Etiologia e Resistência Bacteriana em Unidades de … · a significant statistical association...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MAYARA MARIA BASTOS FRANCO Etiologia e Resistência Bacteriana em Unidades de Terapia Intensiva Através de Culturas de Vigilância. NATAL 2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MAYARA MARIA BASTOS FRANCO
Etiologia e Resistência Bacteriana em Unidades de Terapia
Intensiva Através de Culturas de Vigilância.
NATAL
2017
MAYARA MARIA BASTOS FRANCO
Etiologia e Resistência Bacteriana em Unidades de Terapia
Intensiva Através de Culturas de Vigilância.
NATAL
2017
Dissertação de mestrado do curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Biodiversidade.
Orientador: Professor Doutor Renato Motta Neto
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas – SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências-CB
Franco, Mayara Maria Bastos.
Etiologia e resistência bacteriana em unidades de terapia
intensiva através de culturas de vigilância / Mayara Maria Bastos Franco. - Natal, 2017.
98 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto.
1. Resistência antimicrobiana - Dissertação. 2. Cultura de
vigilância - Dissertação. 3. Unidades de terapia intensiva -
Dissertação. 4. Microbiota - Dissertação. 5. Carbapenêmicos -
Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 615.33
MAYARA MARIA BASTOS FRANCO
Etiologia e Resistência Bacteriana em Unidades de Terapia
Intensiva Através de Culturas de Vigilância.
Aprovada em 29/03/2017
Banca examinadora:
_____________________________
Professora Doutora Ana Isabela Lopes Sales
Departamento Escola da Saúde/Biomedicina- UnP
_____________________________
Professora Doutora Renata Antonaci Gama
Departamento de Microbiologia e Parasitologia- UFRN
_____________________________
Professor Doutor Renato Motta Neto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN
NATAL
2017
Dissertação de mestrado do curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Biodiversidade.
Orientador: Professor Doutor Renato Motta Neto
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu amigo e sustento, que me guiou com seu cuidado e sabedoria por este caminho. A meus pais, em especial minha mãe Fátima Bastos que com seus infinitos cuidados e esforços me proporcionou o apoio para que eu pudesse vencer cada etapa e ser quem sou hoje. A minha tia Sávia Maria que com sua amizade sincera e bom humor deixa os meus dias mais leves. A Fábio Eduardo, agradeço por seu carinho e amparo. Aos colegas e amigos do LABMIC, pelo companheirismo e ajuda mútua nos dias de trabalho. Ao meu orientador, professor Renato Motta que muito me ensinou nesta área da bacteriologia e incentivou meus potenciais. A toda a equipe de enfermagem e responsáveis pelas UTIs do Hospital Universitário Onofre Lopes e Hospital Giselda Trigueiro por abrir as portas com muita dedicação e solicitude para que pudéssemos desenvolver este trabalho.
RESUMO
A existência de patógenos com alto perfil de resistência, colonizando a pele e
mucosas de pacientes internados, elevam o risco da ocorrência de infecções graves.
Deste modo as culturas de vigilância são importantes a fim de se identificar estes
microrganismos e minimizar a sua propagação para outros indivíduos. Este estudo
utilizou culturas de vigilância para determinar o perfil de resistência presente em
bactérias isoladas de 114 pacientes internados em Unidades de Terapia Intensiva
(UTIs). Utilizou-se métodos de identificação fenotípica, de sensibilidade aos
antibióticos e testes fenotípicos de indicação de produção de β-lactamases. Das
amostras de Staphylococcus spp. isoladas, 89% (98/110) apresentaram resistência à
Oxacilina, 39% (52/133) das enterobactérias eram produtoras de β-lactamase de
Espectro Estendido, 57,5% (23/40) das Pseudomanoas aeruginosa eram produtoras
de β-lactamase AmpC e 80% (30/37) dos Acinetobacter spp. eram resistentes aos
carbapenêmicos. Dentre as variáveis clínicas estudadas, encontrou-se uma
associação estatisticamente significativa entre o uso de carbapenêmicos e a
colonização por bactérias resistentes aos antibacterianos mais frequentes utilizados
na rotina. Estes índices elevados refletem a tendência epidemiológica atual do
crescimento das bactérias com alto padrão de resistência, tornando-se essencial a
implementação de medidas de vigilância, isolamento e racionalização do uso de
antibióticos a fim de se minimizar a disseminação destes patógenos.
Palavras-chave: Resistência antimicrobiana; Cultura de Vigilância; Unidades de
Terapia Intensiva; Microbiota; Carbapenêmicos.
ABSTRACT
The existence of pathogens with high antimicrobial resistance, colonizing the skin and
mucous membranes of hospitalized patients, increases the risk of serious infections.
Thus surveillance cultures are important to identify these microorganisms and
minimize their propagation to other individuals. This research used surveillance
cultures to determine the resistance profile existent in bacteria colonizing 114 patients
admitted in Intensive Care Units (ICUs) for 7 or more days. For this purpose, manual
methods of phenotypic identification, antimicrobial susceptibility and phenotypic tests
for the indication of β-lactamase’ production were used. From the Staphylococcus spp.
isolated, 89% (98/110) were resistant to oxacillin, 39% (52/133) of Enterobacteriaceae
were producers of Extended Spectrum β-Lactamases, 57.5% (23/40) of Pseudomonas
aeruginosa were producers of AmpC β-Lactamase and 81% (30/37) of Acinetobacter
spp. were resistant to carbapenems. Among the studied clinical variables, it was found
a significant statistical association between the use of carbapenems and colonization
by bacteria resistant to these antibiotics. These high indexes reflect the current
epidemiological tendency of high resistant bacteria growth, making essential the
implementation of surveillance measures, isolation and rationalization of antibiotic use
to minimize the dissemination of these pathogens.
Keywords: Antibiotic resistance; Active Surveillance; Intensive Care Units; Microbiota;
Carbapenems;
LISTA DE SIGLAS AMC- Amoxicilina com Ácido Clavulânico ATB- Antibiótico ATCC- Coleção Americana de Culturas de Amostras Padrão, do inglês - American Type Culture Collection. ATM- Aztreonam AmpC- β-lactamase AmpC
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC- Coleção Americana de Culturas de Amostras Padrão, do inglês - American Type Culture Collection. BHI- Brain Heart Infusion Broth
BGN- Bacilos Gram-Negativos
BGN-NF- Bacilo Gram-Negativo Não Fermentador
CA-ORSA- Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina associado à
Comunidade CAZ- Ceftazidima CCIH- Comissões de Controle de Infecções Hospitalares CEP-UFRN- Comitê de Ética em Pesquisa de Humanos da Universidade Federal Do Rio Grande do Norte CESP- Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Morganella morganii. CFO- Cefoxitina CIM- Concentração Inibitória Mínima. CLI Clindamicina CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute CPM- Cefepime CRO Ceftriaxona CTX- Cefotaxima
CTX-M- Gene produtor de β-lactamase de Espectro Estendido DMP Departamento de Microbiologia e Parasitologia EDTA- Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Ácido Etilenodiamino Tetra-acético) ESBL- β-lactamase de Espectro Estendido HA-ORSA- Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina Hospitalar. ICU- Infecções na Corrente Sanguínea IMP- Imipenemase IPM Imipenem IRAS- Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde KPC- Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LABMIC Laboratório de Micobactérias LEV Levofloxacina MBL- Metalo-β-lactamase mec-A- Gene codificador da proteína PBP2a ou PBP2’ MRSA- Staphylococcus aureus Resistentes à Meticilina
NaCl- Cloreto de Sódio
NDM- New Delhi Metalo β-lactamase
ORS- Sthaphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina.
ORSA- Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina
ORSCN- Sthaphylococcus Coagulase Negativa resistentes à Oxacilina. PBP- Proteína Ligadora de Penicilina, do inglês - Protein Binding Penicillin PCR- Reação em cadeia da Polimerase, do inglês – Polimerase Chain Reaction. PIT Piperacilina com Tazobactam Rcarb- Resistente aos Carbapenêmicos SCC-mec- Cassete Cromossômico Estafilocócico mec, do inglês - Staphylococcal Cassette Chromosome
SCN- Staphylococcus coagulase-negativa
SHV- Gene produtor de β-lactamase de Espectro Estendido
SUT- Sulfametoxazol com Trimetropim THM- Teste de Hodge Modificado TEM- Gene produtor de β-lactamase de Espectro Estendido UFC- Unidade Formadora de Colônia UFRN- Universidade Federal do Rio Grande do Norte UTI- Unidade de Terapia Intensiva VIM Verona Imipenemase.
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Principais Classes de Antibióticos Utilizados na Prática Clínica..................18
Tabela 2: Resultado obtido de cada gênero e espécie referente aos grupos
bacterianos isolados nas amostras..............................................................46
Tabela 3: Quantidade de Bacilos Gram-Negativos Resistentes aos
Carbapenêmicos positivos ao Teste de Hodge Modificado e
ao Teste de Metalobetalacmase...................................................................54
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Anel β-lactâmico......................................………………………………..........19
Figura 2: Mecanismos de Resistência bacteriana adquirida........................................22
Figura 3: Testes fenotípicos empregados....................................................................36
Figura 4: Teste do OXA-25 de 2 cepas.........................................................................38
Figura 5: Determinação da CIM pelo uso de uma fita de E-teste.................................39
Figura 6: Bactéria com Teste de Indução positivo para a produção de AmpC.............41
Figura 7: Teste de Disco Aproximação para a identificação de
uma cepa produtora de ESBL.......................................................................42
Figura 8: Teste de Hodge Modificado (THM)................................................................43
Figura 9: Teste de Metalobetalactamase Positivo........................................................44
Figura 10: Perfil de Sensibilidade das Cepas de Staphylococcus
Coagulase-Negativa Resistentes à Oxacilina frente aos
antimicrobianos testados.............................................................................48
Figura 11: Perfil de Sensibilidade das cepas de Staphylococcus aureus
Resistentes à Oxacilina frente aos antimicrobianos testados.....................48
Figura 12: E-Teste de Mupirocina.................................................................................49
Figura 13: Perfil de Resistência das enterobactérias quanto à produção
de AmpC, ESBL e quanto à resistência aos Carbapenêmicos....................51
Figura 14: Teste de Indução para a detecção de bactérias
produtoras de AmpC...................................................................................51
Figura 15: Teste fenotípico de disco aproximação para a detecção
de β-lactamase de Espectro Extendido (ESBL)..........................................52
Figura 16: Quantidade de Pseudomonas aeruginosa produtora
de AmpC e Resistentes aos Carbapenêmicos em valores
absolutos e relativos...................................................................................53
Figura 17: Quantidade de Acinetobacter spp. resistentes aos
Carbapenêmicos e sensíveis em números
absolutos e relativos...................................................................................54
Figura 18: Tempo de internação dos pacientes............................................................55
Figura 19: Idade dos Pacientes....................................................................................56
Sumário
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 14
1.1 Gênero Staphylococcus .................................................................................. 14
1.2 Bacilos Gram-Negativos ................................................................................. 15
1.2.1 Família Enterobacteriaceae ......................................................................... 16
1.2.2. Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores ............................................ 16
1.3 Antibacterianos Úteis na Prática Médica ....................................................... 17
1.4 Resistência Bacteriana aos Antibióticos ....................................................... 21
1.5 Bactérias Resistentes de Maior Relevância Clínica. .................................... 23
1.5.1 Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina (ORS). ................................. 23
1.5.2 Bacilos Gram-negativos Produtores de β-lactamase AmpC ........................ 25
1.5.3 Enterobactérias produtoras de β-lactamases de Espectro Estendido ......... 26
1.5.4 Bacilos Gram-negativos Resistentes aos Carbapenêmicos ........................ 26
1.6 Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde ............................................ 28
1.7 Culturas de Vigilância...................................................................................... 29
1.7.1 Aspectos Gerais .......................................................................................... 29
1.7.2 Medidas de isolamento, precauções por contato e de descolonização ...... 31
1.7.3 Epidemiologia das culturas de vigilância no Brasil e no Rio Grande do Norte. .......................................................................... 32
2. OBJETIVOS ............................................................................................................ 34
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 34
2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 34
3. METODOLOGIA ..................................................................................................... 35
3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética ................................................................... 35
3.2 Coleta ................................................................................................................ 35
3.3 Isolamento Primário Bacteriano ..................................................................... 36
3.4. Identificação do Gênero Staphylococcus ..................................................... 37
3.4.1 Pesquisa de Staphylococcus spp. Resistentes a Oxacilina pelo Método do Disco Difusão. ................................................................... 37
3.4.2 Teste do Oxa-25 .......................................................................................... 38
3.4.3 Teste de sensibilidade dos ORS frente a outros antimicrobianos. ............... 38
3.5 Identificação de Bacilos Gram-Negativos...................................................... 40
3.5.1 Identificação de bactérias produtoras de β-lactamase AmpC pelo Teste de Indução. ................................................................................ 40
3.5.2 Identificação de Enterobactérias produtoras de ESBL pelo Teste de Disco Aproximação ............................................................... 41
3.5.3 Pesquisa de Bacilos Gram-negativos Resistentes aos Carbapenêmicos ... 42
3.6 Análises Estatísticas ....................................................................................... 44
4. RESULTADOS ........................................................................................................ 46
4.1 Etiologia dos Espécimes totais isolados ....................................................... 46
4.2. Identificação do gênero Staphylococcus ..................................................... 47
4.2.1 Pesquisa de Staphylococcus spp. Resistentes a Oxacilina pelo Método do Disco Difusão. ................................................................... 47
4.2.2 Teste do OXA-25. ....................................................................................... 47
4.2.3. Teste de sensibilidade dos ORS frente a outros antimicrobianos. .............. 47
4.3 Identificação de Bacilos Gram-Negativos...................................................... 50
4.3.1 Pesquisa de Enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, produtoras de ESBL e de β-lactamase AmpC. ........................................... 50
.4.3.2 Pesquisa de Bacilos Gram-negativos Não-Fermentadores AmpC e Resistentes aos Carbapenêmicos ........................................................... 53
4.4 Análises Estatísticas ....................................................................................... 54
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 57
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 65
7. PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................... 66
8. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 67
10. ANEXOS ............................................................................................................... 78
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 Gênero Staphylococcus
O gênero Staphylococcus inclui bactérias que possuem forma esférica e podem
apresentar-se aos pares, tétrades ou agrupadas em formato de cachos de uva. Assim
como os gêneros Enterococcus e Streptococcus, os Staphylococcus spp. são
pertencentes ao grupo dos cocos Gram-positivos, os quais adquirem tonalidade
púrpura ao serem submetidos ao teste da coloração Gram (ferramenta utilizada na
diferenciação laboratorial das 2 classes bacterianas: Gram-negativas e Gram-
positivas) (CHRISTOF, 2010).
Espécies do gênero Staphylococcus fazem parte da microbiota humana e
também estão envolvidos em uma grande variedade de infecções de caráter
oportunista. De acordo com Sasaki et al (2011), o termo “oportunista” refere-se às
bactérias que normalmente não trazem risco à saúde humana, mas podem causar
infecção em pacientes com estado imunológico comprometido (SASAKI et al, 2011).
Segundo o conceito clínico contemporâneo, o qual utiliza uma classificação
simples e útil baseada em aspectos médicos, este gênero é dividido em:
Staphylococcus Coagulase positiva, quase que exclusivamente representado pela
espécie Staphylococcus aureus, e em Staphylococcus Coagulase Negativa (SCN)
(FERNANDES; CARVALHO; JUNIOR, 2014).
A espécie S. aureus está presente em cerca de 15% a 30% dos indivíduos,
colonizando-os em regiões úmidas e tendo como seu principal habitat as narinas
anteriores (BARROSO; MELIÇO-SILVESTRE; TAVEIRA, 2014). Entretanto, ela tem
sido causa de séria preocupação para os clínicos há mais de um século, devido a sua
proeminência como um importante patógeno oportunista relacionado à saúde
(CHATTERJEE; OTTO, 2013).
Dentre estes principais agravos causados por cepas desta espécie estão as
infecções superficiais e profundas de pele e tecidos moles, bacteremia, endocardite,
osteomielite, pneumonia, intoxicação alimentar, síndrome de choque tóxico e
síndrome de pele escaldada estafilocócica (OSTOJIC; HUKIC, 2015).
Já o grupo dos SCN representa uma parte significativa da microbiota humana,
colonizando normalmente a pele e membranas mucosas, sendo particularmente
prevalentes nas axilas, regiões iguinal e perineal, narinas anteriores e glândulas
sebáceas (BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014).
15
No que se refere às espécies associadas a humanos pertencentes a este
grupo, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus são as mais
prevalentes, seguidas por Staphylococcus capitis, Staphylococcus hominis,
Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus lugdunensis e
Staphylococcus saprophyticus as quais são menos frequentemente encontradas.
(BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014).
Em relação aos agravos clínicos ocasionados por representantes deste grupo,
as infecções na corrente sanguínea associadas aos cuidados hospitalares são as
mais importantes. Isto ocorre, porque o crescente uso, dos dispositivos médicos
invasivos ao longo das décadas e o maior número de pacientes imunodeprimidos
hospitalizados, levou os SCN a serem um dos principais agentes etiológicos
responsáveis por estas infecções (RIGATTI et al, 2010).
Os riscos de bacteremia por estas bactérias são significativos, pois, como elas
já fazem parte regularmente da microbiota da pele dos indivíduos, o uso constante
dos dispositivos médicos invasivos, como cateteres intravenosos, criam uma porta de
entrada, facilitando a passagem destes microrganismos da pele para a corrente
sanguínea dos pacientes (SIEVERT et al, 2013).
Desta forma, bactérias do gênero Staphylococcus são de grande importância
médica devido ao extenso número de acometimentos que elas podem causar, e
também devido a sua alta prevalência em infecções adquiridas no hospital (KAISER et
al, 2010).
1.2 Bacilos Gram-Negativos
Outro grupo que, além dos Staphylococcus spp., estão também envolvidos nos
agravos à saúde humana são os bacilos Gram-negativos (BGN), os quais
apresentam-se em formato bacilar e adquirem uma tonalidade avermelhada ao serem
submetidos à Coloração Gram. Os principais BGN de importância clínica englobam as
enterobactérias, que pertencem à Família Enterobacteriaceae, e os bacilos gram-
negativos não fermentadores (CARNEIRO, 2015).
16
1.2.1 Família Enterobacteriaceae
A família Enterobacteriaceae é composta por BGN anaeróbios facultativos,
fermentadores de glicose, não formadores de esporos, oxidase negativa e capazes de
reduzir nitrato a nitrito. A maioria das espécies possuem flagelos, favorecendo sua
movimentação, são microrganismos ubíquos e constituintes da microbiota intestinal
normal da maioria dos animais, incluindo seres humanos, sendo também conhecidos
por enterobactérias (DONNENBERG, 2010)
Esta família é representada por vários gêneros e espécies como Escherichia
coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Citrobacter spp., Salmonella
spp., Shigella spp., entre outros, os quais são responsáveis por causar uma série de
infecções quando as defesas do indivíduo estão comprometidas. Dentre estes
principais acometimentos causados nos seres humanos estão as gastroenterites, e
infecções extraintestinais como: infecções no trato urinário e septicemia (KONEMAN,
2008).
1.2.2. Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores
Os bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGN-NFs) são microrganismos
aeróbios, não esporulados e possuem a característica de serem incapazes de utilizar
carboidratos através da fermentação. Este grupo inclui organismos como
Pseudomonas spp., Acinetobacter.spp., Alkaligenes.spp., Stenotrophomonas
maltophilia e Burkholderia cepacia. Dentre estes, as espécies Pseudomonas
aeruginosa e Acinetobacter spp são os patógenos mais comumente isolados de
humanos (BHATNAGAR et al, 2014)
Estes organismos possuem ampla distribuição ambiental e uma boa
capacidade de se manterem viáveis em diversos ambientes, sobrevivendo por longos
períodos em superfícies e possuindo necessidades nutricionais mínimas com grande
tolerância às variações ambientais.(CARDOSO; REIS, 2016).
Atualmente eles são classificados como importantes patógenos associados aos
cuidados com a saúde, podendo ser isolados de vários tipos de instrumentos do
ambiente hospitalar tais como ventiladores mecânicos, umidificadores, colchões e
outros equipamentos (SAMANTA et al, 2011)
Os BGN-NFs são causadores de algumas infecções tais como septicemia,
infecções de sítio cirúrgico, infecções do trato respiratório e do trato urinário.
17
Entretanto, eles são mais frequentemente envolvidos nas infecções do trato
respiratório em casos adquiridos nas Unidades de Tratamento Intensivos (UTIs),
principalmente, devido à sua capacidade de se manter viável em variados tipos de
ambientes, particularmente na água e em seus sistemas de distribuição (SILVA et al,
2016).
1.3 Antibacterianos Úteis na Prática Médica
Devido aos diversos tipos de infecções bacterianas que os indivíduos são
expostos, como as que foram abordadas anteriormente, surgiu a necessidade do uso
de medicamentos que detivessem suas ações deletérias contra o organismo humano
(GUIMARÃES et al, 2010).
Estes medicamentos, os antibióticos, são definidos como compostos naturais
ou sintéticos capazes de inibir o crescimento ou causar a morte de bactérias, que
foram utilizados desde o século passado como uma forma significativa de combate às
infecções bacterianas. Podem ser classificados como bactericidas, quando causam a
morte da bactéria, ou bacteriostáticos, quando promovem a inibição do crescimento
microbiano (GUIMARÃES et al, 2010).
O grande marco no tratamento das infecções bacterianas ocorreu com a
descoberta da penicilina, em 1928, pelo cientista Alexander Flemming, ao descobrir
que fungos do gênero Penicillium produziam uma substância que causavam a lise de
bactérias circunvizinhas (WORTHINGTON; MELANDER, 2013).
Entretanto, apenas na década de 40, a penicilina G (forma que o antibiótico foi
descrito) foi introduzida definitivamente como agente terapêutico. Deste então, após o
processo de industrialização da penicilina, especialmente em consequência da
Segunda Guerra Mundial, foi observado um rápido crescimento na descoberta e
desenvolvimento de novos fármacos (WORTHINGTON; MELANDER, 2013).
As principais classes de agentes antibacterianos utilizados na prática clínica
são os β-lactâmicos, aminoglicosídeos. tetraciclinas, fenicóis, quinolonas,
fluoroquinolonas, macrolídeos, lincosamidas, glicopeptídeos, oxazolidinonas e as
polimixinas (GUIMARÃES et al, 2010), os quais estão abordados na Tabela 1.
A tabela abaixo retrata de forma resumida as principais características por meio
da exposição de seus respectivos mecanismos de ação, bem como de alguns
representantes de cada grupo.
18
Tabela 1: Principais Classes de Antibióticos Utilizados na Prática Clínica.
Classe de Antibióticos Mecanismo de Ação Alguns Representantes
β-lactâmicos (WORTHINGTON; MELANDER, 2013)
Inibição da síntese da parede celular (ligação às PBPs)
Penicilinas (Amoxicilina; Penicilina) Cefalosporinas (Cefalotina;
Ceftazidima) Monobactâmicos (Aztreonam) Carbapenêmicos (Imipenem;
Meropenem)
Aminoglicosídeos (GOODMAN, 2010)
Interrupção da síntese proteica (ligação à subunidade 30S ribossomal)
Amicacina Estreptomicina
Gentamicina
Tetraciclinas (GOODMAN, 2010)
Interrupção da síntese proteica (ligação à subunidade 30S ribossomal)
Tetraciclina
Fenicóis (MATINEZ, 2014)
Interrupção da síntese proteica (ligação à subunidade 50S ribossomal)
Cloranfenicol
Quinolonas e Fluoroquinolonas
(MONTEIRO, 2011)
Inibição da replicação do DNA (ligação às topoisomerases II e IV)
Ácido nalidíxico Ciprofloxacina Levofloxacina
Macrolídeos (CUNHA, 2012)
Inibição da síntese proteica(ligação à subunidade 50S)
Eritromicina Azitromicina
Lincosamidas (PEREIRA, 2014)
Inibição da síntese proteica (ligação à subunidade 50S)
Clindamicina
Glicopetídeos
(MANFREDINI; PICOLI; BECHER, 2011)
Inibição da síntese da parede celular (ligação ao resíduo dipeptídico terminal D-Ala-D-Ala do peptideoglicano)
Vancomicina Teicoplamina
Oxazolidinonas (VASCONCELLOS, 2015)
Inibição da síntese proteica(ligação à subunidade 50S
Linezolida
Polimixinas (PINTO, 2011)
Desestabilização da membrana celular
Polimixina B Colistina (polimixina E)
19
Dentre estes fármacos abordados na Tabela 1, os β-lactâmicos representam a
classe mais variada e amplamente utilizada na prática médica, a qual será abordada
mais detalhadamente nos parágrafos subsequentes.
Os β-lactâmicos atuam inibindo a síntese da parede celular bacteriana em sua
etapa de finalização. Estes compostos ligam-se às proteínas ligadoras de penicilina
(PBPs), impedindo que elas atuem na síntese da camada de peptideoglicano,
composto que proporciona a estrutura rígida da parede celular destes
microrganismos. Deste modo, estes fármacos possuem excelente perfil de segurança
para o organismo humano, uma vez que atuam especificamente nas PBPs, presentes
apenas em bactérias (WORTHINGTON; MELANDER, 2013).
Todos os fármacos desta classe possuem em comum em sua estrutura um anel
β-lactâmico (Figura 1) e o que diferencia os grupos entre si são as estruturas ligadas
diretamente a este núcleo comum (FERNANDES, 2014).
Figura 1: Anel β-lactâmico. Fonte: Fernandes, 2014
Esta classe inclui os grupos das penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos,
carbapenêmicos e inibidores de betalactamases (CUNHA, 2012), os quais possuem
usualmente amplo espectro de atividade antibacteriana, gerando uma eficácia clínica
frente a uma vasta gama de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (MATOS,
2015).
As penicilinas constituem o primeiro grupo de antibióticos a serem
desenvolvidos e continuam a ser atualmente um dos grupos mais importantes na
terapêutica, sendo a peniclina G e a penicilina V, os fármacos precursores deste
grupo. No entanto, outras penicilinas com melhores características farmacológicas
foram criadas posteriormente, como a meticilina, a nafcilina, as aminopenicilinas, as
ureidopenicilinas e as carboxipenicilinas, sendo chamadas de penicilinas
20
semissintéticas. Em relação ao seu espectro de ação, esta classe é bastante ativa
contra vários cocos Gram-positivos e bacilos Gram-negativos (AZEVEDO, 2014).
As cefalosporinas são agentes antimicrobianos semissintéticos derivados do
fungo Cephalosporium acremonium. Dependendo de suas características estruturais e
do espectro de ação que possuem, comumente estes compostos são agrupados em 5
gerações. As cefalosporinas de 1ª geração, como a cefalexina, cefazolina e cefalotina,
são efetivas contra algumas espécies dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus e
sua atividade contra os bacilos Gram-negativos é limitada às linhagens de E. coli,
Klebsiella spp. e Proteus mirabilis. As cefalosporinas de 2ª geração apresentam
atividade contra os bacilos Gram-negativos ligeiramente aumentada comparada às de
1ª geração. Alguns representantes delas são a cefuroxima e o cefotentan (DIAS,
2015).
A 3ª geração inclui cefalosporinas de amplo espectro, pois apesar de serem
menos ativas do que as de primeira geração contra os cocos Gram-positivos, exibem
atividade muito maior contra as enterobactérias. Os fármacos representantes incluem
a ceftriaxona, a ceftazidima e a cefotaxima (AZEVEDO, 2014). A 4ª geração, tendo
como único representante o cefepime, tem um espectro de ação sobre as bactérias
Gram-negativas mais alargado que os restantes dos compostos anteriores, atuando
ainda sobre P. aeruginosa e algumas Enterobactereaceae que são geralmente
resistentes às cefalosporinas de 3ª geração (CASTANHEIRA, 2013). E, por último, as
cefalosporinas de 5ª geração tem um espetro de atividade semelhante ao cefepime
contra P. aeruginosa, sendo efetiva também contra o S. aureus resistente à oxacilina e
à maioria das enterobactérias, sendo a ceftarolina um de seus representantes
(LOPES, 2012).
Os monobactâmicos são representados pelo aztreonam, único fármaco
comercializado. Este antibiótico é usado como uma alternativa aos aminoglicosídeos
para o tratamento de infecções por E. coli, Klebsiella spp. e P. aeruginosa (DIAS,
2015).
Por último, os carbapenêmicos são os que têm maior espectro de ação contra
as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, representando os medicamentos de
última escolha da classe dos β-lactâmicos para o combate às infecções causadas por
bactérias resistentes. Os seus representantes são os fármacos ertapenem, imipenem,
meropenem e doripenem (AZEVEDO, 2014).
21
1.4 Resistência Bacteriana aos Antibióticos
A descoberta dos antibióticos abordados anteriormente constituiu um progresso
inquestionável da medicina do século XX. No entanto, a eficácia dos mesmos foi, em
alguns casos, rapidamente superada pelo surgimento da resistência bacteriana aos
diversos antibióticos, tão logo eles sejam introduzidos e usados constantemente na
prática clínica (MAÇÃO et al, 2013).
Em 1944, pouco tempo após o começo da aplicação da penicilina em uso
clínico, já foi registrado o primeiro relato de resistência a este fármaco em cepas de
S.aureus, devido à produção de uma enzima degradadora desta substância chamada
penicilinase (WORTHINGTON; MELANDER, 2013). Desde então, a resistência
bacteriana foi aumentando, ao longo das décadas, conforme a introdução e uso
clínico dos novos antibióticos, até ser atualmente considerada como um dos
problemas de saúde pública mais relevantes em torno do mundo (LOUREIRO et al,
2016).
Esta resistência é caracterizada por mecanismos mediante os quais as
bactérias diminuem a ação dos agentes antimicrobianos, podendo ser de forma
natural ou adquirida. A resistência natural (também conhecida por intrínseca) é uma
característica própria dos microrganismos, pertencendo naturalmente ao seu material
genético. Ela acontece quando todas as bactérias da mesma espécie já nascem
resistentes a antibióticos de mesma família (KOHL; PONTAROLO; PEDRASSANI,
2016).
Por outro lado, a resistência adquirida se dá através de mutações ou da
aquisição de material genético extracromossômico procedente de outra bactéria. Os
mecanismos da resistência bacteriana adquirida se dão de 4 formas: alteração da
permeabilidade, bombas de efluxo, alteração no sítio de ação e mecanismo
enzimático, conforme abordados na Figura 2 (BAPTISTA, 2013).
A alteração de permeabilidade da membrana plasmática diz respeito à
diminuição do número, tamanho ou seletividade das porinas, que são canais
hidrofílicos responsáveis pela passagem de substâncias para o interior da célula
bacteriana. Deste modo, assim como alguns fármacos utilizam este meio para a
penetração na bactéria, a diminuição ou perda da função destas porinas ocasionam a
resistência ao antibiótico, pois eles não conseguem penetrar satisfatoriamente no
interior da célula bacteriana. Um exemplo deste mecanismo é a resistência às
tetraciclinas pelas bactérias Gram-negativas (BAPTISTA, 2013).
22
As bombas de efluxo são proteínas que atuam no transporte ativo de
substâncias do meio intracelular para o extracelular. Em relação aos antibióticos, este
mecanismo pode levar à diminuição de suas concentrações no interior da célula
bacteriana, gerando a resistência. Estas proteínas podem atuar efluxo de todas as
classes de antimicrobianos, como, por exemplo, no efluxo das tetraciclinas,
fluoroquinolonas e macrolídeos (KUMAR; VARELA, 2012).
Por outro lado, a alteração do sítio alvo diz respeito à alteração no local de
ligação do antibiótico à bactéria, impedindo que ele se ligue e então exerça seu efeito.
A origem desta resistência se dá pela aquisição de genes ou por mutação genética. A
obtenção do gene mecA pelas cepas de Staphylococcus spp., gerando uma PBP
modificada, é um exemplo deste mecanismo, o qual leva a resistência aos β-
lactâmicos (CASTANHEIRA, 2013).
E, por último, o mecanismo enzimático é caracterizado pela produção de
enzimas que degradam os antibióticos, levando a resistência bacteriana a
determinados fármacos. A produção de β-lactamases e de enzimas específicas
responsáveis pela degradação de aminoglicosídeos, cloranfenicol e fosfomicina são
exemplos dessa resistência ocasionada pelo mecanismo enzimático (CASTANHEIRA,
2013).
Figura 2: Mecanismos de Resistência bacteriana adquirida. Fonte:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3/mec_a
nimacao.htm. Acessado em 14/03/2017.
23
1.5 Bactérias Resistentes de Maior Relevância Clínica.
Nos últimos anos tem-se assistido a um aumento preocupante de infeções por
bactérias com alto perfil de resistência, o que representa um problema muito
importante em escala mundial, pelo consequente aumento das taxas de morbidade e
mortalidade e pelos custos que as infeções por estes patógenos acarretam (MIYAKIS;
PEFANIS; TSAKRIS, 2011). Do ponto de vista clínico, as bactérias resistentes mais
relevantes na prática médica são os Sthaphylococcus spp. resistentes à oxacilina
(ORS), enterobactérias produtoras de β-lactamase de espectro extendido (ESBL),
bacilos Gram-negativos produtores de β-lactamase AmpC e os bacilos Gram-
negativos resistentes aos carbapenêmicos (Rcarb), os quais serão abordados nos
tópicos subsequentes (MAÇÃO et al, 2013).
