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ESTABILIDADE ALÉLICA DOS MARCADORES FORENSES NAS LEUCEMIAS CLÁUDIO VELOSO BATISTA Dissertação de Mestrado em Medicina Legal 2009
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ESTABILIDADE ALÉLICA DOS MARCADORES FORENSES
NAS LEUCEMIAS
CLÁUDIO VELOSO BATISTA
Dissertação de Mestrado em Medicina Legal
2009
CLÁUDIO VELOSO BATISTA
ESTABILIDADE ALÉLICA DOS MARCADORES FORENSES
NAS LEUCEMIAS
Dissertação de Candidatura ao grau de
Mestre em Medicina Legal submetida ao
Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar
da Universidade do Porto
Orientadores: Doutora Henriqueta Alexandra Coimbra Silva
Professora Auxiliar
Instituto de Genética Médica
da Faculdade de Medicina
da Universidade de Coimbra
Doutora Luísa Maria de Sousa Mesquita Pereira
Investigadora do IPATIMUP
Instituto de Patologia e Imunologia
Molecular da Universidade do Porto
I
Este trabalho é dedicado,
em especial e com um sentimento de imensa saudade,
ao meu cunhado e amigo Filipe Neves.
II
Dedico ainda à minha irmã e aos meus pais, a quem tudo devo,
à minha namorada Sandra,
a toda a minha família, aos meus avós, aos meus padrinhos, ao meu primo Pedro,
a todos os meus amigos, em especial à Clara,
aos amigos das andanças musicais, em particular ao pessoal da Smooth,
às colegas de curso Sofia, Marisa, Viviana, Ana Teresa, Joana e Cátia Daniela,
aos amigos do Secundário,
...
Às minhas orientadoras, Prof. Luísa e Prof. Henriqueta, agradeço a oportunidade que me
proporcionaram de concretizar este trabalho, e além de todo o conhecimento transmitido,
agradeço a disponibilidade, simpatia e amizade com que me acolheram.
À Prof. Maria José, coordenadora do curso de mestrado, agradeço a disponibilidade e a
colaboração, bem como a consideração demonstrada ao longo de todo o curso.
Às pessoas que contribuíram directamente para este trabalho, em particular ao Dr. Luís e
à Dra. Caroline, do Instituto de Genética Médica da Faculdade de Medicina da
Universidade de Coimbra, e à Dra. Verónica, à Dra. Marta e à Dra. Ana Mafalda, do
IPATIMUP.
A todos os que estiveram de algum modo envolvidos na concretização deste projecto, em
particular ao Marco e à Cristina.
À APLL- Associação Portuguesa de Leucemias e Linfomas, na pessoa no Dr. Herlander
Marques, agradeço a bolsa disponibilizada para o financiamento do trabalho.
À Dra. Virgínia Lopes e Dra. Maria João Porto, do Serviço de Genética e Biologia
Forense da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal.
A todos os professores que contribuíram para a minha formação académica, musical e
pessoal.
III
RESUMO
Os marcadores genéticos usados no contexto forense são microssatélites,
também denominados STRs, constituídos por unidades de três a cinco pares de bases,
que se repetem geralmente entre cinco a trinta vezes.
Os loci STR são altamente polimórficos, com uma extensão inferior a 350 pares
de bases, podendo ser facilmente analisados através de sistemas de amplificação
simultânea (PCR multiplex). Um dos requisitos essenciais à escolha dos STRs a incluir
no painel de marcadores usados para identificação humana é a sua dissociação com
qualquer tipo de patologia ou efeito fenotípico. Contudo, existem vários estudos que
referem que a estabilidade destes marcadores se encontra afectada em diversas
patologias, nomeadamente nas neoplasias.
No presente trabalho efectuou-se um estudo da estabilidade alélica apresentada
pelos marcadores genéticos aplicados no âmbito da medicina legal e das ciências
forenses para efeitos de identificação humana individual, em amostras de sangue de
pacientes com o diagnóstico de leucemia. Para isso, foram analisados dois fenómenos
essenciais indicativos de instabilidade genómica, a instabilidade dos microssatélites (MSI)
e a perda de heterozigotia (LOH), através da comparação de diversos parâmetros entre
amostras de DNA de doentes com leucemia e amostras de dois grupos controlos: um
controlo constituído por sujeitos sem nenhuma patologia diagnosticada e um controlo
publicado para a população do Centro de Portugal. A comparação com estes grupos
controlo resultou da impossibilidade de comparar tecido tumoral e normal do mesmo
indivíduo.
Para o estudo da instabilidade dos microssatélites analisou-se a existência de
polialelismo. O estudo da perda de heterozigotia foi avaliado indirectamente pela análise
das frequências de heterozigotia para cada locus, das frequências alélicas para cada
população e pelo desequilíbrio alélico entre os picos dos alelos dos loci heterozigóticos.
As duas populações foram também comparadas relativamente à variação e diferenciação
genética, através de diversos testes estatísticos.
A ausência de diferenças estatisticamente significativas entre as duas populações
e a concordância dos resultados obtidos neste trabalho através de diferentes métodos de
análise das amostras sugerem que, no contexto da Medicina Legal e das Ciências
Forenses, a identificação humana realizada através da elaboração de perfis genéticos
não parece ser condicionada pela utilização de sangue periférico de indivíduos
diagnosticados com leucemia e que os marcadores forenses que integram o kit
AmplSTR®Identifiler são estáveis nas células do sangue leucémico.
IV
ABSTRACT
Genetic markers used on forensic context are microsatellites, also named STRs,
formed by units that vary between 3 and 5 base pairs, which are usually repeated five to
thirty times.
STR loci are highly polymorphic, relatively undersized (with less than 350 base
pairs) and can be easily analyzed by simultaneous systems of amplification (multiplex
PCR). To be included on the markers panel used on human identification, one of the
fundamental requests for STRs choice is their dissociation with any kind of pathology or
phenotypic effect. However, several studies propose that the stability of these markers is
affected by a variety of diseases, particularly neoplasias.
The study of the allelic stability in leukemic patients, by means of genetic markers
currently used for human identification in legal medicine and forensic sciences areas, is
the main aim of this work. To address this issue two major characteristics of genomic
instability were analyzed by comparison of several parameters in DNA samples from
leukemia patients and two control groups: microsatellite instability (MSI) and loss of
heterozygosity (LOH). The first control group was composed of healthy unrelated
individuals and the second by a published control group for Portuguese population from
the Central area. The impossibility of comparing tumoral and normal-matched tissue
justifies the use of the mentioned control groups.
With the aim of studying the microsatellite instability, the polyallelism existence has
been analyzed. The loss of heterozygosity was evaluated indirectly by the analysis of the
heterozygosity frequencies for each locus, by allelic frequencies of both populations and
by the allelic imbalance between allelic peaks of heterozygotic loci. Several statistic tests
were also applied in order to compare the two populations focusing on the genetic
variation and differentiation.
The absence of statistically significant differences between the two studied
populations and the consistency of the obtained results using different practical
approaches to samples analysis suggest that, in Legal Medicine and Forensic Sciences
context, human identification by means of genetic profiles seems not to be conditioned by
the use of peripheral blood of leukemic patients. Also, the forensic markers of the
AmplSTR®Identifiler kit were stable in leukemic blood cells.
V
RÉSUMÉ
Les marqueurs génétiques utilisés dans le contexte forensique sont des
microsatellites, aussi appelés de STR, formés par des unités de trois à cinq paires de
bases, qui se répètent cinq à trente fois.
Les loci STR sont très polymorphes, avec une longueur inferieur à 350 paires de
bases, qui peuvent être facilement analysées par des systèmes d’amplification simultanée
(PCR multiplex). Une des conditions essentielles pour choisir les STRs qui doivent
incorporer le group des marqueurs utilisés pour l’identification humaine c’est leur
dissociation avec aucune pathologie ou effet phénotypique. Cependant, ils existent
plusieurs études qui montrent que la stabilité de ces marqueurs se trouve modifié en
certaines pathologies, particulièrement au niveau des néoplasies.
Dans ce projet nous avons effectué une étude de la stabilité allélique présentée
par les marqueurs génétiques qui sont appliquées au domaine de la médecine légale et
des sciences forensiques pour l’identification humaine individuelle, dans un échantillon de
sang périphérique de patients avec le diagnostique clinique de leucémie. À ce propos,
nous avons analisé deux phénomènes essentiels indicatifs de l’instabilité génomique,
l’instabilité des microsatellites (MSI) et la perte d’hétérozygotie LOH), par la comparaison
de plusieurs paramètres parmi l’échantillon d’ADN des patients avec leucémie et
l’échantillon de deux groupes contrôles: un contrôle formés par des individus avec aucune
pathologie diagnostiquée et un contrôle publié sur la population de la région centre du
Portugal.
Pour l’étude de l’instabilité des microsatellites nous avons examinés l’existence de
polyallélisme. La perte d’hétérozygotie a été étudié indirectement par l’analyse des
fréquences d’hétérozygotie de chaque locus, des fréquences alléliques de chaque
population et par le déséquilibre allélique entre les pics des allèles des loci
hétérozygotiques. Les deux populations ont été comparées relativement à la variation et
différentiation génétique, par des tests statistiques divers.
L’absence de différences statistiquement significatives entre les deux populations
et la concordance des résultats obtenus avec différentes méthodes d’analyse des
échantillons suggèrent que, au niveau de la Médecine Légale et des Sciences
Forensiques, l’identification humaine n’est pas limitée par l’utilisation du sang périphérique
des patients avec leucémie et que les marqueurs forensiques du kit AmplSTR®Identifiler
sont stables dans les cellules du sang leucémique.
VI
ABREVIATURAS
µg – micrograma
AI – Allelic Imbalance
AMPFLPs – Amplified fragment length polymorphisms
CHLC – Cooperative Humane Linkage Center
DNA – Ácido desoxirribonucleico
FAB – Franco-américo-britânico
FSS – Forensic Science Service
HLA – Human leukocyte antigen
HNPCC – Cancro colorectal hereditário não-polipótico
Homoz. - Homozigótico
kb – kilobases
kV - quilovolts
LLA – Leucemia Linfoblástica Aguda
LLC – Leucemia Linfóide Crónica
LMA – Leucemia Mielóide Aguda
LMC – Leucemia Mielóide Crónica
LOH – Loss of heterozygosity
Mb - megabases
MIN ou MSI – Microsatellite instability
ml – mililitro
MLPs – Multi locus probes
MMR – Mismatch repair
ng – nanograma
OMS – Organização Mundial de Saúde
PAR – Peak area ratio
pb – pares de bases
PCR – Polymerase chain reaction
PHR – Peak height ratio
RER+ – Replication error-positive
RFLPs – Restricted fragment length polymorphisms
SLPs – Single locus probes
SSLPs – Single sequence length polymorphisms
STRs – Short tandem repeats
VNTRs – Variable number of tandem repeats
VII
ÍNDICE
Resumo
Abstract
Résumé
Abreviaturas
I – INTRODUÇÃO
1.1 – SHORT TANDEM REPEATS
1.1.1 – Evolução dos marcadores de aplicação forense
1.1.2 – Definição e classificação dos STRs
1.1.3 – Função e aplicabilidade biológica dos STRs
1.1.4 – Selecção dos STRs forenses utilizados actualmente
1.1.5 – Caracterização dos STRs forenses
1.1.6 – STRs e patologias
1.1.7 – STRs e patologia oncológica
1.2 – LEUCEMIAS
1.3 – OBJECTIVOS
II – MATERIAL E MÉTODOS
2.1 – AMOSTRAS
2.1.1 – População de estudo
2.1.2 – População controlo
2.2 – METODOLOGIA
2.2.1 – Reagentes
2.2.2 – Preparação das amostras
2.2.3 – Amplificação
2.2.4 – Leitura e análise da amplificação
2.2.5 – Análise estatística
2.2.6 – Determinação do desequilíbrio alélico
III
IV
V
VI
1
1
1
4
7
8
10
15
17
21
29
30
30
30
30
30
32
32
33
33
34
37
VIII
III – RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 – Avaliação da estabilidade dos STRs pela pesquisa de polialelismo
3.2 – Diversidade genotípica: heterozigotia dos loci e Equilíbrio de
Hardy-Weinberg
3.3 – Distribuição das frequências alélicas
3.4 – Distâncias genéticas, AMOVA e testes de diferenciação
3.5 – Estudo do desequilíbrio alélico
3.5.1 – Definição dos critérios e valores-padrão
3.5.2 – Análise global
3.5.3 – Análise do comportamento dos loci
3.5.4 – Análise das amostras com loci em desequilíbrio alélico
IV – CONCLUSÕES
V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
VI – ANEXOS
Anexo 1 – Sistema de classificação FAB das leucemias mielóides agudas
Anexo 2 – Sistema de classificação FAB das leucemias linfoblásticas agudas
Anexo 3 – Equivalência entre os sistemas de classificação de Rai e Binet
Anexo 4 – Perfis genéticos dos indivíduos que constituem o grupo das leucemias
Anexo 5 – Ratio das alturas dos loci heterozigóticos do grupo controlo 2
Anexo 6 – Ratio das áreas dos loci heterozigótico do grupo controlo 2
38
39
41
44
58
59
59
61
67
69
76
78
94
95
95
95
96
98
101
1
I – INTRODUÇÃO
1.1 – SHORT TANDEM REPEATS (STRs)
1.1.1 – Evolução dos marcadores de aplicação forense
A Biologia e a Genética Forense dispõem actualmente dos mais avançados
recursos tecnológicos e científicos que permitem alcançar com êxito um dos seus
principais objectivos de estudo, a identificação humana. Ao longo da história da ciência
houve acontecimentos que se revelaram de extrema importância para o
desenvolvimento destas áreas do conhecimento. Antes de referir a descoberta e o
estudo pormenorizado do DNA ou a revolução imposta pela invenção da PCR a nível
das metodologias laboratoriais, há que, e não apenas por motivos cronológicos, referir o
contributo de Mendel, cujas leis permitiram definir as bases da genética actual.
A identificação humana, quer pela longínqua utilização das provas de
semelhança fisionómica, quer pelo actual recurso às mais recentes tecnologias usadas
para elaboração de perfis genéticos, pressupõe sempre a comparação, usando como
medida a “quantidade de semelhanças”. Por perfil genético entende-se, do ponto de
vista médico-legal, o conjunto de características hereditárias de um indivíduo
relativamente a um determinado número de marcadores genéticos, que se podem
detectar em qualquer vestígio biológico que lhe pertença. A identidade genética baseia-
se na individualidade biológica de cada ser humano, sendo fundamentada pela
exclusividade do seu material genético, bem como pela igualdade e imutabilidade do
DNA em todas as células do organismo, ao longo da vida.
Antes da aplicação da análise de DNA à resolução de casos de investigação
forense, a vinculação genética baseava-se em exames laboratoriais que permitiam uma
caracterização individual tão pormenorizada e discriminatória quanto possível, através do
estudo de marcadores imunológicos ou proteicos, sendo de destacar a determinação dos
grupos sanguíneos do sistema ABO, Rh, M e N, Hr, haptoglobinas, grupos P e o sistema
HLA (França, 2005).
Os primeiros caracteres humanos de transmissão mendeliana simples que se
estudaram foram os antigénios eritrocitários: o primeiro marcador humano polimórfico
(sistema ABO) foi descrito em 1900 por Landsteiner, mas só em 1924 Bernstein
conseguiu determinar o processo exacto de transmissão hereditária dos alelos do
sistema ABO. Trabalhos posteriores de Landsteiner, Levine, Wiener, Sturli, entre outros,
permitiram descrever por completo os sistemas eritrocitários ABO, MNs, P e Rh, que
viriam a constituir a base fundamental de todas as investigações biológicas de
2
paternidade. A caracterização dos sistemas Kell, Lutheran, Duffy, Kidd e Xg completou o
grupo de marcadores eritrocitários caracterizado pela determinação imunológica dos seus
fenótipos através de anti-soros.
Em 1947, com as proteínas plasmáticas, surge o segundo grupo de marcadores
polimórficos: Jayle e Gillard reconheceram a existência de vários tipos de haptoglobinas
(Hp), sendo este o primeiro passo para a posterior descoberta de múltiplos polimorfismos
de proteínas plasmáticas: Gm, Gc, Ag, Tf, Pi, Lp. Mais tarde, começaram a descrever-se
os polimorfismos que constituem o terceiro grupo de sistemas polimórficos, que engloba
as enzimas eritrocitárias e leucocitárias: ACP, PGM, AK, GPT.
Em 1967, os trabalhos de vários investigadores (Van Rood, Terasaki e Dausset)
culminaram na descrição completa do sistema antigénico mais polimórfico descrito até ao
momento, o sistema Hu-1, que mais tarde se denominou HLA (Human Leukocyte
Antigen) (Calabuig, 1998).
A partir de 1984, a tipagem genética de material biológico tornou-se uma das
ferramentas mais utilizadas para efeitos de identificação humana.
A técnica de DNA Fingerprint está incluída nos métodos clássicos de análise de
material genético e assenta na variabilidade de determinadas porções do DNA não
codificante. Essas porções são denominadas VNTRs (Variable Number of Tandem
Repeats) (Jeffreys, 1985; Nakamura, 1987) e são constituídas por sequências de
nucleótidos que se repetem sucessivamente, entre 2 a 10000 vezes, dependendo do
tipo de polimorfismo, e que podem apresentar um comprimento superior a 10 kilobases
(kb) (Benecke, 1997).
Estas estruturas genómicas eram analisadas sob a forma de RFLPs (Restricted
Fragment Length Polymorphisms), que se obtinham pelo reconhecimento e delimitação
de uma sequência específica através de enzimas de restrição, como por exemplo as
enzimas HaeIII, HinfI ou HindIII. Os fragmentos obtidos eram separados em gel por
electroforese, sendo posteriormente revelados pela técnica de Southern Blot (Southern,
1975), por hibridização com sondas complementares à sequência, marcadas com
fluorescência. Dependendo da especificidade da sonda, poderia identificar-se um único
segmento do DNA, para o qual se utilizava SLPs (Single Locus Probes) (Budowle et al.,
1991) ou vários segmentos, através de MLPs (Multi Locus Probes) (Jeffreys et al, 1985),
com os quais se obtinha um padrão de 20 a 30 bandas - comparado por alguns autores
a um código de barras - padrão esse que seria único e exclusivo para cada pessoa, e
que contribuiu para a designação DNA Fingerprint. Após um período inicial de bastantes
interrogações e dúvidas científicas (Lewin, 1989; Lander 1989; Norman, 1989), esta
técnica implementou-se e foi bastante utilizada na resolução de casos forenses, como
3
por exemplo testes de paternidade (Jeffreys et al., 1991), casos de imigração (Jeffreys et
al., 1985) ou investigações criminais (Gill et al., 1987).
Uma das principais limitações desta metodologia resultava das deficientes
condições de armazenamento e preservação do DNA, do seu elevado estado de
degradação e contaminação ou da limitada quantidade de material genético disponível
para análise, em consequência da própria natureza das amostras usadas neste tipo de
casos. A técnica de DNA Fingerprint permitia obter resultados aceitáveis utilizando uma
concentração mínima de 5 a 10 µg de DNA não degradado, valores nem sempre
possíveis de obter em amostras forenses. Por exemplo, um 1 ml de ejaculado contém
cerca de 150-300 µg de DNA, contudo, a partir de uma zaragatoa vaginal pós-coito só
se consegue obter 0.01-3 ng de DNA; um cabelo arrancado com raiz contém cerca de
30 ng de material genético, enquanto que a haste de um cabelo contém no máximo 0.1
ng de DNA (Benecke, 1997).
Ao comparar a utilização de SLPs com MLPs, conclui-se que os primeiros se
revelavam mais vantajosos no estudo de casos forenses pelo facto de permitirem obter
bandas a partir de 10 ng de DNA e apresentarem maior sensibilidade. Contudo, a
análise do comprimento dos alelos não se conseguia fazer com absoluta precisão,
principalmente devido aos limites de resolução impostos pelo gel utilizado na
electroforese (Tamaki e Jeffreys, 2005). Além destes argumentos, é ainda de referir o
facto de os VNTRs terem o inconveniente de se agruparem, formando clusters nas
regiões teloméricas dos cromossomas (NIH/CEPH Collaborative Mapping Group, 1992)
e de os RFLPs terem a desvantagem de possuírem baixa variabilidade, sendo as
técnicas laboratoriais utilizadas no seu processamento demasiado morosas.
Em 1985, Kary Mullis desenvolveu uma técnica, a Polymerase Chain Reaction
(PCR), cujo contributo para as ciências forenses, à semelhança de outras áreas de
investigação, se veio a revelar determinante. A sua fundamentação baseia-se em dois
princípios: o da complementaridade das bases azotadas, ou seja, o processo de
emparelhamento das mesmas não é aleatório (a adenina e a timina ligam-se de forma
específica, bem como a guanina e a citosina); e o da reversibilidade da desnaturação e
hibridização do DNA, que podem ocorrer num ambiente alcalino ou em determinadas
condições térmicas, provocando a ruptura das pontes de hidrogénio entre as bases e a
separação das duas cadeias de DNA.
Esta técnica permite amplificar pequenas quantidades de material genético e
obter milhões de cópias a partir de um determinado fragmento de DNA. A aplicação
desta metodologia à genética forense viabilizou o estudo de amostras em avançado
estado de degradação (sendo a fragmentação do material genético o tipo de degradação
4
mais limitante em amostras forenses), bem como de amostras com quantidades
mínimas de DNA.
Alguns loci de minissatélites com alelos relativamente pequenos (cerca de 1000
pb) puderam ser amplificados, originando AMPFLPs (Amplified Fragment Length
Polymorphisms); um dos minissatélites bastante utilizado em laboratórios forenses
denominava-se D1S80 (Nakamura et al., 1988; Kasai et al., 1990). Os fragmentos
obtidos a partir da análise deste marcador eram constituídos por 14 a 42 repetições,
sendo o comprimento de cada unidade de repetição de 16 pares de bases (pb). A
amplificação destes fragmentos permitia obter alelos com um tamanho
significativamente inferior aos fragmentos analisados pelas técnicas disponíveis até ao
momento. Ao invés do que acontecia com o estudo dos RFLPs, era possível fazer uma
análise comparativa dos alelos do D1S80 com um padrão que incluísse todos os alelos
conhecidos para este marcador (allelic ladder) no mesmo gel. Este novo procedimento
facilitava significativamente a leitura e interpretação dos resultados, de tal modo que viria
a ser adoptado pelos sistemas de identificação genética usados posteriormente. Após
uma avaliação pormenorizada da frequência alélica deste marcador na população
mundial (Peterson et al., 2000) a utilização do D1S80 caiu em desuso, em detrimento de
uma metodologia ainda mais vantajosa baseada na amplificação multiplex de STRs.
1.1.2 – Definição e classificação dos STRs
Os microssatélites pertencem à família das sequências de DNA repetitivo em
tandem, mais concretamente a uma classe denominada VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats). Esta classe inclui três tipos de sequências distintas, nomeadamente:
satélites, minissatélites e microssatélites.
As sequências satélites são constituídas por repetições cujo comprimento varia
entre 5 a 100 pares de bases (pb), caracteristicamente organizados em grupos que na
sua generalidade podem atingir um tamanho 100 megabases (Mb). O tamanho deste tipo
de sequências é pouco variável dentro de cada população, quando comparado com os
tipos de sequências referidos mais adiante (John et al., 1998; Tyler et al., 1993). Este tipo
de sequências encontra-se localizado predominantemente na heterocromatina junto dos
centrómeros dos cromossomas.
As sequências minissatélites têm um comprimento total que pode variar entre os
0,5 e 30 kb, sendo que a dimensão de cada repetição que as constituem é de 15 a 70 pb.
Este tipo de sequências está situado em determinadas regiões da eucromatina junto dos
telómeros e o seu tamanho é muito variável dentro de uma população (Shriver et al.,
1993; Armour e Jeffreys, 1992).
5
As sequências microssatélites são constituídas por repetições com um
comprimento que varia entre 2 a 6 pb, cuja agregação resulta em sequências que se
caracterizam por uma elevada variabilidade, apesar do seu tamanho não ultrapassar 350
pb. Os microssatélites localizam-se na eucromatina e os seus alelos são agrupados em
múltiplas classes, que variam relativamente ao seu comprimento, e são característicos de
cada população (Tautz e Rents, 1984).
Os microssatélites também podem ser designados de SSLPs (Single Sequence
Length Polymorphisms) ou STRs (Short Tandem Repeats) (Edwards et al., 1991).
Existem autores que fazem distinção entre microssatélites e STRs, considerando que os
primeiros são constituídos por repetições de 2 pb enquanto que os segundos são
constituídos por repetições de 3 a 6 pb; contudo, e de acordo com a linguagem científica
institucionalizada, estes dois termos serão usados com o mesmo significado (Koreth et
al., 1996).
Os STRs existem abundantemente tanto em procariontes como eucariontes,
representando cerca de 30% do DNA repetitivo e 3% da totalidade do genoma humano.
Em média, pode encontrar-se um STR a cada intervalo de 2000 pares de bases
(International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). Embora geralmente se
considere que os STRs estão localizados nas regiões não codificantes do DNA, existe
também uma pequena percentagem (cerca de 8%) que se localiza em regiões
codificantes (Ellgren, 2000).
A distribuição destes microssatélites pelos cromossomas é heterogénea e
irregular, podendo encontrar-se espalhados em diferentes graus de densidade. As
regiões subteloméricas são os locais onde se localizam em menor quantidade (Koreth et
al.,1996). Além disso, a sua frequência varia entre cromossomas; no homem, o
cromossoma 19 é o que apresenta maior quantidade de STRs (Subramaninan et al.,
2003).
Os STRs podem ser classificados de acordo com o comprimento da unidade de
repetição: as repetições podem distinguir-se em mono, di, tri, tetra penta ou
hexanucleotídicas, conforme sejam constituídas por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis
pares de bases, respectivamente (quanto maior for o tamanho da unidade de repetição,
mais informativo se considera o microssatélite) (International Human Genome
Sequencing Consortium, 2001). Por outro lado, tendo em conta a estrutura da repetição,
existem repetições perfeitas ou simples, quando contêm apenas uma unidade de
repetição, e imperfeitas ou compostas, quando são constituídas por mais do que uma
unidade de repetição, distintas entre si (Urquhart et al., 1994). Quando os alelos de um
STR são constituídos por unidades de repetição incompletas são designados de
microvariantes, sendo representados pelo número de unidades de repetição completas,
6
seguido do número de nucleótidos que formam a repetição incompleta. O exemplo mais
comum de um microvariante é o alelo 9.3 do locus TH01, que é composto por nove
unidades de repetição completas e uma unidade incompleta, constituída por três
nucleótidos (Butler, 2005).
