, 1974; Arima e Kumazawa, 1977; Arima, 1979).


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2.2.1 Isoformas e Localizao da GS

Diversos estudos tm demonstrado a presena de duas isoformas de GS nas plantas (Lea et al., 1990): uma isoforma, designada GS1, est localizada no citossol, enquanto a outra isoforma, designada GS2, encontrada nos cloroplastos e outros plastdeos (MacNally et al., 1983). Em razes, a GS ocorre predominantemente no citossol, mas tambm foi encontrada atividade de GS nos plastdeos de algumas espcies (Vzina et al., 1987). Segundo Miflin e Lea (1980) e Stewart et al. (1980), a GS citosslica no idntica enzima encontrada nos plastdeos. A GS citosslica parece ser uma das principais enzimas que atuam no controle da redistribuio de compostos no sentido fontedreno (Hirel et al., 2001). Hirel e Gadal (1980) demonstraram a existncia de trs isoformas de GS em arroz duas isoformas foram identificadas nas folhas: GS1 citosslica e GS2 cloroplstica; uma isoforma foi identificada nas razes: GSr (localizada no citossol). Apesar da GSr estar localizada no mesmo compartimento celular que a GS1, as duas enzimas so diferentes. A purificao da GSr mostrou ser a mesma distinta das enzimas foliares. Segundo Hirel e Gadal (1980), a GS1 estaria ligada reciclagem de amnio durante a fotorrespirao e sntese de glutamina no escuro, enquanto a GSr estaria envolvida provavelmente na assimilao primria de amnio nas razes.2.2.2 Caractersticas da GS

A glutamina sintetase de plantas superiores se apresenta como uma protena constituda de oito subunidades (octomrica) ou quatro subunidades (tetramrica), sendo ambas as formas ativas (Stewart et al., 1980; Mack, 1998). A proporo relativa das isoformas cloroplsticas (GS2) e citosslicas (GS1) influenciada por vrios fatores, inclusive o estgio de desenvolvimento e condies ambientais, tais como luz (Hirel et al., 1982). Vrias evidncias indicam que a GS cloroplstica (GS2) ativa somente na luz (Anderson e Dove, 1977; Mitchell e Stocking, 1975). Segundo Mann et al. (1980), o tecido foliar estiolado de cevada contm somente GS1. Hirel et al. (1982), observaram atividade da GS2 baixa ou ausente em folhas estioladas. Entretanto, quando o

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tecido foi se tornando verde, a GS2 aumentou rapidamente, via sntese de novo, enquanto a GS1 diminuiu. Estes resultados sugerem que a GS2 estaria restrita aos tecidos verdes e que a GS1 estaria presente, de forma mais generalizada, em folhas, razes e sementes. Estudos moleculares sugerem que GS codificada por uma pequena famlia de genes, que mostram expresso rgo-especfica (Cullimore et al.,1983). Tem sido sugerido que a GS1, em virtude de sua localizao subcelular no citossol, funcionaria na assimilao de amnio no citossol na ausncia de luz (Hirel e Gadal, 1980; McNally et al., 1983). Entretanto, outros trabalhos demonstraram que o amnio produzido durante a fotorrespirao pode tambm ser reassimilado nos cloroplastos pela GS2 (Bergnan et al., 1981; Wallsgrove et al., 1979; Woo e Osmond, 1982). Alm disso, algumas plantas, como o espinafre e o fumo, no contm GS citosslica (GS1) (McNally et al., 1983), o que sugere que todo o amnio produzido na clula vegetal possa ser assimilado no cloroplasto pela GS cloroplstica (GS2). Wallsgrove et al. (1979) isolaram mutantes de cevada deficientes em GS cloroplstica e observaram que esses mutantes acumularam concentraes txicas (letais) de amnio devido fotorrespirao, o que enfatiza o papel da GS cloroplstica na assimilao da amnio fotorrespiratrio. Em algumas espcies toda ou quase toda a atividade da GS est associada com a isoforma cloroplstica, enquanto que em outras a maior parte da atividade est no citossol. McNally et al. (1983) identificaram e classificaram quatro categorias de plantas de acordo com a proporo de GS1 (citosslica) e GS2 (cloroplstica), presente: Grupo A: Composto pelas plantas parasitas, que dependem nutricionalmente de seus hospedeiros. Caracterizado pela presena somente de GS citosslica (GS1). Grupo B: Grupo com predominncia de halfitas (Atriplex), mas tambm com a presena de espinafre (Spinacea oleracea) e fumo (Nicotiana tabacum). Apresenta unicamente GS cloroplstica (GS2).