De acordo com a terminologia internacional padronizada que descreve o perfil
de resistência das bactérias, são identificadas como bactérias “multirresistentes”
aquelas que são resistentes a fármacos de 3 ou mais classes de antibióticos. Deste
modo, alguns pesquisadores classificam estas bactérias anteriormente citadas como
“multirresistentes”, porém não se pôde usar esta classificação neste trabalho, pois não
testamos uma quantidade suficiente de antibióticos para cada cepa a fim de as
classificarmos com este termo (por exemplo, para as cepas de Acinetobacter spp., só
testamos a classe dos carbapenêmicos). Desta forma, utilizar-se-á as expressões
“bactérias resistentes de maior importância médica” ou “de maior relevância clínica” a
fim de se referir a estes patógenos abordados a seguir (Magiorakos et al, 2012).
1.5.1 Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina (ORS).
Após o rápido desenvolvimento da resistência à penicilina por S.aureus, foi
introduzida a Meticilina, derivado semissintético da Penicilina, na prática clínica em
1959. Entretanto, logo após 2 anos a primeira cepa S. aureus resistentes a este
fármaco foi isolada de um hospital do Reino Unido em 1961, também conhecida por
Staphylococcus aureus resistente à Oxacilina (ORSA). Após isso, o ORSA tornou-se
endêmico em torno do mundo e já em 1980 emergiu como o principal patógeno
nosocomial (FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Embora tradicionalmente este patógeno tenha surgido no ambiente hospitalar,
a partir da década de 90 ocorreu uma mudança na população alvo dos ORSAs, pois
indivíduos saudáveis na comunidade começaram a desenvolver infecções por estes
24
patógenos. O aparecimento destes casos, culminou no estabelecimento de uma
classificação, como ORSA associado aos cuidados à sáude ou de origem hospitalar
(HA-ORSA) e ORSA associado à comunidade (CA-ORSA) (MEJÍA; ZURITA;
GUZMÁN-BLANCO, 2010).
A resistência à Oxacilina pelas cepas de Staphylococcus spp. ocorre pela
alteração das PBP’s da parede celular, impedindo a ligação com os β-lactâmicos,
conferindo resistência a todos os antibióticos desta classe. O principal gene que
confere a resistência à oxacilina no gênero Staphylococcus é o mecA, inserido no
cromossomo, em um elemento genético móvel, chamado Cassete Estafilocóccico
Cromossômico (SCCmec) (PATERSON; HARRISON; HOLMES, 2014).
A frequência destas bactérias resistentes atingem valores elevados ao redor do
mundo. Nos anos de 2006-2007, cepas de ORSA chegaram a ser responsáveis por
59,5% das infecções em Unidades de Terapia Intensiva de vários hospitais dos EUA e
em vários hospitais brasileiros, o isolamento de ORSA varia de 30 a 80 %
(CARVALHO, 2016).
Outro dado preocupante diz respeito aos Staphylococcus coagulase-negativa
resistentes à Oxacilina (ORSCN) que vêm crescendo vigorosamente ao longo dos
anos em todo o mundo no ambiente hospitalar desde a década de 80. Um exemplo
disto, foi encontrado em um estudo na Suíça, no qual ao longo de 20 anos , houve um
aumento das porcentagens de 11% a 55% dos isolados de SCN resistentes à
oxacilina (GUGGENHEIM et al, 2009). Já no Brasil, uma pesquisa de Rigatti et al,
(2010) detectou um índice de 95% de ORSCN isolados de amostras hospitalares.
A resistência à Oxacilina pelas cepas de SCN é um grave problema hospitalar,
gerando elevados riscos para os pacientes. Isto acontece porque, além destas
bactérias serem um dos principais patógenos causadores de infecções sanguíneas,
por comporem normalmente a microbiota da pele, ao adquirir essa resistência à
oxacilina, tornam-se bactérias altamente resistentes a um elevado número de
antibióticos e passíveis de causar bacteremia grave (BECKER; HEILMANN; PETERS,
2014).
Como fármacos de escolha para o tratamento de infecções por ORSA ou
ORSCN, podem ser usadas a vancomicina, a daptomicina e a linezolida, sendo esta
última mais vantajosa quando usada, apresentando melhor resposta clínica, menos
tempo de internação hospitalar e menor custo total quando comparada com a
vancomicina (VASCONCELLOS et al., 2015). A linezolida, pertencente à classe das
25
oxazolidinonas, é utilizada principalmente no tratamento de infecções de pele e partes
moles pelos estafilococos resistentes à oxacilina (LOPES, 2014).
1.5.2 Bacilos Gram-negativos Produtores de β-lactamase AmpC
As β-lactamases são enzimas que degradam alguns ou todos os β-lactâmicos,
as quais tem como alvo a estrutura que todos os fármacos desta classe compartilham,
o anel β-lactâmico. As β-lactamases do tipo AmpC hidrolisam especificamente
penicilinas, cefamicinas (como cefoxitina), monobactâmicos e cefalosporinas até
terceira geração (JACOBY, 2009).
O gene que codifica estas β-lactamases podem ser tanto de origem
cromossômica como plasmidial. Cromossomicamente, é encontrada em Enterobacter
spp., Providencia spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, e Serratia
marcescens. Por outro lado, o gene de AmpC plasmídial pode ser encontrado em K.
pneumoniae, E. coli, Salmonella spp. and Shigella spp. (KAUR et al., 2016).
As bactérias que possuem o gene de origem cromossômica, produzem a
enzima a níveis basais, conferindo resistência primordialmente às cefoxitina e
cefalosporinas de 1ª e 2ª geração. Entretanto, em alguns destes organismos, pode
ocorrer hiperprodução da enzima quando são expostos a algum agente indutor como
cefoxitina, imipenem e ácido clavulânico. Deste modo, o indutor promove
modificações na regulação da enzima, conferindo resistência também às
cefalosporinas de 3ªgeração (ANDRADE, 2008).
Entretanto, estas enzimas não produzem uma significativa atividade hidrolítica
contra cefalosporinas de 4ª geração, como cefepime, e contra os carbapenêmicos,
além de não serem inibidas por inibidores de β-lactamases (JACOBY, 2009).
A exata prevalência deste mecanismo, principalmente a mediada por
plasmídeo, ainda não é estritamente estabelecida, devido à ausência de um método
universal, simples e que possua sensibilidade e especificidade ideal (KHARI et al.,
2016). Porém, apesar de ainda não haver padronização e recomendação pelo Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI) para a detecção de β-lactamases do tipo
AmpC por métodos fenotípicos, a triagem pode ser realizada pelo teste de indução
que se dá através da detecção do achatamento no halo da cefalosporina provocado
pela ação de algum agente indutor (ANDRADE, 2008).
26
1.5.3 Enterobactérias produtoras de β-lactamases de Espectro Estendido
As Enterobactérias produtoras de β-lactamases de Espectro Estendido
(ESBL) oferecem resistência às penicilinas, cefalosporinas de 3ª e 4ª geração, e
monobactâmicos (incluindo, o aztreonam), mas não fornecem resistência à
cefamicinas (cefoxitina e cefotetan) e aos carbapenêmicos (imipenem, meropenem e
ertapenem). No entanto, eles são inibidos pelos inibidores de β-lactamases, tais como
o ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (SILVA; SILVA; OLIVEIRA, 2014).
A presença de ESBL é descrita em diversos patógenos de origem hospitalar e
comunitária, como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Citrobacter spp.,
Enterobacter spp., Proteus mirabilis e Serratia marcescensi, sendo mais comum nas
duas primeiras espécies (FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Há várias famílias de ESBL, tendo surgido primordialmente com as variedades
clássicas TEM e SHV. Contudo, uma nova família, a CTX-M, surgiu nos últimos anos,
principalmente em E.coli e se tornou o tipo mais largamente distribuído, excedendo a
incidência de SHV e TEM (NOGUEIRA, 2011).
A significativa proporção de isolados de Klebsiella spp produtoras de ESBL,
resultam em falha terapêutica e em surtos destas cepas resistentes no ambiente
hospitalar. Desse modo, diferentes clones de Klebsiella spp. ESBL têm sido relatados
na literatura, especialmente em unidades de tratamento intensivo (UTIs), assim como
cepas de Escherichia coli extraintestinal. Logo, altas taxas de mortalidade são
associadas a infecções por K. pneumoniae produtora de ESBL, tendo como evento
favorável a colonização para o estabelecimento da infecção (DA SILVA; LINCOPAN
2012).
Os carbapenêmicos são considerados os fármacos de escolha para o
tratamento de pacientes com infecção por microrganismos que produzem este tipo de
β-lactamase. Eles são uma boa alternativa, pois não são hidrolisáveis pelas ESBLs,
são bastante ativos in vitro e possuem altos níveis de sucesso nos tratamentos
reportados na literatura (NOGUEIRA, 2011; CARRILHO, 2014).
1.5.4 Bacilos Gram-negativos Resistentes aos Carbapenêmicos
Os carbapenêmicos eram os medicamentos mais eficazes no combate à
bactérias Gram-negativas resistentes, porém seu uso no controle destas infecções
tem sido ameaçado pelo surgimento de cepas resistentes a estes fármacos. Isto se
27
deu tanto pela necessidade de sua constante utilização como fármaco de escolha
para o tratamento de infecções com bactérias ESBL, como também pelo seu uso
inadequado nas prescrições médicas (KATEETE et al., 2016).
Os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos pelas cepas de bacilos
Gram-negativos podem se dar pelas quatro formas de resistência adquirida
abordadas no item 1.4: perda de porinas, hiperexpressão de bombas de efluxo,
alteração da molécula alvo (as PBPs) e pela produção de enzimas que degradam esta
classe de antibiótico, as carbapenemases. Entretanto este último mecanismo citado é
o mais frequente apresentado pelas bactérias Rcarb (DIAS, 2015; DANTAS, 2015).
Estas carbapenemases são enzimas β-lactâmicas que possuem a capacidade
de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos, tendo sido descritas pela
primeira vez na década de 90. Deste modo, estas enzimas são um importante
problema emergente, pois as bactérias produtoras de carbapenemases são
resistentes à maioria dos agentes antimicrobianos confiáveis, restando limitadas
opções terapêuticas (FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Estas enzimas estão divididas em 3 classes. A classe A e D, referem-se às
serino carbapenemases, porque elas têm o aminoácido serina em seu sítio ativo,
enquanto que a classe B, das metalo-β-lactamases (MBLs), utilizam algum metal,
principalmente o Zinco, como cofator em sua atividade catalítica (KATEETE et al.,
2016).
A classe A possui várias famílias, porém a mais prevalente é a das KPCs
(Klebsiella pneumoniae Carbapenemases). As KPCs são de origem plasmidial e
hidrolisam todos os β-lactâmicos usados, mas são fracamente inibidas por inibidor de
β-lactamases, como o tazobactam. Elas foram encontradas primeiramente em K.
pneumoniae, na Carolina do Norte, Estados Unidos, em 1996. Entretanto, as KPCs já
foram descobertas em outros representantes da família Enterobacteriaceae como
Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Enterobacter spp., Salmonella spp., Proteus
mirabilis, Citrobacter freundii, Serratia spp. Além de que sua presença também já foi
relatada em espécies de não fermentadores, mostrando sua disseminação nas
espécies e gêneros bacterianos (RIOS; ALMEIDA, 2015).
A classe B das metalo-β-lactamases possuem genes com origem
cromossômica ou plasmidial e as famílias mais comuns, tendo maior destaque
mundial, são IMP (Imipenemase), VIM (Verona imipenemase) e NDM (New Delhi
Metalo-β-lactamase). A primeira MBL identificada foi encontrada em P. aeruginosa e,
desde então, elas tornaram a ser detectadas também em espécies de Acinetobacter
28
spp. e em Enterobactérias, através da disseminação genética. As enterobactérias
produtoras de NDM são atualmente uma importante preocupação devido à sua rápida
disseminação em todo o mundo (MANENZHE et al, 2015).
As MBLs utilizam o Zinco como cofator enzimático e têm a capacidade de
hidrolisar todos os β-lactâmicos com exceção dos monobactâmicos. Uma
característica importante é que elas podem ser inibidas por ácido etileno-diamino-
tetrácetico (EDTA), o qual é bastante utilizado em testes fenotípicos de triagem para a
detecção deste mecanismo. Entretanto não são inibidas pelo ácido clavulânico ou
tazobactam (RIOS; ALMEIDA, 2015).
Por último, a classe D refere-se às OXA carbapenemases, as quais possuem
origem plasmidial e têm sido descritas principalmente em Acinetobacter spp., mas
também podem ser encontradas em enterobactérias. Estas enzimas não são inibidas
por ácido clavulânico ou EDTA (QUEENAN; BUSH, 2007).
Deste modo, a presença destes patógenos resistentes abordados
anteriormente torna-se um grave problema de saúde, pois eles estão bastante
presentes circulando no ambiente hospitalar, podendo assim ocasionar infecções
nosocomiais severas como as Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
(O’BRIEN; STELLING, 2011).
1.6 Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são caracterizadas
por toda infecção que seja adquirida no ambiente hospitalar e que se manifeste no
paciente após sua admissão ou mesmo após sua alta hospitalar, sendo
correlacionada diretamente com a internação e com os procedimentos hospitalares
(CLIMO et al, 2013). Em relação às origens etiológicas das IRAS, sabe-se que 70%
dos patógenos envolvidos nelas são de origem endógena, ou seja, são
microrganismos provenientes da própria microbiota do indivíduo, como os SCN ou as
enterobactérias (MENDES at al, 2016). No Brasil, estima-se que aproximadamente 5
a 15% dos pacientes hospitalizados e 25 a 35% dos pacientes admitidos em UTI
adquiriram algum tipo de infecção relacionada à assistência a saúde, sendo ela, a
quarta causa de mortalidade (OLIVEIRA et al, 2012)
As Infecções na Corrente Sanguínea (ICU), ou bacteremias, estão dentre as
complicações mais graves associadas aos cuidados médicos hospitalares
29
(BRUSSELAERS et al, 2013). Nas últimas décadas, tem sido observado um aumento
na incidência destas infecções devido à frequente utilização de procedimentos
médicos invasivos, como dispositivos intravasculares e à presença de ventilação
mecânica. Estas práticas são consideradas como fatores de risco para o
desenvolvimento das ICUs, pois estes procedimentos invasivos atuam como porta de
entrada dos patógenos do meio externo para a corrente sanguínea (DANTAS, 2015).
Do ponto de vista epidemiológico, os cocos Gram-positivos, especialmente os
SCN, são os mais frequentemente isolados nas bacteremias. Entretanto, em alguns
casos, essa regra não pode ser expandida para países em desenvolvimento, como o
Brasil, pois as condições econômicas e ambientais favorecem a emergência dos
bacilos Gram-negativos (DANTAS, 2015). Enterococcus spp., Staphylococcus
aureus., Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. são as bactérias que têm um
grande envolvimento neste tipo de infecção (RAMPELOTTO et al, 2015).
As ICUs são geralmente correlacionadas a altos índices de morbidade e
mortalidade, devido às baixas opções terapêuticas em função da emergência e
disseminação das bactérias com alto nível de resistência aos agentes
antimicrobianos, as quais atuam como agentes etiológicos destas infecções com
bastante frequência (BRUSSELAERS et al, 2013).
Deste modo, os orgãos governamentais nacionais e internacionais juntamente
com as Comissões de Controle de Infecções Hospitalares (CCIHs) têm utilizado as
culturas de vigilância, como técnicas de rastreamento epidemiológico das principais
bactérias resistentes a fim de se diminuir os índices de morbidade e mortalidade
relacionados com as Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde.
1.7 Culturas de Vigilância
1.7.1 Aspectos Gerais
As culturas de vigilância são definidas como técnicas laboratoriais que
permitem o isolamento e identificação de bactérias resistentes de maior relevância
clínica obtidas a partir de pacientes colonizados. Esta identificação é importante,
porque os indivíduos que estejam colonizados por estas bactérias estão sofrendo
graves riscos de desenvolverem infecções de difícil tratamento, caso sejam infectados
30
por elas, ou de servirem como transmissores silenciosos destes patógenos para
outros pacientes (CATANEO et al, 2011).
