ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO EFEITO … · As cumarinas são seus constituintes químicos...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE UMA FRAÇÃO RICA EM CUMARINA DE Ayapana triplinervis (ASTERACEAE) Thiago Portal da Paixão BELÉM - PA 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE UMA FRAÇÃO RICA EM CUMARINA
DE Ayapana triplinervis (ASTERACEAE)
Thiago Portal da Paixão
BELÉM - PA
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE UMA FRAÇÃO RICA EM CUMARINA
DE Ayapana triplinervis (ASTERACEAE)
Autor: Thiago Portal da Paixão Orientadora: Profª. Drª. Marcieni Ataíde de Andrade
Co-orientador: Prof. Dr. Enéas de Andrade Fontes Júnior
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, área de
concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto
de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do
Pará, como requisito para obtenção do Título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas
BELÉM - PA
2016
FOLHA DE APROVAÇÃO
Thiago Portal da Paixão
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE UMA FRAÇÃO RICA EM CUMARINA DE Ayapana triplinervis (ASTERACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, da
Universidade Federal do Pará, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos.
Aprovado em: 27 de abril de 2016.
Banca Examinadora
_______________________________________________
Profa. Dra. Marcieni Ataíde de Andrade (Orientadora)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica/UFPA
_______________________________________________
Profa. Dra. Alaíde Braga de Oliveira
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica/UFPA
_______________________________________________
Prof. Dr. Pergentino José da Cunha Sousa Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UFPA
BELÉM-PA
2016 DEDICATÓRIA
Em gratidão a essas mulheres: À minha irmã, por sua
incansável dedicação e amparo; à minha orientadora,
por exercer em mim tanta positividade e por
compartilhar a sua paz; e à minha saudosa mãe que
me ensinou as maiores virtudes de um Ser, dedicou-
me o seu grande amor e a sua vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me fazer acreditar que é possível, sobretudo a existência de pessoas boas,
Ao meu pai, aos meus irmãos e ao meu cunhado, pelo apoio, pela compreensão e dedicação,
À minha orientadora, pela imensa contribuição que ultrapassou as barreiras do conhecimento, alcançando aspectos pessoais,
Ao meu co-orientador, Prof. Enéas, por sua valorosa contribuição,
À Profa. Ana Cristina, pela disposição em ajudar e sempre de forma muito generosa,
À Profa. Alaíde, pela enorme contribuição intelectual prestada de forma muito gentil a mim e a este estudo,
Ao Prof. Marcos Valério, pela demonstração diária de sua preocupação e generosidade,
À Daniele Okabe, pela paciência e dedicação e por dividir comigo a condução deste trabalho,
Aos amigos do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia/UFPA: Suellen, Roberto, Thays, Thamires, Elinalva, Adriana e Giovane, pela contribuição na forma de felicidade, compartilhada diariamente,
Aos amigos do PPGCF/UFPA: João Paulo, Ana Carla e Marcus, pela cumplicidade, pela reciprocidade, pelo companheirismo,
Aos colegas do LAFICO/Faculdade de Farmácia/UFPA: Bruno Pinheiro, Klayton, Fábio, Mayara, Lorena, Brunno Pinho, Diandra, Paula, pois suas inúmeras contribuições foram certamente uma parte essencial para este trabalho,
A todos os colegas do Laboratório de Fitoquímica da Faculdade de Farmácia/UFPA,
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia/UFPA,
A todos que indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho, que apesar de ser indiretamente, não foram menos que essenciais.
“Pensamentos valem e vivem pela observação exata ou nova, pela reflexão aguda ou profunda;
não menos querem a originalidade, a simplicidade e a graça do dizer.”
Machado de Assis
RESUMO
PAIXÃO, T.P. Estudo fitoquímico e avaliação do efeito antinociceptivo de uma fração rica em cumarina de Ayapana triplinervis (Asteraceae). Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2016. 106f. Ayapana triplinervis (Vahl) é uma planta medicinal nativa da Amazônia utilizada para o tratamento de dores. As cumarinas são seus constituintes químicos importantes, tendo sua presença, relação com seus efeitos farmacológicos. O seu efeito antinociceptivo foi demonstrado em animais tratados com extratos brutos, contudo, ainda não há estudos voltados a identificação de compostos responsáveis por este efeito. Deste modo, investigou-se a relação entre uma cumarina de A. triplinervis e o efeito antinociceptivo previamente demonstrado para esta espécie. Extratos de diferentes polaridades foram obtidos a partir da droga vegetal de partes aéreas da planta. Estes extratos foram submetidos às análises fitoquímicas, selecionando um extrato para obtenção de frações. O fracionamento foi realizado por cromatografia em coluna e as frações obtidas foram submetidas às análises cromatográficas e espectrais para seleção da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt). A composição química da FrCAt foi avaliada através de técnicas cromatográficas e espectrais, que permitiram a identificação do seu composto majoritário. A avaliação da toxicidade aguda e do efeito antinociceptivo da FrCAt foi realizada em camundongos. Os modelos de nocicepção foram o teste de contorção abdominal induzido por ácido acético e o teste da formalina. Nas análises fitoquímicas o extrato de acetato de etila apresentou melhor perfil para cumarinas, por isso o mesmo foi selecionado para fracionamento, onde foram obtidas 3 frações cumarínicas. Destas, uma apresentou melhor perfil cromatográfico e espectral, sendo selecionada para outras análises. Através das análises cromatográficas, observou-se existência de composto majoritário na fração que, após ser submetido a diferentes métodos espectrais, foi identificado como 6,7-(metilenodioxi)cumarina, conhecida como aiapina, pois foi isolada pela primeira vez de A. triplinervis. A FrCAt foi considerada com baixo potencial tóxico aguda, pois não causou mortes nem alterações comportamentais no teste de toxicidade. O efeito antinocipetivo foi constatato nos animais tratados por via oral com 5, 10 e 20 mg/kg de FrCAt, através da redução das contorções abdominais e redução do tempo de lambida da pata nas duas fases do teste da formalina. Em adicional a reversão do efeito da FrCAt promovido pela coadministração com naloxona (antagonista opioide), sugeriu que a fração exerça efeito antinociceptivo com envolvimento de receptores opioides. Dessa forma, infere-se que o composto majoritário da FrCAt, a aiapina, possivelmente foi responsável pelo efeito antinociceptivo da fração, atuando no sistema opioide. Este estudo demonstrou pela primeira vez o efeito da aiapina em modelo de dor, evidenciando a relação dessa cumarina com uso medicinal de A. triplinervis contra a dor.
Palavras-chave: Ayapana triplinervis; cumarinas; aiapina; efeito antinociceptivo.
ABSTRACT
PAIXÃO, T.P. Phytochemical study and antinociception evaluation of fraction rich in coumarins from Ayapana triplinervis (Asteraceae). Dissertation (Master) Pos-Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pará, Belem, 2016. 106f. Ayapana triplinervis (Vahl) is a native medicinal plant from the Amazon used for the treatment of pain. Coumarins are your important chemical constituents because they were related to your pharmacological effects. The antinociceptive effect was demonstrated in animals treated with crude extracts of the plant, however, there are no studies aimed at identifying compounds responsible for this effect. Thus, we investigated the relationship between a coumarin from A. triplinervis and antinociceptive effect previously exerted by this plant. Extracts of different polarities were obtained from aerial parts of the plant. The extracts were submitted phytochemical analysis, so was selected an extract to obtain fractions.The obtained fractions was performed by column chromatography and the fractions obtained were subjected to chromatographic and spectral analyzes for selecting the Coumarin Fraction A. triplinervis (CFAt). The chemical composition of CFAt was evaluated by chromatographic and spectral techniques, which allowed the identification of their major compound. The assessment of acute toxicity and the antinociceptive effect of the CFAt were carried out in mice. The nociception models were writhing test induced by acetic acid and formalin test. In the phytochemical analysis the ethyl acetate extract showed the best profile for coumarins, so it was selected for fractionation, which was obtained three fractions containing coumarins. Through chromatographic analysis was observed the presence of major compound in the fraction, the compound was identified by different spectral methods 6,7-(Methylenedioxy)coumarin, called ayapin, a coumarin which was first isolated from A. triplinervis.The CFAt was considered low acute toxic potential due not cause deaths or behavioral changes in toxicity testing. Antinociceptive effect was observed in animals treated orally with 5, 10 and 20 mg/kg of CFAt due reducing writhings and reduction of paw licking time in both phases of the formalin test. In additional, the reversal of the effect of CFAt caused by coadministration with naloxone (opioid antagonist) suggested that the fraction exert antinociceptive effect at opioid receptors. Thus, we show that the majority compound of the CFAt, identified as ayapin, was possibly responsible for the antinociceptive effect of the fraction and acting on opioid system. This study demonstrated for the first time the effect of Ayapin on pain model, showing the relationship of this coumarin with medicinal use of A. triplinervis against pain.
Keywords: Ayapana triplinervis; coumarins; ayapin; antinociceptive effect.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Imagens de Ayapana triplinervis (Vahl). 19
Figura 2: Principais compostos identificados no óleo essencial de A.
triplinervis.
28
Figura 3: Cumarinas isoladas de A. triplinervis. 34
Figura 4: Estrutura molecular do ácido o-hidroxicinâmico (23) e a molécula
resultante de sua lactonização, a 1,2-benzopirona (24), sendo esta
o protótipo da classe das cumarinas.
43
Figura 5: Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal. 52
Figura 6: Esquema de obtenção dos extratos de diferentes polaridades de A.
triplinervis.
58
Figura 7: Prospecção fitoquímica por cromatografia de camada delgada da
droga vegetal de A. triplinervis e seus extratos de diferentes
polaridades.
74
Figura 8: Espectro de absorção (A) na região do UV-VIS dos extratos de A.
triplinervis.
76
Figura 9: Análise por cromatografia de camada delgada das frações do
extrato de acetato de etila de A. triplinervis obtidas em coluna
cromatográfica.
77
Figura 10: Espectro de absorção (A) na região do UV-VIS das frações
cumarínicas obtidas do extrato de acetato de etila de A. triplinervis,
evidenciando os picos de absorção característicos de cumarinas.
78
Figura 11: Perfis cromatográficos exploratórios obtidos por CLAE-DAD com
detecção em 280 nm.
80
Figura 12: Espectro de absorção no infravermelho da Fração Cumarínica de A.
triplinervis (FrCAt).
81
Figura 13: Dados cromatográficos e espectrais da Fração Cumarínica de A.
triplinervis (FrCAt).
82
Figura 14: Espectro de RMN de 1H da Fração Cumarínica de A. triplinervis
(FrCAt) (CDCl3, 400 MHz).
84
Figura 15: Espectro de RMN de 13C da Fração Cumarínica de A. triplinervis
(FrCAt) (CDCl3, 400 MHz).
85
Figura 16: Espectro de RMN de 13C DEPT 135 da Fração Cumarínica de A.
triplinervis (FrCAt) (CDCl3, 400 MHz).
85
Figura 17: Efeito da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt), v.o., sobre
as contorções induzidas pelo ácido acético 0,6 %, i.p., em
camundongos:
87
Figura 18: Teste da Formalina. 91
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Dados etnofarmacológicos de Ayapana triplinervis. 21
Quadro 2: Constituintes identificados no extrato metanólico das folhas de A.
triplinervis por CG/EM. 27
Quadro 3: Principais compostos do óleo essencial de A. triplinervis, obtido em
diferentes localizações geográficas no mundo. 31
Quadro 4: Classificação de todos os compostos identificados no óleo essencial
de A. triplinervis. 33
Quadro 5: Parâmetros utilizados na prospecção fitoquímica por Cromatografia de
Camada Delgada. 59
Quadro 6: Parâmetros utilizados para fracionamento do extrato de acetato de
etila em coluna cromatográfica. 60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Gradiente da fase móvel utilizada na análise por CLAE-DAD 61
Tabela 2: Gradiente da fase móvel empregada na análise por CLAE-DAD-
EM/ESI.
63
Tabela 3: Parâmetros farmacognósticos da droga vegetal de A. triplinervis para
controle de qualidade.
68
Tabela 4: Rendimento dos extratos de A. triplinervis. 68
Tabela 5: Prospecção fitoquímica realizada através de testes de coloração e
precipitação com a droga vegetal de A. triplinervis e seus extratos de
diferentes polaridades, evidenciando o uso de uma droga vegetal
padrão para cada reação.
69
Tabela 6: Rendimento das frações do extrato de acetato de etila de A. triplinervis
obtidas em coluna cromatográfica.
77
Tabela 7: Comparação entre os dados de RMN de 1H e 13C registrados na
literatura para a molécula aiapina e os resultados obtidos para a
Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt).
84
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5-HT Serotonina
A Absorbância
AA Ácido Araquidônico
ACN Acetonitrila
AFD Neurônios de Amplas Faixas Dinâmicas
AINEs Anti-inflamatórios não Esteróides
ANOVA Análise da Variância
Bk Bradicinina
CAT Catalase
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia de Camada Delgada
CG Cromatografia Gasosa
CGRP Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina
CL Cromatografia Líquida
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COX Ciclo-oxigenase
DAD Detector de Arranjo de Diodos
DPPH 1,1-difenil-2-picril-hidrazil
EAAt Extrato de Acetato de Etila de A. triplinervis
EHAt Extrato Hexânico de A. triplinervis
EM Espectrometria de Massas
EMAt Extrato Metanólico de A. triplinervis
ESI Ionização por Spray de Elétrons
FAP’s Fibras Aferentes Periféricas
FrCAt Fração Cumarínica de A. Triplinervis
GSH Glutationa Redutase
GSSG Glutationa Oxidase
HAcOEt Extrato de Acetato de Etila
i.p. intraperitoneal
i.pt. intraplantar
IASP International Association for the Study of Pain
IL Interleucina
IV Infravermelho
LTB4 Leucotrieno B4
LTs Leucotrienos
MDA Malondialdeído
MPO Mieloperoxidase
NO Óxido Nítrico
OECD Organization of Economic Cooperation and Development
PGE2 Prostaglandina E2
PGs Prostaglandinas
ppm parte por milhão
RMN Ressonância Magnética Nuclear
s.c. subcutâneo
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
SP Substância P
TAE Tumor Ascítico de Ehrlich
TMS Tetrametilsilano
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
UFPA Universidade Federal do Pará
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
UV Ultravioleta
v.o. via oral
VIS Visível
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 17 2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................... 19 2.1 Ayapana triplinervis Vahl............................................................................................ 19 2.1.1 ASPECTOS BOTÂNICOS.......................................................................................... 19 2.1.2 ETNOFARMACOLOGIA............................................................................................. 20 2.1.3 CONSTITUINTES QUÍMICOS.................................................................................... 26 2.1.3.1 Compostos do óleo essencial.................................................................................. 27 2.1.3.2 Cumarinas............................................................................................................... 34 2.1.4 AÇÃO FARMACOLÓGICA......................................................................................... 35 2.1.4.1 Efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório............................................................... 37 2.1.4.2 Efeito antioxidante e hepatoprotetor........................................................................ 38 2.1.4.3 Efeito antifúngico..................................................................................................... 40 2.1.4.4 Efeito antibacteriano................................................................................................ 41 2.2 Aspectos gerais sobre a classe das cumarinas....................................................... 42 2.2.1 EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE CUMARINAS DE ORIGEM NATURAL.............. 45 2.3 Nocicepção e fisiopatologia da dor........................................................................... 47 2.3.1 COMPONENTES DA NOCICEPÇÃO....................................................................... 48 2.3.2 MECANISMOS DE TRANSMISSÃO NOCICEPTIVA............................................... 49 2.3.3 SISTEMA OPIOIDE.................................................................................................... 53 3 OBJETIVO........................................................................................................................ 54 3.1 Objetivo geral............................................................................................................... 54 3.2 Objetivos específicos.................................................................................................. 54 4 MATERIAIS e MÉTODOS................................................................................................ 55 4.1 Coleta e identificação botânica.................................................................................. 55 4.2 Obtenção da droga vegetal......................................................................................... 55 4.3 Análises farmacognósticas da droga vegetal........................................................... 55 4.3.1 PERDA POR DESSECAÇÃO..................................................................................... 55 4.3.2 TEOR DE CINZAS TOTAIS........................................................................................ 56 4.3.3 TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS............................................................................... 56 4.4. Obtenção dos extratos............................................................................................... 57 4.5 Prospecção fitoquímica.............................................................................................. 58 4.6 Obtenção de frações cumarínicas por Cromatografia em Coluna (CC)............... 59 4.7 Obtenção do perfil espectral na região do UV-Visível (UV-VIS)............................ 60 4.8 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodo (CLAE-DAD).........................................................................................
61
4.9 Obtenção do espectro no Infravermelho (IV)........................................................... 62 4.10 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas (CLAE-EM)............................................................................
62
4.11 Obtenção do espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)...................... 63 4.12 Avaliação farmacológica........................................................................................... 63 4.12.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO......................................................................... 63 4.12.2 DROGAS E TRATAMENTOS................................................................................... 64 4.12.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA................................................................... 64
4.12.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA....................................................... 65 4.12.4.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético.............................. 65 4.12.4.2 Teste da formalina................................................................................................. 65 4.12.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................... 66 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................
67
5.1 Análises farmacognósticas........................................................................................ 67 5.2 Rendimento dos extratos........................................................................................... 68 5.3 Prospecção fitoquímica.............................................................................................. 68 5.3.1 TESTES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO......................................................... 68 5.3.2 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA........................................................... 71 5.4 Perfil espectral dos extratos na região no UV-VIS................................................... 75 5.5 Frações obtidas por Cromatografia em Coluna (CC)............................................... 76 5.6 Perfil espectral das frações na região no UV-VIS..................................................... 77 5.7 Perfil cromatográfico por CLAE-DAD........................................................................ 78 5.8 Espectro no Infravermelho (IV).................................................................................. 80 5.9 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas (CLAE-EM)..........................................................................................................................
81
5.10 Espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)........................................... 83 5.11 Avaliação farmacológica........................................................................................... 86 5.11.1 TOXICIDADE ORAL AGUDA................................................................................... 86 5.11.2 EFEITO ANTINOCICEPTIVO................................................................................... 86 5.11.2.1 Contorções abdominais induzidos por ácido acético............................................ 86 5.11.2.2 Teste da Formalina................................................................................................ 89 6 CONCLUSÃO................................................................................................................... 94 REFERÊNCIAS................................................................................................................... 95 ANEXO................................................................................................................................ 106
17
1 INTRODUÇÃO As plantas medicinais constituem umas das principais medidas utilizadas em
práticas complementares em saúde. O uso de plantas como único e eficaz recurso
terapêutico ainda é observado, sobretudo, em regiões onde há o
subdesenvolvimento socioeconômico e em regiões onde a população expressa um
rico conhecimento tradicional acerca de terapias alternativas (WHO, 2002).
Neste cenário, observa-se que o uso de plantas medicinais representa uma
possibilidade para a descoberta de novos fármacos capazes de demonstrar eficácia
e segurança semelhantes aos existentes, contudo, com a menor ocorrência de
efeitos adversos (BALUNAS e KINGHORN, 2005).
O tratamento farmacológico de dores é constituído pela utilização de variados
medicamentos das classes dos Anti-Inflamatórios Não Esteroides (AINEs), dos
corticosteroides e dos analgésicos opioides (KOPF e PATEL, 2010). Os AINEs são
os analgésicos mais comumente utilizados, apesar de sua eficácia e segurança bem
estabelecidas, a administração em longo prazo pode induzir efeitos indesejáveis
como úlceras gastrointestinais, sangramentos e complicações cardiovasculares
(VONKEMAN e VAN DE LAAR, 2010; SOSTRES, 2010). As alternativas
terapêuticas diante destes problemas são limitadas, pois outras classes de
medicamentos para combate a dor apresentam reações adversas recorrentes
(BENYAMIN et al. 2008).
Em contrapartida, os AINEs, encontram-se entre os medicamentos mais
utilizados no mundo, incluindo os prescritos e não prescritos (PILOTTO, 2010).
Considerando a demanda por estes medicamentos e as reações adversas comuns
compartilhadas por eles, as plantas medicinais constituem uma considerável fonte
para a pesquisa e desenvolvimento de novos analgésicos com menor ocorrência de
efeitos adversos.
Neste aspecto, evidencia-se a espécie Ayapana triplinervis (Vahl), uma planta
medicinal nativa da Amazônia, conhecida popularmente na região como Japana.
Esta planta apresenta utilização difundida em todo Brasil e em outros países da
América Latina, Caribe e países asiáticos. Dentre suas indicações de uso medicinal
têm sido relatados a sua utilização em diferentes preparações para o tratamento de
dores (VAN DEN BERG et al. 1984; DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2000; DEFILIPPS et
18
al. 2006; SREEKEESOON e MAHOMOODALLY, 2014; AHMAD et al. 2014;
VÁSQUEZ et al. 2014).
Quanto à sua constituição química, destacam-se as cumarinas, já tendo sido
isolados sete, das quais, dois pela primeira vez a partir da espécie, a aiapanina (7-
metoxicumarina) e a aiapina (6,7-(metilenodioxi)cumarina) (BOSE e ROY, 1936;
GARG e NIGAM, 1970; NATAJARAM e NATAJARAM, 1979; CHATURVEDI e
MULCHANDANI, 1989; TRANG et al. 1992 e 1993). As cumarinas são importantes
no aspecto farmacológico de A. triplinervis, pois foram correlacionadas a ações
terapêuticas apontadas no uso médico-cultural da planta (ARUNG et al. 2012).
O efeito antinociceptivo de A. triplinervis foi demonstrado em modelos animais
com a administração oral de extratos brutos (PARIMALA et al. 2012; MELO et al.
2013;), contudo, ainda não há estudos voltados a identificação das frações e/ou
compostos isolados que possivelmente sejam os responsáveis por este efeito. Deste
modo, o presente estudo investigou a relação entre a cumarina majoritária de A.
triplinervis e o efeito antinociceptivo previamente demonstrado para espécie.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Ayapana triplinervis Vahl. 2.1.1 ASPECTOS BOTÂNICOS
Ayapana triplinervis (Vahl) R.M. King & H. Robinson (Figura 1) é o nome
científico oficial e atualizado da espécie, que tem como sinonímias Eupatorium
triplinerve Vahl e Eupatorium ayapana Veuten (ou Vent.). Pertencente à família
Asteraceae, trata-se de uma erva bastante delicada, perene, de caule ereto
semilenhoso na base, ferrugíneo e glabro; folhas (4,5-10,5 cm de comprimento e
0,8-1,7 cm de largura) são aromáticas, suaves, simples, opostas, subsésseis,
glabras, lanceoladas, acuminadas e triplinervada; as flores são reunidas em
capítulos dispostos terminalmente cada um medindo cerca de 6-13 milímetros de
comprimento; fruto tipo aquênio, alongado, anguloso, estriado e diminuto com
papilho do mesmo tamanho (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2000).