Os STRs mais frequentes no genoma humano são constituídos por repetições
dinucleotídicas, o que confirma a constatação de que a frequência de cada um dos tipos
anteriormente referidos diminui à medida que aumenta o seu tamanho. Além disso,
também se verifica que as unidades de repetição mais frequentes apresentam uma
predominância de adeninas: A, AC, AAAN, AAN e AG, por ordem decrescente de
abundância (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001 e Nadir et al.,
1996).
Os microssatélites estão entre os marcadores genéticos mais versáteis, sendo
utilizados num vasto número de aplicações biológicas. Vinte anos após a sua descoberta,
apesar de já haver algumas teorias, existem ainda muitas respostas por obter no que
concerne ao conhecimento destes marcadores, mais precisamente em relação à sua
origem, aos processos que definem a sua localização e garantem a sua manutenção no
genoma, aos mecanismos biológicos responsáveis pela sua enorme variabilidade, e
acima de tudo, relativamente à sua importância biológica e funcional (Buschiazzo e Neil,
2006).
O processo que leva à formação dos microssatélites continua a ser alvo de vários
estudos (Wilder e Hollocher, 2001). Sabe-se, no entanto, que a sua síntese ocorre
aleatoriamente como resultado de um desequilíbrio entre eventos moleculares
promotores e inibidores da iniciação de microssatélites (Buschiazzo e Neil, 2006).
Existem duas teorias explicativas predominantes: uma refere que os microssatélites
surgem espontaneamente a partir de sequências únicas – microssatélites de novo
(Messier et al., 1996); outra sugere a existência de receptores genómicos aos quais
serão ligados formas primárias obtidos a partir de elementos móveis – microssatélites
adoptados (Wilder e Hollocher, 2001). Existem também referências a estruturas
anteriores ao microssatélites, denominados proto-microssatélites, cuja existência resulta
da substituição ou inserção de bases em determinadas regiões do genoma, levando à
formação de 3 ou 4 unidades de repetição sucessivas (Hancock, 1999), que
posteriormente estariam altamente sujeitas a mecanismos de expansão (Messier et al.,
1996). Nos mamíferos, já há muito que se conhece a associação entre microssatélites e a
sequência Alu (Nadir et al., 1996; Arcot et al., 1995; Clark et al., 2004), os elementos L1
(Duffy et al., 1996) e a fracção poli(A), justificada pela elevada susceptibilidade de erros
de transcrição a que estão sujeitos, o que resulta na síntese de proto-microssatélites
7
ricos em A e na sua expansão, motivada por um acontecimento mutagénico denominado
slippage (deslizamento) do DNA.
Apesar destas hipóteses serem plausíveis, a sua fundamentação em critérios
especificamente selectivos poderá ser questionada, visto que não são representativas da
totalidade do genoma.
1.1.3 - Função e aplicabilidade biológica dos STRs
Durante muito tempo os STRs foram considerados como uma parte do material
genético inútil e sem interesse (Buschiazzo e Neil, 2006) mas a partir da última década
do século XX, assistiu-se a um interesse crescente relativamente aos seus efeitos no
organismo.
Inicialmente pensava-se que estas sequências repetitivas desempenhavam um
papel funcional a nível do genoma, quer directamente pela sua participação na regulação
dos genes (Hamada et al., 1984), quer indirectamente, funcionando como hot spots para
a recombinação (Slighton et al., 1980). Contudo, se por um lado não é possível atribuir
uma função específica a estas porções do DNA, por outro lado sabe-se que em
determinadas circunstâncias as repetições trinucleotídicas CAG são transcritas; existem
proteínas que se ligam ao DNA, com especificidade para repetições di e trinucleotídicas
(Richards et al., 1993) e estudos in vitro revelaram que existem também repetições que
podem funcionar como locais indutores da agregação do nucleossoma (Wang et al.,
1994).
Estudos posteriores vieram a constatar algumas funções que se podiam atribuir a
estas porções de material não codificante, tais como a regulação da transcrição do gene
do factor de crescimento da epiderme (Gebhardt et al., 1999), do gene da tirosina-
hidroxilase (Meloni et al., 1998), e do gene PIG33 (Contente et al., 2002); em genomas
de mamíferos, repetições (CA)n e (CT)n junto de determinados genes podem afectar a
expressão desses mesmos genes (Hamada et al., 1984; Naylor et al., 1990); os STRs
podem afectar a recombinação (Wahls et al., 1990), a formação de sinais para o
posicionamento do nucleossoma (Wang e Griffin, 1995) e a manutenção da organização
espacial da cromatina (Heale e Petes, 1995); em 2000, Escher e colaboradores
demonstraram que alguns STRs estão envolvidos na regulação do processo de
transcrição, visto que as proteínas envolvidas neste mecanismo contêm domínios ricos
em glutaminas e repetições trinucleotídicas constituídas por sequências poliglutamínicas
(Escher et al., 2000).
Além dos exemplos mencionados é sabido que as repetições trinucleotídicas
estão implicadas em pelo menos 19 doenças genéticas no Homem, nas quais se
8
observou uma forte correlação entre o comprimento das repetições, a idade em que se
manifestaram os primeiros sintomas e a severidade da doença (Pearson et al., 2005).
Apesar de um crescente número de funções para estes microssatélites estar a ser
descoberto, a sua maioria continua ainda desconhecida, sendo imperativa uma maior
compreensão da variabilidade e mutabilidade dos STRs para perceber as suas variadas
funções biológicas. Mesmo com todas as dúvidas e desconhecimento ainda existentes, a
sua abundância e elevada variabilidade tornaram-nos os marcadores genéticos mais
utilizados nas últimas décadas (Chambers e MacAvoy, 2000).
Os STRs caracterizam-se por uma transmissão estável e conservativa, sendo
herdados por uma geração e transmitidos à geração seguinte de acordo com as Leis de
Mendel (Weber e May, 1989); o perfil de STRs é único para cada indivíduo e comum às
várias células do organismo (Beckman, 1992). Estas características conferem-lhes uma
vasta aplicabilidade no domínio das ciências biológicas a nível individual, familiar,
populacional e filogenético, sendo usados frequentemente para identificação humana,
testes de paternidade/parentesco, construção de árvores filogenéticas de evolução,
estudos genéticos populacionais, elaboração de mapas genéticos, localização de genes e
como meio auxiliar no diagnóstico de patologias. Além de tudo isto, pelo facto de se
poderem localizar na proximidade de genes importantes, podem ser utilizados como
marcadores de determinadas patologias associadas a esses genes e permitir a obtenção
de informação relativamente à importância dos genes num estádio específico da doença
ou da sua evolução, especialmente no caso de patologias do foro oncológico (Naidoo e
Chetty, 1998).
1.1.4 – Selecção dos STRs forenses utilizados actualmente
Edwards e Hammond foram os primeiros investigadores a descrever os STRs como
instrumentos essenciais na identificação humana, no início dos anos 90 (Edwards et al.,
1991 e 1992). Vários estudos foram realizados por diversas instituições científicas
internacionais com o intuito de definir quais os marcadores a aplicar, de acordo com
vários critérios que serão especificados mais adiante. Neste sentido, há que destacar a
Royal Canadian Mounted Police (RCMP) que contribuiu com vários estudos efectuados
em parceria com laboratórios europeus (Frégeau, 1993) e o Forensic Science Service
(FSS), que começou por investigar exaustivamente novos loci e a variação populacional
de uma série de prováveis STRs (Kimpton et al., 1993).
Os loci FES/FPS, F13A1, vWA e TH01 foram agrupados para constituir o primeiro
multiplex aplicado ao estudo de um caso forense pelo FSS (Kimpton et al, 1994). Seguiu-
se um multiplex de segunda geração que incluía os seguintes loci: TH01, vWA, FGA,
9
D8S1179, D18S51 e D21S11 (Kimpton et al, 1996). Em Abril de 1995, foi criada a Base
de Dados Nacional de DNA do Reino Unido, construída a partir da aplicação do multiplex
anteriormente referido, ao qual foi adicionado o estudo da amelogenina para a
determinação do género masculino e feminino (Werret, 1997).
Um ano após a criação da Base de Dados Nacional de DNA daquele país surge o
“Projecto STR”, nos EUA, que tinha como principal objectivo a criação de uma base de
dados genéticos norte-americana. Esta base de dados foi o resultado do trabalho
desenvolvido pelos laboratórios do FBI, que, comprovada a eficácia da tecnologia
genética associada aos STRs, centraram as suas investigações na definição do conjunto
de STRs a aplicar na estruturação do CODIS (Combined DNA Index System) que iria
servir de suporte à NDNAD (U.S. National DNA Database). Este projecto envolveu 22
laboratórios que, durante cerca de ano e meio, estudaram e avaliaram 17 loci candidatos
que se encontravam provisoriamente disponíveis em kits comerciais. Foram então
desenvolvidos vários estudos com o objectivo de avaliar o desempenho e os diversos
protocolos associados a estes kits, bem como a estabilidade das bases de dados
populacionais e a valorização forense dos vários sistemas de STRs em análise.
Paralelamente ao desenvolvimento dos princípios científicos, também se verificou
um progresso acentuado no domínio das tecnologias e técnicas laboratoriais. Enquanto
numa fase inicial se empregava um gel de poliacrilamida com revelação de prata para
detecção de STRs, numa fase posterior começaram a ser usado métodos fluorescentes
associados à electroforese, culminando com o desenvolvimento de analisadores e
sequenciadores automáticos (Fregeau et al, 1993).
A 14 de Novembro de 1997, após uma reunião do “Projecto STR”, foram
anunciados os 13 loci integrantes de um painel utilizado na criação da base de dados
genéticos norte-americana (CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818,
D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11) (Budowle et al., 1998). Foram
igualmente providenciados kits comerciais pelas duas maiores empresas que ainda hoje
são detentoras dos recursos mais avançados relativamente à tecnologia associada a
estes sistemas de análise de DNA repetitivo: a Applied Biosystems lançou no mercado os
kits Profiler Plus e COfiler, enquanto que a rival Promega Corporation, completou um kit
já existente, o PowerPlex 1.1, pela adição de novos loci, dando origem ao kit PowerPlex
2.1. Após o desenvolvimento destes kits, a comunidade científica centrou os seus
esforços no sentido de conseguir que os 13 loci utilizados fossem amplificados numa
única reacção, num sistema denominado multiplex (Holt et al., 2002 e Levedakou et al.,
2002).
Em Maio de 2000 surge o kit PowerPlex 16 (Promega Corporation), que permitia a
amplificação dos 13 loci e incluía também o estudo da amelogenina e dois
10
pentanucleótidos denominados de Penta D e Penta E, que foram descobertos e
caracterizados pelos investigadores numa tentativa de definir loci com elevada
variabilidade e que demonstrassem uma baixa tendência para a formação de artefactos
(Bacher et al., 1998). Em Julho de 2001 a Applied Biosystems apresenta o kit 16plex
Identifiler, que incluía a amplificação dos 13 loci referidos, o estudo da amelogenina e
dois tetranucleótidos: D2S1338 e D19S433, que aumentavam o poder discriminativo do
kit e facilitavam a interpretação dos resultados em caso de misturas (Schumm et al.,
2001).
O Reino Unido e a maioria dos países europeus viriam a adoptar o kit comercial
disponibilizado em 1999 pela Applied Biosystems, denominado SGM Plus, que era uma
versão actualizada do kit SGM já existente, tendo sido introduzidos os loci D3S1358,
D16S539, D2S1338, D19S433 e a amelogenina. O locus SE33 define um STR
extremamente polimórfico e foi incluído em kits comerciais produzidos pelas duas
empresas anteriormente referidas e também por companhias alemãs, visto que a
Alemanha usou este STR quando concebeu a sua base de dados genéticos, em 1998,
uma vez comprovada a sua elevada utilidade em casos resolvidos anteriormente
(Wiegand et al., 1993).
Pode constatar-se, pelos factos supracitados, que a escolha dos loci STRs usados
actualmente na maioria dos países da Europa e nos EUA resultou de uma selecção
orientada pela aplicação dos STRs aquando da concepção das bases de dados
nacionais, o que, em parte, dependia dos marcadores que se encontrassem
disponibilizados pelos kits comerciais ou que já se encontrassem a ser utilizados com
regularidade e êxito na resolução de casos forenses (Butler, 2006).
1.1.5 - Caracterização dos STRs forenses
Os marcadores genéticos usados no contexto forense são microssatélites
constituídos por unidades de repetição que variam entre 3 a 5 pares de bases, que
geralmente se repetem entre 5 a 30 vezes, denominados Short Tandem Repeats. Os
loci STR são altamente polimórficos, com uma extensão inferior a 350 pb (Brinkmann,
1966), podendo ser analisados através de sistemas de reacções de polimerização em
cadeia (PCR multiplex). Esta característica permite a sua utilização em amostras
degradadas ou com quantidades mínimas de material genético, o que acontece com
muita frequência no tipo de amostras estudadas no âmbito médico-legal.
A primeira aplicação forense destes microssatélites foi a identificação dos restos
cadavéricos de uma vítima de assassinato (Hagelberg et al., 1991) e do criminoso Josef
Mengele, conhecido como o “Anjo da Morte” de Auschwitz (Jeffreys et al., 1992), sendo
11
que a sua primeira utilização como marcadores polimórficos foi em 1989 (Litt e Luty,
1989; Weber e May, 1989). O elevado grau de polimorfismo destes microssatélites
resulta da variação do número de unidades de repetição repetidas sequencialmente (em
tandem) e de uma microvariação a nível da sequência ou da estrutura das unidades de
repetição.
Estes marcadores podem ser amplificados por PCR e os amplicons obtidos
podem ser medidos com precisão através da electroforese em gel de poliacrilamida. Em
casos forenses as sequências constituídas por repetições tetranucleotídicas são
utilizadas preferencialmente relativamente às que são compostas por repetições di ou
trinucleotídicas, visto que a separação electroforética baseada no tamanho das
sequências é menos eficaz em alelos que possuam repetições de dois ou três pares de
bases e pelo facto de nestas existir uma maior propensão para a formação de bandas
stutter (Jeffreys e Tamaki, 2005). De facto, em STRs compostos por repetições de
tetranucleótidos, a percentagem de formação de produtos stutter é de 15%, enquanto que
nos STRs compostos por repetições de tri ou dinucleótidos essa percentagem eleva-se
para os 30% (Butler, 2005). Quando os loci STR são amplificados poderá haver a
formação de um artefacto cujo tamanho difere uma unidade de repetição em relação ao
alelo correspondente, o que acontece devido ao fenómeno de deslizamento da cadeia de
DNA durante a PCR ou a uma desnaturação incompleta dos produtos da PCR,
originando produtos stutter (Hauge e Litt, 1993).
Estes artefactos tornavam mais difícil e imprecisa a interpretação dos resultados
no gel, visto que se visualizavam na forma de bandas secundárias ou sombras. Isto
acontecia principalmente no caso de amostras constituídas por misturas de fluidos
biológicos, nas quais se obtém mais do que um perfil genético – muito frequente em
vestígios colhidos de vítimas ou cenas de crimes de índole sexual. As repetições penta e
hexanucleotídicas, apesar de serem estudadas por alguns investigadores, não são
usadas por serem menos frequentes no genoma humano (Bacher et al., 1999).
Assim, pode enumerar-se um conjunto de vantagens na utilização de
microssatélites com repetições tetranucleotídicas relativamente aos minissatélites VNTRs
ou aos STRs com repetições tri ou dinucleotídicas, entre as quais, a reduzida tendência
para formação de produtos stutter, o que permite a interpretação de resultados obtidos no
processamento de amostras com misturas de material biológico; a reduzida variação no
comprimento dos alelos, permitindo uma análise por multiplex, e a capacidade de obter
produtos de PCR de pequenas dimensões, possibilitando a obtenção de informação a
partir de amostras de DNA degradado (Butler, 2005).
Actualmente a amplificação dos STRs é feita quase automaticamente, através de
um sistema denominado PCR multiplex, que permite a amplificação de vários loci numa
12
reacção que ocorre num só tubo. Este método, além de diminuir significativamente o
tempo de processamento das amostras e a quantidade de reagentes e de DNA
necessários, mostra-se ainda vantajoso pelo facto de eliminar eventuais fontes de
contaminação e de evitar a troca de amostras (Schumm et al., 2001). Além disso, um
sistema complementar de detecção fluorescente completa a automatização de todo o
processo e facilita a correcta obtenção e interpretação de perfis genéticos.
O perfil genético de um indivíduo pode ser caracterizado a partir de vários STRs.
O painel usado neste trabalho inclui os marcadores implementados e mais usados em
todo o mundo, estando reunidos num kit desenvolvido por uma empresa comercial pelo
facto de serem os STRs escolhidos pelas duas maiores potências mundiais das ciências
forenses para construírem as suas bases de dados nacionais de perfis genéticos. Assim,
tal como referido na secção anterior, em 1997 os EUA escolheram um conjunto de 13
STRs que viriam a integrar o CODIS usado pelos laboratórios do FBI na criação da
NDNAD e o Reino Unido implementou 10 STRs que viriam a ser adoptados por outros
países da Europa (Gill, 2002). A tabela 1.1 resume algumas das principais
características destes marcadores. A partir dos 13 STRs que integraram o CODIS e dos
10 STRs adoptados pelo Reino Unido, a Applied Biosystems criou um kit denominado
AmplfSTR Identifiler, que é vastamente usado não só na resolução de crimes ou
investigações de paternidade, mas também na identificação de pessoas desaparecidas
ou vítimas de desastres em massa (Ballantyne, 1997).
Os STRs que constituem o painel de marcadores genéticos forenses partilham
um conjunto de características que lhes conferem uma elevada taxa de sucesso na
resolução de casos de interesse médico-legal: elevada heterozigozidade e elevado grau
de polimorfismo; elevado poder de discriminação, geralmente superior a 0,9 numa
heterozigotia superior a 70%; localização dispersa no genoma e segregação
independente, com um posicionamento em diferentes cromossomas ou pelo menos em
braços diferentes, estando a sua localização bem definida no cariótipo humano;
localização em regiões não codificantes, não associadas a patologias; robustez e
reprodutibilidade dos resultados quando analisados em sistemas multiplex com outros
marcadores; baixa propensão para a formação de produtos stutter; alelos de menor
comprimento, compreendidos num intervalo de 90 a 500 pares de bases, conferindo
maior possibilidade de uma análise eficiente do DNA degradado (Butler, 2005) e
estabilidade na maioria dos tecidos, incluindo tecidos post-mortem (Hoff-Olsen et al.,
2001).
13
Pela análise da tabela 1.1 pode observar-se que os STRs estão localizados em
cromossomas distintos (com a excepção do TPOX e do D2S1338 localizados no
cromossoma 2 e do CSF1PO e do D5S818, ambos localizados no cromossoma 5, com
uma distância de aproximadamente 26.3 megabases entre si), o que faz com que sejam
segregados independentemente uns dos outros, durante a meiose. Esta característica
permite a aplicação da regra do produto quando se pretende calcular a “probabilidade de
coincidência” (match probability) quando são utilizados perfis genéticos construídos a
partir de um painel de vários loci (National Research Council, 1996). De referir ainda
que, mesmo no caso de marcadores que se localizem no mesmo cromossoma
separados por milhões de pares de bases ou até com distâncias inferiores a um milhão
de pares de bases, é possível aplicar a regra do produto. Relativamente aos STRs
anteriormente referidos que estão localizados no mesmo cromossoma, apesar de terem
sido efectuados inúmeros estudos em indivíduos escolhidos ao acaso da população, não
foi encontrada nenhuma associação entre eles.
Quando se obtém uma correspondência entre o perfil genético de um vestígio
biológico e a amostra de referência colhida a partir de um suspeito ou de uma vítima é
necessário calcular uma probabilidade. A probabilidade de discriminação é uma medida
relativa de eficácia de um sistema genético, em criminalística biológica. É um parâmetro
estatístico que se define como a probabilidade de dois indivíduos, retirados ao acaso da
mesma população, não aparentados entre si, se poderem diferenciar geneticamente,
mediante a análise de um sistema ou conjunto de sistemas genéticos. O oposto da
probabilidade de discriminação é a probabilidade de coincidência. Relativamente aos
STRs forenses, os loci FGA, D18S51, e D21S11 são os mais polimórficos e o loci
TPOX o menos polimórfico (Butler, 2005). O poder de discriminação do conjunto de
13 marcadores incluídos no kit é extremamente elevado e a média das probabilidades
de coincidência entre indivíduos não relacionados é de um num trilião.
Os STRs constituem hoje em dia uma ferramenta essencial no domínio das
ciências médico-legais, mais especificamente a nível da Biologia e Genética Forense,
mantendo-se os marcadores genéticos mais utilizados (Edwards et al., 1991; Alford et
al., 1994)
14
Tabela 1.1 – Características específicas dos loci STR
que integram o kit AmplfSTR Identifiler
Adaptado de Butler, 2005
STR Unidade
de Repetição Localização
Nº de repetições
Nº de Alelos
Referência
D8S1179 [TCTA] [TCTG] 8q24.13 7-20 17 CHLC
GATA7G07.37564
D21S11 Complexo
[TCTA] [TCTG] 21q21.1 12-41.2 82
Sharma e Litt, 1992
D7S820 GATA 7q21.11 5-16 30 CHLC
GATA3F01.511
CSF1PO TAGA
5q33.1 c-mfs proto-oncogene, 6º
intrão
5-16 20 Hammond et al.,
1994
D3S1358 [TCTG][TCTA] 3p21.31 8-21 24 Li et al., 1993
TH01 TCAT 11p15.5
tirosina hidroxilase, 1º intrão
3-14 20 Polymeropoulos
et al., 1991
D13S317 TATC 13q331.1 5-16 17 CHLC
GATA7G10.415
D16S539 GATA 16q24.1 5-16 19 CHLC
GATA11C06.715
D2S1338 [TGCC] [TTCC] 2q35-37.1 15-28 14 SGM Plus, Identifiler
D19S433 AAGG 19q12-13.1 9-17.2 15 SGM Plus, Identifiler
vWA [TCTG] [TCTA]
5q33.1 factor von
Willebrand, 40º intrão
10-25 28 Kimpton et al.,
1992
TPOX GAAT 2p25.3
tiróide peroxidase, 10º intrão
4-16 15 Anker et al., 1992
D18S51 AGAA 18q21.33 7-39.2 51 Staub et al., 1993
D5S818 AGAT 5q23.2 7-18 15 CHLC
GATA3F03.512
FGA CTTT 4q31.3
alfa fibrinogénio, 3º intrão
12.2-51.2 80 Mills et al., 1992
15
1.1.6 - STRs e patologias
As alterações genéticas ocorridas em sequências repetitivas podem ser causa
frequente para doenças humanas monogénicas. Inicialmente esta relação era
exclusivamente atribuída a repetições trinucleotídicas (Richards e Sutherland, 1994) mas
mais tarde viriam a ser descritas associações entre vários STRs instáveis e diferentes
tipos de cancro. Além disso, sabe-se agora que a própria repetição poderá apresentar
predisposição para mutações, decorrente de uma relação entre a instabilidade e o
número de repetições (Richards e Sutherland, 1992).
Pelo facto da caracterização de um perfil genético através de STRs permitir a
identificação unívoca de um sujeito, cada vez mais tem vindo a interessar a possibilidade
de ser estabelecida algum tipo de relação entre STRs e doenças, o que poderá levantar
várias questões nomeadamente a nível da privacidade desse sujeito, se se tiver em
causa, por exemplo, aspectos como a inclusão do seu perfil numa base de dados, com
todas as questões éticas e morais que daí advêm.
Um dos requisitos essenciais à escolha dos STRs a incluir no painel de
marcadores usados para identificação humana é a sua dissociação com qualquer tipo de
patologia ou efeito fenotípico. Ao efectuar uma revisão da bibliografia que aborda a
relação entre STRs específicos e determinadas patologias é importante ter a noção de
que apesar de haver trabalhos publicados que sugiram essa relação, os resultados, face
à sua ambiguidade e contradição, não foram considerados determinantes a ponto de
impedir a utilização desses microssatélites para fins forenses. Na verdade, houve mesmo
associações que mais tarde se vieram a confirmar inexistentes, como é exemplo o locus
TH01, que está incluído na maioria dos kits para criação de perfis genéticos (Klinstar et
al., 2004 e Klinstar et al., 2005). Este marcador, localizado no primeiro intrão do gene que
codifica a enzima tirosina hidroxilase, tem sido bastante controverso, pela possibilidade
de estar associado a várias patologias. Thibaut et al. (1997) e Burgert et al. (1998)
realizaram estudos em que conseguiram observar uma associação com determinados
alelos do locus TH01 em indivíduos diagnosticados com doença bipolar ou esquizofrenia,
mas por outro lado McQuillin et al. (1999) obtiveram resultados que viriam a demonstrar
que esta associação não era estabelecida; Sharma et al. (1998) e Klintschar et al. (2004)
obtiveram resultados contraditórios quando tentaram relacionar os alelos 9.3 e 10 deste
marcador com a hipertensão, e trabalhos realizados mais recentemente por Anney et al.
(2004) indicaram ainda que indivíduos portadores do alelo 7 do TH01 poderão ser mais
resistentes à dependência de nicotina e menos propícios a hábitos tabágicos viciantes,
não havendo contudo resultados determinantes.
16
Existe apenas uma excepção que, pelo facto de ter sido provada a sua
associação com diversas patologias genéticas, resultou na remoção do STR HumARA do
painel usado para identificação humana. Este marcador caracteriza-se pela repetição
sequencial de trinucleótidos CAG e encontra-se localizado numa região codificante do
cromossoma X - exão 1 do gene que codifica um receptor de androgénio (Szibot et al.,
2005). Contudo, verifica-se que este marcador possui características que não são
partilhadas pelos restantes STRs usados na identificação humana e que poderão
inclusivamente estar na base da explicação da sua relação com as referidas patologias:
por um lado a sua localização numa região codificante; por outro, o facto de ser
constituído por uma repetição trinucleotídica, estando por isso aumentada a propensão
para fenómenos de expansão, o que constitui uma causa de distúrbio genético (Tian et
al., 2005).
