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Estructura genética de poblaciones naturales de palma de aceite (Elaeis

guineensis Jacq.) procedentes de Angola

Sandra Nereida Barrera Galvis

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Agronomía

Bogotá, Colombia

2011

Estructura genética de poblaciones naturales de palma de aceite (Elaeis

guineensis Jacq.) procedentes de Angola

Sandra Nereida Barrera Galvis

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en ciencias agrarias con énfasis en genética y fitomejoramiento

Director (a):

Ph.D., Maria Isabel Chacón Sánchez

Codirector (a):

M.Sc., Diana Marcela Arias Moreno

Línea de Investigación:

Genética y fitomejoramiento

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Agronomía

Bogotá, Colombia

2011

Dedico este trabajo a Dios, por ser mi guía, fortaleza y por haberme dado la oportunidad de continuar con mi realización profesional y permitir que esta etapa de mi vida culmine con éxito. A mi esposo Edison quien, incansablemente y sin dudar, me ha apoyado en cada uno de los retos que en vida he decidió emprender, por su paciencia, compañía, consejo, amor y en fin por poner su tiempo y su vida a disposición de mis sueños. A mi familia, principalmente a mis padres, Evelia y Héctor, por ser los artífices de la mujer que ahora soy, y por su constante apoyo y compañía.

El hombre encuentra ha Dios detrás de cada puerta que logra abrir. Albert Einstein

Agradecimientos A la Universidad Nacional de Colombia, a todos sus profesores y administrativos quienes con su trabajo aportaron un granito de arena para poner a mi disposición su sabiduría y los recursos para mi superación académica.

Al Centro de investigación en palma de aceite (CENIPALMA) y especialmente a Diana Arias coordinadora del laboratorio de marcadores moleculares, por el apoyo económico y logístico para realizar este trabajo, por su confianza y al grupo de apoyo técnico de laboratorio Duzley, Diana, Cristian, a las señoras Gladicita y Elena.

A la profesora María Isabel Chacón Sánchez, por orientación en la elaboración de este documento, por brindarme su apoyo, confianza, tiempo, experiencia y sus enseñanzas al decir acompañarme en el desarrollo de este proyecto mi tesis y en general en el transcurso de la maestría.

A los profesores Gustavo Ligarreto, Gerardo Cayón, Manuel Ruiz y al doctor Leonardo Rey, por sus aportes, sugerencias y comentarios para la obtención de un buen documento resultado de este proyecto.

A María Antonia y Pilar, por su amistad incondicional, durante toda esta etapa de mi vida. A mis compañeros y amigos de universidad Alejandro, Fernan, Isaac, Cesar, Juanito, Deissy, José, Sonia y Diana, por su amistad y confianza, porque en algún momento estuvieron allí compartiendo aquellos momentos de alegría y de angustia, haciendo de este tiempo más grato para mí. A mis hermanas Angela, Patricia y Marcela, por hacer parte importante de mi vida, y ser inspiración en busca de una mejor calidad de vida. A la señora Gloria, a Edwin y Cesar, y a quienes de una u otra manera siempre me han acompañado y apoyado.

Contenido VII

Resumen El objetivo del presente estudio fue evaluar la diversidad y estructura genética de una colección de 455 entradas de palma africana (Elaeis guineensis Jacq) colectadas en 5 zonas geográficas de la República de Angola y 9 híbridos interespecíficos, con 19 loci microsatélite. Un total de 79 alelos fueron detectados con un promedio de 5.61, trece loci fueron polimórficos con un PIC (índice de información polimórfica) promedio de 0,533. La heterocigosidad esperada promedio (0,561) mostro una variabilidad genética alta respecto a los materiales comerciales. La diferenciación genética entre zonas geográficas fue baja (FST= 0,028, P<0,01) y entre familias fue moderada (FST= 0,137, P<0,01), revelando mayor variación entre familias que entre zonas geográficas. La población evaluada no mostro estructura genética debida a la ubicación geográfica. Las topologías permitieron vislumbrar relaciones genéticas de disimilaridad, sin embargo, la mayoría no mostraron tener soporte estadístico.

Palabras clave: palma de aceite, microsatélite, estructura poblacional, diversidad genética

Resumen y abstract

VIII Estructura genética de poblaciones naturales de palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) procedentes de Angola

Abstract The aim of this study was to assess the diversity and genetic structure of a collection of 455 accessions of african oil palm (Elaeis guineensis Jacq.), collected in 5 geographic areas of the Republic of Angola and 9 hybrids, with 19 SSR loci. A total of 79 alleles were detected with an average of 5.61, thirteen markers were polymorphic with average polymorphic index content (PIC) of 0.533. The average expected heterozygosity (0.561) showed a high genetic variability compared to commercial materials. Genetic differentiation between geographic areas was low (FST= 0.028, P<0.01) and between families was moderate (FST= 0.137, P<0.01) indicating greater genetic variation among families within geographic areas than among geographic areas. The study population showed no genetic structure due to geographic location. The cluster analysis made possible to see genetic relationships of dissimilarity, although most of the groups did not show statistical support. Keywords: oil palm, microsatellite, population structure, genetic diversity.

Contenido IX

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ VII Lista de figuras ............................................................................................................... XI Lista de tablas ............................................................................................................... XII Introducción ..................................................................................................................... 1 Objetivos .......................................................................................................................... 3 General ............................................................................................................................. 3 Específicos ...................................................................................................................... 3

1. Capítulo 1. El cultivo de la palma de aceite y las colecciones de germoplasma . 5 1.1 El cultivo de la palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) ........................................................................................................................................... 5

1.1.1 Generalidades ..................................................................................................... 5 1.1.2 Tipos de palma .................................................................................................... 6 1.1.3 Usos y productos ................................................................................................. 7 1.1.4 Importancia Económica ....................................................................................... 7

1.2 Colecciones genéticas ex situ de palma de aceite (CENIPALMA) ........................................................................................................................................... 8

2. Capítulo 2. Diversidad y estructura genética de E. guineensis de la república de Angola ................................................................................................................................. 11

2.1 Marcadores moleculares y estudios de diversidad genética en palma de aceite. Antecedentes .................................................................................................................. 11 2.2 Materiales y métodos………………………………………………………………….13

2.2.1 Lugar del estudio ............................................................................................... 13 2.2.2 Material vegetal y zona de estudio ................................................................... 13 2.2.3 Análisis molecular .............................................................................................. 16 2.2.4 Análisis de datos ............................................................................................... 18

2.3 Resultados ............................................................................................................ 20 2.3.1 Extracción de ADN genómico ........................................................................... 20 2.3.2 Datos faltantes ................................................................................................... 20 2.3.3 Diversidad alélica .............................................................................................. 21 2.3.4 Diversidad genética en las zonas geográficas ................................................. 22 2.3.5 Diversidad genética dentro de familias ............................................................. 23 2.3.6 Estructura genética ............................................................................................ 25 2.3.7 Relaciones genéticas ........................................................................................ 29

X Estructura genética de poblaciones naturales de palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) procedentes de Angola

2.4 Discusión ............................................................................................................... 35 2.4.1 Diversidad alélica .............................................................................................. 36 2.4.2 Estructura poblacional ....................................................................................... 38 2.4.3 Relaciones genéticas ........................................................................................ 40

3. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................... 42 3.1 Conclusiones ......................................................................................................... 42 3.2 Recomendaciones ................................................................................................ 43

A. Anexo: Información del grosor de cuesco en las familias y zonas geográficas en este estudio…………………………………………………………………............................43 B. Anexo: Perfil de los loci PR01, PR06, PR07 y PR16 de las muestras 127 a 136...44 C. Anexo: Test exacto de desequilibrio de ligamiento. Pares de loci con desequilibrio de ligamiento significativo………………………………………………......45

D. Anexo: FST y valor-p entre pares de zonas geográficas……………….....….........46

E. Anexo: FST y valor-p entre pares de familias……………...…………………..……..47

F. Anexo: Distancias genéticas entre pares de zonas geográficas…………………50

G. Anexo: Distancia genética de Nei (1972) entre pares de familias……..…….......51

4. Bibliografía…………………………………………………………………………………55

Contenido XI

Lista de figuras Pág.

Figura 2- 1: Distribución geográfica de las cinco zonas de colecta de E. guineensis en la República de Angola. ...................................................................................................... 15 Figura 2-12: Geles de agarosa (0,8%). ADN de palma E. guineensis extraído con el kit de QIAGEN DNeasy® Plant Min ................................................................................... 20 Figura 2-13: Gráficas para la exploración de la estructura poblacional de las entradas analizadas utilizando el programa Structure. (A) Valores promedio del Ln P(D) (Log likelihood) vs K, (B) K vs K, de acuerdo a Evanno et al. (2005). (I) simulación sin información a priori de la zona geográfica de las entradas (II) simulación con información a priori de la zona geográfica de las entradas evaluadas. ................................................ 28 Figura 2-14: Gráfico del K óptimo (K) de las simulaciones del programa Structure incluyendo el grupo de híbridos. A. Sin información a priori del lugar de colecta. B. Con información geográfica a priori del lugar de colecta. ......................................................... 29 Figura 2-15: Análisis de coordenadas principales (primeras dos dimensiones) basado en la matriz de distancias genéticas dm2 para las 5 zonas geográficas incluyendo los híbridos………… ................................................................................................................. 31 Figura 2-16: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y la distancia genética de Nei (1972), para las 5 zonas geográficas y el grupo de híbridos usado como grupo externo. ................................................................................................ 32 Figura 2-17: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y la distancia genética de Nei (1972), incluye 44 familias correspondientes a las 5 zonas geográficas colectadas de E. guineensis en la República de Angola y un grupo de híbridos……….. .................................................................................................................. 33 Figura 2-18: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y el índice de disimilaridad, incluye 464 entradas de E. guineensis distribuidas en 5 zonas geográficas y un grupo de híbridos usado como grupo externo. Valores de bootstrap superiores a 50. .................................................................................................................. 34

Contenido XII

Lista de tablas Pág.

Tabla 2-1: Información de la estructura de la colecta y número de entradas evaluada…………………………………………………………………………………………16 Tabla 2-12: Información y condiciones de amplificación de los loci SSR evaluados en el presente estudio. ........................................................................................................... 17 Tabla 2-13: Parámetros descriptivos para los loci microsatélites evaluados .............. 22 Tabla 2-14: Parámetros de variabilidad y diversidad genética para las zonas geográficas evaluadas. ........................................................................................................................... 23 Tabla 2-15: Variabilidad y diversidad genética dentro de las familias de cada zona geográfica ........................................................................................................................... 24 Tabla 2-16: Coeficientes de diversidad y diferenciación genética de Nei (1987) entre grupos (familias y zonas geográficas) ................................................................................ 26 Tabla 2-17: Análisis de varianza molecular (AMOVA F) .............................................. 26 Tabla 2-18: Estadísticos F (Wright, 1965) de diferenciación genética entre zonas geográficas y familias. ........................................................................................................ 27

Tabla 2-19. Estimadores de flujo génico con base en el valor promedio del número de migrantes ............................................................................................................................ 27 Tabla 2-10: Distancias genéticas. Valores máximos, mínimos y promedios entre pares de zonas geográficas con inclusión y exclusión del grupo de híbridos. ............................ 30 Tabla 2-11. Análisis de Coordenadas principales. Porcentaje de variación explicado por las 3 primeras coordenadas principales basado en diferentes distancias genéticas. ...... 31

Introducción La palma de aceite africana es una monocotiledónea diploide que pertenece a la familia Palmae, género Elaeis y especie E. guineensis. Es una especie perenne, monoica, alógama (Corley y Tinker, 2003), su genoma es diploide y comprende 16 pares de cromosomas (Singh et al., 2008). La distribución geográfica de la palma de aceite se encuentra en la franja ecuatorial y es ampliamente cultivada por su fruto como fuente de aceite. Se cree que su origen está en las tierras bajas tropicales de África occidental y central extendiéndose de los 16°N en Senegal a los 15°S en Angola. Los procesos de dispersión han sido principalmente realizados por el hombre y la polinización es esencialmente entomófila y anemófila (Corley y Tinker, 2003).

La palma de aceite fue introducida a Colombia como cultivo comercial en 1945 y en la actualidad Colombia se ha posicionado como el primer productor de aceite de palma en Suramérica y el quinto en el mundo (Fedepalma, 2010). Debido a la creciente demanda de aceite de palma y el previsible aumento en los costos del cultivo, es necesario poner a disposición de los cultivadores de palma de aceite un material vegetal con mayor potencial genético, que permita una mayor producción y reducción de costos de manejo del cultivo. Las plantaciones comerciales alrededor de mundo y en Colombia se caracterizan por poseer una base genética muy reducida, circunscrita a la limitada diversidad encontrada en las líneas paternas Deli dura y La Me, Yagambi y AVROS, y ante esta situación, el programa de mejoramiento de Cenipalma ha conformado unas colecciones de germoplasma de E. guineensis con el fin de ampliar el acervo genético, para introducir nuevas variantes alélicas que pudieran tener repercusiones favorables en el desempeño agronómico del cultivar en los materiales comerciales de palma de aceite.

Es así como Rey y colaboradores (2004) realizaron colectas de materiales espontáneos en regiones que se postulan como centro de origen. Sin embargo, el conocimiento de la diversidad genética y la estructura poblacional del material colectado permitirá el uso más eficiente del recurso genético existente en el programa de mejoramiento de Cenipalma. La naturaleza perenne del cultivo, implica largos ciclos de selección que involucran amplias áreas experimentales en las cuales se tendría que esperar por lo menos siete años para definir el comportamiento agronómico y seleccionar parentales para el diseño de cruzamientos. Frente a esta situación, el uso de marcadores moleculares podría acelerar los procesos de selección a través de la generación de información que permita determinar la diversidad genética, estructura poblacional y relaciones de parentesco, similitud y origen entre los distintos materiales en diferentes estados de crecimiento y sin el efecto del medio ambiente, permitiendo entender la complementariedad de dichos materiales al momento de planear esquemas de mejoramiento enfocados a dirigir cruces para generar nuevos materiales genéticos comerciales y determinando cómo se integran las colecciones dentro de los programas de mejoramiento y cómo se adaptan las

2 Introducción

estrategias de selección. Esta información, junto con las evaluaciones morfoagronómicas, permitirá un uso racional y sistemático de los recursos genéticos del germoplasma (colección núcleo) de Cenipalma y una selección de parentales Dura y Pisífera que logre combinaciones deseables con el objetivo de obtener materiales comerciales altamente productivos, y de esta manera, incrementar la producción de aceite de palma en el país.

Con el propósito de comprender mejor la diversidad y la estructura genética de la población de estudio, y evaluar la hipótesis de diferenciación genética entre el germoplasma colectados en las diferentes zonas geográficas, es necesario tener en cuenta algunos fenómenos que posiblemente pudieron haber afectado la estructura. En este contexto, es importante tener en cuenta las generalidades de los factores de flujo génico como la polinización, la cual es principalmente entomófila atribuida a los gorgojos de la familia Derelominae (Elaeidobius) y anemófila que desempeña una parte relativamente pequeña en las polinizaciones. Otro aspecto importante es el efecto antrópico en los procesos de dispersión de semillas, sin embargo, algunos autores describen una importante influencia debida que el fruto de la palma es comestible en fresco en las regiones africanas, proceso que ha influido en la dispersión de la especie. Para las zonas de colecta no se tiene ninguna información de factores que pudieran explicar el flujo génico en la región

El objetivo del presente estudio fue evaluar la diversidad y estructura genética de una colección de 455 entradas de E. guineensis de las colecciones de germoplasma de Cenipalma procedentes de cinco zonas contrastantes y representativas del cultivo de la palma en la República de Angola, con 19 marcadores moleculares tipo microsatélite. La información será utilizada en el programa de mejoramiento genético de Cenipalma, el cual será fortalecido por el conocimiento generado en el presente estudio, permitiendo acelerar el proceso de selección de materiales genéticamente distantes para planear cruces adecuados que permitan lograr materiales comerciales altamente productivos y que a su vez, favorezcan la diversidad fenotípica del cultivo.