A metodologia na aplicação destas culturas de vigilância é feita a partir da
coleta de swabs nasais, retais e axilares da mucosa e pele dos pacientes, seguida de
identificação do gênero ou espécie bacteriana e posteriores testes de susceptibilidade
aos antibióticos a fim de se detectar as bactérias resistentes de maior importância
médica abordadas no item 1.5. que possam estar colonizando o paciente (O’BRIEN;
STELLING, 2011).
Dentre os ambientes hospitalares que abrigam situações de maior risco ou
impacto das infecções e cujos métodos de vigilância são empregados
frequentemente destacam-se os berçários, ambientes de cuidados a pacientes
imunodeprimidos, unidades de diálise e as Unidades de Terapia Intensiva. Estes
locais são considerados de maior risco, pois os pacientes internados nesses
ambientes são geralmente mais debilitados, com diminuição da imunidade e com uso
frequente de dispositivos médicos invasivos, atuando como portas de entrada aos
microorganismos e deixando-os mais vulneráveis à infecção (O’BRIEN; STELLING,
2011 ).
Além disso, destes ambientes citados, a UTI é considerada o epicentro da
resistência bacteriana, sendo a principal fonte de surtos de bactérias com alto perfil de
resistência principalmente devido ao uso ostensivo de antimicrobianos. Isto acontece
porque o uso constante destes fármacos leva à seleção de cepas naturalmente
resistentes, aumentando o percentual de colonização dos pacientes por estes
patógenos (FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Por sua vez, a presença destes patógenos resistentes colonizando
naturalmente a mucosa e pele dos pacientes, associada às práticas comuns do
ambiente de UTI, como o uso rotineiro de técnicas invasivas e de catéteres
intravaculares, aumentam o risco de bacteremias por estes microrganismos altamente
resistentes, gerando infecções graves neste ambiente (GOMES et al, 2014).
A alta densidade de pacientes e a susceptibilidade da população internada em
Unidades de Terapia Intensiva, geralmente portadora de doenças graves, assim
como também uma longa permanência em serviços de saúde, maior longevidade da
população, associada a um quadro clínico mais grave aumentam ainda mais o risco
da ocorrência destas infecções mais severas (CORREIA,2013).
Deste modo, as culturas de vigilância possibilitam a obtenção das taxas de
colonização dos patógenos resistentes nos pacientes internados netas unidades
31
hospitalares, atuando de forma significativa no controle das IRAS, pois permite: a
detecção das tendências epidemiológicas locais das bactérias resistentes de maior
relevância; a identificação de surtos antes de sua propagação; a determinação das
áreas e situações de maior risco e a verificação da eficácia de possíveis intervenções
empregadas (CATANEO et al, 2011).
1.7.2 Medidas de isolamento, precauções por contato e de descolonização
Após a detecção dos pacientes colonizados com bactérias resistentes
(especialmente ORSA e bactérias resistentes aos carbapenêmicos), medidas de
isolamento, precauções por contato e de descolonização são tomadas pela equipe de
enfermagem a fim de se conter a propagação e diminuir (ou eliminar) a colonização
nos indivíduos que tiveram cultura de vigilância positiva para estes patógenos
(ALVAREZ; LABARCA; SALLES, 2010).
As medidas de isolamento mais comuns adotadas consistem em manter o
paciente em quarto privativo ou em quarto com outro paciente que apresente
colonização pelo mesmo microrganismo. Já as precauções por contato consistem no
uso de luvas estéreis, avental e higienização das mãos com álcool a 70% antes e
após o contato com o indivíduo hospitalizado, além de reservar equipamentos
médicos de uso individual para uso exclusivo do paciente (como estetoscópio,
esfignomanômetro, termômetro, entre outros). Deste modo, estas medidas atuam na
prevenção da disseminação dos patógenos resistentes para outros pacientes não
colonizados (LACEN-SC,2016).
E, concomitantemente a estas medidas, é feito também o processo de
descolonização do paciente pelo uso tópico de mupirocina nasal à 2% e pelo uso da
solução degermante gluconato de clorexidina (2-4%) em banho por todo o corpo do
indivíduo. O primeiro fármaco citado é útil na eliminação de ORSA que esteja
colonizando as narinas anteriores e a clorexidina é usada para a descolonização tanto
de bactérias resistentes Gram-positivas, como Gram-negativas que estejam
presentes na superfície corporal. Este processo é aplicado no paciente diariamente
durante 5 dias e apresenta bons resultados no processo de descolonização (LEE et
al, 2016).
Por fim, as culturas de vigilância seguidas por corretas medidas de isolamento
e descolonização do paciente colonizado por patógenos resistentes atua de forma
significativa no controle da colonização e da disseminação destes microrganismos,
32
diminuindo os índices de agravamento no quadro clínico nas Infecções Relacionadas
à Assistência à Saúde (CATANEO et al, 2011).
1.7.3 Epidemiologia das culturas de vigilância no Brasil e no Rio Grande do Norte.
No contexto epidemiológico brasileiro atual, os sítios nasal e retal são
considerados os de maior importância para a pesquisa de patógenos resistentes
(como ORSA, enterobactérias produtoras de ESBL e BGN resistentes aos
carbapenêmicos) mais praticados nas culturas de vigilância por todo o país
(SARMENTO, 2015).
De acordo com alguns estudos recentes brasileiros, índices de 24 a 37% das
culturas de vigilância coletadas na admissão de pacientes que são internados em
UTIs são positivas para a presença destas bactérias resistentes anteriormente
citadas. Destas bactérias, as mais isoladas são Acinetobacter spp. e P. aeruginosa
resistentes aos carbapenêmicos, seguidos por Klebsiella pneumoniae ESBL e por
Staphylococcus aureus resistentes a oxacilina (CAMPOS; PEREIRA; LIMA,2012;
DAMACENO , 2014; SARMENTO, 2015).
As enterobactérias produtoras de ESBL e os BGN resistentes aos
carbapenêmicos constituem o principal problema da resistência bacteriana no Brasil,
porém não há dados sistemáticos sobre sua total prevalência e colonização no país
como um todo, assim como também não há para os Staphylococcus spp. resistentes
à oxacilina (DAMACENO, 2014). Isto prova a urgente necessidade de se fazer
estudos epidemiológicos a nível nacional que possam gerar dados que reflitam a atual
realidade de todo o país. O que se tem sobre a epidemiologia das culturas de
vigilância no Brasil são apenas estudos esporádicos sobre a prevalência de bactérias
resistentes em determinadas localidades, o que será exposto nos parágrafos
subsequentes .
Em relação à prevalência de bactérias produtoras de ESBL, um estudo de
culturas de vigilância feito recentemente em pacientes de UTI do Rio de Janeiro,
detectou uma prevalência de quase 70% dos isolados de K. pneumoniae produtoras
de β-lactamases de espectro estendido obtidos do swab retal (FLORES et al, 2016).
Estima-se ainda que a prevalência no Brasil de ESBL em cepas desta espécie,
bactéria mais envolvida com a produção desta resistência, é de aproximadamente
50% ( PERNA et al, 2015).
33
No que concerne à pesquisa de bacilos Gram-negativos resistentes aos
carbapenêmicos obtidos por cultura de vigilância, um estudo feito em São Paulo
identificou índices de colonização de 40 e 45% de pacientes colonizados por K.
pneumoniae e Acinetobacter spp. resistentes a estes fármacos, respectivamente
(FREIRE et al, 2017)
Por fim, dados epidemiológicos brasileiros de prevalência de Staphylococcus
spp. resistentes à oxacilina obtidos de swab nasal a partir de pacientes hospitalizados,
demonstraram índices de 86% de ORSA, em relação às amostras de S. aureus
isoladas e uma porcentagem de 89% de SCN resistentes à oxacilina, de todos os
SCN isolados. Contabilizando um total de 56% de pacientes colonizados por ORSA,
e de 29% de pacientes colonizados por SCN resistentes à oxacilina (SANTOS et al,
2015).
No que faz referência ao contexto epidemiológico das culturas de vigilância a
nível estadual, também ainda não há uma análise sistemática dos índices de
colonização e prevalência de bactérias resistentes isoladas de pacientes hospitalares.
Entretanto, torna-se necessário traçar a frequência destes patógenos nos ambientes
de UTI de hospitais estaduais, a fim de estabelecer posteriormente melhores ações de
controle das Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde no Estado (SERAFIM,
2013).
Deste modo, este trabalho visa suprir a carência de dados nesta área, sendo o
primeiro estudo sobre cultura de vigilância a ser realizado no Estado do Rio Grande
do Norte.
34
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
- Avaliar a frequência das bactérias resistentes de maior importância no contexto
hospitalar isoladas de pacientes internados em Unidades de Terapia Intensiva,
realizando sua identificação etiológica, bem como a avaliação de seu perfil de
resistência.
2.2 Objetivos Específicos - Determinar a frequência de Staphylococcus spp. Resistentes à Oxacilina (ORS) por
métodos fenotípicos.
- Determinar o perfil de susceptibilidade dos Staphylococcus spp. resistentes à
oxacilina frente a vários antimicrobianos
- Determinar a frequência de enterobactérias produtoras de β-lactamases de espectro
extendido (ESBL), bacilos Gram-negativos produtores de β-lactamase Amp C e
bacilos Gram-negativos resistentes aos carbapenêmicos (Rcarb).
- Avaliar a positividade das bactérias resistentes aos carbapenêmicos frente ao Teste
de Hodge Modificado e ao Teste de Metalobetalactamase.
- Correlacionar a colonização por bactérias resistentes aos carbapenêmicos e
Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina com as características clínicas dos
pacientes.
35
3. METODOLOGIA
3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de
Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN), através da
emissão do parecer consubstanciado de número 1.136.107, emitido em 02/07/2015.
3.2 Coleta
As coletas foram realizadas em 114 pacientes internados nas UTIs do Hospital
Universitário Onofre Lopes e do Hospital Giselda Trigueiro, as quais foram realizadas
em pacientes de todas as idades e apresentando qualquer tipo de diagnóstico, tendo
como único critério de inclusão do paciente no estudo o tempo de internação a partir
de 7 dias. De cada paciente foram coletados swab nasal, axilar e retal. A coleta de
swab nasal foi feita, introduzindo-se o swab, embebido em solução fisiológica estéril,
pelo menos 1 cm nas narinas, fazendo-se movimentos rotacionais na região da
mucosa. A coleta de swab axilar foi feita, passando-se o swab umedecido com
solução fisiológica estéril na região axilar através de movimentos rotatórios. E a coleta
de swab retal foi feita introduzindo-se o swab embebido em solução fisiológica estéril,
por volta de 1cm no reto, fazendo-se movimentos rotatórios na região da mucosa
(RIMLAND; ROBERSON, 1986).
As coletas foram realizadas em um período de Julho de 2015 a Julho de 2016.
De cada paciente, foram colhidas as respectivas informações clínicas do prontuário:
Idade, tempo de internação, diagnóstico e qual o tipo de antibiótico o paciente fazia
uso no momento.
Antes da coleta das amostras, um familiar ou responsável pelo paciente
assinava o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, autorizando o procedimento.
A figura 3, na página seguinte, mostra um esquema de todos os testes
fenotípicos, abordados nos itens subsequentes, empregados para as bactérias
isoladas a partir da coleta das amostras de swabs nasal, retal e axilar.
36
Figura 3: Testes fenotípicos empregados. *Rcarb: Resistentes aos Carbapenêmicos.
3.3 Isolamento Primário Bacteriano
Após a coleta, os swabs foram encaminhados em meios de transporte Stuart
(HIMEDIA) ao Laboratório de Micobatérias do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da UFRN (LABMIC/ DMP-UFRN) onde foram processados. Os swabs
coletados foram semeados no meio BHI caldo (Brain Heart Infusion Broth-HIMEDIA)
e incubados em estufa bacteriológica a 35-37ºC, por cerca de 1-2h a fim de se obter
um crescimento bacteriano significativo para o sucesso do isolamento. Após este
Swabs nasal, retal e axilar
Staphylococcus spp.
Pesquisa de ORS pelo
método de Disco Difusão
Teste do Oxa- 25
Perfil de sensibilidade dos
ORS frente a outros antimicrobianos
(Penicilina, Coranfenicol,
Gentamicina,etc...)
E-teste de Mupirocina
Bacilos Gram-Negativos
(BGN)
Teste de Indução para a pesquisa
de AmpC
Teste de Disco Aproximação
para a Pesquisa de ESBL
Pesquisa de BGN Resistentes aos
Carbapenêmicos
Teste de Hodge
Teste de MBL
Isolamento Bacteriano e Identificação Etiológica lógicalógicaeeEtiológica
P. aeruginosa e Enterobactérias Enterobactérias Todos os BGN
Cepas de ORSCN resistentes ao disco de Mupirocina
Enterobactérias
Rcarb*
Todos os BGN
Rcarb
37
tempo, as amostras foram semeadas em Ágar Sangue (BHI ágar suplementado com
5% de sangue desfibrinado de carneiro-HIMEDIA), em Ágar Mac Conkey (HIMEDIA),
para o isolamento de bacilos Gram-negativos, e em Ágar Manitol (HIMEDIA), para o
isolamente de Staphylococcus spp.
3.4. Identificação do Gênero Staphylococcus
As colônias bacterianas que cresceram no Ágar Manitol e que apresentaram
características morfotintoriais de cocos Gram-positivos, prova da catalase positiva e
resistência ao disco de Bacitracina 0,04μg foram confirmadas como sendo do gênero
Staphylococcus. E a fim de diferenciar estes microrganismos entre S. aureus e SCN,
foi realizada a prova da coagulase em tubo: as bactérias que foram positivas a esta
prova foram classificadas como S. aureus, enquanto as que foram negativas a esta
prova foram classificadas como SCN (JACOBS, C.; ALVES, 2014).
3.4.1 Pesquisa de Staphylococcus spp. Resistentes a Oxacilina pelo Método do
Disco Difusão.
Para cada Staphyloccus spp. isolado e identificado, foi feito o teste de
sensibilidade ao disco de cefoxitina 30μg (fámarco usado como marcador da
resistência à oxacilina). Primeiramente, foi feito o semeio por distensão das amostras
bacterianas em Ágar Muller Hinton de acordo com o seguinte procedimento: Colônias
de aspectos similares de cada amostra bacteriana foram diluídas em solução salina,
ajustadas para o padrão 0,5 da escala de Mac Farland que corresponde à
aproximadamente 1,5 x 108 Unidades Formadora de Colônia por mililitros (UFC/mL) e
então semeadas por distensão por meio de um swab estéril sobre uma placa de Ágar
Muller-Hinton. Após isso, o disco de cefoxitna foi colocado sobre a superfície da placa
e, então, incubada a 24h na estufa a 35-37ºC, a fim de se identificar a resistência à
oxacilina. Após este período, foi realizada a medição do diâmetro da zona de inibição
do crescimento ao redor do disco do disco de antibiótico, com o auxílio de uma régua.
As amostras foram classificadas como sensíveis, intermediárias ou resistentes ao
antibiótico testado, de acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo Clinical and
Laboratory Standards Instituts 2016 (CLSI, 2016).
38
3.4.2 Teste do Oxa-25
Todas as amostras classificadas como resistentes à oxacilina pelo método do
disco difusão foram submetidas a este teste. Foram inoculadas 2 ou 3 colônias de
cada cepa de Staphylococcus spp. resistente à oxacilina em caldo BHI, sendo
incubadas a 35-37ºC, por 24h. Uma porção de 100μl deste caldo foi plaqueado em
Ágar Muller Hinton com uma concentração de 25 mg/L de Oxacilina e Cloreto de
Sódio (NaCl) a 4%. A positividade a este teste foi confirmada pelo crescimento da
cepa na superfíficie do ágar após a incubação por 24-48h à 35-37ºC, em estufa
bacteriológica, conforme descrito na Figura 4 (Adaptado de RESENDE;
FIGUEIREDO, 1997).
Figura 4: Teste do OXA-25 de 2 cepas. Cepa 02 é negativa ao teste, não apresentando crescimento
sobre a placa. Cepa 03 é positiva, apresentando crescimento sobre a placa. Fonte: Arquivo pessoal,
LABMIC.