Alguns dos STRs que constituem o painel para identificação humana têm vindo a
ser considerados úteis no diagnóstico de determinadas patologias genéticas, através da
perda de heterozigotia ou desequilíbrio alélico. Por exemplo, o locus D8S1179 foi
utilizado para localizar um gene relacionado com o Síndrome de Meckel-Gruber, uma das
causas mais frequentes de defeitos do tubo neural (Morgan et al., 2005); um outro estudo
aplicado a cerca de 400 STRs demonstrou que o marcador anteriormente referido
poderia estar associado com o gene responsável pela microalbuminúria, que prejudica a
função renal e pode elevar o risco de doenças cardiovasculares (Fox et al., 2005).
Além dos microssatélites anteriormente referidos há ainda que mencionar o locus
D21S11, que pelo facto de se localizar no cromossoma 21 pode ser associado à
Trissomia 21 ou Síndrome de Down, que é uma patologia que pode ser detectada
regularmente pela presença de três alelos em qualquer marcador polimórfico naquele
cromossoma (Liou et al., 2004); de igual modo, o D18S51 poderá ser caracterizado em
amostras no diagnóstico pré-natal do Síndrome de Edwards ou Trissomia 18 (Yoon et al.,
2002).
Além dos exemplos acima enunciados, a perda de heterozigotia ou um acentuado
desequilíbrio alélico também podem, nalguns casos, estar associados a patologias
neoplásicas.
17
1.1.7 - STRS e patologia oncológica
A patologia oncológica encontra-se frequentemente associada à instabilidade
genética, permitindo a acumulação de um conjunto de alterações oncogénicas num
curto espaço de tempo, necessárias para transformar uma célula normal numa célula
neoplásica. Hartwell (1992) constatou que a perda de funcionalidade dos sistemas
responsáveis pela salvaguarda da integridade do genoma era determinante para o
desenvolvimento de um processo tumoral multifásico.
Existem duas formas principais de instabilidade genética: uma das formas inclui
alterações cromossómicas, como aneuploidia, delecções ou expansões; a outra é mais
subtil e manifesta-se por variações no comprimento das porções de DNA constituídas
pelas sequências microssatélites. Nas células normais, o número de repetições de uma
determinada sequência é herdada de uma forma altamente conservativa; nas células
tumorais acredita-se que a instabilidade genética resulta de um aumento de erros de
deslizamento (slippage) ocorridos durante a replicação do DNA - uma dissociação
momentânea entre a cadeia molde e a cadeia complementar entretanto sintetizada
seguida de um re-emparelhamento incorrecto pode resultar em unidades de repetição
desemparelhadas, o que explica a ocorrência tanto da contracção como da expansão
dos microssatélites (Strand et al., 1993).
Este fenómeno foi inicialmente denominado de fenótipo RER+ (Replication Error-
Positive), sendo agora referido como MIN ou MSI (Microsatellite Instability). Apesar das
alterações no comprimento dos microssatélites serem fenotipicamente silenciosas,
podem ser um reflexo da falta de fidelidade na replicação do DNA. Assim, a
transformação oncogénica das células que apresentem MSI pode ser acelerada por
uma rápida acumulação de erros em proto-oncogenes e genes supressores tumorais
(Loeb, 1994).
Em 1993, Thibodeau e colaboradores observaram MSI pela primeira vez em
tumores associados com cacinoma colorectal hereditário não-polipótico (HNPCC). A
elevada incidência de MSI neste tipo de cancro sugeria que a predisposição para o
desenvolvimento desta patologia podia estar associada a algum tipo de instabilidade
genética, provavelmente a mutações dos genes reparadores do DNA, mais tarde
identificados como os genes MLH1 e MSH2 do sistema MMR. Após esta descoberta,
não demorou muito tempo até que surgissem dados relativos à instabilidade dos
microssatélites noutros tipos de tumores, nomeadamente cancros esporádicos, não
associados ao HNPCC ou a outro tipo de neoplasias de transmissão hereditária.
O estado de MIS em tumores é determinado facilmente, comparando após
amplificação por PCR, o comprimento de determinados microssatélites do DNA do
18
tecido tumoral com o DNA do tecido normal do mesmo indivíduo, sendo necessário que
se observem variações a nível do número de repetições e consequentemente do
comprimento do microssatélite, em cerca de 25% dos marcadores estudados. Contudo,
é exigida a devida precaução na interpretação dos resultados, visto que se pode obter
resultados desiguais se forem analisados microssatélites distintos. Além disso, podem
surgir falsos negativos nos casos em que a instabilidade dos microssatélites seja
investigada usando um reduzido número de microssatélites na totalidade do DNA
tumoral (Jacoby et al., 1995).
Os microssatélites forenses utilizados para a elaboração do perfil genético de um
indivíduo e para a sua identificação têm sido utilizados para avaliar a instabilidade
genética em vários tipos de tumores.
A elevada variabilidade destes marcadores resulta das dificuldades que eles
impõem aos processos de replicação do DNA e aos seus mecanismos de reparação,
elevando a probabilidade de ocorrência de mutações neste tipo de sequências, quando
comparado com regiões do DNA não repetitivo. A sua elevada mutabilidade possibilita a
existência de uma grande variedade de alelos para um determinado marcador numa
população. Por este motivo, os microssatélites localizados próximo ou em genes
associados a tumores têm sido utilizados para localizar esses genes e analisar
anomalias genéticas em células tumorais.
Para isso, além da MSI é também pesquisada a perda de heterozigotia ou LOH
(Loss of Heterozygosity), que é um processo definido pela mutação de um alelo seguida
da delecção do alelo normal, o que acontece quer pela delecção da porção do
cromossoma que contém esse locus, quer por mecanismos de recombinação somática,
levando à substituição do alelo normal por uma cópia duplicada do alelo mutado
(Besnard-Gu’erin et al., 1996). A LOH é uma alteração genética muito frequente que se
pode encontrar ao longo de todo o genoma da maioria das neoplasias, sendo usualmente
indicativa de instabilidade cromossómica, aneuploidia ou rearranjos cromossómicos
(Lasko et al., 1991). As regiões que apresentem LOH podem indicar a existência de
mutações em genes supressores tumorais, sendo muito importante para o prognóstico da
doença (Fearon et al., 1990 e Sidransky et al., 1997).
Em tecidos tumorais nos quais exista uma mistura de células tumorais e células
normais poderão ocorrer falsos negativos e a perda de heterozigotia só poderá ser
detectada através da análise do desequilíbrio observado entre cada um dos dois alelos
de um locus heterozigótico, denominado desequilíbrio alélico ou AI (Allelic Imbalance)
(Slebos et al., 2004). Sabe-se que a existência de desequilíbrio alélico num elevado
número de loci de um tecido eleva a probabilidade do comprometimento de diversos
19
genes responsáveis por um fenótipo neoplásico, o que poderá ter implicações a nível do
diagnóstico e do prognóstico da doença (Heaphy et al., 2007).
Se por um lado, pela perspectiva da patologia oncológica, o estudo da estabilidade
genética através de microssatélites se revela vantajoso para uma melhor compreensão
dos mecanismos genéticos associados à carcinogénese e da especificidade das
alterações ocorridas no material genético das células tumorais, por outro lado, no
contexto das ciências forenses, o estudo dos STRs neste tipo de patologias permite
aferir quanto à estabilidade destes marcadores não apenas no tecido normal, mas em
diferentes tipos de tecidos geneticamente alterados, de acordo com as características
específicas de cada processo tumoral.
Neste sentido, tem sido desenvolvida uma enorme variedade de estudos nos
últimos anos, a fim de observar como se comportam os marcadores forenses nas mais
diversas patologias neoplásicas.
Ceccardi et al. (2006) analisaram a estabilidade de 15 STRs em 68 amostras
correspondentes a três tipos de tecido tumoral distintos (cancro oral, urogenital e
gastrointestinal) e observaram alterações alélicas em 54,4% dos casos, sendo os
marcadores mais afectados os loci vWA, FGA e D18S51. O autor sugere muito cuidado
na leitura dos perfis genéticos obtidos a partir deste tipo de tecidos, especialmente na
ausência de uma amostra de tecido normal para comparação.
Edelmann et al. (2004) investigaram a LOH e a MSI em doentes com carcinoma
cervical humano e, baseados na análise de 21 amostras, concluíram que estes
fenómenos são frequentes em determinados loci e que os STRs são afectados pela
instabilidade genética, o que condiciona a aplicação dos tecidos tumorais em
procedimentos de interesse forense.
Itoh et al. (2004) concluíram num estudo relativo aos STRs TH01, TPOX e CS1PO
realizado com amostras de urina de 52 indivíduos com cancro da bexiga, que é
necessária muita precaução no processamento laboratorial deste tipo de amostras para
efeitos de identificação e que os marcadores referidos poderão ser uma ferramenta útil
no diagnóstico da neoplasia em estudo.
Poetsch et al. (2004) aconselharam a utilização de tecido tumoral apenas quando
não exista outro tipo de amostra biológica, após o estudo de 118 amostras de diferentes
tipos de tumores sólidos e 62 metástases nas quais se observou um maior número de
alterações a nível dos marcadores FGA, D3S1558, D18S51 e D21S11.
Vauhkonen et al. (2004) compararam a estabilidade dos STRs dos kits comercias
utilizados com maior frequência, em biópsias de cancro gastrointestinal e concluíram
que quando estes kits são aplicados, a obtenção de falsa heterozigotia ou homozigotia
20
compromete a tipagem genética, mesmo no que à determinação do género masculino
ou feminino diz respeito.
Peloso et al. (2003) compararam os resultados obtidos em 24 biópsias de cancro
do pulmão com amostras de tecido normal extraídas de nódulos linfáticos dos mesmos
doentes e observaram instabilidade genética na grande maioria das amostras, com
desequilíbrio alélico em todos os STRs analisados. Peloso afirma que este tipo de
amostras afecta o processo de identificação humana baseada no estudo destes
marcadores.
Pai et al. (2002) realizaram um estudo com 300 sujeitos e concluíram que as
zaragatoas bucais de indivíduos com cancro oral não podem ser empregues na
identificação genética, sendo que não existe qualquer objecção à utilização deste tipo
de amostras em indivíduos que não apresentem sintomas de outro tipo de patologia ou
lesão da cavidade bucal.
Além destes, outros investigadores tinham já comprovado a instabilidade genética
de vários microssatélites forenses que poderiam estar relacionados com as patologias
em estudo: Hoff Olsen et al. (1998) obtiveram alterações nos STRs em 19% das
amostras de carcinoma colorectal; Silva et al. (1997 e 1998) observaram instabilidade
dos microssatélites em casos de cancro gástrico; Rubocki et al. (2000) demonstraram
perda de heterozigotia do locus D13S317 em amostras de cancro da bexiga. Por outro
lado, Orlandi et al. (2002) não conseguiram obter alterações significativas quando
aplicaram este tipo de estudo ao cancro da mama.
21
1.2 - LEUCEMIAS
A leucemia é uma patologia oncológica caracterizada por uma proliferação
neoplásica ou acumulação generalizada de células hematopoiéticas, podendo haver
envolvimento do sangue periférico (Henry, 1999). Na generalidade dos casos, as células
leucémicas extravasam para o sangue, onde podem ser vistas em grande número,
podendo também infiltrar-se noutros tecidos e/ou órgãos para além da medula óssea,
como o timo, o fígado, o baço, os gânglios linfáticos, entre outros (Robbins, 1996).
As leucemias englobam um espectro de neoplasias malignas que se classificam
de acordo com o tipo de célula afectado e com o seu grau de maturação. Podem ser
designadas de leucemia mielóide - designação atribuída a um conjunto diversificado de
patologias caracterizadas por uma proliferação anormal de células progenitoras da
linhagem mielóide; e de leucemia linfóide - designação atribuída a um grupo heterogéneo
de patologias que se caracterizam por uma acumulação de células indiferenciadas da
linhagem linfóide.
Estas patologias, quando não tratadas, possuem um prognóstico muito variável
podendo apresentar um crescimento lento ou serem rapidamente fatais. Assim, de
acordo com a sua evolução sem tratamento, cada um dos tipos de leucemia
anteriormente referido pode ser denominado de crónico (normalmente associadas a
célula madura) ou agudo (constituídas por neoplasias de célula imatura), respectivamente
(Harrison, 2004).
A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) representa um grupo heterogéneo de doenças
clonais do tecido hematopoiético nas quais se verificam dois fenómenos biológicos
ligados entre si: a perda de capacidade de diferenciação/maturação das stem cells e a
produção excessiva de células imaturas não funcionais da linhagem mielóide,
denominadas mieloblastos. A acumulação destas células na medula contribui para um
défice de células sanguíneas normais (Lowenberg, 2001), daí que esta patologia seja
frequentemente acompanhada de neutropenia, anemia e trombocitopenia (Pelloso, 2003;
Ferrara, 2004).
A incidência desta doença tende a aumentar com a idade e predomina em adultos
mais velhos, sendo que mais de 50% dos casos são observados em indivíduos com
idade superior a 60 anos. Representa cerca de 15%-20% das leucemias agudas da
infância e 80% das dos adultos (Iovino et al., 2003; Rodrigues, 2003).
Relativamente ao género, é mais comum no sexo masculino do que no feminino
(Douer, 2003) apresentando um prognóstico reservado, especialmente em pacientes
idosos (Bene et al., 1999). Na última década assistiu-se a um aumento significativo da
sua incidência.
22
Ainda não é conhecida a causa responsável pela ocorrência destes eventos em
cada indivíduo, apesar de se saber que o processo subjacente à formação das células
neoplásicas poder ocorrer em qualquer uma das fases do desenvolvimento celular,
durante a hematopoiese (Lusis, 2000). Para além disso, são apenas conhecidos factores
que podem influenciar o aparecimento da doença ou a sua evolução, nomeadamente
factores genéticos e hereditários (Síndrome de Down, de Klinefelter e Patau), radiação
ionizante, exposição a substâncias químicas e fármacos ou antecedentes de doenças
hematológicas (como síndromes mielodisplásicos) (Harrison, 2004).
A classificação das leucemias mielóides agudas tem vindo a sofrer uma evolução
justificada pelo reconhecimento da importância que as características específicas de
cada subtipo de leucemia assumem na escolha da estratégia terapêutica e do
prognóstico para cada indivíduo (Farias et al., 2004). Embora a observação microscópica
das características citomorfológicas e citoquímicas representem ainda um modelo central,
a Organização Mundial de Saúde (OMS) incorporou nos seus sistemas de classificação
os critérios clínicos, citogenéticos e moleculares (Harris et al., 1999).
Segundo o sistema de classificação FAB (Franco-Américo-Britânico) (Lusis,
2000), as leucemias eram classificadas em 8 subtipos principais, M0 a M7, de acordo
com as observações citomorfológicas e citoquímicas, após um diagnóstico prévio
baseado na presença de 30% de mieloblastos ou mais na medula óssea, que
comprovava a existência de LMA (Anexo 1). Actualmente, e de acordo com o sistema de
classificação da OMS, o diagnóstico da LMA é definido pela presença de um número
inferior de blastos: 20% ou mais de mieloblastos no sangue ou na medula óssea. Além da
redução do número de blastos foram adicionadas características moleculares - estudo
das anormalidades citogenéticas; morfológicas – displasia de múltiplas linhagens; e
clínicas – historial clínico e sintomatológico apresentado pelo paciente, nomeadamente
distúrbios hematológicos anteriores (Harrison, 2004).
Um estudo pormenorizado do sangue periférico e da medula óssea podem revelar
anemia frequentemente normocítica e normocrómica, a contagem de leucócitos é de
cerca de 15000/µl, sendo que 25-40% dos pacientes apresentam contagens inferiores a
5000/µl, 20% apresentam contagens superiores a 100000/µl e menos de 5% não
apresentam células leucémicas no sangue. Relativamente às plaquetas, cerca de 75%
dos doentes apresenta contagens inferiores a 100000/µl e cerca de 25% apresenta
valores inferiores 25000/µl, podendo também ser observadas anormalidades
morfológicas e funcionais (Harrison, 2004).
As reacções citoquímicas são muito importantes numa fase inicial de diagnóstico
da LMA, sendo aplicadas técnicas de imunofenotipagem quando se pretende prosseguir
para a sua classificação em subtipos. Além da imunofenotipagem, a OMS incorpora
23
também a análise cromossómica das células leucémicas no estudo das leucemias, visto
que permite obter informações determinantes para a definição do plano terapêutico e
para o prognóstico da patologia. As alterações cromossómicas são detectadas em 55% a
75% dos pacientes diagnosticados com LMA (Lindvall et al., 2004). Muitas das alterações
cromossómicas referidas na tabela 1.2 podem estar associadas a manifestações clínicas
específicas.
Tabela 1.2 – Alterações cromossómicas na LMA
Genes Subtipo LMA % Crianças % Adultos
t(8;21)(q22;q22) AMLI-ETO M2/M1 10-15 8-12
inv(16)(p13;q22) CBFβ-MYHII M4eo 6-12 8-12
t(15;17)(q22;q21) PML-RARα M3/M3v 8-15 8-10
t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9 M5a 8-10 1-2
t(3;21)(q26;q22) AMLI-EAP/EVII - 1 <1
t(6;9)(p23;q34) DEK-CAN M1/M2 1-2 Rara
inv(3)(q21;q26) EVII - <1 1-2
t(1;22)(p13;q13) OTT-MAL M7 2 <1
Trissomia do Cr8 - - 1-4 3-5
Trissomia do Cr11 - M1/M2 - <1
Complexo - - 6 10-20
Adaptado de Silva et al., 2006
A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é o tipo de cancro mais frequente nas
crianças com idades compreendidas entre 2 e 5 anos e adultos jovens, representando
70% dos casos, sendo que nos adultos a sua incidência ronda os 20%; a partir dos 60
anos começa a verificar-se um novo aumento nos casos de LLA diagnosticados. Dentro
do grupo infantil, é atribuída uma maior frequência à raça caucasiana, com maior
prevalência no género masculino (Harrison, 2004).
Esta patologia resulta da acumulação de células linfóides indiferenciadas em
grandes quantidades, denominadas linfoblastos, na medula óssea, timo e/ou gânglios
linfáticos. Estas células podem-se encontrar em diferentes estados de maturação visto
que, apesar de manterem a sua capacidade de multiplicação, não se conseguem
diferenciar (Lorenzi, 1999).
24
A etiologia desta patologia é desconhecida tanto em crianças como em adultos;
existem contudo factores que parecem associar-se a uma maior susceptibilidade para
esta neoplasia: a LLA infantil é mais frequente em subgrupos de classe socio-económica
mais elevada; crianças com Síndrome de Down apresentam maior predisposição ao
desenvolvimento de LLA; a exposição à radiação de alta energia numa fase inicial da vida
tende a aumentar o risco de LLA de células T. Nos adultos, para além da maior
susceptibilidade atribuída a indivíduos com mais de 60 anos, sabe-se apenas que o
tabagismo e a exposição a substâncias químicas agrícolas ou industriais podem elevar a
probabilidade de contrair este tipo de leucemia (Harrison, 2004).
A classificação das leucemias linfóides agudas pelo sistema FAB baseia-se na
análise morfológica e citoquímica das células neoplásicas, tendo sido definidos 3
subtipos: L1, L2 e L3 (Anexo 2).
Actualmente, além dos critérios anteriormente mencionados são também usados
outros dados obtidos a partir da imunofenotipagem, por citometria de fluxo, e da genética
molecular, que permitem a determinação de subgrupos que dificilmente seriam possíveis
de classificar apenas com base na morfologia. Assim, de acordo com as características
imunológicas e citogenéticas, as LLA podem ainda ser divididas em LLA de células B e
LLA de células T (Farias et al., 2004).
O diagnóstico laboratorial da LLA inicia-se com a interpretação do hemograma,
que pode revelar anemia normocítica e normocrómica e trombocitopenia (Hoffbrand et al.,
1998). Poderá haver leucocitose ou leucopenia, com respectiva presença ou ausência de
blastos. A existência de uma quantidade superior a 25% de linfoblastos na medula óssea
é uma condição determinante para o diagnóstico da patologia (Lee et al., 1998).
As leucemias linfóides agudas de linhagem B podem ser classificadas com base
nos diferentes estádios de diferenciação das células precursoras B, em: LLA pró-B ou BI,
LLA comum ou BII, LLA pré-B ou BIII e LLAB madura ou BIV. Este grupo de LA é
maioritário dentro das LLA, constituindo cerca de 80% das LLA em crianças e 75% em
adultos (Cobaleda, 2009).
As leucemias linfóides agudas de linhagem T (LLA-T) podem ser classificadas
com base nos níveis de diferenciação intra-tímica em: LLA-pró T ou TI, LLA-pré T ou TII,
LLA T-cortical ou TIII e LLA T-madura ou TIV.
A análise cromossómica e genética destas patologias são elementos
fundamentais para a correcta definição do diagnóstico e para uma melhor compreensão
dos seus processos moleculares. Além de alterações numéricas (hiper e hipodiploidia)
são de destacar diversas anomalias cromossómicas estruturais:
- t(12;21)(p13;q22): esta translocação é a alteração genética mais comum em LLA-B em
crianças, estando associada a um prognóstico favorável. Como consequência desta
25
alteração estrutural, cria-se a fusão entre o gene TEL no cromossoma 12 – um membro
da família ETS de factores de transcrição e o AML-1, que codifica o complexo de factores
de transcrição AML-1/CBFB (core binding factor) localizados no cromossoma 21 (Jamil,
2000)
- t(9;22)(q34;q41): esta translocação, denominada cromossoma Philadelphia, promove a
fusão dos genes BRC-ABL (Brumpt et al., 2000) que codifica uma proteína quimérica cuja
actividade tirosina cinase origina proliferação celular, bem como inibição da apoptose.
Esta mutação encontra-se em 30% dos casos de LLA em adultos e 3-5% dos casos em
crianças (Faderl et al., 1998), sendo que a sua grande maioria está associada ao subtipo
pré-B (Cobaleda et al., 2000);
- mutação 9p21-22: os genes p15 e p16 são supressores tumorais que desempenham
um papel fulcral no ciclo celular e estão localizados na região 9p21, cuja inactivação é
causada por delecções homozigóticas. Esta mutação encontra-se em 7-13% das LLA
pediátricas, sendo normalmente associada à linhagem T (Maloney et al., 1999);
- t(4;11)(q21;23): a translocação 11q23 resulta no arranjo MLL-AF4, sendo que o gene
MLL foi identificado em leucemias de linhagem mista ou bifenotípicas (Konig et al., 2002).
Esta translocação ocorre em 60% das LLA em crianças com idade inferior a 1 ano e em
3-6% nos adultos (Faderl et al., 1998);
- t(1;19)(q23,p13): esta translocação resulta na fusão dos genes E2A do cr.19 com PBX1
no cr.1, que resulta na expressão de uma proteína oncogénica (Maloney et al., 1999). A
translocação (1;19) (q23,p13) está associada a leucemias da linhagem B, mais
precisamente em 25-30% de LLA pré-B em crianças e 5% dos adultos com LLA (Biondi et
al., 1998);
- gene do receptor de linfócitos T (TCR): em cerca de 3% dos casos de LLA de linhagem
T em crianças, ocorrem translocações que envolvem os cromossomas 1 e 14 e que
resultam na desregulação da expressão do factor de transcrição TAL-1, que codifica uma
proteína implicada na leucemogénese (Aplan, 1999).
A Leucemia Mielóide Crónica (LMC) é uma patologia mieloproliferativa
caracterizada por uma proliferação incrementada da linha granulocítica, sem que estas
células percam a capacidade de diferenciar-se, levando à expansão da série
granulocítica, representada em todos os seus estádios maturativos, na medula óssea,
sangue periférico e outros órgãos hematopoiéticos. Do ponto de vista clínico, esta
neoplasia evolui a partir de uma fase crónica relativamente benigna, passando por
estados muito agressivos, até uma fase que culmina numa crise blástica (LMC-BC)
sobreponível do ponto de vista clínico e hematológico com uma LA. Em alguns casos
estas duas fases podem intercalar-se com uma etapa de transição, denominada fase de
aceleração. A fase crónica tem uma duração que pode oscilar entre 2 e 6 anos, podendo
26
ocasionalmente prolongar-se por períodos superiores a 15 anos. A taxa de sobrevivência
após o começo da transformação é normalmente de 2 a 6 meses, enquanto que após o
diagnóstico o tempo de vida estimado poderá rondar os 5 a 7 anos (Xin-Ying Su et al.,
1999).
A taxa de incidência da LMC é de aproximadamente 1,5 por 100.000
pessoas/ano, sendo mais frequente em homens do que em mulheres e representado
cerca de 15% de todas as leucemias do adulto (Faderl et al., 1999).
Relativamente à idade, a incidência desta patologia tende a aumentar lentamente
até aos 45 anos, sendo que a partir desta idade existe um incremento significativo da
mesma (Harrison, 2004).
Quanto à sua etiologia, não foi ainda comprovada nenhuma causa determinante
para esta patologia; para além da associação com o tabagismo, cujo efeito passa por
uma aceleração da progressão da LMC para as crises blásticas. No entanto reconhece-
se que altas doses de radiação ionizante, a exposição a benzeno e certos agentes
quimioterápicos poderiam actuar como factores de risco para a manifestação da doença
Lee, 2000).
O diagnóstico da LMC é baseado na identificação de uma translocação recíproca
existente na célula leucémica, entre os cromossomas 9 e 22 - cromossoma Philadelphia
(Ph) - que está presente em 95% dos doentes. O resultado desta alteração citogenética é
a fusão sequencial do gene ABL localizado no cromossoma 9q34 com o gene BCR, que
se situa no cromossoma 22q11. (Harrison, 2004).
Além da referida alteração, pode verificar-se instabilidade ao nível de outros
cromossomas (cr.8, 9, 19, 20, 21) ou a ocorrência de determinados eventos moleculares,
como por exemplo a delecção de um ou dos dois alelos do gene TP53, observada em 20-
30% dos doentes na fase de crise blástica (Ahuja et al, 1989), a alteração do gene MYC,
o envolvimento da interleucina IL-1β ou a metilação do DNA no locus BCR/ABL, cuja
acção promove a evolução da doença para a fase blástica (Harrison, 2004).