Objetivos 3

Objetivos

General

Evaluar la diversidad genética y determinar la estructura genética de una colección de 455 entradas de palma de aceite (E. guineensis Jacq.) procedentes de la República de Angola por medio de marcadores microsatélites, con el fin de aportar información a la colección de germoplasma de Cenipalma y su programa de mejoramiento genético.

Específicos

Cuantificar y describir la diversidad genética de una muestra representativa de E. guineensis de la colección de germoplasma procedente de la República de Angola con marcadores tipo microsatélite.

Determinar la estructura genética de las entradas de E. guineensis evaluadas en este estudio.

Evaluar las relaciones genéticas entre las entradas de E. guineensis incluidas en este estudio.

1. Capítulo 1. El cultivo de la palma de aceite y las colecciones de germoplasma

1.1 El cultivo de la palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.)

1.1.1 Generalidades

La palma de aceite africana es una monocotiledónea diploide perteneciente a la familia Arecaceae, sub-familia Cocoidae, género Elaeis y especie E. guineensis. Es una especie perenne, monoica, alógama (Corley y Tinker, 2003), su genoma es diploide y comprende 16 pares de cromosomas, su contenido de ADN nuclear ha sido estimado en 2C= 3.76 pg por citometría de flujo (Rival et al., 1997) con un tamaño de genoma haploide de 1700 Mpb (Singh et al., 2008). El origen de la palma de aceite se ubica en las costas del golfo de Guinea en el África occidental y central, distribuida entre los 11°N y 15°S, desde ahí se expandió en forma natural y con intervención humana. La palma de aceite entró a Asia por Java, en 1848, con cuatro palmas plantadas en el Jardín Botánico Bogor en Indonesia y en Brasil en el siglo XVI con la llegada de los esclavos africanos. El crecimiento del la palma de aceite empezó hacia 1910 en el periodo colonial, en África y en el sureste de Asia. Posteriormente, el desarrollo de la palma se dio junto con el establecimiento de organizaciones de investigación y el establecimiento de colecciones de germoplasma con materiales de las regiones vecinas, el cual se convierte en la base genética para los programas de mejoramiento del mundo. En el 2006, la palma de aceite se convierte en el primer cultivo de oleaginosas en producción superando a la soya (Cochard et al., 2009). Uno de los factores que incrementó significativamente la expansión de la palma fue el descubrimiento de un mejor potencial de producción entre los cruces de origen Africano x Deli (desarrollado en el sureste de Asia). Posteriormente, se implementaron los programas de selección usando solamente recursos genéticos locales, logrando así una ganancia genética rápida. Desde entonces, todos los programas de mejoramiento genético de palma de aceite se han basado en los esquemas de selección recurrente

6 Estructura genética de poblaciones naturales de palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq.) procedentes de Angola

reciproca (SRR) o selección de familias individuales (SFI), en los cuales se han realizado cruces Deli x orígenes africanos (principalmente La Mé o Congo). Muy pocas palmas fundadoras forman la base genética de estos cruces: cuatro Deli, tres para La Mé y alrededor de 10 para Congo. De esta manera, la base genética eficiente es muy estrecha (Cochard et al., 2009). El material comercial de muchas plantaciones en el mundo proviene de estos pocos parentales, situación que en la actualidad genera inconvenientes para el productor. Florentino Clases introdujo la palma africana de aceite a Colombia en 1932. Estas primeras palmas fueron sembradas con fines ornamentales en lugares públicos de algunos pueblos de la región amazónica y en la Estación Agrícola de Palmira, en el Valle del Cauca. Sin embargo, el cultivo comercial de esta planta oleaginosa sólo comenzó años después, en 1945 cuando la United Fruit Company estableció una plantación en la zona bananera del departamento del Magdalena, con plantas procedentes de Honduras. La expansión del cultivo ha variado enormemente en cada uno de los países en donde se ha sembrado la palma (Bernal, 2001).

1.1.2 Tipos de palma

Los tipos de palma africana más relevantes se establecen de acuerdo al grosor del cuesco o endocarpio del fruto, característica relacionada con la producción de aceite. También existe otra clasificación de acuerdo al color del fruto.

Según el grosor del cuesco:

Pisífera (PxP, TxP, TxT). Son palmas cuyos frutos no tienen cuesco, sino un cartílago blando. Los árboles se caracterizan por tener un gran porte y una alta producción de flores femeninas que generalmente no logran culminar la formación de frutos.

Dura (DxD, TxD, TxT). Este tipo de plantas se cultivó comercialmente en el mundo entero hasta finales de la década de los sesenta. Su principal característica es la presencia de un gran cuesco de 2 a 8 mm de espesor en los frutos.

Ténera (DxP, TxD, TxT). Por ser un híbrido proveniente del cruzamiento de Dura por Pisífera, el cuesco del fruto es delgado y la producción de pulpa bastante mayor. Por ende, el contenido de aceite es significativamente más abundante. En un corte transversal de un fruto de Ténera, se observa un anillo de fibras oscuras adyacentes al cuesco que le es característico (Bernal, 2001).

Según el color del fruto:

Frutos nigrescens: son los más comunes, se caracterizan por el color violeta oscuro a negro antes de la maduración y rojo ladrillo en estado de madurez.

Capítulo 1 7

Frutos virescens: son de color verde oliva, que cambia a un claro anaranjado-rojizo cuando maduran.

Frutos albescens: son frutos poco frecuentes, éstos almacenan muy poco o nada de caroteno en el mesocarpio por esto se observan de color blanco o amarillo pálido (Corley y Tinker, 2003).

1.1.3 Usos y productos

La palma de aceite juega un papel muy importante en la economía del país debido a su cultivo para la explotación de aceite de su fruto.

Los productos primarios del cultivo de la palma de aceite son de tres tipos: el aceite que se extrae de la pulpa de la fruta, el que se obtiene de las almendras y la torta que queda del proceso de extracción del aceite de las almendras. El aceite producido en mayor cantidad y más utilizado es el extraído de la pulpa del fruto.

El aceite de palma crudo es utilizado para la fabricación de concentrados animales y para la obtención de ácidos grasos mediante desdoblamiento por hidrólisis. El aceite de palma se fracciona en oleína (liquida) y estearina (sólida), de las que se produce el 56% de los aceites y grasas que se consumen en Colombia (Fedepalma, 2007).

El aceite comestible es materia prima en la industria de alimentos y concentrados para animales. El aceite no comestible es usado en la industria de combustibles, velas, cosméticos y tintas. Otros compuestos del aceite de palma son los oleoquímicos (Fedepalma, 2007) y constituyentes menores como el caroteno vitamina E y esteroles (Corley y Tinker, 2003).

1.1.4 Importancia Económica

La palma de aceite tiene gran importancia económica a nivel mundial debido al alto contenido de aceites en sus frutos, contenido en el mesocarpio (aceite de palma) y en la almendra (aceite de almendra).

En el mundo, el área total en producción de palma de aceite se incrementó pasando de 9.389 millones de hectáreas (mha) en el 2005 a 12.117 mha en el 2009. Indonesia es el país con mayor área en producción registrando 5.350 mha en el 2009 y Malasia posee el mejor rendimiento de aceite de palma crudo obteniendo 4,39 toneladas por hectárea, seguido de Costa Rica con 4,15 ton/hect. (Fedepalma, 2010).

Colombia ocupa el quinto lugar a nivel mundial en área en producción registrando 236 mha para el 2009 y el primero en sur América (Fedepalma, 2010). La producción se encuentra en algunas zonas del país, identificadas por tener las condiciones agroecológicas adecuadas para el cultivo, las cuales se distribuyen en los departamentos Cesar, Atlántico, Guajira, Córdoba, Meta, Casanare, Caquetá, Magdalena, Nariño,


Cauca, Santander, Norte de Santander y Bolívar, conformando las cuatro zonas palmeras de Colombia, las cuales han cambiado su participación en área sembrada debido a la incidencia de la enfermedad de Pudrición del Cogollo (PC) (Fedepalma, 2010).

En los últimos años ha aumentado considerablemente el número de hectáreas sembradas en el país, pasando de 161.210 ha en 2001 a 360.537 ha en el 2009. El área en producción aumentó 7,7% en el 2009, la producción de aceite de palma crudo acumulada en el tercer trimestre (enero/septiembre) del 2009 fue de 620.950 toneladas, cayendo 1,8% por debajo de la producción del mismo periodo en el 2008, lo cual significa un cambio en la tendencia de crecimiento que se venía presentado desde el año 2002. En el rendimiento promedio de aceite de palma por hectárea desde el 2004 cuando se alcanzó 4,1 toneladas por hectárea (t/ha), se ha observado una tendencia al descenso pasando de 3,5 t/ha en el 2008 a 3,4 t/ha en el 2009. Así mismo, la producción nacional de aceite de palma crudo redujo su crecimiento promedio anual de 6% en 2008 a 3,2% en 2009 (Fedepalma, 2010). Esta tendencia afecta de manera importante la economía del país ya que el producto interno bruto (PIB) en el tercer trimestre de 2010 presentó una reducción de la producción respecto al 2009 de -4,0% para palma y soya (Agronet, 2010). Estos descensos son atribuidos a algunos factores como la propagación de enfermedades especialmente la alta incidencia de PC y problemas fitosanitarios en algunas zonas, el cambio en la estructura de edades del área productiva, el ingreso de nuevos palmicultores que no han afianzado el manejo eficiente de sus cultivos, y las condiciones climáticas adversas (Fedepalma, 2010; Agronet, 2010).

El consumo aparente de aceite de palma en el mundo aumentó 27,4% y en el país aumentó 32,2% en 2009, principalmente debido a la demanda para fabricación de biodiesel, que absorbió 153.496 toneladas (Fedepalma, 2010). De acuerdo a los estimativos de crecimiento poblacional para el año 2020, se espera que el consumo mundial de aceite de palma sea de 37,9 millones de toneladas, representando una tasa de crecimiento promedio anual de 3,3%. Dada esta dinámica de crecimiento del aceite de palma, la metas nacionales en área sembrada para el 2020 son de 996.296 ha con una producción de 3.383.892 toneladas, metas que solo se podrán cumplir con materiales comerciales de alta producción y rendimiento.

1.2 Colecciones genéticas ex situ de palma de aceite (CENIPALMA)

Los bancos de germoplasma en el mundo son un recurso creado para ampliar la base genética de los cultivos y conservar buena parte de la variabilidad genética existente, caracterizando agronómica y morfológicamente materiales con uso potencial en fitomejoramiento, debido a que las líneas paternas de las plantaciones comerciales, no poseen algunos caracteres genéticos de interés agronómico y tienen una limitada variabilidad (Rey et al., 2004).

Capítulo 1 9

Cenipalma en el año 2002 inició la conformación de una colección de germoplasma de palma de aceite en el centro experimental “La Vizcaína” ubicado en zonas rurales de Barrancabermeja. La colección genética de Cenipalma cuenta con dos especies de interés económico: palma africana (Elaeis guineensis Jacq.) y palma americana o noli (Elaeis oleifera H.B.K.).

La palma americana está representada en la colección por entradas (una entrada está definida como una palma que conforma la colección de germoplasma) colectadas en el trapecio amazónico entre Leticia y San Juan de Atacuarí constituyendo 13 poblaciones, 92 familias y 137 entradas, y por 10 poblaciones y 250 entradas provenientes de la Costa Norte, del Valle del Río Sinú, la Amazonía y el Magdalena medio (Rey et al., 2003, 2004). La palma americana es considerada en la colección de germoplasma como una fuente valiosa de variabilidad genética en los programas de fitomejoramiento para solucionar algunos de los problemas fitosanitarios y de calidad de aceite que presenta la palma de aceite comercial, y que se están solucionando con el uso de híbridos interespecíficos OxG (Meunier, 1991 citado por Rey et al., 2004). Rey y colaboradores en 2004 publicaron la caracterización realizada para componentes de producción y calidad de aceite, vitamina E y otros metabólitos, de una muestra representativa de la colecta donde se evidenció una variabilidad interesante.

La palma de aceite E. guineensis es de origen africano y es en África donde se encuentra la mayor variabilidad genética de esta especie, motivo por el cual Cenipalma, en convenio con el Instituto Nacional del Café (Inca) de la República de Angola, hicieron colectas en zonas contrastantes y representativas en las cuales la palma de aceite se encuentra en forma espontánea. Esto, con el fin de obtener buena parte de la variabilidad genética existente en este país para mejorar las bases genéticas de las poblaciones actuales, y de esta manera obtener nuevos materiales comerciales con bases genéticas amplias que le confieran mayor estabilidad ante los factores ambientales adversos. Esta especie está representada en la colección por material genético de Angola distribuido en 20 poblaciones, 38 familias y 4876 entradas, y de Camerún distribuido en 18 poblaciones, 72 familias y 3500 entradas.

La colección genética palma cuenta con material genético mejorado Dura, Pisífera, híbridos interespecíficos comerciales y materiales genéticos utilizados como parentales en los diferentes cruces. Para caracterizar el material genético existente en la colección genética de palma de aceite, Cenipalma ha implementado a través de diferentes líneas de investigación estudios genéticos, bioquímicos, moleculares, fisiológicos y de reacción a plagas y enfermedades.

El germoplasma de la República de Angola fue establecido en campo bajo una estructura poblacional que ha permitido identificar después de tres años de evaluaciones morfoagronómicas, variaciones muy importantes entre las características de interés agroindustrial, como las altas producciones de racimos de fruta fresca (RFF) (40 ton/ha/año) y contenido de aceite en pulpa (CAP) (7,5 tonpalma/año), dado por altos porcentajes de pulpa en fruto (75% en familias duras y 95% en familias teneras), bajas tasas de crecimiento (30cm/palma año), estípite largo (40cm) para facilitar la cosecha, altos contenidos de carotenos, tocoferoles y tocotrienoles. Estas características han permitido establecer líneas de mejoramiento por características y combinaciones de ellas, es así que se tienen familias de alta producción de aceite y lento crecimiento, familias con alto contenido de ácidos grasos insaturados similares al híbrido OxG es decir, alto acido oleico, la asistencia en la selección dada por los marcadores


moleculares busca dentro de estas familias evidenciar la variabilidad genética existente con el fin de garantizar un avance genético significativo y determinar los ciclos de selección recurrente necesarios para agotar la varianza aditiva (Comunicación personal Rey, 2011).

.