Figura 1: Imagens de Ayapana triplinervis. A e B: Em seu habitat natural (Fonte: arquivo
próprio). C: Ilustração da espécie (Fonte: Tropilab®inc, 2013).
A C B
20
2.1.2 ETNOFARMACOLOGIA
No Brasil, A. triplinervis é conhecida popularmente como Japana, Aiapana,
Iapana, Erva-de-cobra, Japana Branca, Japana Roxa, Erva-santa, Pimenta
malagueta. Na Índia é conhecida como Ayapan, Vishalyakarani, Ayaapaana,
Ayapanai, Ayapani (Maharashtra). Nas ilhas da Reunião e Maurícia, a espécie é
localmente conhecida como Ayapana; em Bangladesh além de Ayapana e também
conhecida como Bishallakarani; e na Indonésia, Belabetan. Em Trinidad e Tobago, a
espécie tem as seguintes denominações tradicionais: Ayapana, Japanne, 'z'herbe à
femme'. Na Guiana Francesa: Aiapana, Ayapana, Diapana, the de l'Amazone. No
Suriname: Sekrepatoewiwiri, Sekrepatoe-wiwiri, Sekrepatoe wiri, Sekrepatu wiwiri.
Os estudos relatam, em sua grande maioria, o uso das folhas de A.
triplinervis. Infusões e decocções prevalecem para uso interno e o sumo/suco para
uso externo. Apresenta-se no Quadro 1 os estudos etnofarmacológicos que
registraram as distintas formas e finalidades de uso de A. triplinervis em diferente
regiões.
21
Finalidade de uso Parte utilizada Forma de utilização País Referência Acne Folhas Sumo Índia (GHOSH, 2008)
Adstringente Folhas Infusão Brasil, Peru (MORS et al. 2000; AGAPITO e SUNG et al. 2003) Sumo Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Aftas Folhas Não citado Brasil (LE COINT, 1947) Infusão Brasil (BALBACH, 1995)
Anemia Folhas Extrato Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Angina Infusão Brasil (MOREIRA, 1996; LE COINT, 1947; DI STASI, 1989) Planta Infusão Brasil (BALBACH, 1995) Folhas Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984)
Antisséptico Folhas Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014) Decocção Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Cicatrização de úlceras/feridas Folhas
Decocção Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Sumo Brasil (LE COINT, 1947; AGAPITO e SUNG et al. 2003) Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003)
Sumo Peru (BALBACH, 1995) Maurício (SAMOISY e MAHOMOODALLY, 2015)
Cataplasma Maurício (NUNKOO E MAHOMOODALLY, 2012) Índia (DEEPTHY et al. 2014)
Cólera Planta Infusão Brasil (MOREIRA, 1996) Folhas Infusão Brasil (DI STASI, 1989) Folhas Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984)
Cólica Folhas Infusão Peru (BRACK EGG, 1999) Sumo Peru (ARÉVALO, 1994) Não citado Ilhas Mascarenhas (POURCHEZ, 2016)
Colite Partes aéreas Decocção Maurício (MAHOMOODALLY e SREEKEESOON, 2014) Constipação intestinal Folhas Decocção Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Depurativo Folhas Infusão Peru (BRACK EGG, 1999) Sumo Peru (ARÉVALO, 1994)
Desordens hepáticas
Folhas Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003)
Folhas Decocção Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002) Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Planta Não citado Brasil (VIEIRA, 1992) Quadro 1: Dados etnofarmacológicos da espécie Ayapana triplinervis. (continua)
22
Finalidade de uso Parte utilizada Forma de utilização País Referência
Diarreia Folhas
Decocção Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Infusão Brasil (DEFILIPPS et al. 2006) Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984; LE COINT, 1947) Infusão Brasil (BALBACH, 1995) Infusão Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002) Chá Brasil (VÁSQUEZ et al. 2014)
Partes aéreas Decocção Maurício (MAHOMOODALLY e SREEKEESOON, 2014)
Digestivo Folhas
Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984; LE COINT, 1947) Infusão Brasil (BALBACH, 1995)
Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014) Maurício (MAHOMOODALLY e MUTHOORAH, 2014) Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Disenteria Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000; DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002)
Dor estomacal Folhas Sumo Peru (ARÉVALO, 1994) Infusão Maurício (SREEKEESOON e MAHOMOODALLY, 2014)
Partes aéreas Decocção Maurício (MAHOMOODALLY e SREEKEESOON, 2014)
Dor de cabeça Folhas
Não citado Brasil (VAN DEN BERG et al. 1984)
Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Maurício (SREEKEESOON e MAHOMOODALLY, 2014)
Sumo Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002) Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014) Chá Brasil (VÁSQUEZ et al. 2014)
Edema Folhas Sumo Peru (ARÉVALO, 1994) Emoliente Folhas Sumo Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003)
Escorbuto Folhas Não citado Brasil (LE COINT, 1947; BALBACH, 1995) Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Estimulante
Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000) Folhas Infusão Índia (BOSE e ROY, 1936) Planta Infusão Peru (BRACK EGG, 1999; SOPLIN et al. 1996) Folhas Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984)
Estimulante cardíaco Planta Não citado Índia (SINGH, 2012)
Expectorante Folhas Infusão Brasil (DI STASI, 1989) Chá e banhos Brasil (JARDIM, 2009)
Quadro 1: Dados etnofarmacológicos da espécie Ayapana triplinervis. (continua)
23
Finalidade de uso Parte utilizada Forma de utilização País Referência
Febre Folhas
Não citado Brasil (ELISABETHSKY et al. 1990, SANTOS et al. 2012) Sumo Brasil (DI STASI, 1989) Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Infusão Brasil AGAPITO e SUNG et al. 2003) Não citado Brasil (JONVILLE et al. 2008) Extrato Bangladesh (UDDIN et al. 2013) Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Gengivites Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000; LE COINT, 1947; BALBACH, 1995)
Gripe
Folhas Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Planta Não citado Brasil (VAN DE BERG, 1991) Folhas Chá e banhos Brasil (JARDIM, 2009) Planta Não citado Brasil (VIEIRA, 1992) Folhas Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Hemorragias Folhas Emplasto Peru (ARÉVALO, 1994) Pó Peru (BRACK EGG, 1999) Extrato Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Hemorroidas Folhas Infusão Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002)
Hemostático Folhas Infusão Índia (BOSE e ROY, 1936) Planta Não citado Índia (SINGH, 2012)
Hipertensão arterial Folhas Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Extrato Índia (DAS e BONDYA, 2015)
Inflamações Folhas Infusão Maurício (SAMOISY e MAHOMOODALLY, 2015)
Inflamação e dor urinária Folhas Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Chá Brasil (VÁSQUEZ et al. 2014)
Inflamação na garganta Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000; AGAPITO e SUNG et al. 2003) Insônia Folhas Infusão Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003)
Malária Partes aéreas Não citado Ilha da Reunião (JONVILLE et al. 2008) Folhas Decocção Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002)
Náusea Folhas Decocção Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Planta Não citado Guianas (DEFILIPPS et al. 2006)
Picadas de cobra Folhas
Infusão Brasil (BRACK EGG, 1999; MOREIRA, 1996; DI STASI, 1989) Infusão Peru (MORS et al. 2000) Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984) Decocção Brasil (MOURA et al. 2015)
Quadro 1: Dados etnofarmacológicos da espécie Ayapana triplinervis. (continua)
24
Finalidade de uso Parte utilizada Forma de utilização País Referência
Problemas nos olhos e ouvidos Planta Infusão Brasil (MOREIRA, 1996) Folhas Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Promover a menstruação Planta Infusão Argentina (MANFRED, 1977) Folhas Não citado Trinidad e Tobago (LANS, 2007b)
Resfriados Folhas
Não citado Brasil (VAN DEN BERG et al. 1984) Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006)
Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014) Maurício (MAHOMOODALLY e MUTHOORAH, 2014)
Sudorífico
Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000; BALBACH, 1995) Folhas Infusão Guianas (LE COINT, 1947) Folhas Infusão Peru (DEFILIPPS et al. 2006) Folhas Infusão Índia (BRACK EGG, 1999; AGAPITO e SUNG et al. 2003) Planta Infusão Peru (BOSE e ROY, 1936) Planta Infusão Peru (PASTOR et al. 1996)
Folhas Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984)
Tétano Folhas Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Infusão Brasil (MOREIRA, 1996; DI STASI, 1989)
Tônico Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000; BALBACH, 1995) Infusão Índia (BOSE e ROY , 1936) Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984; LE COINT, 1947)
Tosse
Folhas Infusão Brasil (MORS et al. 2000) Planta Não citado Brasil (VIEIRA, 1992)
Folhas Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014) Chá Brasil (VÁSQUEZ et al. 2014)
Tuberculose Planta Não citado Brasil (VIEIRA, 1992)
Tumor Folhas Infusão Peru (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Planta Não citado Argentina (BECKSTRONG-STERNBERG, 1994)
Úlceras Folhas Decocção Paquistão (AHMAD et al. 2014)
Úlceras bocais/infecções
Folhas Infusão Brasil (MORS et al.) 2000 Folhas Infusão Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Planta Infusão Brasil (MOREIRA, 1996) Folhas Não citado Brasil (PIO CORREA, 1984)
Úlceras gástricas Folhas Não citado Brasil (VAN DEN BERG et al. 1984) Quadro 1: Dados etnofarmacológicos da espécie Ayapana triplinervis. (continua)
25
Finalidade de uso Parte utilizada Forma de utilização País Referência
Verminoses Folhas Não citado Trinidad e Tobago (LANS, 2007a) Infusão Brasil (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002) Decocção Maurício (MAHOMOODALLY e MUTHOORAH, 2014)
Vômito Folhas Infusão Brasil (AGAPITO e SUNG et al. 2003) Planta Não citado Guianas (DEFILIPPS et al. 2006) Partes aéreas Decocção Maurício (MAHOMOODALLY e SREEKEESOON, 2014)
Quadro 1: Dados etnofarmacológicos da espécie Ayapana triplinervis.
26
2.1.3 CONSTITUINTES QUÍMICOS
As cumarinas foram os primeiros compostos isolados de A. triplinervis e
muitos estudos foram dedicados à identificação de compostos do seu óleo essencial.
Além disso, testes de triagem fitoquímica por coloração e precipitação têm detectado
diferentes classes de metabólitos secundários.
O extrato aquoso de partes aéreas de A. triplinervis foi submetido à
cristalização, o resíduo resultante desta técnica sofreu análise cromatográfica, na
qual, identificaram-se três compostos: éter dimetílico da timol hidroquinona,
timoquinona e éter metílico do timol. Sendo a timoquinona obtido com maior
rendimento e pela primeira vez isolada (TRANG et al. 1993).
A triagem fitoquímica de cinco diferentes extratos da planta (hexano; éter de
petróleo; metanol; clorofórmio:metanol [1:1, v/v]; clorofórmio:metanol [4:1, v/v])
obtidos das folhas A. triplinervis, demonstrou reações positivas para alcaloides (com
exceção do extrato metanólico), terpenos (com exceção do extrato metanólico),
esteroides, fenóis, taninos, flavonoides (com exceção do extrato metanólico e de
éter de petróleo) e heterosídeos antraquinônicos (com exceção do extrato
metanólico e clorofórmio: metanol [1:1, v/v]) (FACKNATH e LALLJEE 2008).
A fração metanólica obtida por fracionamento do extrato metanólico em
coluna cromatográfica de sílica-gel, foi submetida à análise por Cromatografia
Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massa (CG/EM). No total, 10 compostos
pertencentes a diferentes classes foram identificados, incluindo ácidos graxos,
alcanos, alcenos, álcoois, álcoois graxos e ésteres (Quadro 2), sendo o ácido
hexadecanoico, o composto majoritário (SELVAMANGAI e BHASKAR, 2012)
27
Composto Classe Propriedade e aplicações Ácido tetradecanoico Ácido
graxo Antioxidante, prevenção do câncer, nematicida, hipercolesterolêmica,
lubrificante 2,6,10-trimetil,14-etileno-14-
pentadeceno Alceno Antiproliferativa
7-butil-biciclo[4,1,0]heptano Alcano Não conhecida
Ácido 8-metildecanoico Ácido graxo
Condimento, nematicida, pesticida
1-undecanol Álcool graxo
Condimento, perfumaria
Ácido hexadecanoico Ácido graxo
Antioxidante, hipocolesterolêmico, nematicida, hemolítica, inibidor da 5-alfa-
redutase
1-hexil-1-nitrociclohexano Alcano Antioxidante, antimicrobiano e anti-inflamatório
1,14-tetradecanediol Álcool Antimicrobiano
Ácido 2-hidroxi-1,3-
propanediloctadecanoico Ácido graxo
Hipocolesterolêmico, antiarrítmico, nematicida, inibidor da 5-alfa redutase,
antiacneico, hepatoprotetor. 2-hidroxi-3-[(9E)-9-octadecenoloxi]
propila-(9E)-9-octadecenoato Éster Não registrada
Quadro 2: Constituintes identificados no extrato metanólico das folhas de A. triplinervis por CG/EM. Fonte: Selvamangai e Bhaskar (2012).
Na prospecção fitoquímica do extrato de éter de petróleo obtido das folhas de
A. triplinervis foram detectados esteroides, carboidratos, taninos, glicosídeos e
alcaloides (PARAMILA et al. 2012).
2.1.3.1 Compostos do óleo essencial
A análise do óleo essencial obtido das folhas de A. triplinervis coletada na
Índia identificou os compostos majoritários selina-4(15),7(11)-dien-8-ona (13;
36,6%); β-cariofileno (3; 14,7%); δ-elemeno (8; 5,9%); β-sesquifelandreno (5; 4,7%)
(Figura 2; GUPTA et al. 2004). Já o óleo essencial da espécie obtido de folhas e
caule, coletados no estado do Amapá, no norte do Brasil, apresentou como
constituintes majoritários o éter dimetílico da timol hidroquinona ou 2,5-dimetoxi-ρ-
cimeno (15; 69,7%); β- cariofileno (3, 19,7%) (Figura 2) (MAIA et al. 1999).
28
Gauvin-Bialecki e Marodon, em 2009, realizaram um estudo com o óleo
essencial obtido das folhas de A. triplinervis coletada em diferentes estágios de
desenvolvimento em três regiões distintas na Ilha da Reunião (Réunion), território
francês localizado ao leste de Madagascar. Neste estudo, 47 compostos foram
identificados em três amostras de óleo essencial, sendo o derivado aromático éter
éter dietílico da timol hidroquinona (15), o composto predominante, totalizando 89,9–
92,8%, seguido pelo hidrocarboneto sesquiterpênico β-selineno (4) com 2,1–3.4%
(Quadro 3).
Figura 2: Principais compostos identificados no óleo essencial de A. triplinervis. (1) α-felandreno, (2)
α-terpineol, (3) β-cariofileno, (4) β-selineno, (5) β-sesquifelandreno, (6) borneol, (7) acetato de bornil (8) δ-elemeno, (9) dipenteno, (10) isoeugenol, (11) linalol, (12) sabineno, (13) selina-4(15),7(11)-dien-8-ona, (14) 2-tert-butil-1,4-dimetoxibenzeno, (15) éter dimetílico da timol hidroquinona.
O estudo realizado por Gauvin-Bialecki e Marodon (2009) relacionou à
influência do local de coleta e estágio de desenvolvimento na expressão dos
constituintes do óleo essencial. A principal variação observada foi entre os
29
componentes identificados em menor quantidade, pois entre constituintes
majoritários, o teor foi semelhante nas três amostras coletadas em locais diferentes.
Então, o estudo considerou que não houve influência do estágio de desenvolvimento
da planta na expressão dos constituintes do óleo essencial de A. triplinervis. A partir
desta observação, os autores concluíram que a composição do óleo essencial da
espécie depende principalmente da localização geográfica, devido às condições
climáticas de cada região coletada.
Gauvin-Bialecki e Marodon (2009) também vincularam aos seus dados,
informações de quatro estudos com o óleo essencial de A. triplinervis, realizados em
diferentes localizações geográficas (GARG e NIGAM, 1970; GARG e NAKHARE,
1993; MAIA et al. 1999; GUPTA et al. 2004) e estabeleceram uma comparação entre
eles a partir do percentual dos constituintes com maior rendimento (maior que 4%).
Com base nisto, os autores sugeriram a existência de dois grupos
quimiotaxonômicos: no primeiro grupo, espécies que sintetizam principalmente
composto éter dimetílico da timol hidroquinona (15), descritos em estudos com
amostras coletadas no Brasil e na região de Saugar na Índia; no segundo grupo,
espécies que produziram principalmente o composto selina-4(15),7(11)-dien-8-ona
(13), descrito em estudos com amostras coletadas na região de Lucknow na Índia
(Quadro 3).
O estudo considerou que as amostras de A. triplinervis coletadas na Ilha de
Reunião, com maior percentual de éter dimetílico da timol hidroquinona (15), podem
ser incluídas no primeiro grupo quimiotaxônomico. E neste grupo, por haver outros
componentes expressivos, os autores sugeriram uma subdivisão em três
quimiotipos: o primeiro, éter dimetílico da timol hidroquinona (15)/α-
felandreno(1)/borneol(6) (Saugar/Índia); o segundo, éter dimetílico da timol
hidroquinona(15)/β-cariofileno(3) (Brasil); e o terceiro, somente o éter dimetílico da
timol hidroquinona (Ilha da Reunião) (GAUVIN-BIALECKI e MARODON, 2009) .
Begum et al. (2010), analisaram a constituição química do óleo essencial
obtido de partes aéreas de A. triplinervis coletada em Chittagong, Blangladesh. No
total, 30 compostos foram identificados, sendo o 2-terc-butil-1,4-metoxibenzeno (14;
74,27%) e o β-selineno (4; 8,59%) em maior quantidade (Quadro 3). Nota-se que os
dados referentes aos compostos majoritários deste estudo não permitem a sua
inclusão na classificação quimiotaxonômina proposta por Gauvin-Bialecki e Marodon
30
(2009), pois o composto majoritário obtido por Begum et al. (2010) difere daqueles
que pertenciam a chave do grupo quimiotaxonômico proposto.
A análise do óleo essencial obtido separadamente das folhas e dos caules
frescos da planta coletada no estado indiano de Querala demonstrou um total de 18
compostos identificados no óleo das folhas e 14 no óleo dos caules (Quadro 3). O
composto majoritário em ambos as amostras foi o éter dimetílico da timol
hidroquinona (15), com 86,92% e 80,3% de rendimento no óleo dos caules e no óleo
das folhas, respectivamente (KUMAR et al. 2014).
O estudo de Kumar et al. (2014) foi único trabalho publicado que descreveu o
isolamento de compostos do óleo essencial da planta. O isolamento foi realizado por
coluna cromatográfica de sílica-gel, utilizando três solventes como fase móvel. O
primeiro solvente, éter de petróleo, separou os derivados hidrocarbonetos com
rendimento de 8,28% para óleo das folhas e 8,34% para óleo do caule; o segundo
solvente, acetato de etila, separou o composto majoritário com rendimento de
79,12% para óleo das folhas e 82,14% para óleo do caule; o terceiro solvente,
metanol, separou compostos oxigenados polares com rendimento de 9,8% e 8,3%
para óleo das folhas e caules, respectivamente. O composto majoritário teve
elucidação estrutural realizada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), sendo
identificado como éter dimetílico da timol hidroquinona (15).
31
País Local de coleta Parte *% Compostos (> 4%) **% Referência
Brasil Lago Grande, Macapá- AP
Folhas e
Caule 0,4
Éter dimetílico da timol hidroquinona 69,7 Maia et al.
(1999) β-cariofileno 19,7
Índia Saugar (Jardim Botânico) Flores 0,9
Éter dimetílico da timol hidroquinona 50,3
Garg e Nakhare (1993)
Borneol 5,8 α-terpineol 4,6 Isoeugenol 4,0
Índia Saugar (Jardim Botânico) Folhas 0,6
Éter dimetílico da timol hidroquinona 49,3
Garg e Nigam (1970)
α-felandreno 8,9 Borneol 8,0
Limoneno 7,3 Linalol 6,5
Sabineno 5,3 α-terpineol 5,2
Acetato de bornil 4,6
Índia
Lucknow (Campus de
Instituto Central de Plantas
Medicinais e Aromáticas)
Folhas 0,4
Selina-4(15),7(11)-dien-8-ona 36,6
Gupta et al. (2004)
β- cariofileno 14,7
δ-elemeno 5,9
β-sesquifelandreno 4,7
Ilha da Reunião
Saint-Denis Bellepierre Folhas 0,28 Éter dimetílico da timol
hidroquinona 98,0
Gauvin-Bialecki e Marodon,
(2009)
Ilha da Reunião
Saint Denis Saint-François Folhas 0,28 Éter dimetílico da timol
hidroquinona 97,3
Gauvin-Bialecki e Marodon,
(2009)
Ilha da Reunião Tampon Folhas 0,29 Éter dimetílico da timol
hidroquinona 97,1
Gauvin-Bialecki e Marodon,
(2009)
Bangladesh Chittagong Aéreas 1,10 2-tert-butil-1,4-
dimetoxibenzeno 92,8 Begum et al. (2010) β-selineno 8,59
Índia Querala
Caule 0,28
Éter dimetílico da timol hidroquinona 86,92
Kumar et al. (2014)
β-selineno 6,77 β-cariofileno 4,01
Folhas 0,4
Éter dimetílico da timol hidroquinona 80,3
β-selineno 9,94 β-cariofileno 5,7
Quadro 3: Principais compostos do óleo essencial de A. triplinervis, obtido em diferentes localizações geográficas no mundo. *% Rendimento bruto do óleo essencial **% Teor do composto no óleo essencial
32
Com base nos dados gerados por todos os estudos com óleo essencial de A.
triplinervis que visam elucidar sua composição química, observa-se a necessidade
de mais estudos para entender se a diferença na composição química do óleo
essencial desta espécie é uma consequência de fatores como localização
geográfica, influência climática, estágio de desenvolvimento da planta ou se são
quimiotipos definidos geneticamente. Isto possibilitaria uma classificação
quimiotaxonômica mais completa, a partir do que foi sugerido por Gauvin-Bialecki e
Marodon (2009).
O Quadro 4 apresenta todos os compostos químicos identificados no óleo
essencial de A. triplinervis, bem como, a classificação destes compostos.