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Grupo C: Caracterizado pela GS citosslica (GS1) ser o menor componente da atividade total da GS (GS2>70% da atividade total). Tpico de muitas gramneas C3 e algumas leguminosas temperadas. Ex: aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) apresentam atividade de GS2>80%. Feijo (Phaseolus vulgaris) GS2>90%. Tambm a presena de halfitas e rvores. Grupo D: Plantas que exibem a atividade GS2>30% da atividade total e que no se enquadram no grupo C. Este modelo observado em muitas plantas C4, CAM (Kalanche) e leguminosas tropicais como Erythrema cristagalli. Ex.: Digitaria sanguinalis, Pennisetum americanium, Sorghum vulgare, Zea mays (C4).2.2.3 Fonte de Energia para a GS

O ATP necessrio para o funcionamento da GS pode ser proveniente de diferentes fontes, dependendo da localizao subcelular da isoforma. A GS cloroplstica (GS2) requer luz para que ocorra a produo fotossinttica de ATP, necessria para a atividade da enzima, enquanto que para a GS citosslica (GS1) o ATP pode ser produzido pela gliclise ou fosforilao oxidativa mitocondrial (Oaks e Hirel, 1985; Tischner, 1987; Hageman e Bellow, 1990; Hageman et al., 1990).

Figura 6. A glutamina sintetase citosslica (GS1) pode utilizar o ATP produzido pela via glicoltica ou pela fosforilao oxidativa mitocondrial

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Nas clulas radiculares, outras enzimas oxidam acares ou produtos derivados para fornecer energia para a regenerao de ATP (Hageman e Bellow, 1990).2.3 - GLUTAMATO SINTASE (GOGAT)

A descoberta da glutamato sintase (GOGAT) em plantas superiores mudou radicalmente os conceitos sobre a assimilao de N. Em bactrias, uma GOGAT dependente de NADH como doador de eltrons (NADH-GOGAT) foi detectada por Tempest et al., em 1970. Entretanto, em plantas superiores, somente em 1974, Miflin e Lea demonstraram uma glutamato sintase que utilizava ferredoxina como redutor em cloroplastos (Fd-GOGAT). Ambas as enzimas promovem a transferncia redutiva do grupo amida da glutamina para o cetoglutarato, formando duas molculas de glutamato:glutamina + -cetoglutarato + NADH ou Fdred 2glutamato + NAD+ ou Fdoxid

Uma das duas molculas de glutamato formado retorna ao ciclo GSGOGAT, via GS, enquanto a outra molcula de glutamato pode ser usada nas reaes biossintticas (Miflin e Lea, 1976).2.3.1 - Isoformas e Localizao da GOGAT

Tanto em razes como em folhas a glutamato sintase (GOGAT) foi detectada em plastdeos (Ernes e Lowler, 1979; Suzuki et al., 1981; Wallsgrove et al., 1977). As plantas superiores apresentam uma enzima GOGAT dependente de nucleotdeo-piridina como redutor (NADH-GOGAT) e a forma Fd-GOGAT que utiliza ferredoxina reduzida como doador de eltrons (Miflin e Lea, 1976). Estas duas GOGAT so protenas imunologicamente distintas, uma vez que os anticorpos contra NADH-GOGAT no reconhecem Fd-GOGAT e vice-versa (Hayakawa et al., 1992; Suzuki et al., 1982). NADH-GOGAT est localizada principalmente em tecidos no verdes tais como razes, ndulos e cotildones em desenvolvimento (Chen e Cullimore, 1989). Nas folhas, Fd-GOGAT a forma predominante da enzima, encontrada nos cloroplastos. Ela especfica para ferredoxina reduzida,


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e inativa com nucleotdeo-piridina como doador de eltrons (Miflin e Lea, 1974; Suzuki e Gadal, 1982). Segundo Botella et al. (1988), FdGOGAT est localizada no estroma do cloroplasto. Em tecidos verdes NADH-GOGAT muito menos ativa que a FdGOGAT (Matoh et al., 1980). A Fd-GOGAT foi a principal forma de glutamato sintase encontrada nas folhas verdes de arroz (Suzuki e Godal, 1982; Yamaya et al., 1992; Hayakawa et al., 1993), enquanto que, em folhas que ainda no tinham emergido, e portanto no estavam verdes e expandidas, foi detectada alta atividade de NADH-GOGAT (Yamaya et al., 1992). Entretanto, parece que uma vez atingida a expanso total da folha, a atividade e o contedo de protena NADH-GOGAT diminuem, sugerindo que a expresso do gene para NADH-GOGAT em folhas de arroz reduzida com a idade da folha e que ocorre degradao da protena NADH-GOGAT (Yamaya et al., 1992).2.3.2 - Fonte de poder redutor para Fd-GOGAT e NADH-GOGAT

Nos cloroplastos, a ferredoxina utilizada pela Fd-GOGAT produzida atravs do Fotossistema I, durante a etapa fotoqumica da fotossntese (Hageman e Bellow, 1990). A Fd-GOGAT presente em razes similar, mas no idntica foliar. Na raiz, a ferredoxina no pode ser reduzida pelas reaes luminosas da fotossntese, mas sim, por NADH ou NADPH proveniente da oxidao de acares, que por sua vez a mesma fonte de poder redutor para o NADH-GOGAT (Hageman e Bellow, 1990).2.4 - GLUTAMATO DESIDROGENASE (GDH)