2. Capítulo 2. Diversidad y estructura genética de E. guineensis de la república de Angola

2.1 Marcadores moleculares y estudios de diversidad genética en palma de aceite. Antecedentes

Los marcadores moleculares son etiquetas de ADN utilizadas para identificar y evaluar los genes de interés en una planta. Son neutros con respecto al medio ambiente y pueden detectarse en cada etapa del crecimiento de la planta, particularmente útiles en especies perennes con tiempo generacional largo, ya que permiten pruebas de selección temprana en material mejorado (Billote et al., 2007).

Los estudios de diversidad genética han dado un entendimiento general de la estructura genética, a través de uso de marcadores isoenzimáticos (Hayati et al., 2004) y marcadores moleculares.

Inicialmente los marcadores moleculares fueron utilizados en Malasia y Reino Unido a principio de la década de los noventa en estudios de diversidad genética utilizando RFLP (Restriction Fragment length polymorphism) (Cheah et al., 1991; Barcelos et al., 2002; Maizura et al., 2006), RAPD (Random Amplification of polymorphic DNA) (Shah et al., 1994) y AFLP (Amplified Fragment length polymorphism) (Purba et al., 2000; Singh et al.,1998; Barcelos et al., 2002), en pruebas de genotipificación de entradas de E. guineensis y E. oleifera (Jack et al., 1995; Mayes et al., 1996), en la búsqueda de marcadores de genes (ADNc) comprometidos en el desarrollo floral (Singh y Cheah, 2000), en el control genético de enzimas de la biosíntesis de ácidos grasos (Rashid y Shan, 1996; Shah y Cha, 2000), en la búsqueda de variantes somaclonales (Paranjothy et al., 1993; Chowdhury, 1993; Rival et al., 1998) y en la detección de tolerancia a la pudrición del cogollo (Ochoa et al., 1997). Se han realizado trabajos de cartografía genética con marcadores moleculares inicialmente con RFLP (Mayes et al., 1997), RAPD (Moretzsohn et al., 2000) y posteriormente con SSR (Sequence Simple Repeat) (Billote et al., 2005).

Estos estudios han demostrado la utilidad de los marcadores moleculares en la


evaluación de la diversidad genética, para el manejo de cultivares y establecimiento de colecciones núcleo para la conservación ex situ del acervo genético de la palma de aceite (Singh et al., 2008).

Los marcadores microsatélites (Simple Sequense Repeats: SSR) son arreglos de secuencias de nucleótidos repetidos consecutivamente en el genoma, se presentan en motivos di, tri o tetranucleotidos y están presentes en todos los organismos (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Estos marcadores han sido ampliamente utilizados en muchas especies por ser considerados ideales en trabajos de identificación varietal, análisis de pedigrí, cartografía de genomas y detección de QTL para el mejoramiento asistido por marcadores, mapeo genético, medidas de diversidad y estructura poblacional, debido a que son altamente variables y permiten distinguir entre cultivares estrechamente relacionados (Mohammadi y Prasanna, 2003; Billote et al., 2007). En palma de aceite, de todos los marcadores moleculares existentes para la evaluación de germoplasma, los SSR parecen ser los más promisorios para el entendimiento de la estructura genética poblacional y el flujo génico debido a que presentan herencia mendeliana (Billote et al., 2007), alta reproducibilidad, co-dominancia, naturaleza multialélica, son abundantes y ampliamente distribuidos en el genoma, son de detección simple por medio de PCR y son fácilmente transferibles entre laboratorios (Singh et al., 2008).

El uso de SSR para evaluar germoplasma de E. guineensis ha sido descrito por Billote y colaboradores quienes en el 2001 reportaron 20 secuencias de marcadores SSR y posteriormente en el 2005 publicaron el uso de marcadores SSR en la construcción de un mapa de ligamiento de alta densidad basado en microsatélites. En este estudio se utilizaron 390 marcadores SSR y AFLP permitiendo la construcción de un mapa de ligamiento constituido por 288 SSR, 688 AFLP y el locus del gen Sh. Los marcadores se distribuyeron en 16 grupos de ligamiento con una longitud de 1,743 cM. Este trabajo constituye el primer mapa con los grupos de ligamiento igual al número de cromosomas y un avance importante para el análisis de QTL (Quantitative trait loci).

En el 2005 Montoya y colaboradores estimaron la diversidad genética e infirieron la estructura genética de 48 entradas procedentes de Angola pertenecientes a 6 poblaciones con 20 combinaciones de marcadores SSR. En este estudio se identificaron 69 alelos, una diversidad genética estimada en términos de heterocigosidad esperada (He) de 0,45 y un índice de endogamia global FIS de -0,0604, presentando un leve exceso de heterocigotos. La diferenciación genética entre poblaciones fue baja (FST= 0,0836) y el flujo génico estimado entre poblaciones fue alto (Nm= 2,73). Bakoumé y colaboradores (2007) determinaron la diversidad alélica dentro de 4 poblaciones naturales que representan 10 países africanos, 3 materiales mejorados y 1 material semi-silvestre mediante 16 loci SSR. En este estudio se detectaron 209 alelos. Se encontraron alelos poco comunes en poblaciones de áreas con clima seco, sin tener en cuenta el país. Los alelos excepcionales DeliMPOB, eran poco comunes en poblaciones naturales de palma de aceite, presentaban una reducción debido a los muchos años de selección. El número medio de alelos osciló entre 1,1 y 1,67. El número efectivo de alelos (Ae) osciló entre 1,1 y 4,7. Singh y colaboradores (2008), usaron etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) de palma de aceite para buscar marcadores SSR. Diez marcadores ESTs-SSR fueron

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desarrollados y usados para evaluar 76 muestras de palma de aceite de 7 países de África y una población estándar de Deli dura. El número promedio de alelos observados y Ae fue de 2,56 y 1,84, respectivamente. Los marcadores ESTs-SSR fueron polimórficos presentando un PIC (contenido de información polimórfica) de 0,53. La diferenciación genética (FST= 0,249) entre poblaciones indicó un alto nivel de divergencia genética. El análisis UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) reveló una fuerte asociación entre distancia genética y localización geográfica de la poblaciones estudiadas. El germoplasma evaluado presentó alta diversidad comparado con Deli dura. Las poblaciones de Nigeria, Congo y Camerún mostraron alta diversidad. Los resultados del estudio mostraron el potencial de los ESTs-SSR, en estudios de diversidad, estructura poblacional y análisis de filogenia. Cochard y colaboradores (2009) analizaron 318 individuos de 26 orígenes y 8 países con 14 marcadores microsatélites. Con el propósito de describir la estructura de los recursos genéticos involucrados en la historia del mejoramiento de la palma en relación a los orígenes africanos subespontáneos. Los datos revelaron dos grupos originales, el grupo I formado por África occidental y “Benin-Nigeria-Camerum-Congo-Angola” formando el grupo II. El tercer grupo Deli es derivado del grupo II, resultado de la selección artificial. Con los resultados obtenidos se propuso una estrategia de selección basada en la complementariedad de los grupos genéticos africanos, donde fueron sugeridos los cruces (Deli x grupo II) x Grupo I.

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Lugar del estudio

El análisis de las muestras se realizó en el laboratorio de biología molecular (LBM) de Cenipalma (Bogotá).

2.2.2 Material vegetal y zona de estudio

Las 455 entradas (una entrada está definida como una palma que conforma la colección de germoplasma) utilizadas en este estudio representan una muestra significativa (10%) del germoplasma colectado en Angola y establecido en el Centro Experimental La Vizcaína ubicado en el departamento de Santander.

Este recuso genético de E. guineensis fue colectado por Rey et al., (2004) en la República de Angola bajo el marco de un convenio entre el Instituto Nacional del Café (Inca) de la República de Angola y Cenipalma, con el fin de obtener buena parte de la variabilidad genética existente en este país para mejorar la base genética de las poblaciones comerciales actuales. La colecta se realizó en cinco regiones naturales consideradas zonas contrastantes y representativas del cultivo de palma de aceite E. guineensis, donde se encontró como poblaciones espontanéas. Al momento de la


colecta se realizó una caracterización in situ, de 17 características morfoagronómicas entre las cuales están el contenido de la pulpa en el fruto, peso medio del racimo, forma del racimo, presencia de espinas, color de frutos, altura de la palma, entre otras características. Se presentaron diferencias significativas para el contenido de mesocarpio en fruto, entre las zonas de colecta con una variación entre 31 y 67% (tipo Dura) y entre 60 y 77% (tipo Ténera), este criterio fue tenido en cuenta al realizar la colecta (Rey et al, 2004). De las zonas analizadas en este estudio se desconoce información acerca del aprovechamiento y actividades culturales que involucren el transporte de semillas de una región a otra.

Según Rey et al. (2004), las zonas se encuentran localizadas entre los 5,5° y 12° de latitud sur, entre la zona desde el litoral hasta la montaña, con regímenes climáticos contrastantes, así (Figura 2-1):

Caixito (1). Presenta alturas entre los 250 y 400 msnm, con pluviometría bimodal entre 600 y 900 mm al año y temperaturas entre 23 y 26°C, clima subhúmedo seco a semiárido de litoral bajo. La vegetación es de sabana arbóreo-arbustiva y suelos ferralíticos.

Sumbe (2). Comprendida entre los 0 y 250 msnm, precipitación monomodal entre 300 y 600 mm, temperaturas entre 24 y 26°C, clima árido a semiárido, suelos de vega sedimentarios y arídicos tropicales, pardo anaranjados, con vegetación de sabana arbórea.

Cabinda (3). Zona de sublitoral, muy accidentada con alturas entre los 400 y 1.000 msnm, clima húmedo, con precipitaciones anuales entre 900 y 1.400 mm y temperaturas entre 22 y 25°C, vegetación densa y siempre verde, intercalada con pequeñas sabanas arbustivas – arbóreas, con suelos ferralíticos. Zona de colecta en el extremo norte de Angola.

Benguela (4). Comprendida entre los 0 y 250 msnm, precipitación monomodal entre 300 y 600 mm, temperaturas entre 24 y 26°C, clima árido a semiárido, suelos de vega sedimentarios y arídicos tropicales, pardo anaranjados, con vegetación de sabana arbórea. Zona de colecta en el extremo sur de Angola.

Uige (5). Presenta alturas sobre el nivel del mar entre 600 y 900 metros, con clima húmedo megatérmico, con dos estaciones de lluvias bien definidas, precipitaciones pluviales entre 1.300 y 1.400 mm al año y temperaturas entre 23 y 24°C, la vegetación es de sabana arbórea, con galerías de selva densa y húmeda y suelos ferralíticos.

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Figura 2-1: Distribución geográfica de las cinco zonas de colecta de E. guineensis en la República de Angola.

Rey et al. (2004) realizaron la colecta bajo un diseño genético estructural el cual posee tres niveles jerárquicos. El primer nivel conformado por cinco zonas geográficas, el segundo por las familias colectadas cada zona y el tercero los individuos (frutos) de cada racimo. En la palma de aceite, cada racimo es una familia polihíbrida de medios hermanos formados a través de polinización abierta, donde se conoce solamente la identidad del progenitor femenino, ya que el polen proviene de cualquier palma circundante (Tabla 2-1). Las 455 entradas analizadas incluyen material genético tipo Dura y Ténera (Anexo A). Se incluyó en el estudio un grupo de 9 híbridos interespecíficos (HB) (Elaeis oleifera x Elaeis guineensis) para fines de comparación en los análisis de distancias genéticas.


Tabla 2-1: Información de la estructura de la colecta y número de entradas evaluadas.

ZONA GEOGRÁFICA

FAMILIAS Muestras Vegetales (cód. Laboratorio)

TOTAL INDIVIDUOS

1. Caixito 9 127 al 214 88 2. Sumbe 9 215 al 315 100

3. Cabinda 11 317 al 435 119 4. Benguela 6 436 al 494 58

5. Uige 10 496 al 585 90 6. HB - 1 al 9 9

TOTAL 45 - 464 Fuente: Programa de Biología y Mejoramiento Genético de Cenipalma

2.2.3 Análisis molecular

Extracción de ADN La extracción de ADN genómico total se realizó a partir de tejido foliar joven de palma de aceite (E. guineensis Jacq.) utilizando el kit de QIAGEN DNeasy® Plant Mini y siguiendo las recomendaciones del fabricante. La cuantificación del ADN extraído se realizó mediante un espectrofotómetro y la calidad del ADN se verificó utilizando el método comparativo de electroforesis en gel de agarosa. Amplificación de microsatélites (SSR) Para desarrollar la técnica de marcadores moleculares microsatélites se seleccionaron 19 loci y se amplificaron bajo las condiciones reportadas por Billote et al. (2001) y Singh et al. (2008) (Tabla 2-2).

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Tabla 2-22: Información y condiciones de amplificación de los loci SSR evaluados en el presente estudio.

A: alelos detectados por marcador, TA: Rango del tamaño de los alelos en pares de bases. Fuente: Billote et al. (2001) y Singh et al. (2008)

Para la amplificación de las muestras se optimizaron las condiciones de amplificación reportadas por los autores para algunos de los loci. En general, las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 15 µl que contenían 20 a 30 ng de ADN, 1X de buffer (100 mM Tris-HCl pH 8,8, 500 mM KCl) para PCR, 2 ó 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,15 uM de cada marcador (“forward” y “reverse”) y 0,5; 1 ó 1,5 µl de Taq polimerasa dependiendo del marcador. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador iCycler 1000 de BioRad. Las temperaturas utilizadas para los loci fueron 2 minutos a 94ºC, seguidas de 30 ciclos a 94ºC por 30 s, 1 minutos a 52ºC y 30 s a 72ºC y 10 minutos a 72 ºC de extensión.

El producto de amplificación fue detectado en geles denaturantes de poliacrilamida 6%, urea 5M, en cámaras de secuenciación BioRad y visualizado mediante tinción en nitrato de plata y revelado con carbonato de sodio (Anexo B). El marcador de peso molecular utilizado fue de 10 pares de bases (pb) (invitrogen, cat. No. 10821-015), el cual determinó fragmentos entre 10 pb y 330 pb, rango en el cual se encuentran todos los fragmentos amplificados.