A Leucemia Linfóide Crónica (LLC) é o tipo de leucemia mais frequente na Europa
e na América do Norte e, não sendo exclusiva, apresenta uma maior predominância em
adultos idosos: é muito rara em sujeitos com idades inferiores a 50 anos, mas após esta
idade a taxa de incidência aumenta abruptamente. A idade média para o diagnóstico é 70
anos nos homens e 74 anos nas mulheres (National Cancer Institute, 2001).
Esta patologia é mais frequente em homens do que em mulheres, sendo também
mais comum em indivíduos de raça caucasiana do que em negros ou asiáticos. Segundo
Dighiero e Hamblin, 2008, mais de três quartos dos pacientes são diagnosticados por
acaso, durante a realização de um hemograma ocasional, o que significa que a
determinação da prevalência da doença depende directamente da frequência dos
27
rastreios. Para isto contribui também o facto desta patologia possuir uma evolução clínica
muito variável, visto que se por um lado há indivíduos que morrem alguns meses após o
diagnóstico, há outros que podem viver durante mais de 20 anos (Rozman e Monserrat,
1995).
Os factores etiológicos da LLC, à semelhança dos outros tipos de leucemia, são
ainda desconhecidos; não existe ainda qualquer relação devidamente estabelecida entre
a doença e a exposição a radiação ou agentes químicos, com excepção de agricultores
expostos a herbicidas (Veterans and Agent Orange, 2002).
O diagnóstico laboratorial da LLC é estabelecido por uma linfocitose de 5x109/L
com predomínio de linfócitos de aspecto maduro e um imunofenótipo característico que
permite distingui-la de outras patologias muito semelhantes, nomeadamente linfoma de
células do manto e linfoma esplénico da zona marginal (Matutes et al., 1994). Além disso,
foram identificados marcadores celulares e moleculares (como o estado mutacional das
cadeias pesadas dos genes das imunoglobulinas) e anomalias citogenéticas que têm
elevado interesse relativamente ao prognóstico da doença (Dohner et al., 2000).
Contudo, as diferenças biológicas que possam ser encontradas não permitem
definir diferentes patologias e a LLC continua a ser definida como uma única doença,
com características muito heterogéneas (Hamblin, 2002).
O estadiamento desta patologia é feito com base nos sistemas de classificação de
Rai e Binet, de acordo com os critérios apresentados em anexo (Anexo 3). Apesar destes
sistemas fornecerem informação útil relativamente à sobrevivência dos pacientes,
apresentam maior limitação na previsão do decurso da leucemia, mais especificamente
em determinar se um indivíduo incluído num estádio inicial ou intermédio irá progredir
para a forma agressiva ou indolente da doença.
Nos últimos anos, vários estudos constataram que o estado de mutação dos
genes da região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas (IgVH) permite fazer uma
previsão evolutiva bastante precisa das complicações clínicas da LLC. Desde então, os
doentes passaram a ser classificados em “não mutados” e “mutados”, respectivamente,
com o perfil mutacional IgVH a ser considerado um elemento determinante na avaliação
de prognóstico na LLC (Kaufman, 2008). No entanto, a metodologia empregue no estudo
destas moléculas é bastante laboriosa e pouco aplicável na rotina laboratorial. Por esta
razão, começaram a ser estudados outros marcadores de prognóstico, como CD38, Zap-
70, e LPL.
Relativamente às alterações genéticas associadas a esta patologia são de
destacar as alterações cromossómicas que se traduzem em mutações, delecções e
trissomias; também podem ocorrer translocações, que muitas vezes resultam na perda
de material genético (Dicker et al., 2006). As alterações mais frequentes são:
28
- delecção no cromossoma 13q (55%), associada a bom prognóstico, com predomínio em
estádios iniciais da doença, sendo encontrada em indivíduos com genes IgVH mutados;
- trissomia 12 (16%), apesar de alguma controvérsia acredita-se que seja característica
de indivíduos não mutados, estando por isso associada a mau prognóstico. Esta
alteração aparece mais frequentemente associada a morfologia e imunofenótipo atípicos.
(Quijano, 2008)
- delecção no cromossoma 11q (18%) e no cromossoma 17p (7%), que predomina em
estádios avançados da doença e em doentes com genes IgVH não mutados e está
associada a um prognóstico muito reservado, pela falta de resposta a tratamentos
convencionais com agentes alquilantes e análogos de purina, com um período de
sobrevivência inferior a três anos (Dohner et al., 2000). Não são ainda devidamente
conhecidas as implicações moleculares resultantes das alterações genéticas referidas.
Os subtipos anteriormente caracterizados integram o grupo de leucemias mais
estudadas, devido à sua incidência e agressividade, sendo por isso escolhidos para a
realização do presente estudo. Contudo, é de referir que existem outras formas de
leucemia (como por exemplo a tricoleucemia, a leucemia/linfoma da célula T grande
granular, a leucemia prolinfocítica T ou B, entre outras) mas que devido à complexidade
do seu diagnóstico e à indisponibilidade de amostras não foram incluídas neste trabalho.
29
1.3 - OBJECTIVOS:
O principal objectivo deste trabalho é avaliar a estabilidade alélica apresentada
pelos marcadores genéticos aplicados no âmbito da medicina legal e das ciências
forenses para a identificação humana individual, em amostras de sangue de pacientes
diagnosticados com leucemia.
Como objectivos específicos, pretende-se:
- investigar a existência de perfis polialélicos, dada a coexistência de células normais e
células leucémicas;
- averiguar se existem diferenças no nível de heterozigotia de cada locus;
- averiguar diferenças nas frequências alélicas em comparação com a população normal;
- investigar a existência de uma associação entre a leucemia e determinados alelos dos
marcadores genéticos;
- avaliar a variação e a distância genética entre as duas populações;
- detectar a existência de perda de heterozigotia nas células leucémias, através do
desequilíbrio alélico revelado pela diferença das dimensões dos picos dos alelos dos loci
heterozigóticos;
- comparar a aplicabilidade da altura e da área dos picos dos alelos dos loci
heterozigóticos para determinação do desequilíbrio alélico;
- avaliar a aplicabilidade do sangue enquanto amostra para efeitos de identificação
humana através de STRs, no caso de indivíduos diagnosticados com leucemia;
- avaliar a eficácia das metodologias e dos procedimentos laboratoriais utilizados para
análise de STRs e criação de perfis genéticos em amostras de sangue leucémico.
30
II - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 - AMOSTRAS
2.1.1 – População de estudo
As amostras e os respectivos dados foram obtidos a partir do banco de material
genético do Instituto de Genética Médica da Faculdade de Medicina da Universidade de
Coimbra. Foram estudadas 63 amostras de DNA extraído do sangue periférico de
indivíduos do Centro de Portugal, com o diagnóstico de leucemia, com uma média de
idades de 48 anos e um desvio padrão de 22, numa percentagem de 49,2% de mulheres
e 50,8% de homens. De acordo com o tipo de leucemia, a população de estudo incluiu 19
amostras de leucemia mielóide aguda (30%), 10 amostras de leucemia mielóide crónica
(16%), 19 amostras de leucemia linfóide aguda (30%) e 15 amostras de leucemia linfóide
crónica (24%). O sangue foi colhido antes do início da terapêutica.
2.1.2 – População controlo
Controlo 1: Para a análise dos STRs foi usado o controlo publicado para a
população do Centro de Portugal, usando somente os perfis genéticos completos, ou
seja, com dados relativos à totalidade dos marcadores, num total de 1236 indivíduos
(Lopes et al., 2009).
Controlo 2: Para o estudo do desequilíbrio alélico foi utilizada uma população
controlo obtida a partir do banco de material genético do Instituto de Genética Médica da
Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, sendo usadas 61 amostras de DNA
extraído do sangue periférico de indivíduos do Centro de Portugal, sem nenhuma
patologia hematológica ou outra patologia diagnosticada no momento da punção venosa,
com uma média de idades de 66 anos e um desvio padrão de 12, numa percentagem de
49,2% de mulheres e 50,8 % de homens.
2.2 – METODOLOGIA
A amplificação dos loci STR usados no contexto forense foi realizada pela
aplicação do kit AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems, Foster City, EUA), de
acordo com as instruções sugeridas pelo fabricante. O kit contém os reagentes
necessários para amplificação multiplex de 15 STRs e da amelogenina, marcador usado
para determinação do género, numa única reacção de PCR. Os marcadores
31
tetranucleotídicos analisados pelo kit englobam os 15 loci exigidos pelo CODIS, para
integração no banco de dados de condenados dos Estados Unidos: CSF1PO, FGA,
TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,
D18S51, D21S11, dois loci adicionais, D2S1338 e D19S433 e a amelogenina.
Este kit baseia-se na técnica de PCR multiplex: durante a amplificação os
microssatélites são flanqueados pelos seus respectivos primers, que vão emparelhar em
cada extremidade da sequência repetitiva. Um dos primers é marcado na extremidade 5’
com um corante fluorescente, que irá permitir a detecção do produto de PCR após a
amplificação. A posição dos primers define o comprimento total do produto de PCR e
permite determinar o número de repetições que constituem o STR amplificado.
Os produtos obtidos após amplificação são separados de acordo com o seu
tamanho, através de uma electroforese capilar, de acordo com a cor exibida pelo corante,
após detecção da fluorescência emitida aquando da excitação por laser.
Simultaneamente, e em cada amostra, é aplicado um calibrador interno (GeneScan™-
500 Size Standard) marcado com um corante de cor distinta e que contém fragmentos de
DNA com tamanhos definidos, com o objectivo de calibrar os tamanhos entre cada
corrida das amostras.
Na electroforese capilar a separação dos produtos amplificados é feita num
capilar com um diâmetro interno de 50-100 µm que, devido à sua reduzida dimensão,
evita a aplicação de campos eléctricos muito elevados e abrevia o tempo da corrida de
cada amostra, eliminando os problemas de sobreaquecimento associados à alta
voltagem; além disso, o capilar pode ser manipulado com facilidade durante as injecções
automatizadas. O sistema utiliza a injecção electrocinética, na qual uma determinada
voltagem positiva é aplicada num intervalo de tempo definido, a fim de mover as
moléculas com carga negativa, da mistura para o interior do capilar. No interior do capilar
encontra-se um polímero de baixa viscosidade, que servirá de suporte físico à separação
dos fragmentos por tamanho. Estes fragmentos são marcados com fluoróforos distintos,
que emitem fluorescência máxima a diferentes comprimentos de onda. Durante a recolha
dos dados pelo equipamento, os sinais são separados por um gradiente de difracção de
acordo com os seus comprimentos de onda e são projectados na câmara CCD (Charge-
Couple Device) num padrão de espaçamento previamente definido.
O kit AmpFlSTR® Identifiler™ utiliza os fluoróforos 6-FAM™, VIC™, NED™,
PET™, LIZ™, sendo que a emissão espectral para estes fluoróforos ultrapassa os 660
nm. Os loci D8S1179, D21S11, D7S820 e CSF1PO são marcados pelo 6-FAM e
apresentam cor azul, os loci D3S1358, TH01, D13S317, D16S539 e D2S1338 são
marcados pelo VIC e apresentam cor verde, os loci D19S433, vWA, TPOX e D18S51 são
marcados pelo NED e apresentam cor amarela (expressa a preto), a amelogenina e os
32
loci D5S818 e FGA são marcados pelo PET e apresentam cor vermelha. O LIZ é usado
para marcar o calibrador interno GeneScan-500 Size Standard e apresenta cor laranja.
Os dados obtidos são registados na forma de um electroferograma multicolor e
são analisados por programas informáticos que determinam automaticamente o tamanho
dos alelos dos STRs, com base na curva padrão obtida a partir do calibrador interno. O
perfil genético é obtido por comparação entre os tamanhos dos alelos da amostra e os
tamanhos dos alelos presentes no allelic ladder, que é corrido antes das amostras e que
contém os alelos mais frequentes previamente sequenciados para todos os marcadores.
2.2.1 – Reagentes
Os reagentes do kit utilizados para a preparação da amplificação foram o
AmpFlSTR PCR® Reaction Mix, que contém cloreto de magnésio (MgCL2),
desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs) e soro de albumina bovino em tampão, com 0,05
de azida de sódio (NaN3); AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, enzima com actividade de
5U/µL e AmpFlSTR PCR® Identifiler™ Primer Set, que contém os primers para todos os
marcadores. Para configuração prévia do sistema de leitura foi ainda usado o reagente
AmpFlSTR® Identifiler™ Allelic Ladder, que contém todos os alelos mais frequentes para
os marcadores em estudo e para avaliação da metodologia experimental foi usado como
controlo negativo água mili-Q esterilizada e como controlo positivo o controlo incluído no
kit, AmpFlSTR® Control DNA 9947A, cujo perfil genético se encontra descrito no
respectivo manual.
2.2.2 – Preparação das amostras
Tendo em conta o número de amostras, fez-se uma master mix, adicionando o
correspondente a 10,5 µL de Reaction Mix, 0,5 µL de DNA Polymerase e 2,75 µL de
Primer Set por amostra. Homogeneizou-se a mistura no agitador IKA Vortex Genius3 e
pipetou-se 15µl da master mix por cada tubo de PCR, ao qual foi adicionado 10 µL de
DNA na concentração aproximada de 0,05-0.125 ng/µL, perfazendo um volume final de
25 µL em cada tubo.
A concentração do DNA das amostras foi determinada através da leitura por
espectrofotometria: diluiu-se a amostra (1:1000) em água mili-Q esterilizada num tubo
cónico de 1,5 ml (Eppendorf) e homogeneizou-se a diluição num agitador Retsch Mixer,
sendo depois transferida para uma cuvette de vidro. A concentração foi calculada a partir
do valor da absorvância lida no espectrofotómetro a um comprimento de onda de 260 nm
33
(DO260). Sempre que necessário foram realizadas diluições a fim de ajustar a
concentração de acordo com o valor exigido pelo kit.
2.2.3 – Amplificação
A amplificação do DNA foi realizada num termociclador MyCycler (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, EUA) segundo a técnica de PCR, respeitando as seguintes
condições: 1) incubação inicial, à temperatura de 95ºC, durante 11 minutos; 2)
desnaturação, à temperatura de 94ºC, durante 1 minuto; 3) emparelhamento, à
temperatura de 59ºC, durante 1 minuto; 4) extensão, à temperatura de 72ºC, durante 1
minuto (os passos 2,3 e 4 foram realizados numa sucessão de 28 ciclos); 5) extensão
final, à temperatura de 60ºC, durante 60 minutos; 6) passo final, à temperatura de 4-25ºC,
em tempo indeterminado.
Após a amplificação, preparou-se outra mix contendo 13µL de formamida, um
desnaturante que serve para evitar a formação de estruturas secundárias que possam vir
a afectar a velocidade da migração dos fragmentos durante a electroforese, e 0,5µL de
GeneScan-500 LIZ (Applied Biosystems, Foster City, EUA) por amostra. 13,5 µl desta
mistura foram de seguida pipetadas para cada poço da placa MicroAmp Optical 96-Well
Reaction Plate (Applied Biosystems, Foster City, EUA) ao qual foi adicionado 1 µL do
produto amplificado de cada amostra. Após uma breve centrifugação a 1500 rpm numa
centrífuga Orto Alusa Digicen 20-R, seguiu-se um passo de desnaturação, sujeitando as
amostras a uma temperatura de 95ºC durante 5 minutos e imediata inclusão em gelo
durante 5 minutos, para promover uma descida rápida da temperatura e efectivar a
desnaturação. Antes de iniciar o processamento das amostras no sequenciador,
procedeu-se à preparação da injecção das amostras através da programação dos
respectivos softwares.
2.2.4 – Leitura e análise da amplificação
A electroforese capilar foi realizada em capilares de 50 cm, sendo que para a
injecção das amostras para o interior do capilar foi aplicada uma voltagem de 1.5 kV
durante 15 segundos.
O polímero que serviu de suporte à electroforese foi o POP-7™, na qual foi
aplicada uma carga eléctrica de 15 kV, a uma temperatura de 60ºC. O tempo necessário
para a realização de uma electroforese completa foi de 1h por cada grupo de quatro
amostras.
34
O sequenciador utilizado para a separação dos fragmentos por electroforese
capilar e leitura dos resultados relativos à amplificação foi o Abi Prism 3130xl Genetic
Analyser (Applied Byosistems), utilizando os programas Data Collection v3.1 para
aquisição de dados e o Gene Mapper v3.7 para análise dos dados.
2.2.5 – Análise estatística
Os dados referentes aos STRs foram analisados recorrendo ao programa Arlequin
v3.11, tendo sido obtidos os parâmetros de Heterozigotia, Equilíbrio Hardy-Weinberg,
FST – distância genética entre populações, AMOVA e Teste de Diferenciação.
A Heterozigotia é um parâmetro que representa a probabilidade de dois alelos do
mesmo locus, escolhidos ao acaso na população, serem diferentes (Fernandez, 1999). A
heterozigosidade observada (para um determinado locus) define-se como o número de
indivíduos heterozigóticos observados, relativamente ao número total de indivíduos da
população (Nei, 1987).
A variabilidade genética de uma população é quantificada pela heterozigosidade
média por locus. Este valor consiste na média aritmética dos valores de heterozigosidade
dos vários loci analisados.
A diversidade genética e a sua variância podem ser calculadas através da
seguinte fórmula:
em que n é o número de cópias do gene da amostra, k é o número de alelos e p1 é a
frequência da amostra de determinado alelo i. O programa informático utilizado permite
também calcular o desvio padrão da Heterozigozidade aplicando a fórmula:
^
^
^ ^
35
O Equilíbrio Hardy-Weinberg, demonstrado em 1908 por G. H. Hardy e G.
Weinberg, fundamenta-se no princípio que enuncia que numa população em que os
cruzamentos ocorram ao acaso e na ausência de mutações, de processos de selecção
natural e de eventos migratórios, as frequências genéticas e genotípicas associadas a um
determinado locus permanecem constantes de geração em geração. As frequências
genotípicas determinam as frequências genéticas. Considerando os alelos A e a os três
genótipos possíveis são AA, Aa e aa. Sob a validade deste princípio, a frequência
conjunta de um par de alelos é o produto das frequências alélicas; assim, existe uma
relação entre as frequências genotípicas e genéticas: se numa população, num dado
momento, se verificar um excesso de homozigóticos ou heterozigóticos ocorre um
desequilíbrio. Para averiguar o equilíbrio/desequilíbrio de populações são aplicados
diversos testes estatísticos, por vezes também designados por testes de independência
(Guo & Thompson, 1992; Devlin et al, 1990; Geisser e Johnson, 1991; Devlin e Risch,
1993; Weir, 1993).
A necessidade de estimar as frequências genotípicas e genéticas que,
obviamente, dependem da verificação ou não deste princípio, contribuiu para a
implantação da amostragem e para o desenvolvimento de métodos estatísticos de
estimação na genética. Principalmente quando os genótipos são resultantes da
combinação de m alelos múltiplos (m ≠ 2), a estimação das frequências dos m(m+1)/2
genótipos possíveis, envolve fórmulas bastante extensas (Weir, 1990).
Para se detectar um desvio significativo ao equilíbrio Hardy-Weinberg é aplicado
um procedimento definido por Guo e Thompson (1992), utilizando um teste semelhante
ao teste exacto de Fisher numa tabela de contingência 2X2.
A estrutura genética das populações inferida pela análise de variância (AMOVA) é
um tipo de análise baseado na variância das frequências genéticas, tendo em
consideração o número de mutações. São definidos a priori grupos populacionais e a sua
estrutura genética é testada através da análise hierárquica de variância total em partições
dos componentes de co-variância devidas a diferenças intra-individuais, diferenças inter-
individuais e, no caso de vários grupos de populações, diferenças inter-populacionais.
No caso de uma estrutura genética hierárquica simples, a implementação do
algoritmo conduz ao índice de fixação FST que é idêntico à média ponderada de FS sobre
os loci, W, definido por Weir e Cockerham (1984).
^
36
Este FST pode ser expresso pela fórmula:
em que f0 é a probabilidade de identidade por descendência de dois genes diferentes
tirados da mesma população, f1 será a probabilidade de identidade por descendência de
dois genes diferentes tirados de duas populações diferentes, t1 é o tempo médio de
coalescência de dois genes provenientes de duas populações diferentes e t0 será o
tempo médio de coalescência de dois genes provenientes da mesma população.
Quando se testam vários grupos de populações, são calculados os índices FST,
correspondente à variância entre genótipos intra-populações, FSC, entre populações
dentro de grupos, e FCT, entre grupos. As fórmulas para estes cálculos estão descritas em
pormenor no manual do programa informático Arlequin 3.11.
A significância dos índices de fixação é testada através de uma estratégia de
permutação não-paramêtrica, descrita por Excoffier et al. (1992).
Distância genética entre populações por comparação duas a duas (FST): os FST
entre duas populações podem ser usados como distâncias genéticas entre populações,
pela aplicação de uma transformação que lineariza a distância com o tempo de
divergência entre as populações. Estes valores de FST são apresentados sob a forma de
uma matriz de distâncias.
A distribuição nula destes valores FST, sob a hipótese de inexistência de
diferenças entre as populações, é obtida por permutações de genótipos entre
populações. O valor de P do teste (P-value) é a proporção de permutações que levam a
valores de FST maiores ou iguais ao observado. Os valores de P são também fornecidos
sob a forma de uma matriz.
O teste de diferenciação entre populações, desenvolvido por Raymond e Rousset
(1995), permite testar a possibilidade de haver uma distribuição padronizada de
diferentes haplótipos ou genótipos (r) entre populações (k). Este teste é análogo ao teste
exacto de Fisher numa tabela de contingência de 2x2 transformada numa tabela de
contigência rxk. Todos os potenciais estados da tabela são explorados com base numa
cadeia de Markov, ao longo da qual é estimada a probabilidade de se observar uma
tabela com um grau de semelhança igual ou inferior à configuração da amostra sob a
hipótese nula de panmixia. Quando são usados genótipos a tabela de contigência é
construída a partir de frequências genotípicas. Tal como nos testes anteriores é feita uma
estimativa do erro do P-value reduzindo o número total de passos a um determinado
número de análises.
37
2.2.6 – Determinação do desequilíbrio alélico
A instabilidade genómica pode promover alterações cromossómicas que levem à
perda e fusão de material genético, resultando frequentemente em desequilíbrio alélico, o
que se vai reflectir num desvio da proporção normal de 1:1 relativo aos alelos paterno e
materno. Com base neste facto, Heaphy et al. (2007) sugerem uma metodologia para
poder comparar a diferença entre cada um dos alelos dos marcadores amplificados pelo
kit AmpFlSTR® Identifiler™, cujas vantagens se traduzem na utilização de uma
quantidade mínima de DNA, na economia do processo resultante da utilização de
reagentes, aparelhos e software comercializados rotineiramente e no facto de não ser
necessária a existência de tecido normal do mesmo indivíduo para comparação com o
tecido tumoral.
Os ratios alélicos foram calculados sendo comparada a diferença entre a
utilização, para este objectivo, da altura ou da área dos picos, visto que na literatura há
autores que se contradizem relativamente a este aspecto. Neste sentido é de referir
Slebos et al. (2004) que afirmam que é indiferente efectuar o cálculo através da área ou
da altura do pico, enquanto Heaphy et al. (2007) argumentam, com base nos trabalhos de
Paulson et al. (1999), Medintz et al. (2000) e Skotheim et al. (2001), que é preferível a
utilização da altura do pico para efectuar esse cálculo.
Na teoria, o ratio entre dois alelos heterozigóticos no tecido normal é 1.0.
Contudo, pode haver diferenças de eficiência durante a amplificação e oscilações
resultantes da variação de reagentes, aparelhos e manuseamento. Para evitar a
ocorrência destes factores todas as amostras foram processadas pelo mesmo
investigador, usando o mesmo lote de reagentes e a mesma instrumentação, sendo por
este motivo que se explica a impossibilidade de usar o controlo publicado; as amostras
do grupo de estudo e do grupo de controlo (controlo 2) foram analisadas em condições
exactamente iguais a fim de evitar qualquer influência de factores externos à reacção.
O ratio alélico pode ser calculado nos marcadores que apresentem heterozigotia
de diversas formas, nomeadamente através do quociente do alelo menor pelo alelo
maior, sendo o valor final expresso em percentagem, ou através do quociente do alelo
maior pelo alelo menor, o que resultará num valor sempre superior a 1.0 visto que este,
como já foi referido, é o valor do ratio teórico em tecidos normais. No presente trabalho,
por motivos de maior objectividade na leitura e análise dos resultados, foi utilizada a
última fórmula. Os cálculos foram efectuados através do programa Excell versão 2007, da
Microsoft Office.
38
III - RESULTADOS E DISCUSSÃO
As alterações genéticas que levam ao aparecimento das patologias hemato-
oncológicas ainda não se encontram completamente estudadas, sabendo-se no entanto
que a inibição da actividade dos genes supressores tumorais e a activação dos proto-
oncogenes são processos essenciais (Krsková-Honzátková et al., 2001).
Para que estes se verifiquem é determinante a ocorrência de alterações
cromossómicas e moleculares como a perda de material cromossómico, que poderá
resultar na perda de heterozigotia de alguns marcadores, duplicações e outras alterações
cromossómicas estruturais e diversos tipos de mutações, como delecções ou mutações
pontuais.
Estes eventos já foram encontrados nas leucemias, sendo reveladores da
instabilidade genómica e cromossómica que acompanha o processo de transformação
das células hematopoiéticas (Nowell, 1997; Zhang e Rowley, 2006).
As células neoplásicas manifestam um número elevado de alterações genéticas,
que a nível dos STRs se reflectem na delecção ou inserção de alelos, o que se traduz na
perda de heterozigotia (LOH) ou instabilidade dos microssatélites (MSI), respectivamente.
O presente trabalho pretendeu estudar a estabilidade dos marcadores forenses
nas leucemias. Para isso, e face às limitações impostas pela indisponibilidade do perfil
não tumoral de cada doente, procedeu-se à caracterização dos fenómenos anteriormente
referidos em DNA extraído de sangue periférico de um grupo de doentes e de um grupo
controlo – controlo 2. Recorreu-se igualmente a resultados publicados em 2009, para a
população do Centro de Portugal (Lopes et al., 2009) – controlo 1.