3.4.3 Teste de sensibilidade dos ORS frente a outros antimicrobianos.
3.4.3.1 Teste de Disco Difusão Para cada Staphylococcus spp. resistentes à oxacilna, foi feito o teste de
sensibilidade para 10 discos de antibióticos adicionais: Penicilina 10μg, cloranfenicol
30μg, gentamicina 10μg, ciprofloxacina 05μg, sulfametoxazol-trimetropim 25μg (SUT),
linezolida 30μg, teicoplamina30μg, mupirocina 05μg, eritromicina 15μg e clindamicina
2μg. Cada amostra bacteriana foi semeada por distensão com o auxílio de um swab
em placas de Ágar Muller Hinton, conforme a metodologia exposta no item 3.4.1. Após
feito isso, os discos de cada antibiótico citado foram colocados sobre a superfície da
placa Ágar Muller Hinton . Estas placas foram incubadas em estufa bacteriológica a
35-37ºC por 16-18h, para S.aureus e por 24h, para SCN, conforme recomendado no
Clinical and Laboratory Standards Instituts 2016 (CLSI 2016). Após este período, foi
39
realizada a medição do diâmetro da zona de inibição do crescimento ao redor de cada
disco de antibióticos, com o auxílio de uma régua. As amostras foram classificadas
como sensíveis, intermediárias ou resistentes aos antimicrobianos testados, de
acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI, 2016.
3.4.3.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) por E-teste.
As cepas resistentes ao disco de mupirocina foram submetidas à determinação
da Concentração Inibitória Mínima (CIM) deste fármaco pelo método do E-teste
(Biomerieux, Lyon, França). O procedimento do teste foi feito através do semeio das
amostras bacterianas por distensão em placas de Ágar Muller Hinton, com o auxílio
de um swab, conforme a metodologia exposta no item 3.4.1. Após feito isso, foi
depositada no centro da placa, com o auxílio de uma pinça estéril, uma fita de E-teste
para mupirocina. As placas foram incubadas por 18 h, a 35-37°C em estufa
bacteriológica. Após este tempo foi feita a leitura do teste a qual é feita da seguinte
maneira: a determinação do CIM é visualizada exatamente no ponto de intersecção
entre a fita de E-teste e a área de crescimento bacteriano, como demonstrado na
Figura 5.
As cepas que apresentassem CIM ≥ 512 μg/ml foram classificadas como
resistentes a altos níveis de mupirocina. Aquelas que obtivessem um CIM entre 8 e
256 μg/ml foram classificadas como resistentes a níveis intermediários de mupirocina
e as cepas que obtivessem um CIM <4 μg/ml foram interpretadas como sensíveis
(RAJKUMAEI et al, 2014).
Figura 5: Determinação da CIM pelo uso de uma fita de E-teste. A seta vermelha está indicando o
ponto de intersecção entre a fita de E-teste e a área de crescimento bacteriano, correspondente a uma
Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 0,25 μg/ml. *MIC (do inglês “Minimal Inhibitory
Concentration”). Fonte: Biomérieux, Brasil: http://www.biomerieux.com.br/node/1037. Acessado em
15/03/17
40
3.5 Identificação de Bacilos Gram-Negativos.
As colônias bacterianas que cresceram no Ágar Mac Conckey e que
apresentaram características morfotintoriais de bacilos Gram-negativos, foram
submetidas às seguintes provas bioquímicas a fim de se determinar as espécies de
enterobactérias e bactérias não-fermentadoras, conforme recomendado por
KONEMAN et al (2008): produção de pigmento (fermentação da lactose em Ágar Mac
Conckey), atividade de citocromo-oxidase (identificação de bactérias não-
fermentadoras), fermentação da lactose e glicose, produção de sulfeto, vermelho de
metila, prova do indol, utilização do citrato, prova da descarboxilação dos aminoácidos
arginina, ornitina e lisina, produção de urease, produção de fenilalanina desaminase e
prova da motilidade (KONEMAN et al., 2008).
3.5.1 Identificação de bactérias produtoras de β-lactamase AmpC pelo Teste de
Indução.
O procedimento deste teste foi feito através do semeio das amostras
bacterianas por distensão em placas de Ágar Muller Hinton, com o auxílio de um
swab, conforme a metodologia exposta no item 3.4.1. Após feito isso, discos de
cefoxitina e de imipenem foram colocados sobre a superfície do Àgar Muller Hinton
lado a lado a uma distância de 20mm do disco de cefalosporina de 3ª geração
(ceftazidima). Logo após, as placas foram incubadas por 18h à 35-37ºC em estufa
bacteriológica. Considerou-se positiva ao teste a cepa que apresentasse um
achatamento do halo da ceftazidima para a cefoxitina e/ou um achatamento do halo
da ceftazidima para o imipenem, conforme exemplificado na Figura 6. Ambos
(cefoxitina e imipenem) agem como indutores à bactéria produzir a enzima AmpC,
provocando o achatamento do halo da Cefalosporina de 3ª geração (Gupta; TAK;
MATHUR, 2014).
Este teste fenotípico não foi feito para as cepas de Acinetobacter spp., porque
ele é apenas indicado para as cepas de enterobactérias e de Pseudomonas
aeruginosa.
41
Figura 6: Bactéria com Teste de Indução positivo para a produção de AmpC. IPM: Imipenem. CAZ:
Ceftazidima. CX: Cefoxitina. Setas: Achatamento do halo da ceftazidima para a direção do imipenem,
indicando um teste positivo. Fonte: GUPTA; TAK; MATHUR, 2014.
3.5.2 Identificação de Enterobactérias produtoras de ESBL pelo Teste de Disco
Aproximação
O procedimento deste teste foi feito através do semeio das amostras
bacterianas por distensão em placas de Ágar Muller Hinton, com o auxílio de um
swab, conforme a metodologia exposta no item 3.4.1. Após feto isso, foram
adicionados na superfície das placas de Àgar Muller Hinton discos de amoxicilina com
ácido clavulânico (AMC) no centro à distância de 20mm dos discos de aztreonam
(ATM), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (CTX) e cefepime (CPM). Após a incubação da
placa por 18-24h a 35-37ºC, foi feito a interpretação do teste. As amostras foram
consideradas positivas quando visualizava-se o aumento da zona de inibição, pela
presença do “halo ghost” entre pelo menos um dos discos periféricos para o disco do
centro de AMC, conforme visualizado na Figura 7 (RIVA; BRUST; PICOLI, 2008).
20 mm
20 mm
42
Figura 7: Teste de Disco Aproximação para a identificação de uma cepa produtora de ESBL. Setas:
Zona de alargamento do halo de inibição (zona “ghost”), formada entre os discos da extremidade da
cruz e o disco de centro, indicando positividade ao teste. ATM: Aztreonam, AMC: Amoxicilina com Ácido
Clavulânico, CPM: Cefepime, CAZ: Ceftazidima, CTX: Cefotaxima. Fonte: Arquivo Pessoal, LABMIC.
3.5.3 Pesquisa de Bacilos Gram-negativos Resistentes aos Carbapenêmicos
Para a triagem dos bacilos gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas
aeruginosa e Acinetobacter spp) resistentes aos carbapenêmicos e das
enterobactérias do grupo CESP resistentes aos carbapenêmicos (Citrobacter spp,
Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., e Morganella morgani), foram
utilizados os discos de Imipenem e Meropenem. Para a triagem de outras
enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, foram utilizados os discos de
Ertapenem e Imipenem (ANVISA,2013). O procedimento deste teste foi feito através
do semeio das amostras bacterianas por distensão em placas de Ágar Muller Hinton,
com o auxílio de um swab, conforme a metodologia exposta no item 3.4.1. Após feito
isso, os discos foram colocados sobre a superfície das placas de Àgar Muller Hinton
e, então, as placas foram incubadas por 18h à 35-37ºC em estufa bacteriológica.
Após este período, foi realizada a medição do diâmetro da zona de inibição do
crescimento ao redor de cada disco de antibióticos, com o auxílio de uma régua. As
amostras foram classificadas como sensíveis, intermediárias ou resistentes aos
antimicrobianos testados, de acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI,
2016.
ATM
CTX
CAZ
CPM AMC
43
3.5.3.1 Teste de Hodge modificado (THM)
As enterobactérias que foram classificados como resistentes aos
carbapenêmicos, de acordo com o item anterior, foram submetidas ao THM. A
metodologia foi feita através do semeio de uma amostra de Escherichia coli ATCC
25922 por distensão em placas de Ágar Muller Hinton, com o auxílio de um swab,
conforme o procedimento exposto no item 3.4.1. Após feito isso, colocou-se um disco
meropenem sobre a superfície do Ágar no centro da placa, e, em seguida, fez-se
estrias ( com o auxílio de uma alça bacteriológica) partindo do disco no centro, até a
borda da placa com uma cepa controle positivo (Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-
1705) e com as amostras teste. Incubou-se por 16-20h em estufa bacteriológica a 35-
37ºC. O Teste de Hodge foi considerado positivo quando houve um alargamento da
área de crescimento bacteriano no ponto de inserção da estria com o limite externo do
halo de inibição do disco do centro, gerando uma reentrância neste local, conforme
abordado na Figura 8 (CLSI 2015).
Este teste fenotípico não foi feito para as bactérias não fermentadoras, pois ele
é apenas recomendado para as cepas de enterobactérias.
Figura 8: Teste de Hodge Modificado (THM). Estrias 76 e “KPC”: Cepa positiva ao teste e cepa controle
positivo, respectivamente (Setas vermelhas: Indicam que há um alargamento da área de crescimento
bacteriano no ponto da inserção destas estrias com o limite externo do halo de inibição, formando uma
reentrância e caracterizando o teste como positivo para estas amostras). Estria 92: Cepa negativa ao
teste (Setas brancas: note-se que nesta cepa não há a formação da reentrância no local da inserção
esta estria com o limite externo do halo de inibição). Fonte: Arquivo Pessoal, LABMIC.
3.5.3.2 Teste de Metalobetalactamase (MBL)
Todos os bacilos Gram-negativos que foram classificados como resistentes aos
carbapenêmicos, foram também submetidos ao Teste de Metalobetalactamase. A
metodologia foi feita através do semeio das amostras bacterianas por distensão em
44
placas de Ágar Muller Hinton, com o auxílio de um swab, conforme o procedimento
exposto no item 3.4.1. A seguir foram adicionados sobre a superfície do ágar discos
de imipenem com e sem a adição de 10ul de EDTA e as placas foram incubadas por
16-20h em estufa bacteriológica a 35-37ºC. Foram consideradas cepas positivas ao
teste e, portanto, possíveis produtoras de MBL, as amostras que apresentaram
aumento maior ou igual a 5 mm do diâmetro do halo do imipenem com a adição do
EDTA, em comparação com o disco do antibiótico que não teve a adição deste ácido
(KATEETE et al., 2016). Esta forma de interpretação está abordada na Figura 9.
Figura 9: Teste de Metalobetalactamase Positivo. Note-se o aumento do diâmetro do halo de inibição
ao redor do disco de imipenem com a adição do ácido etileno-diamino-tetrácetico (EDTA), em
comparação com o halo do disco sem a adição deste ácido, caracterizando um teste positivo. Fonte:
Arquivo pessoal, LABMIC.
3.6 Análises Estatísticas
Foi utilizado o modelo de Regressão Logística a fim de se verificar quais das
variáveis clínicas independentes (antibioticoterapia, tempo de internação, idade e
diagnóstico) influenciavam na colonização por ORS e/ou por bactérias RCarb nos
pacientes deste estudo.
Para analisar a influência da antibioticoterapia na colonização por bactérias
resistentes, os pacientes foram divididos em 2 grupos nas análises estatísticas:
pacientes que faziam uso de carbapenêmicos em sua antibioticoterapia e pacientes
+ IPM
IPM
45
que não faziam uso de carbapenêmicos. Deste modo, pôde-se verificar se o uso desta
classe de antibióticos pelos pacientes em sua antibioticoterapia influenciava ou não na
colonização por ORS e/ou bactérias Rcarb.
Resultados com P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Todas as análises foram feitas no programa estatístico Software R.
46
4. RESULTADOS
4.1 Etiologia dos Espécimes totais isolados
De 114 pacientes, foram isolados um total de 320 bactérias, das quais, 110
eram do gênero Staphylococcus spp. e 210 eram Bacilos Gram-negativos.
Na tabela 2, pode-se visualizar todos os gêneros e espécies isoladas referentes
a cada grupo bacteriano abordado neste estudo.
Tabela 2: Resultado obtido de cada gênero e espécie referente aos grupos bacterianos isolados nas
amostras.
Grupo Bacteriano Número de Bactérias Isoladas Porcentagem
Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus 9 2,80%
Staphylococcus Coagulase-Negativa 101 31,50%
SUBTOTAL 110 34,30%
Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores Pseudomonas aeruginosa 40 12,50%
Acinetobacter spp. 37 11,50%
SUBTOTAL 77 24,00%
Enterobacteriaceae
Escherichia coli 44 13,75% Escherichia fergusonii 1 0,31% Klebisiella pneumoniae 41 12,80% Klebisiella oxytoca 2 0,62%
Klebsiella ozanae 1 0,31% Enterobacter aerogenes 9 2,80% Enterobacter clocae 6 1,87% Enterobacter gergivae 2 0,62% Enterobacter sakazakii 9 2,80%
Enterobater agglomerans 2 0,62% Proteus vulgaris 2 0,62% Proteus mirabilis 3 0,93% Citrobacter freundii 8 2,70% Citrobacter koseri 1 0,31% Morganella morganii 2 0,62%
SUBTOTAL 133 42%
TOTAL 320 100%
47
4.2. Identificação do gênero Staphylococcus
Houve um total de 110 cepas bacterianas do gênero Staphylococcus isoladas
das amostras dos pacientes, sendo que, destas, 101 eram Staphylococcus
Coagulase-Negativa (SCN) e 9 eram da espécie S.aureus.
4.2.1 Pesquisa de Staphylococcus spp. Resistentes a Oxacilina pelo Método do
Disco Difusão.
Pelo método de Disco Difusão, das 101 cepas de SCN isolados, 91% (92/101)
foram resistentes à oxacilina (ORSCN), enquanto que das 9 cepas de S.aureus
isolados, 66,6% (6/9) foram resistentes à oxacilina (ORSA), contabilizando um total de
98 cepas de Staphyloccus spp. resistentes à oxacilina (ORS) (92 ORSCN + 6 ORSA).
4.2.2 Teste do OXA-25.
Das 92 cepas de ORSCN, 91 foram positivas a este teste apresentando
crescimento sobre a placa do teste de OXA-25. Por outro lado, todas as cepas de
ORSA (6/6) submetidas a este teste foram positivas, também apresentando
crescimento sobre a placa.
4.2.3. Teste de sensibilidade dos ORS frente a outros antimicrobianos.
4.2.3.1 Método de Disco Difusão Em relação ao teste de sensibilidade aos antibióticos pelo método do disco
difusão, a maioria das cepas de ORSCN foram sensíveis à teicoplamina (93,5%-
86/92), ao cloranfenicol (91,3%- 84/92) e à mupirocina (87%-80/92), entretanto ainda
encontrou-se um número significativo de 12 cepas de ORSCN resistentes a este
último antibiótico. Por outro lado, a maioria delas foram resistentes à clindamicina
(95,6%- 88/92), à eritromicina (93,5%- 86/92), ao SUT (89%-82/92), à ciprofloxacina
(88%-81/92), e à gentamicina (79%- 73/92). Além disso, todas as cepas de ORSCN
foram sensíveis à linezolida e todas foram resistentes à penicilina (Figura 10).
48
Figura 10: Perfil de Sensibilidade das Cepas de Staphylococcus Coagulase-Negativa Resistentes à
Oxacilina frente aos antimicrobianos testados. SUT: Sulfametoxazol com Trimetropim.
Em relação ao teste de sensibilidade aos antibióticos para as cepas de ORSA,
a maioria delas foram sensíveis à Gentamicina (83,3%- 5/6) e todas foram sensíveis à
linezolida, teicoplamina, cloranfenicol, mupirocina e SUT. Em contrapartida, a maioria
delas foi resistente à eritromicina (83,3%- 5/6) e todas foras resistentes à penicilina,
clindamicina e ciprofloxacina (Figura 11).
Figura 11: Perfil de Sensibilidade das cepas de Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina frente
aos antimicrobianos testados. SUT: Sulfametoxazol- Trimetropim
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Po
rce
nta
gem
de
ce
pas
Antibióticos
Perfil de Sensibilidade dos Staphylococcus Coagulase-Negativa Resistentes à Oxacilina
Sensível
Resistente
Intermediário
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Po
rce
nta
gem
de
ce
pas
Antibióticos
Perfil de Sensibilidade dos Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina
Sensível
Resistente
49
4.2.3.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CIM) por E-teste
As 12 cepas de ORSCN resistentes ao disco de 5 μg de mupirocina foram
submetidas à detecção da Concentração Inibitória Mínima por tiras de E-teste. Deste
modo, destas 12 cepas, 5 foram resistentes a níveis intermediários (CIMs de 8 - 256
μg/ml) e 7 cepas foram resistentes a altos níveis (CIMs acima de 256 μg/ml),
contabilizando um total de 13% (12/92) cepas ORSCN resistentes a mupirocina.