CÓD. LOCUS A TA MOTIVO Secuencia del Cebador (5'-3')

Forward Reverse PR01 mEgCIR0008 6 195–220 (GA)18 CGGAAAGAGGGAAGATG ACCTTGATGATTGATGTGA

PR02 mEgCIR0009 4 162–204 (GA)20 CAGTCTTTAAGTACGGCTATGAT

GAATTTTTAGTTCAACCAGGTAGA

PR03 mEgCIR0018 11 158–177 (GA)18 CCTTATTTTCTTTGCTTACC TTCTATTTTATTTTCTTCCT

PR04 mEgCIR0046 5 198–262 (GA)19 AGCCTTAGTATTTTGTTGAT CCTCTGATTTGTCCTTTTGG

PR05 mEgCIR0067 8 135–187 (GA)17 TACACAACCCATGCACAT AAAAACATCCAGAAATAAAA

PR06 mEgCIR0219 7 205–233 (GA)17 TTTGCTCGGCGGATACAT CTCACTGGCCTCTTTCTT

PR07 mEgCIR0221 7 195–213 (GA)11 TGCCATGTTCCAGAGAGC TTCAGATTTTTCCGACTTC

PR10 mEgCIR0304 1 275–281 (GT)4(GC)2(GT)2

CCACAAACAATCCAAGCAAGT TGGCATACACGAAAGCATAA

PR11 mEgCIR0326 1 131–147 (GT)9 GCTAACCACAGGCAAAAACA AAGCCGCACTAACATACACATC

PR12 mEgCIR0332 4 269–281 (GT)8 ATTTCGTAAGGTGGGTGT CCTCCAAACTCCTCTGT

PR13 mEgCIR0350 4 80–102 (GT)8 AAATCCTAAATCCTAAACTC TCTACCTGTACTGGTGACAA

PR16 mEgCIR1772 12 293–297 (GT)22 ACCTTGTATTAGTTTGTCCA CTTCCATTGTCTCATTATTCTCTTA

PR23 sEg00066 10 192-215 (AT)9 TTGCTCCAACTGACTGATGC ACATTCCAGATCCCAGCAAG

PR24 sEg00067 4 150- 170 (TGTA)6 GTCAGCCCGTAGAAGATTGC CTTTCGGATAGCCAAAACGA

PR27 sEg00090 8 200–210 (AT)9 TATGCGGGTGATCAAGTGAA CCACCATGGTTCTCAGGAAA

PR28 sEg00125 4 152- 170 (GCG)6 TACCCTTTTCCCTCCCTCCATA

CATCATCTCCGTTGCCAGTATT

PR29 sEg00126 2 212–215 (CGC)7 CCGTCTCAAAAGCCCTAAAC TTGTTGTCCCACTCCCTCTT

PR31 sEg00140 5 210–226 (GA)10 AAGTGAGACGGTGGATTTGG GTTCCAGTTGTCCTCGCATT

PR37 mEgCIR3282 12 232-272 (GA)20 GTAACAGCATCCACACTAAC GCAGGACAGGAGTAATGAGT


Para la electroforesis, se llevó a cabo una fase de precorrido de 20 minutos, posteriormente el corrido electroforético se realizó durante 1 hora y 30 minutos a 80W. El tiempo de corrida difirió según el tamaño del fragmento. Se generó registro fotográfico para cada gel y la lectura de los alelos fue realizada visualmente y registrada en matrices digitales.

2.2.4 Análisis de datos

Las matrices fueron codificadas para ser analizadas en los diferentes programas de computador.

Los loci monomórficos no fueron incluidos en la descripción y cuantificación de la diversidad genética, teniendo en cuenta los siguientes parámetros: número de individuos evaluados por locus (N), número de alelos por locus (A), número de alelos efectivos por locus (Ae), heterocigosidad observada (Ho), heterocigosidad esperada (He) de Nei 1978, alelos privados por zona geográfica (APP), porcentaje de loci polimórficos (%P), riqueza alélica (Ra) Índice de fijación (F) y número total de alelos, estimados con los algoritmos incluidos en el programa GenALEX 6.1 (Peakall y Smouse, 2006). Se estimó el contenido de información polimórfica promedio (PIC), el cual mide la diversidad alélica de un locus, estimando y comparando el poder de discriminación de los marcadores moleculares (Botstein et al., 1980). El test exacto de equilibrio Hardy-Weinberg (EHW) (Guo y Thompson, 1992) fue realizado tomando como unidades de análisis las zonas geográficas basado en 1000 permutaciones. Se evaluó el desequilibrio de ligamiento entre pares de loci basado en 1000 permutaciones utilizando el programa Arlequín versión 3.1.1 (Excoffier, 2006).

La estructura y diferenciación genética entre las zonas geográficas se calculó mediante los índices F (FST, FIS y FIT) y sus diversas maneras de estimación (Nei, 1987; Wright 1946, 1951 y 1965). El test estadístico de significancia para estos índices se basó en 30000 cadenas de Markov de genotipos multilocus entre pares de zonas geográficas y familias utilizando el programa Arlequín versión 3.1.1 (Excoffier, 2006). El parámetro Nm (número de migrantes) se estimó a partir del estadístico FST (Nei, 1987). Para evaluar la estructura genética de la muestra se realizó además, en un contexto jerárquico, un Análisis Molecular de la Varianza (AMOVA) a partir del cual se calcularon los estadísticos FST, cuya significancia estadística se obtuvo a partir de 999 permutaciones, incluyendo como fuentes de variación los individuos, las familias y las zonas geográficas, mediante el uso del programa GenALEX 6.1 (Peakall y Smouse, 2006) y Arlequín versión 3.1.1 (Excoffier, 2006).

Incluso en ausencia de discontinuidades geográficas extremas en el flujo génico, la conectividad limitada entre subpoblaciones distribuidas continuamente podrían producir patrones de aislamiento por distancia (IBD), donde la divergencia subpoblacional aumenta con la distancia geográfica (Wright, 1943). Para evaluar la posible influencia de procesos de IBD, se realizó un análisis usando el coeficiente de Mantel para probar la hipótesis nula de no asociación entre divergencia genética y distancia geográfica. Para este análisis, se usaron matrices de FST y FST linearizado (Slatkin, 1995) como medida de

Capitulo 2 19

divergencia genética entre pares de zonas geográficas estimadas con el programa Arlequín versión 3.1.1 (Excoffier, 2006), y una matriz de distancias geográficas en kilómetros entre los lugares de colecta estimada usando distancias euclidianas. La significancia del test se realizó a partir de 10000 permutaciones con el programa IBMWS versión 3.16 (Jensen et al., 2005)

Para explorar la estructura poblacional sin asumir poblaciones a priori se utilizó el programa Structure 2.3 (Pritchard et al., 2010), el cual implementa un modelo bayesiano basado en un algoritmo de agrupamiento. Sus aplicaciones incluyen la deducción de la presencia de poblaciones distintas, para asignar individuos a las poblaciones. En este análisis se intenta estimar el número más probable de grupos (K) en la muestra minimizando las desviaciones al equilibrio Hardy-Weinberg y al equilibrio de ligamiento dentro de cada grupo y asignando los individuos a un número K de poblaciones. El método emplea un algoritmo Monte Carlo de cadenas de Markov (MCCM) para estimar las frecuencias alélicas en cada uno de los K, y para cada individuo, la proporción de su genoma derivado de cada población (qK). El análisis se realizó inicialmente sin asumir poblaciones a priori y posteriormente incluyendo información del origen de colecta. Los parámetros de corrida fueron 100000 de burnin y 2000000 de iteraciones de MCCM, bajo un modelo de mezcla y de frecuencias alélicas correlacionadas. También se calculó el K según Evanno et al. (2005) utilizando 5 iteraciones y explorando de 2 a 20 K. Finalmente se realizó un análisis de coordenadas principales (ACoP) a partir de 1000 permutaciones utilizando como unidades de análisis los individuos con el programa DARwin versión 5.0. 158 (Perrier y Jacquemoud-Collet, 2009) y posteriormente utilizando las zonas geográficas como unidad de análisis con el programa GenAIEX 6.1 (Peakall y Smouse, 2006).

Para evaluar las relaciones genéticas entre individuos y zonas geográficas se utilizaron dos tipos de análisis descriptivos a partir de la estimación de distancias genéticas. Las distancias genéticas son una medida de disimilaridad entre los individuos o grupos evaluados de la misma o diferentes especies. Se estimaron diferentes distancias entre las que están la distancia genética estándar de Nei (DSG) (1972), distancia cuadrática media (ASD) (Goldstein, 1995b y Slatkin, 1995) y la distancia d2 (Goldstein 1995a). Las últimas dos distancias mencionadas asumen modelos mutacionales para loci microsatélites. También se estimó la distancia geométrica de Cavalli-Sforza y Edwards (1967) usando el programa MSA 4.05 (Dieringer y Schlötterer, 2003). El análisis coordenadas principales (ACoP) se realizó utilizando como unidades de análisis los individuos para estimar una matriz de disimilaridad calculada con el índice de concordancia simple basado en 1000 permutaciones con el programa DARwin versión 5.0.158 (Perrier y Jacquemoud-Collet, 2009) y posteriormente se realizó nuevamente utilizando las zonas geográficas como unidades de análisis con el programa GenAIEX 6.1 (Peakall y Smouse, 2006). El segundo fue la reconstrucción de topologías utilizando el método de agrupamiento Neighbour-joining usando un bootstrap de 1000 réplicas con el programa Phylip versión 3.69 (Felsenstein, 2005). La significancia de los nodos en las topologías solo fue tenida en cuenta para valores superiores al 50%.


2.3 Resultados

2.3.1 Extracción de ADN genómico

Se extrajo ADN de 464 entradas de E. guineensis con el kit de QIAGEN DNeasy® Plant Mini, con el cual se obtuvo ADN de calidad adecuada para el uso de la técnica de microsatélites. La calidad y concentración de ADN visualizada en el gel arrojó concentraciones entre 30 y 100 ng/µl (Figura 2-2):

Figura 2-22: Geles de agarosa (0,8%). ADN de palma E. guineensis extraído con el kit de QIAGEN DNeasy® Plant Min

2.3.2 Datos faltantes

Los datos faltantes de genotipos en los loci no superaron el 1% para cada marcador en toda la muestra de estudio, con excepción de los loci PR03, PR04 y PR05, los cuales fueron descartados del análisis. Las entradas colectadas fueron codificadas con los números consecutivos desde el 127 al 585, sin embargo, en este estudio las entradas 314, 316, 466 y 495 no fueron incluidas por falta del material vegetal al momento de la colecta. La información de pasaporte de cada entrada fue registrada y almacenada en la base de datos del laboratorio.

Capitulo 2 21

2.3.3 Diversidad alélica

Se evaluaron 19 loci, solo para 16 visualizaron perfiles genéticos claramente diferenciables (Anexo B). Los loci PR03, PR04 y PR05 presentaron porcentajes de amplificación muy bajos, por esta razón, no se incluyeron en los análisis. De los 16 loci amplificados, 13 mostraron ser polimórficos. Tres fueron monomórficos (PR10, PR11 y PR12) con los cuales se detectó 1 alelo por locus, estos loci no fueron incluidos en el análisis de datos.

Los loci microsatélites son conocidos por presentar un gran número de alelos y los parámetros que describen la diversidad detectada por los loci se presentan en la Tabla 2-¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.3. Un total de 79 alelos fueron detectados con los 13 loci microsatélites evaluados en las 455 entradas, con un promedio de 5,61 alelos por locus. El porcentaje de amplificación para la mayoría de los loci fue del 100% exceptuando el locus PR23 (95,6%). El número máximo de alelos detectados fue de 9 alelos para los loci PR37 y PR23, el mínimo fue para los loci PR10, PR11 y PR12, en los cuales se detectó un solo alelo. El nivel de polimorfismo entre las 455 entradas de Angola fue evaluado con el índice de información polimórfica (PIC) para cada locus. El PIC mostró un valor máximo de 0,843 para el locus PR16 y un valor mínimo de 0,240 para el marcador PR28, con un promedio de 0,533. Según los valores reportados en la Tabla 2-3, se puede decir que los loci más informativos en esta población son el PR16, PR23 y PR37 y los menos informativos fueron los loci monomórficos (PR10, PR11 y PR12), seguidos de PR28, PR31 y PR29. Los loci con mayor número de alelos efectivos (Ae) se correlacionan con los mayores PIC y viceversa.

El máximo número de alelos efectivos detectado fue de 7.107 en el locus PR16 de un total de 8 alelos identificados y el mínimo fue de 1,3 para el locus PR28. La máxima heterocigosidad observada fue detectada en el locus PR16 (0,781) y el mínimo valor en el locus PR28 (0,209). La riqueza alélica (Ra), basada en la estimación de las variantes alélicas por locus, osciló entre 1,995 y 6,093, con un promedio de 3,636.

El análisis del equilibrio de Hardy–Weinberg (EHW) en una población nos permite inferir si las frecuencias alélicas evaluadas cumplen el modelo bajo asunciones como que el organismo sea diploide, reproducción sexual, generaciones no sobrelapadas, frecuencias alélicas iguales en hembras y machos, apareamiento al azar, tamaño poblacional infinito, ausencia de migración, mutación y que los loci evaluados no estén bajo selección (Hartl y Clark, 1997). El conocimiento de la biología de la especie nos permitirá inferir acerca de los posibles procesos evolutivos y biológicos que dentro de la población pudieron llevarla al desequilibrio. El test exacto de EHW fue significativo a un nivel del 0,05 para la mayoría de los loci, rechazando la hipótesis nula. Los loci PR01, PR02, PR07, PR013, PR024, PR27 y PR31, mostraron valores de probabilidad que oscilaron entre 0,136 y 0,999, interpretados como no significativos para rechazar la hipótesis nula de equilibrio HW. El desequilibrio presentado en los otros loci es debido a un leve déficit de heterocigotos detectados en la muestra, sugiriendo la ausencia de apareamiento aleatorio. El test exacto de desequilibrio de ligamiento (DL) global (Anexo C) mostró un desequilibrio significativo para el 56,4% de los pares de loci, lo cual indica no independencia entre los loci evaluados. Todas las zonas geográficas presentaron un DL significativo en algunos pares de loci, principalmente Sumbe (36) seguida de Caixito, Cabinda, Uige y Benguela (29, 24, 23 y 8), respectivamente.


El índice de Fijación FIS muestra un exceso significativo de homocigotos detectados para los loci PR06, PR16, PR23, PR28, PR29 y PR37 y exceso no significativo de heterocigotos para los loci PR02, PR24, PR27 y PR31.

Tabla 2-33: Parámetros descriptivos para los loci microsatélites evaluados

Locus N A PIC Ae Ho He Ra FIS P<0,05

PR01 442 7 0,644 3,110 0,649 0,678 4,317 0,029 0,136

PR02 444 5 0,534 2,427 0,568 0,588 3,473 0,021 0,214

PR06 455 7 0,645 3,284 0,505 0,696 4,059 0,251 0,001

PR07 455 5 0,457 2,075 0,501 0,518 2,869 0,026 0,246

PR13 455 4 0,441 1,971 0,545 0,493 2,878 -0,174 0,999

PR16 453 8 0,843 7,107 0,781 0,859 6,093 0,059 0,002

PR23 435 9 0,836 6,818 0,779 0,853 6,014 0,070 0,001

PR24 455 3 0,442 2,161 0,580 0,537 2,506 -0,075 0,979

PR27 455 4 0,460 1,983 0,484 0,496 3,138 0,017 0,350

PR28 455 5 0,240 1,332 0,209 0,249 2,293 0,138 0,003

PR29 455 2 0,352 1,838 0,277 0,456 1,995 0,388 0,001

PR31 455 5 0,298 1,458 0,332 0,314 2,528 -0,088 0,993

PR37 452 9 0,741 4,327 0,695 0,769 5,110 0,082 0,001

PROMEDIO 451,2 5,61 0,533 3,069 0,531 0,577 3,636 0,057 0,001

N: número de individuos evaluados por locus, A: número de alelos detectados por locus, Ae: número efectivo de alelos, PIC: indice de información polimórfica, Ho: hetetocigosidad observada, He: heterocigosidad esperada, Ra: riqueza alélica, P<0,05: probabilidad del equilibrio Hardy-Weinberg estadísticamente significativa menor de 0,05, Fis: índice de Fijación

2.3.4 Diversidad genética en las zonas geográficas

La diversidad genética es un atributo que mide la frecuencia esperada de heterocigotos en las poblaciones, independiente de su sistema de apareamiento. La diversidad genética dentro de las cinco zonas geográficas es presentada en la Tabla 2-4. Los 13 loci evaluados fueron polimórficos en todas las zonas geográficas, el porcentaje de loci polimórficos (%P) para todas las zonas geográficas fue de 100%. El número promedio de alelos por locus (A) dentro de cada zona geográfica varió entre 5,308 y 4,846, mientras que el número de alelos efectivos por zona geográfica (Ae) osciló entre 2,998 y 2,780, con un promedio de 2,846. La máxima heterocigosidad observada fue detectada en Uige (0,612) seguida por Benguela (0,586), Cabinda (0,517), Caixito (0,496) y finalmente Sumbe (0,474) que presentó la heterocigosidad observada más baja. El promedio de la heterocigosidad esperada (He) a través de las zonas geográficas fue de 0,561. Estos valores muestran que la magnitud de la diversidad genética a lo largo de las cinco zonas geográficas fue relativamente alta y varió en un rango muy estrecho. Los valores del índice de Fijación FIS (F) para Sumbe, Caixito y Cabinda fueron positivos y significativos, indicando un déficit de heterocigotos. Por el contrario, en Benguela y Uige se observa un

Capitulo 2 23

exceso no significativo de heterocigotos, tendencia que se esperaría encontrar en la mayoría de las zonas debido al sistema de reproducción de la palma. Solo en Caixito se detectaron dos alelos privados en los loci PR02 (184pb) y PR06 (221pb), con una frecuencia de 0,47 y 0,068, respectivamente.