A enzima glutamato desidrogenase (GDH) promove a reao reversvel de aminao redutiva do -cetoglutarato formando glutamato, utilizando como doador de eltrons: NADH ou NADPH.NH4+ + -cetoglutarato + NAD(P)H + H+ Glutamato + H2O + NAD(P)+

Nesta reao a afinidade da enzima pelo NH4+ baixa (KM = 5,270,0 mM), variando de acordo com a localizao da enzima no tecido vegetal (Miflin e Lea, 1977). O KM pelo -cetoglutarato de 3,3 mM e pelo glutamato de 7,3 mM.

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Nos solos, um ambiente freqentemente aerado, o nitrognio na forma reduzida de amnio oxidado rapidamente NO3-. Caso o N seja absorvido como NH4+ pela planta, pouco desse NH4+ chegar parte area, pois ele prontamente oxidado nas razes. Deste modo, nas plantas superiores, normalmente, a concentrao de NH4+ baixa. O maior KM apresentado pela GDH para o amnio em relao a GS demonstra que a GDH no estaria atuando no sentido da aminao, em condies de baixa disponibilidade de NH4+, pois a GS seria a enzima mais apropriada, devido a sua maior afinidade pelo amnio (menor KM). Parece que o real substrato da GDH seria a amnia (NH3) e no o amnio (NH4+), entretanto, a velocidade com que NH3 reage com a gua formando NH4+ torna difcil a determinao do real substrato da enzima (Srivastava e Singh, 1987).2.4.1 - Localizao da GDH

A GDH est presente tanto nas razes quanto nas folhas. Foram detectadas duas isoenzimas GDH, uma localizada na mitocndria e dependente de NADH (E.C.1.4.1.2 - NADH-GDH) e outra presente nos cloroplastos que utiliza como coenzima o NADPH (E.C.1.4.1.4 NADPH-GDH). A enzima mitocondrial est associada membrana da mitocndria. Devido ao seu alto KM para amnio, GDH parece no estar ligada assimilao de nitrognio primrio, mas sim envolvida na assimilao de altos nveis de amnio como os liberados na mitocndria, atravs da fotorrespirao e reaes catablicas, e metabolismo relacionado senescncia. Segundo Hirel et al. (2001) existe a possibilidade de que GS e GDH atuem como enzimas centrais no processo de reciclagem do N liberado pela hidrlise de protenas durante a senescncia (ver itens 5.3 e 6.3 para mais informaes sobre GDH).2.5 - ASPARAGINA SINTETASE (AS) AMINOTRANSFERASE (ASPAT)E ASPARTATO

Os aminocidos glutamato e glutamina produtos das enzimas GS, GOGAT e GDH so doadores de N utilizados para a sntese dos aminocidos aspartato e asparagina. A sntese do aspartato e da asparagina ocorre atravs das enzimas asparagina sintetase (AS: EC. 6.3.5.4) e aspartato aminotransferase (AspAT: EC. 2.6.1.1).


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2.5.1 - Asparagina Sintetase (AS)

A asparagina foi o primeiro aminocido descoberto e foi isolado de aspargos, no incio do sculo XIX. A elucidao do mecanismo de biossntese deste aminocido ocorreu apenas no sculo XX, no entanto ainda permanece parcialmente enigmtico devido instabilidade da AS. A enzima AS pode utilizar a glutamina ou o NH4+ como doadores de N para a sntese da asparagina. a) Sntese da asparagina a partir de glutamina A enzima asparagina sintetase utiliza preferencialmente a glutamina como doador de N para a sntese da asparagina. Como pode ser visto na reao a seguir, o N retirado da glutamina transferido e ligado ao aspartato com a energia liberada pela hidrlise do ATP, formando assim a asparagina:Glutamina + Aspartato + ATP Glutamato + Asparagina + AMP + PPi

b) Sntese de asparagina a partir do NH4+ Apesar da glutamina ser o principal doador de N utilizado pela AS, esta enzima pode assimilar nitrognio inorgnico, quando NH4+ est em excesso na planta. Neste caso o NH4+ ligado diretamente ao aspartato formando asparagina, com simultnea hidrlise de ATP, o que fornece energia para a reao:Aspartato + NH4+ + ATP Asparagina + AMP + PPi

Neste caso, acredita-se que a asparagina seja um produto da detoxificao do amnio, quando as plantas esto submetidas a altas concentraes de NH4+. Em soja, por exemplo, o KM da AS para o NH4+ de 3,0 mM, que muito maior do que o KM da enzima para a glutamina (0,18mM), indicando que em altas concentraes de amnio a AS utilizaria este substrato. Esta funo de detoxificao respaldada pela alta taxa nitrognio:carbono da asparagina (2:4) que, aliada a sua relativa estabilidade, a torna um importante composto para o transporte e armazenamento de N.