33
Monoterpenos hidrocarbonetos
Monoterpenos oxigenados
Sesquiterpenos hidrocarbonetos
Sesquiterpenos oxigenados
Derivados aromáticos
champeno f
dimetilnona-1,3,7-trieno e
limoneno a, c,d,e
mirceno d
sabineno a,d,f
terpinoleno e,f
α-limoneno f
α-felandreno a,e,f
α-pineno d,e,f
α-terpineno d
α-tujeno e,f
β-mirceno e,f β-ocimeno e
β-felandreno e
β-pineno d,e,f
γ-perpineno d,e
(+) acetato de mirtenil f
borneol a,b
acetato de bornil a
cânfora c
acetato de cis-mirtenila f
cis-ρ-met-2-en-1-ol e
linalol a,e
acetato de nerila e aldeído perila c
acetato de terpinila f
acetato de trans-pinocarvila e
trans-piperitol e
trans-p-met-2-en-1-ol e
α-terpineol a,b,d,e
acetato de linanolg
cariofileno e cis-β-elemeno e
ciperadieno e cipereno c,e
drima-7,9(11)-dieno e
9,10-dihidroisolongifoleno f
isopatchoula-3,5-dieno e trans-calameno d
α-cubeneno d α-gurjuneno f
α-humuleno c,e,g α-selineno e,g β-cariofileno c,d,g
β-chamigreno c
β-elemeno e,f,g β-farneseno d,g
β-selineno e,f,g β-sesquifelandreno d
γ-cadineno c,g
γ-elemeno d
β- bourboneno g
β-guaiono g
α-muuroleno g
α-bisaboleno g
β-bisaboleno g
(E)-nerolidol e óxido cariofileno c,d,f,g selin-11-en-4-a-ol e
α-cadinol c
selina-4(15),7(11)-dien-8-one d
5-cedranona c
α-cadinol g
2-tert-butil-1,4-dimetoxibenzeno f
anetole f
benzaldeído e éter metilcarvacrol c,e
isoeugenol b
metilchavicol f
metilsalicylato e éter dimetílico da timol
hidroquinona a,b,c, e,g timol c,e,g
éter metiltimol c,e,f,g da timoquinona e ο-cimeno f
ρ-cimen-8-ol e ρ-cimene d,e
Quadro 4: Classificação de todos os compostos identificados no óleo essencial de A. triplinervis. a Garg e Nigam (1970) b Garg e Nakhare (1993) c Maia et al (1999) d Gupta et al (2004) e Gauvin-Bialecki e Marodon (2009) f Begum et al (2010) g Kumar et al. (2014)
34
2.1.3.2 Cumarinas
As cumarinas de A. triplinervis foram isoladas e identificadas principalmente
por estudos desenvolvidos na Índia (BOSE e ROY, 1936; NATAJARAM e
NATAJARAM, 1979; CHATURVEDI e MULCHANDANI, 1989).
A 6,7-(metilenodioxi)cumarina (16) foi isolado pela primeira vez em
preparações utilizando as folhas de A. triplinervis e recebeu o nome trivial de aiapina
(BOSE e ROY, 1936). Posteriormente, outro derivado cumarínico foi isolado pela
primeira vez das folhas da espécie, a 7-metoxicumarina (17) denominada como
aiapanina, (NATAJARAM e NATAJARAM, 1979).
Outras cumarinas foram isoladas da planta, dafnetina, éter dimetílico da
dafnetina, éter 7-metílico da dafnetina, hidragentina, umbeliferona (CHATURVEDI e
MULCHANDANI, 1989). Ao todo sete derivados cumarínicos foram isolados de A.
triplinervis (Figura 3).
Figura 3: Estruturas químicas das cumarinas isoladas de A. triplinervis.
(16) aiapina, (17) aiapanina, (18) dafnetina, (19) éter dimetílico da dafnetina, (20) éter 7-metílico da dafnetina, (21) hidragetina, (22) umbeliferona.
Trang et al. (1993), realizaram um estudo com o extrato aquoso de partes
aéreas de A. triplinervis, do qual foram isolados por cristalização do extrato bruto as
cumarinas aiapina (16) e aiapanina (17).
35
Begum et al. (2010) foram os únicos a demonstrar a identificação de uma
cumarina no óleo essencial de A. triplinervis, sendo ela a aiapanina (17) com um teor
0,16%.
O extrato metanólico obtido das folhas foi fracionado por cromatografia de
coluna e as frações foram usadas para isolamento dos compostos por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em escala preparativa. O composto isolado foi
analisado por RMN e identificado como 7-metoxicumarina (aiapanina; 17).
2.1.4 AÇÕES FARMACOLÓGICAS
Estudos têm avaliado efeitos farmacológicos in vitro e in vivo principalmente
de extratos obtidos das folhas de A. triplinervis, contudo, também se observa
avaliações a partir de extratos dos caules e com menor frequência das raízes. Estes
estudos estabelecem, em sua grande maioria, uma correlação com dados
etnofarmacológicos da planta.
Constatou-se atividade inseticida do extrato aquoso de A. triplinervis frente às
larvas de Spodoptera litura uma praga que infesta culturas agrícolas. O extrato
promoveu alta mortalidade das larvas em diferentes estágios de desenvolvimento,
demonstrando potencial para um futuro biopesticida (ASHOKARAJ e MAHADEV,
2013).
Realizou-se uma avaliação do efeito inseticida do extrato aquoso de A.
triplinervis frente às larvas de Spodoptera litura, uma praga que infesta culturas
agrícolas. Constatou-se alta mortalidade das larvas em diferentes estágios de
desenvolvimento a partir do tratamento com extrato aquoso, demonstrando que o
mesmo tem potencial para um futuro biopesticida (ASHOKARAJ e MAHADEV,
2013).
O extrato etanólico das folhas de A. triplinervis apresentou atividade anti-
helmíntica contra as espécies Pheritima posthuma e Ascardia galli, sendo a inibição
do crescimento dos parasitas semelhante ao controle positivo utilizado, o Albendazol
(SUBASH et al. 2012).
36
As folhas de A. triplinervis são utilizadas tradicionalmente para tratar
problemas de pele, tal como a ocorrência de manchas ocasionadas por
hiperpigmentação. Na tentativa de comprovar e identificar o princípio ativo
responsável por este efeito foi demostrado que a aiapanina (17), isolada do extrato
metanólico das folhas da espécie, inibiu a tirosinase, enzima que catalisa a formação
da melanina. Sendo assim, esta substância foi considerada responsável pela ação
despigmentante da planta (ARUNG et al. 2012).
A ação de A. triplinervis frente à coagulação sanguínea e hemostasia foi
avaliada através da determinação do tempo de sangramento em ratos tratados (v.o.)
com extrato aquoso e extrato metanólico. O extrato aquoso (50, 100 e 200 mg/kg)
demonstrou diminuição significativa no tempo de sangramento (114, 99 e 102
segundos, respectivamente) 60 min. após sua administração, quando comparado ao
grupo controle (161 segundos). De forma semelhante, o extrato metanólico (50
mg/kg) também demonstrou redução significativa no tempo de hemorragia 60 min.
após sua administração (RAJASEKARAN et al. 2010).
O extrato hidroalcoólico de partes aéreas de A. triplinervis demonstrou efeitos
no Sistema Nervoso Central (SNC) em ratos. Constatou-se atividade ansiolítica nas
doses de 400 mg/kg, 600 mg/kg e 800 mg/kg (v.o.), semelhante ao controle positivo
utilizado, o Diazepam; e atividade antidepressiva inicialmente com 200 mg/kg de
extrato (v.o.), sendo que nas doses a partir de 400 mg/kg este efeito foi tão intenso
quanto o controle positivo, a fluoxetina (MELO et al. 2013).
O tratamento (v.o.) com extrato metanólico, obtido das folhas de A. triplinervis,
por 7 dias nas doses de 100 e 200 mg/kg reduziu significativamente os efeitos
provocados pela colite induzida por ácido acético (3,0%, via intrarretal) em
camundongos. O extrato promoveu a recuperação do peso corporal e a diminuição
das lesões macroscópicas (ulceração hemorrágica, hiperemia, edema da mucosa)
no cólon dos animais, semelhante ao que foi observado para a droga padrão
utilizada como controle positivo, a ranitidina (50 mg/kg; v.o). Em adicional, o exame
histopatológico do cólon dos animais, tratados com o extrato, demonstrou a
recuperação de danos como a perda de células epiteliais, necrose seguida por
edema da mucosa e difusão da infiltração de células inflamatórias, constatando
assim o efeito antiulcerativo do extrato (KRISHNAN et al. 2014).
Tratamentos por via intraperitoneal (i.p.) com o extrato aquoso e extrato
etanólico das folhas de A. triplinervis foram eficazes contra a proliferação de células
37
tumorais em camundongos submetidos à indução ao Tumor Ascítico de Ehrlich
(TAE). Verificou-se o efeito citotóxico, contra as células do TAE, através do teste do
de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazólico) com IC50
(Concentração Inibitória Média) de 100,6 µg/ml para o extrato etanólico e 112,7
µg/ml para o extrato aquoso (MAITY et al. 2015).
Os extratos, aquoso e etanólico, administrados por i.p. foram capazes de
induzir a morte celular por apoptose. Análises microscópicas demostraram a
formação de vesículas apoptóticas na membrana celular e condensação da
cromatina nas células coletadas do TAE em camundongos, sendo estes processos
característicos de morte celular por apoptose. Os agentes anticancerígenos exercem
seus efeitos por este mecanismo, tal como o controle positivo utilizado nos ensaios,
o 5-fluoracil (5 mg/kg). Além disso, o ensaio por citometria de fluxo demonstrou que
as células cancerígenas do TAE tratadas com os extratos (dose IC50, por 24 horas)
predominantemente foram observadas na fase G1 ciclo celular, esta fase é a mais
longa do ciclo celular onde a célula pode receber estímulo não proliferativo,
confirmando o efeito antiproliferativo dos extratos (MAITY et al. 2015).
O tratamento com os extratos, aquoso e etanólico, foi capaz de reverter
condições comuns observadas durante a proliferação de células tumorais, como a
angiogênese, a perda de peso corporal e a diminuição do tempo de sobrevida.
Assim, os extratos foram considerados possíveis candidatos para o desenvolvimento
de um novo agente antitumoral natural. Sendo que, apesar de ambos demonstrarem
o mesmo efeito, o extrato etanólico apresentou melhores resultados em todos os
testes (MAITY et al. 2015).
2.1.4.1 Efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório
O tratamento (v.o.) com o extrato hidroalcoólico de A. triplinervis demonstrou
ação antinociceptiva dose-dependente no teste das contorções abdominais
induzidas por ácido acético (0,6%) em camundongos. Este efeito foi detectado a
partir de 200 mg/kg com menos intensidade do que o controle positivo, a
Indometacina (10 mg/kg; v.o.), contudo, na dose de 800 mg/kg o efeito foi tão
acentuado quanto ao do padrão (MELO et al. 2013). Submetido ao mesmo modelo
38
animal de nocicepção, o extrato de éter de petróleo das folhas da planta apresentou
efeito antinociceptivo nas doses de 100 mg/kg e 200 mg/kg (v.o.), contudo com
menor intensidade do que o controle positivo utilizado, a morfina (1 mg/kg
administração subcutânea) (PARIMALA et al. 2012).
O teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético não tem
especificidade entre o efeito antinociceptivo central e periférico, deste modo, outro
modelo experimental (o teste da formalina) foi avaliado a partir dos extratos
hidroalcoólico e de éter de petróleo de A. triplinervis. Ambos demonstraram efeito
antinociceptivo na primeira fase do teste, indicando possível ação na transmissão
central da dor (MELO et al. 2013; PARIMALA et al. 2012 ). Contudo o extrato
hidroalcoólico não apresentou efeito revertido pela coadministração com naloxona
(antagonista opioide), indicando que o seu efeito a nível central não tem participação
do sistema opioide (MELO et al. 2013).
A ação do extrato de éter de petróleo na segunda fase do teste da formalina
indica que o mesmo possivelmente atue na dor de origem inflamatória. De fato este
extrato apresentou efeito anti-inflamatório na dose de 200 mg/kg (v.o.), pois
promoveu a redução do edema de pata em ratos submetidos a administração de
carragenina (polissacarídeo sulfatado indutor da formação edema) (PARIMALA et al.
2012).
2.1.4.2 Efeito antioxidante e hepatoprotetor
O extrato hidroalcoólico de A. triplinervis (100-600 mg/kg; v.o) exerceu efeito
antioxidante in vivo em camundongos, observado através da redução de níveis de
Óxido Nítrico (NO) e de Malondialdeído (MDA) no sangue dos animais tratados. Na
dose de 800 mg/kg (v.o.), o extrato induziu um efeito pró-oxidante devido aumento
dos níveis de NO, contudo sem alterar os níveis de MDA (MELO et al. 2013).
Avaliou-se a atividade antioxidante in vitro dos extratos de éter de petróleo,
clorofórmico e metanólico de A. triplinervis, através do método de sequestro de
radical livre, estimado pela atividade do agente pró-oxidante 1,1-difenil-2-picril-
hidrazil (DPPH). Todos os extratos apresentaram atividade sequestrante de radical
livre, quando comparados ao composto padrão utilizado como controle positivo
39
(ácido ascórbico), contudo o extrato metanólico apresentou resultados mais
aproximados ao padrão (BISWAS et al. 2012).
O composto 7-metoxicumarina (aiapanina), isolado do extrato metanólico de
A. triplinervis, não demonstrou ação antioxidante in vitro, no modelo do DPPH
(ARUNG et al. 2012).
O tratamento oral com o extrato metanólico das folhas de A. triplinervis
promoveu a diminuição do dano hepático em ratos submetidos à administração de
tetracloreto de carbono (CCl4). Os animais tratados com doses de 100, 200 e 300
mg/kg do extrato apresentaram redução dos níveis de Transaminase Glutâmico
Pirúvico (TGP), Transaminase Glutâmico Oxalacético (TGO), fosfatase alcalina e
bilirrubina que têm seus níveis séricos aumentados na presença de lesões(BOSE et
al. 2007).
Ainda neste estudo foi realizada a mensuração in vivo de parâmetros de
estresse oxidativo após administração do extrato metanólico (100, 200 e 300 mg/kg;
v.o.). O tratamento com o extrato promoveu de forma dose-dependente, o aumento
a atividade da glutationa (agente antioxidante endógeno), a redução da peroxidação
lipídica, através da redução dos níveis de MDA e o incremento da atividade das
enzimas antioxidantes Catalase (CAT) e Superóxido Desmutase (SOD). Deste
modo, os autores sugeriram que o efeito hepatoprotetor está relacionado com a
ação antioxidante do extrato (BOSE et al. 2007).
Camundongos sofreram a inoculação de células tumorais para indução Tumor
Ascítico de Ehrlich (TAE), posteriormente, foram tratados com o extrato aquoso e
etanólico das folhas de A. triplinervis administrados via i.p. na dose de 150 mg/kg
durante 14 dias. No último dia de tratamento os animais foram sacrificados e o
fígado e os rins foram coletados para mensuração dos níveis de MDA, Glutationa
Redutase (GSH), Glutationa Oxidase (GSSG), CAT e SOD. Ambos os extratos
apresentaram efeito antioxidante devido alteração nos níveis de todos os parâmetros
mensurados quando comparado com o grupo controle positivo (5-fluoracil 5 mg/kg).
Este efeito foi observado através da redução da peroxidação lipídica que tem a
diminuição da concentração de MDA como parâmetro indicativo e aumento da
concentração das enzimas antioxidantes endógenos (GSH, GSSG, CAT e SOD),
sendo extrato etanólico mais efetivo (BEPARI et al. 2013)
O estudo da atividade antioxidante in vitro, através do método do DPPH,
demonstrou capacidade sequestradora de radicais livres do extrato metanólico das
40
folhas de A. triplinervis nas concentrações de 50 a 200 µg/mL, semelhante ao
composto utilizado como padrão, a quercetina, sendo a IC50 de 83,89 µg/mL para o
extrato e 52,28 µg/mL para a quercetina. Em adicional as mesmas doses do extrato
apresentaram efeito no ensaio da atividade antioxidante por redução férrica, sendo a
capacidade de redução, promovida pelo extrato, semelhante a quercetina
(KRISHNAN et al. 2014).
O tratamento com o extrato metanólico das folhas de A. triplinervis nas doses
de 100 e 200 mg/kg (v.o) demonstrou a diminuição dos níveis da enzima
mieloperoxidase (MPO) e de MDA no cólon de camundongos com colite induzida por
administração intrarretal de ácido acético. O dano no tecido do cólon aumenta o
nível de MPO e MDA. A MPO, uma enzima libertada a partir das vesículas de
armazenamento em neutrófilos, catalisa a formação de oxidantes citotóxicos, tais
como o peróxido de hidrogénio (H2O2), e N-cloramina durante estímulos
inflamatórios. O aumento dos níveis de MPO também resulta em aumento dos níveis
de MDA em tecidos do cólon, e pode iniciar um ciclo em cascata da formação de
radicais livres, favorecendo o desenvolvimento de inflamação e esgotando os níveis
de antioxidantes celulares. A diminuição de tais parâmetros constata a capacidade
antioxidante do extrato, sendo um mecanismo possível para explicar a reversão da
inflamação e ação antiulcerativa do extrato (KRISHNAN et al. 2014).
O extrato metanólico (100 e 200 mg/kg; v.o.) promoveu o reestabelecimento
dos níveis das enzimas antioxidantes CAT, glutationa peroxidase e glutatione-S-
transferase (GST), observado no cólon de camundongos com colite induzida por
ácido acético. Estas enzimas exercem um importante papel na eliminação dos
radicais livres, estes que têm sua formação aumentada por danos teciduais. Sendo
assim, a suplementação com o extrato demonstrou um possível mecanismo
adicional para recuperação do dano tecidual induzido por ácido acético em
camundongos, corroborando com seu efeito antioxidante (KRISHNAN et al. 2014).
2.1.4.3 Efeito antifúngico
O óleo essencial extraído de partes aéreas de A. triplinervis apresentou ação
antifúngica contra seis fungos, Alternaria alternate, Botryodiplodia theobromae,
41
Colletotrichum corchori, Curvularia luneta, Fusarium equiseti, Macrophomina
phaseolina. Observou-se neste estudo que em algumas cepas o óleo essencial
apresentou atividade antifúngica superior ao fármaco utilizado como controle
positivo, a Nistatina (BEGUM et al. 2010).
Os extratos de éter de petróleo, clorofórmico, de tetracloreto de carbono e de
acetato de etila obtidos das folhas de A. triplinervis demonstrou inibição do
crescimento de cepas fúngicas de Alternaria alternata, Curvularia luneta,
Colletotrichum corchori, Fusarium equiseti, Macrophomina phaseolina, Bryodiplodia
theobromae, Botryodiplodia theobromae, com dos extratos de tetracloreto de
carbono, clorofórmio e acetato de etila para Botryodiplodia theobromae. A inibição
máxima (73,5%) do crescimento fúngico foi registada contra Colletotrichum corchori,
a uma concentração de 100 µg/µl do extrato clorofórmico (RAHMAN e JUNAID,
2008).
Gupta et al. (2002) compararam a atividade antifúngica dos extratos de éter
de petróleo e metanólico obtidos das folhas de A. triplinervis. Verificou-se a inibição
do crescimento dos fungos Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Alternaria solani e
Fusarium solani para ambos os extratos, com melhores resultados para o de éter de
petróleo.
2.1.4.4 Efeito antibacteriano
O óleo essencial extraído de partes aéreas de A. triplinervis apresentou
eficácia moderada contra o crescimento de dez cepas bacterianas das seguintes
bactérias gran-positivas: Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus; e das seguintes bactérias gran-negativas: Escheriachia coli,
Pseudomonas spp., Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Vibrio
cholerae. A maior zona de inibição, testada em disco, foi registrada contra a
Salmonella typhi (23 mm), seguido por Shigella sonnei (19 mm) na concentração de
20 µl/disco (BEGUM, et al. 2010).
Os extratos de éter de petróleo, clorofórmico, tetracloreto de carbono, acetato
de etila extraídos das folhas de A. triplinervis (1000 µg/disco) apresentaram de
moderada a boa atividade antibacteriana contra as cepas de Bacillus subtilis,
42
Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichi coli, Vibrio
spp., Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi e
Pseudomonas aeruginosa. Sendo a maior zona de inibição (22 mm de diâmetro),
registada contra Vibrio spp. (RAHMAN e JUNAID, 2008).
O extrato de éter de petróleo apresentou ação antibacteriana superior ao
extrato metanólico, ambos obtidos das folhas de A. triplinervis, frente às bactérias:
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus
leuteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Vibrio
cholerae e Vibrio parahaemolyticus (GUPTA et al. 2002)
Lopes et al. (2014) demonstraram efeito antibacteriano de extratos
hidroalcoólicos de diferentes partes de A. triplinervis (folhas; folhas e caules; raízes;
caules). O extrato das folhas apresentou maior inibição para Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. O extrato de folhas e caules foi
mais efetivo na inibição de cepas de Enterococcus faecalis.
Em adicional, Lopes et al. (2014), testaram outros extratos obtidos das folhas
da planta (hexânico, de acetato de etila e metanólico) contra as mesmas cepas
bacterianas. Os testes demonstraram que o extrato metanólico apresentou melhor
inibição do crescimento das cepas, motivando a sua escolha e seleção para
fracionamento biomonitorado com atividade antibacteriana frente às cepas de P.
aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis, E. coli e E.coli de isolado
clínico. Observou-se que as frações de baixa polaridade ou polaridade intermediária
foram as mais efetivas contra todas as cepas. As melhores atividades foram
constatadas contra E. coli de frações de hexano e diclorometano/acetato de etila e
contra E. coli oriunda de isolado clínico de fração diclorometânica.
2.2 Aspectos gerais sobre a classe das cumarinas
As cumarinas constituem uma classe de metabólitos secundários, derivadas
de ácido cinâmico. Cerca de 1800 já foram identificadas, principalmente em plantas
verdes, mas também podem ser encontradas em fungos e bactérias (MURRAY,
1995). Em relação estrutura química básica, as cumarinas, são lactonas do ácido o-
43
hidroxicinâmico (23), sendo o composto protótipo desta classe a 1,2-benzopirona
(24) (Figura 5) (KUSTER e ROCHA, 2010).
Figura 4: Estrutura molecular do ácido o-hidroxicinâmico (23) e a molécula resultante de sua
lactonização, a 1,2-benzopirona (24), sendo esta o protótipo da classe das cumarinas.