Tabla 2-44: Parámetros de variabilidad y diversidad genética para las zonas geográficas evaluadas.

ZG N %P A Ae Ho He Ra F P<0,05 AP

CX 88 100 5,077 2,780 0,403 0,559 4,993 0,100 0,000 2

SU 100 100 5,154 2,883 0,385 0,537 4,886 0,106 0,000 0

CB 117 100 5,308 2,779 0,420 0,561 5,047 0,076 0,000 0

BG 57 100 4,846 2,792 0,476 0,551 4,787 -0,063 0,599 0

UG 89 100 5,154 2,998 0,497 0,598 4,975 -0,019 0,951 0

PROMEDIO 90 100 5,108 2,846 0,537 0,561 4,938 0,040 0,000 0,4

DE 0,00 0,258 0,187 0,025 0,023 0,023 0,000

ZG: zona geográfica, CX: Caixito, SU: Sumbe, CB: Cabinda, BG: Benguela, UG: Uige, P: promedio, DE: desviación estándar, N: entradas evaluadas por zona geográfica, %P: porcentaje de loci polimórficos, A: número promedio de alelos por zona geográfica, Ae: número efectivo de alelos, Ho: hetetocigocidad observada, He: heterocigosidad esperada, Ra: riqueza alélica, F: índice de fijación FIS, P<0,05: probabilidad del test de EHW estadísticamente significativa menor de 0,05, AP: alelos privados

2.3.5 Diversidad genética dentro de familias

La estimación de la diversidad genética dentro de familias es importante ya que ésta puede ser usada para detectar familias con diversidad genética relativamente más alta y que a su vez, puedan marcar diferencias genéticas entre zonas geográficas. De esta manera, se pueden diseñar estrategias de mejoramiento y mantenimiento que las involucren.

En la Tabla 2-5 se observan los parámetros que describen la diversidad genética dentro de familias, donde el porcentaje de loci polimórficos (%P) fue en promedio de 94,58%. Sin embargo, la familia 5 de Sumbe (SU5) y la familia CX8 de Caixito presentaron los valores más bajos de %P (61,54 y 76,92, respectivamente). El valor máximo para el promedio de alelos detectados por familia (A) correspondió a las familias SU2 y CB3 (4,077), seguido por la familia BG5 (3,769) y contrario a la familia CX8 (2,154). Igualmente, para el número promedio de alelos efectivos (Ae) las mismas familias registraron los valores extremos incluyendo a la familia UG4 (2,718) que obtuvo uno de los mayores Ae. La mayoría de las familias de Uige superaron el promedio (2,273) de alelos efectivos.

Los valores de heterocigosidad esperada (He) oscilaron en un rango entre 0,564 (UG9) y 0,265 (CX8), con un promedio de 0,478 (Tabla 2-5). El índice de Fijación FIS (F) describe


para la mayoría de las familias un exceso de heterocigotos reflejado en los valores negativos de F, los cuales oscilaron entre -0,348 (p=0,000) (UG9) y 0,080 (p=0,046) (SU1), con un valor promedio de -0,1111 (p=0,002). Las familias CX6, SU1, SU5, SU6, BG2, BG4, BG6, UG2, UG7, UG9 y UG10, se desvían significativamente del EHW por exceso de heterocigotos, por el contrario, las familias SU1 y SU9 presentaron desviación significativa del EHW por deficiencia de heterocigotos. Benguela y Uige presentaron mayor proporción de familias con desviación significativa del EHW por exceso de heterocigotos (3:6, y 4:9, respectivamente).

No se identificaron alelos privados en ninguna familia, y a nivel de zonas geográficas se identificaron dos alelos privados en Caixito, con lo cual se puede suponer que a pesar de su aislamiento geográfico, las zonas geográficas comparten los mismos alelos por un presumible alto flujo génico o divergencia reciente entre estas zonas.

Tabla 2-55: Variabilidad y diversidad genética dentro de las familias de cada zona geográfica

Pop N %P A Ae Ho He F P<0,05

CX1 10 100,00% 3,154 2,018 0,531 0,455 -0,123 0,432 CX2 10 92,31% 2,923 2,065 0,485 0,435 -0,105 0,165 CX3 9 100,00% 3,692 2,322 0,470 0,472 -0,015 0,956 CX4 10 92,31% 3,769 2,539 0,538 0,522 -0,002 0,879 CX5 10 92,31% 3,077 2,111 0,513 0,451 -0,123 0,117 CX6 10 92,31% 3,692 2,351 0,588 0,486 -0,205 0,005 CX7 10 92,31% 3,615 2,373 0,500 0,495 -0,026 0,848 CX8 9 76,92% 2,154 1,475 0,274 0,265 0,024 0,224 CX9 10 100,00% 3,385 2,280 0,546 0,500 -0,108 0,265 SU1 10 100,00% 3,462 2,527 0,477 0,522 0,080 0,046 SU2 15 100,00% 4,077 2,131 0,508 0,470 -0,070 0,354 SU3 17 100,00% 3,615 2,098 0,480 0,482 -0,009 0,917 SU4 10 92,31% 3,077 2,217 0,545 0,460 -0,184 0,088 SU5 10 61,54% 2,308 1,953 0,385 0,333 -0,149 0,042 SU6 10 84,62% 2,462 1,921 0,477 0,393 -0,211 0,044 SU7 10 84,62% 3,385 2,364 0,469 0,433 -0,083 0,790 SU8 10 84,62% 3,462 2,329 0,485 0,449 -0,071 0,197 SU9 8 92,31% 3,385 2,181 0,413 0,438 0,014 0,037 CB1 10 92,31% 3,538 2,215 0,474 0,447 -0,034 0,349 CB2 10 100,00% 3,231 2,116 0,510 0,475 -0,056 0,244 CB3 10 100,00% 4,077 2,563 0,652 0,557 -0,180 0,200 CB4 10 92,31% 2,846 2,153 0,514 0,447 -0,135 0,443 CB5 10 92,31% 3,231 1,761 0,377 0,365 -0,029 0,499 CB6 12 100,00% 3,615 2,205 0,490 0,495 0,003 0,113 CB7 17 100,00% 3,692 2,007 0,409 0,399 -0,034 0,591 CB8 10 92,31% 3,538 2,416 0,592 0,509 -0,159 0,092 CB9 10 100,00% 3,615 2,259 0,536 0,496 -0,073 0,492

Capitulo 2 25

Tabla 2- 5: (Continuación)

Pop N %P A Ae Ho He F P<0,05

CB10 10 100,00% 3,385 2,347 0,615 0,532 -0,182 0,381 CB11 10 100,00% 3,692 2,508 0,605 0,549 -0,110 0,237 BG1 10 100,00% 3,538 2,661 0,521 0,537 0,025 0,080 BG2 10 100,00% 3,462 2,468 0,638 0,522 -0,192 0,006 BG3 10 100,00% 3,154 2,107 0,517 0,478 -0,064 0,481 BG4 9 84,62% 3,000 2,343 0,606 0,457 -0,328 0,000 BG5 10 100,00% 3,769 2,536 0,587 0,507 -0,172 0,086 BG6 9 100,00% 3,385 2,462 0,650 0,531 -0,244 0,031 UG1 10 100,00% 3,308 2,322 0,568 0,513 -0,114 0,267 UG2 10 92,31% 3,538 2,184 0,603 0,485 -0,225 0,065 UG3 10 100,00% 3,538 2,520 0,607 0,513 -0,168 0,214 UG4 10 92,31% 3,615 2,718 0,532 0,530 -0,021 0,752 UG6 10 100,00% 3,538 2,503 0,541 0,549 0,008 0,113 UG7 10 100,00% 3,308 2,345 0,689 0,530 -0,301 0,001 UG8 10 92,31% 3,308 2,126 0,531 0,466 -0,151 0,169 UG9 10 100,00% 3,692 2,556 0,768 0,564 -0,348 0,000 UG10 10 92,31% 3,538 2,371 0,669 0,536 -0,257 0,003

PROMEDIO 10 94,58 3,383 2,273 0,534 0,478 -0,111 0,002 DE 0,074 1,16 0,064 0,041 0,012 0,009 0,013 0,0001

ZG: zona geográfica, CX: Caixito, SU: Sumbe, CB: Cabinda, BG: Benguela, UG: Uige, N: entradas evaluadas por familia, %P: porcentaje de loci polimórficos, A: número promedio de alelos por familia, Ae: número efectivo de alelos, Ho: hetetocigosidad observada, He: heterocigosidad esperada, F: índice de fijación FIS, P<0,05: probabilidad del test de EHW estadísticamente significativa menor de 0,05, DE: desviación estándar.

2.3.6 Estructura genética

La Tabla 2-6 muestra los parámetros de diferenciación genética entre familias y entre zonas geográficas según Nei (1987), los cuales pueden ser aplicados sin considerar el número de alelos por locus y las fuerzas evolutivas (Laurentin, 2009). La Tabla 2-6 muestra valores promedio de heterocigosidad observada (Ho) y diversidad genética dentro de grupos (Hs). Se observa que la diversidad genética dentro de familias es un poco menor que dentro de zonas geográficas, también se muestra una diversidad genética total relativamente alta (0,581). El promedio de diversidad genética entre subgrupos (DST) muestra un valor de tan solo 0,079 entre familias y de 0,016 entre zonas geográficas, reflejando menor variabilidad entre las zonas geográficas, con lo cual se concluye que la mayor parte de la diversidad genética se encuentra distribuida dentro de grupos (familias y zonas geográficas) y no entre ellos. El valor calculado para el coeficiente de diferenciación genética (GST) fue de 0,136, que aunque significativo (P<0,01) determina una diferenciación genética más baja entre zonas geográficas que entre familias. El promedio del Gis entre zonas geográficas fue de 0,049 y entre familias


de -0,063, mostrando leves desviaciones del EHW, entre familias un exceso significativo de heterocigotos (P<0,01) y entre zonas geográficas un déficit altamente significativo (P<0,01) de heterocigotos.

Tabla 2-66: Coeficientes de diversidad y diferenciación genética de Nei (1987) entre grupos (familias y zonas geográficas)

Agrupamiento HO HS DST HT GST GIS P<0,05

Por familias 0,534 0,502 0,079 0,581 0,136 -0,063 0,002

Por zonas geográficas 0,537 0,565 0,016 0,581 0,028 0,049 0,000

Ho: promedio de diversidad genética observada, Hs: promedio de diversidad genética dentro de grupos, Ht: diversidad genética total, DST: promedio de diversidad genética entre subgrupos, GST: coeficiente de diferenciación genética, GIS: coeficiente de endogamia, P<0,05: probabilidad del test de EHW estadísticamente significativa menor de 0,05.

El análisis molecular de varianza (AMOVA) se realizó teniendo en cuenta como fuentes de variación de nivel jerárquico las zonas geográficas, las familias y los individuos, con el fin de identificar la variación molecular dentro y entre estos niveles. El AMOVA (Tabla 2-¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.7), muestra que la diferenciación genética entre zonas geográficas es solo del 1% y entre individuos dentro de familias no hay diferenciación genética, así que la varianza se encuentra distribuida principalmente entre familias y dentro de individuos. La varianza entre familias dentro de zonas geográficas representa el 12% de la varianza total, con valores de diferenciación genética moderada (FST= 0,137) pero significativos (Tabla 2-8). Es claro que la mayor parte de la varianza genética está dentro de los individuos (87%) con una baja pero significativa consanguinidad individual (FIT= 0,029) en la población total. Estos valores son concordantes con los valores reportados en la Tabla 2-6, concluyendo que la mayor parte de la varianza se encuentra entre familias dentro de las zonas geográficas y dentro de los individuos en la población total. La diferenciación genética entre todos los pares de zonas geográficas y familias aunque fue baja, en todos los casos fue significativa (Anexo D y E).

Tabla 2-77: Análisis de varianza molecular (AMOVA F)

Fuente de Variación gl Suma de

cuadrados Componentes

2 % 2

Entre zonas geográficas 4 92,711 0,057 1,4

Entre familias dentro de zonas geográficas

39 487,009 0,465 11,8

Entre Individuos dentro de familias

411 1295,048 0,000 0

Dentro de Individuos 455 1554,00 3,415 86,8

Total 909 3438,768 3,937 100

gl: grados de libertad, % 2 : porcentaje de variación

Capitulo 2 27

Tabla 2-88: Estadísticos F (Wright, 1965) de diferenciación genética entre zonas geográficas y familias.

ZONAS GEOGRÁFICAS FAMILIAS

F P<0,05 F P<0,05

FST 0,028 0,001 0,137 0,001

FIT 0,077 0,001 0,102 0,001

FIS 0,103 0,001 -0,040 1,000

El test de Mantel mostró que entre las 5 zonas geográficas la correlación entre la divergencia genética (valorada como FST) y la distancia geográfica no fue estadísticamente significativa (Z = 122,6220, r = -0,3917, R2= 0,154, valor-p= 0,8250), Por lo tanto en el presente estudio no se evidenció un proceso de aislamiento por distancia entre las zonas geográficas.

Flujo génico

El flujo génico es una fuerza homogenizadora que actúa en contra de la divergencia genética entre las zonas geográficas. Para la estimación del número de migrantes no se consideró el método de alelos privados puesto que su resultado podría subestimar el estadístico Nm, ya que solo se registraron dos en las zonas geográficas evaluadas. Por lo tanto, la estimación de Nm se basó en el estadístico FST. La Tabla 2-9 muestra que los valores promedio de flujo génico son moderadamente altos entre zonas geográficas (Nm= 8,664) y entre familias (Nm= 1,572) basado en un numero efectivo de 50 individuos para zonas geográficas y 10 para familias. Estas estimaciones del flujo génico entre familias eran esperadas debido al tipo de polinización alógama característico de la palma, sin embargo, entre zonas geográficas no se esperaba un flujo génico moderadamente alto, pero estos resultados corroboran los resultados de la AMOVA y el GST.