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Tanto em leguminosas como em no-leguminosas, a asparagina um dos principais compostos nitrogenados de transporte nas plantas, sendo que no floema de leguminosas concentraes acima de 30mM de asparagina j forma detectadas.2.5.2 - Aspartato Aminotransferase (AspAT)

O nitrognio inorgnico assimilado em glutamato e glutamina, atravs das enzimas GS, GOGAT ou GDH, pode ser distribudo para outros compostos por ao das enzimas chamadas aminotransferases ou transaminases. A enzima AspAT tambm conhecida como glutamato:oxaloacetato aminotransferase (GOT) uma enzima dependente de piridoxalfosfato e catalisa a transaminao reversvel do oxaloacetato pelo glutamato formando -cetoglutarato e aspartato:Glutamato + Oxaloacetato -cetoglutarato + Aspartato

Diversas isoenzimas AspAT tm sido encontradas em diferentes tecidos e diferentes localizaes subcelulares tais como o citossol, mitocndrias, cloroplastos, glioxissomos ou peroxissomos. Uma vez que o aspartato, que o produto das isoenzimas AspAT, utilizado para transferir carbono, nitrognio e equivalentes redutores entre estes compartimentos celulares. Devido a AspAT utilizar glutamato e regenerar o -cetoglutarato ou vice-versa, que so precursores necessrios para a assimilao de NH4+, essas reaes de transaminao permitem que a assimilao de N ocorra mesmo na ausncia de sntese lquida de -cetoglutarato. Assim, AspAT tem papel chave na assimilao de N, interligando o metabolismo de N e C em plantas.


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VISO G ERAL DO METABOLISMO DE NITROGNIONo Quadro 1 pode ser visto um resumo das enzimas do metabolismo de nitrognio. O fornecimento de energia ou poder redutor para o funcionamento destas enzimas acopla o metabolismo de N ao de carbono (C) em trs vias: Utilizao de esqueletos de carbono: como na GDH, GOGAT, AS, AspAT. Utilizao de redutores: como para a NR, NiR, GOGAT e GDH. Utilizao direta de energia: como na GS e AS.Quadro 1. Principais enzimas do metabolismo do nitrognio (adaptado de Oaks e Yamaya, 1990)ENZIMA

REAO

FONTE DE ELTRONS OU ENERGIA LOCALIZAO CELULAR

NR NiR GS GOGAT GDH AS AS AspAT

NO 3 - NO 2 NO 2 NH 4+

NAD(P)H Ferredoxina ATP Ferredoxina NAD(P)H NAD(P)H ATP ATP -

Citossol Cloroplasto Plastdeos Citossol (GS1) Cloroplasto (GS2) Cloroplasto Plastdeos Mitocndria Cloroplasto Citossol Citossol Citossol - mitocndria cloroplasto - peroxissomo

Glutamato + NH 4 + Glutamina -cetoglutarato + Glutamina 2 Glutamato -cetoglutarato + NH 4 + Glutamato Glutamina + Aspartato + ATP Glutamato + Asparagina + AMP + PPi Aspartato + NH 4 + + ATP Asparagina + AMP + PPi Glutamato + Oxaloacetato -cetoglutarato + Aspartato

Nas folhas, essas interaes ocorrem s expensas dos produtos primrios da fotossntese ATP, NAD(P)H, ferredoxina e competem com a reduo de carbono, enquanto que, nas razes, os carboidratos armazenados ou translocados servem como substrato para a produo de energia e fonte de carbono para a assimilao de N.

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C APTULO 3

PRINCIPAIS PROCESSOS DE ASSIMILAO DE NITROGNIOO nitrognio a ser utilizado pelas plantas pode ser oriundo de diferentes fontes: N-atmosfrico ou fornecido como NH4+ ou NO3- (N-primrio). Produzido na fotorrespirao (via C2) (N-fotorrespiratrio). Reaes de catabolismo (desaminao de aminocidos) ou metabolismo especial (biossntese de ligninas etc.) (N-reciclado).3.1. ASSIMILAODO

NITROGNIO PRIMRIO (N-PRIMRIO)

A formao de NH4+ em leguminosas ocorre atravs da fixao direta do N atmosfrico, atravs de ndulos radiculares, enquanto que em no-leguminosa h produo de NH4+ pelas reaes de reduo promovidas pela ao da NR-NiR. A assimilao desse Nprimrio em folhas atribuda GS2 cloroplstica e Fd-GOGAT, por estas serem as formas isoenzimticas predominantes nos plastdeos foliares, enquanto que nas razes este papel atribudo GS1 citosslica e a NADH-GOGAT. Devido ao se alto KM para NH4+ (5,2-70mM) a GDH provavelmente no est envolvida com a assimilao de N-primrio (figura 7).3.2 - REASSIMILAODO