A instabilidade dos microssatélites foi estudada a partir da identificação de
polialelismo em um ou mais marcadores e a perda de heterozigotia foi inferida a partir de
diversas metodologias complementares: comparação da heterozigotia apresentada pelo
grupo das leucemias e pelo grupo controlo, estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg,
comparação da distribuição das frequências alélicas para cada um dos grupos, análise da
variabilidade genética entre os dois grupos e estudo do desequilíbrio alélico.
39
3.1 - Avaliação da estabilidade dos STRs pela pesquisa de polialelismo
Todas as amostras do grupo de estudo foram analisadas com sucesso, visto que
se conseguiu obter o perfil genético para a totalidade dos STRs sugeridos para estudo
(Anexo 4).
O material genético utilizado no grupo das leucemias foi obtido a partir de sangue
periférico, contendo células normais e células neoplásicas, sendo por isso de esperar
que, caso os marcadores forenses fossem afectados na sua estrutura pelas alterações
genéticas que ocorrem a nível do DNA das células leucémicas, se obtivessem perfis nos
quais se pudessem observar múltiplos alelos por locus no mesmo indivíduo, em vez de
apenas um no caso de homozigotia ou dois no caso de heterozigotia.
Deste modo, os genótipos obtidos foram analisados no sentido de averiguar a
existência de perfis com mais de dois alelos num ou mais marcadores, para tentar avaliar
até que ponto a presença do material genético de células leucémias numa amostra
poderá dificultar ou inviabilizar a interpretação do electroferograma e elaboração do
respectivo perfil genético. Um perfil com polialelismo para um ou vários marcadores
poderia ser compreendido como uma consequência da instabilidade de microssatélites.
Assim, a presença de quatro picos num determinado locus significaria a existência
de dois genótipos heterozigóticos distintos para esse mesmo marcador, correspondentes
ao DNA normal e ao DNA tumoral, podendo o tamanho dos pares de picos ser
semelhante ou diferente, em proporção com a quantidade de células normais ou
neoplásicas existentes na amostra (Fig. 3.1 – Hipótese A). A presença de três picos num
locus significaria igualmente a existência de dois genótipos distintos, podendo ser um
heterozigótico e o outro homozigótico, ou ambos heterozigóticos, mas com sobreposição
de um dos alelos (Fig. 3.1 – Hipótese B). Além disso, poderia também observar-se
polialelismo em loci de genótipos correspondentes somente a DNA tumoral, no caso de
surgirem vários alelos para o mesmo marcador apenas com origem nas células tumorais.
Nenhuma das possibilidades acima referidas foi observada nas amostras
processadas no grupo das leucemias, o que sugere que as alterações genéticas que
ocorrem nas células leucémicas não originam o fenómeno de MSI nos STRs usados
como marcadores forenses.
40
Figura 3.1 – Electroferograma exemplificativo de polialelismo e heterozigotia em três loci
distintos (D3S1358, vWA e FGA). O eixo dos XX representa o tamanho dos produtos de PCR, em
pares de bases e o eixo dos YY representa a altura dos picos, em unidades de fluorescência.
Legenda: Hipótese A – locus D3S1358 definido por 4 alelos, indicativos da existência de dois
genótipos distintos; Hipótese B – locus vWA definido por 3 alelos, indicativos da existência de dois
genótipos distintos, com sobreposição de um dos alelos; Hipótese C – locus FGA definido por 2
alelos, indicativos da existência de um ou de dois genótipos.
A instabilidade dos microssatélites em patologias hematológicas continua a ser
um tema controverso, existindo uma variedade de estudos com resultados que se
contradizem: Kodera et al. (1999) afirmam que a instabilidade dos microssatélites
contribui para o desenvolvimento das patologias linfóides mas não das mielóides;
Ohyashiki et al (1996) constataram que a instabilidade dos microssatélites varia em
diferentes tipos de leucemia, de acordo com a progressão da doença. Já Wada et al.
(1994) obtiveram uma frequência elevada de instabilidade de microssatélites na LMC,
concluindo haver uma relação com a evolução da doença. Contudo, estudos posteriores
comprovaram que essa instabilidade é pouco frequente tanto na LMC como nas
leucemias agudas; Niv et al. (2005) obtiveram dados que demonstravam instabilidade
microssatélite na LMC com muito maior incidência do que nos estudos publicados até à
data, enquanto que Praz et al. (2007) demonstraram precisamente o contrário, ou seja, a
ausência de instabilidade microssatélite naquele tipo de leucemia.
Quando se observam dois alelos num marcador, situação ilustrada na figura
anterior com a hipótese C, não se podem tirar conclusões definitivas, visto que, não
sendo conhecido o genótipo apenas do DNA normal, torna-se difícil distinguir casos em
que se verifique homozigotia do DNA normal e homozigotia do DNA tumoral, de casos
Hipótese A Hipótese B Hipótese C
41
em que se verifique homozigotia de um e heterozigotia do outro, com sobreposição de
um dos picos. Para resolução deste problema, revelou-se de extrema importância a
análise dos tamanhos dos picos, traduzidos na sua altura ou na sua área, e da proporção
de um em relação ao outro, o que resultou no estudo do desequilíbrio alélico dos
marcadores, apresentado e discutido mais adiante neste trabalho.
3.2 – Diversidade genotípica: heterozigotia dos loci e Equilíbrio de Hardy-
Weinberg
A análise da diversidade genotípica, através da heterozigotia dos loci e do
Equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi efectuada com o intuito de investigar a perda de
heterozigotia. Caso ocorresse perda de heterozigotia de algum ou de vários marcadores
forenses a nível do material genético dos indivíduos com leucemias, seria de esperar
uma diminuição no índice de heterozigotia deste grupo relativamente ao grupo controlo 1.
O teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg é geralmente utilizado para avaliar a
independência dos alelos de cada locus e permitir que as frequências genotípicas sejam
estimadas a partir das frequências alélicas. Todos os loci usados neste estudo foram
testados, com excepção da amelogenina. As frequências alélicas observadas foram
usadas para calcular a heterozigotia esperada e esta foi posteriormente comparada com
a heterozigotia observada. Uma população encontra-se em Equilíbrio de Hardy-Weinberg
para um locus que se considera estável, quando não se observam diferenças
estatisticamente significativas entre a heterozigotia observada e a heterozigotia esperada.
As tabelas 3.1 e 3.2 resumem os valores de heterozigotia esperada e observada
bem como o valor de probabilidade para o teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto
no grupo de indivíduos com leucemia como no grupo controlo 1, respectivamente.
42
Tabela 3.1 - Valores de heterozigotia esperada e observada e avaliação do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg no grupo de indivíduos com leucemia.
Loci Heterozigotia esperada Heterozigotia observada P-value
D8S1179 0.85714 0.82197 0.97646
D21S11 0.77778 0.83378 0.27050
D7S820 0.87302 0.78806 0.39523
CSF1PO 0.73016 0.70705 0.73467
D3S1358 0.76190 0.78946 0.56223
TH01 0.79365 0.78133 0.91041
D13S317 0.84127 0.78083 0.68763
D16S539 0.82540 0.78717 0.89279
D2S1338 0.85714 0.84635 0.17542
D19S433 0.79365 0.73905 0.20495
vWA 0.92063 0.82870 0.58657
TPOX 0.65079 0.68127 0.60576
D18S51 0.88889 0.87517 0.22605
D5S818 0.65079 0.70565 0.30599
FGA 0.87302 0.88470 0.58024
Média 0.80635 0.79004 -
43
Tabela 3.2 - Valores de heterozigotia esperada e observada e avaliação do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg no grupo controlo 1.
Loci Heterozigotia esperada Heterozigotia observada P-value
D8S1179 0.81311 0.81080 0.24627
D21S11 0.83414 0.83851 0.88668
D7S820 0.81472 0.80465 0.20441
CSF1PO 0.72249 0.71115 0.03535
D3S1358 0.80583 0.78844 0.35552
TH01 0.80663 0.78850 0.58706
D13S317 0.77427 0.78741 0.96293
D16S539 0.79369 0.78644 0.44665
D2S1338 0.85437 0.86377 0.04422
D19S433 0.77913 0.79074 0.15173
vWA 0.81311 0.81081 0.38707
TPOX 0.64806 0.63936 0.04416
D18S51 0.88026 0.87665 0.10381
D5S818 0.69741 0.69600 0.98190
FGA 0.85841 0.86238 0.20245
A heterozigotia é uma medida básica da diversidade genética presente num
grupo amostral. A heterozigotia média observada para os 15 marcadores STR foi
igualmente elevada na amostra de leucemias (0.80635) e no controlo 1 (0.79304),
reflectindo heterozigotias idênticas para cada marcador individualmente (os valores
oscilaram entre 0.64806 para o TPOX e 0.88889 para o D18S51).
A comparação das heterozigotias observadas com as heterozigotias esperadas e
a aplicação do teste estatístico de Fisher permitiram confirmar que ambos os grupos, o
de indivíduos com leucemia e controlo, se encontram em Equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Para os marcadores TPOX, D2S1338 e CSF1PO houve diferenças entre a heterozigotia
esperada e a heterozigotia observada (p<0,05) para o grupo controlo (Tabela 3.2) mas
que não podem ser consideradas estatisticamente significativas, visto que após a
correcção de Bonferroni para a aplicação de testes múltiplos, o valor de p passa a ser
44
significativo abaixo de 0.05/15, ou seja, 0.0033. Para os restantes marcadores não se
registaram diferenças estatisticamente significativas em nenhum dos grupos.
A comparação dos valores de heterozigotia entre as duas populações indicia que
nas células leucémicas não existem processos de perda de heterozigotia por delecções
que afectem os loci destes marcadores. Caso isso acontecesse haveria um aumento da
homozigotia de um ou da totalidade dos marcadores estudados com a consequente
diminuição da heterozigotia e seria observável um distanciamento genético relativamente
à população controlo, o que não aconteceu (demonstrado mais adiante).
Estes resultados sugerem por isso que as alterações genéticas que ocorrem a
nível da célula leucémica não se traduzem na perda de heterozigotia dos marcadores
forenses, ou que, no caso de ocorrerem nesses loci, não são detectáveis em material
genético extraído do sangue total de indivíduos com leucemia, na fase do diagnóstico da
doença, no qual poderão coexistir células neoplásicas e células normais.
3.3 – Distribuição das frequências alélicas
A distribuição das frequências alélicas do grupo das leucemias acompanhou a
variação do grupo controlo 1 para cada marcador, com algumas alterações não
estatisticamente significativas, como se pode constatar pelas figuras 3.2 a 3.16.
No locus D8S1179, que também pode ser encontrado na literatura com a
designação de D6S502, não se observaram diferenças significativas para as frequências
dos vários alelos entre o grupo das leucemias e o grupo controlo (Fig.3.2). Embora
estejam actualmente identificados quinze alelos distintos para este marcador, no gráfico
apenas se representaram os alelos para os quais se obtiveram dados em cada um dos
grupos estudados (Fig.3.2).
45
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Controlo(%) 1,214 1,092 9,304 8,495 12,581 30,987 21,602 11,934 2,508 0,202 0,081
Leucemia(%) 0,794 0,794 6,349 11,905 11,905 28,571 22,222 14,286 2,381 0,794 0
0
5
10
15
20
25
30
35F
req
uê
ncia
alé
lica
(%
)
D8S1179
Figura 3.2 – Frequências alélicas para o locus D8S1179, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
O locus D21S11 é o marcador mais polimórfico existente no kit que foi utilizado e
caracteriza-se pela extrema facilidade com que pode ser analisado através de técnicas
baseadas na separação de fragmentos de acordo com o seu comprimento. Estão já
descritos na literatura cerca de noventa alelos, incluindo os microvariantes, mas muitos
deles apresentam o mesmo comprimento e apenas se conseguem distinguir por métodos
de sequenciação (Butler, 2005).
O kit Identifiler permite identificar os alelos mais frequentes na população para
este marcador, podendo estar ou não previamente incluídos no allelic ladder. Deste
modo, além dos alelos identificados pelo kit, conseguiu identificar-se vários alelos out of
ladder que já se encontram descritos na literatura (Fig.3.3). Da totalidade dos 22 alelos
apresentados no gráfico seguinte (dos quais não constam os alelos 28.2, 36, 37 e 38 pelo
facto de, apesar de serem referidos pelo fabricante, não terem sido encontrados em
nenhum dos grupos estudados) há que referir o alelo 20, que não integrava o allelic
ladder mas que foi identificado apenas no grupo das leucemias, bem como os alelos 25.2
e 29.3, presentes em amostras do grupo controlo.
Através da análise do gráfico da figura 3.3, pode verificar-se que não existem
diferenças significativas entre as frequências alélicas dos indivíduos do grupo controlo e
as do grupo das leucemias.
46
20 24.2 25 25.2 26 27 28 29 29.2 29.3 30 30.2 31 31.2 32 32.2 33 33.2 34 34.2 35 35.2
Controlo(%) 0 0,162 0,04 0,162 0,04 2,265 14,36 22,65 0,04 0,081 24,76 3,358 6,594 12,14 1,011 8,05 0,04 3,56 0,04 0,485 0,04 0,121
Leucemia(%) 0,794 0 0 0 0 3,175 11,11 29,37 0 0 21,43 3,968 8,73 11,11 0,794 7,143 0 2,381 0 0 0 0
0
2,5
5
7,5
10
12,5
15
17,5
20
22,5
25
27,5
30
Fre
qu
uê
ncia
alé
lica
(%
)
D21S11
Figura 3.3 – Frequências alélicas para o locus D21S11, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
O locus D7S820 é um marcador constituído pela repetição de unidades simples,
para o qual tem vindo a caracterizar-se um número crescente de microvariantes, estando
já conhecidos trinta alelos distintos (Butler, 2005). Nos grupos estudados não foram
encontrados todos os alelos identificados pelo kit, motivo pelo que do gráfico seguinte
não constam os alelos 6 e 15. Por outro lado, os alelos 6.3, 7.3 e 11.1 foram encontrados
em amostras do grupo controlo e do grupo das leucemias, apesar de não estarem
descritos no manual do fabricante. A frequência dos alelos deste marcador no grupo das
leucemias é muito semelhante à dos alelos do grupo controlo (Fig. 3.4), sendo ainda de
referir o alelo 7.3, que apenas foi observado em amostras do grupo das leucemias.
47
Figura 3.4 – Frequências alélicas para o locus D7S820, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
Na análise do gráfico relativo ao locus CSF1PO pode observar-se que os alelos
que mais se destacam pela sua elevada frequência tanto no grupo controlo como no
grupo das leucemias são os alelos 10, 11 e 12 (Fig.3.5). Além disso é de referir que não
foi observado o alelo 6, que faz parte do allelic ladder, nem qualquer outro alelo menos
frequente, dos que integram a lista dos vinte alelos já descritos para este marcador.
6.3 7 7.3 8 9 10 11 11.1 12 13 14
Controlo(%) 0,081 1,416 0 14,604 12,945 27,549 23,625 0,04 15,615 3,56 0,566
Leucemia(%) 0 2,381 0,794 11,905 8,73 29,365 29,365 0 15,079 2,381 0
0
5
10
15
20
25
30
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D7S820
48
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Controlo(%) 0,081 0,485 1,901 26,578 34,547 31,068 4,693 0,607 0,04
Leucemia(%) 0 0,794 0,794 30,159 31,746 32,54 2,381 1,587 0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Fre
quência
alé
lica
(%)
CSF1PO
Figura 3.5 – Frequências alélicas para o locus CSF1PO, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
Para o locus D3S1358 foi possível identificar os alelos mais frequentes, sendo os
resultados do grupo das leucemias idênticos aos do grupo controlo (Fig. 3.6). Os alelos
11 e 20, apesar de não estarem indicados no manual e não terem sido encontrados no
grupo das leucemias, foram incluídos no gráfico da figura 3.6 pelo facto de terem sido
encontrados em amostras do grupo controlo.
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Controlo(%) 0,121 0,243 0,162 10,194 26,335 25,85 19,782 16,141 1,092 0,081
Leucemia(%) 0 0 0,794 9,524 29,365 25,397 19,048 14,286 1,587 0
0
5
10
15
20
25
30
35
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D3S1358
Figura 3.6 – Frequências alélicas para o locus D3S1358, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
49
O locus TH01, também denominado TC11 ou HUMTH01, é um dos
marcadores mais estudados de entre os quinze loci identificados pelo kit Identifiler,
estando publicados mais de 1000 estudos populacionais nos quais este marcador é
utilizado (Butler, 2005). Caracteriza-se pela predominância de um microvariante que
resulta da delecção de uma única base do alelo 10, originando o alelo 9.3 que é muito
frequente na população caucasiana, tal como atestam os resultados obtidos neste estudo
tanto para o grupo controlo como para o grupo das leucemias (Fig.3.7). Nos restantes
alelos encontrados, a variação da sua frequência nas leucemias acompanha a variação
do grupo controlo.
Figura 3.7 – Frequências alélicas para o locus TH01, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
Os alelos do locus D13S317 são constituídos por sequências que variam entre
sete a quinze unidades de repetição. Como se pode verificar pelos resultados
apresentados na figura 3.8, o alelo mais frequente é o alelo 11. Para todos os alelos os
resultados foram muito idênticos entre o grupo das leucemias e o grupo controlo. Está
descrita na literatura uma mutação encontrada em indivíduos de origem afro-americana
caracterizada pela delecção de quatro pares de bases, que apesar de não afectar
directamente o número de repetições que constituem os alelos deste marcador, podem
alterar a leitura dos mesmos, variando consoante os primers utilizados para a sua
amplificação (Drabek et al., 2004). Pelo facto dos resultados terem sido obtidos de
4 5 6 7 8 9 9.3 10
Controlo(%) 0,121 0,04 20,752 14,523 14,199 18,447 30,542 1,375
Leucemia(%) 0 0,794 18,254 19,841 8,73 18,254 33,333 0,794
0
5
10
15
20
25
30
35
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
TH01
50
amostras de indivíduos exclusivamente de populações caucasianas, este elemento não
se considerou relevante na interpretação dos dados relativos a este marcador.
Figura 3.8 – Frequências alélicas para o locus D13S317, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
No gráfico referente ao locus D16S539 estão representadas as frequências
correspondentes aos alelos mais frequentes para este marcador, não se tendo registado
diferenças significativas entre os dois grupos analisados (Fig.3.9). O alelo 5, por não ter
sido encontrado em nenhum destes grupos, não está indicado no gráfico.
8 9 10 11 12 13 14 15
Controlo(%) 12,985 6,392 5,016 31,837 26,214 13,269 4,207 0,081
Leucemia(%) 20,635 6,349 2,381 30,159 26,984 11,905 1,587 0
0
5
10
15
20
25
30
35
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)D13S317
8 9 10 11 12 13 14 15
Controlo(%) 2,508 12,743 6,311 28,6 27,71 18,204 3,6 0,324
Leucemia(%) 1,587 12,698 7,937 28,571 21,429 26,19 1,587 0
0
5
10
15
20
25
30
35
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D16S539
Figura 3.9 – Frequências alélicas para o locus D16S539, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
51
Nos resultados relativos ao locus D2S1338 pode observar-se que, pela sua
elevada frequência, se destaca o alelo 17, no qual se verifica inclusivamente valores mais
elevados para o grupo das leucemias do que para o grupo controlo, embora essa
diferença não seja estatisticamente significativa (Fig.3.10). Os restantes alelos
apresentam resultados muito semelhantes nos dois grupos. O alelo 28 não foi identificado
e por isso não se encontra representado no gráfico da figura 3.10.
Figura 3.10 – Frequências alélicas para o locus D2S1338, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
A análise do gráfico referente ao marcador D19S433 permite verificar que, dos
quinze alelos identificados, existem dois que se destacam pela sua elevada frequência:
os alelos 13 e 14 (Fig.3.11). Contudo, não se verificaram diferenças estatisticamente
significativas entre as amostras controlo e as leucémicas. De referir ainda que este
marcador foi o que se revelou mais instável na prática laboratorial, obrigando por vezes a
várias repetições no processamento de amostras pertencentes ao grupo das leucemias,
pelo facto de apresentar resultados de difícil interpretação.
13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Controlo(%) 0,04 0,162 5,34 25,93 8,131 11,003 14,604 3,155 3,236 9,992 9,102 7,686 1,497 0,121
Leucemia(%) 0 0 1,587 30,159 13,492 8,73 14,286 3,968 3,968 11,111 7,143 4,762 0,794 0
0
5
10
15
20
25
30
35
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D2S1338
52
Figura 3.11 – Frequências alélicas para o locus D19S433, no grupo controlo
e no grupo das leucemias
O marcador vWA, também designado de VWA ou vWA, não se revelou muito
informativo para o grupo das leucemias, visto que dos vinte e nove alelos conhecidos
para este marcador e dos catorze alelos indicados no allelic ladder, apenas se
identificaram sete alelos (14 a 20), como se pode ver no gráfico da figura 3.12. Contudo,
as frequências obtidas para estes alelos estão muito próximas das frequências obtidas
para o grupo controlo, havendo ligeiras oscilações sem relevância estatística.
10 11 12 12.2 13 13.2 14 14.2 15 15.2 16 16.2 17 17.2 18.2
Controlo(%) 0,162 0,93 10,558 0,081 26,416 1,092 31,472 2,387 15,494 4,409 5,178 1,335 0,324 0,081 0,081
Leucemia(%) 0 1,587 5,556 0 35,714 0 33,333 1,587 15,079 2,381 1,587 3,175 0 0 0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D19S433
53
Figura 3.12 – Frequências alélicas para o locus vWA, no grupo controlo e no grupo das
leucemias
O locus TPOX, também designado de hTPO, foi o que se revelou menos
polimórfico para o grupo das leucemias, visto que, como se pode constatar pelo gráfico
seguinte, apenas foram identificados cinco dos quinze alelos descritos para este
marcador (Fig.3.13). Este marcador caracteriza-se por uma elevada tendência para a
formação de locus tri-alélicos, resultantes da formação de artefactos ou de mutações
pontuais, o que não se verificou em nenhuma das amostras dos grupos em estudo.
Apesar do reduzido número de alelos identificados, as suas frequências são idênticas nos
dois grupos.
11 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Controlo(%) 0,04 0,202 11,246 11,772 25,283 24,595 18,325 6,917 1,497 0,121
Leucemia(%) 0 0 14,286 12,698 23,016 18,254 22,222 7,143 2,381 0
0
5
10
15
20
25
30
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
vWA
54
Figura 3.13 – Frequências alélicas para o locus TPOX, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
Ao contrário do locus TPOX, o locus D18S51 foi, de entre todos os marcadores
usados neste trabalho, o que se revelou mais informativo para o grupo das leucemias,
visto que foi possível determinar a frequência de 13 alelos distintos (Fig.3.14). Estão
actualmente identificados mais de cinquenta alelos para este marcador, dos quais cerca
de um terço são microvariantes x.2, resultantes de uma delecção de dois pares de bases
(AG) (Butler, 2005). Nos resultados obtidos para este marcador é possível verificar que o
alelo mais frequente entre os doentes é o 12, que se distancia do valor correspondente
no grupo controlo, embora sem atingir uma diferença com significado estatístico. O
mesmo se verifica nos restantes alelos, cujas frequências não se diferenciam das
frequências do grupo controlo. De referir que no gráfico da figura 3.14 não estão
indicados os alelos 7, 25, 26, e 27 porque, apesar de serem identificados pelo kit, não
foram encontrados em nenhum dos grupos analisados. O alelo 24 é o único que apesar
de não existir no grupo controlo foi identificado em amostras leucémicas, embora numa
percentagem muito reduzida.
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Controlo(%) 0,324 0,243 50,971 10,194 5,744 29,409 2,994 0,04 0,04 0,04
Leucemia(%) 0 0 46,825 14,286 7,937 27,778 3,175 0 0 0
0
10
20
30
40
50
60F
req
uê
ncia
alé
lica
(%
)
TPOX
55
Figura 3.14 – Frequências alélicas para o locus D18S51, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
O locus D5S818 é um dos marcadores que apresenta menores dimensões após
amplificação, sendo por isso muito útil na análise de amostras com material genético
muito degradado. Estão apenas descritos 15 alelos para este marcador, dos quais consta
um alelo que apesar de não ser indicado no manual do fabricante, foi encontrado numa
das amostras do grupo das leucemias, o alelo 18. O gráfico da figura 3.15 também
apresenta os resultados referentes aos restantes alelos, cujas frequências do grupo das
leucemias e do grupo controlo apresentam elevada proximidade.
9 10 10.2 11 12 13 13.2 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Controlo(%) 0,04 1,254 0,081 0,93 13,67 13,19 0,04 14,64 15,01 14,97 12,1 6,392 4,167 2,063 1,052 0,243 0,162 0
Leucemia(%) 0 1,587 0,794 0,794 18,25 14,29 0 16,67 13,49 11,11 12,7 3,175 2,381 3,968 0 0 0 0,794
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20F
req
uê
ncia
alé
lica
(%
)
D18S51
56
Figura 3.15 – Frequências alélicas para o locus D5S818, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
O locus FGA completa o grupo de marcadores mais polimórficos usados para
identificação humana, juntando-se aos loci D18S51 e D21S11 anteriormente referidos.
Também pode ser designado de FIBRA ou HUMFIBRA e diferencia-se por ser o
microssatélite com maior amplitude do número de repetições, indo desde o alelo 12.2 ao
51.2. Estão identificados cerca de 80 alelos para este marcador, muitos dos quais
referentes a microvariantes que resultam de uma mutação muito frequente, caracterizada
por uma delecção de dois pares de bases (CT) (Butler, 2005). No gráfico referente a este
marcador e à semelhança dos anteriores, não são observadas diferenças significativas
entre as frequências alélicas de cada um dos grupos, nem mesmo relativamente ao alelo
21, cuja variação é mais acentuada ou ao alelo 15, que foi identificado no grupo das
leucemias, mas com valores mínimos (Fig.3.16). Note-se ainda que, tanto no grupo
controlo como no grupo das leucemias, não foram encontrados alelos constituídos por
mais de vinte e nove unidades de repetição, não estando por isso indicados no gráfico os
alelos 30 a 51.2.