As cumarinas foram isoladas pela primeira vez em 1822, na espécie Dipterix
odorata Wild e sintetizada primeiramente em 1868 (EGAN et al., 1990). Em muitas
espécies de plantas já foram isoladas, sendo registradas em 150 espécies
distribuídas em cerca de 30 famílias, dentre as quais, destacam-se a Rutaceae,
Umbelliferae, Clusiaceae, Guttiferae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Nyctaginaceae,
Apiaceae (VENUGOPALA et al. 2013), bem como, a Asteraceae (KUSTER e
ROCHA, 2010).
Diversos tipos de cumarinas são encontrados na natureza, diferenciadas
pelos distintos grupamentos químicos ligados aos anéis (aromáticos e lactônico) que
constituem a sua estrutura básica. Esta variedade não somente implica nas suas
propriedades químicas como também nas suas atividades frente a sistemas
biológicos e aplicações terapêuticas (KOSTOVA, 2005).
A classe das cumarinas é dividida em seis subclasses de acordo com a
estrutura química dos compostos: cumarinas simples, furanocumarinas,
dihidrofuranocumarinas, piranocumarinas (lineares e angulares), fenilcumarinas e
dicumarinas (VENUGOPALA, et al., 2013). Em geral os derivados cumarínicos
possuem uma importante propriedade química que facilita sua identificação, pois
têm um espectro ultravioleta (UV) característico, facilitando a identificação e
quantificação por técnicas cromatográficas e espectrofotométricas, em grande parte
sem haver necessidade de isolamento prévio (KUSTER e ROCHA, 2010).
44
As cumarinas simples possuem um odor característico, que é explorado pela
indústria de cosméticos. Contudo, há uma perda de propriedades aromatizantes em
derivados cumarínicos conjugados com açúcares e ácidos, os quais ocorrem
frequentemente na natureza. Há uma relação que estabelece que, quanto maior o
peso molecular, menor a aromaticidade das cumarinas (KUSTER e ROCHA, 2010).
A indústria cosmética vem utilizando 1,2-benzopirona (24) como um agente
fixador e de reforço para o odor dos óleos essenciais em perfumes. Com a mesma
finalidade, adicionado também a sabonetes, a pastas de dentes e a preparações
capilares. Além de ser usada em derivados do tabaco para melhorar o sabor e o
aroma e, ocasionalmente, usado em produtos industriais para mascarar odores
desagradáveis (JAGER et al. 2007).
A 1,2-benzopirona (24) foi bastante utilizada como aromatizante em alimentos
industrializados, contudo, estudos demonstraram efeito hepatotóxico deste
composto em ratos e cachorros, levando a proibição de sua utilização nos EUA para
a finalidade de agente flavorizante (JAGER et al. 2007).
Apesar de apresentar hepatotoxicidade nos animais testados, a 1,2-
benzopirona (24) não tem demonstrado toxicidade em humanos e babuínos, fato
atribuído ao seu metabolismo em humano, pois é metabolizada a 7-hidroxicumarina,
fato que tem sido apontado como uma via para detoxificação do composto (LAKE,
1999).
As cumarinas exibem notável capacidade de atuar em mecanismos
bioquímicos e farmacológicos, das quais alguns de seus derivados se destacam,
afetando significativamente a função de vários sistemas biológicos em mamíferos.
De fato, elas têm diversas propriedades biológicas e efeitos farmacológicos
comprovados, sendo os mais importantes as atividades anticoagulantes, anti-
inflamatórias, antioxidantes, antialérgicas, hepatoprotetoras, antivirais e
anticancerígenas (KOSTOVA, 2005).
A cumarina simples (24) tem com alguns efeitos farmacológicos
comprovados, como, imunomodulador, antitumoral, anticoagulante. No entanto, essa
cumarina tem baixa biodisponibilidade em humanos, devido à conversão hepática de
primeira passagem, que gera o metabólito ativo 7-hidroxicumarina, sugeriu-se então
que a 1,2-benzopirona é um pró-fármaco (LAKE, 1999).
O principal emprego clínico dos derivados cumarínicos é como
anticoagulante. O primeiro derivado identificado como esta propriedade foi
45
dicumarol, uma dicumarina isolada da espécie Melilotus officinalis L. (BELLIS et al.
1967).
O dicumarol e seu derivado sintético, a varfarina, começaram a ser utilizados
durante a década de 1940 como raticidas e como anticoagulantes orais. Estes
compostos apresentam ação anticoagulante atuando como inibidores das enzimas
vitamina K epoxirredutase e a vitamina K redutase, impedindo a redução da
Vitamina K, esta que é necessária para a síntese hepática normal de quatro fatores
da coagulação (II, VII, IX e X), da proteína C e da proteína S (ARMSTRONG e
GOLAN, 2011). Outros derivados sintéticos como acenocumarol e femprocumona,
apresentam atividade anticoagulante e são muito utilizadas na clínica. No entanto,
estes fármacos possuem algumas limitações, no caso da terapia com varfarina, a
janela terapêutica estreita faz com que a administração da droga seja dificultada
(CHAVES et al. 2010).
2.2.1 EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE CUMARINAS DE ORIGEM NATURAL
A 1,2-benzopirona (24) isolada do extrato etanólico das cascas do caule de
Torresea cearenses (Leguminoseae) apresentou efeito antinociceptivo em
camundongos (10 e 20 mg/kg v.o), demonstrado no teste das contorções
abdominais induzidas por ácido acético (0,6%) e no teste da formalina (1%), neste,
sendo efetiva nas duas fases. Em adicional, no teste da formalina houve reversão do
efeito com a coadministração da naloxona (antagonista opioide) na segunda fase do
teste, sugerindo um mecanismo antinociceptivo com envolvimento parcial do sistema
opioide. Contribuindo com este dado, esta cumarina (5 e 10 mg/kg v.o.) aumentou o
tempo de latência ao estímulo térmico provocado no teste da placa quente e
também teve este efeito revertido pela naloxona. Por outro lado, a 1,2-benzopirona
na dose de 10 mg/kg (v.o.) apresentou atividade revertida pela coadministração da
L-arginina (aminoácido substrato endógeno para síntese de NO), indicando possível
inibição da formação do NO, sendo mais um mecanismo possível para seu efeito
antinociceptivo (LEAL et al. 1997).
A umbeliferona (7), nas doses de 2,5 e 5 mg/kg (v.o.), apresentou resultados
mais efetivos do que a 1,2-benzopirona (24) nos mesmos modelos experimentais,
46
contudo, não houve reversão do seu efeito pela naloxona. Em contrapartida, esta
cumarina apresentou efeito revertido pelo L-arginina na segunda fase do teste da
formalina, indicando seu possível envolvimento com o sistema de formação de NO.
Tal constatação permitiu considerar que a umbeliferona exerça seu mecanismo na
transmissão periférica da dor, considerando também a sua efetividade em modelos
de inflamação (LINO et al. 1997).
Estudo do mecanismo de ação da umbeliferona (7) em camundongos
demonstrou que a inibição de mediadores inflamatórios como Interleucina 1 Beta (IL-
1β), Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α), redução da produção de prostaglandina
E2 (PGE2) e a migração de neutrófilos contribuem significativamente para redução
da resposta nociceptiva diante do estímulo, comprovando o efeito e mecanismo
dessa cumarina na dor de origem inflamatória (LIMA et al, 2011).
A escopoletina, isolada do extrato etanólico da planta Polygala sabulosa,
promoveu redução das contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%)
em camundongos de forma dose-dependente (0,01; 0,1; 1,0 e 10 mg/kg; i.p.)
(MEOTTI et al. 2006).
No teste da formalina, a escopoletina (1, 5 e 10 mg/kg; i.p) apresentou efeito
apenas no segunda fase, indicando que o seu efeito antinociceptivo pode ser
exercido na dor de origem inflamatória. Por este fator, foram realizados ensaios para
avaliar o efeito desta cumarina sob mediadores inflamatórios. Para tanto, animais
após a indução do edema de pata foram sacrificados para a coleta do tecido do
edema e do soro, os quais foram submetidos a análises de parâmetros inflamatórios.
No soro foi detectado redução dos níveis de NO, TNF-α e PGE2. No tecido do
edema foi verificado a inibição da expressão da enzima ciclo-oxigenase 2 (COX-2) e
da enzima NO sintase. Estes resultados confirmaram o envolvimento de mediadores
inflamatórios no mecanismo antinociceptivo da escopoletina (CHANG et al, 2012).
A esculetina (1,25 a 20 mg/kg i.p.) promoveu efeito antinociceptivo de forma
dose-dependente através da inibição da hiperalgesia provocada por estímulos
mecânicos e térmicos, em modelos de avaliação de dor aguda não inflamatória e em
modelos de indução de dor inflamatória. Após tratamento, houve redução dos níveis
plasmáticos de leucotrieno B4 (LTB4). Os LTs, especialmente o LTB4, podem estar
envolvidos na transmissão da dor a nível central e periférico, neste sentido, a
inibição da síntese de LTs pela esculetina pode ser considerado um mecanismo
47
antinociceptivo exercido por essa cumarina contra a dor, tanto de origem
inflamatória, quanto não inflamatória (RZODKIEWICZ et al, 2015).
2.3 Nocicepção e fisiopatologia da dor
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)
como uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada à lesão
tecidual real ou potencial (LOESER e TREEDE, 2008). A percepção da dor é
subjetiva, composta por fatores fisiológicos que geram a sensação dolorosa e
fatores relacionados à reatividade emocional do indivíduo. Por este fator a dor pode
ser classificada de diversas maneiras, de acordo com sua duração, a fisiopatologia,
a localização, a etiologia (LOESER e MELZACK, 1999).
Quanto à duração, o estímulo doloroso pode se desenvolver de forma aguda
ou crônica. A dor aguda é resultante de uma reposta fisiológica imediata a um
estímulo nocivo que pode ser químico, mecânico ou térmico, podendo causar lesões
teciduais (CARR e GOUDAS 1999). A dor crônica, por sua vez, é caracterizada pela
persistência da sensação dolorosa, resultante da incapacidade do organismo em
restabelecer suas funções fisiológicas. Por este fator, a manifestação e intensidade
da dor podem ser contínuas, mesmo após a recuperação da lesão ou eliminação do
estímulo externo (LOESER e MELZACK, 1999).
De acordo com a fisiopatologia, a dor pode ser classificada em nociceptiva ou
neuropática. A nociceptiva corresponde ao desencadeamento de mecanismos
neuronais de transmissão do estímulo doloroso associados a lesões teciduais. A
partir da ativação de receptores sensoriais periféricos, chamados de nociceptores, o
estímulo é conduzido ao SNC, onde o sinal pode ser interpretado como uma
sensação dolorosa (BESSON, 1999). A dor neuropática, por sua vez, é gerada por
uma lesão ou disfunção no Sistema Nervoso Central (SNC) ou Periférico (SNP),
caracterizada pela desregulação do aparelho somatossensorial (MILLAN, 1999).
48
2.3.1 COMPONENTES DA NOCICEPÇÃO
A nocicepção é o processo fisiológico para percepção da dor. Sua arquitetura
é constituída por fibras sensoriais sensíveis a estímulos térmicos, químicos ou
mecânicos, que podem ser originados em eventos de lesão tecidual. A sinalização é
captada por receptores sensoriais periféricos, sendo conduzidos até os centros
cerebrais onde ocorre a diferenciação entre os estímulos nocivos e inócuos (WOOLF
e MA, 2007). Esta diferenciação constitui um mecanismo fisiológico de proteção e
prevenção de danos ao organismo, resultando em medidas comportamentais para
evitar um novo contato com tais estímulos, bem como, gerando reflexos de retirada
e produzindo uma sensação desagradável que sinaliza o risco ou dano potencial
(LATREMOLIERE e WOOLF, 2009).
As estruturas responsáveis pela percepção dos estímulos nocivos são
denominadas de nociceptores, estando localizados nas terminações nervosas livres
das Fibras Aferentes Periféricas (FAP’s). Estes terminais estão amplamente
distribuídos em vasos sanguíneos, músculos, articulações, vísceras e na pele, sendo
este último o tecido que capta a maioria dos estímulos nociceptivos periféricos.
Através da ativação dos nociceptores, os estímilos são transformação em impulsos,
os quais são transmitidos ao SNC pelas FAP’s (JULIUS e BASBAUM, 2001).
Existem três conjuntos de FAP’s que conduzem as sensações periféricas,
sendo classificadas de acordo com a presença de mielina, diâmetro e velocidade de
condução, características que diferenciam também o tipo de resposta que cada fibra
é capaz de promover (JULIUS e BASBAUM, 2001).
As fibras Aβ são mielinizadas, de grande diâmetro e de rápida condução,
sendo capazes de detectar sensações inócuas, não estando relacionadas com a
percepção da dor. As fibras Aδ e C, por sua vez, são vinculadas a percepção de
estímulos nocivos. As fibras Aδ são pouco mielinizadas, de diâmetro médio e
possuem velocidade de condução intermediária. Já as fibras C não são mielinizadas,
apresentam pequeno diâmetro e têm baixa velocidade de condução (JULIUS e
BASBAUM, 2001).
No que concerne a percepção dos estímulos nocivos, as fibras do tipo A estão
relacionadas a respostas mais rápidas, resultando na dor aguda ou de primeira fase,
que contribui para o reflexo de retirada. As fibras do tipo C, por outro lado, são
49
responsáveis por uma dor mais difusa, geralmente persistente à dor aguda
(BASBAUM et al., 2009).
A sensibilização dos nociceptores é mediada por substâncias algogênicas que
são produzidas em largas escala pelo tecido lesionado durante o processo
inflamatório. Essas substâncias são mediadores químicos liberados por neurônios
sensoriais e simpáticos e por células não neuronais como plaquetas, células
sanguíneas, mastócitos, células endoteliais, fibroblastos e células de Schwann
(BESSON, 1999).
Constituem os mediadores mais importantes, derivados do ácido araquidônico
(AA) como prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs); peptídeos como Bradicininas
(Bk), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP), substância P (SP),
colescistocinina, peptídeo intestinal vasoativo; aminoácido excitatórios como o
glutamato; aminas, óxido nítrico (NO), adenosina trifosfato (ATP), adenosina
difosfato (ADP), fator de crescimento neural (NGF), fator de ativação plaquetária;
citocinas como o TNF-α e a IL-1β; e íons como potássio e hidrogênio (REN e
DUBNER, 2010).
Os neuropeptídios como a SP, a neurocinina A (NKA) e a CGRP são
liberados após reflexo espinhal local resultante da estimulação dos nociceptores
aferentes primários. Eles desempenham um papel fundamental na neurotransmissão
e modulação da dor inflamatória, especialmente a SP que induz a degranulação de
mastócitos, vasodilatação e permeabilidade vascular (BJÖRKMAN, 1995).
2.3.2 MECANISMOS DE TRANSMISSÃO NOCICEPTIVA
A partir da ativação periférica, as FAP´s conduzem o impulso até o corno
dorsal da medula, onde ativam grande número de neurônios, dos quais alguns são
ativados exclusivamente por estímulos nóxicos (Figura 4) (WOOLF, 2011).
O corno dorsal da medula, onde as terminações centrais das fibras
nociceptivas são conectadas, é dividida anatomicamente em 10 diferentes lâminas.
As fibras C conectam nas lâminas I, II e V e as fibras Aδ terminam nas lâminas I e II
e também penetram mais profundamente nas lâminas V (Figura 4) (MILLAN, 1999).
50
Todas as lâminas são constituídas de conjuntos de neurônios especializados
na transmissão de impulsos resultantes de diferentes estímulos. Os neurónios
espinais são classificados em três classes: neurônios não nociceptivos, nociceptivos
específicos e neurônios de Amplas Faixas Dinâmicas (AFD) (ALMEIDA, 2004).
Os neurônios não nociceptivos, presentes principalmente nas lâminas II-IV,
respondem a estímulos inócuos, mas podem também responder aos nóxicos,
conservando, no entanto, o padrão de resposta relativa ao inócuo. Os neurónios
nociceptivos específicos, localizados, sobretudo, nas lâminas I e II, são ativados
apenas por estímulos nóxicos. Os neurónios AFD, encontrados em maior número na
lâmina V, respondem a excitações inócuas e nóxicas, sendo as respostas
diretamente proporcionais à intensidade do estímulo (ALMEIDA, 2004).
A condução do impulso nóxico ao longo da medula espinal até regiões
encefálicas envolve mecanismos excitatórios e inibitórios que atuam na integração e
modulação da nocicepção, havendo duas importantes vias envolvidas neste
processo, uma via ascendente e outra descendente (DICKENSON, 1995).
A via ascendente conduz o impulso nervoso ao longo das colunas dorsais da
medula espinal em direção ao tálamo através dos neurônios aferentes primários.
Neste processo ocorre liberação de neurotransmissores excitatórios, como o
glutamato e a SP, com consequente ativação de receptores de N-Metil-D-Aspartato
(NDMAr) e liberação de NO e metabólitos do AA. Estes mediadores alteram a
transmissão do potencial de ação, resultando no aumento da duração da resposta
neuronal (MILLAN, 1999).
A via ascendente conta também com neurônios de segunda ordem, que
ascendem até o tálamo, transmitindo impulsos com diferenciação e baixa
velocidade. Os diferentes feixes ascendentes formam dois sistemas filogenéticos
diferentes. O primeiro feixe surge da região média do tronco cerebral, sendo
constituída pelo trato espinotalâmico, espinorreticular, espinomesencefálico,
espinoparabraquial e por último o feixe espinohipotalâmico. O outro conjunto de
feixes consiste no trato neoespinotalâmico, espinocervical e o feixe pós-sináptico do
corno dorsal (ALMEIDA et al. 2004).
A partir do tálamo, os neurônios de terceira ordem emitem axônios á matriz da
dor (principalmente ao córtex somatossensorial), onde ocorre a somatização do
estímulo nocivo. Paralelamente, há projeções axônais ao giro cingulado anterior
51
(componente do sistema límbico), vinculado ao componente emocional da dor
(Figura 4) (RUSSO e BROSE, 1998).
A via descendente de modulação é formada projeções neurais de diferentes
áreas do encéfalo para a medula espinhal. A via melhor caracterizada neste
processo liga a região cinzenta periaquedutal, no mesencéfalo, à região rostral
ventromedial da medula espinhal. Sua ativação leva a liberação de
neurotransmissores que exercem atividade inibitória sobre a nocicepção (Figura 4).
Uma grande quantidade de neurotransmissores está envolvida na modulação da
dor, incluindo peptídeos opióides (endorfinas, encefalinas e dinorfinas) e
monoaminas (serotonina – 5-HT) (REN e DUBNER, 2008).
Este mecanismo, denominado “controle do portão” promove a modulação das
sinapses entre as FAP’s e as células do corno dorsal da medula espinal, reduzindo
ou bloqueando a transmissão, havendo assim uma diminuição da percepção da dor
(MILLAN, 2002).
52
Figura 5. Processamento sensorial no corno dorsal da medula espinal. (a) A estimulação das fibras C
pela lesão intradérmica produz dor espontânea e dor provocada por toques leves no local da lesão (hiperalgesia primária). Além disso, uma área de hiperalgesia secundária (dor mecânica aumentada após um estímulo nocivo) fora da área da lesão primária é produzida pela ativação dos receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) junto ao sistema nervoso central (SNC), que ocorre em consequência do tráfico de impulsos nociceptores aferentes. (b) Quando ativados por estímulos mecânicos, térmicos ou químicos, os nociceptores conduzem impulsos aferentes na direção da medula espinal. (c) O corno dorsal da medula espinal constitui o 1º centro de retransmissão sensorial junto ao SNC. Os sinais nociceptores que chegam são submetidos a uma considerável modulação antes da deflagração dos sinais ascendentes. (d) Quando há ativação de áreas localizadas no tálamo e no córtex cerebral, as projeções secundárias ao nível do trato espinotalâmico, trato da coluna dorsal e outras vias nociceptoras levam à percepção consciente da dor. Fonte: MedicinaNet, 2015.
53
2.3.3 SISTEMA OPIOIDE
O sistema opioide endógeno é constituído por células especializadas na
liberação de mediadores químicos como encefalinas, endorfinas e dinorfina,
responsáveis por ativar quatro tipos de receptores opiodes: k (kappa), σ (delta), δ
(gama), µ (mi); que estão distribuídos na substância cinzenta periaquedutal e no
bolbo raquidiano ventral e em várias regiões da espinal medula (MANSOUR, 1988;
REISINE e BELL, 1993; SNYDER e PASTERNAK, 2003). Estes receptores, uma vez
ativados, exercem efeitos a nível espinhal, supraespinhal e periférico, provocando
uma diminuição na libertação de neurotransmissores pelas terminações das fibras C,
inibindo os neurônios medulares pós-sinápticos, ou ativando as vias de modulação
descendente (PASTERNAK, 2005; LEE et al. 2011).
Os opioides, tanto endógenos e quanto exógenos, ligam-se aos receptores
aumentando a permeabilidade ao potássio e reduzindo a permeabilidade ao cálcio,
promovendo a diminuição da liberação de neurotransmissores nas terminações
nervosas, especialmente da SP. Estes mecanismos levam a redução do fenômeno
da excitabilidade neuronal, consequentemente reduzindo a transmissão neuronal do
estímulo nóxico (MAO et al. 1995).
54
3 OBJETIVO 3.1 Objetivo geral:
Realizar o estudo fitoquímico e avaliar o efeito antinociceptivo de uma fração
rica em cumarina de Ayapana triplinervis (Vahl).
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar a droga vegetal obtida de partes aéreas de A. triplinervis por análises
físico-químicas e fitoquímicas;
- Avaliar extratos da droga vegetal de A. triplinervis por análises fitoquímicas e
selecionar um extrato para obtenção de fração rica em cumarina;
- Obter frações do extrato selecionado e submetê-las às análises
cromatográficas e espectrais, selecionando a Fração Cumarínica de Ayapana
triplinervis (FrCAt);
- Realizar a identificação do composto majoritário da FrCAt por métodos
espectrométricos;
- Avaliar a toxicidade oral aguda da FrCAt;
- Investigar os efeitos da FrCAt sobre os mecanismos periféricos e centrais de
nocicepção.
55
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Coleta e identificação botânica
O material vegetal foi coletado no mês de abril de 2014 em uma região
florestal pertencente ao município de Acará-PA, localizada a 01°32.684’ de latitude e
a 048°23.984’ de longitude. Coordenadas geográficas obtidas por um aparelho de
GPS (Global Positioning System).
A identificação botânica foi realizada por especialista do Herbário do Museu
Paraense Emílio Goeldi, onde uma exsicata se encontra depositada com o número
de registro MG123913.
4.2 Obtenção da droga vegetal
As amostras de partes aéreas do material vegetal foram cuidadosamente
selecionadas, lavadas com água corrente e submetidas à secagem em temperatura
ambiente por 24 horas e em estufa com fluxo de ar forçado (40ºC) durante 48 horas.