Tabla 2-99. Estimadores de flujo génico con base en el valor promedio del número de migrantes

Ne Nm

Zonas geográficas 50 8.664 Familias 10 1,572

Nm: número de migrantes, Ne: Número efectivo


Estructura poblacional y aproximación bayesiana

Para el análisis basado en métodos de estadística bayesiana, se calculó el K optimó (K) según la metodología de Evanno et al. (2005), realizando varias simulaciones y explorando diferentes parámetros. El análisis fue realizado sin información a priori y con información a priori de la zona geográfica donde se realizó la colecta, y los resultados de las dos simulaciones son mostrados en la Figura 2-3. Las Figuras 2- 3 A muestran que a medida que aumenta el K, el valor de la likelihood tiende a estabilizarse, sin embargo no se logra estabilidad completa ya que a partir de K=14 (Figura 2- 3 A (I)) y K=16 (Figura 2-3 A (II)) el valor de la likelihood vuelve a descender. La Figura 2-3 B (I) presenta un K máximo en un K=5 poblaciones, mientras que la simulación con información a priori calculó un K máximo en un K=3 poblaciones (Figura 2-3 B (II)).

Figura 2-33: Gráficas para la exploración de la estructura poblacional de las entradas analizadas utilizando el programa Structure. (A) Valores promedio del Ln P(D) (Log likelihood) vs K, (B) K vs K, de acuerdo a Evanno et al. (2005). (I) simulación sin información a priori de la zona geográfica de las entradas (II) simulación con información a priori de la zona geográfica de las entradas evaluadas.

A (I) B (I)

A (II) B (II)

Capitulo 2 29

Las simulaciones sin información a priori y con información del lugar de colecta mostraron diferentes resultados de agrupamiento, como se muestra en las Figuras 2-3 y 2-4, respectivamente. En la Figura 2-4 se observa que cada zona geográfica está compuesta por un conjunto de individuos heterogéneos evidenciado en el patrón de asignación de los individuos a cada una de las K=5 (Figura 2-4 A) y K=3 (Figura 2-4 B) poblaciones estadísticas sugeridas por el análisis. Por lo cual, el análisis sugiere desde el punto de vista genético, que las zonas geográficas no muestran una clara diferenciación entre ellas, lo que está en corcondancia con los resultados anteriores de AMOVA y de índices de fijación.

Después de inspeccionar la asignación de los individuos a cada una de las K=3 poblaciones, aún no es claro cuál podría ser el significado de cada una de estas tres poblaciones estadísticas ni desde el punto de vista biológico ni geográfico.

Figura 2-44: Gráfico del K óptimo (K) de las simulaciones del programa Structure incluyendo el grupo de híbridos. A. Sin información a priori del lugar de colecta. B. Con información geográfica a priori del lugar de colecta.

2.3.7 Relaciones genéticas

Distancias genéticas entre las zonas geográficas

La distancia genética refleja la diferenciación a nivel de frecuencias génicas expresada en el número de sustituciones alélicas por locus que se han dado en la evolución separada de dos subpoblaciones, grupos o especies. Por eso es de suponer que los individuos más distantes en las topologías construidas con disimilaridades comparten menor número de variantes alélicas. Los promedios y valores máximos de las diferentes distancias genéticas entre todos los pares de zonas geográficas (Tabla 2-10) permiten inferir que a nivel general la diferenciación genética es baja entre las zonas geográficas donde se encuentra E. guineensis consideradas en este trabajo. Por otra parte, se

A

B


observa que el promedio de las distancias aumenta significativamente cuando se incluye la población de híbridos para todas las clases de distancias genéticas. La distancia dm2, la cual asume un modelo mutacional “Stepwise” o paso a paso para loci microsatélites y tiene una varianza menor (Goldstein y Pollock, 1997), muestra diferencias mayores entre los promedios de las comparaciones. Finalmente, se concluye que la distancia genética entre E. guineensis de las 5 zonas geográficas de estudio es mínima comparada con la distancia genética entre E. guineensis y el híbrido.

Tabla 2-100: Distancias genéticas. Valores máximos, mínimos y promedios entre pares de zonas geográficas con inclusión y exclusión del grupo de híbridos.

COMPARACIONES DISTANCIA MÁXIMO MÍNIMO PROMEDIO

Entre E. guineensis CAS 0,2003 0,1413 0,1650 E. guineensis vs HB CAS 0,6078 0,1413 0,3062

Entre E. guineensis DSG 0,0557 0,0202 0,0375 E. guineensis vs HB DSG 0,4675 0,0202 0,1941

Entre E. guineensis dm2 0,4223 0,0589 0,2042 E. guineensis vs HB dm2 906,704 0,0589 276,594

Entre E. guineensis ASD 930860 777857 858896 E. guineensis vs HB ASD 2071106 777857 1226346,2

CAS: distancia de Cavalli Sforza y Edwards (1967) (Valor máximo 2), DSG: distancia genética estándar de Nei (1972) (Valor máximo ), dm2 = 2 (Goldstein, 1995a) (Valor máximo ), ASD: distancia cuadrática media (Goldstein, 1995b y Slatkin 1995) (Valor máximo ).

Análisis de Coordenadas principales (ACoP)

El análisis de coordenadas principales (ACoP) fue usado como una herramienta adicional para explorar patrones de agrupamiento entre individuos y corroborar los datos de la estructura poblacional. Al realizar el análisis de coordenadas principales con una distancia de disimilaridad estimada con un índice de concordancia simple y aplicando un test de bootstrap de 1000 repeticiones, el resultado de las dos primeras coordenadas principales representa en conjunto tan solo el 8,36 % de la varianza total de la población (CoP1= 4,32 y CoP2= 4,04) no siendo significativo.

Es claro notar que las coordenadas encontradas para el análisis anterior explican un porcentaje muy bajo de la variación, por esta razón, se exploraron cuatro distancias genéticas (Nei, 1972; Cavalli Sforza y Edwards, 1967; dm2 (Goldstein, 1995a) y cuadrática media (ASD) (Goldstein, 1995b y Slatkin, 1995)) (Anexo F), incluyendo distancias como dm2 y ASD que asumen modelos mutacionales para marcadores

Capitulo 2 31

microsatélites (Tabla 2-11).

Tabla 2-11. Análisis de Coordenadas principales. Porcentaje de variación explicado por las 3 primeras coordenadas principales basado en diferentes distancias genéticas.

Distancia CoP1 CoP2 CoP3 % Acumulado

dm2 100 0 0 100 Nei 85,20 6,24 4,18 95,62 Cavalli Sforza 56,94 13,63 10,52 81,09 ASD 44,15 15,30 14,43 73,88

Como se observa, la distancia genética dm2 explicó mejor la variación de los datos en su primera coordenada principal acumulando un 100%. En este ACoP se utilizaron las zonas geográficas como unidades de análisis incluyendo los híbridos, aumentando significativamente el porcentaje de explicación de la variación en los tres primeros ejes. La Figura 2-5 muestra que las zonas geográficas de Uige y Benguela están más cercanas entre ellas y de forma similar las zonas geográficas de Cabinda y Caixito. Sumbe se ubica más distante respecto a las otras. Por otra parte, se puede observar que el grupo de híbridos se encuentra muy alejado de las cinco zonas geográficas de estudio como se esperaba.

Figura 2-55: Análisis de coordenadas principales (primeras dos dimensiones) basado en la matriz de distancias genéticas dm2 para las 5 zonas geográficas incluyendo los híbridos.


Análisis de agrupamiento realizado para zonas geográficas, familias e individuos

El análisis de agrupamiento obtenido usando el algoritmo NJ y la distancia genética de Nei (1972), en las 5 zonas geográficas y el grupo de híbridos de palma de aceite es mostrado en la Figura 2-6. Se observan las zonas geográficas de Caixito, Uige y Cabinda como las más cercanas, sin embargo, los valores de bootstrap no son significativos para la mayoría se los agrupamientos ya que no superan el 50% (470 y 265). La zona de Benguela y los híbridos se observan más distantes respecto a las otras.

Figura 2-66: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y la distancia genética de Nei (1972), para las 5 zonas geográficas y el grupo de híbridos usado como grupo externo.

Capitulo 2 33

La topología de agrupamiento NJ tomando como unidad de análisis las cuarenta y cuatro familias de palma de aceite, es mostrada en la Figura 2-7, donde se puede identificar la familia UG10 como la más distante del grupo seguida por las familias CX2, CX7, CX8, CB5, CB6, CB9, BG4, SU2, SU3, SU6, SU5, UG2, UG6, UG7 y UG9, respectivamente. La topología no muestra agrupamientos definidos que presenten un patrón claro. Sin embargo, muestra cuales familias son cercanas o distantes, vislumbrando relaciones entre ellas definidas por las distancias genéticas entre pares de familias (Anexo G), lo cual en términos prácticos es importante para la selección de germoplasma. La mayoría de los nodos de la base de la topología no presentan soporte estadístico, puesto que no superan el 50% de las repeticiones (1000).

Figura 2-77: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y la distancia genética de Nei (1972), incluye 44 familias correspondientes a las 5 zonas geográficas colectadas de E. guineensis en la República de Angola y un grupo de híbridos.


La topología de agrupamiento obtenida al aplicar el algoritmo de NJ (Figura 2-8) y tomando como unidad de análisis los individuos no permitió identificar grupos grandes con soporte estadístico según los valores de bootstrap. Al examinar la Figura 2-8 se observan agrupamientos muy heterogéneos conformados por individuos provenientes de orígenes geográficos diferentes. En la gráfica se muestran los valores bootstrap mayores a 50. Los valores más altos corresponden a los híbridos los cuales están separados significativamente del resto de individuos.

Figura 2-88: Topología basada en el método de agrupamiento Neighbor-joining y el índice de disimilaridad, incluye 464 entradas de E. guineensis distribuidas en 5 zonas geográficas y un grupo de híbridos usado como grupo externo. Valores de bootstrap superiores a 50.

Capitulo 2 35

Finalmente, se puede concluir que no se detectó ninguna estructura en la cual las zonas geográficas, familias o individuos pudieran ser agrupados separadamente unas de otras, por criterios geográficos o por la característica grosor de cuesco de la cual se tiene información y para la cual se evaluó la posible presencia de un patrón de agrupamiento. La topología obtenida nos brinda una aproximación descriptiva de las relaciones de disimilitud entre individuos, pero no tiene soporte estadístico significativo para la mayoría de las agrupaciones.

2.4 Discusión


2.4.1 Diversidad alélica

Los loci microsatélites utilizados en este estudio permitieron evaluar y cuantificar los patrones de variación genética existente en E. guineensis de las cinco zonas geográficas evaluadas para 13 loci.

El número promedio de alelos por locus (5,61) es relativamente menor respecto al número de alelos reportados por Billote et al. (2001) y Singh et al. (2008), en los loci evaluados, sin embargo, se detectaron tres alelos nuevos en tres loci (PR01, PR02 y PR028), lo cual podría explicarse debido a la naturaleza del material analizado correspondiente a diferentes orígenes africanos y americanos. Por otra parte, Bakoumé et al. (2007), reporta un número total de 209 alelos detectados con 16 loci microsatélites en 494 individuos procedentes de 10 países africanos, número que atribuyen al alto número de repeticiones de las secuencias microsatélites. En el presente estudio, con zonas geográficas de un solo país, no podemos corroborar estos resultados ya que a pesar del alto número de repeticiones en algunos loci, el número de alelos detectados no fue similar a los reportados por Bakoumé et al. (2007), para el mismo locus y para otros con igual o mayor número de repeticiones. De lo anterior, podemos concluir que independientemente del número de repeticiones de cada locus, el número de los alelos detectados depende de la naturaleza del germoplasma y por ende de su variabilidad.

La mayoría de loci utilizados en este estudio para la amplificación de regiones microsatélites en E. guineensis mostraron ser útiles en la identificación de variabilidad genética. Los promedios del número de alelos (A= 5,61) y el número de alelos efectivos en la población de Angola (Ae= 3,069), presentan una clara diferencia lo cual podría indicar la presencia de alelos raros en todas las zonas geográficas principalmente en Caixito y Cabinda, donde la diferencia es mayor, teniendo en cuenta que diferencias grandes entre estos parámetros indican bajas frecuencias de algunos alelos presentes solo en pocos individuos, diferencia usada para identificar alelos raros (Laurentin, 2009). La presencia de alelos raros en las zonas geográficas de condiciones climáticas diferentes podrían ser atribuidas a la presencia de nuevas variantes alélicas como consecuencia de las adaptaciones especificas a cada región, resultados similares fueron reportados por Bakoumé et al. (2007), quien atribuye su presencia no solo a procesos de deriva genética sino también de selección. Por ende, es de suponer que las poblaciones mejoradas tras muchos ciclos de selección han perdido muchos de estos alelos raros.

El polimorfismo encontrado en este estudio permitió hacer estimaciones de diversidad genética (He= 0,577) que corroboran los resultados obtenidos por Montoya et al. (2005), en la exploración preliminar del germoplasma de Angola de Cenipalma (He= 0,455). En otros estudios realizados con isoenzimas (Hayati et al., 2004) y RFLP (Maizura et al., 2006), incluyendo germoplasma de varios países africanos, reportan valores de heterocigosidad esperada menores (0,184 y 0,199, respectivamente) y en donde las poblaciones de Angola mostraron valores superiores al promedio total (0,194 y 0,211, respectivamente). Por el contrario, con loci microsatélites Cochard et al. (2009) encontraron que la población de Angola evaluada mostró la riqueza alélica más baja (4,877), así mismo, fue la menor heterocigosidad observada (0,632). Es de notar que, lo anterior no puede ser una comparación debido a los loci y tipo de germoplasma utilizado

Capitulo 2 37

en cada estudio, pero si podría ser un referente para concluir que los loci microsatélite debido al poder de detección y en general a sus características particulares (Goldstein y Pollock, 1997), respecto a los otros loci, pueden hacer mejores estimaciones de la diversidad de las poblaciones, también que hay otras poblaciones africanas que podrían tener mayor y menor diversidad genética.

En general, las poblaciones espontáneas de palma africana colectadas en las regiones a las cuales se les atribuye su origen, poseen altos valores de diversidad genética. Los coeficientes de diversidad genética (Tablas 2-4, 2-5 y 2-6) entre zonas geográficas no variaron mucho (He varía entre 0,537 y 0,598), pero a nivel de familias se puede observar una variación en un rango más amplio (He varía entre 0,265 y 0,564). En términos de mejoramiento genético en palma, estos niveles de variabilidad genética detectados son muy importantes, ya que superan el promedio de He de las poblaciones mejoradas de Deli y Dura reportadas en diferentes estudios (Montoya et al., 2005; Maizura et al., 2006; Singh et al., 2008; Tingh et al., 2010), constituyendo a la colección de Angola del centro de investigación de Cenipalma en un recurso genético útil para el propósito de ampliar la base genética de las poblaciones mejoradas y establecer en los acervos genéticos seleccionados la presencia de características de interés agroindustrial y de esta manera, guiar los cruzamientos que generan segregantes transgresivos, además de identificar las regiones de alta diversidad con el fin de realizar nuevas colectas en estos sitios.