8 9 10 11 12 13 14 15 18
Controlo(%) 0,688 2,549 5,178 36,084 38,026 16,1 1,335 0,04 0
Leucemia(%) 0,794 2,381 6,349 36,508 37,302 15,079 0 0,794 0,794
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
D5S818
57
15 17 18 19 20 20.2 21 21.2 22 22.2 23 23.2 23.3 24 24.2 25 26 27 28 29
Contr.(%) 0 0,243 1,092 6,149 13,27 0,04 18,73 0,324 18,2 0,688 15,37 0,243 0,04 12,22 0,04 9,264 3,155 0,607 0,283 0,04
Leuc.(%) 0,794 0 3,968 7,937 15,08 0 12,7 0,794 15,08 0,794 16,67 0 0 13,49 0 7,143 3,175 0 2,381 0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Fre
qu
ên
cia
alé
lica
(%
)
FGA
Figura 3.16 – Frequências alélicas para o locus FGA, no grupo controlo
e no grupo das leucemias.
A amelogenina é um marcador utilizado para identificação do género e está
incluída no kit utilizado neste trabalho, não tendo sido representada graficamente. Para a
população de doentes pôde-se, contudo, verificar a existência de concordância entre os
resultados deste marcador e o registo da caracterização de cada doente.
Pela análise da generalidade dos marcadores, pode constatar-se que existe um
elevado grau de semelhança entre as frequências alélicas do grupo controlo e do grupo
das leucemias, o que comprova a elevada proximidade entre os dois grupos e
impossibilita a distinção de um do outro, estando em concordância com os resultados
obtidos no estudo da heterozigotia de cada um dos grupos.
58
3.4 – Distâncias genéticas, AMOVA e testes de diferenciação
O valor de distância genética FST entre o grupo de indivíduos com leucemia e o
grupo controlo é nulo, podendo ser considerados como o mesmo grupo amostral (o valor
de probabilidade para a distância genética é de 0.46364).
Este dado foi corroborado com o teste de AMOVA (Analysis of Molecular
Variance), no qual se avalia a partição da diversidade genética em vários níveis de
hierarquia. Neste caso, em média, está presente dentro dos grupos estudados 100% da
variação genética, sendo nulo o valor de variação entre eles. Ou seja, os dois grupos
amostrais podem ser considerados como um só. O mesmo se verifica para cada um dos
marcadores individualmente (Tabela 3.3).
Tabela 3.3 – Valores de percentagem de variação genética entre os grupos e dentro dos
grupos de indivíduos com leucemia e do controlo 1.
Loci % de variação entre
amostras % de variação dentro das
amostras
D8S1179 -0.21287 100.21287
D21S11 0.04046 99.95954
D7S820 -0.01357 100.01357
CSF1PO -0.20318 100.20318
D3S1358 -0.32591 100.32591
TH01 0.04722 99.95278
D13S317 0.07584 99.92416
D16S539 0.28715 99.71285
D2S1338 0.05424 99.94576
D19S433 0.45576 99.54424
vWA 0.02358 99.97642
TPOX -0.09288 100.09288
D18S51 -0.05519 100.05519
D5S818 -0.37439 100.37439
FGA 0.01402 99.98598
Média -0.01306 100.01306
59
O teste de diferenciação, baseado na comparação de todos os genótipos entre os
dois grupos, mostra igualmente que as duas populações não são estatisticamente
diferenciadas (p = 0.27155±0.1202).
Os dados obtidos na avaliação da distância genética são concordantes entre si e
permitem reforçar os resultados apresentados a partir da análise da heterozigotia dos loci
e do estudo das frequências alélicas dos marcadores nas amostras do grupo das
leucemias e do grupo controlo, comprovando a proximidade entre os dois grupos
estudados.
3.5 – Estudo do desequilíbrio alélico
3.5.1 – Definição dos critérios e valores-padrão
Aquando da pesquisa de polialelismo nos marcadores das amostras estudadas,
verificou-se que a interpretação de loci definidos por dois alelos poderia revelar-se
ambígua. Esta ambiguidade resultou da dificuldade em perceber até que ponto se estaria
na presença de apenas um perfil, com heterozigotia para esse marcador, ou por outro
lado, se teria havido perda de heterozigotia do DNA normal por processos subjacentes à
própria patologia, e um dos picos detectado ser proveniente do material genético mutado
existente na amostra, havendo deste modo dois genótipos distintos, correspondentes ao
DNA normal e ao DNA tumoral.
Assim, houve necessidade de analisar a diferença das dimensões (altura ou área)
dos picos correspondentes a cada um dos alelos dos loci heterozigóticos, no sentido de
identificar diferenças acentuadas (desequilíbrio alélico) reveladoras de perda de
heterozigotia.
O cálculo do valor a partir do qual se definiu o desequilíbrio alélico resultou dos
pares de alelos dos loci heterozigóticos, com os quais se calculou um ratio, através do
quociente entre a altura ou a área do alelo maior pela do alelo menor: PHR (Peak Height
Ratio) e PAR (Peak Area Ratio), respectivamente. De acordo com uma distribuição
normal, a média dos ratios adicionada de duas vezes e meia o desvio padrão permitiu
calcular o valor exacto que definiu os loci cujos alelos não estariam em equilíbrio
Os valores padrão foram definidos a partir da caracterização do grupo controlo 2,
constituído por amostras de DNA extraído do sangue periférico de indivíduos sem
nenhuma patologia hematológica ou outra patologia diagnosticada.
60
Verificou-se que os 61 perfis genéticos analisados com base nos 16 marcadores
forenses, incluindo a amelogenina, eram constituídos por 670 loci heterozigóticos e 306
loci homozigóticos.
Para a altura dos picos dos 670 alelos dos loci heterozigóticos, obteve-se uma
média de ratios de 1,23 e um desvio padrão de 0,32, sendo considerados fora do
equilíbrio os alelos cujos ratios fossem superiores a 2,038 (Fig.3.17).
Figura 3.17 – Electroferograma de uma amostra do grupo das leucemias (L2063), exemplificativo
do cálculo do ratio das alturas dos alelos dos loci heterozigóticos, através do quociente da altura
do alelo maior pelo alelo menor: A – locus D16S539, em equilíbrio alélico; B – locus D2S1338, em
desequilíbrio alélico. O eixo dos XX representa o tamanho dos produtos de PCR, em pares de
bases e o eixo dos YY representa a altura dos picos, em unidades de fluorescência.
Para a área dos picos dos 670 alelos dos loci heterozigóticos, obteve-se uma
média de ratios de 1,21 e um desvio padrão de 0,25, sendo considerados fora do
equilíbrio os alelos cujos ratios fossem superiores a 1,852 (Fig.3.18).
A
B
2,53
1,15
61
Figura 3.18 – Electroferograma de uma amostra do grupo controlo (C4517), exemplificativo do
cálculo do ratio das áreas dos alelos dos loci heterozigóticos, através do quociente da área do
alelo maior pelo alelo menor: A – locus D21S11, em equilíbrio alélico; B – locus D7S820, em
desequilíbrio alélico. O eixo dos XX representa o tamanho dos produtos de PCR, em pares de
bases e o eixo dos YY representa a altura dos picos, em unidades de fluorescência.
3.5.2 – Análise global
No grupo das leucemias, foram analisados os alelos respeitantes aos 16
marcadores para cada uma das 63 amostras em estudo, que na sua totalidade se
verificou serem constituídas por 786 loci heterozigóticos e 222 loci homozigóticos. A
quantidade de alelos em desequilíbrio alélico foi obtida com base nos valores-padrão
calculados a partir do grupo controlo (2,038 para a altura e 1,852 para a área).
Pela avaliação da altura dos picos (PHR) (Anexo 5), observou-se que nas 61
amostras do grupo controlo existiam 20 loci em desequilíbrio alélico (PHR>2,038) (Figura
3.19), o que representa uma média de aproximadamente 0,33 loci em desequilíbrio por
amostra. No que respeita ao grupo de estudo, essa média foi de 0,29 visto que em 63
amostras de DNA de pacientes com leucemia se observaram 18 loci em desequilíbrio
alélico (Figura 3.20).
2,05 1,28
A
B
62
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 100 200 300 400 500 600 700
Ra
tio
da
s a
ltu
ras d
os p
ico
s d
os a
lelo
s h
ete
rozig
ótico
s
Nº de loci heterozigóticos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Ratio
da
s a
ltu
ras d
os p
ico
s d
os a
lelo
s h
ete
rozig
ótico
s
Nº de loci heterozigóticos
Figura 3.19 – Dispersão dos ratios das alturas dos picos dos alelos dos loci
heterozigóticos do grupo controlo 2.
Figura 3.20 – Dispersão dos ratios das alturas dos alelos dos loci heterozigóticos
do grupo das leucemias.
63
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 100 200 300 400 500 600 700
Ratio
da
s á
rea
s d
os p
ico
s d
os a
lelo
s h
ete
rozig
ótico
s
Nº de loci heterozigóticos
Comparando os resultados obtidos nos dois grupos relativamente à altura dos
picos (Tabela 3.4), verifica-se que não existe uma diferença estatisticamente significativa
(p=0,26).
Tabela 3.4 – Resultados do estudo do desequilíbrio alélico através do PHR
nas duas populações
De acordo com os cálculos efectuados com base na área dos picos (PAR)
correspondentes a cada um dos alelos dos loci heterozigóticos (Anexo 6), pôde observar-
se que em 61 amostras do grupo controlo existiam 21 loci que apresentavam um ratio
superior ao valor limite de 1,852 (Fig. 3.21), representando uma média de 0,34 loci em
desequilíbrio por amostra. Relativamente ao grupo das leucemias, observaram-se 24 loci
em desequilíbrio nas 63 amostras estudadas (Fig. 3.22), o que resulta numa média de
0,38 loci em desequilíbrio alélico por amostra
ALTURA Nº de loci
heterozigóticos
Nº de loci
em desequilíbrio alélico Totais
Controlo n=61
786 18 804
Leucemia n=63
670 20 690
Totais 1456 30 1494
Figura 3.21 – Dispersão das áreas dos ratios dos alelos dos loci heterozigóticos
do grupo controlo 2.
64
Comparando os resultados obtidos nos dois grupos relativamente à área dos
picos (Tabela 3.5), pode verificar-se que não existe uma diferença estatisticamente
significativa (p=0.53)
Tabela 3.5 – Resultados do estudo do desequilíbrio alélico através do PAR
nas duas populações.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Ra
tio
da
s á
rea
s d
os p
ico
s d
os a
lelo
s h
ete
rozig
ótico
s
Nº de loci heterozigóticos
ÀREA Nº de loci
heterozigóticos
Nº de loci
em desequilíbrio alélico Totais
Controlo n=61
786 24 809
Leucemia n=63
670 21 691
Totais 1456 44 1500
Figura 3.22 – Dispersão das áreas dos ratios dos alelos dos loci heterozigóticos
do grupo das leucemias.
65
Partindo para uma análise geral por amostra, no grupo controlo e no grupo
leucemias pode observar-se que apenas apresentavam loci em desequilíbrio cerca de um
quinto das amostras estudadas (cerca 80% das amostras do grupo controlo e do grupo
das leucemias não apresentaram loci em desequilíbrio alélico para nenhum dos critérios
analisados), das quais mais de metade se caracterizavam pela existência de apenas um
locus em desequilíbrio (Tabela 3.6). Comparativamente, e em concordância com os
resultados obtidos na análise alélica, não se registaram diferenças significativas entre o
grupo controlo e o grupo das leucemias relativamente à aplicação da altura ou da área
para realização dos cálculos.
Tabela 3.6 – Resultados do estudo do desequilíbrio alélico por amostra.
Relativamente à metodologia sugerida por Heaphy et al. (2007), ficou comprovada
a sua eficácia na determinação do desequilíbrio alélico, bem como as vantagens
apontadas pelo autor. Destaca-se a vantagem mais significativa e que justifica a
aplicação da técnica neste estudo: a dispensabilidade da utilização de material genético
não neoplásico do mesmo indivíduo, para controlo. Além desta, é importante referir ainda
a reduzida quantidade de DNA utilizado bem como a rapidez e facilidade de execução de
toda a metodologia, usando recursos técnicos de rotina num laboratório de biologia
molecular.
Número total de amostras
Amostras sem desequilíbrio
alélico
Amostras com desequilíbrio alélico
Em 1 locus
Em 2 loci
Em mais de 2 loci
Total
PHR*
Controlo 61 51 (83,6%) 5 (8,2%) 3 (4,9%) 2 (3,3%) 10 (16,4%)
PHR
Leucemia 63 52 (82,5%) 9 (14,3%) 0 (0%) 2 (3,2%) 11 (17,5%)
PAR**
Controlo 61 50 (82%) 7 (11,5%) 1 (1,6%) 3 (4,9%) 11 (18%)
PAR
Leucemia 63 47 (74,6%) 12 (19%) 1 (1,6%) 3 (4,8%) 16 (25,4%)
* PHR – Peak Height Ratio; ** PAR – Peak Area Ratio
66
Os dados apresentados por este autor para as leucemias, num estudo aplicado a
diversos tipos de tumores, diferem significativamente dos resultados aqui apresentados.
No estudo de Heaphy et al. (2007) mais de 70% das amostras apresentavam
desequilíbrio alélico em mais de dois loci. Contudo, esses resultados deverão ser
interpretados com a devida precaução, visto que o grupo de estudo relativo às leucemias
era constituído apenas por 10 amostras, sendo a sua representatividade discutível.
De referir que a heterogeneidade do tecido tumoral, mais precisamente a
quantidade de células tumorais existentes nas amostras relativamente à quantidade de
células normais, deve ser tida em consideração aquando da interpretação dos resultados
relativos à determinação do desequilíbrio alélico, visto que uma elevada predominância
de células normais pode enviesar os ratios calculados para os alelos heterozigóticos e
gerar falsos negativos.
Ao contrário do que acontece com tumores sólidos, nas leucemias a questão da
representatividade da amostra relativamente à totalidade do tecido tumoral não será
muito expressiva, pelo facto de as células se encontrarem em suspensão no fluxo
sanguíneo e estarem igualmente representadas na amostra. Deve, contudo, ser tido em
consideração o facto de se estar a aplicar uma metodologia e reagentes cujas
características se encontram direccionadas para o estudo de amostras forenses. Este
tipo de amostras possui características muito específicas, sendo muitas vezes recolhidas
após exposição a condições adversas de preservação. Além disso, a quantidade de
material genético que se consegue extrair deste tipo de amostras é geralmente muito
reduzido. É por isso necessário algum sentido crítico aquando da interpretação dos
resultados obtidos a partir de amostras clínicas, bem como da generalização das
conclusões a todo um tecido ou órgão, ou mesmo à patologia em estudo.
67
3.5.3 – Análise do comportamento dos loci
Para cada um dos critérios utilizados no estudo do desequilíbrio alélico (PHR e
PAR) avaliou-se o comportamento individual de cada locus (Tabela 3.7).
Tabela 3.7 – Quantificação dos loci em desequilíbrio alélico de acordo com o
grupo de estudo e o critério aplicado.
PHR PAR
PHR + PAR
Marcadores Controlo Leucemia Controlo Leucemia Controlo Leucemia
D8S1179 1 1 0 1 1 1
D21S11 1 1 1 0 1 1
D7S820 2 0 2 1 2 1
CSF1PO 1 2 1 2 1 3
D3S1358 1 2 1 1 2 3
TH01 1 1 2 1 2 1
D13S317 1 4 1 6 2 6
D16S539 1 0 1 2 1 2
D2S1338 0 2 1 3 1 3
D19S433 0 0 0 0 0 0
vWA 2 3 2 2 3 3
TPOX 2 1 0 1 2 1
D18S51 2 0 1 1 2 1
Amelogenina 3 1 3 2 4 2
D5S818 0 0 1 1 1 1
FGA 2 0 4 0 4 0
Total 20 18 21 24 29 29
* PHR – Peak Height Ratio; ** PAR – Peak Area Ratio
68
Através da análise da tabela 3.7 pode constatar-se que a generalidade dos STRs
se apresentava em desequilíbrio alélico em pelo menos uma amostra, sendo que:
- os loci D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D2S1338,
D18S51, D5S818, vWA e a Amelogenina não apresentaram diferenças significativas
(nunca superiores a uma amostra) quando comparados os dois grupos de estudo e os
dois critérios utilizados;
- os loci CSF1PO e D19S433 foram os únicos marcadores nos quais não se
verificaram diferenças entre o grupo controlo e o grupo das leucemias e houve
concordância entre os critérios PHR e PAR;
- o locus D13S317 apresentou maior desequilíbrio em amostras do grupo das
leucemias relativamente ao grupo controlo, tanto aquando da aplicação dos cálculos
relativos à altura como à área dos picos, sendo estes dados concordantes entre si;
- o locus D16S539 apresentou maior desequilíbrio quando os cálculos foram
efectuados recorrendo ao quociente das áreas no grupo das leucemias, apesar da
diferença não se considerar significativa; no grupo controlo, os valores foram iguais para
os dois critérios;
- os locus D19S433 foi o único marcador que não apresentou desequilíbrio em
nenhuma amostra, para nenhum dos critérios;
- o locus D5S818 não apresentou desequilíbrio em nenhuma amostra quando foi
aplicado o critério da altura dos picos, o que não aconteceu quando se aplicou o critério
da área dos picos, apesar das diferenças não se considerarem estatisticamente
significativas;
- o locus FGA não se apresentou em desequilíbrio em nenhuma das amostras do
grupo das leucemias, sendo que no grupo controlo as amostras em desequilíbrio foram o
dobro aquando da aplicação do quociente das áreas dos picos face ao quociente das
alturas.
Pela análise destes resultados pode concluir-se que existem ligeiras discrepâncias
entre os grupos estudados e entre os dois critérios aplicados, que na sua totalidade
nunca ultrapassaram um número máximo de duas amostras. Contudo, tendo em conta o
número total de amostras do grupo controlo e do grupo de doentes, essas diferenças não
são relevantes a ponto de permitirem destacar qualquer um dos marcadores, quer por
excesso quer por defeito de alelos em desequilíbrio por amostra. Seria, no entanto,
desejável a confirmação dos resultados obtidos para o locus D13S317 através de um
controlo de DNA normal, visto que é o marcador que apresenta uma discrepância mais
acentuada entre os valores obtidos para cada população.
69
Verifica-se que existe uma homogeneidade no comportamento destes
marcadores, estando o desequilíbrio alélico dos alelos heterozigóticos igualmente
distribuído por cada locus.
Os resultados publicados por outros autores em estudos aplicados a diversos
tipos de neoplasias apresentam igualmente um comprometimento da generalidade dos
marcadores estudados, sendo que, contrariamente aos resultados aqui apresentados,
foram registadas diferenças significativas relativamente ao grupo controlo: Ceccardi et
al. (2006) observaram alterações alélicas em 54,4% dos casos de tumores orais,
urogenitais e gastrointestinais, sendo os marcadores mais afectados o vWA, o FGA e o
D18S51; Edelmann et al. (2004) obtiveram resultados para o carcinoma cervical
humano nos quais todos os loci apresentavam LOH ou MSI em cerca de 40% dos casos
analisados; num estudo efectuado em diferentes tipos de tumores sólidos realizado por
Poetsch et al. (2004) observou-se que todos os STRs eram afectados, sendo os
marcadores FGA, D3S1558, D18S51 e D21S11 os que apresentavam um maior número
de alterações alélicas; os resultados obtidos por Peloso et al. (2003) para o cancro do
pulmão evidenciaram instabilidade genética na maioria das amostras, com desequilíbrio
alélico em todos os STRs analisados, com maior incidência nos loci D3S1558, D5S818,
D13S317 e D18S51; Vauhkonen et al. (2004) analisaram amostras de cancro
gastrointestinal e observaram que os marcadores forenses eram estáveis em apenas
32% das amostras, com perda de heterozigotia para todos os loci, com maior frequência
para o D18S51.
3.5.4 – Análise das amostras com loci em desequilíbrio alélico
O número total de amostras com loci em desequilíbrio alélico foi idêntico nos dois
grupos, considerando a presença de pelo menos um critério (PAR ou PHR): 15 amostras
(24,6%) no grupo controlo (n=61) e 16 amostras (25,4%) no grupo das leucemias (n=63)
(Tabelas 3.8 e 3.9, respectivamente).
No grupo controlo, 40% dessas amostras apresentaram marcadores em
desequilíbrio alélico nos dois critérios em simultâneo, variando de 1 a 5 marcadores por
amostra. Na mesma amostra, os dois critérios identificaram um número semelhante de
loci em desequilíbrio alélico, com uma diferença nunca superior a um locus. Além da
quantidade, também os próprios marcadores considerados em desequilíbrio alélico se
mantiveram estáveis em cada amostra, visto que nunca se observou, por exemplo, a
totalidade dos marcadores alterada aquando da variação entre os dois critérios numa
mesma amostra.
70
Ainda no grupo controlo, 27% das amostras apresentaram um marcador em
desequilíbrio exclusivamente para o critério da altura dos picos dos alelos heterozigóticos
e 33% das amostras apresentaram um marcador em desequilíbrio exclusivamente para o
critério da área dos picos dos alelos heterozigóticos. Será importante notar que em todas
as amostras em que a existência de desequilíbrio não se observou em simultâneo nos
dois critérios, o número de loci afectados é sempre unitário (Tabela 3.8).
Tabela 3.8 – Análise dos loci em desequilíbrio alélico em cada amostra do grupo
controlo, para os dois critérios utilizados.
Amostra
PHR* PAR**
Total Concordância
PHR/PAR Nº de loci em
desequilíbrio
alélico
Loci em
desequilíbrio
alélico
Nº de loci em
desequilíbrio
alélico
Loci em
desequilíbrio
alélico
C4049 1 Amelogenina 1 Amelogenina 1 100%
C4512 2 D21S11,
TPOX 1 D21S11 2 50%
C4514 5
D7S820,
vWA, TPOX,
D18S51, FGA
4
D7S820,
D18S51,
vWA, FGA
5 80%
C4516 2 D8S1179,
D16S539 3
TH01,
D16S539,
Amelogenina
4 25%
C4517 4
D7S820,
TH01, vWA,
FGA
5
D7S820,
TH01,
D2S1338,
D5S818, FGA
6 50%
C4280 2 CSF1PO,
Amelogenina 2
CSF1PO,
Amelogenina 2 100%
C4045 1 D18S51 - - 1 0%
C4322 1 Amelogenina - - 1 0%
C4324 1 D13S317 - - 1 0%
C4564 1 D3S1358 - - 1 0%
C3852 - - 1 FGA 1 0%
C4048 - - 1 vWA 1 0%
C4466 - - 1 D13S317 1 0%
C4489 - - 1 FGA 1 0%
C4563 - - 1 D3S1358 1 0%
Total 20 - 21 - 29 -
* PHR – Peak Height Ratio; ** PAR – Peak Area Ratio
71
No que diz respeito à comparação entre os critérios PHR e PAR pode verificar-se
que não existe uma concordância total, visto que nas 6 amostras em que se observaram
loci em desequilíbrio para ambos os critérios apenas 2 (33%) apresentaram uma
concordância de 100%, sendo que 3 (50%) apresentaram uma concordância igual ou
superior a 50% e 1 (17%) apresentaram uma concordância de 25%. Contudo, de um
modo global, houve concordância total entre os dois critérios em 48 amostras (79%) das
61 amostras do grupo controlo – 46 amostras sem desequilíbrio alélico e 2 amostras com
desequilíbrio alélico.
Relativamente ao grupo das leucemias, das amostras com loci em desequilíbrio
alélico, 69% apresentaram marcadores em desequilíbrio alélico nos dois critérios em
simultâneo, numa quantidade variável de 1 a 5 marcadores por amostra. Dentro desta
percentagem, é de referir que mais de 70% corresponde a amostras que apresentaram
exactamente o mesmo número e o mesmo tipo de marcador em cada um dos critérios
(Tabela 3.9).
Pela análise dos dados expostos na tabela anterior pode-se ainda constatar que
31% das amostras apresentaram apenas um marcador em desequilíbrio exclusivamente
para o critério da área dos picos dos alelos, sendo que não existiu nenhuma amostra que
apresentasse desequilíbrio alélico baseado somente no critério da altura dos picos dos
alelos.
72
Tabela 3.9 – Análise dos loci em desequilíbrio alélico em cada amostra do grupo das
leucemias, para os dois critérios utilizados.
Amostra
PHR PAR
Total Concordância
PHR/PAR
Nº de loci em
desequilíbrio
alélico
Loci em
desequilíbrio
alélico
Nº de loci em
desequilíbrio
alélico
Loci em
desequilíbrio
alélico
L1048 1 TPOX 1 TPOX 1 100%
L1082 1 vWA 1 vWA 1 100%
L1095 1 D13S317 1 D13S317 1 100%
L1121 1 D13S317 3
D13S317,
CSF1PO,
D16S539
3 33%
L2048 1 vWA 1 vWA 1 100%
L2054 1 D13S317 1 D13S317 1 100%
L2057 4
D2S1338,
CSF1PO,
D3S1358,
TH01
4
D2S1338,
CSF1PO,
D3S1358,
TH01
4 100%
L2060 5
D21S11,
D13S317,
CSF1PO,
vWA,
Amelogenina
2 D3S1358,
Amelogenina 5 40%
L2062 1 D3S1358 3
D16S539,
D18S51,
D5S818
4 0%
L2063 1 D2S1338 1 D2S1338 1 100%
L2050 1 D8S1179 1 D8S1179 1 100%
L1080 - - 1 D2S1338 1 0%
L1137 - - 1 D13S317 1 0%
L1764 - - 1 Amelogenina 1 0%
L2054 - - 1 D13S317 1 0%
L2066 - - 1 D7S820 1 0%
Total 18 - 24 - 28 -
* PHR – Peak Height Ratio; ** PAR – Peak Area Ratio
73
No que concerne à comparação entre os critérios aplicados pode verificar-se que
a concordância, não sendo total, é mais significativa no grupo das leucemias do que no
grupo controlo, visto que naquele grupo, das 11 amostras em que se observaram loci em
desequilíbrio para ambos os critérios, 8 (73%) apresentaram uma concordância de 100%
e apenas 2 (18%) apresentaram uma concordância inferior a 50%, havendo 1 amostra
(9%) cuja concordância foi nula. Na globalidade, houve no grupo dos doentes uma
concordância total entre os dois critérios em 55 amostras (87%) das 63 amostras do
grupo controlo – 47 amostras sem desequilíbrio alélico e 8 amostras com desequilíbrio
alélico.