A figura 12 mostra a leitura do E-teste de 3 cepas diferentes: uma sensível,
outra resistente a níveis intermediários e a terceira resistente a altos níveis.
A)
B) C)
Figura 12: E-Teste de Mupirocina. A) Cepa ATCC, sensível à Mupirocina (Seta: Ponto de intersecção
entre a fita e a zona de crescimento bacteriano, indicando um CIM entre 0,19- 0,25 μg/ml) B) Cepa 77,
com Resistência a Níveis Intermediários de Mupirocina (Seta: Ponto de intersecção entre a fita e a
zona de crescimento bacteriano, indicando um CIM entre 8-12 μg/ml). C) Cepa 79, Resistente a Altos
Níveis de Mupirocina (Note-se que o crescimento bacteriano se estabeleceu por toda a extensão da
fita, indicando um CIM > 1024 μg/ml). Fonte: Arquivo pessoal, LABMIC.
50
4.3 Identificação de Bacilos Gram-Negativos. De um total de 210 bacilos Gram-negativos isolados, 133 eram enterobactérias
e 77 eram bacilos Gram-negativos não fermentadores. Destes bacilos não
fermentadores, 40 eram da espécie Pseudomonas aeruginosa e 37 eram do gênero
Acinetobacter. As enterobactérias que tiveram maior frequência de isolamento foram
as da espécie Escherichia coli, seguida por Klebsiella pneumoniae. Outras bactérias
dos gêneros Enterobacter, Citrobacter, Proteus e Morganella também foram isolados,
conforme detalhado na Tabela 2.
A seguir, nos itens 4.3.1 e 4.3.2, serão abordados os resultados quanto ao perfil
de resistência para os 2 grupos bacterianos de bacilos Gram-negativos:
Enterobactérias e bacilos Gram-negativos não fermentadores
4.3.1 Pesquisa de Enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, produtoras
de ESBL e de β-lactamase AmpC.
Das 133 cepas de enterobactérias isoladas, a maior parte delas eram
produtoras de ESBL, representando um total de 39,09% (52/133) dos isolados,
seguido por 18% (24/133) de bactérias resistentes aos Carbapenêmicos e de 7,45%
de bactérias produtoras de AmpC (10/133). Além de que, destas bactérias citadas,
uma cepa foi positiva ao teste de AmpC e também foi resistente aos carbapenêmicos,
apresentando estes dois tipos de perfis de resistência concomitantemente, conforme
está abordado na Figura 13.
Estas 52 enterobactérias produtoras de ESBL, estavam presentes colonizando
um número total de 42 pacientes, gerando uma proporção de 36,8% (42/144) de
pacientes deste estudo colonizados com bactérias ESBL. Isto aconteceu, porque, de
alguns destes indivíduos, foram isoladas mais de uma enterobactéria ESBL.
51
Figura 13: Perfil de Resistência das enterobactérias quanto à produção de AmpC, ESBL e quanto à
resistência aos carbapenêmicos.* Sensíveis: Bactérias que não apresentaram nenhum dos tipos de
resistência citados. N=133 cepas
As figuras 14 e 15, a seguir, trazem fotos de um teste fenotípico de detecção de
AmpC e de um teste fenotípico de detecção de ESBL em 2 amostras deste estudo,
respectivamente.
A) B)
Figura 14: Teste de Indução para a detecção de bactérias produtoras de AmpC. IPM: Imipenem. CAZ:
Ceftazidima. CFO: Cefoxitina. A: Teste positivo (Setas: O achatamento do halo da Ceftazidima, para a
direção do imipenem indica a positividade do teste) B: Controle negativo (Note-se que não há
formação de achatamento do halo da ceftazidima nem para a direção do imipenem, nem para a direção
da cefoxitina. Fonte: Arquivo pessoal, LABMIC.
IPM CAZ CFO
52
A)
B)
Figura 15: Teste fenotípico de disco aproximação para a detecção de β-lactamase de Espectro
Extendido (ESBL). A: Teste positivo (Círculo: Teste fenotípico de disco aproximação para a detecção
de β-lactamase de espectro extendido- ESBL. Setas: Zonas de alargamento do halo de inibição- zonas
“ghost”, formada entre os discos da extremidade da cruz com o disco de centro, indicando positividade
ao teste). B: Controle negativo: (Círculo: Teste fenotípico de disco aproximação para a detecção de β-
lactamase de espectro extendido- ESBL. Entretanto, note-se que não há formação de zonas “ghost”
entre o disco central e os discos das extremidades). Fonte: Arquivo pessoal, LABMIC.
Das 24 cepas de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, 10 foram
positivas apenas no teste de Hodge, 3 foram positivas apenas no teste de MBL e 6
foram positivas em ambos os testes concomitantemente (Tabela 3). Em um número
percentual, isto contabiliza um total de 66,6% (16/24) enterobactérias positivas ao
THM e de 37,5% (9/24) bactérias positivas ao teste de MBL.
53
4.3.2 Pesquisa de Bacilos Gram-negativos Não-Fermentadores AmpC e
Resistentes aos Carbapenêmicos
Das 40 P. aeruginosa isoladas, o perfil de resistência mais frequente foi a
produção de β-lactamase AmpC, representando um total de 57,5% (23/40) e a
resistência aos carbapenêmicos foi encontrada em 40%(16/40) delas. Além disso
,destas bactérias citadas, 5 cepas apresentaram os 2 tipos de resistência: foram
produtoras de AmpC e resistentes aos carbapenêmicos concomitantemente, conforme
abordado na Figura 16.
Figura 16: Quantidade de Pseudomonas aeruginosa produtora de AmpC e Resistentes aos
Carbapenêmicos em valores absolutos e relativos. * Sensíveis: Bactérias que não apresentaram
nenhum dos tipos de resistência citados. N=40
Além disso, todas as cepas de P. aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos
foram positivas ao teste de MBL (16/16) ( Tabela 3).
Por outro lado, dos 37 Acinetobacter spp. isolados, 81% (30/37) foram
resistentes aos carbapenêmicos (Figura 17), sendo que, destas 30 cepas de
Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos, 26 foram positivas ao teste de
MBL (Tabela 3).
54
FIGURA 17: Quantidade de Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos e sensíveis em
números absolutos e relativos. N=37.
Tabela 3: Quantidade de Bacilos Gram-Negativos Resistentes aos Carbapenêmicos
positivos ao Teste de Hodge Modificado e ao Teste de Metalobetalacmase (MBL).
Teste de Hodge MBL HODGE + MBL
Enterobactérias Rcarb* (N=24) 10 3 6
Pseudomonas aeruginosa Rcarb (N=16)
------------- 16 ------------
Acinetobacter spp. Rcarb (N=30) ------------ 26 ------------
*Rcarb: Resistente aos carbapenêmicos.
4.4 Análises Estatísticas
De 114 pacientes utilizados no estudo, 98 deles estavam colonizados com
bactérias do gênero Staphylococcus resistentes à oxacilina (ORS), representando um
percentual de 86%. Destes 98, a maior parte deles faziam uso de carbapenêmicos em
sua antibioticoterapia (44,8%- 44/98), 29,5% (29/98) usavam Vancomicina, 13,2%
(13/98) usavam Amicacina e 12,4% (12/98) faziam uso de outros antibióticos.
Não foi observada influência significativa no uso de carbapenêmicos na
antibioticoterapia em relação à colonização por ORS.
55
Por outro lado, desses 114 pacientes estudados, 55 deles estavam colonizados
com bactérias RCarb, representando uma porcentagem de 48,2%. Em relação a
antibioticoterapia, o fármaco mais usado pelos pacientes colonizados por esta
bactéria resistente era também algum tipo de carbapenêmico, representando um total
de 56,3% (31/55). Vinte e nove por cento (16/55) deles faziam uso de outros tipos de
antimicrobianos e apenas 14,5% (8/55) não estavam fazendo antibioticoterapia no
momento.
Foi observada uma influência estatisticamente significativa do uso de
carbapenêmicos na antibiocoterapia do paciente em relação à colonização por
bactérias Rcarb, considerando um nível de significância de 5% (p=0,04). Foi também
visto que indivíduos destas UTIs que faziam antibioticoterapia com carbapenêmicos
tinhas 2 vezes e meia mais chances de virem a ser colonizados com bactérias Rcarb,
do que os que não usavam este tipo de antibiótico (odds ratio 2,5).
Os pacientes estudados se encontravam em um tempo de internação de 7 até
62 dias, sendo que a maior parte deles estavam internados num período de 11 a 20
dias, com média de 16 dias (Figura 18). Não houve influência estatisticamente
significante da variável tempo de internação com a presença de bactérias ORS e
RCarb colonizando pacientes numa faixa a partir de 7 dias de internação.
.
Figura 18: Tempo de internação dos pacientes
As idades dos 114 pacientes estudados variavam entre 15 e 98 anos. A média
foi de 55 anos completos com frequências maiores entre 41 a 50, e entre 61 a 70
56
anos (Figura 19). Também não houve influência estatisticamente significante da
variável idade com colonização dos pacientes pelas bactérias ORS e RCarb.
Figura 19: Idade dos pacientes
Por último, os diagnósticos mais presentes entre os pacientes colonizados com
bactérias ORS e RCarb foram os de doenças infeciosas, seguido por quadros de
sepse e, em terceiro lugar, por doenças respiratórias. Assim como as variáveis tempo
de internação e idade, o tipo de diagnóstico também não apresentou influência
estatisticamente significativa na colonização dos pacientes deste estudo pelas
bactérias ORS e RCarb.
57
5. DISCUSSÃO
A resistência bacteriana vem aumentando significativamente nas últimas
décadas, ocasionada principalmente pelo uso rotineiro e indiscriminado de
antimicrobianos. Deste modo, são encontrados elevados índices de bactérias
resistentes em torno do mundo, assim como demonstrado também no presente
trabalho.
A alta porcentagem de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) resistentes à
oxacilina (91%) é um reflexo de um vigoroso aumento desta resistência em algumas
espécies de SCN, como vêm sendo mostrado desde a década de 80, por Becker;
Heilmann; Peters, 2014, e mostra que o índice dessa resistência bacteriana
encontrados neste Estado do país, não difere dos índices alarmantes que estes
patógenos estão tomando em torno o mundo.
Em um recente estudo que envolveu várias regiões do mundo, como Europa,
América do Norte, América Latina e Ásia, também foram detectados níveis bastante
elevados de SCN resistentes à oxacilina, chegando a níveis de 80-90% dependendo
da espécie. As espécies de S. epidermidis, S. haemolyticus e S.cohnii foram
resistentes à Oxacilina em 79,5%, 89,6% e 96% respectivamente (SADER; JONES,
2012).
Os SCN, assim como uma grande quantidade de outros organismos, fazem
parte da microbiota da pele e mucosas de seres humanos, podendo estar presentes
em regiões do corpo tais como axilas, regiões iguinais e região anterior das narinas
(BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014). Deste modo, ao colonizar normalmente a
pele, estes microrganismos podem ganhar acesso à corrente sanguínea por meio de
uma porta de entrada, como cateteres intravenosos ou próteses valvulares, causando
septicemia principalmente em pessoas mais vulneráveis à infecção, como pacientes
de UTIs (CUNHA; MORAES; MONTEIRO, 2016).
Assim, este número elevado de resistência à oxacilina que os SCN estão
tomando é um dado preocupante para a população, pois qualquer infecção
sanguínea, ocasionada por estes microrganismos resistentes, torna-se mais difícil de
ser tratada, já que a resistência a este fármaco leva à resistência a todos os outros β-
lactâmicos, restringindo significativamente as opções de tratamento (OSTOJIC;
HUKIC, 2015).
Devido ao maior número de pacientes imunodeprimidos hospitalizados e o uso
destes dispositivos médicos invasivos, os Staphylococcus coagulase-negativa (SCN),
58
têm emergido como um dos principais agentes etiológicos das infecções sanguíneas
(RIGATTI et al., 2010). O Staphylococcus epidermidis, espécie mais prevalente entre
os SCN, tornou-se a maior causa de infecções relacionadas com o uso destes
dispositivos médicos (cateteres venosos centrais, próteses osteoarticulares, válvulas
cardíacas) variando entre incidências de 50-70% (NETO, 2012).
Foram isolados 9 S. aureus de 114 pacientes do estudo, representando um
total de 7,8% de pacientes colonizados, nível abaixo de colonização por S.aureus
descrita na literatura. Sabe-se que aproximadamente cerca de 30% dos adultos
saudáveis são colonizados por essa espécie na região anterior das narinas
(FOWLER; CHEN; TONG, 2012). Provavelmente um fator que pode ter afetado o
índice de prevalência de S.aureus nos pacientes deste estudo é a prática de
descolonização nasal (por mupirocina) rotineiramente feita pela equipe de
enfermagem dos 2 hospitais ao se detectar a presença de ORSA colonizando o
paciente. Logo após sua chegada nas UTIs, é coletado um swab nasal de vigilância
para a pesquisa deste patógeno.
Como as coletas deste estudo foram realizadas em pacientes a partir de 7 dias
de internação, uma parte deles provavelmente já tinha sido descolonizada para ORSA
com mupirocina nasal antes das coletas, afetando a prevalência desta espécie nos
resultados. O agente tópico empregado é efetivo na eliminação do estado de portador
nasal por S. aureus por até 12 semanas (LEE et al., 2016).
O teste do OXA-25 foi feito como um teste suplementar para a detecção da
resistência à oxacilina e demonstrou estar em concordância com o teste de disco
difusão na detecção das cepas com esta resistência, pois 99% (97/98) das cepas
ORS identificadas por disco difusão foram positivas também no teste do OXA-25.
As cepas de Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina de origem hospitalar
se caracterizam também por uma resistência acentuada a diversos grupos de
antimicrobianos (FRANCHI, 2011), pois o cassete cromossômico SCCmec, que elas
carregam em seu material genético, além de conter o gene mecA, também podem
carrear genes responsáveis pela resistência a uma ampla gama de antimicrobianos
além dos β-lactâmicos (OTTO, 2013). Isto explica, então, a importância da aplicação
de testes de sensibilidade para outros antimicrobianos como foi feito neste trabalho, já
que o carreamento de outros genes de resistência é uma realidade presente entre
essas cepas.
A linezolida, antibiótico testado que apresentou 100% (98/98) de sensibilidade
entre os Staphylococcus spp. resistentes à oxacilina, é um medicamento pertencente
59
à classe das oxazolidinonas, utilizado como última escolha para o tratamento de
infecções com estes microrganismos, incluindo infecções de pele e partes moles
(LOPES, 2014).
Assim como este estudo, pesquisas ocorridas no Brasil e nos Estados Unidos,
detectaram 100% de sensibilidade em espécies do gênero Staphylococcus
(RAMPELOTTO et al, 2014; NELSON et al., 2015), indicando que este medicamento
pode ser ainda considerado como uma boa escolha para o tratamento de infecções
graves com estes patógenos resistentes. Dados recentes de vigilância global sugerem
que a sensibilidade à esta droga está em torno de 99%(mesmo entre os estafilococos
resistentes à oxacilina) (MENDES et al., 2015).
A mupirocina, importante fármaco utilizado na descolonização nasal de
pacientes de UTI que sejam portadores de ORSA, é rotineiramente usado a fim de se
prevenir possíveis infecções graves futuras com esse tipo de microrganismo.
Entretanto o uso indiscriminado ou prolongado deste medicamento tem contribuído
para o surgimento de estirpes resistentes à mupirocina, inclusive entre as espécies de
SCN (FERREIRA, 2010).
A emergência desta resistência varia em torno do mundo por meio de
diferentes porcentagens. Em relação ao S.aureus, verificou-se uma resistência de 6%
na Índia (GADEPALLI et al., 2007) e de 13,2% nos EUA (JONES et al., 2007). Já entre
os SCN, obteve-se um valor de 7,8% de um estudo feito em um hospital terciário no
país da França (TROUILLET-ASSANT et al., 2015) e de 28% em uma pesquisa na
Índia (OOMMEN; APPALARAJU; JINSHA, 2010). No Brasil, uma pesquisa de
caracterização desta resistência em uma espécie de SCN (S.haemolyticus) de origem
nosocomial verificou uma resistência de 12% destas cepas ao fármaco (FERREIRA,
2010). Já neste trabalho, todas as cepas de S.aureus foram sensíveis à Mupirocina,
no entanto, entre os SCN resistentes à oxacilina, verificou-se um nível de 13% (12/92)
de resistência, equivalendo a um valor comparável ao estudo de Ferreira et al.,2010 e
um valor mediano entre as frequências obtidas nas pesquisas feitas em várias partes
do mundo.