N-FOTORRESPIRATRIO

A atividade da enzima fotossinttica RUBISCO (Ribulose 1,5 bisfosfato carboxilase-oxigenase) com o substrato O2 ao invs do CO2 leva formao de fosfoglicolato na chamada reao de fotorrespirao ou via C2. As reaes da via C2 de fixao do O2 promovem a liberao de CO2 e NH4+, sendo considerada uma via de perda. Em plantas C3 onde a fotorrespirao predominante, pois a RUBISCO est em contato direto tanto com O2 quanto com CO2, a liberao desse NH4+ pode exceder em 10 vezes a capacidade de assimilao primria de N (Keys et al., 1978). Portanto, para


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Figura 7. Destino do nitrognio primrio (absorvido como nitrato ou amnio)

sobreviver, a planta deve reassimilar esse amnio gerado pela via C2 em glutamina e glutamato, atravs da ao da GDH ou GS2. Na figura 8 so propostos possveis destinos do N-fotorrespiratrio.3.3 - ASSIMILAODO

N-RECICLADO

Alm de assimilar o N proveniente da absoro radicular, as plantas devem ser capazes de incorporar em compostos orgnicos o NH4+ liberado de vrios processos metablicos relacionados ao catabolismo, como hidrlise de protenas e desaminao de

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Figura 8: Reassimilao do nitrognio gerado pela fotorrespirao (via C2)

aminocidos, sntese de metablitos especiais como a lignina (Nreciclado) (figura 9). Em dois momentos durante o desenvolvimento da planta h maior quantidade de NH4+ a ser reciclado: durante a germinao, quando as protenas de reserva das sementes so hidrolisadas e o N transportado como glutamina para o crescimento da plntula, e durante a senescncia, quando as protenas foliares so degradadas e o N reassimilado e transportado como glutamina, para os gros em desenvolvimento (Miflin e Lea, 1976). Durante esses processos, tem sido observado aumento da atividade da GS1 citosslica, NADHGOGAT e GDH, o que sugere a participao dessas isoenzimas, conforme esquematizado na figura 9 (Hirel, et al. 2001; Lea et al., 1990; Stewart et al., 1980). Segundo Buchanan-Wollaston e Ainsworth (1997), a isoforma GS1 est provavelmente envolvida na remobilizao de compostos nitrogenados, pois sua expresso induzida durante a senescncia.


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Figura 9. Gerao de amnio atravs de vrios processos metablicos e assimilao desse N pela GDH e via GS-GOGAT

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C APTULO 4

METABOLISMO DO NITROGNIO DURANTE A FASE REPRODUTIVA4.1 - REDISTRIBUIO DE NITROGNIO DURANTE A FASE REPRODUTIVA

O incio da fase reprodutiva pode ser um perodo crtico para a manuteno de um adequado suprimento de N para o desenvolvimento dos rgos de reproduo. Em culturas de cereais, sob condies de campo, comum que aps o florescimento (antese) o teor de N do solo seja baixo e o nitrognio do gro seja proveniente da mobilizao de N de outros tecidos (Simpson e Dalling, 1981; Souza et al., 1993 e 1999). Os gros requerem grande quantidade de N para suprir a demanda decorrente da elevada sntese de protena que ocorre durante o seu desenvolvimento (Staswick, 1989). A mobilizao de N dos tecidos vegetativos contribui significativamente para essas necessidades, uma vez que a absoro de N do solo durante o desenvolvimento dos gros freqentemente insuficiente (Pate, 1980). A principal fonte de nitrognio para o desenvolvimento das folhas e panculas de arroz o N liberado das folhas mais velhas senescentes (Kamachi et al., 1991; Souza et al., 1998). Do mesmo modo que acontece com o trigo, as folhas mais inferiores do arroz senescem primeiro e as superiores permanecem ativas por um perodo mais longo (Jenner et al., 1991). Estudos com 15N demonstraram que o N remobilizado das folhas mais velhas contribui com cerca de 64% de N-total das folhas mais jovens (Mae et al., 1983; Makino e Okira, 1983). Uma pequena proporo de N translocado das folhas para as razes. Segundo Nooden (1980), o lento crescimento radicular em plantas anuais, durante a fase reprodutiva, se relaciona reduzida taxa de absoro de nutrientes e produo de hormnios. No processo de remobilizao de N, protenas so hidrolisadas e os aminocidos so convertidos principalmente em formas amdicas, como a glutamina, que so translocadas para os rgos em desenvolvimento (Millard, 1988; Ghosh et al., 1995). Nas folhas, o nitrognio est concentrado nos cloroplastos, principalmente sob a forma de ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase-oxigenase (RUBISCO), a