El progreso de los procesos de mejoramiento genético depende de la utilización eficiente y sistemática del recurso genético permitiendo la obtención de materiales mejorados agronómicamente, a través de la inclusión de germoplasma de poblaciones naturales, silvestres, nativas y especies relacionadas con valor potencial que contengan buena parte de la diversidad genética resultante de procesos de selección y mutación en respuesta a la adaptación a factores bióticos y abióticos (Rey, 2007), en este contexto, la variabilidad genética encontrada en el germoplasma de Angola puede ser muy útil e interesante para el programa de mejoramiento genético de Cenipalma, información que permitirá identificar familias, las cuales presentaron mayor diversidad genética que podría aportar variantes alélicas de interés en la planeación de nuevos cruces y ganar eficiencia en el proceso del fitomejoramiento, teniendo en cuenta la correlación con los estudios bioquímicos, morfoagronómicos, de plagas y enfermedades.

Por otra parte, el entendimiento de los patrones de desequilibrio de ligamiento entre los loci evaluados en el germoplasma disponible podría ayudar a vislumbrar fenómenos poblaciones que han afectado a la población. El desequilibrio de ligamiento puede ser causado principalmente por la selección, la deriva genética y la mezcla de poblaciones de diferentes frecuencias alélicas. Sin embargo, hay otros factores que juegan un papel importante en los niveles del desequilibrio de ligamiento en una población como son la distancia física entre los loci, las tasas de recombinación, el apareamiento al azar, los patrones de reproducción (sexual, asexual, alógama o autógama), los procesos de mutación, el tamaño poblacional, el efecto fundador y los cuellos de botella (Flint-García et al., 2003; Hartl y Clark, 1997). Estos últimos pueden incrementar dramáticamente los niveles de DL (Charlesworth et al., 2003) reduciendo la variabilidad.


Estas fuerzas posiblemente han actuado en diferentes niveles a lo largo de la historia de la población de Angola, principalmente en las zonas de Sumbe, Caixito, Cabinda y Uige, las cuales presentaron los mayores niveles de DL. Por el contrario, Benguela presentó la menor proporción de pares de loci en DL (8:78), por lo cual podría inferirse que esta zona ha tenido menor efecto de algunas fuerzas evolutivas o el apareamiento al azar y la recombinación han sido más efectivos. Sin embargo, ninguna zona supera el 50% lo cual puede ser posiblemente un efecto principal del sistema de reproducción de la palma (sexual, alógama) y puede decrecer según la dinámica poblacional.

En los estudios de estructura y diversidad genética de palma realizados hasta el momento no se han encontrado reportes de los niveles de DL en las poblaciones analizadas, siendo éste un atributo importante de las poblaciones ya que la estructura incrementa el DL en el genoma (Aranzana et al., 2010). Adicionalmente, el DL afecta los análisis de datos produciendo distorsiones, patrones inestables y poco confiables (Mohammadi y Prasanna, 2003; Kaeuffer et al., 2007), además tiene implicaciones importantes en los procesos de mejoramiento, ya que reduce la variabilidad genética y puede ser importante en futuros estudios de asociación que involucren los loci o germoplasma evaluados.

El índice de endogamia (FIS), mostró ser levemente positivo (0,103, P<0,001) entre zonas geográficas, reflejando un efecto menor de la endogamia dentro de las zonas geográficas, resultado similar al encontrado por Cochard et al. (2009) (FIS= 0,125), lo cual podría ser una de las causas que explicaría el desequilibrio de Hardy-Weinberg detectado en las zonas geográficas evaluadas, debido posiblemente al sistema de reproducción de la palma de aceite, donde rara vez, en algunas inflorescencias femeninas se desarrollan flores masculinas que causarían esos bajos porcentajes de endogamia. Sin embargo, se podría decir que en general parece predominar un patrón de apareamiento y de distribución de la diversidad genética que no se aleja significativamente de lo esperado bajo un modelo de apareamiento al azar. En términos prácticos, la homocigocis observada aunque es baja, puede representar una desventaja en términos de mejoramiento si se involucran familias como CX8 y SU1, sin conocimiento de esta condición en algún programa de mejoramiento o conservación de germoplasma, adicionalmente es probable que aumente positivamente el F en estas familias, si las siguientes generaciones no tienen cruzamiento al azar y flujo génico efectivo.

2.4.2 Estructura poblacional

La mayoría de la diferenciación genética ocurre dentro de individuos, sin embargo, entre familias dentro de las zonas geográficas, se detectaron niveles de diferenciación genética bajos pero significativos. Resultados similares han sido reportados en poblaciones no domesticadas y espontáneas de chontaduro (Bactris gasipaes Kunth) colectadas en el Amazonas (FST= 0,19 y GST= 0,16) (Adin et al., 2004; Rodrígues et al., 2004). Por el contrario, otros estudios en palma de aceite de origen africano en los cuales se estima la diferenciación genética entre poblaciones (Hayati et al., 2004; Singh et al., 2008;

Capitulo 2 39

Chochard et al., 2009) han encontrado grados superiores de diferenciación, debido posiblemente a que fueron incluidos dentro de la colecta de germoplasma de diferentes orígenes en varios países Africanos donde se encuentra la palma de aceite.

Los resultados de este estudio mostraron una diferenciación genética menor entre zonas geográficas y un poco mayor entre familias. A nivel de familias, el proceso de flujo génico es dado por la dispersión natural de polen por efecto entomófilo y anemófilo, el cual ocurre a cortas distancias, posiblemente haciéndolo más restringido a algunas familias dentro de cada zona, lo cual, explicaría la diferenciación entre familias. El movimiento dinámico de las semillas de palma entre poblaciones a pesar de las amplias distancias geográficas es principalmente atribuido al efecto antrópico dado que el fruto de la palma es comestible en fresco y comercializado en los mercados locales de toda la República de Angola, actividad cultural que ha podido durante miles de años tener un efecto homogenizador. Otros dispersores de semillas de palma son los animales y el agua, este último con un impacto importante en el proceso de migración de semillas al que se le atribuye parte del proceso de dispersión de la palma de aceite a través de los ríos y manantiales africanos (Hayati et al., 2004; Corley y Tinker, 2003). La baja diferenciación genética es consistente con la ausencia de correlación significativa de aislamiento por distancia entre las zonas geográficas evaluadas en este trabajo. Igualmente, Elsibli y Korpelainen, (2008) y El-Assar et al. (2005), evaluando la estructura genética para poblaciones de palma de dátil (Phoenix dactylifera L.) de Sudan y Egipto no encontraron estructura debida a la localización geográfica de las poblaciones. Los resultados del análisis bayesiano no mostraron ninguna estructura genética aparente debida a la localización geográfica en las entradas evaluadas. Sin embargo, es fundamental tener en cuenta que se desconoce el estatus de aprovechamiento de la población evaluada por lo cual, no se puede afirmar concretamente cual ha sido el efecto de este fenómeno en los proceso de flujo génico entre las zonas geográficas.

El K calculado en el análisis podría ser causado por el desequilibrio de ligamiento entre los loci usados como lo menciona Kaeuffer et al. ( 2007), quien evaluó el efecto del desequilibrio de ligamiento en el análisis de estructura poblacional con el programa Structure, sugiriendo que el análisis puede ser sensible incluso a un par de loci con DL fuerte en algunos casos, donde la tasa de recombinación, la dinámica poblacional y el efecto fundador pueden incrementar o decrecer los niveles de DL alterando las estimaciones de probabilidades de agrupamientos. Los pares de loci evaluados en este estudio, en su mayoría mostraron desequilibrio de ligamiento significativo (Apéndice C), lo cual podría explicar en parte el K obtenido, ya que Kaeuffer et al. (2007) cita que desequilibrios de ligamiento “fuertes” o desviaciones de EHW podrían generar una sobrestimación del numero de agrupamientos detectados, ambas condiciones son presentadas en los resultados de este estudio. Por otra parte, el perfil de agrupamiento mostrado en la Figura 2- 5 infiere una población heterogénea (poblaciones compuestas por plantas con genotipos diferentes) e individuos mayoritariamente heterocigotos, características que tienden a tener las poblaciones naturales de especies alógamas (Vallejo y Estrada, 2002).

Lo cual podría ser posiblemente explicado por el efecto mayor de algunas fuerzas evolutivas como la selección que estarían actuando más que la recombinación efectiva


(factores que podrían afectar como el sistema de apareamiento y el tamaño poblacional) favoreciendo algunas asociaciones de loci, que podrían pertenecer a genotipos que tienen altos valores de fitness.

Al analizar la falta de estructura genética y no encontrar un patrón de agrupamiento por ubicación geográfica, es importante tener en cuenta la naturaleza del muestreo, el cual fue basado en el criterio de contenido de la pulpa en el fruto y no de ubicación geográfica, concluyendo que el muestreo puede estar sesgado por este criterio de colecta, posiblemente excluyendo otros materiales genéticos presentes en las zonas geográficas. El número de entradas y los loci (464 y 13, respectivamente) empleados en este análisis proveen un poder estadístico significativo para rechazar la hipótesis nula de estructura geográfica dentro de la muestra evaluada.

2.4.3 Relaciones genéticas

La exploración de las relaciones genéticas a través de la estimación de las distancias genéticas y métodos de agrupamiento, permitió distinguir cuales individuos, familias y zonas geográficas son más cercanos o distantes respecto a los otros. Los valores máximos y los promedios de las diferentes distancias genéticas entre zonas geográficas (Tabla 2-10) incluyendo y excluyendo el grupo de híbridos son una evidencia más de la baja pero significativa diferenciación genética en E. guineensis, por lo tanto, al incluir los híbridos se observa un aumento en los valores de las distancias.

Las diferentes distancias muestran una mayor similitud entre las zonas de Cabinda, Benguela y Uige (Anexo F). La mayor divergencia se presenta entre Sumbe y Caixito (Anexo D). Por la ubicación geográfica y las condiciones climáticas que caracterizan cada zona de colecta se esperaba la mayor similitud entre Benguela y Sumbe ya que están ubicadas en zonas con altitud, condiciones de pluviosidad y temperatura similares, sin embargo, en los resultados de los análisis se observaron relativamente distantes, y por el contrario Benguela se observa más cercana de Uige. Este resultado muestra que las relaciones genéticas entre las zonas geográficas para los loci evaluados podrían ser explicadas por procesos de flujo génico entre ellas y no por ubicación geográfica o adaptaciones climáticas. Sin embargo, esto podría ser una evidencia que refleja que el muestreo fue sesgado a la característica contenido de pulpa en fruto, y no en base a la zona geográfica de colecta, por cual los resultados obtenidos expresan la ausencia de correlación significativa entre la ubicación geográfica y la diversidad colectada en cada zona.

En la topología mostrada en la Figura 2-8 se observa una población altamente heterogénea y heterocigota donde no se observan agrupaciones correlacionadas bajo un criterio aparente. Los agrupamientos con valores de bootstrap superiores al 50 por ciento, aunque son pocos pueden ser tenidos en cuenta a la hora de seleccionar germoplasma.

Capitulo 2 41

3. Conclusiones y recomendaciones

3.1 Conclusiones

Los 13 loci microsatélite y la metodología usada permitieron la determinación de la variabilidad, estructura y relaciones genéticas de una muestra representativa de la colección procedente de la República de Angola establecida y mantenida en el centro experimental La Vizcaína.

Los índices de variabilidad genética mostraron ser superiores a los descritos para las poblaciones Deli mejoradas reportadas en diferentes estudios. Las zonas geográficas evaluadas presentaron índices de diversidad relativamente homogéneos. Sin embargo, a nivel de familias se detectaron algunas con índices de diversidad relativamente mayores con respecto al promedio, lo cual indica que este material genético podría ser un recurso importante de nuevos genes para su introgresión en materiales mejorados y ampliación de su base genética.

Todos los análisis realizados mostraron resultados que permiten rechazar la hipótesis de investigación, la cual evalúa la estructura genética del germoplasma colectado en Angola basada en la ubicación geográfica, donde no mostraron agrupamientos bajo ningún criterio aparente, definiendo una población heterogénea y formada de individuos heterocigotos, la cual ha mantenido un alto flujo génico a través de los años determinando un efecto homogenizador entre zonas geográficas.

Este trabajo generó gran cantidad de información que, junto a las evaluaciones morfoagronómicas y su análisis a partir de la estructura genética establecida en la colección de germoplasma (componentes de las varianzas) puede efectivamente asistir el proceso de selección de parentales que generen segregaciones transgresivas para las características de interés y junto a las evaluaciones morfoagronómicos, permitirá un uso racional y sistemático de las colecciones de germoplasma (colección núcleo) y una selección de parentales que logren, combinaciones deseables entre Dura y Pisífera, con el objetivo de obtener materiales comerciales altamente productivos, y de esta manera, fortalecer el programa de mejoramiento genético de Cenipalma.

Capitulo 2 43

3.2 Recomendaciones

Este estudio se constituye como uno los primeros en evaluar una muestra representativa de la estructura poblacional y caracterización de la diversidad genética del germoplasma de poblaciones naturales de Cenipalma, por cual es importante, seguir desarrollando investigaciones que contemplen otros marcadores, poblaciones y estudios de asociación.

Se recomienda para futuros estudios diseñar estrategias de muestreo y realizarlo sistemáticamente definiendo el criterio principal de colecta para evitar sesgos. También es importante a la hora de colectar el material vegetal tomar datos acerca de los factores culturales que podrían estar jugando un papel importante en la diversidad y estructura genética de la especie en la región, como por ejemplo agentes dispersores, polinizadores y aprovechamiento de frutos.

Este estudio aporta la información de diversidad y estructura genética de la colección de Angola al programa de mejoramiento genético de Cenipalma, la cual se recomienda analizar en conjunto con la información obtenida de los estudios morfoagronómicos, bioquímicos, fisiológicos, de plagas y enfermedades permitiendo definir de manera más clara y contundente las relaciones genéticas y estructura poblacional logrando la selección correcta de parentales para planear nuevos cruces, y así involucrar eficientemente este germoplasma para ampliar la base genética y obtener materiales comerciales con mejores características agronómicas.

La mayor parte de la varianza se encuentra distribuida dentro de individuos (87%) y entre familias (12%) haciendo de estos grupos un recurso valioso de mejoramiento donde la selección debe hacerse cuidadosamente ya que soy muy variables entre ellos y esto puede repercutir de manera importante.

Así mismo, la información obtenida en este estudio y complementada con los resultados de los otros programas de Cenipalma podría en el futuro servir de lineamiento para formar una colección núcleo del germoplasma de Angola. Teniendo en cuenta únicamente los resultados de este trabajo se recomienda para propósitos de colectar la mayor diversidad genética en pocas entradas, realizar un exhaustivo y sistemático muestreo de las familias con mayor diversidad genética pero sin considerar las zonas geográficas.