Tanto no grupo das leucemias como no grupo controlo, pode verificar-se que
existe um predomínio de amostras nas quais apenas um locus apresenta desequilíbrio
alélico, independentemente do critério utilizado. Além disso, pode encontrar-se tanto num
grupo como no outro, amostras com um número superior a dois loci em desequilíbrio
alélico. Estes dados não são concordantes com os resultados publicados por Heaphy et
al. (2007) para diversos tumores visto que, usando a mesma metodologia para
determinação do AI, verificou que os tecidos tumorais apresentavam um maior número de
loci em desequilíbrio alélico do que os tecidos normais, sendo que 99% das amostras nas
quais se observou desequilíbrio alélico para 2 ou mais loci eram de tecido tumoral.
Os dados obtidos para cada um dos critérios, tanto no grupo controlo como no
grupo das leucemias, sugerem que a aplicação da altura ou da área para a determinação
do desequilíbrio entre alelos heterozigóticos de um determinado locus não permite obter
resultados totalmente concordantes, não se podendo argumentar a preferência da
utilização de um em detrimento do outro.
Estes resultados vêm contradizer os estudos de alguns autores, como os de
Paulson et al. (1999), Medintz et al. (2000), Heaphy et al. (2007), entre outros, nos quais
se afirma que, empiricamente, parece ser preferível a utilização da altura em vez da área
para o cálculo dos ratios quando se pretende proceder à determinação do desequilíbrio
alélico.
O desequilíbrio alélico encontrado apenas em alguns loci não se revela
significativo, devido à seu reduzida representatividade na dimensão geral do grupo
amostral e poderá ser explicado por diversos factores, nomeadamente pela amplificação
preferencial de alguns alelos, uma vez que se sabe, por exemplo, que existem alelos
constituídos por um menor número de repetições que são geralmente amplificados em
maior quantidade do que os de maior comprimento. Além disso, esta ocorrência também
poderá ser facilmente explicada por variações decorrentes da própria reacção de
amplificação, de pequenas oscilações na leitura automatizada dos resultados ou de
imprecisões técnicas durante a preparação e manuseamento das amostras.
74
A perda de heterozigotia encontra-se descrita numa elevada percentagem de
determinados marcadores, escolhidos de acordo com a sua proximidade com regiões
específicas dos cromossomas nas quais são conhecidas mutações características das
leucemias ou se localizam genes supressores tumorais, como por exemplo a região
telomérica 11p15 (Krsková-Honzátková et al., 2001). Contudo, essa perda de
heterozigotia raramente se caracterizou pela perda total de um alelo.
Na maioria dos trabalhos publicados, os marcadores estudados foram escolhidos
para investigar loci nos quais se localizam genes supressores tumorais que se sabe
estarem relacionados com tumores sólidos (Wada et al. 1994; Silly et al. 1994), Noutros
tipos de estudos, em que os marcadores foram escolhidos aleatoriamente, a frequência
da perda de heterozigotia foi inferior (Cavé et al. 1996). A perda de heterozigotia permite
assinalar a localização de genes supressores tumorais e traduz a instabilidade
cromossómica de um tumor, mas contrariamente ao que acontece com os tumores
sólidos, a relevância deste fenómeno na patologia hematológica ainda não está
devidamente estabelecida.
Uma das justificações que poderá explicar a inexistência de diferenças entre o
grupo das leucemias e o grupo controlo, bem como relativamente aos resultados obtidos
para outro tipo de neoplasias é o facto de se saber que existem marcadores localizados
em determinados loci cujo comportamento difere consoante o tipo de tecido, e que são
instáveis em tumores sólidos mas que não o são em patologias hematológicas (Niv et al
(2005). À semelhança desses loci, o mesmo parece acontecer com os marcadores
usados para identificação humana, nos quais não parece haver alterações nem qualquer
contributo para a patogenicidade da leucemia.
Além disso, é importante não esquecer que os marcadores forenses utilizados
actualmente são escolhidos de acordo com características específicas que permitem a
sua utilização para efeitos de identificação humana, estando à partida dissociados de
qualquer patologia. Estes marcadores são constituídos por repetições tetranucleotídicas e
como tal apresentam maior estabilidade do que os marcadores di ou trinculeotídicos que
têm sido aplicados no estudo da estabilidade genómica de outras neoplasias.
Não estão publicados até ao momento trabalhos para as leucemias nos quais se
tenha utilizado a totalidade dos marcadores forenses usados neste trabalho, havendo
apenas referência a alguns marcadores. Por exemplo, os marcadores TPOX e TH01
foram incluídos num painel analisado por Ribeiro et al. (2002) em LMC, LLA e LMA, não
se tendo observado qualquer tipo de instabilidade para estes marcadores. Num trabalho
de Boyer et al. (1998) utilizaram-se catorze marcadores, nos quais se incluía o vWA, e
para o qual não se observou MSI nem LOH, tendo-se concluído que a instabilidade
genómica não seria determinante para a progressão das neoplasias mielóides. Gradiz
75
(2007), num estudo aplicado a linfomas e leucemias, no qual usou como controlo
amostras de progenitores, obteve resultados com os quais concluiu não haver
impossibilidade de identificação individual a partir da aplicação dos marcadores forenses
nessas patologias.
Actualmente, na genética forense, as únicas alterações que podem conduzir à
criação de um perfil genético incorrecto são a perda total de alelos ou a ocorrência de
novos alelos no tecido tumoral relativamente ao tecido normal. Os resultados obtidos
para as leucemias, apesar de não serem peremptórios na negação destes eventos,
permitem caracterizar geneticamente o grupo de indivíduos diagnosticados com a
patologia e comprovar a sua semelhança com o grupo de indivíduos saudáveis, bem
como constatar que os marcadores forenses são estáveis na presença de células
leucémicas.
76
IV – CONCLUSÕES
O presente trabalho sugere que, no contexto da Medicina Legal e das Ciências
Forenses, a utilização de sangue periférico de indivíduos diagnosticados com leucemia
não condiciona a identificação humana realizada através da elaboração de perfis
genéticos.
Os resultados obtidos questionam os dados publicados por vários autores acerca
da fiabilidade da aplicação de marcadores forenses no âmbito da patologia oncológica,
no qual é sempre sugerida muita precaução na interpretação dos resultados obtidos a
partir de amostras clínicas provenientes de biópsias de diferentes tipos de tecidos
tumorais. É também referido na maioria das publicações que este tipo de amostras deve
ser utilizado apenas em casos muito específicos, nos quais não exista ou não seja
possível a utilização de amostras obtidas a partir de tecidos normais.
Neste estudo, todos os perfis genéticos foram determinados com êxito, não sendo
observadas dificuldades resultantes da natureza da amostra. Não se observaram perfis
com mais do que dois alelos por marcador, o que pode indiciar que, pelo facto do material
genético ter sido extraído de sangue contendo células normais e células tumorais, as
alterações genéticas não se traduzem na instabilidade dos microssatélites dos loci
analisados neste trabalho, a nível das células leucémicas.
O estudo realizado forneceu dados que não revelam diferenças significativas
relativamente à diversidade genotípica na população controlo e na população leucémica,
de acordo com a heterozigotia dos loci analisados, estando as duas populações em
equilíbrio de Hardy-Weinberg. Também não se registaram diferenças em relação às
frequências alélicas dos dois grupos analisados.
Além disso, a aplicação de diversos testes estatísticos permitiu revelar a
inexistência de diferenciação genética entre as duas populações, sendo que a
comparação da totalidade dos genótipos demonstrou igualmente que as duas populações
não são estatisticamente diferenciadas
A perda de heterozigotia, investigada através do estudo do desequilíbrio alélico,
foi observada numa percentagem irrelevante de amostras, permitindo concluir que a
quantidade de alelos em desequilíbrio por amostra não difere significativamente entre a
população leucémica e a população controlo, não se encontrando evidências do
fenómeno de perda de heterozigotia na patologia estudada. Ficou também demonstrado
que a aplicação da altura ou da área dos picos no estudo do desequilíbrio alélico não
permite obter resultados plenamente concordantes. Não se pode por isso considerar
nenhum dos critérios preferencial.
77
Em conclusão, a concordância dos resultados obtidos neste trabalho através de
diferentes métodos de análise das amostras indiciam que o sangue de um indivíduo
leucémico pode ser usado para efeitos de identificação humana e que os marcadores
forenses que integram o kit AmplSTR®Identifiler são estáveis nas células do sangue
leucémico.
Além disso, as metodologias e os procedimentos laboratoriais utilizados na
análise de STRs e na elaboração de perfis genéticos revelaram-se totalmente adequados
e eficazes quando aplicados em material genético extraído das células existentes neste
tipo de amostras.
O contributo dos dados disponibilizados por este trabalho poderá revestir-se de
extrema utilidade no contexto da Medicina Legal, pela sua aplicação em casos muito
concretos que envolvam indivíduos com leucemia e cujo diagnóstico seja ou não
conhecido. Disso constituem exemplo estudos de paternidade em que o pretenso pai
tenha falecido e apenas se possa recorrer a amostras clínicas com as características das
que foram presentemente utilizadas, situações em que seja necessária estabelecer uma
correspondência entre o tecido normal e o sangue do individuo, bem como casos de
negligência nos quais se verifique troca ou perda de amostras, o que poderá resultar em
episódios extremamente dolosos de erros de diagnóstico, com graves consequências
tanto para o doente que não é diagnosticado como para o indivíduo não leucémico
erradamente diagnosticado com a doença.
No seguimento deste trabalho, seria interessante tentar efectuar um estudo mais
pormenorizado, no qual se pudessem utilizar indivíduos em diferentes estádios da
patologia, inclusivamente após a intervenção terapêutica, e tentar avaliar até que ponto a
evolução da doença ou as estratégias aplicadas no seu tratamento se poderiam reflectir
na estabilidade dos marcadores forenses. Neste sentido, e para confirmação dos
resultados apresentados neste trabalho, seria vantajosa a disponibilização de material
genético obtido de tecidos normais do próprio indivíduo para comparação, bem como a
utilização de amostras constituídas por células exclusivamente leucémicas.
78
V – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Com o Apoio da APLL – Associação Portuguesa de Leucemias e Linfomas
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VI - ANEXOS
95
ANEXO 1 - Sistema de Classificação FAB das leucemias mielóides agudas
M0 – LMA minimamente diferenciada;
M1 – Leucemia mieloblástica sem maturação;
M2 – Leucemia mieloblástica com maturação;
M3 – Leucemia promielocítica; (M3 – variante hipogranular)
M4 – LMA mielomonocítica (componente monocítico ≥ 20%)
(M4E0 – variante: aumento de eosinófilos medulares)
M5 – LMA monoblástica (maduração a monoblasto, promonócito e monócito)
(M5a – LMA monoblástica (≥80% dos blastos constituem monoblastos))
(M5b – LMA monocítica (<80% dos blastos constituem monoblastos)
M6 – eritroleucemia aguda (doença de DiGuglielmo aguda)
M7 – leucemia megacarioblástica.
ANEXO 2 - Sistema de classificação FAB das leucemias linfoblásticas agudas
Morfologia L1 L2 L3
Diâmetro celular Células pequenas e
homogéneas Células grandes e
heterogéneas Células grandes e
homogéneas
Cromatina Nuclear Fina ou aglomerada Fina Fina
Forma do núcleo Regular, pode
apresentar fenda ou indentação
Irregular, pode apresentar fenda ou
indentação
Regular, redondo ou oval
Nucléolos Indistintos ou não
visíveis
Um ou mais por célula, grandes e
proeminentes
Um ou mais por célula, grandes e
proeminentes
Quantidade de citoplasma
Escassa Abundante Abundante
Basofilia citoplasmática
Ligeira Ligeira Evidente
Vacúolos citoplasmáticos
Variáveis Variáveis Evidentes
Adaptado de Lee et al., 1998
ANEXO 3 - Equivalência entre os sistemas de classificação de Rai e Binet para as leucemias
linfóides crónicas
Rai Binet
Estádio Critérios Estádio Critérios
0 Linfocitose no sangue periférico A Sem anemia nem
trombocitopenia; menos de 3 áreas linfóides* afectadas
I Linfocitose + adenopatias A ou B
Sem anemia nem trombocitopenia; 3 ou mais áreas linfóides* afectadas II Linfocitose + Hepato/Esplenomegalia
III Linfocitose + anemia (Hb < 11g/dl)
C Anemia (Hb <10g/dl) e/ou
trombocitopenia (plaquetas < 100x10
9/L) IV
Linfocitose + trombocitopenia (plaq. <100x10
9/L)
Adaptado de Harrison, 2004
96
*No sistema de Binet as cinco áreas linfóides a considerar são o fígado, o baço e os gânglios
linfáticos das zonas cervicais, axilares e inguinais, independentemente da sua afectação uni ou
bilateral. Com base na classificação de Rai são considerados 3 grupos distintos para efeitos de
prognóstico, sendo que o estádio 0 é considerado de baixo risco, os estádios I e II são de risco
intermédio e os estádios III e IV são de risco elevado. A equivalência entre os dois sistemas
indicada na tabela resulta da recomendação do International Workshop on CLL, 1998.
Anexo 4 – Perfis genéticos dos indivíduos que constituem o grupo das leucemias
D8
S1
17
9
D2
1S
11
D7
S8
20
CS
F1
PO
D3
S1
35
8
TH
01
D1
3S
31
7
D1
6S
53
9
D2
S1
33
8
D1
9S
43
3
vW
A
TP
OX
D1
8S
51
Am
elo
g.
D5
S8
18
FG
A
L1108 13 30 8 11 15 9.3 8 11 21 15 16 10 14 12 24 13
14 30 10 14 18 9.3 11 12 25 15 20 11 14 13 26 14
L1044 10 31.2 8 11 15 9 9 11 16 13 14 8 14 11 24 10
12 31.2 10 12 17 9.3 13 11 17 15 20 11 16 12 24 12
L1046 13 29 11 11 15 6 8 8 21 14 16 8 12 11 20 13
15 30 12 12 16 9 12 12 24 15 19 10 13 11 28 15
L1048 14 30.2 9 11 14 9.3 12 9 18 13 17 8 16 12 20 14
15 32.2 13 12 15 9.3 13 12 21 14 20 11 17 12 21 15
L1050 14 29 11 10 16 7 9 11 23 13 18 8 12 10 19 14
14 30 11 12 18 7 12 11 25 15.2 19 8 12 11 26 14
L1055 13 32.2 8 10 15 6 8 11 20 13 16 9 13 11 20 13
14 32.2 11 12 17 8 9 13 23 14 18 11 24 12 20 14
L1056 11 28 10 11 15 8 11 9 18 14 16 10 14 11 19 11
13 30 11 12 15 9.3 13 12 20 16 17 11 15 11 24 13
L1061 11 29 10 10 15 7 11 12 17 13 14 8 15 10 21 11
15 29 11 11 16 9 11 13 18 15 15 10 15 12 24 15
L1063 13 30 9 12 14 7 8 11 17 13 14 8 12 12 19 13
14 31 10 12 18 9.3 12 12 23 14 18 9 16 12 26 14
L1066 10 29 11 11 16 6 11 11 17 12 16 11 13 10 22 10
13 31 12 11 17 9.3 12 13 20 15 19 11 14 12 23 13
L1067 13 29 10 11 14 6 11 9 17 14 17 8 16 11 22 13
14 31.2 10 11 16 6 11 10 25 14 18 8 17 11 23 14
L1074 11 28 11 10 14 9.3 12 11 17 14 15 8 12 11 20 11
14 29 13 12 17 9.3 14 11 24 14 18 9 13 12 22 14
L1080 12 29 9 10 16 9 8 9 17 14 18 9 18 11 22 12
15 32.2 10 10 16 9.3 12 13 19 14 19 9 20 11 24 15
L1082 14 28 8 9 14 9 8 13 18 13 16 8 14 8 19 14
15 33.2 10 11 18 9.3 12 14 18 14 18 12 19 11 22 15
L1083 12 29 8 10 16 6 12 9 20 15 16 8 12 11 18 12
15 29 10 12 18 9.3 12 10 20 15 18 8 15 11 24 15
L1087 11 30.2 9 10 17 6 11 11 18 13 16 9 12 12 20 11
14 32.2 10 11 17 7 12 14 18 13 17 11 16 12 23 14
L1092 11 29 10 10 15 7 11 12 17 13 14 8 15 10 21 11
15 29 11 11 16 9 11 13 18 15 15 10 15 12 24 15
L1095 13 30 9 12 14 7 8 11 17 13 14 8 12 12 19 13
14 30 10 12 18 9.3 12 12 23 14 18 9 16 12 26 14
L1103 13 31 10 10 17 9.3 8 11 18 13 16 8 17 10 20 13
14 31 12 10 17 9.3 11 13 24 15 18 11 17 11 21 14
L1109 11 29 11 12 14 7 12 9 18 14 18 8 15 10 21 11
16 29 12 13 15 7 13 12 18 15.2 19 12 17 12 22 16
L1110 15 28 11 10 15 9.3 11 8 17 12 16 8 13 9 19 15
16 30 12 12 17 9.3 12 11 17 13 17 9 17 13 20 16
97
L1119 12 28 10 10 14 6 11 10 20 13 14 8 14 12 20 12
13 29 11 12 16 8 12 13 22 15 19 11 15 13 23 13
L1126 12 29 11 10 15 8 11 13 17 14 17 8 14 11 22 12
14 29 11 12 15 9.3 13 13 20 15 18 8 16 13 23 14
L1127 14 28 11 10 15 6 9 10 19 13 16 8 102 11 22 14
14 31 12 11 16 9.3 11 11 21 15 17 10 12 12 25 14
L1135 11 27 73 10 16 6 11 9 19 13 15 8 14 11 20 11
11 30 11 11 17 9.3 12 9 20 14 18 8 19 13 24 11
L1138 15 30 11 11 15 6 11 12 17 11 15 8 12 11 24 15
15 312 12 12 16 9.3 11 13 24 15 16 12 14 12 25 15
L1639 11 29 9 8 16 8 9 13 18 13 15 8 17 11 21 11
13 32.2 11 11 18 9 12 13 22 14 17 9 20 12 24 13
L1645 10 30 8 10 16 7 11 10 18 13 18 8 12 10 24 10
14 31 9 12 17 9.3 12 13 19 15 19 8 13 12 24 14
L1739 10 28 10 11 15 7 11 11 19 13 15 8 13 11 21 10
13 30 12 11 16 9 13 13 23 14 17 8 15 13 21 13
L1764 8 30 10 11 15 9.3 8 13 20 11 17 9 11 11 20 8
13 30 11 11 17 10 13 13 23 13 18 11 12 12 24 13
L1769 13 30 8 11 16 7 10 11 18 13 15 8 12 12 21 13
14 31.2 11 12 16 8 11 12 19 13 16 11 17 13 23 14
L1772 12 29 8 10 15 7 8 11 17 13 16 9 14 13 19 12
14 31.2 11 12 15 9.3 14 12 20 14 17 11 15 13 23 14
L1776 13 30.2 11 10 18 7 11 11 18 13 15 9 17 12 22 13
13 31.2 12 13 18 9.3 12 13 19 14 17 11 20 12 23 13
L1848 14 30 8 10 15 6 8 10 23 15 16 8 14 10 20 14
15 31.2 10 11 17 9.3 12 12 24 16 18 11 16 18 23 15
L1850 13 29 10 10 15 9 8 9 23 12 16 8 14 11 18 13
15 30 11 10 16 9.3 13 10 26 14 16 9 20 11 22 15
L1855 13 29 10 12 16 7 8 12 17 14 17 8 12 11 22 13
14 31 10 14 17 9 11 12 19 14 19 9 13 12 25 14
L1887 14 29 10 10 15 6 12 11 17 13 14 8 12 11 23 14
14 30.2 11 11 15 9 12 12 24 16.2 16 8 15 11 25 14
L2026 11 28 10 10 15 6 11 12 17 13 14 8 13 11 21 11
13 29 12 11 16 9 12 13 17 15 18 11 14 12 25 13
L2039 10 27 7 10 13 7 8 9 17 13 14 8 12 11 20 10
13 33.2 10 11 15 9 9 13 20 14 15 11 19 11 22 13
L2040 13 28 10 10 15 5 10 9 22 13 15 8 17 12 24 13
14 31.2 10 11 16 9 12 11 23 14 16 11 17 13 24 14
L2041 11 28 10 10 15 6 11 12 17 13 14 8 13 11 21 11
13 29 12 11 16 9 12 13 17 15 18 11 14 12 25 13
L2043 12 30 10 11 14 6 11 9 22 13 14 8 12 11 22 12
14 31 11 11 18 6 12 13 23 16.2 18 9 18 11 23 14
L2046 9 29 8 12 18 7 8 11 17 12 14 11 14 9 20 9
14 30 11 12 19 9.3 12 12 17 15 16 11 17 11 21 14
L2047 13 27 8 10 17 6 11 10 17 13 15 8 14 12 20 13
13 30 12 12 17 9.3 11 12 25 14 17 8 17 12 23 13
L2048 13 29 11 10 15 6 8 11 18 13 15 10 18 12 19 13
14 29 12 12 17 7 11 11 24 14 17 11 20 12 20 14
L2049 13 30 11 10 15 6 8 9 17 13 14 8 14 11 21 13
16 32 12 12 18 8 13 11 23 14 18 11 15 12 15 16
L2050 12 28 9 11 16 7 11 9 20 12 16 8 16 12 21 12
17 32.2 12 12 17 9 11 13 24 14 18 8 17 12 22 17
L2051 13 29 8 11 16 8 8 11 17 12 18 8 12 11 21 13
15 30 10 11 17 9.3 12 11 20 14 18 8 13 12 23 15
L2054 10 29 11 12 16 6 8 11 16 13 14 8 12 12 22 10
10 29 12 12 16 6 11 13 22 14 16 10 16 15 22 10
L2056 14 29 7 12 14 9 8 11 17 14 17 10 13 12 18 14
15 30 10 12 15 9.3 12 13 23 15.2 19 11 13 13 23 15
98
Anexo 5 – Ratio das alturas dos alelos dos loci heterozigóticos do grupo controlo 2
C4327 C4563 C4488 C4044 C3912 C4467 C3852 C4054 C3908
D8S1179 1,438543 1,346154 1,024099 1,201019 1,099388 1,391775 1,001181 1,471944 1,042455
D21S11 Homozig. Homozig. 1,052297 1,046875 1,095281 Homozig. 1,098712 Homozig. 1,011136
D7S820 1,645333 1 1,345226 1,077807 1,237113 Homozig. Homozig. 1,633106 1,161333
CSF1PO Homozig. 1,048077 1,10662 Homozig. 1,142612 1,3125 Homozig. Homozig. Homozig.
D3S1358 1,279461 1,267925 1,151955 1,115395 1,090843 1,393939 1,053922 1,02509 1
TH01 1,230655 Homozig. 1,099211 1,160829 1,173204 1,316456 1,061694 1,132668 1,037609
D13S317 1,783537 1,34632 Homozig. Homozig. 1,319071 Homozig. 1,107692 1,038328 1,170648
D16S539 Homozig. 1,019084 Homozig. Homozig. Homozig. 1,010989 Homozig. 1,008881 1,196846
D2S1338 1,104369 1,028986 Homozig. 1,088179 1,036186 Homozig. Homozig. 1,399723 1,063927
D19S433 1,255118 1,151261 1,066011 Homozig. 1,468995 1,261194 1,118404 Homozig. Homozig.
vWA 1,262319 1,986395 1,011279 1,368231 1,10178 Homozig. 1,343481 1,04811 1,090766
TPOX Homozig. 1,069034 1,025547 1,011172 Homozig. Homozig. 1,163577 Homozig. 1,025919
D18S51 1,390295 1,148607 1,252688 1,041052 1,30198 1,158537 1,14977 1,004594 1,402996
Amelog. 1,028947 Homozig. Homozig. Homozig. 1,272663 Homozig. 1,071287 Homozig. 1,370229
D5S818 Homozig. Homozig. 1,143723 1,101952 1,228799 Homozig. 1,061798 1,386139 1,053571
FGA 1,27451 1,103448 1,274406 1,093043 1,384259 Homozig. 1,235714 1,535948 1,050725
C4329 C4564 C4489 C4045 C3911 C4466 C4517 C4322 C3906
D8S1179 1,045264 1,29572 1,021884 Homozig. 1,176979 Homozig. 1,510101 1,003352 1,296919
D21S11 1,117083 Homozig. 1,160384 1,40035 1,070763 Homozig. 1,327586 1,067125 Homozig.
D7S820 1,185841 1,210526 1,401598 Homozig. 1,13151 1,803738 2,426087 1,209279 Homozig.
L2057 12 30 9 10 14 9 8 12 17 14 16 9 14 11 23 12
13 32.2 10 11 17 9.3 9 13 19 14 18 11 17 13 23 13
L2058 12 29 9 10 16 9 9 11 18 14 14 8 12 9 22 12
13 31.2 11 10 18 9 11 12 25 14 15 10 15 13 23 13
L2059 12 32.2 8 12 18 8 8 12 17 13 14 11 10 12 23 12
13 33.2 12 12 18 9.3 12 13 20 14 18 11 12 12 25 13
L2060 13 27 10 10 16 9.3 11 9 17 13 16 8 13 11 20 13
13 29 11 12 17 9.3 13 11 25 14.2 17 11 15 12 25 13
L2061 13 28 10 11 15 7 12 10 17 16.2 16 11 12 12 22 13
15 29 10 12 16 9.3 13 13 17 16.2 16 11 16 13 28 15
L2062 11 31 11 12 17 7 8 10 17 13 17 8 13 11 20 11
15 31 11 13 18 9 12 12 19 13 17 8 15 13 28 15
L2063 11 29 11 10 17 9 11 11 21 13 18 8 15 11 21 11
12 30 12 11 18 9.3 11 12 23 14 18 8 17 13 23 12
L2064 10 30 9 11 16 9.3 12 11 17 14 14 11 12 12 23 10
15 31.2 10 12 16 9.3 13 13 19 14.2 17 11 16 12 24 15
L2066 11 20 10 10 15 7 10 11 17 13 15 9 13 11 22 11
13 30.2 12 11 19 9 13 12 20 13 16 12 18 11 22.2 13
L1071 13 28 8 12 15 6 11 9 17 13 14 11 13 11 20 13
15 31 13 12 17 7 13 13 20 14 17 11 16 13 25 15
L1121 11 29 11 10 15 8 11 11 17 13 15 8 14 11 19 11
12 31.2 11 11 15 9.3 13 13 20 14 17 8 16 12 21.2 12
L1137 12 29 8 10 15 7 8 11 17 13 16 9 14 13 19 12
14 31.2 11 12 15 9.3 8 12 20 14 17 11 15 13 23 14
L1846 12 28 7 11 14 7 8 13 23 12 16 8 10 11 18 12
13 31.2 10 12 18 8 12 13 24 13 18 8 13 12 18 13
99
CSF1PO Homozig. Homozig. 1,190356 1,287425 1,144869 Homozig. 1,220183 Homozig. Homozig.