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enzima fotossinttica responsvel pela assimilao do CO2. Em plantas C3, como o arroz, a RUBISCO contribui com cerca de 50% do total de protena solvel das folhas (Feller, 1990). Durante a senescncia, a degradao desta protena rpida e serve como fonte de N para o desenvolvimento dos gros (Huffaker e Peterson, 1974; Mae et al., 1983 e 1985; Makino et al., 1984). Em arroz, no decorrer do perodo de enchimento dos gros, o nitrognio translocado gradualmente dos rgos vegetativos para as panculas em desenvolvimento. Entre os vrios tecidos vegetativos, as lminas foliares contribuem com a maior parte do N fornecido pancula, podendo chegar a cerca de 60% do N-total translocado dos rgos vegetativos (Mae e Ohira, 1984). Harper et al. (1987) estimaram que aproximadamente 50% do nitrognio disponvel na folha e caule de trigo catabolisado e transportado para os gros em desenvolvimento, onde ento convertido e usado para a sntese de protena. Uma estreita relao pode ser observada entre o nitrognio exportado das folhas senescentes e o enchimento dos gros (Mae e Ohira, 1981). Entretanto, a quantidade de N presente nas pores vegetativas pode no ser suficiente, frente ao elevado requerimento verificado na poca de desenvolvimento dos gros. Por exemplo, Morris e Powlson (1985) verificaram que quando a planta no recebe adubao nitrogenada, o contedo de N da planta pode diminuir antes do perodo reprodutivo, fazendo com que o teor de protena dos gros seja baixo. Quando o N aplicado no plantio, podem ocorrer perdas que tambm inviabilizam o adequado suprimento de N para os gros (Strong, 1981). Desta maneira, como aps a antese os gros so os principais drenos para o N das folhas (Del Molino et al., 1989), se o N for aplicado durante este perodo de maior demanda, pode suprir as necessidades da planta, alm de evitar a acentuada translocao de N das folhas, que pode contribuir para sua senescncia. No entanto, Bellow et al. (1985) observaram que a aplicao foliar de uria em milho, aps o florescimento, no afetou a perda normal de N das folhas, a fotossntese e a taxa de senescncia da planta. Parece que a adubao nitrogenada no afeta a atividade fotossinttica, porque a RUBISCO no pode ser sintetizada durante o perodo reprodutivo, o que parece estar relacionado com a no

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funcionalidade do genoma do cloroplasto aps a expanso foliar total. De acordo com Thomas e Sttodart (1980), como o DNA cloroplstico responsvel pela sntese das oito subunidades proticas maiores que compe a RUBISCO (as oito subunidades menores so codificadas pelo DNA nuclear), sua represso aps a folha estar totalmente expandida pode justificar a impossibilidade de sntese desta protena e a perda linear da atividade fotossinttica durante o perodo reprodutivo, o que est de acordo com os resultados de Hidema et al. (1991) que observaram diminuio da taxa fotossinttica aps a expanso total da folha. Apesar da adubao nitrogenada na poca de desenvolvimento dos gros no ser eficaz para aumentar a taxa fotossinttica, devido limitao de expresso gnica para a sntese de RUBISCO durante este perodo, o N-suplementar pode afetar a taxa de degradao desta protena. Segundo Mae e Ohira (1984), a adubao nitrogenada no perodo reprodutivo no aumentou a sntese das protenas foliares RUBISCO e glutamina sintetase (GS), porm retardou a degradao das mesmas, devido a no ocorrer aumento na atividade das proteases. Assim, as plantas atingiram a fase final de senescncia mais tardiamente. Os autores tambm verificaram que as plantas que receberam mais nitrognio apresentaram maior teor de protena nos gros do que as plantas que receberam menores doses de N. Desta maneira, o N-adicional, aplicado durante o perodo reprodutivo, alm de poder retardar a produo de enzimas proteolticas (promovendo a manuteno da taxa fotossinttica por um maior perodo), direcionado em maior intensidade para os gros, aumentando o teor de protena dos mesmos, o que pode ser comprovado pelos resultados obtidos em diversos trabalhos, onde houve relao positiva entre o teor de protena do gro e a adubao nitrogenada no perodo reprodutivo: milho (Deckard et al., 1984; Pearson e Jacobs, 1987), arroz (Nishizawa et al., 1977; Thom et al., 1981; Souza et al., 1993 e 1999), cevada (Turley e Ching, 1986), trigo (Finney et al., 1957), ervilha (Pate e Flinn, 1973) e soja (Parker e Boswell, 1980). Como a atividade fotossinttica pode ser mantida por maior tempo, devido ao atraso na senescncia, esqueletos de carbono podero ser produzidos para a incorporao do N-suplementar que for fornecido planta durante este perodo. Deste modo, a escolha de variedades que apresentem senescncia mais tardia, acompanhada de maior capacidade