O material resultante foi pulverizado, pesado e armazenado.
4.3 Análises farmacognósticas
4.3.1 PERDA POR DESSECAÇÃO
Pesou-se 1 g de droga vegetal de A. triplinervis e transferiu-se para pesa-filtro
previamente dessecado durante 30 min. nas mesmas condições empregadas na
determinação. Colocou-se o pesa-filtro na estufa, onde permaneceu em secagem
por um período inicial de 2 horas, a uma temperatura variando entre 105-110ºC.
56
Após, o pesa-filtro com amostra foi pesado e, em seguida, novamente colocado na
estufa, nas mesmas condições, por ciclos de 1 hora até peso constante
(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). O resultado, a partir da média de três
determinações, foi expresso em percentual de perda por dessecação, calculado
conforme a equação:
% perda = Pu - Ps x 100
Pa
Onde:
Pa = peso da amostra (g) Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação (g) Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação (g)
4.3.2 TEOR DE CINZAS TOTAIS
A droga vegetal de A. triplinervis (3 g) foi transferida para cadinho
previamente calcinado, resfriado e pesado nas mesmas condições da determinação.
O cadinho contendo a amostra foi incinerado em mufla a temperatura de 450-500ºC
por 2 horas, após, resfriou-se em dessecador por 20 min. e, pesou-se. O
procedimento foi repetido até peso constante (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).
O resultado, a partir da média de três determinações foi expresso em percentual de
cinzas totais, calculado em relação à massa de droga vegetal utilizada.
4.3.3 TEOR DE CINZAS INSOLÚVEIS
O resíduo obtido na determinação de cinzas totais foi mantido em ebulição
por 5 min. com 25 mL de ácido clorídrico (7%; v/v). Após, filtrou-se para recolher o
resíduo insolúvel em ácido sobre papel-filtro, adicionando água até a neutralidade do
filtrado. Transferiu-se o papel-filtro contendo o resíduo para um cadinho, secou-se
57
sobre placa quente, em seguida, incinerou-se a cerca de 500ºC até peso constante
(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). O resultado, a partir da média de três
determinações foi expresso em percentual de cinzas insolúveis, calculado em
relação à massa de droga vegetal utilizada.
4.4. Obtenção dos extratos
Os extratos foram obtidos através do processo de maceração, a partir de
extrações consecutivas com solventes de polaridades crescentes. Para tanto,
utilizou-se os solventes n-hexano, acetato de etila e metanol, sendo que cada
solvente permaneceu em contato com a droga vegetal (700 g) por 48 horas e, em
seguida, realizou-se a filtração. O resíduo resultante após filtração foi submetido à
remaceração com o mesmo solvente por 48 horas (Figura 6). As soluções extrativas
obtidas do mesmo solvente foram reunidas e concentradas até secagem completa,
em seguida, pesou-se e o rendimento foi calculado.
58
Figura 6: Esquema de obtenção dos extratos de diferentes polaridades de A. triplinervis.
4.5 Prospecção fitoquímica
A prospecção fitoquímica da droga vegetal e dos extratos de diferentes
polaridades foi realizada através dos testes de coloração e precipitação (COSTA,
1994) e por CCD (WAGNER e BLADT, 2001), das seguintes classes de metabólitos
secundários: alcaloides, flavonoides, esteroides e triterpenos, antraquinonas,
polifenóis e cumarinas. A droga vegetal foi submetida à extração direcionada de
acordo com a classe a ser testada.
Para cada teste, uma droga vegetal padrão foi utilizada como controle
positivo: Cinchona calisaya (alcaloides), Rhamnus purshiana (antraquinonas), Citrus
limon (cumarinas) Citrus sinensis (flavonoides), Panax ginseng (esteroides e
triterpenos) e Stryphnodendron adstrigens (polifenois).
59
Na análise por CCD, utilizou-se cromatoplaca de alumínio recoberta por sílica
gel 60G F254 Merck® e para algumas classes foram utilizados, além da droga
vegetal padrão, substâncias padrões. Os parâmetros definidos nas análises de cada
classe são mostrados no Quadro 5.
Classe Droga vegetal padrão
Substância padrão Fase móvel Revelador
Alcaloides
Cinchona calisaya Pilocarpina
Tolueno:acetato de etila:dietanolamina
(70:20:10)
Reativo de Dragendorff
(VIS)*
Flavonoides
Citrus sinensis
Quercetina
Tolueno:acetato de etila:metanol:ácido fórmico
(75:25:10:6)
Solução metanólica de
cloreto de alumínio (AlCl3)
2% (UV-365nm)**
Compostos fenólicos
Stryphnodendron adstringens
Ácido tânico
Tolueno:acetato de etila:metanol:ácido fórmico
(40:30:30:10)
Solução metanólica de cloreto férrico
(FeCl3) 1% (VIS)
Esteroides e terpenoides
Panax ginseng
-
Tolueno: clorofórmio:metanol
(40:40:10);
Reativo de Liebermann-
Burchard (UV-365nm)
Cumarinas Citrus limon 1,2 –benzopirona
Tolueno:éter (1:1), saturado com ácido acético
glacial 10%.
Solução etanólica de hidróxido de
potássio (KOH) 10% (UV-365nm)
Antraquinonas
Rhamnus purshiana
-
Acetato de etila:metanol:água
(100:13,5:10)
Solução etanólica de
KOH 10% (UV-365nm)
Quadro 5. Parâmetros utilizados na prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada. * Análise em luz visível (VIS) ** Análise em luz ultravioleta 365 nm (UV-365nm)
4.6 Obtenção de frações cumarínicas por Cromatografia em Coluna (CC)
De acordo com a prospecção fitoquímica por CCD e com o espectro de
absorção na região do UV-VIS (descrito abaixo) foi possível identificar o extrato com
melhor perfil cromatográfico e espectral para cumarinas, o extrato de acetato de etila
(EAAt). Deste modo, o EAAt foi submetido ao fracionamento em coluna de vidro
preenchida por sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM), utilizando como fase móvel
60
diferentes sistemas de eluição com os solventes n-hexano, acetato de etila e
metanol. Os parâmetros utilizados no fracionamento estão detalhados no Quadro 6.
Parâmetros Especificações Altura da coluna 40 cm Diâmetro da coluna 4 cm Massa de sílica gel 100 g Amostra de extrato 4,5 g
Fase móvel
1. Hexano:acetato de etila (9:1) 2. Hexano:acetato de etila (7:3) 3. Hexano:acetato de etila (1:1) 4. Acetato de etila (100%) 5. Acetato de etila:metanol (1:1) 6. Metanol:acetato de etila (7,5:2,5) 7. Metanol (100%)
Volume de fase móvel 500 mL Quadro 6: Parâmetros utilizados para fracionamento do extrato de acetato de etila em coluna cromatográfica.
As frações obtidas foram submetidas à análise por CCD para detecção de
cumarinas, utilizando como a fase móvel hexano:acetato de etila (8:2) e análise sob
luz UV-365 nm. A presença de cumarinas foi evidenciada pela formação de uma
mancha verde-fluorescente e outra azul-fluorescente. Assim, foi possível reunir as
frações conforme semelhança no perfil cromatográfico, selecionando as frações
ricas em cumarinas.
4.7 Obtenção do perfil espectral na região do UV-Visível (UV-VIS)
Os extratos e frações ricas em cumarinas foram submetidos a uma varredura
espectral em espectrofotômetro (PerkinElmer/Lambda 950®). Para tanto, as
amostras foram diluídas em metanol (grau analítico de CLAE) para concentração de
1 mg/mL e transferidas para cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico. A
absorbância (A) foi registrada no intervalo de comprimento de onda entre 700 nm a
190 nm, com diminuição regressiva de 0,1 nm.
O perfil espectral dos extratos constituiu uma complementação aos dados
obtidos por CCD, permitindo selecionar um extrato para fracionamento (EAAt)
61
devido o seu melhor perfil espectral e cromatográfico para cumarinas. Já o perfil
espectral das frações permitiu avaliar a separação da cumarinas no fracionamento,
possibilitando a identificação de uma fração com melhor perfil de absorção para
cumarinas. Assim, foi possível selecionar a Fração Cumarínica de Ayapana
triplinervis (FrCAt) para continuidade das análises.
4.8 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodo (CLAE-DAD) O EAAt e a FrCAt foram analisados no Cromatógrafo Acquity UPLC H-
Class® com detector PDA Waters®, realizado no Laboratório de Fitoquímica da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).
As amostras (2 mg) foram solubilizadas em 1 mL de metanol (grau CLAE) em
banho ultrassônico por 20 min., posteriormente centrifugadas a 10.000 Rotações Por
Min. (RPM) por 10 min.
Utilizou-se coluna de fase reversa (12,5 x 4,5 cm, LiChroCART ® RP 18-5 µm)
e as leituras foram realizadas na região do UV (220 a 400 nm), registrando-se
cromatogramas em 280 nm.
As condições cromatográficas foram estabelecidas de acordo metodologia de
perfil exploratório, com tempo de varredura de 18 min. em gradiente linear de 5 a
95%. Como fase móvel foi empregada água deionizada (H2O) contendo 0,1 % de
ácido fosfórico (eluente A) e acetonitrila (ACN) contendo 0,1 % de ácido fosfórico
(eluente B) (Tabela 1). Fluxo de 0,3 mL/min., injetando-se 4,0 µL da solução de cada
amostra. A temperatura da coluna foi mantida em 40 °C.
Tabela 1: Gradiente da fase móvel utilizada na análise por CLAE-DAD.
Tempo (min.) Fase móvel A(ácido fórmico 0,1% em água
deionizada) B (ácido fórmico 0,1% em
acetronitrila) 0 2 98 1 5 95
15 95 5 16 95 5 18 5 95
62
4.9 Obtenção do espectro no Infravermelho (IV)
Para obtenção do espectro da FrCAt no IV (IR Prestige 21 Shimadzu®), uma
amostra de 1 mg da fração foi compactada em pastilhas com brometo de potássio
(KBr), sendo o espectro obtido em transmitância na região de 4000 a 400 cm-1, com
32 varreduras e resolução de 1 cm-1.
4.10 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas (CLAE-EM)
A FrCAt foi submetida a análise em equipamento UPLC-DAD-EM/ESI Waters
Acquity®, realizada no Laboratório de Fitoquímica da Faculdade de Farmácia da
UFMG.
As amostras (2 mg) foram dissolvidas em 1 mL de metanol (grau CLAE) em
banho ultrassônico por 20 min., em seguida foram centrifugadas por 10 min. a
10.000 RPM.
Utilizou-se coluna de fase reversa Acquity UPLC HSS C18 SB (partículas de
1,8 µm, 2,1x50 mm), detecção em UV (220 a 400 nm), fluxo de 0,3 mL/min.,
mantendo o forno da coluna a 40 ºC. Como fase móvel foi utilizado gradiente de
ACN com 0,1% de ácido fórmico (eluente A) e H2O deionizada com 0,1% de ácido
fórmico (eluente B), compreendendo um período de eluição linear longo (5 – 95% de
acetonitrila, em 10 min.) e, após, um curto período de eluição isocrática (95% de
ACN por 1 min.) (Tabela 2).
Na obtenção do espectro de massas (EM), empregou-se um sistema de
Ionização por Spray de Elétrons (ESI), voltagem do capilar 3,5; voltagem do cone
60. Foram utilizados solventes com grau para CLAE e água deionizada.
63
Tabela 2: Gradiente da fase móvel empregada na análise por CLAE-DAD-EM/ESI. Tempo (min.) Fase móvel
A (ácido fórmico 0,1% em acetronitrila)
B (ácido fórmico 0,1% em água deionizada)
0 95 5
10 5 95 11 5 95 13 95 5
4.11 Obtenção do espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
A FrCAt foi submetida a análise por RMN de H1, de C13, DEPT 135 em
espectrômetro Bruker Avance DPX200®, realizada no Laboratório RMN de Alta
Resolução do Departamento de Química da UFMG.
A amostra foi solubilizada em clorofórmio deuterado (CDCl3), os
deslocamentos químicos (δ) foram medidos em parte por milhão (ppm) e as
constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Utilizou-se o Tetrametilsilano (TMS)
como referência interna.
4.12 Avaliação farmacológica 4.12.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus), machos (n =
50) e fêmeas (n= 9), com peso corporal entre 20-35 g, cedidos pelo biotério do
Instituto de Ciências Biológicas da UFPA. Os animais foram mantidos no biotério de
experimentação da Faculdade de Farmácia da UFPA, acondicionados em gaiolas
com água e ração ad libtum, com controle de temperatura (25 ± 1 ºC), exaustão e
ciclo de claro/escuro de 12 horas (claro das 6 às 18h).
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Animais de Experimentação da UFPA, sob o número de registro 64-2015 (Anexo I).
64
4.12.2 DROGAS E TRATAMENTOS
Para a indução dos processos álgicos foram utilizados ácido acético (0,6%,
v/v), administrado por via intraperitoneal (i.p), e formalina (formaldeído 1%, v/v),
administrada por injeção na região intraplantar (i.pt.) na pata posterior direita.
Os controles positivos utilizados foram a Indometacina (10 mg/kg), a Morfina
(4 mg/kg) e a Naloxona (0,4 mg/kg), preparadas em água destilada ou solução
salina (solução de cloreto de sódio 0,9%). A FrCAt, foi solubilizada em solução
aquosa de Tween 80 (1%) em diferentes concentrações, de acordo com o teste.
A via oral (v.o.) foi adotada como padrão para administração dos fármacos,
obedecendo a um volume máximo de 0,1 mL/10g de massa corporal. Com exceção
da morfina e naloxona, administradas por via subcutânea (s.c.).
4.12.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA
A avaliação da toxicidade oral aguda foi realizada conforme a diretriz 423,
para testes de substâncias químicas, da Organization of Economic Cooperation and
Development (OECD, 2008).
Para tanto, camundongos fêmeas (n = 3/grupo), em jejum prévio de 12 horas
(água disponível), foram tratadas com doses de 200, 600 e 1000 mg/kg da FrCAt
(v.o). A seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um período de 4
horas para avaliação de possíveis alterações comportamentais ou morte.
Após este período, foram avaliados nos tempos 24, 48 e 72 horas, seguidos
de observação por um período total de 14 dias com o intuito de verificar a possível
ocorrência de óbito e alteração no peso corporal (OECD, 2008). Durante todo o
período de observação foram disponibilizados ração e água ad libitum.
65
4.12.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
4.12.4.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético
De acordo com o método padronizado por Koster e seus colaboradores
(1959), foram induzidas contorções abdominais em camundongos (n = 5/grupo),
através da administração de ácido acético (0.6%; i.p.), em volume de 0,1 mL a cada
10 g de massa corpórea. A seguir os animais foram alocados em câmaras de
observação para contagem do número de contorções abdominais (contração da
parede abdominal, com rotação do corpo e extensão das patas traseiras) durante 20
min., 10 min. após a administração do ácido acético.
Os animais foram tratados com o veículo de dissolução (solução aquosa de
Tween 80 a 1% – Controle), Indometacina 10 mg/kg (Controle positivo) ou FrCAt nas
doses de 5, 10 e 20 mg/kg, 60 min. antes da administração do ácido acético.
4.12.4.2 Teste da formalina
A injeção de formalina provoca uma resposta nociceptiva em duas fases,
permitindo avaliar dois tipos distintos de nocicepção. A primeira fase, observada
entre 0-5 min. após a injeção da formalina, destina-se à avaliação de mecanismos
neurogênicos, pela estimulação direta dos nociceptores. A segunda fase, observada
no intervalo de 15-30 min. é de caráter inflamatório, dependente da combinação de
uma reação inflamatória no tecido periférico lesionado, com mudanças funcionais no
corno dorsal da medula. Entre uma fase e outra ocorre o período de quiescência, em
que não há manifestação de estímulos (HUNSKAAR e HOLE, 1987).
Para esta avaliação, camundongos (n = 5/grupo) receberam 20 µL de
formalina (1%; i.pt.) na pata posterior direita, sendo cronometrado o tempo que cada
animal passou lambendo ou mordendo a pata injetada durante a 1ª e a 2ª fase de
nocicepção.
66
Os grupos foram tratados com o veículo de dissolução (controle; v.o.) e
doses da FrCAt (5, 10 e 20 mg/kg; v.o.) 60 min. antes da administração da formalina.
O grupo controle positivo recebeu morfina (4 mg/kg; s.c.) 30 min. antes da formalina.
A naloxona, um fármaco antagonista opioide, foi utilizado para avaliar o
possível envolvimento do sistema opioide no efeito antinociceptivo. Três grupos
foram testados, o primeiro grupo tratado com veículo recebeu apenas naloxona (0,4
mg/kg; s.c.); o segundo grupo tratado com FrCAt na dose de 5 mg/kg recebeu
naloxona 15 min. antes da administração oral da fração; o terceiro grupo recebeu
naloxona (0,4 mg/Kg; s.c., 45 min. antes da formalina) e morfina (4 mg/Kg; s.c.; 30
min. antes da formalina).
4.12.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± e.p.m (erro padrão da média) e
submetidos à análise de variância (ANOVA), um critério, seguido do teste de Turkey.
Em todas as análises, considerou-se o nível crítico para rejeição da hipótese de
nulidade menor que 0,05 (p < 0,05).
67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análises farmacognósticas
Nas análises farmacognósticas foram estabelecidos parâmetros para controle
de qualidade da droga vegetal de A. triplinervis.
A perda por dessecação é um indicativo do teor de umidade e/ou de
substâncias voláteis de drogas vegetais (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).
Diferentes farmacopeias estabelecem um percentual aceitável de 8 a 14% para o
teor de umidade/voláteis em drogas vegetais. Neste sentido, observa-se que o teor
de umidade da droga vegetal de A. triplinervis está de acordo com os índices
preconizados (Tabela 3). Este dado é importante, uma vez que, para conservação
de drogas vegetais é necessário controlar o teor de umidade, pois pode haver
proliferação de microrganismos, além disso, pode ser prejudicial para alguns
constituintes químicos que sofrem degradação por hidrólise (MIGLIATO et al. 2007).
Cinzas totais e insolúveis são parâmetros importantes para controle de
qualidade farmacognóstico. As cinzas totais são indicativas do teor de substâncias
inorgânicas não voláteis da droga vegetal, que podem ser impurezas oriundas do
processo de preparação da droga e/ou substâncias minerais que compõe a planta.
Adicionalmente, o teor de cinzas insolúveis estima os constituintes silicosos da
planta (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).
Muitas monografias de drogas vegetais estabelecem um limiar aceitável,
variando entre diferentes espécies (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). Uma vez
que A. triplinervis não possui monografia, alternativamente, os teores de cinzas
totais e insolúveis de sua droga vegetal foram comparados com índices
estabelecidos por monografias de outras espécies da mesma família
(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), e os dados obtidos no presente estudo estão
de acordo com os valores presentes nestas monografias (Tabela 3).
68
Tabela 3: Parâmetros farmacognósticos da droga vegetal de A. triplinervis para controle de qualidade. Teor Média ± Desvio Padrão
Umidade/voláteis 10,73 ± 0,002 %
Cinzas totais 5,66 ± 0,001 %
Cinzas insolúveis 0,03 ± 0,033 %
5.2 Rendimento dos extratos
O extrato metanólico (EMAt) apresentou maior rendimento, permitindo inferir
que a planta pode ser composta majoritariamente por substâncias polares, seguido
pelo extrato de acetato de etila (EAAt) e com menor rendimento o extrato hexânico
(EHAt), demonstrando que a planta pode ter um menor teor de substâncias com
baixa polaridade (Tabela 4).
Tabela 4: Rendimento dos extratos de A. triplinervis. Calculado em relação à massa de droga vegetal
utilizada na extração (700 g). Extrato Rendimento em massa (g) Rendimento em percentual (m/m) Hexano 7,805 1,12%
Acetato de etila 15,999 2,29%
Metanol 36,187 5,17%
5.3 Prospecção fitoquímica
5.3.1 TESTES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO
Somente cumarinas e esteroides/triterpenos foram detectados na droga
vegetal de A. triplinervis e nos extratos de diferentes polaridades, as demais classes
apresentaram diferenças (Tabela 5):
• Alcaloides não foram detectados na droga vegetal e nem nos extratos;
• O teste para antraquinonas realizado neste estudo permitiu diferenciar entre
as formas livres e combinadas (heterosídeos) que estes metabólitos são
69
encontrados. Na droga vegetal foram identificadas antraquinonas nas formas
O-heterosídeo e C-heterosídeo, contudo, nos extratos não foram detectadas,
em nenhuma forma;
• Quatro tipos testes foram usados para identificar flavonoides, contudo
nenhum deles apresentou reações positivas, incluindo para a droga vegetal e
todos os extratos;
• Polifenóis apresentaram reações positivas indicativas da sua presença tanto
para droga vegetal, quanto para o EMAt.
Tabela 5: Prospecção fitoquímica realizada através de testes de coloração e precipitação com a
droga vegetal de A. triplinervis e seus extratos de diferentes polaridades, evidenciando o uso de uma droga vegetal padrão para cada reação.
Classe química Reação/Indicador Extratos Droga
vegetal
Droga vegetal Padrão Hexano Acetato
de etila Metanol
Alcaloides *(C. calisaya)
Dragendorff - - - - +++
Bouchadart - - - - +++
Mayer - - - - +++ Complexação com
ácido tânico - - - - +++
Antraquinonas *(R. purshiana)
Identificação de antraquinonas livres - - - - +++
Identificação de O-heterosídeos NR NR - +++ +++
Identificação de C-heterosídeos NR NR - + +++
Flavonoides *(C. sinensis)
Shinoda - - - - +++
Hidróxido de sódio - - - - +++
Cloreto de alumínio - - - - +++
Oxalo-bórica - - - - +++ Esteroides e triterpenos
*(P. ginseng)
Liebermann-Bouchardat +++ ++ + + +++
Cumarinas (C. limon)
Hidróxido de Potássio + +++ ++ +++ -
Polifenóis *(S. adstringens)
Cloreto férrico NR NR + ++ +++
Acetato de cobre NR NR + ++ +++
Acetato de chumbo NR NR + ++ +++ Complexação com
gelatina NR NR + ++ +++
*Droga vegetal padrão; NR: Não Realizado; negativo (-); fracamente positivo (+); positivo (++); fortemente positivo (+++).
70
Para prospecção fitoquímica da droga vegetal de A. triplinervis foi realizada
extrações específicas e direcionadas, de acordo com a classe a ser detectada. Este
procedimento permitiu verificar a diferença entre o perfil fitoquímico dos extratos e
da droga.