O surgimento de cepas SCN resistentes à mupirocina é um dado preocupante,
pois elas podem servir de reservatório de genes desta resistência e agir na sua
disseminação para S.aureus e para outras espécies de Staphylococcus
spp.(FERREIRA, 2010). Isso então levaria à uma maior dificuldade na prática de
descolonização nasal das cepas de ORSA por meio da mupirocina, que passariam a
não serem mais afetadas pelo uso deste fármaco.
60
Em relação às enterobactérias isoladas, detectou-se uma taxa de 39,09% (52
de 133) de ESBL, diferente das taxas obtidas em estudos realizados em outros
países. Isto ocorre, porque também há uma diferença geográfica na ocorrência de
ESBL em cada nação. Em um estudo realizado na França, encontrou-se uma
prevalência de 22,3% (DORTET; POIREL; NORDMANN, 2015) enquanto que na
Uganda, este índice de enterobactérias produtoras de ESBL chegou à 62%
(KATEREGGA et al, 2015). Esta diferença geográfica dos índices tanto de ESBL,
como de outros patógenos abordados neste estudo, ocorre porque o nível de
bactérias resistentes que surgem é diretamente proporcional à frequência de
exposição aos antibióticos em cada localidade. Isto significa que quanto maior é a
exposição aos antimicrobianos em uma determinada população, maior será a
probabilidade de ocorrência de elevados níveis de resistência a estes medicamentos
(FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Dos 144 pacientes utilizados nesta pesquisa, uma proporção de 36,8% deles
estavam colonizados com algum tipo de bactéria ESBL. Outros estudos que coletaram
amostras de swab retal à procura de bactérias resistentes colonizando pacientes de
UTI também mostraram níveis significativos da prevalência deste mecanismo de
resistência. Entre pacientes admitidos em UTIs da Coréia, foi obtido uma
porcentagem de 28,2% de colonização por ESBL (KIM et al., 2014). Já outro estudo
feito entre pacientes de UTI neonatal na Suécia, demonstrou uma porcentagem de
mais da metade deles (56%) colonizados com ESBL, que estavam internados entre 1
até mais de 30 dias de internação (NORDBERG et al., 2013). Nossos dados, portanto,
situam-se entre uma porcentagem mediana de indivíduos colonizados encontrados
em estudos realizados em torno do mundo.
Em relação ao grupo das não fermentadoras, os representantes isolados foram
Pseudomonas aeruginosa e espécies do gênero Acinetobacter.
P. aeruginosa é um dos bacilos Gram-negativos mais comumente associados
à infecções de pacientes de UTI, como bacteremias e infecções urinárias,
predominando como agente de infecções do trato respiratório inferior. Além disso, ele
apresenta um elevado nível de resistência intrínseca a diversos antibióticos e uma
capacidade de se tornar ainda mais resistente aos fármacos, através de mutações em
seu material genético que levam à hiperexpressão de AmpC e resistência aos
carbapenêmicos (GALETTI, 2010).
61
Mais da metade das cepas isoladas de P. aeruginosa (57,5%- 23/40),
apresentavam produção de AmpC detectada pelo método fenotípico, número
comparável a uma pesquisa feita para este mecanismo de resistência no Sul do país
(WAGNER et al, 2012). Entretanto, a prevalência encontrada neste estudo foi maior
em comparação com uma pesquisa feita na Índia, encontrando-se uma incidência de
42,8% da β-lactamase AmpC em Pseudomonas spp. isoladas de pacientes de UTI
(GUPTA et al, 2016). A produção da enzima AmpC nesta bactéria, é um fator
preocupante, pois resulta na resistência a quase todos os antibióticos β-lactâmicos,
com exceção dos carbapenêmicos. Isto acontece, porque a quantidade de antibióticos
que podem ser utilizados naturalmente para este microrganismo é mais reduzido, pois
ele possui intrinsecamente mais genes de resistência aos β-lactâmicos do que as
enterobactérias (TSUTSUMI; TOMITA; TANIMOTO, 2013).
A correta detecção laboratorial da produção de β-lactamase AmpC, não só em
P. aeruginosa, mas também em outros organismos é bastante necessária, pois o
desenvolvimento da resistência ao longo do tratamento é uma realidade alarmante.
Isto acontece porque algumas cepas produtoras de β-lactamase AmpC podem
apresentar sensibilidade às cefalosporinas in vitro, em testes laboratorias, mas ao
serem expostas a algum agente indutor na terapia, estas estirpes podem ser
induzidas a hiperproduzir a enzima, gerando resistência ao antibiótico e consequente
falha do tratamento (JACOBY, 2009).
Por outro lado, representantes do gênero Acinetobacter são bacilos não
fermentadores com alta capacidade de colonizar o corpo humano e reservatórios
ambientais. Eles vêm se tornando, nas últimas 3 décadas, importantes agentes de
infecções associados a uma alta morbidade e elevada mortalidade em pacientes de
UTI com bacteremia (OBEIDAT et al., 2014). No Brasil, foi encontrado um elevado
índice de 65,5% de óbitos dos pacientes quando apresentam infecções na corrente
sanguínea por este patógeno (MARRA et al, 2011).
Um dos fatores que levam a este elevado índice de mortalidade é a
característica do microrganismo de ser também intrinsecamente resistente a vários
antimicrobianos, o que restringe consideravelmente as opções terapêuticas. Esta
bactéria é um patógeno oportunista e que também é capaz de adquirir rapidamente
genes de resistência aos fármacos, como elementos genéticos móveis. Assim, até
recentemente, espécies deste gênero permaneciam susceptíveis aos
carbapenêmicos, porém a resistência a esta classe foi sendo cada vez mais
62
observada em torno do mundo, sendo considerado um problema de saúde
significativo (KEMPF; ROLAIN, 2012).
O índice bastante elevado de 81% de resistência aos carbapenêmicos pelas
cepas de Acinetobacter spp. isoladas neste estudo é um fato que comprova a
emergente preocupação mundial em relação a este problema no país e no mundo.
Assim como este trabalho, outra pesquisa feita recentemente no Brasil detectou um
alto índice de resistência aos carbapenêmicos, em cepas deste gênero (92%) (LEÃO
et al., 2016). Deste modo, as opções de tratamento para estas bactérias com alto
padrão de resistência tornam-se limitadas, sendo o uso das polimixinas (colistina e
polimixina B) a antibioticoterapia de último recurso nestes casos, porém isolados de
bactérias resistentes à colistina já foram relatados (KEMPF; ROLAIN, 2012).
O grupo bacteriano com maior proporção de resistência aos carbapenêmicos
neste estudo foi o das não fermentadoras (Acinetobacter spp - 81% e Pseudomonas
aeruginosa- 40%) em detrimento das Enterobacteriaceae (18%). Estes resultados
demonstram já o esperado, pois sabe-se que a resistência aos carbapenêmicos é
mais frequentemente observada no grupo das bactérias não fermentadoras, apesar
de ser uma problemática existente entre todas as bactérias Gram-negativas (WAN
NOR AMILAH et al., 2012). Levando assim, a uma maior dificuldade no tratamento de
infecções com estes microrganismos resistentes, pela ineficácia no uso de muitos
outros β-lactâmicos.
A significativa proporção da resistência aos carbapenêmicos das bactérias não-
fermentadoras é devido a produção de metalo-β-lactamase (MBL),um dos tipos de
enzimas carbapenemases existentes (WAN NOR AMILAH et al., 2012). Conforme os
resultados deste estudo, a maior parte das bactérias resistentes aos carbapenêmicos,
foram positivas no teste de MBL: Dos Acinetobacter spp. Rcarb, 86,6% (30/37) foram
positivos ao teste e todas as P.aeruginosa Rcarb 100% (16/16) também foram
positivas. Isto indica que estas cepas são possíveis produtoras de carbapenemase
metalo-β-lactamase, necessitando que estudos genéticos sejam feitos para confirmar
esta produção.
Quanto às enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, 37,7% (9/24)
foram positivas no teste fenotípico para a enzima MBL. Há alguns anos, o gene MBL
foi disseminado de P.aeruginosa para estas bactérias da Família Enterobacteriaceae,
o qual tem aumentado a sua prevalência em bacilos Gram-negativos na Ásia, Europa,
América Latina e nos EUA (WAN NOR AMILAH et al., 2012).
63
Por outro lado, 66,6% (16/24) das enterobactérias resistentes aos
carbapenêmicos foram positivas no THM. A realização deste teste foi recomendada
desde 2009 pelo CLSI, para a detecção de carbapenemases. Ele tem demonstrado
alta sensibilidade (superior a 90%) na detecção de KPC, porém não é específico
apenas para KPC, sendo também altamente sensível para a detecção de
carbapenemase do tipo OXA-48 (93%). Deste modo, os resultados positivos no MHT
também indicam a necessidade de realização de técnicas moleculares para
confirmação do gene KPC ou OXA-48 (MELO, 2014).
Múltiplos fatores têm sido associados à emergência de bactérias com alto
padrão de resistência, como utilização de antibióticos, tempo de permanência
hospitalar, idade avançada e quadro clínico do pacientes (DE MORAES et al., 2013).
Deste modo, foi avaliada neste trabalho, a correlação destas variáveis clínicas com a
colonização dos pacientes por ORS e bactérias Rcarb.
O uso, muitas vezes, irracional e inadequado de antimicrobianos em
prescrições médicas tem sido bastante discutido e pesquisado sua correlação com o
surgimento de cepas com alto perfil de resistência (CATANEO et al., 2011).
A significativa influência estatística do uso de carbapenêmicos na colonização
de pacientes por bactérias Rcarb encontrados nesta pesquisa ressalta a influência do
uso de antimicrobianos como um fator de risco para a aquisição de bactérias
resistentes, pois o uso constante e indiscriminado destes fármacos provoca uma
pressão seletiva, eliminando as bactérias mais sensíveis e provocando um aumento
percentual na população das mais resistentes (CATANEO et al., 2011). No caso deste
estudo, pacientes que faziam o uso de carbapenêmicos tiveram mais chances de
serem colonizados por bactérias Rcarb, pois o uso contínuo destes antibióticos, não
só atuou de forma positiva, eliminando os patógenos sensíveis a eles, mas também
pôde atuar selecionando as bactérias Rcarb, até provocar um aumento percentual na
população destes microrganismos, conforme explicado anteriormente, elevando assim
os seus índices de colonização nos pacientes (FRAIMOW; TSIGRELIS, 2011).
Deste modo, as medidas que podem minimizar essa realidade dizem respeito
ao controle do uso de antimicrobianos, racionalizando a prescrição destes
medicamentos e a duração do tratamento (OLIVEIRA; SILVA, 2008).
Outra variável clínica importante analisada neste estudo foi o tempo de
internação. Isto porque quanto mais longa é a permanência do paciente no hospital,
mais tempo ele pode estar fazendo uso de antibioticoterapia, levando a uma maior
pressão seletiva para o surgimento de bactérias com alto perfil de resistência. Deste
64
modo, quanto maior o tempo de internação, maior será a probabilidade do paciente
adquirir estes microrganismos (FERRAREZI et al, 2006).
A idade avançada e a gravidade da doença de base também são alguns dos
múltiplos fatores que também têm sido associados à emergência de microrganismos
resistentes. Isto acontece, porque pacientes mais idosos ou pacientes com quadros
clínicos mais difíceis (independentemente do tipo de diagnóstico) tendem a se tornar
mais debilitados, aumentando seu tempo de permanência na UTI e, com isso, a
probabilidade da infecção por bactérias mais resistentes (SAFDAR; MAKI, 2002). Em
relação ao quadro clínico dos pacientes abordados neste estudo, o diagnóstico mais
presente em pacientes colonizados com bactérias Rcarb e ORS eram o de doenças
infecciosas, seguido por sepse e, em terceiro lugar, por doenças respiratórias
Entretanto, não houve resultados estatisticamente significativos para as
variáveis idade, tempo de internação e tipo de diagnóstico neste trabalho,
provavelmente devido à impossibilidade de se ter feito a coleta das amostras de forma
“aleatorizada” (através do método de sorteio), conforme é recomendado para as
pesquisas estatísticas. Isto aconteceu, porque nem todos os pacientes que estavam
dentro do critério de inclusão, estavam disponíveis para que as coletas dos swabs
fossem feitas, pois alguns deles estavam em procedimento médico no momento.
Deste modo, as coletas foram feitas “por conveniência”, ou seja, de acordo com a
disponibilidade do paciente no momento da coleta.
Outros elementos importantes que podem ter interferido no resultado
estatístico destas variáveis são os fatores extrínsecos como a transferência de
bactérias resistentes entre pacientes, de leito-a-leito, pelos profissionais de saúde,
problema ainda vigente no ambiente nosocomial e bastante debatido pelas
Comissões de Controle de Infecção Hospitalar.
Deste modo, o fator clínico que estava diretamente correlacionado com o
aumento da colonização de pacientes por bactérias resistentes neste trabalho foi o
uso de carbapenêmicos na antibioticoterapia. Isto sugere, então, a necessidade de
prevenção e controle do surgimento e disseminação destes microrganismos, através
de medidas que diminuam a ação desse fator de risco no surgimento de bactérias
resistentes.
65
6. CONCLUSÕES
Foi demonstrado que os elevados índices de Staphylococcus spp. coagulase-
negativa resistentes à oxacilina (ORSCN) e de Acinetobacter spp. resistentes aos
carbapenêmicos encontradas nesse estudo refletem e acompanham as tendências
nacionais e internacionais do aumento da resistência destes patógenos.
Foi detectado que a maior parte das enterobactérias apresentaram produção
de β-lactamase de espectro extendido (ESBL) e a maioria das cepas de P. aeruginosa
apresentaram a produção de β-lactamase AmpC.
O significativo índice de Staphylococcus spp. coagulase-negativa resistentes à
mupirocina indicou a necessidade de um maior cuidado pelos hospitais deste estudo a
fim de que essa resistência não tome proporções maiores e dificulte a prática de
descolonização nasal por este fármaco.
A maioria das bactérias não fermentadoras resistentes aos carbapenêmicos foi
positiva ao Teste de MBL, indicando possível produção de metalo-β-lactamase e a
maior parte das enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos, foram positivas ao
Teste de Hodge Modificado, indicando a produção de enzima KPC ou OXA-48.
Entretanto, são necessários posteriores testes genéticos a fim de se confirmar o tipo
de enzima carbapenemase presente.
Dentre as variáveis clínicas estudadas, a antibioticoterapia teve relevância
estatística, influenciando na colonização dos pacientes deste estudo por bactérias
resistentes aos carbapenêmicos.
Os elevados índices de bactérias resistentes obtidos nesta pesquisa,
demonstram que é essencial que os 2 hospitais em estudo melhorem suas condutas
de vigilância e racionalização do uso de fármacos na UTI a fim de se diminuir o
surgimento e a disseminação destes microrganismos.
66
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
A partir dos resultados dos testes fenotípicos aplicados neste trabalho, é
necessário que posteriormente estudos genéticos moleculares sejam feitos para a
determinação dos principais genes de resistência presentes nestas bactérias
resistentes isoladas de pacientes de UTI.
Além disso, planeja-se converter o texto desta dissertação em um livro didático
sobre as culturas de vigilância no Estado e as bactérias resistentes de maior
importância clínica que possam colonizar ou infectar pacientes internados em
unidades hospitalares, a fim de se aplicar um retorno imediato dos conhecimentos
adquiridos nesta pesquisa para a população.
67
8. REFERÊNCIAS
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78
10. ANEXOS
- Documento de aprovação da pesquisa pelo Comitê de ética em Humanos da
UFRN
79
80
81
82
- Comprovante de Submissão do Artigo à Revista Epidemiology and
Infection
83
- Artigo
Aetiology and resistance of Staphylococcus spp. and Gram-
negative bacilli isolated from ICUs’ surveillance culture.
M. M. B. FRANCO1*
, C. A. MACEDO1, M. V. S. ALMEIDA
1, A. P. DANTAS
1, S.
A. LOSS1, R. M. NETO
1.
1 Laboratory of Mycobacteria , Department of Microbiology and Parasitology, Federal
University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.
*Author Responsible for Correspondence about the
Manuscript (and author to whom correspondence and requests for reprints should be addressed
or statement that reprints will not be available from the author)
Mayara Maria Bastos Franco (M. M. B. FRANCO)
Email address: [email protected]
Address: Laboratory of Mycobacteria, Department of Microbiology and
Parasitology, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN)
3000 Senador Salgado Filho Ave.
Natal, RN 59 072-970
Brazil
Running Head: Surveillance culture of ICU patients.