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de remobilizao ou a manipulao da adubao nitrogenada durante o perodo reprodutivo podem ser benficos para garantir o melhor desenvolvimento dos gros (Souza et al., 1993 e 1998; Ferraz Jr. et al., 2001).4.1.1 - Glutamato e Glutamina durante a Senescncia

O glutamato o aminocido presente em maior proporo nas folhas de arroz. Entretanto, durante a senescncia, o teor de glutamato diminui acentuadamente e os nveis de sua amida, a glutamina, aumentam (Kamachi et al., 1991). Segundo Hayashi e Chino (1990), a glutamina contribui com 42% do total de aminocidos presentes na seiva do floema de arroz, tornando-se o principal aminocido de transporte durante o desenvolvimento dos gros. A glutamina sintetase (GS) a mais provvel enzima para a formao de glutamina, nos tecidos senescentes (Miflin e Lea, 1977; Oaks e Hirel, 1985). No entanto, como acontece com a RUBISCO, a atividade da GS tambm diminui durante o perodo reprodutivo (Simpson e Dalling, 1985; Hayashi e Chino, 1990; Kamachi, et al., 1991 e 1992; Souza et al., 1999). Entretanto, como a GS no tecido vegetal est presente em pelo menos duas isoformas a GS1 localizada no citossol e a GS2 localizada no cloroplasto (Oaks e Hirel, 1985) , a queda na atividade da GS observada durante a senescncia pode ser atribuda diminuio da isoforma GS2 que, como outras protenas cloroplsticas, sofre hidrlise preferencial durante este perodo. A isoforma citosslica GS1, por sua vez, se mantm constante e pode at aumentar ligeiramente durante a senescncia (Makino et al., 1983; Kamachi et al., 1991 e 1992). Desta maneira, durante o perodo reprodutivo, apesar da atividade da GS total (GS1 + GS2) diminuir, a atividade da isoforma GS1 permanece constante e pode ser a responsvel pela converso de glutamato e NH4+ em glutamina. Feller (1990) e Kamachi et al. (1991) sugeriram que a GS1 das folhas senescentes seria a enzima responsvel pela sntese de glutamina, que por sua vez seria ento transferida para os tecidos em crescimento. A forma citosslica da GS estaria, portanto, envolvida na formao de compostos de transporte, a partir da quebra de produtos do catabolismo de protenas.

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Como ocorre progressiva deteriorao das funes do cloroplasto durante a senescncia e as enzimas cloroplsticas como RUBISCO, GS cloroplstica e GOGAT tambm so degradadas, parece lgico que o glutamato deixe de ser o principal aminocido de transporte e essa posio passe glutamina. A glutamina pode transportar mais N, por unidade de C do que o glutamato. Esta modificao no metabolismo benfica no perodo da senescncia, quando a taxa fotossinttica est declinando e a produo de esqueletos de carbono limitada. Isto pode acionar outras enzimas, como a glutamato desidrogenase, para que, atravs de sua funo de desaminao possa suprir, em parte, esta demanda por esqueletos de carbono (Thomas, 1978; Robinson et al., 1990 e 1992).4.2 - ENZIMAS DE ASSIMILAO DE NITROGNIO DURANTE A SENESCNCIA

A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo do nitrognio diminui durante a senescncia da planta. Em geral, a atividade da nitrato redutase (NR) perdida primeiro, enquanto que a glutamina sintetase (GS) e a glutamato sintase (GOGAT) permanecem ativas por um perodo mais longo (Storey e Beevers, 1978). Em arroz, foi observado que a diminuio na atividade da GS durante a senescncia ocorre devido diminuio da isoforma GS2cloroplstica, enquanto que a GS1-citosslica permanece constante. A RUBISCO (enzima fotossinttica localizada no cloroplasto) tambm diminui continuamente durante a senescncia (Kamachi, et al.,1991; Feller, 1990). Feller (1990) e Kamachi et al. (1991) sugeriram que a GS1 das folhas senescentes seria a responsvel pela sntese de glutamina, que passa a ser o aminocido de transporte mais importante nos estgios tardios da senescncia da planta, enquanto o glutamato diminui acentuadamente no mesmo perodo. Durante a senescncia, a glutamina sintetizada pela GS1 seria ento transferida para os tecidos em crescimento da planta de arroz. Portanto, a forma citosslica da GS estaria envolvida na formao de compostos de transporte, a partir da quebra de produtos do catabolismo de protenas e clorofila. Ao contrrio da GS e da GOGAT, alta atividade de glutamato desidrogenase (GDH) est, freqentemente, presente nas razes e folhas senescentes (Srivastava e Singh, 1987).