D3S1358 Homozig. 2,051095 1,175595 1,121311 1,189702 1,057692 Homozig. 1,07235 1
TH01 1,228909 1,031315 1,016691 Homozig. Homozig. 1,065877 2,275229 1,221501 Homozig.
D13S317 1,306569 1,118421 Homozig. 1,247312 Homozig. 1,580645 Homozig. Homozig. Homozig.
D16S539 1,205144 1,006494 Homozig. 1,034979 1,338637 Homozig. Homozig. 1,140519 Homozig.
D2S1338 1,546539 1,001751 1,13946 1,279781 Homozig. 1,204331 1,992308 Homozig. 1,100529
D19S433 Homozig. 1,145833 1,106958 1,056369 1,133638 1,01921 Homozig. 1,378321 1,004115
vWA 1,017999 Homozig. 1,07573 Homozig. 1,098051 1,453944 4,62963 Homozig. 1,15261
TPOX 1,018308 1,02439 1,018981 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. 1,013658 Homozig.
D18S51 Homozig. 1,293103 1,099528 2,142857 1,182997 1,430769 Homozig. 1,027383 1,56
Amelog. 1,088636 Homozig. Homozig. 1,191201 1,0503 Homozig. Homozig. 3,408528 1,113764
D5S818 1,123499 Homozig. 1,194081 1,044709 1,265907 1,108168 1,709677 1,018171 Homozig.
FGA 1,180108 1 1,153611 1,24 1,212159 1,552 2,242105 1,216931 1
C4512 C4281 C4490 C4444 C3910 C4464 C4561 C4324 C3913
D8S1179 Homozig. 1,271493 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. 1,204927 1,184906 1,037303
D21S11 2,078512 1,317757 1,184896 Homozig. 1,185567 Homozig. 1,294923 1,46777 1,798507
D7S820 1,186147 Homozig. Homozig. 1,230944 1,11 1,135135 1,058175 Homozig. 1,105263
CSF1PO 1,340206 Homozig. 1,055016 1,175089 1,210526 Homozig. 1,250648 1,240431 1,098976
D3S1358 1,406404 1,306122 1,235669 1,11526 1,099688 Homozig. Homozig. 1,634921 1,153846
TH01 Homozig. Homozig. 1,05184 1,089699 Homozig. 1,002597 1,039156 1,026882 1,020566
D13S317 1,418079 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. 1,194444 1,130435 3,12782 1,036364
D16S539 1,006993 1,272436 1,069538 1,109367 1,099291 1,368 1,035957 Homozig. 1,146
D2S1338 2,300885 1,246479 1,352345 1,098439 1,112701 1,460954 1,133011 1,184917 1,129346
D19S433 Homozig. 1,481481 1,09008 1,236176 1,119613 1,020704 1,02323 Homozig. 1,027586
vWA Homozig. 1,364641 Homozig. 1,068081 1,336815 1,730876 1,420886 1,268966 1,301619
TPOX 1,511429 1,045307 Homozig. Homozig. 1,201379 1,103026 Homozig. Homozig. Homozig.
D18S51 1,204301 Homozig. Homozig. 1,386654 1,091743 1,311594 1,353642 1,143959 1,389831
Amelog. 1,049751 1,10101 Homozig. Homozig. 1,11114 Homozig. Homozig. 1,15416 1,492958
D5S818 1,640523 Homozig. 1,15311 Homozig. 1,343826 1,148352 Homozig. Homozig. 1,070707
FGA 1,508065 1,15 1,547511 1,240705 1,447368 1,418605 1,349925 Homozig. 1,37037
C4514 C4282 C4511 C4476 C3909 C4463 C4562 C4486 C3853
D8S1179 1,209184 1,490639 1,120268 1,14437 1,146325 1,131824 Homozig. 1,06363 1,252506
D21S11 1,046263 Homozig. Homozig. Homozig. 1,145585 1,205298 Homozig. 1,063492 1,309414
D7S820 2,172932 Homozig. Homozig. 1,119237 1,173913 1,28125 1,186441 1,024 1,228606
CSF1PO 1,269841 1,330749 1,316505 1,060041 1,377358 1,12093 1,196581 1,11811 1,162306
D3S1358 Homozig. 1,08727 Homozig. 1,07607 1,125 1,080292 1,017157 1,049587 1,078603
TH01 1,770115 1,411165 1,079425 1,132761 Homozig. Homozig. 1,178195 1,419895 1,049717
D13S317 Homozig. 1,096447 Homozig. Homozig. 1,385621 1,184211 1,488506 Homozig. Homozig.
D16S539 Homozig. 1,045638 1,019917 Homozig. 1,235294 1,454414 1,23601 1,040276 1,10407
D2S1338 1,347826 1,084226 1,220779 Homozig. 1,059567 Homozig. Homozig. Homozig. 1,048364
D19S433 1,344595 Homozig. 1,065782 Homozig. Homozig. 1,132438 Homozig. 1,346437 1,090466
vWA 2,165468 1,196124 1,11749 1,142639 1,3625 Homozig. Homozig. Homozig. 1,164065
TPOX 2,051948 1,168904 1,07965 Homozig. Homozig. 1,130584 Homozig. Homozig. Homozig.
D18S51 2,290698 1,231023 1,189323 1,065789 Homozig. 1,302326 Homozig. 1,160156 Homozig.
Amelog. 1,545455 1,096248 Homozig. Homozig. 1,010183 Homozig. 1,261803 Homozig. 1,032004
D5S818 Homozig. Homozig. Homozig. 1,114375 Homozig. 1,010309 Homozig. Homozig. 1,044218
FGA 2,041667 1,056352 1,166545 1,120104 1,105263 Homozig. 1,031447 Homozig. 1,11553
100
C4515 C4318 C4048 C3956 C4473 C4462 C4474 C4487 C4471
D8S1179 Homozig. 1,0423 1,140914 1,564313 1,507463 1,005996 1,326891 1,037251 1,162375
D21S11 1,093079 Homozig. Homozig. 1,186627 Homozig. 1,154378 1,0736 1,195787 1,138957
D7S820 1,202985 1,068269 1,352941 Homozig. Homozig. 1,331169 Homozig. 1,040513 Homozig.
CSF1PO 1,860465 Homozig. 1,241135 1,132718 1,469388 1,233202 1,153496 1,034689 Homozig.
D3S1358 Homozig. 1,032941 1,15942 1,109827 1,304233 Homozig. Homozig. Homozig. 1,013455
TH01 1,408907 1,199163 1,2 Homozig. Homozig. 1,170473 Homozig. Homozig. Homozig.
D13S317 Homozig. Homozig. 0,921053 1,206548 Homozig. Homozig. 1,181321 1,162765 Homozig.
D16S539 1,520868 1,07045 1,242634 1,065079 Homozig. 1,202996 Homozig. 1,141952 1,055556
D2S1338 Homozig. 1,242606 Homozig. Homozig. Homozig. 1,295424 Homozig. 1,278414 1,022355
D19S433 1,121901 Homozig. Homozig. 1,289488 1,015068 1,040252 1,30782 1,120067 1,027275
vWA 1,252199 1,080097 1,999274 1,027691 1,473988 1,299904 1,153451 1,094248 1,013526
TPOX Homozig. Homozig. 0,994142 Homozig. 1,064444 Homozig. 1,030753 1,057606 Homozig.
D18S51 1,150327 1,166883 1,108911 1,074496 1,705882 1,228519 Homozig. 1,232205 1,005225
Amelog. Homozig. 1,112798 1,075933 1,039435 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. Homozig.
D5S818 Homozig. Homozig. 1,194969 1,002885 1,079268 1,155 1,158963 1,084771 Homozig.
FGA 1,354717 1,2 Homozig. Homozig. 1,317073 1,127273 Homozig. 1,096774 1,132794
C4516 C4321 C4049 C4480 C4472 C4461 C4050 C4481 C4470
D8S1179 3,072464 1,513143 Homozig. 1,009532 1,24727 1,075537 1,137737 Homozig. 1,145686
D21S11 Homozig. 1,230769 1,261937 1,202143 1,447993 1,428894 1,354227 1,218903 Homozig.
D7S820 1,489627 1,15562 Homozig. 1,11542 1,069444 Homozig. 1,430556 1,02038 Homozig.
CSF1PO Homozig. 1,27577 Homozig. 1,027891 Homozig. 1,055363 1,470817 1,122271 1,319588
D3S1358 1,269231 1,129825 Homozig. 1,124692 Homozig. 1,138544 1,222656 1,098604 1,06588
TH01 Homozig. 1,450307 Homozig. 1,19346 1,080668 1,388254 1,03981 1,035874 Homozig.
D13S317 Homozig. Homozig. 1,201597 1,171965 1,578366 1,349138 1,287234 Homozig. 1,124378
D16S539 Homozig. 1,529299 1,025068 1,085017 1,124315 1,22807 1,119109 1,023758 1,241265
D2S1338 1,888158 1,065838 Homozig. 1,084204 1,427252 1,141917 Homozig. 1,285213 Homozig.
D19S433 1,54321 1,079659 1,072002 1,072888 1,195701 1,115789 1,006798 1,008924 Homozig.
vWA 2,331731 1,046059 1,009379 1,095322 1,331124 1,06044 1,019932 1,174338 1,36294
TPOX 1,532751 Homozig. 1,062021 Homozig. 1,17734 Homozig. 1,0193 1,02546 Homozig.
D18S51 1,135 1,212625 1,118795 1,072344 1,173913 1,135802 1,377358 Homozig. 1,446097
Amelog. 1,920354 1,296073 3,861963 Homozig. Homozig. Homozig. 1,069793 Homozig. Homozig.
D5S818 Homozig. 1,244681 1,028486 1,224926 Homozig. 1,079174 1,062593 1,076026 1,17581
FGA 1,227848 1,300518 Homozig. Homozig. 1,458791 1,046358 1,184211 1,100508 1,09447
C4280 C3952 C4469 C4475 C3947 C4468 C4482
D8S1179 1,030137 1,12766 1,027553 1,220472 1,061311 1,068072 1,000367
D21S11 1,19469 1,474903 1,219178 1,173524 1,223577 1,156154 1,039111
D7S820 Homozig. Homozig. 1,045142 1,070632 Homozig. 1,117381 1,087152
CSF1PO 2,309859 Homozig. 1,189964 Homozig. Homozig. Homozig. 1,070357
D3S1358 Homozig. Homozig. Homozig. 1,020765 1,053922 1,225907 1,015159
TH01 1,075835 1,038513 1,005884 1,214391 1,033773 Homozig. 1,002149
D13S317 1,064516 1,243243 1,061184 Homozig. 1,076797 1,279403 Homozig.
D16S539 Homozig. 1,142433 Homozig. 1,164227 Homozig. 1,089823 1,014667
D2S1338 1,11231 1,560976 1,283879 1,277816 Homozig. 1,370178 Homozig.
D19S433 1,040462 Homozig. Homozig. 1,198251 1,079145 1,092644 1,054096
vWA 1,268949 Homozig. 1,218835 1,144358 1,17433 1,099453 1,152395
TPOX 1,085613 1,090047 Homozig. Homozig. 1,053345 1,077944 Homozig.
101
D18S51 1,135714 Homozig. 1,054242 1,035528 1,161747 1,076128 1,307526
Amelog. 3,888112 1,019873 Homozig. Homozig. 1,129865 Homozig. Homozig.
D5S818 1,064516 1,048711 Homozig. 1,03046 1,113586 Homozig. 1,144541
FGA 1,207547 1 1,031419 1,434716 1,076996 1,287687 Homozig.
Média dos ratios 1,231 Desvio padrão 0,322 Média + 2,5 desvio padrão 2,038
ANEXO 6 – Ratio das áreas dos alelos do loci heterozigóticos
C4327 C4563 C4488 C4044 C3912 C4467 C3852 C4054 C3908
D8S1179 1,678593 1,405814 1,057648 1,22838 1,126311 1,415734 1,019564 1,4915 1,035624
D21S11 Homozig. Homozig. 1,05674 1,029066 1,094166 Homozig. 1,118259 Homozig. 1,020566
D7S820 1,643319 1,024846 1,356799 1,082441 1,220814 Homozig. Homozig. 1,659855 1,144135
CSF1PO Homozig. 1,004704 1,574824 Homozig. 1,160728 1,39542 Homozig. Homozig. Homozig.
D3S1358 1,278679 1,175689 1,246243 1,109273 1,062512 1,182143 1,038618 1,037679 1,015957
TH01 1,210934 Homozig. 1,182239 1,151305 1,179056 1,250253 1,051681 1,127821 1,035964
D13S317 1,768541 1,235068 1,284604 Homozig. 1,31502 Homozig. 1,033493 1,046656 1,13758
D16S539 Homozig. 1,100887 Homozig. Homozig. Homozig. 1,012953 Homozig. 1,006447 1,202951
D2S1338 1,086092 Homozig. Homozig. 1,068018 1,041822 Homozig. Homozig. 1,48916 1,092969
D19S433 1,24361 1,190272 1,095744 Homozig. 1,467424 1,298044 1,101764 Homozig. Homozig.
vWA 1,352452 1,969543 1,036896 1,411149 1,087252 Homozig. 1,350959 1,033824 1,053842
TPOX Homozig. 1,051274 1,012725 1,01067 Homozig. Homozig. 1,1611 Homozig. 1,009931
D18S51 1,382577 1,125396 1,567133 1,051543 1,246159 1,21134 1,121138 1,006541 1,344297
Amelog. 1,035057 Homozig. Homozig. Homozig. 1,283849 Homozig. 1,037673 Homozig. 1,311048
D5S818 Homozig. Homozig. 1,145507 1,090966 1,240257 Homozig. 1,061192 1,381814 1,04553
FGA 1,276173 1,084711 Homozig. 1,104554 1,331124 Homozig. 1,964895 1,542495 1,06033
C4329 C4564 C4489 C4045 C3911 C4466 C4517 C4322 C4471
D8S1179 1,038762 Homozig. 1,064459 Homozig. 1,373875 Homozig. 1,293915 1,024597 1,2482
D21S11 1,124659 Homozig. 1,174464 1,406856 1,058464 Homozig. 1,323445 1,061548 1,131373
D7S820 1,235103 1,118574 1,41551 Homozig. 1,147065 1,722689 2,178182 1,203297 Homozig.
CSF1PO Homozig. 1,122482 1,157917 1,232941 1,137351 Homozig. 1,199271 1,12054 Homozig.
D3S1358 Homozig. 1,001793 1,244546 1 1,187548 1,026301 Homozig. Homozig. 1,001542
TH01 1,301614 1,163352 1,01251 Homozig. Homozig. 1,07238 2,409236 1,400424 Homozig.
D13S317 1,332092 1,518777 Homozig. 1,357305 Homozig. 1,867742 Homozig. Homozig. Homozig.
D16S539 1,23648 1,225859 Homozig. 1,046006 1,372697 Homozig. Homozig. 1,027351 1,04649
D2S1338 1,498249 Homozig. 1,175727 1,26815 Homozig. 1,16517 2,031414 1,059575 1,005313
D19S433 Homozig. Homozig. 1,129646 1,078576 1,149779 1,017224 Homozig. Homozig. 1,038864
vWA 1,002488 Homozig. 1,241251 Homozig. 1,100944 1,48651 Homozig. 1,210918 1,002238
TPOX 1,037634 Homozig. 1,003546 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. 1,070498 Homozig.
D18S51 Homozig. Homozig. 1,097765 Homozig. 1,170078 1,383423 Homozig. Homozig. 1,005139
Amelog. 1,109262 Homozig. Homozig. 1,188366 1,116767 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig.
D5S818 1,157094 1,347344 1,190513 1,066693 1,263596 1,067949 1,945652 1,033048 Homozig.
FGA 1,204232 1,035647 1,895942 1,043054 1,213937 1,349505 2,042076 1,220408 1,120117
C4512 C4281 C4490 C4444 C3910 C4464 C4561 C4324 4470
D8S1179 Homozig. 1,215107 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. 1,232875 1,20266 1,167074
102
D21S11 2,168742 1,293525 1,195389 Homozig. 1,175889 Homozig. 1,297573 1,4414 Homozig.
D7S820 1,097561 Homozig. Homozig. 1,227705 1,152411 1,132296 1,027019 Homozig. Homozig.
CSF1PO 1,548909 Homozig. 1,069435 1,160147 1,230964 Homozig. 1,230042 1,239288 1,263081
D3S1358 1,235724 1,130612 1,18122 1,089956 1,012613 Homozig. Homozig. 1,304569 1,106535
TH01 1,301541 Homozig. 1,038178 1,062861 Homozig. 1,008917 1,016012 1,049031 Homozig.
D13S317 Homozig. Homozig. 1,043965 Homozig. Homozig. 1,445055 1,134155 1,753459 1,129744
D16S539 1,4503 1,311372 1,066286 1,107192 1,090986 1,321429 1,038965 Homozig. 1,2459
D2S1338 1,337607 1,159325 1,326025 1,14782 1,119934 1,42657 1,117545 1,179449 Homozig.
D19S433 Homozig. 1,393502 1,107723 1,224351 1,119689 1,046481 1,065858 Homozig. Homozig.
vWA Homozig. 1,231689 Homozig. 1,092995 1,282274 1,702128 1,45949 1,264961 1,348304
TPOX Homozig. 1,136276 Homozig. Homozig. 1,236125 1,085705 Homozig. Homozig. Homozig.
D18S51 1,090633 Homozig. Homozig. 1,355981 1,053405 1,284817 1,30064 1,096942 1,380328
Amelog. 1,047278 1,026412 Homozig. Homozig. 1,125864 Homozig. Homozig. 1,238694 Homozig.
D5S818 1,556701 Homozig. 1,126387 Homozig. 1,371719 1,120397 Homozig. Homozig. 1,101401
FGA 1,553058 1,11276 1,336102 1,248526 1,478456 1,722603 1,301509 Homozig. 1,105214
C4514 C4282 C4511 C4476 C3909 C4463 C4562 C4486 C4469
D8S1179 1,259976 1,507226 1,131595 1,178382 1,170669 1,137447 Homozig. 1,097683 1,0316
D21S11 1,054708 Homozig. Homozig. Homozig. 1,153297 1,186087 Homozig. 1,043742 1,218556
D7S820 2,225394 Homozig. Homozig. 1,006116 1,126214 1,23301 1,091706 1,014815 1,044337
CSF1PO 1,257213 1,353941 1,312526 1,070105 1,189448 1,156185 1,127882 1,213805 1,15295
D3S1358 Homozig. 1,24141 Homozig. 1,054497 Homozig. 1,006349 1,037864 1,025653 Homozig.
TH01 Homozig. 1,055147 1,07524 1,124441 Homozig. Homozig. 1,173978 1,412776 1,0196
D13S317 1,283262 1,08786 Homozig. Homozig. 1,336777 1,003817 1,526393 Homozig. 1,089057
D16S539 2,126408 1,418535 1,010611 Homozig. 1,239524 1,410208 1,278521 1,062093 Homozig.
D2S1338 1,659979 1,051366 1,206679 Homozig. 1,085432 Homozig. Homozig. Homozig. 1,248381
D19S433 2,194055 1,194661 1,093774 Homozig. Homozig. 1,132665 Homozig. 1,354216 Homozig.
vWA 1,414545 1,130605 1,120244 1,117909 1,276782 Homozig. Homozig. Homozig. 1,18461
TPOX Homozig. Homozig. 1,107936 Homozig. Homozig. 1,143989 Homozig. Homozig. Homozig.
D18S51 1,63467 1,067253 1,196411 1,060804 1,776667 1,206101 Homozig. 1,068606 1,083476
Amelog. 1,755251 1,07853 Homozig. Homozig. 1,002829 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig.
D5S818 Homozig. Homozig. Homozig. 1,123194 Homozig. 1,09585 1,317846 Homozig. Homozig.
FGA 2,02873 1,035057 1,168103 1,093341 1,073103 Homozig. 1,013333 Homozig. 1,028901
C4515 C4318 C4048 C3956 C4473 C4462 C4474 C4487 C4468
D8S1179 Homozig. 1,075614 1,087866 1,617868 1,615709 1,003645 1,350353 1,11205 1,083883
D21S11 1,061217 Homozig. Homozig. 1,177666 Homozig. 1,157303 1,049241 1,173118 1,121412
D7S820 1,187207 1,106817 1,221477 Homozig. Homozig. 1,308629 Homozig. 1,027321 1,14707
CSF1PO 1,848908 Homozig. 1,256902 1,119637 1,629179 1,197395 1,120133 1,019091 Homozig.
D3S1358 Homozig. 1,004062 1,314189 1,135555 1,33786 Homozig. Homozig. Homozig. 1,24129
TH01 1,39931 1,195443 1,276469 Homozig. Homozig. 1,172501 Homozig. Homozig. Homozig.
D13S317 Homozig. Homozig. 1,057377 1,193584 Homozig. Homozig. 1,158827 1,171053 1,311271
D16S539 1,498786 1,039797 1,227079 1,065157 Homozig. 1,192278 Homozig. 1,142085 1,071029
D2S1338 Homozig. 1,199038 Homozig. Homozig. Homozig. 1,300628 Homozig. 1,265337 1,308856
D19S433 1,08563 Homozig. Homozig. 1,294839 1,043664 1,093009 1,654205 1,095975 1,072464
vWA 1,187942 1,08091 1,957685 1,044606 1,515988 1,301309 1,159445 1,111529 1,087835
TPOX Homozig. Homozig. 1,01407 Homozig. 1,043857 Homozig. 1,011793 1,114748 1,07142
D18S51 1,200869 1,126861 1,012752 1,085156 1,642857 1,184607 Homozig. 1,197551 1,091754
Amelog. Homozig. 1,120413 1,099554 1,042456 Homozig. Homozig. Homozig. Homozig. Homozig.
103
D5S818 Homozig. Homozig. 1,345397 1,000595 1,042644 1,14147 1,147307 1,090059 Homozig.
FGA 1,369752 1,143519 Homozig. Homozig. 1,291994 1,084135 Homozig. 1,082238 1,304137
C4516 C4321 C4049 C4480 C4472 C4461 C4050 C4481 C3853
D8S1179 Homozig. 1,525346 Homozig. 1,01307 1,285214 1,039089 1,168045 Homozig. 1,302089
D21S11 Homozig. 1,243243 1,261937 1,181456 1,429088 1,408825 1,313504 1,177282 1,328423
D7S820 Homozig. 1,133936 Homozig. 1,071502 1,066441 Homozig. 1,38171 1,023509 1,220263
CSF1PO Homozig. 1,265816 Homozig. 1,052069 Homozig. 1,06295 1,474532 1,114209 1,189675
D3S1358 Homozig. 1,184497 Homozig. 1,146852 Homozig. 1,156061 1,482359 1,11015 1,213527
TH01 1,879435 1,427143 Homozig. 1,196278 1,076909 1,415912 1,049851 1,019021 1,059394
D13S317 1,588437 Homozig. 1,201597 1,163762 1,439265 1,403392 1,118667 Homozig. Homozig.
D16S539 2,321823 1,52934 1,025068 1,078822 1,137279 1,177699 1,120292 1,011159 1,105468
D2S1338 1,327051 1,056041 Homozig. 1,072467 1,377269 1,138085 Homozig. 1,30738 1,055764
D19S433 1,300904 1,107654 1,072002 1,11399 1,236082 1,117389 1,004785 1,031587 1,108808
vWA 1,09352 1,062188 1,009379 1,088044 1,320396 1,097895 1,037702 1,178137 1,185356
TPOX Homozig. Homozig. 1,062021 Homozig. 1,163842 Homozig. 1,024235 1,054108 Homozig.
D18S51 1,442199 1,215482 1,118795 1,068909 1,165008 1,124696 1,248371 Homozig. Homozig.
Amelog. 1,857143 1,271353 3,861963 Homozig. Homozig. Homozig. 1,070728 Homozig. 1,017903
D5S818 Homozig. 1,243869 1,028486 1,25923 Homozig. 1,068567 1,07406 1,084013 1,045697
FGA 1,037736 1,117454 Homozig. Homozig. 1,529963 1,077634 1,368821 1,099445 1,078398
C4280 C4482 C3952 C3906 C3913 C4475 C3947
D8S1179 1,023735 1,057676 1,091239 1,293605 1,042639 1,236075 1,106144
D21S11 1,140449 1,042369 1,442195 Homozig. 1,794416 1,145371 1,236034
D7S820 Homozig. 1,03308 Homozig. Homozig. 1,216606 1,069684 Homozig.
CSF1PO 2,170773 1,067459 Homozig. Homozig. 1,088583 Homozig. Homozig.
D3S1358 Homozig. 1,079909 Homozig. 1,003425 1,182257 1,015125 1,44211
TH01 1,100508 1,011793 1,052088 Homozig. 1,029811 1,235777 1,026376
D13S317 1,105932 Homozig. 1,336226 Homozig. 1,06087 Homozig. 1,04674
D16S539 Homozig. 1,001927 1,132439 Homozig. 1,12292 1,152269 Homozig.
D2S1338 1,063618 Homozig. 1,493034 1,073788 1,096204 1,237605 Homozig.
D19S433 1,080711 Homozig. Homozig. 1,007376 1,040421 1,21544 1,092198
vWA 1,282973 1,108561 Homozig. 1,143296 1,288141 1,133414 1,204582
TPOX 1,101962 Homozig. 1,112907 Homozig. Homozig. Homozig. 1,060943
D18S51 1,067828 1,264531 Homozig. 1,418919 1,344222 1,009674 1,122658
Amelog. 3,409396 Homozig. 1,01408 1,11387 1,4627 Homozig. 1,146319
D5S818 1,050873 1,137503 1,038918 Homozig. 1,039437 1,011602 1,15016
FGA 1,122768 Homozig. 1,301676 1 1,418149 1,39052 1,055597
Média dos ratios 1,216 Desvio Padrão 0,254 Média + 2,5 Desvio Padrão 1,852