84
SUMMARY
The existence of pathogens with high antimicrobial resistance, capable of being part of
enteric and cutaneous microbiota, increases the risk of serious infections. Thus
surveillance cultures are important to identify these microorganisms and minimize their
propagation. This research used surveillance cultures to determine the presence of
several resistance mechanisms existent in bacteria colonizing 114 patients admitted in
Intensive Care Units (ICUs) for 7 or more days. For this purpose, manual methods of
phenotypic identification, antimicrobial susceptibility and phenotypic tests for the
indication of beta-lactamases’ production were used. From 110 isolated
Sthaphylococcus spp., 89% (98 of 110) were resistant to Oxacillin. On the other hand,
43% (58 of 133) of Enterobacteriaceae were Extended Spectrum Beta-Lactamases
(ESBL), 57.5% (23 of 40) of Pseudomanoas aeruginosa were AmpC and 81% (30 of
37) of Acinetobacter spp. were resistant to Carbapenems. Among the studied clinical
variables, it was found a significant statistical association between the use of
Carbapenems and colonization by bacteria resistant to these antibiotics. These really
high indexes reflect the current epidemiological tendency of high resistant bacteria
growth, making essential the implementation of surveillance measures, isolation and
rationalization of antibiotic use to minimize the dissemination of these pathogens.
Kew words: Antibiotic resistance; Surveillance; Intensive Care Units; Microbiota;
Carbapenems;
85
INTRODUCTION
Hospital- acquired infection (HAI) is every infection that manifests itself in a
patient after being admitted to the hospital, being correlated with the hospitalization and
hospital procedures, creating a considerable morbidity and mortality index [1]. This
happens because the pathogens that cause the infections are, in many occasions, high
resistant nosocomial strains, such as Staphylococcus spp. resistant to Oxacillin (ORS)
and Carbapenem-resistant (CarbR) bacteria, which circulate in hospital environment and
when infects the patient can cause severe clinical conditions [2].
In this context, the conclusion that non-infected patients can be colonized by
resistant bacteria, acting also as silent transmitters, led several hospitals to practice
surveillance cultures, which are a set of techniques for the isolation and identification of
resistant microorganisms in colonized individuals. Thus, this action acts significantly on
the control of HAIs in the prediction of pathogens that can cause severe nosocomial
infections, in addition to minimize the transmission of such microorganisms to other
individuals, through isolation measures [3].
It’s interesting to conduct these actions in all patients admitted in the hospital but
the time spent and high costs of the procedure have been the cause of the difficult
implementation of such actions in most hospitals [4].
One hospital space that is considered the epicenter of antimicrobial resistance is
the Intensive Care Unit (ICU), being the main source of high antimicrobial resistance
bacteria outbreaks. Constant use of antimicrobial drugs, in such environments, leads to
the selection of naturally resistant strains. Besides that, the frequent use of invasive
techniques, the high density of patients and the susceptibility of this population, usually
carriers of severe diseases, increases even more the risk of infection caused by these
microorganisms [5].
86
Among resistant pathogens representing the genus Staphylococcus, ORS are the
most studied and well known worldwide. These strains, besides oxacillin, are also
resistant to all others beta-lactam antibiotics [6]. On the other hand, among gram-
negative bacilli, the most important resistance patterns are the ones related to the
production of beta-lactamases enzymes. These enzymes can be classified in AmpC
(leading to the degradation of penicillins, cephamycins, monobactams and
cephalosporins up to the third-generation), ESBL -Extended spectrum beta-lactamase
(inducing the hydrolysis of penicillins, third-generation and fourth-generation
cephalosporins and monobactams) and carbapenemases (promoting resistance to
carbapenems) [6].
It becomes necessary to determine the frequency of these types of high
antimicrobial resistance bacterium in ICU’s environments, to improve surveillance
procedures, stopping the transmission of these pathogens. Thereby, this work aims to
determine aetiological frequency and the frequency of resistance mechanisms in
bacteria isolated from ICUs’ patients hospitalized in two university hospitals related to
Federal University of Rio Grande do Norte.
METHODS
Ethical Standards
The research project was submitted and approved by the Human Research Ethics
Committee from the Federal University of Rio Grande do Norte (CEP-UFRN), through
the issue of an official report (number 1136107) on 02 July 2015.
Collection
Collections were made from 114 patients hospitalized for 7 or more days in
ICUs from two hospitals bound to the Federal University of Rio Grande do Norte,
(Natal-RN, Brazil). It was conducted from July 2015 to July 2016. Nasal, axillary and
87
rectal swabs were collected from each patient [7] and their respective clinical
information was also acquired: Age, hospitalization period, diagnosis and the type of
antibiotics the patient was using.
Isolation and Identification of Bacterial Isolates
After the collection, swabs were transported into Stuart (HIMEDIA) transport
media to Laboratory of Mycobacteria of the Department of Microbiology and
Parasitology (LABMIC/ DMP-UFRN) where they were processed. The collected swabs
were sown in the BHI broth medium (Brain Heart Infusion Broth-HIMEDIA) and
incubated in a bacteriological stove for about 1-2h at 36 °C. After this period of time,
the samples were sown in Blood Agar (BHI agar supplemented with 5% defibrinated
sheep blood - HIMEDIA), MacConkey Agar (HIMEDIA) and in Mannitol Agar
(HIMEDIA), so Gram-negative bacillli and also Staphylococcus spp. from each patient
may be isolated. Each bacterial specie was identified according to KONEMAN, 2006
[8].
Study of Oxacillin Resistant Staphylococcus spp.(ORS)
Each Sthaphyloccus spp., isolated and identified, was tested for susceptibility to
the Cefoxitin disk 30ug, to identify the resistance to Oxacillin as recommended by the
Clinical and Laboratory Standards Institute 2016 (CLSI 2016) [10]. Sthaphylococcus
spp. resistant to Oxacillin disk were submitted to OXA-25 test, adapted from Lencastre,
1991 [9], as a supplementary test to the identification of such resistance. It was also
verified the susceptibility to Penicillin (10 µg), Chloramphenicol (30 µg), Gentamicin
(10 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Trimethoprim-Sulfamethoxazole-TSU (25 µg), Linezolid
(30 µg), Teicoplanin (30 µg), Mupirocin (5 µg), Erythromycin (15 µg) and Clindamycin
(2 µg) disks, by the disc diffusion method [10]. The strains resistant to Mupirocin disk
were submitted to E-test (Biomerieux, Lyon, France) from the same antibiotic for the
88
determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC). A MIC ≥ 512 ug/ml was
classified as high-level resistance. A MIC ranging from 8 to 256 ug/ml was classified as
intermediate resistance and MIC <4 μg/ml were interpreted as sensitive [11].
Phenotypic Tests of the Mechanisms of antimicrobial resistance ESBL, AmpC and
Resistance to Carbapenems (MHT and Imipenem-EDTA Test) in Gram-negative
bacilli
AmpC Test was made for Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa, by
the disk approximation method [12], ESBL Test was made only for Enterobacteriaceae
(DDST20)[13], and the test for the identification of resistance to carbapenems was
made for all Gram-negative bacteria through the use of Ertapenem, Imipenem and
Meropenem disks [10]. A Modified Hodge Test(MHT) was conducted for Carbapenem-
resistant Enterobacteriaceae and to detect metallo-beta-lactamase, the imipenem-EDTA
double-disk synergy test was also conducted in all carbapenem-resistant gram-negative
bacteria [14].
Statistical Analysis
It was used the logistic regression model, through R software, to verify which
clinical independent variables(age, hospitalization period, diagnosis and the type of
antibiotics the patient was using) influences on the colonization of patients by ORS and
CarbR bacteria. Results with P < 0.05 were considered statistically significant.
RESULTS
A total of 320 bacteria were isolated from 114 patients. One hundred and ten
from which were of the genus Staphylococcus and 210 belonged to the Gram-negative
bacilli group(Table 1).
89
In the disk diffusion assay, from 101 CoNS isolated, 92 were resistant to
Oxacillin (ORCoNS) and from nine isolated Staphylococcus aureus, six were resistant
to Oxacillin (ORSA), representing a total of 91% of ORCoNS and 66.6% of ORSA
isolated. From 98 ORS, 97 were positive in the OXA-25 test and only one was negative.
In what concerns the antibiotic susceptibility test, most strains of Staphylococcus
spp. Resistant to Oxacillin (ORS) were susceptible to Teicoplamin (93.8%, 92 of 98), to
Chloramphenicol (91.8% - 90 of 98) and to Mupirocin (87.7%, 86 of 98). On the other
hand, most of them were resistant to antibiotics: Clindamycin (95,9%, 94 of 98),
Erythromycin (92,8%, 91 of 98), Ciprofloxacin (88.7%, 87 of 98),
Trimethoprim/Sulfamethoxazole (83,6%, 82 of 98) and Gentamicin (75.5%, 74 of 98).
In addition, all of ORS strains (100%, 98 of 98) were sensitive to Linezolid and all were
resistant to Penicillin.
All 12 strains of Staphylococcus spp. resistant to Mupirocin discs were CoNS.
Thus, by the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) through
Mupirocin E-Test (of 12 Mupirocin disc resistant strains) it was verified that five strains
were resistant to intermediary levels (MICs of 8- 256 ug/ml) and seven strains to high
levels (MIC above 256 ug/ml), representing a total of 13%(12 of 92) CoNS strains
resistant to Mupirocin.
Phenotypic tests for the detection of resistance mechanisms made for
Gram-negative bacilli, found the results described in table 2.
From 24 Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, ten were positive only to the
Modified Hodge Test (MHT), three were positive only to the Imipenem-EDTA
double-disk synergy test and six were positive in both tests: MHT and Imipenem
EDTA-Test. On the other hand, five bacteria were not positive in any of the mentioned
90
tests. From 16 CarbR P.aeruginosa all 16 were MBL. And from 30 CarbR
Acinetobacter spp., 26 were MBL and 4 haven’t presented this type of carbapenemase.
From a total of 114 patients participating in the study, 95.9% (98 of 114) were
colonized by ORS and 48.2% (55 of 114) were colonized by CarbR bacteria. Most of
the patients colonized by CarbR bacteria were using some Carbapenem in their
antibiotic therapy (Meropenem or Imipenem).
Thereby, among the clinical variables studied, the use of carbapenems had a
statistical significant influence in the colonization of patients by CarbR bacteria (p value
= 0.04, with significance level of 5%). It was also verified that individuals from these
ICUs that made antibiotic therapy with carbapenems had two and a half times more
chances of becoming colonized by CarbR bacteria, than those who didn’t use this type
of antibiotic (Odds Ratio 2.5).
DISCUSSION
A high percentage of 91% CoNS resistant to Oxacillin (92 of 101) is a reflex of a
vigorous increase of such resistance in some CoNS species, as it’s been shown since the
80’s according to the study of Becker; Heilmann; Peters, 2014 [15]. Other recent study
that involved several world regions, such as Europe, North America, Latin America and
Asia, it was also detected high levels of CoNS resistant to Oxacillin, reaching levels of
80-90% depending on the specie [16].
These microorganisms, while naturally colonizing the skin, may gain access to
the blood stream through an entrance pathway, such as IV catheters or valvular
prostheses, causing septicemia specially in patients most vulnerable to infection, such as
ICU patients [14]. Thus, the high level of resistance to Oxacillin among CoNSs is an
alarming data for the population, because any blood infection, caused by these resistant
91
microorganisms, becomes harder to be treated, once this resistance in Sthaphylococcus
spp. strains also gives resistance to all other beta-lactam antibiotics [17,18].
The low proportion of individuals colonized by S.aureus (7.8%- 9 of 114
patients) probably happened due to the use of Mupirocin as a decolonizing agent in
patients that presented colonization by oxacillin-resistant Staphylococcus aureus
(ORSA). The test for ORSA in these patients is made right after the admission in
hospitals’ ICU. As the Collections were conducted in patients with seven or more days
of hospitalization, a part of them had probably already been decolonized of S.aureus
with nasal Mupirocin before the collection, affecting the prevalence of this specie in the
results. A study conducted by Lee et al., 2016 showed that patients taking this drug can
stay for up to 120 days without S. aureus colonization [19].
However, the indiscriminate or extended use of Mupirocin has helped the
emergence of strains resistant to this drug, varying through different percentages around
the world, including among CoNS species. In a study made in a tertiary hospital in
France, it was found a 7.8% percentage of CoNS resistant to to this antibiotic [20],
while in India the proportion reached 28% [21]. The significant value of 13% CoNS
resistant to Mupirocin found in this study alerts about this issue.
Thus, the emergence of CoNS strains resistant to Mupirocin is a concerning
matter, because they can serve as host for resistance genes and act in their dissemination
to S.aureus or other Staphylococcus spp. species [22]. This would lead to a bigger
difficulty in the practice of decolonization of ORSA strains by Mupirocin, which would
become unaffected by the use of this drug.
In what concerns isolated enterobacteria, a rate of 43% (58 of 133) of ESBL was
detected, different from the rates obtained in studies conducted in other countries. This
occurs because there is also a geographical difference in the occurrence of ESBL in each
92
nation. In a study conducted in France, was found a prevalence of 22.3% [23], while in
Uganda, this ESBL-producing enterobacteria index reached 62% [24]. This geographic
difference in ESBL indices occurs because the level of resistant bacteria that arise is
directly proportional to the frequency of exposure to antibiotics in each locality. This
means that the higher the exposure to antimicrobial agents in a given population, the
greater the likelihood of high levels of resistance to these drugs [6].
More than half of P. aeruginosa isolated strains (57.5%- 23 of 40), presented the
mechanism of AmpC resistance detected through phenotypic method. This result was
greater when compared to a research conducted in India, in the same year, in which was
found 42.8% incidence of this mechanism in Pseudomonas spp. isolated from ICU’s
patients [25]. AmpC enzyme is a class C cephalosporinase that can be present in most of
bacteria from the Enterobacteriaceae family, P.aeruginosa and other Gram-negative
organisms. The overproduction of this mechanism of resistance in P. aeruginosa results
in the resistance to almost all beta-lactam antibiotics, with the exception of carbapenems
[26].
Correct laboratory detection of the AmpC mechanism in organisms is very
important, because the development of resistance throughout the treatment is a worrying
reality. This happens because of inducible AmpC-producing strains may exhibit
sensitivity to cephalosporins in vitro, but upon being exposed to an inducing agent in
therapy, these strains may be induced to hyperproduce the enzyme, generating
resistance to the antibiotic and consequent treatment failure [27].
On the other hand, Acinetobacter genus bacteria are nonfermentative bacilli,
being opportunist pathogens that can also quickly obtain resistance genes to
antimicrobial drugs, such as mobile genetic elements. Thus, not long ago, species from
93
this genus still remained susceptible to Carbapenems, but the resistance to this class
became more observed worldwide, being considered a significant health issue [28].
The rate of 81% resistance to Carbapenems in Acinetobacter spp. strains that
were isolated in the study is a fact that proves the emergent global concern relating to
this issue in Brazil and the world. As in these results, other researches conducted
recently detected high levels of resistance to Carbapenems, reaching rates as high as
92% [29]. Thus, the options for the treatment of infections caused by this high
resistance pattern bacteria become limited, being the use of Polymyxins (Colistin and
Polymyxin E) the antibiotic of last resort in these cases, but isolates from bacteria
resistant to Colistin were already reported [28,30].
The significant statistical influence of the use of Carbapenems in colonization of
patients by CarbR bacteria found on this research highlights the influence of
antimicrobial use as a risk factor for the acquisition of high antimicrobial resistant
bacteria. This happens because its constant and indiscriminate use promotes a selective
pressure, killing the most sensitive ones, until it promotes a percentage increase in the
population of the most resistant ones [6].
In the case of this study, patients who used Carbapenems had more chances of
becoming colonized by CarbR bacteria, because its ostensive use not only acted
positively, eliminating the pathogens sensitive to it, but also acted by selecting the
CarbR bacteria, until it promotes a percentage increase in the population of the most
resistant ones, increasing their possibilities of colonization.
The growing number of resistant bacteria shortens more and more the antibiotic
therapy alternatives and promoting a tendency of antibiotic of last resort use. Thus, it is
essential to intensify the implementation of screening procedures even more, such as
surveillance cultures, to minimize the risk of potential hospital- acquired infection
94
outbreaks. Besides, it is urgent that measures are taken on the rationalization of
antibiotics use and on the establishment of contact isolation precautions and sanitation
of ICU environments to prevent the rise and dissemination of these microorganisms.
ACKNOWLEDGEMENTS
We acknowledge the help and commitment to work cooperatively of all staff of
the Hospital Infection Control Commissions, nurses, nursing technicians and direct staff
responsible for the ICUs of the Hospitals in which this research was conducted.
DECLARATION OF INTEREST
None
FINANCIAL SUPPORT
This research received no specific grant from any funding agency, commercial or
not-for-profit sectors.
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