De fato, algumas diferenças foram observadas, pois as antraquinonas não
foram detectadas nos extratos, contudo, foram identificadas na droga vegetal nas
formas O-heterosídeo e C-heterosídeo, demonstrando que as antraquinonas desta
espécie são encontradas nas formas combinadas (Tabela 5). Neste sentido, infere-
se que uma extração direcionada é necessária para extrair os heterosídeos
antraquinônicos de A. triplinervis.
Estudos de A. triplinervis por prospecção fitoquímica (testes de coloração e
precipitação) têm demonstrado diferentes resultados:
- Alcaloides foram detectados nos extratos hexânico, de éter de petróleo, de
clorofórmio:metanol (1:1) e de clorofórmio:metanol (4:1) obtidos das folhas através
de um processo de extração consecutiva no aparelho extrator Soxhlet (FACKNATH
e LALLJEE 2008); também foram detectados no extrato de éter de petróleo obtido
por maceração (PARAMILA et al. 2012); e nos extratos hexânico, de acetato de etila
e metanólico obtidos por uma extração consecutiva (maceração) com solventes de
polaridade crescente (LOPES et al. 2014).
Diferente do que observado nos estudos citados acima, a droga vegetal e os
extratos, no presente estudo, não apresentaram reações positivas para alcaloides.
Essa diferença pode ser associada a três fatores. Primeiro, as variações intrínsecas
dos locais de coleta, que influenciam na constituição química das plantas. Segundo,
métodos extrativos variados que resultam em diferentes perfis de composição
química. Terceiro, o tipo de reação utilizada para identificar os compostos, pois as
reações de coloração e precipitação podem não ser específicas para algumas
classes. Por exemplo, o reativo de Dragendorff, o mais utilizado para identificar
estes compostos, precipita na presença de outras substâncias, incluindo os
polifenóis (HENRIQUES et al. 2010). Por esta razão, tal como foi realizado no
presente estudo, é necessário realizar o tratamento por partição ácido-base das
amostras como forma de minimizar a ocorrência de resultados falso-positivos.
- Tal como no presente estudo, as antraquinonas foram detectadas
anteriormente na forma glicosídica em A. triplinervis, contudo, a partir de diferentes
extratos (FACKNATH e LALLJEE 2008), diferentemente do presento estude, pois
71
houve apenas detecção de glicosídeos antraquinônicos apenas na droga vegetal
submetida ao processo extrativo direcionado.
- Os flavonoides foram detectados nos extratos hexânico, de
clorofórmio:metanol (1:1) e de clorofórmio:metanol (4:1) (FACKNATH e LALLJEE
2008). Contudo, outros estudos, realizados em diferentes regiões, não têm
demonstrado a presença de flavonoides em diversos extratos, tais como, de éter de
petróleo (PARAMILA et al. 2012), de hexânico, de acetato de etila e metanólico
(LOPES et al. 2014). A divergência entre estes dados é uma evidência de que a
variabilidade química da planta é influenciada pelos diferentes locais de coleta.
- Esteroides e triterpenos foram identificados nos extratos hexânico, de éter
de petróleo, de clorofórmio:metanol (1:1) e de clorofórmio:metanol (4:1) (FACKNATH
e LALLJEE 2008; PARAMILA et al. 2012). No presente estudo, estes metabólitos
foram detectados com maior evidência no EHAt, contudo Lopes et al. (2014)
descreveram reação negativa para um extrato hexânico. Este diferença pode estar
relacionada ao tipo de reação utilizada para detecção em cada estudo, pois, em uma
extração, esteroides e triterpenos tem afinidade por solventes de baixa polaridade,
tal como o hexano, por isso a não detecção no estudo de Lopes et al. pode ter sido
devido as condições da reação realizada.
- Polifenóis foram detectados em diferentes extratos de A. triplinervis
(FACKNATH e LALLJEE, 2008; PARAMILA et al. 2012; LOPES et al. 2014). Os
polifenóis, que incluem derivados fenólicos de variadas origens metabólicas, tais
como, flavonoides e taninos, são muitos comuns em espécies vegetais. Estes
compostos são detectados com a formação de precipitados ou oxidação, resultantes
da reação de grupos hidroxila, presentes em suas moléculas, com íons metálicos
que em geral são constituídos os reativos (COSTA, 1994).
5.3.2 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
As análises por CCD apresentaram perfil de detecção semelhante aos
ensaios de coloração e precipitação, com exceção de C-heterosídeos
antraquinônicos na droga vegetal (Figura 7-D).
72
Cumarinas foram detectadas na droga vegetal e nos extratos, contudo o
extrato de acetato de etila (EAAt) apresentou melhor perfil cromatográfico para esta
classe, por tal razão, o EAAt foi selecionado para a obtenção de frações
cumarínicas.
Na análise por CCD foi possível avaliar as características das cumarinas
presentes na planta. As manchas azuis fluorescentes observadas sob luz UV-365
nm, tanto na droga vegetal quanto nos extratos, podem se relacionadas a derivados
cumarínicos substituídos, pois, diferentemente da cumarina simples (1,2-
benzopirona; padrão utilizado) que apresenta fluorescência somente após a
revelação com soluções alcalinas, as cumarinas substituídas apresentam manchas
fluorescentes sem o uso de reveladores (WAGNER e BLADT, 2001).
As antraquinonas são detectadas por CCD após revelação com soluções
alcalinas, formando manchas de coloração vermelha ou marrom-avermelhada em
luz visível (WAGNER e BLADT, 2001). Os extratos não apresentaram manchas
sugestivas de antraquinonas, conforme comparação com o padrão utilizado (Figura
7-C). A cromatoplaca com aplicações da droga vegetal demonstrou a ausência de
antraquinonas livres e manchas sugestivas de O-heterosídeos antraquinônicos,
semelhante à droga vegetal padrão (Figura 7-D).
Esteroides e triterpenos foram detectados na droga vegetal e nos extratos. A
detecção ocorreu após revelação da cromatoplaca com o reativo de Libermann-
Burchard, observou-se a formação de manchas vermelho-fluorescentes sob UV-365
nm com mesma retenção das manchas formada para a droga vegetal padrão. Sabe-
se que P. ginseng (padrão de esteroides e triterpenos) é uma droga vegetal rica em
saponina, que por sua vez é encontrada de duas formas, a forma esteroidal e a
forma triterpênica (WAGNER e BLADT, 2001), logo as manchas detectadas nas
amostras podem ser relacionadas à presença de saponinas (Figura 7-E).
Para flavonoides foram utilizados dois padrões, um composto isolado, a
quercetina e uma droga vegetal padrão de Citrus sinensis. Após a revelação com
solução de cloreto de alumínio e sob UV 365 nm, os flavonoides apresentam
manchas verde-fluorescentes (COSTA, 1994). Na droga vegetal e nos extratos não
foram detectadas manchas com essa característica, ressaltando a ausência de
flavonoides (Figura 7-F).
Os alcaloides são facilmente detectados por CCD após revelação com reativo
de Dragendorff, apresentando manchas com diferentes tonalidades de vermelho
73
(WAGNER e BLADT, 2001). No presente estudo, a droga vegetal (não demonstrado)
e os extratos não apresentaram manchas sugestivas de alcaloides (Figura 7-G).
Polifenóis constituem um grande grupo que reúne uma série de classes de
metabólitos secundários. Os taninos representam uma das suas principais classes.
Estes compostos são divididos em duas subclasses, os taninos condensados, que
são polímeros formados pela associação de moléculas de catequinas (flavan-3-ol) e
os taninos hidrolisáveis, que são constituídos por diversas moléculas de ácidos
fenólicos, como o gálico e o elágico, unidos por um resíduo de glicose central
(SANTOS e MELLO, 2010). Utilizou-se como padrão, nesta análise, o ácido tânico
(tanino hidrolisável) e o S. adstringens, droga vegetal rica em taninos hidrolisáveis.
As manchas observadas nas aplicações referentes à droga vegetal e ao EMAt
apresentaram o mesmo fator de retenção que as manchas dos padrões utilizados
(Figura 7-H). Sendo assim, é possível afirmar que tanto a droga vegetal quanto o
extrato são constituídos por taninos hidrolisáveis.
74
A: Cumarinas
A: Padrão (1,2-benzopirona, 1 mg/mL) B: Droga vegetal padrão C. sinensis
C: Droga vegetal (A. triplinervis) D: Extrato hexânico
E: Extrato de acetato de etila F: Extrato metanólico
Eluente: tolueno:éter (1:1), saturado com ácido acético glacial (10%)
Revelador: não utilizado
B: Cumarinas (após revelação)
A: Padrão (1,2-benzopirona, 1 mg/mL) B: Droga vegetal padrão C. sinensis
C: Droga vegetal (A. triplinervis) D: Extrato hexânico
E: Extrato de acetato de etila F: Extrato metanólico
Eluente: tolueno:éter (1:1), saturado com ácido acético glacial (10%)
Revelador: solução etanólica de KOH (10%)
C: Antraquinonas (extratos)
A: Extrato metanólico
B: Extrato de acetato de etila C: Extrato Hexânico
D: Droga vegetal padrão R. purshiana E: Droga vegetal (A. triplinervis)
Eluente: acetato de etila:metanol:água (100:13,5:10)
Revelador: solução etanólica de KOH (10%)
D: Antraquinonas (droga vegetal)
A: R. purshiana (Antraquinonas livres) B: A. triplinervis (Antraquinonas livres)
C: R. purshiana (O-heterosídeos) D: A. triplinervis (O-heterosídeos) E: R. purshiana (C-heterosídeos) F: A. triplinervis (C-heterosídeos)
Eluente: acetato de etila:metanol:água (100:13,5:10)
Revelador: solução etanólica de KOH (10%)
Figura 7: Prospecção fitoquímica por cromatografia de camada delgada da droga vegetal de A.
triplinervis e seus extratos de diferentes polaridades. (continua)
A B C D E F
A B C D E A B C D E F
A B C D E F
75
E: Esteroides e triterpenos
A: Droga vegetal padrão (Panax giseng)
B: Droga vegetal (A. triplinervis) C: Extrato hexânico
D: Extrato de acetato de etila E: Extrato metanólico
Eluente: tolueno: clorofórmio:metanol (40:40:10)
Revelador: reativo de Liebermann-Burchard
F: Flavonoides
A: Extrato hexânico;
B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico;
D: Droga vegetal padrão (Citrus sinensis) E: Droga vegetal (A. triplinervis)
F: Padrão (quercetina 0,3 mg/mL). Eluente: tolueno:acetato de
etila:metanol:ácido fórmico (75:25:10:6) Revelador: solução metanólica de AlCl3 (2%)
G: Alcaloides
A: Extrato hexânico;
B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico;
D: Padrão (pilocarpina 1mg/mL) Eluente: tolueno:acetato de etila:dietanolamina
(70:20:10) Revelador: reativo de Dragendorff
H: Polifenóis
A: Extrato metanólico
B: Padrão ( solução metanólica de ácido tânico) C: Droga vegetal padrão S. adstringens
D: Droga vegetal (A. triplinervis) Eluente: tolueno:acetato de
etila:metanol:ácido fórmico (40:30:30:10) Revelador: solução metanólica FeCl3 (1%)
Figura 7: Prospecção fitoquímica por cromatografia de camada delgada da droga vegetal de A. triplinervis e seus extratos de diferentes polaridades.
5.4 Perfil espectral dos extratos na região do UV-VIS
Na varredura espectral (190 nm a 700 nm) dos extratos foram observada
absorções característica da presença de cumarinas na faixa do UV (190 a 400 nm).
As cumarinas simples, em geral, apresentam dois ou três picos de absorção na
A B C D E A B C D E F
A B C D E
A B C D
76
região do UV, o primeiro entre 215-235 nm, o segundo entre 275-290 nm e o terceiro
entre 315-350 nm, sofrendo variações de acordo com o grupo químico presente na
cadeia lateral do esqueleto básico das cumarinas (CROSBY e BERTHOLD, 1962;
GANGULY e BAGCHI, 1956).
O EAAt apresentou absorção característica da presença de derivados
cumarínicos, com picos em 233, 293 e 346 nm. Os demais extratos não
apresentaram tais picos (Figura 8). De acordo com estas características espectrais e
com o perfil cromatográfico, o EAAt foi selecionado para fracionamento e obtenção
da FrCAt.
Figura 8: Espectro de absorção (A) na região do UV-VIS dos extratos de A. triplinervis, evidenciando
os picos de absorção característicos de cumarinas. EHAt: extrato hexânico; EAAt: extrato de acetato de etila; EMAt: extrato metanólico.
5.5 Frações obtidas por Cromatografia em Coluna (CC)
Obteve-se um total de 13 frações do EAAt por CC. A análise por CCD com
visualização sob luz UV 365 nm, permitiu observar nas frações de 4 a 10 duas
manchas sugestivas de cumarinas, uma verde-fluorescente e outra azul-fluorescente
mais intensa (Figura 9). A intensidade das manchas referentes às cumarinas foi o
fator determinante para reunião das frações (Tabela 6).
77
Figura 9: Análise por cromatografia de camada delgada das frações do extrato de acetato de etila de
A. triplinervis obtidas em coluna cromatográfica. Fase móvel hexano:acetato de etila (8:2). Análise sob luz UV 365 nm.
Tabela 6: Rendimento das frações do extrato de acetato de etila de A. triplinervis obtidas em coluna cromatográfica. Massa de extrato utilizado no fracionamento: 4,5 g.
Frações Rendimento (mg) 1 e 2 599
3 518
4 201
5-9 1431
10 1036
11-13 176
5.6 Perfil espectral das frações na região do UV-VIS
Após reunião, as frações cumarínicas foram submetidas à varredura espectral
na região do UV-VIS (190 a 700 nm). A fração 5-9 apresentou picos de absorção em
233, 293 e 345 nm (Figura 10), nestes comprimentos de onda ocorrem absorções
relacionadas com derivados cumarínicos, sendo os deslocamentos batacrômicos
favorecidos pelos radicais presentes na cadeia lateral do esqueleto cumarínico (SEM
e BAGCHI, 1959.).
Absorções nas regiões de 290-300 nm e 340-350 nm são características de
compostos contendo grupos com ligações metoxilas (C-O-C) nas posições 6 e 7 do
anel benzênico da 1,2-benzopirona. Dentre as moléculas que apresentam este
Fr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
78
comportamento espectral estão a escopoletina (7-hidroxi-6-metoxicumarina), a
escoparona (6,7-dimetoxicumarina) e a aiapina (6,7-metilenodioxicumarina)
(GOODWIN e POLLOCK, 1954).
As frações 4 e 10, diferentemente da fração 5-9, apresentaram absorção com
menor intensidade na região relacionada a cumarinas (Figura 10). Sendo assim, a
fração 5-9 foi considerada como a Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt),
selecionada para os demais ensaios.
Figura 10: Espectro de absorção (A) na região do UV-VIS das frações cumarínicas obtidas do extrato
de acetato de etila de A. triplinervis, evidenciando os picos de absorção característicos de cumarinas.
5.7 Perfil cromatográfico por CLAE-DAD
O perfil cromatográfico exploratório do EAAt, obtido por CLAE-DAD,
demonstrou a formação de picos em duas regiões de retenção no cromatograma,
entre 3,069 e 4,745 min. e entre 10,131 e 15,330 min.. Em ambas as regiões
ocorreram a formação de um pico com maior intensidade, sendo o primeiro com
tempo de retenção (TR) em 4,773 min. (percentual de área = 34,07%) e o segundo
com TR em 10,719 min. (percentual de área = 9,94%) (Figura 11-A).
O pico de maior intensidade (percentual de área = 34,07%) formado em TR
4,773 min. apresentou, no espectro na região de UV, absorções em 232,9, 293,4 e
79
346,6 nm, sendo compatíveis com derivados cumarínicos (Figura 11-A). O segundo
pico evidenciado, (TR 10,719 min.; percentual de área = 9,94%), apresentou
absorções em UV de 221,1, 288,6 nm relacionadas à presença de outros derivados
aromáticos.
No intervalo entre 3,069 a 4,745 min, além do pico majoritário, inúmeros picos
foram formados, todos eles demonstraram absorções em torno de 230, 290 e 340
nm que são relativas à presença de cumarinas, constatando a presença de diversos
derivados cumarínicos no EAAt.
No perfil cromatográfico por CLAE do EAAt foi observado a formação de
poucos de picos, considerando que este extrato é resultante de uma extração
consecutiva com solventes de polaridades crescentes, é possível afirmar que o
processo extrativo foi eficiente para separação inicial dos compostos de A.
triplinervis, promovendo a concentração de cumarinas no EAAt.
O perfil cromatográfico exploratório da FrCAt demonstrou a existência um pico
de maior intensidade com TR 4,773 min., referente ao composto majoritário da fração
e com dados espectrais em UV relativos à presença cumarinas. Além disso, o
intervalo entre 3,525 a 4,773 apresentou picos com maiores áreas e com absorções
espectrais características de cumarinas, tal como para o extrato. A diferença
observada entre perfil do extrato e fração foi a não retenção de picos acentuados
entre 10,131 e 15,330 min. para FrCAt, inferindo, que na fração houve separação
das cumarinas do EAAt com concentração dos compostos majoritários,
principalmente do composto com pico em TR 4,773 (Figura 11-B).
80
Figura 11: Perfis cromatográficos exploratórios obtidos por CLAE-DAD com detecção em 280 nm. A:
Cromatograma do Extrato de Acetato de Etila (EAAt) de A. triplinervis e espectro de absorção dos picos majoritários na região do UV. B: Cromatograma da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt) e espectro de absorção do pico majoritário na região do UV.
5.8 Espectro no Infravermelho (IV)
O espectro no IV da FrCAt apresentou absorções correspondentes a
derivados cumarínicos (Figura 12). A absorção em 1708 cm-1 é atribuída a uma
deformação axial C=O da carbonila α, β insaturada do grupo lactônico presente nas
cumarinas, sendo a característica mais importante destas moléculas no espectro de
IV. Já bandas em 1579 e 1489 cm-1 são indicativas de deformações axiais de
ligações C=C presentes no anel aromático das cumarinas. Bandas em 941, 883 e
837 cm-1 são relacionadas a deformações angulares C-H, devido ligações deste tipo
localizadas em diferentes posições do anel benzênico das cumarinas (CUNHA et al.
2015).
81
Figura 12: Espectro de absorção no infravermelho da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt).
5.9 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas
(CLAE-EM) Na análise por CLAE foi possível verificar a existência de um composto
majoritário na FrCAt. No cromatograma, observa-se a formação de um pico com
maior intensidade no TR 3,48 min. (Figura 13-A).
A análise por EM com sistema de Ionização por Spray de Elétrons (ESI -
Electrospray Ionisation) do TR 3,48 min. demonstrou a formação de íon molecular
m/z [M+1]+ 191,2 u, com o qual se determinou a massa molecular do composto
majoritário (190 g/mol), sendo compatível com a fórmula molecular C10H6O4 (Figura
13-B).
Os dados espectrais por EM-ESI do composto majoritário da FrCAt constam
na literatura como referentes a uma cumarina com grupamento metilenodioxi
substituindo as posições 6 e 7 do anel aromático cumarínico (MAES et al. 2005).
Sendo assim é possível afirmar que a cumarina majoritária presente na fração, trata-
se da 6,7-(metilenodioxi)cumarina (aiapina). Para complementar a elucidação
estrutural da molécula, a FrCAt foi submetida a análise por RMN.
82
Figura 13: Dados cromatográficos e espectrais da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt). A: Cromatograma da FrCAt obtido por CLAE; B: Espectro de
massas obtido por EM-ESI [M+1] referente ao pico majoritário formado em TR 3,48 min. .
A B
83
5.10 Espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
A análise por RMN permitiu a confirmação da estrutura molecular do
composto majoritário da FrCAt (Tabela 7). O espectro de RMN 1H 400 MHz emitiu
um sinal em δ 6,82 relativo a um singleto atribuído ao deslocamento de hidrogênios
presentes nas posições 5 e 8 do anel benzênico da molécula. A presença de um par
de dupletos em δ 7,58 e 6,28 (J = 9,5 Hz) é associada a hidrogênios com
configuração cis, ocupantes da dupla ligação na posição 3 e 4 do anel lactônico da
molécula. A formação de um singleto em δ 6,08 corresponde a dois átomos de
hidrogênio presentes no grupo metilenodioxi ligados à posição 6,7 do anel benzênico
da molécula (Figura 14).
No espectro de RMN 13C 400 MHz foi possível observar formação de apenas
6 sinais referentes a 6 carbonos, porém, a substância apresentou fórmula molecular
com 10 carbonos, apesar disso, a identificação estrutural por RMN 13C não foi
comprometida. O sinal em δ 145,1 foi atribuído ao carbono ligado ao oxigênio na
posição 6 do anel benzênico. Os deslocamentos δ 105,2 e 98,6 correspondem aos
carbonos presente nas posições 5 e 8 do anel benzênico, respectivamente. A dupla
ligação presente anel lactônico foi evidenciado com sinais característicos em δ 143,7
para o carbono 4 e em δ 113,5 para o carbono 3 (Figura 15).
No espectro de RMN 13C-DEPT135 foi possível constatar a presença de 5
ligações C-H na molécula. A absorção em δ 102,6 apresentou amplitude negativa,
sendo uma característica atribuída à presença de apenas um carbono metileno
(CH2) (Figura 16).
Com os dados espectrais obtidos por EM e RMN, determinou-se a estrutura
molecular do composto majoritário de FrCAt, sendo a molécula 6,7-
(metilenodioxi)cumarina. Este composto foi isolado pela primeira vez a partir da
espécie Ayapana triplinervis, por isso a molécula recebeu denominação trivial de
aiapina (BOSE e ROY, 1936). A aiapina foi identificada em outras espécies da
família Asteraceae como Helianthus annuus (TAL e ROBESON, 1985), Pterocaulon
virgatum (DEBENEDETTI et al. 1998), Pterocaulon polystachyum (VERA et al. 2001)
e Ageratum fastigiatum (GONÇALVES et al. 2011).
A aiapina foi apontada como uma fitoalexina nas espécies que a produzem.
Na espécie Helianthus annuus a sua produção é aumentada em resposta a ataques
84
de patógenos como fungos (TAL e ROBESON, 1985; URDANGARIN et al. 1999;
PRATS et al. 2006) e em P. polystachyum foi atribuída a esta cumarina a inibição do
crescimento de larvas que infestam a planta (VERA et al. 2006).