A. Anexo: Información del grosor de cuesco en las familias y zonas geográficas analizadas en este estudio

FAMILIA TIPO DE FRUTO FAMILIA TIPO DE FRUTO

CX1 DURA CB5 DURA

CX2 DURA CB6 TENERA

CX3 DURA CB7 TENERA

CX4 DURA CB8 DURA

CX5 DURAS Y TENERAS CB9 DURA

CX6 DURAS Y TENERAS CB10 DURA

CX7 DURA CB11 DURAS Y TENERAS

CX8 DURA BG1 DURA

CX9 DURA BG2 DURA

SU1 TENERA BG3 DURAS Y TENERAS

SU2 DURA BG4 DURAS Y TENERAS

SU3 TENERA BG5 DURA

SU4 DURA BG6 DURA

SU5 DURAS Y TENERAS UG1 TENERA

SU6 DURA UG2 DURA

SU7 DURA UG3 DURAS Y TENERAS

SU8 DURAS Y TENERAS UG4 DURA

SU 9 ANG 4 UG6 DURAS Y TENERAS

CB1 DURA UG7 DURA

CB2 DURA UG8 DURA

CB3 DURA UG9 DURAS Y TENERAS

CB4 DURA UG10 DURAS Y TENERAS


B. Anexo: Perfil de los loci PR01, PR06, PR07 y PR16 en las muestras 127 a 139

Anexo C. Test exacto de desequilibrio de ligamiento. Pares de loci con desequilibrio de ligamiento significativo

47

C. Anexo: Test exacto de desequilibrio de ligamiento. Pares de loci con desequilibrio de ligamiento significativo.

LOCUS1 LOCUS1 P<0.05 LOCUS1 LOCUS1 P<0.05

PR01 PR02 0,03846 PR07 PR27 0,02244

PR01 PR06 0,04487 PR07 PR31 0,00705

PR01 PR07 0,03782 PR07 PR37 0,00064

PR01 PR16 0,01859 PR13 PR23 0,01410

PR01 PR23 0,00321 PR13 PR29 0,00064

PR02 PR06 0,01474 PR13 PR31 0,01154

PR02 PR07 0,00513 PR16 PR23 0,00064

PR02 PR16 0,00256 PR16 PR24 0,00449

PR02 PR23 0,01538 PR16 PR27 0,04744

PR02 PR24 0,00192 PR16 PR31 0,03077

PR02 PR27 0,00962 PR16 PR37 0,01346

PR02 PR28 0,04487 PR23 PR27 0,00064

PR02 PR37 0,00064 PR23 PR29 0,03013

PR06 PR07 0,00064 PR23 PR31 0,00385

PR06 PR16 0,00064 PR23 PR37 0,00385

PR06 PR23 0,00064 PR24 PR28 0,02756

PR06 PR24 0,03205 PR24 PR37 0,00128

PR06 PR27 0,01987 PR27 PR29 0,02115

PR06 PR28 0,02051 PR27 PR31 0,01987

PR06 PR31 0,04744 PR28 PR29 0,03590

PR06 PR37 0,01731 PR29 PR37 0,02628

PR07 PR16 0,04615 PR31 PR37 0,00192

GLOBAL 0.000641***

Probabilidad de significancia P<0,05, P<0,01***


D. Anexo: FST y valor-p entre pares de zonas geográficas.

P<0.01

FST CX SU CB BG UG

CX 0 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 SU 0,04352 0 0,00000 0,00000 0,00000 CB 0,02644 0,02547 0 0,00000 0,00000 BG 0,0368 0,02156 0,02074 0 0,00000 UG 0,03761 0,03278 0,01988 0,01439 0


49

E. Anexo: FST y valor-p entre pares de familias

Anexo E. FST y valor-p entre pares de familias


Anexo E: (Continuación)


51

Anexo E: (Continuación)

Probabilidad de significancia P<0,01

Anexo E. FST y valor- p entre pares de familias


F. Anexo: Distancias genéticas entre pares de zonas geográficas

DSG CX 0,00000

SU 0,05572 0,00000

CB 0,03561 0,03328 0,00000

BG 0,05102 0,02914 0,02683 0,00000

UG 0,05334 0,04243 0,0273 0,02015 0,00000

HB 0,43981 0,43097 0,42698 0,40433 0,46746 0,0000

dm2 CX 0,00000

SU 0,42232 0,00000

CB 0,11285 0,36741 0,00000

BG 0,13440 0,28900 0,08457 0,00000

UG 0,16408 0,33243 0,0759 0,05893 0,0000

HB 887,631 744,883 906,704 812,451 797,244 0,0000

DAN CX 0,00000

SU 0,06001 0,00000

CB 0,04344 0,03922 0,00000

BG 0,05569 0,04094 0,03361 0,00000

UG 0,05161 0,03941 0,03252 0,03354 0,0000

HB 0,47990 0,46072 0,44692 0,44007 0,4859 0,0000

ASD CX 0,00000

SU 904,886 0,00000

CB 913,132 863,119 0,00000

BG 837,865 777,857 796,607 0,00000

UG 930,860 872,227 885,767 806,649 0,00000

HB 2,071,106 1,865,400 2,046,415 1,872,235 1,952,068 0,0000

DSG: distancia genética estándar de Nei (1972), DN: distancia corta de Nei (1983), dm2: d2 (Goldstein 1995b), ASD: distancia cuadrática media (Goldstein 1995b y Slatkin 1995)


53

G. Anexo G: Distancia genética de Nei (1972) entre pares de familias

CX1 CX2 CX3 CX4 CX5 CX6 CX7 CX8 CX9 SU1 SU2 SU3 SU4 SU5

CX1

CX2 0,187

CX3 0,082 0,103

CX4 0,166 0,185 0,055

CX5 0,259 0,175 0,128 0,147

CX6 0,190 0,186 0,135 0,186 0,098

CX7 0,195 0,111 0,062 0,148 0,089 0,080

CX8 0,249 0,172 0,207 0,272 0,293 0,303 0,246

CX9 0,220 0,205 0,112 0,094 0,171 0,185 0,166 0,348

SU1 0,227 0,144 0,082 0,094 0,093 0,122 0,097 0,268 0,096

SU2 0,268 0,239 0,195 0,195 0,139 0,138 0,124 0,293 0,214 0,084

SU3 0,214 0,164 0,094 0,144 0,161 0,150 0,126 0,345 0,118 0,074 0,092

SU4 0,242 0,250 0,203 0,216 0,201 0,115 0,169 0,239 0,223 0,151 0,151 0,178

SU5 0,251 0,245 0,196 0,273 0,186 0,090 0,182 0,250 0,273 0,214 0,258 0,284 0,097

SU6 0,301 0,249 0,209 0,265 0,124 0,069 0,127 0,362 0,231 0,150 0,193 0,189 0,118 0,107

SU7 0,303 0,227 0,211 0,224 0,216 0,198 0,167 0,201 0,246 0,105 0,116 0,178 0,081 0,197

SU8 0,181 0,241 0,136 0,207 0,236 0,172 0,178 0,311 0,178 0,156 0,228 0,192 0,120 0,128

SU9 0,159 0,166 0,113 0,167 0,142 0,118 0,128 0,205 0,165 0,078 0,129 0,136 0,031 0,109

CB1 0,272 0,255 0,143 0,216 0,171 0,168 0,117 0,302 0,206 0,082 0,148 0,182 0,141 0,198

CB2 0,166 0,118 0,093 0,146 0,157 0,125 0,093 0,247 0,140 0,114 0,174 0,146 0,106 0,159

CB3 0,155 0,175 0,132 0,170 0,150 0,090 0,122 0,247 0,134 0,110 0,125 0,137 0,072 0,095

CB4 0,177 0,177 0,120 0,152 0,090 0,156 0,134 0,197 0,171 0,104 0,140 0,200 0,205 0,220

CB5 0,204 0,241 0,122 0,159 0,229 0,173 0,159 0,254 0,170 0,214 0,228 0,212 0,212 0,178

CB6 0,221 0,206 0,123 0,188 0,186 0,149 0,108 0,312 0,172 0,172 0,228 0,203 0,165 0,132

CB7 0,150 0,185 0,118 0,160 0,200 0,136 0,152 0,253 0,188 0,131 0,176 0,128 0,086 0,135

CB8 0,198 0,168 0,116 0,092 0,131 0,162 0,108 0,285 0,143 0,063 0,144 0,116 0,121 0,206

CB9 0,225 0,180 0,107 0,166 0,113 0,139 0,044 0,324 0,130 0,139 0,162 0,184 0,221 0,256

CB10 0,108 0,129 0,111 0,116 0,191 0,157 0,164 0,274 0,175 0,139 0,251 0,159 0,174 0,168

CB11 0,198 0,166 0,188 0,157 0,205 0,165 0,158 0,290 0,251 0,153 0,198 0,214 0,146 0,198

BG1 0,146 0,177 0,107 0,139 0,093 0,066 0,110 0,323 0,102 0,069 0,129 0,081 0,064 0,161

BG2 0,197 0,122 0,081 0,134 0,117 0,093 0,093 0,218 0,112 0,074 0,167 0,106 0,089 0,099

BG3 0,216 0,199 0,119 0,166 0,102 0,101 0,098 0,302 0,115 0,113 0,174 0,142 0,087 0,126

BG4 0,261 0,252 0,173 0,175 0,186 0,157 0,166 0,342 0,177 0,108 0,197 0,188 0,132 0,192

BG5 0,137 0,145 0,114 0,157 0,125 0,072 0,087 0,241 0,120 0,068 0,172 0,138 0,085 0,118

BG6 0,114 0,163 0,062 0,143 0,105 0,075 0,044 0,182 0,128 0,077 0,130 0,107 0,098 0,142

UG1 0,102 0,133 0,053 0,077 0,158 0,160 0,097 0,236 0,112 0,086 0,171 0,112 0,163 0,229

UG2 0,251 0,258 0,169 0,156 0,186 0,135 0,153 0,339 0,163 0,139 0,215 0,196 0,111 0,170

UG3 0,222 0,218 0,083 0,100 0,174 0,163 0,129 0,248 0,123 0,083 0,164 0,138 0,142 0,214

UG4 0,175 0,179 0,153 0,159 0,151 0,089 0,096 0,223 0,224 0,114 0,199 0,214 0,083 0,121

UG6 0,123 0,150 0,156 0,166 0,183 0,117 0,183 0,247 0,183 0,146 0,215 0,174 0,112 0,135

UG7 0,244 0,258 0,232 0,199 0,279 0,230 0,226 0,269 0,253 0,169 0,206 0,198 0,165 0,249

UG8 0,174 0,162 0,111 0,145 0,081 0,091 0,118 0,292 0,089 0,064 0,146 0,072 0,095 0,148

UG9 0,221 0,313 0,185 0,156 0,251 0,219 0,194 0,466 0,181 0,164 0,182 0,152 0,199 0,326

UG10 0,141 0,284 0,133 0,128 0,248 0,184 0,165 0,308 0,150 0,110 0,204 0,207 0,144 0,229

Anexo G. Distancia genética de Nei (1972) entre pares de familias


Anexo G: (Continuación)

SU6 SU7 SU8 SU9 CB1 CB2 CB3 CB4 CB5 CB6 CB7 CB8 CB9 CB10 CB11

SU7 0,178

SU8 0,184 0,231

SU9 0,108 0,074 0,104

CB1 0,104 0,096 0,190 0,056

CB2 0,129 0,151 0,175 0,062 0,116

CB3 0,116 0,117 0,099 0,066 0,126 0,075

CB4 0,190 0,147 0,261 0,126 0,136 0,129 0,097

CB5 0,208 0,231 0,215 0,150 0,170 0,127 0,141 0,199

CB6 0,120 0,195 0,188 0,101 0,088 0,077 0,097 0,198 0,082

CB7 0,169 0,137 0,132 0,051 0,139 0,081 0,087 0,192 0,148 0,099

CB8 0,164 0,123 0,162 0,075 0,140 0,095 0,114 0,141 0,238 0,164 0,121

CB9 0,193 0,216 0,279 0,175 0,142 0,106 0,134 0,099 0,207 0,146 0,246 0,155

CB10 0,158 0,251 0,142 0,100 0,212 0,086 0,127 0,191 0,210 0,145 0,090 0,099 0,223

CB11 0,178 0,137 0,188 0,130 0,166 0,077 0,108 0,173 0,248 0,170 0,130 0,094 0,208 0,075

BG1 0,063 0,144 0,121 0,060 0,110 0,032 0,058 0,126 0,194 0,123 0,076 0,089 0,115 0,069 0,091

BG2 0,078 0,121 0,119 0,045 0,067 0,042 0,064 0,122 0,113 0,064 0,075 0,085 0,155 0,093 0,132

BG3 0,089 0,146 0,126 0,068 0,103 0,061 0,081 0,128 0,154 0,113 0,090 0,112 0,118 0,128 0,159

BG4 0,102 0,164 0,164 0,086 0,116 0,128 0,134 0,229 0,231 0,145 0,149 0,124 0,217 0,149 0,189

BG5 0,074 0,137 0,103 0,023 0,098 0,057 0,078 0,149 0,165 0,112 0,073 0,084 0,160 0,050 0,106

BG6 0,105 0,138 0,142 0,054 0,115 0,072 0,072 0,083 0,163 0,136 0,079 0,090 0,084 0,085 0,138

UG1 0,194 0,160 0,175 0,076 0,162 0,072 0,134 0,121 0,209 0,176 0,105 0,050 0,121 0,035 0,101

UG2 0,103 0,171 0,193 0,103 0,131 0,069 0,098 0,212 0,177 0,106 0,147 0,151 0,183 0,120 0,129

UG3 0,168 0,158 0,174 0,091 0,106 0,050 0,115 0,146 0,142 0,107 0,134 0,145 0,157 0,158 0,161

UG4 0,126 0,116 0,166 0,077 0,141 0,084 0,110 0,155 0,237 0,167 0,121 0,116 0,167 0,095 0,089

UG6 0,193 0,196 0,125 0,097 0,192 0,111 0,110 0,205 0,246 0,175 0,090 0,092 0,244 0,086 0,103

UG7 0,262 0,166 0,272 0,160 0,187 0,160 0,168 0,227 0,241 0,190 0,123 0,178 0,294 0,207 0,208

UG8 0,104 0,120 0,130 0,056 0,133 0,083 0,087 0,121 0,193 0,156 0,071 0,088 0,166 0,095 0,155

UG9 0,266 0,267 0,189 0,206 0,195 0,172 0,138 0,281 0,290 0,200 0,170 0,117 0,193 0,177 0,147

UG10 0,224 0,200 0,094 0,102 0,114 0,121 0,099 0,187 0,228 0,156 0,133 0,089 0,195 0,130 0,108

BG1 BG2 BG3 BG4 BG5 BG6 UG1 UG2 UG3 UG4 UG6 UG7 UG8 UG9 UG10

BG1 0,058

BG2 0,025 0,013

BG3 0,085 0,069 0,079

BG4 0,032 0,035 0,060 0,052

BG5 0,039 0,072 0,058 0,132 0,019

BG6 0,060 0,098 0,119 0,141 0,057 0,037

UG1 0,062 0,090 0,087 0,039 0,069 0,147 0,136

UG2 0,078 0,056 0,098 0,061 0,099 0,097 0,104 0,052

UG3 0,059 0,074 0,070 0,095 0,048 0,066 0,098 0,091 0,108

UG4 0,081 0,057 0,126 0,157 0,069 0,119 0,099 0,176 0,163 0,068

UG6 0,162 0,122 0,170 0,204 0,176 0,171 0,182 0,209 0,143 0,135 0,106

UG7 0,007 0,052 0,028 0,126 0,029 0,055 0,079 0,123 0,128 0,070 0,082 0,159

UG8 0,099 0,202 0,201 0,179 0,166 0,182 0,160 0,146 0,184 0,243 0,176 0,227 0,200

UG9 0,089 0,128 0,156 0,125 0,072 0,093 0,095 0,133 0,089 0,118 0,101 0,164 0,152 0,058

UG10 0,067 0,082 0,104 0,119 0,080 0,107 0,119 0,133 0,136 0,127 0,116 0,183 0,176 0,058 0,000

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Estructura genética de poblaciones naturales de palma … · guineensis Jacq.) procedentes de ......

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