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4.3 - PAPEL DA GLUTAMATO DESIDROGENASE (GDH) METABOLISMO DO NITROGNIO

NO

A principal objeo ao papel da GDH na assimilao de nitrognio sua baixa afinidade pelo amnio (Miflin e Lea, 1977). A assimilao de amnio um processo importante, porque os ons NH4+ so txicos planta, mesmo em nveis relativamente baixos (Givan, 1979). Aps a descoberta da via GS/GOGAT para a assimilao de amnio, alguns autores propuseram que a GDH teria um papel importante somente em concentraes extremamente altas de NH4+, quando uma rpida detoxificao seria necessria (Givan, 1979; Miflin e Lea, 1976; Rhodes et al., 1976). Lewis et al. (1983) verificaram que nas razes de cevada os ons NH 4+ absorvidos do solo eram assimilados, exclusivamente, atravs da via GS/GOGAT e que a enzima GDH teria somente um papel limitado neste processo. Eles supem que a GDH das plantas superiores seria importante na reao de desaminao oxidativa do glutamato e no na aminao do -cetoglutarato a glutamato. Wallsgrove et al. (1983 e 1987) tambm sugerem que a GDH pode ser uma enzima catablica, ativa na desaminao de glutamato e funcionando s parcialmente na sua sntese. Resultados de Luxov (1988) demonstraram maior atividade da GS nas regies de crescimento radicular, enquanto que a atividade da GDH foi consideravelmente maior nas partes mais velhas da raiz. Souza et al. (1999) observaram que, durante o perodo de enchimento dos gros, a atividade da GS diminui na folha bandeira de arroz. Simpson e Dalling (1981) tambm verificaram queda na atividade da GS, enquanto que a atividade da GDH permaneceu constante durante o mesmo perodo e atingiu um pico de atividade aos 25 dias aps a antese. Esse pico de atividade da enzima GDH coincidiu com o perodo do rpido declnio na atividade da GS. Boggio et al. (2000) observaram em tomate que GS estava presente quase que exclusivamente nos frutos verdes, enquanto que a GDH se encontrava apenas nos frutos mais maduros, sugerindo um modelo recproco de induo entre GS e GDH durante o amadurecimento e senescncia do fruto de tomate.

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Aumentos na GDH, no perodo tardio da senescncia, foram observados em ptalas de tulipa senescentes (Corfantan e Daussant, 1975) e em folhas destacadas e senescentes de Lolium (Thomas, 1978). Tem sido observado que GDH a enzima do metabolismo de N que freqentemente atinge a mais alta atividade durante a senescncia (Frith et al., 1978; Ragster e Chrispeels, 1981; Laurire e Daussand, 1983; Feller, 1990). De acordo com Robinson et al. (1992), as mudanas na atividade da GDH, observadas em folhas senescentes, poderiam estar relacionadas com a diminuio da fotossntese nesses tecidos, e, portanto, ligadas disponibilidade de carbono. A partir destas consideraes, as duas funes para a enzima glutamato desidrogenase so destacadas a seguir: a) Desaminao oxidativa (funo catablica): catalisando a oxidao do glutamato a -cetoglutarato e fornecendo, assim, esqueletos de carbono para o ciclo de Krebs (Thomas, 1978). b) Aminao redutiva (funo anablica): assimilando amnio e formando glutamato (Srivastava e Singh, 1987; Yamaya et al., 1986). Robinson et al. (1990) demonstraram, em cultura de clulas de cenoura, que a GDH ativa na oxidao do glutamato, mas no na aminao redutiva do -cetoglutarato, que ocorreria somente via GS/GOGAT. Em outro experimento, os mesmos autores observaram relao inversa entre atividade da GDH e suprimento de carboidrato (sacarose) do meio de cultura. Sahulka e Lis (1980) tambm observaram aumento da atividade da GDH em resposta limitao de sacarose em pedaos de razes de ervilha. Com baixa luminosidade e, conseqentemente, baixa produo de carbono, devido baixa taxa fotossinttica, foi observado que a GDH tem importante papel na assimilao de amnio (Cammaerts e Jacobs, 1985; Laurire e Daussant, 1983). Estas evidncias levaram hiptese de que o papel primrio da GDH seria o catabolismo do glutamato, fornecendo esqueletos de carbono para que o ciclo de Krebs funcione, sob condies de limitao de carbono (Srivastava e Singh, 1987; Yamaya e Oaks, 1987; Oaks e Yamaya, 1990; Robinson et al., 1990 e 1992; Stulen e Steege, 1995).


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Sob este ponto de vista, poderia se supor que a chamada induo da atividade da GDH por amnio, observada por diversos autores (Kanamore et al., 1972; Barash et al., 1975; Kar e Feierabend, 1984; Jain e Shargool, 1987; Shargool e Jain, 1987; Srivastava e Singh, 1987; Robinson et al., 1991), estaria na verdade acontecendo devido diminuio de esqueletos de carbono e no pelo aumento de amnio no tecido da planta. A GDH teria, portanto, uma importante funo anaplertica, unindo o metabolismo do carbono e do nitrognio nas plantas superiores.

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