Tabela 7: Comparação entre os dados de RMN de 1H e 13C registrados na literatura para a molécula
aiapina e os resultados obtidos para a Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt). Posição δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)
Aiapina (CDCl3)* FrCAt (CDCl3) Aiapina (CDCl3)* FrCAt (CDCl3)
3 6,28 d J = 9,5 Hz) 6,28 d 113,4 113,5
4 7,58 d J = 9,5 Hz) 7,59 d 143,4 143,7
5 6,82 s 6,82 s 105,0 105,2
6 - - 143,4 145,13
8 6,82 s 6,82 s 98,6 98,6
6,7-OCH2O 6,10 s 6,07 s 102,3 102,5
*(DEBENEDETTI et al. 1998)
Figura 14: Espectro de RMN de 1H da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt) (CDCl3, 400 MHz).
85
Figura 15: Espectro de RMN de 13C da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt) (CDCl3, 400
MHz).
Figura 16: Espectro de RMN de 13C-DEPT135 da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt) (CDCl3,
400 MHz).
30405060708090100110120130140150160170180190 ppm
98.539
102.354
105.023
113.387
143.511
86
5.11 Avaliação farmacológica
5.11.1 TOXICIDADE ORAL AGUDA
Não foram observadas alterações comportamentais (diminuição da
mobilidade, letargia ou sedação), durante as primeiras 4 horas de observação, nos
animais tratados com doses de 200, 600 e 1000 mg/kg da FrCAt. Ao final dos 14
dias de acompanhamento, nenhuma morte foi registrada, não havendo também
diferença no ganho de peso corporal em relação ao grupo controle. Sendo assim,
conforme estabelecido na OECD 423, a FrCAt apresentou baixo potencial tóxico
agudo por via oral.
Concordando com este achado, avaliações da toxicidade oral aguda de
diferentes derivados vegetais da A. triplinervis também demonstraram baixo
potencial tóxico. A administração de extrato metanólico (100 a 1600 mg/kg; BOSE et
al. 2007) ou extrato éter de petróleo (2000 mg/kg; PARIMALA et al. 2012) das folhas
não promoveram mortes nos animais tratados.
A administração oral do extrato hidroalcoólico (etanol 70%) de partes aéreas
(2000 e 5000 mg/kg) promoveu alterações comportamentais, sendo observadas
sonolência e letargia até 90 min. após a administração. Não houve, contudo, morte
dos animais durante todo o período de observação (14 dias), portanto, o extrato foi
considerado de baixa toxicidade (MELO et al. 2013).
5.11.2 EFEITO ANTINOCICEPTIVO
5.11.2.1 Contorções abdominais induzidos por ácido acético
A FrCAt, nas doses de 5, 10 e 20 mg/kg 9 (v.o.), reduziu significativamente as
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (0,6%; i.p.) quando comparado
ao grupo controle (Figura 17). Não foram observadas diferenças significativas entre
87
os efeitos das doses, bem como, não apresentam diferença estatística em relação
ao padrão indometacina (10 mg/kg; v.o.).
Figura 17: Efeito da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAt), v.o., sobre as contorções induzidas
pelo ácido acético 0,6 %, i.p., em camundongos. Grupo controle positivo tratado com Indometacina (INDO) 10 mg/kg, v.o. Cada valor representa média ± erro padrão da média (n = 5), *p < 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA, um critério, seguido pelo teste de Tukey).
A ausência de variação do efeito com o aumento da dose de FrCAt
administrada, considerando que desempenharam resultado aproximado a
indometacina, pode significar que se encontram na faixa de efeito máximo para
estas doses. Estudos adicionais deverão ser conduzidos para identificar a dose
mínima eficaz, bem como a dose efetiva mediana. Apesar disto, os dados obtidos já
permitem notar que a FrCAt apresenta efeitos significativos.
O tratamento oral com extrato de éter de petróleo das folhas (100 e 200
mg/kg) (PARIMALA et al. 2012) e com o extrato hidroalcoólico das partes aéreas
(200 a 800 mg/kg) (MELO et al. 2013) da A. triplinervis promoveu redução das
contorções induzidas pelo ácido acético. Contudo, nestes estudos não foram
88
demonstrados investigações fitoquímicas que relacionassem a presença de algum
composto ou classe de composto com tal efeito. Os dados obtidos no presente
estudo podem contribuir para o entendimento da relação entre este efeito e a
constituição química da planta.
O teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético é um modelo
utilizado para avaliar efeito antinociceptivo periférico de origem inflamatória. O ácido
acético é um agente flogístico que induz a nocicepção indireta resultante de uma
inflamação aguda no peritônio (LE BARS et al. 2001). Neste processo ocorre o
recrutamento de células, como macrófagos e mastócitos, para o peritônio, onde
liberam mediadores inflamatórios como PGs, histamina, 5-HT, Bk e citocinas
(CARVALHO e LEMÔNICA, 1998).
As citocinas desempenham um importante papel na hiperalgesia. A liberação
de TNF-α, interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 8 (IL-8) contribue para o
desenvolvimento da dor inflamatória, além de estimular a produção de outros
mediadores inflamatórios como PGs e mediadores simpaticomiméticos (RIBEIRO et
al. 2001). A redução do número de contorções promovida pela FrCAt pode
representar uma possível atividade sobre estes mediadores.
Não foram encontrados dados na literatura sobre efeito antinociceptivo
associado ao composto majoritário da FrCAt, a aiapina. Contudo, outras cumarinas
têm demontrado capacidade de interferir no processo da nocicepção. A umbeliferona
(7-hidroxicumarina), nas doses de 3,15, 30 e 60 mg/kg, v.o., reduziu as contorções
abdominais induzidas por ácido acético em um padrão dependente da dose
(BARROS et al. 2010). A escopoletina (6,7-dimetoxicumarina), por sua vez,
promoveu este efeito em doses de 1 a 10 mg/kg (CHANG et al. 2012).
O estudo de Lima e seus colaboradores (2011) demonstrou que a
umbeliferona é capaz de reduzir os níveis de citocinas pró-inflamatórios (TNF-α e IL-
β) e da PGE2 no tecido da pata dos animais induzidos ao dano inflamatório. Ela
também reduziu os níveis teciduais de MPO, um marcador da migração de
neutrófilos.
A escopoletina, nas doses de 1 a 10 mg/kg (v.o), também mostrou-se capaz
de reduzir os níveis de TNF-α e PGE2 no tecido plantar submetido a indução de
processo inflamatório. Reduziu também a concentração da enzima COX-2 no tecido
(CHANG et al. 2012).
89
A demonstração dos efeitos antinociceptivos destes derivados cumarínicos,
bem como os mecanismos identificados podem representar um norteador para a
investigação dos mecanismos de ação da aiapina, composto cumarínico majoritário
na FrCAt. Apesar disto, é necessário considerar que o teste das contorções
abdominais é sensível a uma ampla gama de drogas antinociceptivas, quer sejam de
ação central ou periférica (LE BARS et al, 2001).
Tanto os analgésicos do grupo dos AINEs, que atuam sobre os processos
periféricos inibindo a síntese de prostaglandinas, quanto os analgésicos opioides
que atuam principalmente sobre os mecanismos de condução da dor, são efetivos
neste teste (REICHERT et al. 2001). Outras classes de fármacos, como
bloqueadores adrenérgicos (DUARTE et al, 1988), anti-histamínicos (CHUNG, et al.
1984) e relaxantes musculares (KAMEYAMA et al. 1985) também apresentam
atividade neste teste. Por esta razão, faz-se necessário a aplicação de modelos que
permitam discernir a natureza da ação da FrCAt.
5.11.2.2 Teste da Formalina
No presente estudo, o tempo de lambida da pata injetada com formalina foi
reduzido em todas as doses (5, 10 e 20 mg/kg) testadas, tanto na primeira (0-5 min.)
quanto na segunda fase (15-30 min.) do teste. No entanto, tal como no teste
anterior, não foram observadas diferenças entre as doses, reforçando a hipótese de
que representam o efeito máximo produzido pela droga nestas doses. Na
comparação com o padrão (morfina; 4 mg/kg; s.c.), a análise estatística também não
revelou diferença significativa (p = 0,937 versus 5 mg/kg; p = 0,965 versus 10 mg/kg
e p = 0,603 versus 20 mg/kg da FrCAt) em ambas as fases (Figura 18-A).
O teste da formalina é muito eficaz para avaliação antinociceptiva de agente
farmacológicos (WHEELER-ACETO et al. 1990). Diferente do teste das contorções
abdominais, este modelo apresenta especificidade diante da resposta nociceptiva,
possibilitando o estudo do mecanismo de ação de fármacos (HUNSKAAR e HOLE,
1987).
A avaliação ocorre em duas etapas distintas, a primeira fase (0-5 min.)
corresponde a mecanismos de sinalização neurogênica, com a ativação de FAPs,
90
sendo as mais importantes as fibras C, devido à estimulação química promovida
pela injeção da formalina (MARTINDALE et al. 2001).
Na segunda fase do teste (15-30 min.) é observada a manifestação da dor de
origem inflamatória, ocorrendo uma sucessão de eventos caracterizados pela
resposta inflamatória gerada pelo dano tecidual promovido pela injeção da formalina
(HUNSKAAR e HOLE, 1987). Nesta fase, há intensa liberação de mediadores
inflamatórios (PGs, 5-HT, histamina e Bk), que também podem promovem a
sensibilização e/ou ativação de nociceptores (CHICHORRO et al. 2004).
Analgésicos narcóticos, como a morfina e derivados, que agem em
mecanismos centrais, demonstram atividade nas duas fases do teste (DICKENSON
e SULLIVAN, 1987). Drogas, como os AINES, que atuam sobre os mecanismos
periféricos, envolvendo a produção e liberação de mediadores inflamatórios,
geralmente apresentam atividade significativa apenas na segunda fase (SHIBATA et
al. 1989).
A redução significativa do tempo de lambida na fase neurogênica do teste
sugere o envolvimento de mecanismos centrais no efeito da FrCAt. É sabido que a
morfina, droga padrão utilizada, exerce efeito antinociceptivo pela ativação de
receptores acoplados a uma proteína Gαi, denominados receptores opioides. A
ativação destes receptores, entre outros efeitos, promove a hiperpolarização
(abertura de canais de K+) do terminal nervoso e o bloqueio de canais de Ca2+,
reduzindo a intensidade ou bloqueando a transmissão do impulso nóxico da FAP
para o neurônio medular (PASTERNAK, 2005).
A fim de avaliar envolvimento de receptores opioides nos efeitos promovidos
pela FrCAt, foi realizada a coadministração da naloxona (0,4 mg/kg; s.c.) com a
FrCAt (5 mg/kg) e com a droga padrão. Como esperado de um antagonista de
receptores opioides, a naloxona inibiu o efeito promovido pela morfina (4 mg/kg;
s.c.). De maneira semelhante, suprimiu também o efeito antinociceptivo promovido
pela FrCAt em ambas as fases do teste, sugerindo que a fração cumarínica utiliza a
via opióide para exercer seu efeito (Figura 18-B).
91
Figura 18: Teste da Formalina. A: Efeito da Fração Cumarínica de A. triplinervis (FrCAT; v.o.), sobre
as fases neurogênica (0-5 min.) e inflamatória (15-30 min.) da nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina (1%). Cada valor representa a média ± e.p.m. (n = 5). *p < 0,05 versus grupo controle (one way ANOVA seguido pelo teste de Tukey). B: Efeito da coadministração de naloxona (0,4 mg/kg, s.c) sobre a ação da FrCAT (5 mg/kg, v.o.). Cada valor representa média ± e.p.m. (5 animais/grupo). *p < 0,05 comparação entre os grupos de cada tratamento (ANOVA one way seguido por teste de Tukey).
A B
92
O extrato éter de petróleo das folhas de A. triplinervis, administrado v.o.,
reduziu o tempo de lambida em 19,79% na primeira fase e 68,98% na segunda fase
do teste da formalina (PARIMALA et al. 2012). O extrato hidroalcoólico de partes
aéreas da planta (400 a 800 mg/kg), por outro lado, demonstrou efeito apenas na
primeira fase, mesmo assim, com intensidade inferior ao controle positivo (morfina 4
mg/kg). Adicionalmente, a naloxona não foi capaz de reverter este efeito, sugerindo
que o efeito central promovido pelo extrato hidroalcoólico não envolve o sistema
opioide (MELO et al. 2013).
A variação dos efeitos entre os derivados vegetais de A. triplinervis, pode
estar relacionada às influencias sazonais ou mesmo aos distintos processos
extrativos, que resultam em diferentes composições químicas. Considerando a
carência de estudos que apontem os possíveis compostos responsáveis pelos
efeitos antinociceptivos desta espécie, o presente estudo traz importante
contribuição ao demonstrar a participação das cumarinas para tal. Destacando ainda
a aiapina, composto majoritário da FrCAt, como possível responsável pelos efeitos
observados.
Estudos anteriores já identificaram cumarinas com atividade antinociceptiva
revertida pela coadministração da naloxona. A cumarina simples (1,2-benzopirona)
administrada por v.o. (10 mg/kg) demonstrou efetividade nas duas fases do teste da
formalina, tendo o efeito revertido pela naloxona em ambas as fases, motivo pelo
qual, relacionou-se o seu efeito antinociceptivo com o sistema opioide (LEAL et al.
1997).
A umbeliferona (7-hidroxicumarina), que difere da cumarina simples por uma
hidroxila ligada na posição 7 do anel benzênico, apresentou atividade em ambas as
fases no teste da formalina (2,5 mg/kg; v.o.), mas não sofreu influencia da naloxona
(LINO et al. 1997), apresentando relação com nocicepção periférica de origem
inflamatória, devido à inibição da atividade da PGE2 (LIMA et al. 2011).
De fato, é frequente a associação do efeito anti-inflamatório com as
propriedades antinociceptivas dos derivados cumarínicos, como no caso da
esculetina (RZODKIEWICZ et al. 2015) e da escopoletina (CHANG et al. 2012). A
própria cumarina simples, anteriormente citada com possível atividade sobre o
sistema opioide, também apresenta forte evidencia de interferir em mecanismos
inflamatórios (LEE et al. 1980).
93
Dentro deste contexto, apesar de o presente estudo apontar uma atividade da
FrCAt, e possivelmente da aiapina, sobre o sistema opióide, não é possível excluir a
participação de mecanismos anti-inflamatórios. Estudos adicionais deverão ser
realizados a fim de elucidar esta questão.
Diferentemente dos estudos que comprovam a relação das cumarinas e a
variação das suas estruturas moleculares com o efeito sobre diversos mediadores
inflamatórios, não há estudos do mecanismo das cumarinas a nível central,
principalmente em receptores opioides, neste sentido, os resultados demonstrados
neste trabalho com FrCAt/aiapina, estimulam que investigações sejam realizadas
para avaliar o efeito das cumarinas no sistema opioide e elucidar os seus
mecanismos.
94
6 CONCLUSÃO
O fracionamento do extrato de acetato de etila das partes aéreas de A.
triplinervis resultou uma fração rica em cumarinas (FrCAt), evidenciado por análises
cromatográficas e espectrométricas, pelas quais foi possível identificar a cumarina
majoritária da fração, sendo a aiapina (6,7-[metilenodioxi]cumarina).
A FrCAt demonstrou efeito antinociceptivo com tratamento por via oral, em
camundongos, através do teste das contorções abdominais induzidas por ácido
acético e do teste da formalina, neste último o efeito foi revertido pela naloxona,
indicando que o mecanismo de ação da fração pode estar relacionado ao sistema
opioide. Apresentou também baixa toxicidade oral aguda, não promovendo
alterações comportamentais ou morte dos animais.
Desta forma, o presente estudo aponta pela primeira vez uma cumarina como
possível responsável pelos efeitos antinociceptivos da A. triplinervis, corroborando
com o uso tradicional desta espécie e contribuindo para sua futura aplicação
medicinal contra a dor. Estudos adicionais deverão ser conduzidos para confirmar o
papel de aiapina, constituinte majoritário, neste efeito.
95
REFERÊNCIAS
AGAPITO, T.; SUNG, I. Fitomedicina, 1100 Plantas Medicinales. Isabel, Lima, Peru, 2003.
AHMAD, S. S. et al. Exploring the medicinal plants wealth: a traditional medico-botanical knowledge of local communities in Changa Manga Forest, Pakistan. Middle-East Journal of Scientific Research, v. 20, n. 12, p. 1772-1779, 2014.
ALMEIDA, T.F.; ROIZENBLATT, S.; TUFIK, S. Afferent pain pathways: a neuroanatomical review. Brain research, v. 1000, n. 1, p. 40-56, 2004.
ARÉVALO, G. Medicina Indígena. Las plantas medicinales y su beneficio en la salud Shipibo-Conibo. Editorial AIDESEP, Lima, Perú, 1994.
ARMSTRONG, A.W.; GOLAN, D.E. Pharmacology of hemostasis and thrombosis. Principles of Pharmacolog. In: GOLAN, D.E; TASHJIAN, A.R.; ARMSTRONG, E.J.; ARMSTRONG, A.W. (eds) Principles of Pharmacology: The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 3. ed., p. 372-400, 2011.
ARUNG, E.T.; KUSPRADINI H.; KUSUMA, I.W.; SHIMIZU, K.; KONDO, R. Validation of Eupatorium triplinerve Vahl leaves, a skin are herb from East Kalimantan, using a melanin biosynthesis assay. Journal of Acupuncture and Meridian Studies, v. 5, n. 2, p. 87-92, 2012.
ASHOKARAJ, S.; MAHADEV, C. Study on larvicidal activity of weed extracts against Spodoptera litura. Journal of Environmental Biology, v. 34, p. 253-257, 2013.
BALBACH, A. As plantas curam. 2. ed. Vida Plena, São Paulo, Brasil, 2003.
BALUNAS, M.J.; KINGHORN, A.D. Drug discovery from medicinal plants. Life sciences, v. 78, n. 5, p. 431-441, 2005.
BANSAL, Y.; SETHI, P.; BANSAL, G. Coumarin: a potential nucleus for anti-inflammatory molecules. Medicinal Chemistry Research, v. 22, n. 7, p. 3049-3060, 2013.
BARROS, T.A. et al. Antinociceptive and anti-‐inflammatory properties of 7-‐hydroxycoumarin in experimental animal models: potential therapeutic for the control of inflammatory chronic pain. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 62, n. 2, p. 205-213, 2010.
BASBAUM, A. I. et al. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell, v. 139, n. 2, p. 267-284, 2009.
96
BECKSTROM-STERNBERG, Stephen M.; DUKE, J. A.; WAIN, K. K. The ethnobotany database. Genome Informatics Group, National Agricultural Library. US Department of Agriculture, Beltsville, MD, 1994.
BEGUM, J.; BHUIYAN, M.N.I.; TAZNIN, T. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oil from Eupatorium triplinerve Vahl. aerial parts. Asian Journal of Microbiology Biotechnology Environmental Society, v.12, n. 3, p. 543-547, 2010.
BELLIS, D.M.; SPRING, M.S.; STOKER, J.R. The biosynthesis of dicoumarol. Biochemical Journal, v. 103, n. 1, p. 202, 1967.
BENYAMIN, R. et al. Opioid complications and side effects. Pain Physician, v.11, p. S105-S120, 2008.
BEPARI, M. et al. Eupatorium ayapana leaf extracts enhance anti-oxidant potential in Ehrlich’s ascites carcinoma-bearing Swiss albino mice. International Journal of Life Science & Pharma Research, v. 4, n. 3, 2013.
BESSON, J. M. The neurobiology of pain. The Lancet, v. 353, n. 9164, p. 1610-1615, 1999.
BISWAS, A.; BHATTACHARYA, S.; MAHAPATRA, S. D.; DEBNATH, M.; BISWAS, M. The antioxidant effects of Eupatorium triplinerve, Hygrophila triflora and Pterocarpus marsupium-A comparative study. European Journal of Applied Sciences, v. 4, n. 3, p. 136-139, 2012..
BJÖRKMAN, R. Central antinociceptive effects of non-‐steroidal anti-‐inflammatory drugs and paracetarmol. Acta Anaesthesiologica Scandinavica, v. 39, n. s103, p. 7-44, 1995.
BOSE, P. et al. Hepatoprotective and antioxidant effects of Eupatorium ayapana against carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in rats. Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics, v. 6, n. 1, p. 27-33, 2007.
BOSE, P.K.; ROY, A.C. The constitution of ayapanin. Journal Indian Chemical Society, v. 13, p. 586, 1936.
BRACK EGG, A. Diccionario enciclopédico de plantas útiles del Perú. CBC; Centro de Estudios Regionales Andinos, Bartolomé de Las Casas, Cuzco, Peru, 1999.
CARR, D.B.; GOUDAS, L.C. Acute pain. The Lancet, v. 353, n. 9169, p. 2051-2058, 1999.
CARVALHO, W.A.; LEMÔNICA, L. Mecanismos celulares e moleculares da dor inflamatória. Modulação periférica e avanços terapêuticos. Revista Brasileira de Anestesiologia, v. 48, n. 2, p. 137-158, 1998.
97
CHANG, T.N. et al. Ameliorative effects of scopoletin from Crossostephium chinensis against inflammation pain and its mechanisms in mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v. 2012.
CHATURVEDI, R.; MULCHANDANI, N. B. Coumarins from Eupatorium ayapana. Journal Indian Chemical Society, v. 66, p. 286-287, 1989.
CHAVES, D.S.A. et al. Metabólitos secundários de origem vegetal: uma fonte potencial de fármacos antitrombóticos. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 172-180, 2010.
CHICHORRO, J.G.; LORENZETTI, B.B.; ZAMPRONIO, A.R. Involvement of bradykinin, cytokines, sympathetic amines and prostaglandins in formalin-‐induced orofacial nociception in rats. British journal of pharmacology, v. 141, n. 7, p. 1175-1184, 2004.
CHUNG, Y.H. et al. Analgesic effect of histamine induced by intracerebral injection into mice. Agents and actions, v. 15, n. 3-4, p. 137-142, 1984.
COSTA, A.F. Farmacognosia. 5 ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1994.
CROSBY, D.G.; BERTHOLD, R.V. Fluorescence spectra of some simple coumarins. Analytical biochemistry, v. 4, n. 5, p. 349-357, 1962.
CUNHA, S. et al. Síntese de ácidos cumarino-3-carboxílicos e sua aplicação na síntese total da aiapina, cumarina e umbeliferona. Química Nova, v. 38, n. 8, p. S1-S9, 2015.
DAS, A.; BONDYA, S.L. Indigenous herbal healers of dumka district: repositories of ethno-medicines. International Journal Indegenous for Exchange of Knowledge, v. 2, n. 1, p. 25-33, 2015.
JAGER, L.S.; PERFETTI, G.A.; DIACHENKO, G.W. Determination of coumarin, vanillin, and ethyl vanillin in vanilla extract products: liquid chromatography mass spectrometry method development and validation studies. Journal of Chromatography A, v. 1145, n. 1, p. 83-88, 2007.
DE MOURA, V. M. et al. Plants used to treat snakebites in Santarém, western Pará, Brazil: An assessment of their effectiveness in inhibiting hemorrhagic activity induced by Bothrops jararaca venom. Journal of ethnopharmacology, v. 161, p. 224-232, 2015.
DEBENEDETTI, S.L. et al. Two 6, 7-dioxygenated coumarins from Pterocaulon virgatum. Phytochemistry, v. 48, n. 4, p. 707-710, 1998.
DEEPTHY, R. et al. Ethanobotanical studies on medicinal plants used for skin diseases in Malabar Region of Kerala. International Journal of Herbal Medicine, v. 2, n. 1, p. 92-99, 2014.
98
DEFILIPPS, R.A.; MAINA, S.L.; CREPIN, J. Medicinal plants of the Guianas (Guyana, Surinam, French Guiana). Washington, DC: Department of Botany, National Museum of Natural History, Smithsonian Institution, 2004.
DI STASI, L.C.; HIRUMA-LIMA, C.A. Plantas medicinais na Amazônia e na mata atlântica, 2 ed. UNESP, São Paulo, Brasil, 2000.
DI STASI, L.C.; SANTOS, E.M.R.; SANTOS, C.M.; HIRUMA-LIMA A.C. Plantas Medicinais da Amazônia. UNESP, São Paulo, Brasil, 1989.
DICKENSON, A.H. Spinal cord pharmacology of pain. British Journal of Anaesthesia, v. 75, p. 193-193, 1995.
DICKENSON, A.H.; SULLIVAN, A.F. Subcutaneous formalin-induced activity of dorsal horn neurones in the rat: differential response to an intrathecal opiate administered pre or post formalin. Pain, v. 30, n. 3, p. 349-360, 1987.
DUARTE, I. D.; NAKAMURA, M.; FERREIRA, S. H. Participation of the sympathetic system in acetic acid-induced writhing in mice. Brazilian journal of medical and biological research, v. 21, n. 2, p. 341-343, 1987.
EGAN, D. et al. The pharmacology, metabolism, analysis, and applications of coumarin and coumarin-related compounds. Drug Metabolism Reviews, v. 22, n. 5, p. 503-529, 1990.
ELISABETSKY, E.; CASTILHOS, Z.C. Plants used as analgesics by Amazonian caboclos as a basis for selecting plants for investigation. Pharmaceutical Biology, v. 28, n. 4, p. 309-320, 1990.
FACKNATH, S.; LALLJEE, B. Study of various extracts of Ayapana triplinervis for their potential in controlling three insect pests of horticultural crops. Tropicultura, v. 26, n. 2, p. 119-124, 2008.
GANGULY, B.K.; BAGCHI, P. Studies on the ultraviolet absorption spectra of coumarins and chromones Part I. Journal of Organic Chemistry, v. 21, n. 12, p. 1415-1419, 1956.
GARG, S.C.; NAKHARE, S. Studies on the essential oil from the flowers of Eupatorium triplinerve. Índian Perfumer, v. 37, p. 318-323, 1993.
GARG, S.C.; NIGAM, S.S. Chemical examination of the essential oil from the leaves of Eupatorium triplinerve (Vahl). Flavour Industry, v. 1, p. 469–472, 1970.
GAUVIN-BIALECKI, A.; MARODON, C. Essential oil of Ayapana triplinervis from Reunion Island: A good natural source of thymohydroquinone dimethyl ether. Biochemical Systematics and Ecology, v. 36, p. 853–858, 2009.
GHOSH, A. Herbal folk remedies of Bankura and Medinipur districts, West Bengal, Indian Journal Traditional Knowledge, v. 2, p. 393-396, 2003.
GONÇALVES, L.D. et al. Contribution for the phytochemical studies of Ageratum fastigiatum. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 21, n. 6, p. 936-942, 2011.
99
GOODWIN, R.H.; POLLOCK, B.M. Ultraviolet absorption spectra of coumarin derivatives. Archives of biochemistry and biophysics, v. 49, n. 1, p. 1-6, 1954.
GUPTA, D.; CHARLES, R.; GARG, S.N. Chemical composition of the essential oil from the leaves of Eupatorium triplinerve Vahl. Journal Essential Oil Research, v. 16, p. 473-475, 2004.
GUPTA, M. et al. Antimicrobial activity of Eupatorium ayapana. Fitoterapia, v. 73, p. 168-170, 2002.
HENRIQUES, A.T.; LIMBERGER, R.P; KERBER, V.A.; MORENO, P.R.H. Alcaloides: generalidades e aspectos básicos. In: SIMÕES, C.M.O. (Orgs.). Farmacognosia, da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre (RS): UFRGS, 2010. p. 765-791.
HUNSKAAR, S.; HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and noninflammatory pain. Pain, v. 30, p. 103-104, 1987.
JARDIM, M.A.G. (org). Diversidade biológica das áreas de proteção ambiental: Ilhas do Combu e Algodoal-Maiandeua. MPEG/MCT/CNPq. Belém, Pará, Brasil, 2009.
JONVILLE, M.C. et al. Screening of medicinal plants from Reunion Island for antimalarial and cytotoxic activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 120, n. 3, p. 382-386, 2008.
JULIUS, D.; BASBAUM, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413, n. 6852, p. 203-210, 2001.
KAMEYAMA, T. et al. Antinociceptive action of tizanidine in mice and rats. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology, v. 330, n. 2, p. 93-96, 1985.
KIM, H.J. et al. Scopoletin suppresses pro-inflammatory cytokines and PGE2 from LPS-stimulated cell line, RAW 264.7 cells. Fitoterapia, v. 75, n. 3, p. 261-266, 2004.
KOPF, A.; PATEL, N.B. Guide to pain management in low-resource settings. Seattle, WA: International Association for the Study of Pain, p. 67-78, 2010.
KOSTER, R.; ANDERSON, M.; BEER, E. J. Acetic acid for analgesic screening. Federation Proceeding, v. 18, p. 412-417, 1959.
KOSTOVA, I. Synthetic and natural coumarins as cytotoxic agents. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents, v. 5, n. 1, p. 29-46, 2005.
KRISHNAN, M. et al. Antioxidant mediated antiulcer effect of Eupatorium triplinerve Vahl against acetic acid induced ulcerative colitis in mice. Biomedicine & Aging Pathology, v. 4, n. 2, p. 153-160, 2014.
KUSTER, R.M.; ROCHA, L.M. Cumarinas, cromonas e xantonas. In: SIMÕES, C.M.O. (Orgs.). Farmacognosia, da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre: UFRGS, 2010. p. 537-556.
100
LAKE, B.G. Coumarin metabolism, toxicity and carcinogenicity: relevance for human risk assessment. Food and Chemical Toxicology, v. 37, n. 4, p. 423-453, 1999.
LANS, C. Comparison of plants used for skin and stomach problems in Trinidad and Tobago with Asian ethnomedicine. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine. v. 3, p. 3, 2007a.
LANS, C. Ethnomedicines used in Trinidad and Tobago for reproductive problems. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, v. 3, p. 13, 2007b.
LATREMOLIERE, A.; WOOLF, C.J. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. The Journal of Pain, v. 10, n. 9, p. 895-926, 2009.
LE BARS, D.; GOZARIU, M.; CADDEN, S.W. Animal models of nociception. Pharmacological reviews, v. 53, n. 4, p. 597-652, 2001.
LE COINT, P. Árvores e plantas úteis (indígenas e aclimatadas). 2 ed. Companhia Editora Nacional, Pará, Brasil, 1947.
LEAL, L.K.A.M. et al. Antinociceptive and antiedematogenic effects of the hydroalcoholic extract and coumarin from Torresea cearensis Fr. All.Phytomedicine, v. 4, n. 3, p. 221-227, 1997.
LEE, R.E.; BYKADI, G.; RITSCHEL, W.A. Inhibition of prostaglandin biosynthesis by coumarin, 4-hydroxycoumarin, and 7-hydroxycoumarin.Arzneimittel-Forschung, v. 31, n. 4, p. 640-642, 1980.
LIMA, F.O. et al. Mechanisms involved in the antinociceptive effects of 7-hydroxycoumarin. Journal of natural products, v. 74, n. 4, p. 596-602, 2011.
LINO, C.S. et al. Analgesic and antiinflammatory activities of Justicia pectoralis Jacq and its main constituents: coumarin and umbelliferone.Phytotherapy Research, v. 11, n. 3, p. 211-215, 1997.
LOESER, J.D.; MELZACK, R. Pain: an overview. The Lancet, v. 353, n. 9164, p. 1607-1609, 1999.
LOESER, J.D.; TREEDE, R.D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain, v. 137, n. 3, p. 473-477, 2008.
LOPES, T. R. M. et al. Antimicrobial bioassay-guided fractionation of a methanol extract of Eupatorium triplinerve. Pharmaceutical biology, n. 0, p. 1-7, 2014.
MAES, D. et al. Synthesis and structural revision of naturally occurring ayapin derivatives. Tetrahedron, v. 61, n. 9, p. 2505-2511, 2005.
MAHOMOODALLY, M.F.; SREEKEESOON, D.P.A Quantitative ethnopharmacological documentation of natural pharmacological agents used by pediatric patients in Mauritius. BioMed research international, v. 2014, 2014.
101
MAHOMOODALLY, M.F.; MUTHOORAH, L.D. An ethnopharmacological survey of natural remedies used by the Chinese community in Mauritius. Asian Pacific journal of tropical biomedicine, v. 4, p. S387-S399, 2014.
MAIA, J. G.S.; ZOGHBI, M. G.B.; SILVA, M. H.L.; ANDRADE, E.H.A. Essential oils of Eupatorium triplinerve and Eupatorium paniculatum. Journal Essential Oil Research, v. 11, p. 541-544, 1999.
MAITY, P.; CHOUDHURY, S.M.; BEPARI, Madhubanti. Antimitotic, apoptotic and antineoplastic potential of leaf extract of Eupatorium ayapana. International Journal of Phytomedicine, v. 7, n. 1, p. 69-77, 2015.
MANFRED, L. Siete mil recetas botánicas a base de mil trescientas plantas medicinales. Kier, 1977.
MANSOUR, A. et al. Anatomy of CNS opioid receptors. Trends in neurosciences, v. 11, n. 7, p. 308IN2310-309IN3314, 1988.
MAO, J.; PRICE, D.D.; MAYER, D.J. Mechanisms of hyperalgesian and morphine tolerance: a current view of their possible interactions. Pain, v. 62, n. 3, p. 259-274, 1995.
LEE, M. D. M. et al. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain physician, v. 14, p. 145-161, 2011.
MARTINDALE, J.; BLAND-WARD, P.A.; CHESSELL, I.P. Inhibition of C-fibre mediated sensory transmission in the rat following intraplantar formalin.Neuroscience letters, v. 316, n. 1, p. 33-36, 2001.
MELO, A.S. et al. Antinociceptive, neurobehavioral and antioxidant effects of Eupatorium triplinerve Vahl on rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 147, p. 293 – 301, 2013.
MEOTTI, F.C., et al. Antinociceptive properties of coumarins, steroid and dihydrostyryl-2-pyrones from Polygala sabulosa (Polygalaceae) in mice. Journal of Pharmacy anda Pharmacology, v. 58, p. 107–112, 2006.
MILLAN, M.J. Descending control of pain. Progress in neurobiology, v. 66, n. 6, p. 355-474, 2002.
MILLAN, M.J. The induction of pain: an integrative review. Progress in neurobiology, v. 57, n. 1, p. 1-164, 1999.
MOON, P.D. et al. Use of scopoletin to inhibit the production of inflammatory cytokines through inhibition of the IκB/NF-κB signal cascade in the human mast cell line HMC-1. European Journal of Pharmacology, v. 555, n. 2, p. 218-225, 2007.
MOREIRA, F. Plantas que curam - cuide de sua saúde através da natureza. 5 ed. Hemus, São Paulo, Brasil, 1985.
102
MORS, W.B.; RIZZINI, C.T.; PEREIRA, N.A. In: DEFILIPPS, N.A. (Eds.). Medicinal Plants of Brazil Algonac. Ethnobotany in the Neotropics, New York Botanical Garden, Bronx, New York, p. 140–149, 2000.
MURRAY, R.D.H. Coumarins. Natural Product Reports, v. 12, n. 5, p. 477-505, 1995.
NATARAJAN, R.K.; NATARAJAN, M. Phytochemical investigation of Eupatorium ayapana. Journal of Research Indian Medicine, Yoga and Homeopathy, v. 14, p. 155-156, 1979.
NATHAN, P.W.; RUDGE, P. Testing the gate-control theory of pain in man. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, v. 37, n. 12, p. 1366-1372, 1974.
NUNKOO, H.; MAHOMOODALLY, M. F. Ethnopharmacological survey of native remedies commonly used against infectious diseases in the tropical island of Mauritius. Journal of Ethnopharmacology, v. 143, n. 2, p. 548-564, 2012.
OECD – Organization of Economic Cooperation and development. In: The Revised Up-and-Down Procedure: A Test Method for Determining the Acute Oral Toxicity of Chemicals. NIH Publication. Nº 02-4501, p. I-4CD-ROM 1-2, 2008.
PARIMALA, K., CHERIYAN, B.V., VISWANATHAN., S. Antinociceptive and anti-inflammatory activity of petroleum-ether extract of Eupatorium triplinerve Vahl. International Journal of Life Science and Pharma Research, v.2, n. 3, p. 12-18, 2012.
PASTERNAK, G.W. Molecular biology of opioid analgesia. Journal of pain and symptom management, v. 29, n. 5, p. 2-9, 2005.
PASTOR, S. et al. Perú: Informe Nacional para la Conferencia Técnica Internacional de la FAO sobre los Recursos Fitogenéticos (Leipzig, 1996).Informe interno, 1995.
PILOTTO, A. et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use in the elderly. Surgical oncology, v. 19, n. 3, p. 167-172, 2010.
PIO CORREA, M. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Ministério da Cultura: Rio de Janeiro, 1984.
POURCHEZ, L. Acolher o recém-nascido nas sociedades crioulas do Oceano Índico. Pro-Posições, v. 24, n. 3, p. 45-64, 2016.
Kumar, P.U; Sreedhar, S.N.B; Shree, R.A.B Study on a New Thymohydroquinone Dimethylether Rich Eupatorium triplinerve Vahl from India. Proceeding of 26th Kerela Science Congress Pookode, Wayanad: 28-31 Jan. 2014.
PRATS, E. et al. Fungitoxic effect of scopolin and related coumarins on Sclerotinia sclerotiorum. A way to overcome sunflower head rot. Euphytica, v. 147, n. 3, p. 451-460, 2006.
103
RAHMAN, M.S.; JUNAID, M. Antimicrobial activity of leaf extracts of Eupatorium triplinerve Vehl. against some human pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi. Bangladesh Journal of Botany, v. 37, n. 1, p. 89-92, 2008.
RAJASEKARAN, A.; KALIVANI, M.; ARIHARASIVAKUMAR, G. Haemostatic Effect of fresh juice and methanolic extract of Eupatorium ayapana leaves in rat model. 2010. International Journal Biological Medicine Research, v. 1, n. 3, p. 85-87, 2010.
REICHERT, J. A. et al. Peripheral and preemptive opioid antinociception in a mouse visceral pain model. Pain, v. 89, n. 2, p. 221-227, 2001.
REISINE, T.; BELL, G.I. Molecular biology of opioid receptors. Trends in neurosciences, v. 16, n. 12, p. 506-510, 1993.
REN, K.; DUBNER, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nature medicine, v. 16, n. 11, p. 1267-1276, 2010.
RIBEIRO, R.A. et al. Involvement of resident macrophages and mast cells in the writhing nociceptive response induced by zymosan and acetic acid in mice. European journal of pharmacology, v. 387, n. 1, p. 111-118, 2000.
ROSE, H.S; GOLAN, D.E. Pharmacodynamics. In: GOLAN, D.E; TASHJIAN, A.R.; ARMSTRONG, E.J.; ARMSTRONG, A.W. (eds) Principles of Pharmacology: The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 3. ed., p. 372-400, 2011.
RUSSO, M.D.; CATHY, M.; BROSE, M.D.; WILLIAM, G. Chronic pain. Annual review of medicine, v. 49, n. 1, p. 123-133, 1998.
RZODKIEWICZ, P. et al. Antinociceptive properties of esculetin in non-‐inflammatory and inflammatory models of pain in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 42, n. 2, p. 213-219, 2015.
SAMOISY, A.K.; MAHOMOODALLY, M.F. Ethnopharmacological analysis of medicinal plants used against non-communicable diseases in Rodrigues Island, Indian Ocean. Journal of ethnopharmacology, v. 173, p. 20-38, 2015.
SANTOS, S.C.; MELLO, J.C.P. Taninos. In: SIMÕES, C.M.O. (Orgs.). Farmacognosia, da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre (RS): UFRGS, 2010. p. 615-656.
SELVAMANGAI, C.; BHASKAR, A. GC-MS analysis of phytocomponents in the methanolic extract of Eupatorium triplinerve. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. v. 2, n. 3, p. 1329-1332, 2012.
SEN, K.; BAGCHI, P. Studies on the ultraviolet absorption spectra of coumarins and chromones. ii. hydroxy derivatives. The Journal of Organic Chemistry, v. 24, n. 3, p. 316-319, 1959.
104
SHIBATA, M. et al. Modified formalin test: characteristic biphasic pain response. pain, v. 38, n. 3, p. 347-352, 1989.
SINGH, A. Phytomedicinal investigation for antimicrobials based on chemical and biological properties of herbal medicines: An overview. Novel Science International Journal of Pharmaceutical Science. v. 1, n. 7, p. 405-424, 2012.
SNYDER, S.H.; PASTERNAK, G.W. Historical review: opioid receptors. Trends in pharmacological sciences, v. 24, n. 4, p. 198-205, 2003.
SOSTRES, C. et al. Adverse effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs, aspirin and coxibs) on upper gastrointestinal tract. Best practice & research Clinical gastroenterology, v. 24, n. 2, p. 121-132, 2010.
SREEKEESOON, D.P.; MAHOMOODALLY, M.F. Ethnopharmacological analysis of medicinal plants and animals used in the treatment and management of pain in Mauritius. Journal of ethnopharmacology, v. 157, p. 181-200, 2014.
SUBASH, K. R. et al. The anthelmintic activity of Eupatorium triplinerve and Alpinia galanga in Pheritima posthuma and Ascardia galli: a comparative study. Journal of Clinical and Diagnostic Research, v. 6, n. 6, p. 947-950, 2012.
SUROOWAN, S.; MAHOMOODALLY, F. Complementary and alternative medicine use among Mauritian women. Complementary Therapies in Clinical Practice, p. 1-8, 2012.
TAL, B.; ROBESON, D.J. The induction, by fungal inoculation, of ayapin and scopoletin biosynthesis in Helianthus annuus. Phytochemistry, v. 25, n. 1, p. 77-79, 1985.
TRANG, N.T.D.; DUNG, N.X.; PHUONG, L.V.N.; WANNER, M.; KOOMEN, G.J. The 13C-NMR spectroscopy of ayapin isolated from Eupatorium ayapana Vent. from Vietnam, Tap Chi Ho´ a Hoc. Journal of Chemistry, v. 30, p. 62–63, 1992.
TRANG, N.T.D.; WANNER, M.J.; PHUONG, L.V.N.; KOOMEN, G.J., DUNG, N.X.. Thymoquinone from Eupatorium ayapana. Planta Medica. v. 59, p. 99, 1993.
UDDIN, S. B.; RATNA, R.S.; FARUQUE, M.O. Ethnobotanical study on medicinal plants of rakhaing indigenous community of Cox's Bazar District of Bangladesh. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 2, n. 4, 2013.
URDANGARIN, C. et al. Sunflower coumarin phytoalexins inhibit the growth of the virulent pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Phytopathology, v. 147, n. 7-‐8, p. 441-443, 1999.
VAN DEN BERG, M. A. Ver-o-peso: the ethnobotany of an Amazonian market. Advances in Economic Botany Ethnobotany in the Neotropics GT France and JA Kallunki (eds.), New York Botanical Garden Bronx, v. 1, p. 140-149, 1984.
105
VASCONCELOS, J.F. et al. Effects of umbelliferone in a murine model of allergic airway inflammation. European Journal of Pharmacology. v. 609, p. 126-131, 2009.
VÁSQUEZ, S.P.F.; MENDONÇA, M.S.; NODA, S.N. Etnobotânica de plantas medicinais em comunidades ribeirinhas do Município de Manacapuru, Amazonas, Brasil. Acta Amazonica, v. 44, n. 4, p. 457-472, 2014.
VENUGOPALA, K.N.; RASHMI, V.; ODHAV, B. Review on natural coumarin lead compounds for their pharmacological activity. BioMed Research International, v. 2013, p. 1-14, 2013.
VERA, N. et al. New coumarins from Pterocaulon polystachyum. Planta medica, v. 67, n. 7, p. 674-677, 2001.
VERA, N. et al. Toxicity and synergism in the feeding deterrence of some coumarins on Spodoptera Frugiperdasmith (Lepidoptera: Noctuidae).Chemistry & biodiversity, v. 3, n. 1, p. 21-26, 2006.
VIEIRA, L.S. Fitoterapia da Amazônia, manual de plantas medicinais, a farmácia de Deus. 2 ed. Agronômica Ceres, São Paulo, Brasil, 1992.
VONKEMAN, H.E.; VAN DE LAAR, M.. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs: adverse effects and their prevention. In: Seminars in arthritis and rheumatism. WB Saunders, 2010. p. 294-312.
WAGNER, H.; BLADT, S. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas. 2 ed. Springer, 2001.
WHEELER-ACETO, H.; PORRECA, F.; COWAN, A. The rat paw formalin test: comparison of noxious agents. Pain, v. 40, n. 2, p. 229-238, 1990.
WINTER, C. A; RISELY, E. A; NUSS, G. W. Carrageenan-induced edema in the hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drugs. Proceeding of the Society Experimental Biological, v. 111, p.544–547, 1962.
WOOLF, C.J. Central sensitization: implications for the diagnosis and treatment of pain. Pain, v. 152, n. 3, p. S2-S15, 2011.
WOOLF, C.J.; MA, Q. Nociceptors-noxious stimulus detectors. Neuron, v. 55, n. 3, p. 353-364, 2007.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. WHO Traditional Medicine Strategy 2002–2005. WHO, Geneva; 2002.
106
ANEXO
Parecer do comitê de ética da UFPA:
