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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA PÓS – GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER PROGRAMA DE HEMATOLOGIA E ONCOLOGIA PEDIÁTRICAS EXPRESSÃO DE CD135 E ALTERAÇÕES NO GENE FLT3 NAS LEUCEMIAS AGUDAS INFANTIS JULIANE MENEZES RIO DE JANEIRO 2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - UFRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA

PÓS – GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

PROGRAMA DE HEMATOLOGIA E ONCOLOGIA PEDIÁTRICAS

EXPRESSÃO DE CD135 E ALTERAÇÕES NO GENE FLT3 NAS

LEUCEMIAS AGUDAS INFANTIS

JULIANE MENEZES

RIO DE JANEIRO 2009

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JULIANE MENEZES

EXPRESSÃO DE CD135 E ALTERAÇÕES NO GENE FLT3 NAS LEUCEMIAS

AGUDAS INFANTIS

Dissertação apresentada à Coordenação da Pós-

Graduação Strictu Sensu em Ciências

Morfológicas como requisito parcial para a

obtenção do Título de Mestre em Ciências

Morfológicas.

Orientadora: Dra. Maria do Socorro Pombo-de-

Oliveira.

RIO DE JANEIRO 2009

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EXPRESSÃO DE CD135 E ALTERAÇÕES NO GENE FLT3 NAS LEUCEMIAS

AGUDAS INFANTIS

JULIANE MENEZES

ORIENTADORA: Dra. Maria do Socorro Pombo-de-Oliveira.

COMISSÃO EXAMINADORA

NOTA CONFERIDA: _____________

__________________________________________________ Prof. Dra. Helena Lobo Borges

Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - UFRJ

__________________________________________________ Prof. Dra. Maria Isabel Doria Rossi

Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - UFRJ

__________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Kneip Fleury Faculdade de Farmácia - UFRJ

__________________________________________________ Prof. Dra. Raquel Maia (Suplente)

Serviço de Hematologia - INCa

_________________________________________________ Prof. Dra. Márcia Cury (Revisora)

Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - UFRJ

RIO DE JANEIRO, 06 DE NOVEMBRO DE 2009.

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MENEZES, Juliane.

Expressão de CD135 e alterações no gene FLT3 nas leucemias agudas infantis / Juliane

Menezes. Rio de Janeiro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, 2009.

Orientadora: Maria do Socorro Pombo-de-Oliveira.

Dissertação de mestrado em Ciências Morfológicas

Palavras – chave: 1. Leucemias Mielóide Agudas. 2. Leucemia Aguda de Lactente. 3.

CD135. 4. FLT3. 5. Relação Imunofenótipo-Genótipo.

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À minha querida mãe, por me ensinar

que com fé e perseverança posso alcançar

todos os meus objetivos.

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AGRADECIMENTOS

As Agências de Fomento (CNPq, CAPES, Fundação Ary Frauzino e SwissBridge) por todo suporte financeiro: pela bolsa para realizar este trabalho e pela verba disponibilizada para pesquisa.

A minha orientadora, Dra. Maria do Socorro Pombo-de-Oliveira, que além de dar-me a oportunidade, gostaria de agradecer a confiança, a experiência e os conhecimentos transmitidos.

Ao professor Dr. Vivaldo Moura Neto e a Dra. Helena Lobo Borges da Pós Graduação em Ciências Morfológicas pela oportunidade e principalmente pela confiança nos momentos finais da tese.

Aos pais destas crianças com leucemia, que mesmo sofrendo, acreditam no nosso trabalho e concordam em dar uma amostra de sangue de seus filhos para nossas pesquisas.

Aos meus companheiros do Programa de Hematologia e Oncologia Pediátrica: Alessandra, Alice, Bruno, Camilla, Eliane, Kelly, Lilian, Marcela, Mariana Emerenciano, Mariana Sant’Ana, Nara e Victória. Em especial, a Bárbara Alemar Beserra, pela amizade e carinho; a Fernanda Azevedo Silva e Gisele Moledo de Vasconcelos, que por tantas vezes me socorreram e tiveram paciência de transmitir seus conhecimentos e experiências.

Aos meus amigos do Programa de Medicina Experimental com os quais compartilhei muitos momentos divertidos. Meu carinho especial para Ana Carolina, Ana Merck, Flávio, Galvani, Heitor, Isabela, João Luiz, Leonardo, Nathalia, Ramom e Viviane. Quero agradecer também a Andréa, Dona Rose, Thais e Suely, por todo carinho que tiveram comigo.

Aos meus amigos pela força, pela palavra amiga, pela alegria, pela companhia e por toda a ajuda. Vocês são muito importantes para mim. Ana Paula Gregório, Beatriz Vasconcello, Jeniffer Dantas, Luciana Moreira, Kátia Candian, Sophie Hodara e tantos outros amigos que passaram pela minha vida.

A Rômulo Braga Areal, pelo amor, pela força e por todos os momentos felizes que passamos juntos. Obrigada por acreditar em mim e nunca me deixar desistir.

A todos os meus familiares. Todos vocês, cada um de uma forma peculiar, iluminaram meu caminho.

A minha mãe, Maria Lucia dos Santos Menezes; minha irmã, Flavia Menezes e Wilma Maria dos Santos por todo o carinho, paciência, amor incondicional e tantas outras coisas que somente nossa família pode nos proporcionar.

A ELE, inteligência e causa suprema de todas as coisas, agradeço acima de tudo, pela benção da vida e pelas oportunidades que tenho.

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“O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano.”

Sir Isaac Newton

(1643-1727)

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RESUMO

As células hematopoéticas normais utilizam um sistema complexo para controlar

a proliferação, diferenciação e morte celular. O controle da proliferação é, em parte,

realizado através da estimulação dos receptores de tirosina quinase pelos seus ligantes.

O gene FLT3 codifica um receptor de tirosina quinase da subclasse III, também

chamado de CD135, que possui um papel crucial na hematopoese normal. As alterações

na via de sinalização do FLT3, podem ser avaliadas tanto pela expressão membranar

aberrante de FLT3, quanto por mutações que promovem ganho de função no gene

FLT3. Nós avaliamos estas alterações em 139 crianças portadoras de LMA através da

citometria de fluxo e genética molecular a fim de buscar uma relação imunofenótipo –

genótipo nestes pacientes. Observamos que 16,4% (n = 21) dos pacientes apresentavam

expressão de CD135 e mutações no FLT3, das quais 12,5% (n=16) eram do tipo DIT e

3,9 % (n=5) do tipo D835. Nos casos que apresentaram FLT3 selvagem, a intensidade

de fluorescência do CD135 foi maior nos casos que tinham a mutação DIT, porém

menor do que os que tinhas a mutação D835 (p=0,029). Consolidar a relação

imunofenótipo - genótipo é um fator importante para agilizar o diagnóstico e ajudar na

orientação terapêutica, desde que os antígenos necessários para a identificação destes

genótipos sejam incluídos no imunodiagnóstico básico.

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ABSTRACT

Normal hematopoietic cells use a complex system to control the proliferation,

differentiation and cell death. The control of proliferation is partly achieved through the

stimulation of receptor tyrosine kinase by its ligands. The FLT3 gene encodes a receptor

tyrosine kinase subclass III, also called CD135, which has a crucial role in normal

hematopoiesis. Changes in the signaling pathway of the FLT3 can be assessed by both

membrane expression of aberrant FLT3, and by mutations that promote gain of function

in the FLT3 gene. We evaluate these changes in 139 children with AML by flow

cytometry and molecular genetics in order to find a relation phenotype - genotype in

these patients. We found that 16.4% (n = 21) of patients had CD135 expression and

mutations in FLT3, of which 12.5% (n = 16) were type ITD and 3.9% (n = 5) type

D835. In cases with FLT3 wild-type, the fluorescence intensity of CD135 was higher in

patients who had the mutation ITD, but smaller than you had a D835 mutation (p =

0.029). Strengthen the relationship phenotype - genotype is an important factor to speed

diagnosis and help guide therapy, since the antigens needed to identify these genotypes

are included in the basic immunodiagnosis.

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ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Subtipos celulares e alterações moleculares nas LAs

Tabela 2: Caracterização clinica e laboratorial das amostras de lactentes

Tabela 3: Associação das alterações genéticas do FLT3 e MLL.

Tabela 4: Aspectos clínicos dos pacientes com alterações genéticas do FLT3.

Tabela 5: Características clínicas e demográficas dos pacientes com LMA

Tabela 6: Associação entre a expressão de CD135 e as mutações do FLT3

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Visão convencional da hematopoiese.

Figura 2: Diferenciação da linhagem linfóide B e seus correspondentes malignos

Figura 3: Diferenciação da linhagem linfóide T e seus correspondentes malignos

Figura 4: Esquematização figurativa da diferenciação da linhagem mielóide com

seus respectivos marcadores de membrana

Figura 5: Freqüência das alterações cromossômicas na LLA infantil

Figura 6: Freqüência das alterações cromossômicas na LMA infantil

Figura 7: Expressão de CD135 na hematopoiese normal.

Figura 8: Estrutura e localização das mutações do FLT3

Figura 9: Painel de AcMo para LLA

Figura 10: Painel de AcMo para LMA

Figura 11: Desenho da reação de PCR para DIT-FLT3 e localização dos primers

foward (F) e reverse(R) no gene

Figura 12: Desenho da reação de PCR para FLT3-D835 e digestão enzimática para

detecção da mutação

Figura 13: Corrida de eletroforese em gel de agarose 3% do PCR FLT3-DIT

Figura 14: Corrida de eletroforese em gel de agarose 3% após a digestão com

EcoRV, para visualizar a mutação D835.

Figura 15: CD135 x status do FLT3.

Figura 16: Histogramas representativos da expressão de CD135 em pacientes com

FLT3

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LISTA DE ABREVIATURAS

AcMo = anticorpo monoclonal aMPO = anti- Mieloperoxidase ATRA = ácido transretinóico c = intracitoplasmático CD = cluster de diferenciação cDNA = DNA complementar CFU = unidade formadora de colônia CFU-E = unidade formadora de colônia de eritrócitos CFU - Eo= unidade formadora de colônia de eosinófilos CFU - GEMM = unidade formadora de colônia de granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos CFU – GM = unidade formadora de colônia de granulócitos e monócitos CFU-Meg = unidade formadora de colônia de megacariócitos CSF = fator estimulador de colônia DEPC = dietilpirocarbonato DMSO = dimetilsulfóxido DNA = ácido desoxirribonucléico dNTP = desoxinucleotídeos DRM = doença residual mínima DTT = ditiotreitol EDTA = ácido etilenodiaminotetraacético EGIL = grupo europeu de imunofenotipagem das leucemias FAB = grupo francês- americano-britânico GAPDH = gliceraldeído - 3 - fosfato desidrogenase HLA-DR = antígeno leucocitário humano-DR inv = inversão Ig = imunoglobulina Kb = quilo base LA = leucemia aguda LLA = leucemia linfoblástica aguda LMA = leucemia mielóide aguda �M = micro molar �l = micro litro ml = mili litro MO = medula óssea p = braço curto do cromossomo pb = pares de bases PBS = solução salina tamponada com fosfato PCR = reação em cadeia da polimerase q = braço longo do cromossomo RNA = ácido ribonucléico RT-PCR = reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa s = superfície SP = sangue periférico t = translocação Taq = enzima Thermus aquaticus TdT = terminal deoxynucleotidyl transferase

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1) INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 15 1.1) BIOLOGIA DAS LEUCEMIAS AGUDAS............................................................ 15 1.2) RELAÇÃO ENTRE LEUCEMIA E HEMATOPOIESE ........................................ 16 1.3) LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA (LLA)................................................................ 18 1.4) LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA (LMA).............................................................. 20 1.5) FUSÕES GÊNICAS ENCONTRADAS NAS LEUCEMIAS AGUDAS ................ 22

1.5.1) Os rearranjos do gene MLL ................................................................................ 25 1.5.2) LLA com a fusão gênica TEL/AML1 ................................................................. 25 1.5.3) LLA com a fusão gênica E2A/PBX1 .................................................................. 26 1.5.4) LMA com a fusão gênica AML1/ETO ............................................................... 26 1.5.5) LMA com a fusão gênica PML/RARA ............................................................... 27 1.5.6) LMA com a fusão gênica CBFβ/MYH11........................................................... 28

1.6) ALTERAÇÕES ADICIONAIS NAS LEUCEMIAS AGUDAS.............................. 29 1.6.1) Duplicação interna em tandem no gene FLT3 ................................................... 32 1.6.2) Mutações pontuais no gene FLT3 ...................................................................... 35

1.7) IMPORTÂNCIA DA DETECÇÃO DE ALTERAÇÕES MOLECULARES .......... 38 2) JUSTIFICATIVA DO ESTUDO ..................................................................................... 39 3) OBJETIVOS .................................................................................................................... 41 3) OBJETIVOS .................................................................................................................... 41

3.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................... 41 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 41 4.1) AMOSTRAS ............................................................................................................. 42 4.2) ANÁLISE MORFOLÓGICA ................................................................................... 43 4.3) IMUNOFENOTIPAGEM ......................................................................................... 43

4.3.1) Técnica de marcação de antígenos citoplasmáticos ........................................... 43 4.3.2) Técnica de marcação de antígenos de membrana .............................................. 44 4.3.3) Aquisição dos dados e análise............................................................................ 47

4.4) ANÁLISES MOLECULARES................................................................................. 47 4.4.1) Purificação de DNA genômico .......................................................................... 47 4.4.2) Detecção das duplicações em tandem do FLT3 (DIT-FLT3) ............................ 49 4.4.3) Detecção da mutação pontual FLT3-D835......................................................... 50 4.4.4) Extração de RNA total ....................................................................................... 52 4.4.5) Tratamento com DNase...................................................................................... 53 4.4.6) Síntese de cDNA ................................................................................................ 54 4.4.7) RT-PCR GAPDH .............................................................................................. 54 4.4.8) RT-PCRs das alterações cromossômicas ........................................................... 55

4.5) ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 55 5) RESULTADOS................................................................................................................ 57

5.1) LEUCEMIA AGUDA DE LACTENTES ................................................................ 57 5.2) LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA .......................................................................... 60

5.2.1) Análise descritiva dos casos............................................................................... 60 5.2.2) Expressão de CD135 .......................................................................................... 61 5.2.3) Status do gene FLT3........................................................................................... 62 5.2.4) Rastreamento das fusões gênicas ....................................................................... 63 5.2.5) Expressão de CD135 e status do FLT3 .............................................................. 63

6) DISCUSSÃO.................................................................................................................... 67 7) CONCLUSÕES................................................................................................................ 74

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8) PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 75 8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 76 9) ANEXOS I ....................................................................................................................... 83 10) ANEXOS II .................................................................................................................... 84 11) ANEXOS III................................................................................................................... 85

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1) INTRODUÇÃO

1.1) BIOLOGIA DAS LEUCEMIAS AGUDAS

A leucemia pode ser definida como a proliferação ou expansão incontrolada de

células hematopoiéticas que perderam a capacidade de se diferenciarem normalmente em

células maduras do sangue. As leucemias resultam da expansão clonal de uma única célula

tronco pluripotente que adquiriu uma série progressiva de alterações genéticas, as quais se

acumulam em um único clone celular, conferindo vantagem proliferativa em relação às

demais células e impedindo seu processo de diferenciação normal e morte subseqüente

(Greaves, 2002).

As leucemias são classificadas a partir de dois fatores: o tipo de células afetadas e a

rapidez do desenvolvimento e progressão da doença. Elas ocorrem pela transformação de

um progenitor com comprometimento para a linhagem linfóide ou mielóide, sendo então

classificadas como linfóides ou mielóides de acordo com critérios morfológicos e

citoquímicos (Kersey, 1997). Também podem ser classificadas como agudas ou crônicas,

de acordo com a fisiopatologia da doença, sendo que nas agudas as células leucêmicas

pertencem ao compartimento de células progenitoras mais imaturas, enquanto que nas

crônicas as células malignas se desenvolvem em estágios de maturação mais tardios.

A expansão dos blastos leucêmicos na medula óssea (MO) reflete uma pancitopenia

no sangue periférico (SP), uma vez que estes blastos secretam substâncias inibidoras e, até

mesmo, promovem uma inibição física impedindo a hematopoiese normal. Logo, a

fisiopatologia primária das leucemias é caracterizada pela insuficiência medular, anemia,

neutropenia e trombocitopenia. Posteriormente, podemos observar a infiltração de órgãos,

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tais como fígado, baço, linfonodos, meninges, pele, testículos e ovários. Como

conseqüência, as maiores causas de morte são infecções, hemorragias e anemias.

A taxa de cura das leucemias agudas (LA) vem crescendo exponencialmente nos

últimos anos graças ao estabelecimento de terapias eficazes adaptadas ao risco de

progressão da doença. O sucesso terapêutico é decorrente da utilização de tecnologias

combinadas com o objetivo de estabelecer o diagnóstico preciso e indicativo de

prognóstico, baseando-se na análise de fatores clínicos, biológicos, genéticos e moleculares

(Greaves, 1999).

O desenvolvimento da metodologia diagnóstica e a análise de grandes séries de

pacientes permitiram identificar fatores prognósticos altamente relevantes, levando à

reclassificação das leucemias de acordo com a origem e linhagem celular, o estágio de

maturação e o tipo de anormalidade citogenética ou molecular envolvida na patogênese da

doença (Mckenna, 2000). Destes, o cariótipo é o mais importante para classificar os

pacientes com LAs em diferentes grupos de risco de falha terapêutica, o que permite o uso

de drogas mais específicas e eficazes. Diversas alterações clonais e anomalias moleculares

foram identificadas nas LAs, sendo a maioria relacionada com o descontrole de vias

funcionais tais como ciclo celular, apoptose e diferenciação através da regulação

transcricional (Cline, 1994).

1.2) RELAÇÃO ENTRE LEUCEMIA E HEMATOPOIESE

A origem e a progressão das leucemias podem ser compreendidas ao se relacionar

os mecanismos leucemogênicos às alterações dos mecanismos homeostáticos normais que

regulam a produção e a diferenciação das células sanguíneas (Enver e Greaves, 1998).

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Durante a hematopoiese normal, uma população de células-tronco hematopoiéticas

(CTH) pluripotentes e auto-renováveis possui a capacidade de originar todos os elementos

figurados do sangue: granulócitos, eritrócitos, monócitos, linfócitos e plaquetas (Figura 1).

A progressão ao longo da cascata de diferenciação é controlada por um complexo

conjunto de fatores de transcrição que regulam a expressão gênica. Este processo se

desenvolve de forma autônoma e pode ser estimulado por sinais resultantes das interações

celulares entre as CTH e as células do estroma, assim como da expressão de moléculas

solúveis (citocinas) ou de superfície (receptores e moléculas de adesão) (Morrison et al.,

1997).

Figura 1: Visão convencional da hematopoiese1. As células-tronco hematopoiéticas (CTH) multipotentes possuem capacidade de auto-renovação e de produzir células precursoras comprometidas com determinada linhagem com potencial de proliferação restrito. UFC-S = unidade formadora de colônia esplênica; PMC = progenitor mielóide comum; PLC = progenitor linfóide comum; PGM = progenitor granulocítico-macrofágico; PME = progenitor megacariocítico-eritróide; CFC = células formadoras de colônias; CFU-E = Unidade formadora de colônia eritróide; Meg = megacariócito; Eo = eosinófilo; G = granulócito; GM = granulócito/ Monócito; M = macrófago; Mas = mastócito.

1 Adaptado de (Hitzler e Zipursky, 2005).

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O acúmulo de alterações genéticas em genes que regulam o processo de

diferenciação, proliferação, reparo e morte celular leva à aquisição de um fenótipo maligno

em que as células adquirem vantagem de sobrevida e deixam de exercer suas funções

normais (Pui et al., 2004).

Estudos recentes sugerem que a transformação maligna ocorre inicialmente em uma

célula com um mínimo comprometimento para linhagem linfóide ou mielóide e não na

célula tronco pluripotente, e que este progenitor acumula alterações genéticas que

culminarão na leucemogênese (Satoh e Ogata, 2006). A análise de clones leucêmicos pode,

portanto, fornecer informações sobre o momento em que ocorreu a transformação maligna

e quais são os mecanismos moleculares envolvidos.

A seguir detalharemos um pouco mais os subtipos leucêmicos mais freqüentes na

infância.

1.3) LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA (LLA)

As LLAs são as neoplasias mais comuns da infância, apresentando um pico de

incidência característico que ocorre entre 2-5 anos de idade, mas podem também ocorrer

nas demais faixas etárias até 21 anos (Sandler e Ross, 1997). Os principais tipos das LLAs

são definidos pela origem linfóide das células, B ou T, sendo subdivididos de acordo com a

etapa maturativa. Para a uniformização de protocolo terapêutico o grupo European Group

for Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) propôs uma classificação para as

LLAs de acordo com a expressão de antígenos celulares nas linhagens B e T, como

ilustrado nas figuras 2 e 3, respectivamente (Bene et al., 1995).

A LLA de linhagem B corresponde a 85 % das LLAs, e é definida pela expressão de

pelo menos dois dos seguintes marcadores citoplasmáticos e de membrana: CD79a, CD22 e

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DIFERENCIAÇÃO NORMAL CORRESPONDENTECORRESPONDENTE

MALÍGNOMALÍGNO

CÉLULATRONCO

LINFÓIDE

LLA LLA ProPro-B-B

LLA-LLA-comumcomum

CÉLULAPRÉ-B LLA PRÉ-B

(µµµµ+)

CÉLULA BIMATURA LLA -B sIg M+

CD34HLADr

CD34CD19HLADrcCD79a

CD19HLADrCD10cCD79a

CD19HLADrCD10cCD22Cµ Ig

CD19HLADrCD22sIgM+κκκκ ou λ λ λ λ

µµµµ

TDT+

µ

µµ

µ

µ

TDT+

TDT+

TDT+

VLA-4

ÓR

OS

LIN

IDE

SSE

CU

ND

ÁR

IOS

SAN

GU

E P

ER

IFÉ

RIC

O

sIgCD19

B

CD19sIgGsIgAsIgEsIgM

B

B

Plasmócito

Y

Y

Linfócito Bde Memória

CD19, podendo ser subdividida em quatro subtipos (Pró-B, Comum, Pré-B e B) de acordo

com o grau de diferenciação das células blásticas (Figura 2). Já a LLA de linhagem T

corresponde a 15 % das LLAs na infância e adolescência, e é definida pela expressão

citoplasmática ou de membrana do CD3 e CD7 conforme o grau de diferenciação tímica.

Ela pode ser classificada em três subtipos de (Pré-T, intermediária e T madura) de acordo

com o grau de maturação da célula (Figura 3).

Figura 2: Diferenciação da linhagem linfóide B e seus correspondentes malignos2. Nesta ilustração podem ser observados os diferentes marcadores imunológicos expressos em cada estágio da diferenciação da célula B.

2 Diagrama elaborado pelo Dr. Geraldo Cavalcanti Júnior.

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TIMÓCITOSINTERME-DIÁRIOS

TIMÓCITOSMEDULARES

CD44(++)

CD44( - )

CD7

CD1aCD2CD4CD8CD7

CD7 CD2 CD4 CD3/TCR CD7 CD2 CD8 CD3/TCR

CD44( + )

CD3

CD3

MEDULA

CÓRTEX

TI

MO

CD44 ( + )

CD7 CD2 CD4CD3/TCR

LINFÓCITO THELPER

CD7 CD2 CD8CD3/TCR

LINFÓCITO TCITOTÓXICO

SA

NG

UE

PE

RIF

ÉR

ICO

Correspondentes malignos

LLA-pré-T

LLAIntermediária

LLA-T Medular

ESTÁGIO

���

CÓRTEX

ESTÁGIO

�����

Lth

Lth LTsc

ÓR

OS

LIN

IDE

S

SE

CU

ND

ÁR

IOS

CD44( + )

DiferenciaçãoNormal

LTscLPL-TSSLNH-TATLL

LPL-TSSLNH-TATLL

Figura 3: Diferenciação da linhagem linfóide T e seus correspondentes malignos3. Nesta ilustração podem ser observados os diferentes marcadores imunológicos expressos em cada estágio da diferenciação da célula T.

1.4) LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA (LMA)

A LMA representa cerca de 15-20% das LAs da infância e 80% entre adultos, sendo

uma doença rara em crianças (Lowenberg et al., 1999). Nos países ocidentais ocorrem em

torno de cinco a seis casos por cada um milhão de crianças com idade de até 14 anos,

representando cerca de 20% das leucemias da infância. Somente na idade perinatal, em

crianças com Síndrome de Down, a LMA é mais freqüente que a LLA.

3 Diagrama elaborado pelo Dr. Geraldo Cavalcanti Júnior.

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A heterogeneidade da LMA, assim como uma possível diferença de comportamento

biológico de diferentes subtipos, motivou o estabelecimento de uma classificação. O grupo

cooperativo Franco-Americano-Britânico (FAB) propôs uma classificação morfológica

baseada nos aspectos citológicos e citoquímicos em 8 subtipos deferentes de LMA (M0-

M7) (Bennett et al., 1976). As LMAs dos subtipos M1 e M2 mostram diferenciação

predominante granulocítica, diferindo uma da outra pelo grau de maturação dos grânulos e

nível de diferenciação celular. O subtipo M3 é caracterizado por uma célula blástica

hipergranular típica ao nível de promielócitos. Os subtipos M4 e M5 apresentam

diferenciação monocítica. Predomínio de diferenciação eritroblástica e megacarioblástica

são características de M6 e M7, respectivamente. Somente os subtipos M0 e M7 são

definidos pelos marcadores imunológicos como aMPO, CD117, CD33/CD13 e

CD41/CD61. Com base nesta classificação e com acréscimo dos testes imunofenotípicos e

citogenéticos, a classificação seguida pela OMS (Organização Mundial de Saúde) tem mais

valor no que se refere aos estudos prognósticos, pois ela tem como base os marcadores

genético-moleculares (Harris et al., 1999). Os marcadores imunológicos que identificam

uma LMA e a distinguem de uma LLA incluem a reatividade com anticorpos dos clusters

CD13, CD33, CD65 e CD117 e a reatividade com anticorpos que reconhecem a proteína

mieloperoxidase (aMPO), incluindo a sua forma proenzimática. Os anticorpos CD13,

CD33, CD65 e aMPO exibem pequena diferença entre os subtipos de LMA, ao passo que

outros anticorpos monoclonais (AcMo) mostram alguma seletividade para células imaturas,

para células mais maduras, para diferenciação granulocítica ou para a diferenciação

monocítica (Bene, 2005). A figura 4 ilustra as diferentes etapas maturativas da linhagem

mielóide e a expressão de marcadores imunofenotípicos.

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CD34

CD33

CD13 CD65 CD15 / CD115 CD66

C

HLADR

CFU-GM Mieloblasto Metamielócito Pró-Mielócito Mielócito Bastão

Figura 4: Esquematização figurativa da diferenciação da linhagem mielóide com seus respectivos marcadores de membrana. 4

1.5) FUSÕES GÊNICAS ENCONTRADAS NAS LEUCEMIAS AGUDAS

A análise cuidadosa das anormalidades nas células blásticas dos pacientes com

leucemia tem um profundo impacto na compreensão das mudanças moleculares envolvidas

nas leucemogênese (Look, 1997). A maioria das alterações cromossômicas nas leucemias é

não-randômica, e são aquisições somáticas de translocações cromossômicas ou inversões

que compreendem 65% das LAs As figuras 5 e 6 ilustram as alterações genéticas mais

freqüentes nas LLAs e nas LMAs, respectivamente. Estes rearranjos estruturais afetam a

expressão de genes de maneira que subvertem os programas normais de proliferação

celular, diferenciação e sobrevivência de forma que culminam em uma transformação

leucêmica.

4 Ilustração realizada pelo Dr. Geraldo Cavalcanti Júnior.

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Figura 5: Freqüência das alterações cromossômicas na LLA infantil5.

Os dados provenientes de estudos epidemiológicos nos permitem estabelecer

associações entre as categorias genotípicas das LAs e suas características imunofenotípicas

(Tabela 1). O conhecimento destas categorias reflete em aplicações práticas que já são

realidade em muitos laboratórios. É possível, por exemplo, monitorar os pacientes com LA

durante e depois do tratamento, para detecção da Doença Residual Mínima (DRM), tanto

pela identificação de marcadores aberrantes por citometria de fluxo como por técnicas de

reação em cadeia da polimerase (PCR) e reação em cadeia da polimerase por transcriptase

reversa (RT-PCR) (Macintyre e Delabesse, 1999; Van Dongen et al., 1999). A presença de

determinadas fusões gênicas (ex. PML/ RARA e BCR/ABL) apontam para a necessidade de

um tratamento específico. As lesões moleculares ajudam também a explicar os mecanismos

etiopatogênicos de determinados subtipos das leucemias (Greaves e Wiemels, 2003).

5 Adaptado de (Pui et al., 2004).

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Figura 6: Freqüência das alterações cromossômicas na LMA infantil6.

Tabela 1: Subtipos celulares e alterações moleculares nas LAs7.

Subtipo Alteração Lesão molecular Frequência (%)

leucêmico cromossômica

LLA pró-B Translocações 11q23 MLL/AF4, /ENL e

outras ~ 85 (LLA de lactentes)

LLA comum Hiperdilpoidia Maior dosagem gênica ~ 35 (LLA cél-B precursora)

t(12;21)(p13;q22) TEL/AML1 ~ 20 (LLA cél-B precursora)

LLA pré-B t(1;19)(q23;p13) E2A/PBX1 ~ 5 (LLA cél-B precursora)

t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL ~ 5 (LLA cél-B precursora)

LLA pró-T 1q-; t(1;14)(p32;q11) SIL/SCL ~ 25 (LLA cél- T precursora)

LMA-M4/M5 Translocações 11q23 MLL/AF6, /AF9. /AF10 ~ 50 (LMA de lactentes)

LMA-M2 t(8;21)(q22;q22) AML1/ETO ~ 15 (LMA em geral)

6 Adaptado de (Giles et al., 2002). 7 Adaptado de (Greaves e Wiemels, 2003).

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A seguir, estão descritos os principais alterações genéticas nas LAs, definidos por

suas características genético-moleculares e as expressões antigênicas freqüentemente

encontradas nos blastos.

1.5.1) Os rearranjos do gene MLL

A proteína codificada pelo MLL (“Mixed Lineage Leukemia”) é um homólogo

humano do Trithorax da Drosophila, que é um regulador crucial do desenvolvimento,

incluindo a regulação da expressão dos genes Hox, conforme mostrado em estudos de

eliminação gênica (Yu et al., 1995; Yu et al., 1998). Geralmente encontrados em LLA pró-

B, os transcritos envolvendo o gene MLL também podem ser vistos na LMA. Nas LLA, o

gene AF4 é o parceiro mais comum entre muitos possíveis parceiros do MLL, sendo

observado em 60-80% dos casos de LAs de lactentes (LAL) (0-2 anos). Os blastos de LLA

com rearranjos do MLL são tipicamente CD19+, CD34+, TdT+ e CD10- e, muitas vezes,

expressam antígenos associados à linhagem mielóide (Ludwig et al., 1998). Um marcador

importante das células leucêmicas que carregam rearranjos do MLL é o homólogo de NG2,

uma molécula de sulfato de condroitina que reage com o AcMo 7.1, freqüentemente

detectado nos casos de LLA assim como nos de LMA. A expressão de NG2 é altamente

sensível e específica para rearranjos no MLL, chegando a alcançar quase 100% de

especificidade nos casos de LLA (Behm et al., 1996).

1.5.2) LLA com a fusão gênica TEL/AML1

A fusão gênica TEL/AML1 pode ser detectada em aproximadamente 25% dos casos

de LLA da infância, despontando como o rearranjo mais freqüente nesta faixa etária

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(Romana et al., 1995; Shurtleff et al., 1995). O fator de transcrição quimérico TEL/AML1

age, assim como o MLL, no controle dos genes da família Hox, fundamentais na

hematopoiese. Os casos de LLA que carregam o transcrito gênico TEL/AML1 apresentam

exclusivamente fenótipo de célula precursora B, sendo a maioria casos de LLA comum.

Estes pacientes são caracterizados por uma baixa contagem leucocitária ao diagnóstico

(<50.000/L) (Borkhardt et al., 1997), e os blastos são tipicamente CD19+, CD34+, TdT+ e

CD10+, ocorrendo em muitos casos a expressão aberrante do CD33 e/ou CD13 (Hrusak e

Porwit-Macdonald, 2002).

1.5.3) LLA com a fusão gênica E2A/PBX1

A fusão gênica E2A/PBX1 ocorre em aproximadamente 5-6% das crianças e, em

menos do que 5% dos adultos com LLA (Hunger, 1996). Existe uma forte correlação entre

esta fusão e os casos de LLA pré-B expressando IgM citoplasmática, embora alguns casos

raros em LLA pró-B, LLA comum, LLA-T e LMA já tenham sido descritos (Raimondi et

al., 1990). O imunofenótipo típico destes casos mostra uma expressão homogênea de

CD19, CD10, CD9 e cIgM, ausência completa de CD34 e, ausência parcial de CD20

(Troussard et al., 1995). A presença desta fusão não é animadora para estes pacientes, pois,

está correlacionada à presença de riscos clínicos como elevada contagem celular, altos

níveis séricos de desidrogenase láctea e envolvimento do sistema nervoso central (Crist et

al., 1990).

1.5.4) LMA com a fusão gênica AML1/ETO

Ela está associada com a LMA do subtipo FAB M2 (20 – 40%), mas também foi

descrita em raros casos em LMA-M1 e LMA-M4. É uma das duas translocações específicas

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mais comuns nas LMAs (7%) (Van Dongen et al., 1999). A conseqüência desta

translocação é que a fusão AML1/ETO possui uma atividade inibitória dominante da

atividade transcricional do gene normal AML1, impedindo este último gene de coordenar a

maturação e a diferenciação normal das células hematopoéticas (Downing et al., 1993;

Downing, 2001). As células blásticas são caracteristicamente positivas para CD13, CD33,

CD34, CD65, CD117, aMPO e HLA-DR. Raros casos são negativos para CD13, CD33 e

CD14, mas positivos para aMPO. O CD11b e o CD15 são expressos principalmente nas

células granulocíticas em maturação. Geralmente há positividade para o marcador de

linhagem B CD19 e muitas vezes para o marcador de células exterminadoras naturais

CD56. A expressão do CD56 pode indicar um prognóstico pior. A coexpressão de CD 19 e

CD34, incomum em outros subtipos de LMA, sugere um diagnóstico de LMA com t(8;21).

Geralmente há negatividade para CD2, CD7, CD14, CD64 e TdT (Hrusak e Porwit-

Macdonald, 2002). Estudos demonstram que esta translocação está associada a uma boa

resposta terapêutica com o uso de citoarabinosídeos (ARA-C) e um relativo bom

prognóstico.

1.5.5) LMA com a fusão gênica PML/RARA

A fusão está diretamente relacionada com a leucemia promielocítica (LMA-

M3/M3v) em 98% dos casos. Esta translocação não se encontra em outros subtipos de

LMA, sendo, portanto exclusiva das LMAs M3 e M3v (Gutierrez et al., 2005). As reações

com CD13, CD33 e aMPO são tipicamente positivas. O HLA-DR e o CD34, que se

mostram positivos nas células de linhagem granulocítica precoces e negativos nos

promielócitos normais, são geralmente negativos. O CD7 é freqüentemente negativo.

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Observam-se reações positivas com CD11b e CD14 numa minoria dos casos. O CD64

geralmente é positivo, ao passo que o CD65 e o CD117 são negativos na maioria das vezes.

O CD11a não é expresso, ao contrário do que freqüentemente ocorre em outras categorias

de LMA. O CD2 é positivo numa significativa minoria dos casos. Quando uma LMA é

negativa para HLA-DR e positiva para CD2, provavelmente pertence à categoria M3/M3v

(Hrusak e Porwit-Macdonald, 2002). Essa aberração envolve a fusão dos genes do receptor

de ácido transretinóico (RARA), que são cruciais para diferenciação mielóide. A descoberta

da sensibilidade dos blastos com esta translocação ao ATRA revolucionou o tratamento dos

pacientes, o que os torna o subtipo de LMA com o maior potencial de cura (Biondi et al.,

1994).

1.5.6) LMA com a fusão gênica CBFββββ/MYH11

Embora possam ocorrer tipos morfológicos FAB-M2, M4 e M5, a apresentação com

a morfologia M4Eo é a mais comum e representa cerca de 3-6% dos casos de LMA (Liu et

al., 1995; Schnittger et al., 2007). A característica do imunofenótipo é sua positividade para

CD13, CD33, CD14, CD15, CD64, CD65, CD117, aMPO e HLA-DR, enquanto que

CD11b é positivo em cerca de um terço dos casos. CD2 pode ser expresso e correlaciona-se

com a expressão de CD11b. CD34 foi comunicado variadamente como sendo positivo em

cerca de um terço dos casos ou na grande maioria dos casos. CD7 não é usualmente

expresso (Hrusak e Porwit-Macdonald, 2002). Esta alteração é geralmente associada a um

bom prognóstico, embora isso não seja universal.

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1.6) ALTERAÇÕES ADICIONAIS NAS LEUCEMIAS AGUDAS

Embora a identificação de alterações cromossômicas seja a base para a abordagem

diagnóstica atual, sozinhas elas não são suficientes para o aparecimento das leucemias

agudas (Schnittger et al., 2002). Torna-se cada vez mais evidente que alterações que

desregulam genes como FLT3 e c-KIT, N-RAS e K-RAS, alterando seus produtos tirosinas

quinases envolvidos na regulação de vias intracelulares de transdução de sinais de morte e

proliferação celular, atuam em colaboração com os fatores de transcrição resultantes das

translocações e são necessárias para a aquisição do fenótipo maligno da leucemia aguda.

Recentemente demonstrou-se que mutações no gene FLT3, que codifica um receptor

tirosina quinase, é uma das alterações genéticas mais freqüentes nas LMAs, tendo sido

posteriormente descrito também nas LLAs, com menor freqüência.

O gene que codifica a proteína FLT3 (“Fms-like tyrosine kinase-3”, também

conhecido como FLK-2 de “fetal liver kinase-2” e STK-1 de “human stem cell kinase-11”)

foi clonado pela primeira vez em 1991 por Matthews e colaboradoes. Este estudo

demonstrou que este gene possui muitas seqüências semelhantes aos demais receptores de

tirosina quinase do tipo III. Este subgrupo de proteínas da família TRKIII que inclui ainda

platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) e KIT, é caracterizado por um domínio

extracelular composto de 5 domínios do tipo imunoglobulina (Ig-like) e por um domínio

citoplasmático do tipo tirosina quinase (Kottaridis et al., 2003).

O gene FLT3 codifica uma glicoproteína de 993 aminoácidos no homem, que é

reconhecida pelo CD135 (Del Zotto et al., 2001). Esta glicoproteina, CD135, é expressa

em células progenitoras hematopoéticas humanas, tendo sido detectada em células

progenitoras da medula óssea (MO) CD34+/CD38-, em progenitores linfóides B

CD34+/CD19+ e em precursores monocíticos CD34+/CD14+/CD64+. Além disso, o CD135

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é altamente expresso dentro da população de timócitos, especialmente nos precursores de

célula T intra-tímica (Rappold et al., 1997) (Figura 7). O ligante de FLT3 foi clonado em

1993 por Lyman e colaboradores. Trata-se de uma proteína transmembrana do tipo 1 ou

proteína livre homodimérica solúvel, sendo expressa em células do microambiente da

medula óssea, incluindo fibroblastos, linhagens precursoras de células mielóides e

linfóides. Tanto as formas solúveis quanto transmembrana podem ativar o domínio tirosina

quinase do receptor FLT3 e estimular o crescimento de células progenitoras na medula e no

sangue (Parcells et al., 2006).

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Figura 7: Expressão de CD135 na hematopoiese normal8. A expressão ocorre principalmente nas células progenitoras linfóides e mielóides, com alguma expressão em células mais maduras da linhagem monocítica. CFU=unidade formadora de colônia; Nk= Natural killer; B=basófilo; GM=granulócito/Monócito; D=dendritica; M=monócito; G=granulócito; Mk=megacariócito; E=eritróide.

Em condições normais, a transcrição do gene FLT3 codifica uma proteína

monomérica, constituída por um domínio extracelular, uma região transmembrana um

domínio justamembrana (JM) e dois domínios tirosina-quinase intracelulares. Em presença

de ligante ocorre a dimerização de monômeros seguida da fosforilação de substratos

efetores de vias intracelulares de transdução de sinal (Figura 8B). As principais vias

8 Adaptado de (Stirewalt e Radich, 2003).

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acometidas pela ativação do FLT3 são a PI3K (phosphatidilinositol 3-Kinase), as vias do

RAS/MAPK (mitogen-activated Kinase protein) e STAT5 (signal transducers and activators

of Transcription 5), resultando no aumento proliferativo e inibição da apoptose (Stirewalt et

al., 2001).

Estudos recentes apontam para a alta expressão da proteína FLT3 selvagem nas

LAs, principalmente nas LLAs B (97%), além das LMAs (87%) e das LLAs T(13%) porém

não se sabe o mecanismo de atuação uma vez que estudos mostraram não haver aumento da

expressão de FLT3 ligante (Yeoh et al., 2002; Kottaridis et al., 2003).

As alterações no gene FLT3 podem ser de 2 tipos: duplicações internas em tandem

ou mutações pontuais. Ambas resultam na ativação constitutiva do receptor independente

de ligante e ativação das vias de transdução de sinais subseqüentes, ocasionando

proliferação celular e bloqueio da diferenciação em estágios precoces do processo de

maturação (Figura 8A). Recentemente foram descritas alterações menos freqüentes em

outras regiões do gene, nos éxons 14, 17 e 20, também conferindo a auto-ativação do

receptor (Jiang et al., 2004; Stirewalt et al., 2004; Reindl et al., 2006).

1.6.1) Duplicação interna em tandem no gene FLT3

A alteração mais freqüente é a Duplicação Interna em Tandem (DIT) nos éxons 14 e

15 de FLT3 (previamente descritos como éxons 11 e 12), que ocorre em 15-35% dos

pacientes com LMA e em 5-10% das LLAs (Thiede et al., 2002; Kottaridis et al., 2003). O

grupo do Dr Nakao foi o primeiro a descrever em 1996 a duplicação em tandem no domínio

justamembrana de um alelo de FLT3 em pacientes com LMA (Nakao et al., 1996). A DIT-

FLT3 pode variar de local dentro dos éxons 14 e 15 ou íntron 14, mas ocorre sempre in-

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frame, ou seja, não altera o marco de leitura, e produz uma proteína com domínio JM sem a

capacidade auto-inibitória, levando à auto-ativação do receptor.

O modelo molecular do funcionamento da proteína alterada foi descrito através de

estudos in-vitro os quais demonstraram a dimerização descontrolada do domínio JM

produzido por DIT-FLT3, o qual perde a capacidade auto-inibitória e permite a dimerização

dos receptores independente de ligante, resultando na auto-fosforilação e promovendo

crescimento autônomo das células mutantes (Figura 8C) (Gilliland e Griffin, 2002).

Foram realizados vários estudos para a determinação do valor prognóstico de DIT-

FLT3 nos pacientes com leucemia aguda (Shih et al., 2002).

Na LMA, a DIT-FLT3 foi descrita em 5-15% das crianças e 25-35% dos adultos

(Schnittger et al., 2002). Foi observada em todos os subtipos FAB, mas nos adultos sua

prevalência não é randômica, sendo rara na LMA M2 e mais prevalente nas LMAs de

cariótipo normal e na M3. Nas crianças a associação com cariótipo normal ou com FAB

M3 é reduzida e especula-se a maior freqüência nos subtipos M1/M2. A importância clínica

das mutações em FLT3 na LMA foi estabelecida a partir da estreita correlação entre a

presença de DIT-FLT3 com leucocitose, alto percentual de blastos e pior resposta

terapêutica (Kottaridis et al., 2001; Liang et al., 2002).

Estudos realizados em pacientes com LMA que apresentavam outras alterações de

bom prognóstico, como a t(8;21) e inv 16 encontraram baixa incidência de DIT-FLT3 e

associação com leucocitose, o que indica que a DIT exerce um efeito biológico proliferativo

nos casos de LMA que supostamente tinham baixo risco de recaída devido à presença

destes genes de fusão. No entanto, nem todos os grupos identificaram alteração de

sobrevida na presença das alterações em conjunto.

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Alguns grupos detectaram ainda a presença de DIT-FLT3 concomitante à

duplicação parcial em tandem do gene MLL (PTD-MLL), a qual apresenta valor

prognóstico ruim quando detectada sozinha e ainda pior com ambas as alterações (Olesen et

al., 2005). Sendo assim o valor prognóstico de DIT-FLT3 associado a outras alterações

ainda não foi bem estabelecido uma vez que a literatura traz trabalhos com DIT associado a

altos níveis de recaída, com os níveis de remissão iguais aos do grupo sem esta alteração,

ou até mesmo associado à boa resposta clínica (Lacayo et al., 2004; Gale et al., 2005).

Foram também observadas diferenças quanto ao valor prognóstico da DIT-FLT3

quando comparada a LMA do adulto e da criança. Estas foram atribuídas ao mecanismo

molecular de perda do alelo selvagem contribuindo para a agressividade do clone

leucêmico. As duplicações em FLT3 são encontradas na maioria dos casos em heterozigose,

mas existem casos de homozigose. Acredita-se que este seja um evento pós-leucêmico que

confira resistência às células, sendo assim a variação na relação entre alelo mutado e alelo

selvagem (taxa alélica) pode ser a explicação para o valor prognóstico adverso encontrado

(Whitman et al., 2001). Recentemente um estudo multicêntrico com a colaboração de

vários países relatou a incidência de DIT em 600 crianças (12%) e não encontrou diferença

evolução clínica em relação ao grupo controle sem a alteração. No entanto o estudo da taxa

alélica revelou impacto significativo da perda do alelo selvagem na sobrevida dos pacientes

com a duplicação (Meshinchi et al., 2006).

Na LLA de origem B, por outro lado, a presença DIT-FLT3 foi descrita em baixa

incidência (1% nos adulto e crianças), com valor prognóstico associado ao baixo índice de

remissão (Armstrong et al., 2004).

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Na LLA de origem T a incidência de DIT-FLT3 descrita na literatura é baixíssima,

porém Van Vlierberghe et al. relatou 2-3% de DIT-FLT3 em crianças com LLA T, com

prognóstico adverso (Van Vlierberghe et al., 2005).

1.6.2) Mutações pontuais no gene FLT3

As mutações pontuais no gene FLT3 acometem a alça de ativação do segundo

domínio quinase, e a mutação mais comum resulta da substituição de um resíduo de ácido

aspártico na posição 835 do éxon 20 por um resíduo de tirosina (D835) (Yamamoto et al.,

2001). A alça de ativação é um componente comum aos receptores tirosina quinase e tem

como função bloquear o acesso de ATP e do substrato ao domínio quinase quando o

receptor está inativo. Com uma mutação pontual nesta região o receptor se encontra auto-

ativado e assim como na presença de DIT, o controle da cascata de sinalização promovido

por FLT3 é perdido, levando à proliferação celular e bloqueio da diferenciação (figura 8D)

(Griffin, 2001).

A mutação foi descrita em cerca de 5-10% dos pacientes com LMA e têm sido

relacionada ao pior prognóstico. Não foi encontrada associação com nenhum subtipo FAB

específico e há relatos de detecção em pacientes com t(15;17) ou mesmo com DIT-FLT3.

No caso da presença das duas alterações em FLT3, a baixa incidência (1,7%) relatada

dificulta a avaliação do valor clínico, no entanto o prognóstico ruim parece prevalecer e

estudos in-vitro sugerem a aquisição de resistência a terapias convencionais e alvo-

específicas para o receptor.

Em bebês e crianças com LLA de origem B a mutação pontual de FLT3 foi

detectada na presença concomitante de alterações no gene MLL (15-18%dos casos com esta

alteração), ainda com valor prognóstico controverso (Taketani et al., 2004). Foi também

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relatada associação de mutações pontuais em FLT3 e crianças com cariótipo hiperdiplóide

(25-28%), com + 50 cromossomos, que normalmente é associado a um bom prognóstico.

Na presença da mutação o risco de recaída aumentou, mostrando mais uma vez o papel

proliferativo de FLT3 (Lacayo et al., 2004).

Na LLA T um trabalho com adultos sugere a associação da presença de FLT3-D835

com a expressão de CKIT/CD117 pelo clone leucêmico, conferindo pior prognóstico.

De maneira geral as alterações em FLT3 são mais freqüentes nas LMAs (10-45%

dos casos) e têm sido consideradas o fator prognóstico independente de maior valor, já

sendo incorporada para determinação de risco e intensificação terapêutica nos protocolos

recém atualizados utilizados nos países desenvolvidos (Frohling et al., 2002; Moreno et al.,

2003). Por mais que haja discordâncias quanto à agressividade da doença, todos os estudos

revelaram maior leucometria e menor taxa de remissão na presença da alteração. Alguns

estudos avaliam também a possibilidade de utilização das alterações em FLT3 como

marcadores tumorais para identificação de doença residual mínima. O fato é que foram

observados ganhos e perdas de mutações no decorrer do tratamento, o que restringe o valor

de FLT3 como marcador indicativo de recaída (Kottaridis et al., 2002; Heidel et al., 2006).

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Figura 8: Estrutura e localização das mutações do FLT39. TM = domínio transmembrana; DIT =

duplicação em tandem; JM = domínio justamembrana; K1 e K2 = domínio tirosina-quinase; P = fosfato; L=ligante.

9 Adaptado de (Stirewalt e Radich, 2003).

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1.7) IMPORTÂNCIA DA DETECÇÃO DE ALTERAÇÕES MOLECULARES

Estudos in vitro comprovaram que tanto as translocações cromossômicas quanto as

alterações em genes codificantes de receptores tirosina quinase, como o FLT3, sozinhas não

são capazes de produzir a transformação maligna e ocasionar a leucemia. Isto reforça a

teoria dos dois eventos de Knudson (“Two Hit Model”) (Knudson, 1996) e tem levado à

busca por potenciais terapias alvo-específicas que restabeleçam a normalidade de ambas as

vias de sinalização desreguladas na doença.

Novos fármacos destinados à inibição da via de ativação de FLT3 têm sido testados

e a combinação com as terapias atuais seria preditiva do sucesso terapêutico das leucemias

agudas, em substituição aos pesados regimes quimioterápicos atuais. No entanto, a

aquisição de mutações no decorrer do tratamento tem representado um empecilho aos

fármacos testados, o que deve ser sanado em breve com o avanço das pesquisas com

leucemias (Kaspers e Creutzig, 2005).

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2) JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

Do ponto de vista clínico, é de extrema importância que se tenha o diagnóstico

rápido e a classificação biológica precisa das leucemias agudas para orientação terapêutica.

Por isso, a imunofenotipagem através da citometria de fluxo se tornou uma ferramenta

extremamente importante para o diagnóstico das LAs. Trata-se de uma técnica rápida, que

pode direcionar as definições do tratamento inicial, enquanto se aguardam os resultados dos

testes moleculares mais laboriosos. Dentro deste contexto, nós estamos propondo um

algoritmo de testes capazes de direcionar protocolos terapêuticos baseados no padrão

imuno-molecular das células leucêmicas. Para viabilizar nossa proposta, contamos com um

considerável número de amostras biológicas de Leucemias Agudas, algumas consideradas

doenças raras na infância.

Conforme descrito previamente, o padrão imuno-molecular, as informações

epidemiológicas e dados etiopatológicos consistentes sugerem que as leucemias são

causadas por mecanismos multifatoriais. Durante a evolução de uma célula progenitora, é

possível que ocorra uma anormalidade genômica e, outros fatores celulares ou moleculares,

que favoreçam a expansão deste clone de células defeituosas. Estas células são

caracterizadas por um fenótipo definido por moléculas de superfície celular e pela etapa de

diferenciação do precursor hematopoético. A via tirosina-quinase vem sendo alvo de

tratamento terapêutico em complementação aos fármacos quimioterápicos atuais. Dentro

deste contexto, resolvemos adicionar ao painel de diagnóstico de leucemias o AcMo que

reconhece o receptor tirosina-quinase CD135 (expressão de membrana do FLT3), a fim de

caracterizar uma possível relação de expressão do receptor com as possíveis mutações do

gene FLT3.

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Como ponto de partida, que justificou este projeto, nos baseamos nas observações

que indicam um papel ativo de uma ou mais mutações adicionais nos casos de leucemias

com rearranjos do gene MLL. Em número substancial de casos de leucemias em lactentes

diagnosticados com LLA-MLL positivo, estão associadas às alterações cromossômicas

adicionais com mudanças genéticas sutis. Dentre estas alterações 20% das LALs

apresentam mutações no domínio de ativação do gene FLT3.

Os estudos realizados até o momento nos ajudaram a entender melhor a biologia das

mutações deste gene e como elas afetam a clinica do paciente, porém muitas questões

referentes à etiologia destas mutações e como elas induzem a leucemogênese ainda

precisam ser esclarecidas. Desta maneira, nosso estudo propõe uma avaliação entre a

expressão membranar das células afetadas e o padrão molecular.

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3) OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

� Explorar a associação entre a expressão antigênica do CD135 na membrana celular

e as possíveis mutações do gene FLT3 no diagnóstico das Leucemias Agudas na

infância.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Determinar a distribuição de freqüência e intensidade antigênica do CD135 em

blastos de crianças portadoras de LMA;

� Determinar a ocorrência de mutações no gene FLT3 em leucemias de lactentes e em

crianças portadoras de LMA, independente da idade;

� Analisar a associação entre as alterações moleculares e o perfil imunofenotípico das

células leucêmicas.

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4) MATERIAL E MÉTODOS

4.1) AMOSTRAS

Foram incluídas nesta análise 298 amostras de aspirados de MO de crianças

portadoras de LA, com faixa etária entre 0 e 21 anos, coletadas entre 2005 e 2008 e isentos

de tratamento quimioterápico prévio. Amostras destes pacientes foram obtidas após exames

clínicos e hemogramas sugestivos de leucemia e encaminhadas, para fins diagnósticos, ao

laboratório do Centro de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro. Foram

excluídos do estudo os pacientes portadores de LMA secundária, com história clínica de

mielodisplasia, com Síndrome de Down e casos de Leucemia Mielóide Crônica (LMC) em

crise blástica mielóide. Estas amostras nos foram enviadas juntamente com dados

demográficos e clínicos de cada paciente.

A autorização para utilização destas amostras em pesquisas foi solicitada ao

responsável legal da criança / adolescente, através da assinatura de um “Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido” (TCLE). O projeto foi devidamente aprovado em 14

de abril de 2006 pelo comitê de ética em pesquisa (CEP) do INCA sob o número de

protocolo 005/06.

As amostras de MO foram coletadas em seringas estéreis e colocadas em tubo

vacutainer esterilizado (5,0 -10,0 ml) com anticoagulante EDTA e enviadas para o nosso

laboratório juntamente com as lâminas contendo os esfregaços para a realização da análise

morfológica.

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4.2) ANÁLISE MORFOLÓGICA

A análise morfológica foi realizada pela coloração convencional usando May-

Grünwald-Giemsa complementada pela técnica citoquimica através do Negro de Sudan. Os

critérios de diagnóstico aplicados seguiram as orientações da Organização Mundial de

Saúde (Harris et al., 1999).

4.3) IMUNOFENOTIPAGEM

As amostras foram manipuladas cuidadosamente para separação de plasma,

alíquotas para extração de RNA e DNA, e para imunofenotipagem. Após a retirada do

plasma, a amostra foi reconstituída com o meio de cultura RPMI contendo 10% de soro

fetal bovino.

4.3.1) Técnica de marcação de antígenos citoplasmáticos

As amostras foram incubadas previamente com 10% de soro AB por 20 minutos.

No tubo de FACS colocou-se 50 �L de suspensão celular acrescido de 500 �L de solução

de lise FACS Lysing Solution® (BD) e a mistura foi incubada por 15 minutos, à

temperatura ambiente e protegido da luz. Após este tempo, as células foram lavadas com

3mL de PBS e centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. Descartado o sobrenadante, foram

adicionados 500�L de solução detergente TWEEN 20 a 0,5% (BD) para permeabilizar a

membrana celular. Centrifugou-se novamente por 5 minutos a 1500 rpm e o sobrenadante

foi desprezado. Para a marcação foram utilizados 10 �L dos AcMos (aMPO, CD13, CD3,

CD79a, CD22, TDT e IGM) por 20 minutos no escuro e de acordo com fluorocromo

conjugado (FITC, PE ou Cy/PerC5) (Figura 9 e 10). Um tubo contendo os controles

isotípicos foi feito para cada uma das amostras. As células foram lavadas por duas vezes

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com 3mL de PBS, centrifugadas por 10 minutos a 1500 rpm. Após descartar o

sobrenadante, as células foram ressuspensas em 500 �L de PBS e lidas no citômetro de

fluxo.

A partir dos resultados desta marcação citoplasmática, as células são categorizadas

como pertencentes à linhagem B, T ou mielóide. Dependendo deste resultado, elas foram

submetidas a um segundo painel, desta vez de membrana, que também pode ser observado

nas figuras 9 e 10. Esta segunda marcação foi usada para definição da maturação celular de

acordo com os critérios EGIL.

4.3.2) Técnica de marcação de antígenos de membrana

À 50 �L de suspensão celular, já incubado com o soro AB, foram adicionados os

AcMo (Figura 9 e 10) conforme a concentração pré-estabelecida. Um tubo contendo os

controles isotípicos foi feito para cada uma das amostras. O tubo foi homogeneizado e

incubado por 20 minutos, à temperatura ambiente e protegido da luz. Após o tempo de

incubação, foram adicionados 500 �l de solução de lise FACS Lysing Solution® (BD) e as

células incubadas por 15 minutos, no escuro. As células foram lavadas por duas vezes com

3mL de PBS, centrifugadas por 10 minutos a 1500 rpm. Após descartar o sobrenadante, as

células foram ressuspensas em 500 �L de PBS e lidas no citômetro de fluxo.

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Resultado dos Marcadores Citoplasmáticos

aMPO neg

CD79a pos

CD13 neg

CD3 neg

e/ou TdT pos

IgM pos

ou neg

CD22 pos

Marcadores de Membrana

FITC PE PC5 ou Cy

1 - - CD45

2 CD34 CD19 CD45

3 CD61 CD19 CD45

4 CD58 CD19 CD45

5 CD58 CD34 CD45

6 CD10 CD19 CD45

7 - - CD19

8 CD38 CD22 CD19

9 CD34 CD22 CD19

10 CD10 CD20 CD19

11 CD34 HLA-DR CD19

12 CD58 CD10 CD19

13 - CD33+13 CD19

14 CD34 CD135 CD19

15 sIgM CD20 -

16 CD4 CD8 CD3 (Cy)

17* CD34 7.1 (NG2) CD45

Figura 9: Painel de AcMo para LLA10. *Acrescentar este tudo nos casos de lactentes.

10 Fonte: (Pombo-De-Oliveira, 2008)

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Resultado dos Marcadores Citoplasmáticos

aMPO pos

CD79a neg

e/ou CD3 neg

CD22 neg

TdT pos / neg

IgM neg

CD13 pos

Marcadores de Membrana

FITC PE PC5 ou Cy

1 CD45

2 CD34 CD33+13 CD45

3 CD33 CD56 CD45

4 CD42 CD41 CD45

5 CD33+13 CD19 CD45

6 CD4 CD8 CD3

7 CD34 CD117 CD45

8 CD33+13 CD135 CD45

9 CD15 CD14 -

10 HLA-DR CD11b -

11 CD61 Glico A -

12 CD33+13 HLA-DR -

13 CD33 CD7 -

Figura 10: Painel de AcMo para LMA11.

11 Fonte: (Pombo-De-Oliveira, 2008).

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4.3.3) Aquisição dos dados e análise

A expressão antigênica foi analisada utilizando o citômetro de fluxo FACScalibur

(BD). O programa Cellquest (BD) foi utilizado para a aquisição e posterior análise dos

dados. Pelo menos 10.000 eventos / tubo foram adquiridos. O aparelho foi setado de acordo

com os parâmetros utilizados para LAs. O gate de células foi feito nas células viáveis, com

base os parâmetros FSC x SSC, e combinadas com a exclusão de células normais,

utilizando o tubo de CD45. A expressão antigênica dos marcadores foi considerada positiva

quando acima de 20% para os marcadores de membrana e de 10% para os marcadores

citoplasmáticos (Lucio et al., 2001; Del Vecchio et al., 2004). Para melhor avaliar a

expressão antigênica do CD135, foram avaliados também a média de intensidade de

fluorescência (MFI) e o canal de pico (CP).

4.4) ANÁLISES MOLECULARES

As amostras foram mantidas congeladas em freezer -80ºC ou em tanque de

nitrogênio líquido, conforme rotina do laboratório, até o momento das análises moleculares.

4.4.1) Purificação de DNA genômico

O DNA genômico foi extraído seguindo protocolo padrão (Miller, 1988). No início

do procedimento adicionou-se TLH (tampão de lise de hemácias) previamente gelado em

um volume 3,5 vezes o volume total de sangue homogeneizou-se bem e se refrigerou em

um recipiente com gelo por pelo menos 30 minutos. Posteriormente, centrifugou-se por 20

minutos a 6000 rpm numa temperatura de 4°C, a seguir, descartou-se o sobrenadante e

lavou-se o pellet com 300 �l de TLH, a fim de retirar o excesso de hemácias junto aos

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leucócitos. Homogeneizou-se até que o pellet estivesse solto e limpo, subseqüentemente,

centrifugou-se por 10 minutos a 6000 rpm.

O procedimento seguiu com a ressuspensão do pellet em 300 �l de TLN (tampão de

lise de núcleo), dissolveu-se completamente o pellet e em seguida adicionaram-se 1,5 �l de

SDS 10,0 % e 1,0 �l de proteinase K, homogeneizou-se para posterior incubação over night

a temperatura de 56°C. Após a incubação adicionou-se 60 �l de NaCl 5,0 M e centrifugou-

se por 30 minutos numa rotação de 6000 rpm a 4°C. Ao término da centrifugação o

sobrenadante foi retirado e passado para um novo tubo onde se adicionou em torno de 900

�l de etanol absoluto que tornou o DNA insolúvel provocando sua precipitação. Houve

homogeneização vertendo o tudo e se incubou por 30 minutos a -80°C.

Em seguida foi centrifugado por 30 minutos numa rotação de 1000 rpm a uma

temperatura de 4°C e então o etanol absoluto foi dispensado e se acrescentou 1000�l de

etanol 70,0 % (que teve a função de retirar o excesso do sal). Centrifugou-se novamente

por 5 minutos com uma rotação de 10000 rpm (4ºC).

O procedimento foi encerrado com o descarte do etanol 70% e a adição de 30,0-

50,0 �l de TE (10mM Tris pH 8,0; 1,0 mM EDTA Na2) para posterior incubação por 30

minutos a 68°C, a fim de diluir totalmente o DNA. O armazenamento da solução resultante

foi feito a 4°C.

Após a extração do DNA, realizou-se a quantificação deste. Para tanto se utilizou

um espectrofotômetro (NanoDrop1000), que possuía um programa específico para

quantificação de DNA. O fator de diluição foi ajustável, a unidade de concentração foi

ng/µl, as absorbâncias utilizadas foram de 260 nm e 280 nm. Para a realização da

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quantificação utilizou-se 1,0 µl de DNA. A concentração do DNA foi dada de modo

automático pela máquina, de acordo com o programa pré-existente nesta.

4.4.2) Detecção das duplicações em tandem do FLT3 (DIT-FLT3)

Foram utilizados iniciadores previamente descritos, para amplificação dos exons 14

e 15 do gene FLT3 (Figura 11)(Nakao et al., 1996). Foram amplificados 100ng de DNA

num volume final de 50 �L contendo 50mM KCL, 10mM Tris-HCL, 2mM MgCL2, 200

�M de cada DNTP, iniciadores 11F e 12R (0,5 �M de cada), 1U de Taq- DNA polimerase

(Promega). A reação consistiu de incubação inicial de 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de

desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 1 minuto e extensão a 72°C

por 2 minutos, seguidos de extensão final de 72ºC por 8 minutos. Foi utilizado um

termociclador (PCR – System 9700 Gene Amp, Applied Biosystems, EUA).

Os resultados foram avaliados em gel de agarose 3%, contendo 0.5 �g/mL de

brometo de etídeo e visualizados sob luz ultravioleta. As amostras normais apresentavam

apenas uma banda de 314 pares de bases correspondente ao gene selvagem. Os fragmentos

maiores que o selvagem foram considerados mutantes e apresentavam tamanhos variados

devido ao número diferente de duplicações em tandem presentes. A detecção de dois ou

mais fragmentos diferentes do tamanho esperado para o alelo selvagem foi interpretada

como presença de mais de um alelo mutado, com número diferente de duplicações em cada

um. Para fins de avaliação da metodologia, as duas primeiras amostras com produtos não-

digeridos foram cortadas do gel, purificadas e seqüenciadas no seqüenciador automatizado

MegaBACE 1000 (GE HealthCare – Amersham, Piscataway, NJ). Os resultados do

sequenciamento confirmaram os achados do PCR.

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Figura 11: Desenho da reação de PCR para DIT-FLT3 e localização dos primers foward (F) e reverse (R) no gene12. TK1 e TK2 = domínios tirosina kinase; JM = domínio justamembrana; DIT = duplicação em tandem.

4.4.3) Detecção da mutação pontual FLT3-D835

As mutações FLT3-D835 foram detectadas por ensaio de PCR seguido de

fragmentação por enzima de restrição polimorfismo – específica (RFLP) (Figura 12). Os

iniciadores utilizados foram previamente descritos (Yamamoto et al., 2001). Foram

amplificados 100ng de DNA num volume final de 50 �L contendo 50mM KCL, 10mM

Tris-HCl, 2mM MgCL2, 200 �M de cada DNTP, iniciadores D835F e D835R (0,5 �M de

cada), 1U de Taq-DNA polimerase (Promega) e água deionizada estéril para completar o

volume.A reação utilizou o termociclador (PCR – System 9700 Gene Amp, Applied

Biosystems, EUA), seguindo o ciclo: 95ºC por 7 minutos para a desnaturação inicial, 35

ciclos de 94ºC por 30 segundos, 61ºC por 30 segundos, e 72°C por 45 segundos, e uma

extensão final de 72°C por 10 minutos.

Os resultados foram avaliados em gel de agarose 3%, contendo 0,5 �g/mL de

brometo de etídeo e visualizados sob luz ultravioleta, visualizando-se uma banda única de

12 Adaptado de (Parcells et al., 2006).

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114 pares de bases em todos os casos amplificados. Sabendo-se que a seqüência codificante

de D835 compreende GATA, sítio de atividade endonuclease da enzima EcoRV, foi

utilizada a técnica de RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) para a detecção da

mutação pontual de FLT3. A digestão de 10�L do produto amplificado foi realizada com a

enzima de restrição EcoRV (New England Biolabs) por 12 horas a 37ºC de acordo com

recomendações do fabricante. Utilizou-se 2,5U de enzima e 2�L de seu buffer para cada de

10�L de produto, completando-se com água deionizada para um volume final de 15�L. Os

produtos digeridos foram posteriormente analisados em gel de agarose 3%. As amostras

sem a mutação sofriam digestão completa pela enzima, resultando em duas bandas de 68 e

46 pares de bases. As amostras com mutação apresentaram a banda de 114pb parcial

(heterozigoto) ou totalmente não digerida (homozigoto), em virtude da mutação de uma

base alterada no sítio enzimático. A figura 10 esquematiza a reação de RFLP-PCR. Para

fins de avaliação da metodologia, as duas primeiras amostras com produtos não-digeridos

foram cortadas do gel, purificadas e seqüenciadas no seqüenciador automatizado

MegaBACE 1000 (GE HealthCare – Amersham, Piscataway, NJ). Os resultados do

sequenciamento confirmaram os achados do RFLP.

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Figura 12: Desenho da reação de PCR para FLT3-D835 e digestão enzimática para detecção da mutação13

. TXD1 e TXD2 = domínios tirosina kinase; JM = domínio justamembrana; pb = pares de base.

4.4.4) Extração de RNA total

As amostras de RNA total foram obtidas através de técnica de extração com o

reagente comercializado TRIzol� Reagent (Invitrogen life technologies). Anteriormente à

extração do RNA, propriamente dita, fêz-se à lise das hemácias nas amostras de para não

prejudicar as análises. Acrescentaram-se 500µl de solução de lise (10mM TRIS pH 7,6;

5mM MgCl2 pH 8,0; 10mM NaCl) e homogeneizou-se invertendo os tubos; incubou-se por

10minutos a temperatura ambiente (25ºC); depois se centrifugou à 12,500xg (Centrifuge

5415D, eppendorf) por 10 minutos; após a centrifugação, foi retirado o sobrenadante e

iniciada a extração a partir do pellet de células que permaneceu no tubo. A esse pellet

foram adicionados 1000µl de trizol e homogeneizada a solução.

Para a separação das fases, foi preciso incubar essa amostra já homogeneizada por 5

minutos de 15 a 30º C (temperatura ambiente) para permitir a dissociação completa dos

complexos de nucleoproteína.

13 Adaptado de (Yamamoto et al., 2001).

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Adicionaram-se 200µl de clorofórmio, agitando vigorosamente com as mãos por 15

segundos. As soluções foram incubadas de 15 a 30º C por 2 a 3 minutos e posteriormente

foram centrifugadas a 12,000 x g por 15 minutos a 4º C (Centrifuge 5402, eppendorf).

Depois da centrifugação, a mistura foi separada em 3 fases constituídas de um pellet rosa

(fenol-clorofórmio), uma interfase esbranquiçada e uma fase aquosa incolor (o RNA

aparece exclusivamente na fase aquosa). A fase aquosa foi transferida para um tubo livre de

RNAse com cuidado para não haver contaminação com DNA e proteínas que estão na

outras fases. O RNA foi precipitado da fase aquosa misturando a esta 500µl de álcool

isopropílico. As amostras foram incubadas de 15 a 30º C por 10 minutos e centrifugadas a

12,000 x g por 10 minutos a 4º C. O precipitado de RNA freqüentemente é visto após a

centrifugação como um pellet gelatinoso no fundo do tubo. O sobrenadante foi desprezado

e o pellet foi lavado com 1000µl de etanol 75%. A amostra foi misturada no vortex e

centrifugada a 7,500 x g por 5 minutos a 4º C, retirado o sobrenadante, secado o precipitado

e acrescentado 20µl de água DEPC. Para homogeneizar, incubou-se por 10minutos à 55-

60ºC. O RNA extraído foi então quantificado. Para tanto se utilizou um espectrofotômetro

(NanoDrop1000), que possuía um programa específico para quantificação de RNA, neste

programa o fator de diluição foi ajustável, a unidade de concentração foi ng/µl, as

absorbâncias utilizadas foram de 260 nm e 280 nm.

4.4.5) Tratamento com DNase

O RNA foi tratado com o kit Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (Invitrogen

life technologies) para eliminar o DNA contaminante. Para isso foi preparada uma solução

contendo de 3 a 5 µg de RNA total, 1µl de 10X DNase Reaction Buffer, 1µl de DNase I

Amp Grade (1 unidade) e água DEPC para completar 10µl de solução final. Esta solução

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foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente a DNase I foi

inativada adicionando-se 1µl de 25mM EDTA. A solução foi aquecida por 10 minutos a

65º C. Desta forma o RNA está pronto para a síntese do cDNA.

4.4.6) Síntese de cDNA

A síntese do cDNA foi feita a partir do protocolo do kit First-Strand cDNA

Synthesis (Amersham Biosciences). Colocou-se o RNA, já tratado com DNAse, em um

tubo livre de RNAse e adicionou-se, quando necessário, água DEPC para deixar a solução

de RNA com um volume adequado, de acordo com as proporções estabelecidas da reação.

Quando o volume da solução de RNA era menor ou igual a 8�l, foi usado 5�l do bulk first-

strand reaction mix, quando este volume era maior do que 8�l foi usado 11�l deste último.

Esta solução de RNA foi aquecida a 65º C por 10 minutos e depois resfriada no gelo. Foi

adicionado 1µl de DTT, 1µl do oligonucleotídeo pd(N)6 e o volume apropriado de bulk

first-strand cDNA reaction mix. Pipetou-se várias vezes e incubou-se a solução a 37º C por

1 hora.

4.4.7) RT-PCR GAPDH

Para testar a qualidade do c-DNA realizou-se uma reação de RT-PCR utilizando o

gene GAPDH, que é constitutivamente expresso em níveis elevados nos tecidos

hamatopoeticos e não-hematopoeticos.

As concentrações dos reagentes para uma solução final de 20µl foram de 1µl de c-

DNA; 200µM de dNTP; 0,8µM dos oligonucleotídeos específicos (F-

5’TGACCCCTTCATTGACCTCA3’ e R-5’AGTCCTTCCACGATACCAAA 3’); tampão

para PCR 1,0X; concentração de 1,5mM de MgCl2; 1 unidade da enzima Taq polimerase

(Promega). Os ciclos e as temperaturas da reação foram: desnaturação inicial à 94ºC por 3

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minutos; desnaturação 94ºC por 30 segundos; anelamento 60ºC por 60 segundos; extensão

72ºC por 45 segundos; e depois de 35 ciclos uma extensão final à 72ºC por 10 minutos. O

resultado foi checado em gel de agarose 1,5% corado com brometo dietídio. O produto

esperado possui 419 pares de bases.

4.4.8) RT-PCRs das alterações cromossômicas

Foram realizadas reações simples de RT-PCR, contendo os oligoprimers específicos

para as alteraçõesgenéticas mais freqüentes nas LAs (BCR-ABL; MLL-AF4; TEL-AML1;

PBX1-E2A; PMLRAR�, AML-1-ETO, CBF � -MYH11) seguindo o protocolo Biomed-1

Concerted Action (Van Dongen et al., 1999). Como controle positivo foram utilizadas

linhagens celulares e/ou amostras de pacientes leucêmicos cujas alterações foram

identificadas previamente pela citogenética. O controle negativo foi obtido de pacientes

não-leucêmicos. As reações tiveram o volume final de 50µl e foram utilizados 3µl de c-

DNA. A concentração final dos reagentes foi de 400nM para os oligonucleotídeos

específicos; 200µM para dNTP; 2,5mM para MgCl2 ;1 unidade da enzima Taq por 50µl de

volume e PCR buffer 10x (20mM Tris HCl, 50 mM KCl, pH 8.3) diluído para 1 vez

(Promega). Foi utilizado nos experimentos o termociclador Gene Amp PCR System 9700

(Applied Biosystems). A visualização das bandas resultantes se deu por eletroforese em gel

de agarose 1,5% , contendo brometo de etídio.

4.5) ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada através do programa SPSS 13.0 (SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA, 2004). Para a avaliação estatística das freqüências e das associações

entre os dados clínicos e biológicos e a presença ou ausência das anormalidades genéticas,

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foi utilizado o teste Pearson Chi-Square. Um valor de p menor ou igual a 0,05 foi

considerado significativo.

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5) RESULTADOS

5.1) LEUCEMIA AGUDA DE LACTENTES

No total, 159 amostras de lactentes com LA (108 LLA, 48 LMA e 3 LA

bifenotípicas) foram rastreadas para a presença das mutações D835 e DIT no gene FLT3. A

média de idade ao diagnóstico nesta coorte foi 11,3 meses. Embora tenham sido incluídos

os diferentes subtipos de LLA e LMA, houve uma predominância de crianças com menos

de 13 meses, com alta leucometria, imunofenótipo pró-B e MLL positivo. Dentro das

LMAs, os subtipos M4 e M5 foram responsáveis por 42% dos casos, seguidos do M7.

Nenhum caso foi diagnosticado com o subtipo M3. Além dos rearranjos do gene MLL,

foram observadas alterações genéticas e cromossômicas tais como hiperdiploidia (n=9),

TEL/AML1 (n=4) e E2A/PBX1 (n=3) (Tabela 2).

Cerca de 7,5% dos pacientes continham anormalidades no FLT3. Nenhuma mutação

foi encontrada nos paciente não-leucemicos. Dentre os pacientes MLL+, a mutação do

FLT3 estava presente em 6% dos casos (n=5). Quatro mutações foram encontradas no

domínio de ativação do FLT3 entre os lactentes com MLL rearranjado, representando 5%

dos casos. Foram encontradas 2 mutações D835 e 5 DITS-FLT3 nos pacientes com o MLL

selvagem. Somente uma DITs-FLT3 foi encontrada dentre os pacientes MLL rearranjados

(Tabela 3). Este paciente, diagnosticado com LMA-M5, apresentou alta leucometria.

Em outro paciente, diagnosticado com LLA comum, foi detectada a hiperdiploidia,

além da DIT- FLT3. As idades dos pacientes que apresentaram algum tipo de alteração do

FLT3 variaram de 1 a 22 meses, e a maioria apresentava alta leucometria e elevada

porcentagem de blastos. Não foi observada nenhuma diferença estatística significante em

relação ao gênero (5 masculinos, 6 femininos).

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Tabela 2: Caracterização clinica e laboratorial das amostras de lactentes.

n (%)

Subtipo de LA

LLA 108 (67,9)

LMA 48 (30,1)

LA bifenotípica 3 (2)

Idade (meses)

0-12 95 (58,7)

13-24 64 (40,3)

Gênero

Masculino 86 (54,1)

Feminino 73 (45,9)

Leucometria (x 109/L)

< 50.0 72 (45,3)

>50.0 87 (54,7)

Subtipos de LLA

pró-B 51 (47,2)

Comum 42 (38,9)

pré-B 6 (5,6)

pró-T 9 (8,3)

Status do MLL*

Rearranjado 82 (54,3)

Não-rearranjado 69 (45,7)

Outras alterações adquiridas

Hiperdiploidia 9 (47)

TEL/AML1 4 (21)

E2A/PBX1 3 (16)

SIL/TAL1 1 (5,3)

CBFB/MYH11 1 (5,3)

AML1/ETO 1 (5,3) * O status do MLL não pode ser avaliado em 8 casos. LLA = leucemia linfóide aguda, LMA = leucemia mielóide aguda, LA = leucemia aguda.

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Tabela 3: Associação das alterações genéticas do FLT3 e MLL.

FLT3 selvagem

N (%) FLT3 D835

N (%) p FLT3 –DIT

N (%) p

MLL não-rearranjado 67 (46,2) 2 (33,3) 5 (83,3)

MLL rearranjado 78 (53,8) 4 (66,7) 0,688 1 (16,7) 0,093

Total 145 6 6 *DIT= duplicação in tandem.

A tabela 4 mostra as principais características dos pacientes que continham

mutações do FLT3. Os dados demográficos dos pacientes com mutações do FLT3 não

diferiram dos demais pacientes. Por exemplo, pacientes com anormalidades do FLT3 não

eram significativamente mais novos do que os pacientes sem tais anormalidades, sendo que

a média de idade dos casos mutados e selvagens foram 10,94 e 12,08 meses,

respectivamente (p= 0,572). Em contraste, os casos FLT3 mutados exibiram uma

leucometria significantemente maior do que os pacientes selvagens (p=0.047).

Tabela 4: Aspectos clínicos dos pacientes com alterações genéticas do FLT3.

Paciente Idade Gênero Leucometria blastos Subtipo LA Mutação FLT3 MLL 1 2 M 192,1 92 pró-B D835 R 2 12 F 80,1 80 M1 D835 R 3 5 F 155,1 95 pró-B D835 R 4 21 F 107,1 90 M7 D835 R 5 11 M 55 91 Comum D835 NR 6 21 F 157 63 M1 D835 NR 7 17 F 354,1 94 M5 DIT R 8 5 M 220,1 60 Comum DIT NR 9 1 F 58,7 35 Bifenotípica DIT NR 10 22 M 380,1 96 pró-T DIT NR 11 15 F 4,4 28 LMA DIT NR 12 14 M 75 83 Comum DIT NR Idade em mêses; M=masculino; F=feminino; leucometria x109/L; % de blastos; LA=leucemia aguda; R=rearranjado; NR=não rearranjado.

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5.2) LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA

5.2.1) Análise descritiva dos casos

Nesta parte do estudo, foram analisadas 139 amostras de crianças (2-21 anos) com o

diagnóstico de LMA. As características clínicas e demográficas destes pacientes podem ser

observadas na tabela 5. A média de idade foi 9,41 anos e da leucometria, 86,16 x 109/L.

Houve um predomínio de crianças do sexo masculino e 67,6% das mães definiu a cor da

pele de seu filho como não-branca. A região nordeste respondeu por cerca de 57,6% dos

casos. Os subtipos LMA-M4 e M5 corresponderam a 25,2% dos casos, seguidos pelos

subtipos M3 e M2.

Tabela 5: Características clínicas e demográficas dos pacientes com LMA.

N (%)

Gênero

Masculino 82 (59)

Feminino 57 (41)

Cor da pele

Branco 26 (18,7)

Não-Branco 94 (67,6)

Procedência

Nordeste 80 (57,6)

Sudeste 29 (20,9)

Centro-oeste 28 (20,1)

Sul 2 (1,4)

Subtipo de LMA

M0 6 (4,3)

M1 8 (5,8)

M2 26 (18,1)

M3 28 (20,21)

M4/M5 35 (25,2)

M6 3 (3,2)

M7 6 (4,3)

LMA* 27 (19,4)

* 27 pacientes não puderam ter o subtipo de LMA determinado pelos aspectos morfológicos devido a pobre qualidade das lâminas. LMA=leucemia mielóide aguda.

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5.2.2) Expressão de CD135

A expressão do CD135 pela citometria de fluxo foi avaliada em 128 amostras. O

material biológico das 11 amostras restantes não estava disponível para as análises

imunofenotípicas, sendo possível somente a análise molecular.

O primeiro parâmetro analisado foi a porcentagem de células positivas para o

CD135. Este marcador analisado como uma variável contínua, não apresentou significância

estatística quando comparado aos subtipos de LMA (p=0,497). Como uma variável

categórica (cut-off para positividade = 20%), viu-se que 60,9 % (n=78) das amostras de

LMA apresentaram positividade para este marcador, enquanto 39,1% destas (n=50) foram

negativas para o mesmo. Não houve significância estatística quando comparamos a

porcentagem de células positivas como subtipo de LMA (p=0,664). Porém observamos

uma predominância de positividade nos casos LMA-M2 (n=17) e M3+M3v (n=17), juntos

respondendo por 26,6% dos casos.

A MFI nos casos analisados foi 100,6 e a média do CP foi 93,8. As amostras que

possuíam a porcentagem de células positivas abaixo de 20% (CD135 negativo) possuíam

um menor valor de MFI, quando comparados aos que possuíam o CD135 positivo

(p=0,03). Esta análise também foi confirmada quando analisamos o CP, ou seja, os

pacientes que possuíam CD135 positivo, possuíam um valor de CP maior quando

comparado aos pacientes com CD135 negativo (p<0,001). Não houve significância

estatística quando comparamos os subtipos de LMA com a MFI (p = 0,411) e o CP (p =

0,548).

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5.2.3) Status do gene FLT3

A mutação do gene FLT3 foi rastreada nas 139 amostras de LMA. Destas amostras,

33,9 % (n=47) apresentaram mutações neste gene, sendo 24,5% (n=34) do tipo DIT (Figura

13) e 9,4% (n=13) do tipo D835 (Figura 14). Não houve significância estatística quando o

status do FLT3 foi comparado ao sexo (p=0,576), cor da pele (p=0,400), procedência

(p=984), leucometria (p=0,895) e subtipo de LMA (p=0,973).

Também não encontramos significância estatística entre o status do FLT3 e as

fusões gênicas mais comuns nas LMAs. Não foram encontrados pacientes homozigotos

para a mutação.

Figura 13: Corrida de eletroforese em gel de agarose 3% do PCR FLT3-DIT. PM= peso molecular; Mut= pacientes com a mutação FLT3-DIT; 400pb= alelo duplicado; 314pb= alelo selvagem.

Figura 14: Corrida de eletroforese em gel de agarose 3% após a digestão com EcoRV, para visualizar a mutação D835. PM= peso molecular; Mut= pacientes com a mutação D835; 114pb= alelo mutado; 68 e 42pb= alelo selvagem digerido pela enzima.

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5.2.4) Rastreamento das fusões gênicas

As principais fusões gênicas (AML1/ETO, PML/RARA e CBF�/MYH11) foram

rastreadas em 78 amostras de LMA. Não foi possível o rastreamento nas demais amostras

por falta de material biológico ou qualidade de RNA e cDNA.

A fusão gênica AML1/ETO esteve presente em 29,5% (n=23) dos casos analisado, a

PML/RARA em 17,9% (n=14) e a CBF�/MYH11 em 5,1% (n=4). Como o esperado, quando

comparamos a freqüência destas fusões gênicas com os subtipos de LMA encontramos um

valor de p significativo, uma vez que AML1/ETO foi encontrada principalmente no subtipo

M2 (p<0,001), PML/RARA exclusivamente no subtipo M3 e M3v (p<0,001) e

CBF�/MYH11 nos subtipos M4 e M4Eo (p=0,029).

5.2.5) Expressão de CD135 e status do FLT3

Para avaliar a relação imunofenótipo-genótipo em nossos casos, analisamos as 128

amostras que tiveram a análise do CD135 definida pela citometria de fluxo e que possuíam

o status do FLT3 determinado.

A correlação do CD135, como variável categórica, e o status do FLT3, revelou que

44,5% das amostras positivas para o marcador possuíam o FLT3 selvagem (n=57) e 16,4%

possuíam alguma mutação no gene (n=21). Já os pacientes CD135 negativos, 20,3% destes

apresentavam o FLT3 selvagem, contra 18,8% que possuíam mutações. Esta associação

pode ser observada na tabela 6.

.

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Tabela 6: Associação entre a expressão de CD135 e as mutações do FLT3.

FLT3 selvagem

N (%) DIT – FLT3

N (%) FLT3 D835

N (%) p

CD135 + 57 (44,5) 16 (12,5) 5 (3,9) NS

CD135 - 26 (20,3) 17 (13,3) 7 (5,5) NS = não significativo.

O valor médio de expressão do CD135 foi maior nos casos com FLT3 selvagem do

que naqueles que tiveram alguma mutação, sendo este valor foi maior nas mutações do tipo

D835 do que nas DIT (p=0,138). A MFI do CD135 foi menor nas amostras de pacientes

com FLT3 selvagem quando comparada com a dos pacientes com a mutação D835, porém

maior do que aqueles com a mutação DIT. E, esta correlação foi estatisticamente

significante (p=0,029). A mesma relação foi observada quando analisamos o CP, porém

sem significância estatítica (p=0,163) (Figura 15).

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Figura 15: CD135 x status do FLT3: % CD135; média de intensidade de fluorescência (MFI) e Canal de Pico (CP). Selv= selvagem; DIT= duplicação in tandem do FLT3 e D835=mutação pontual do FLT3. A MFI do CD135 apresentou significância estatística quando comparada ao status do FLT3 (p = 0,029).

A Figura 16 mostra histogramas representativos da expressão de CD135 em 3

pacientes diferentes: (A) FLT3 selvagem (B) DIT-FLT3 e (C) D835, abordando os três

parâmetros utilizados para avaliar a expressão de CD135.

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Figura 16: Histogramas representativos da expressão de CD135 em pacientes com FLT3 (A) selvagem, (B) DIT-FLT3 e (C) D835. A marcação de M1 e M2 foi feita de acordo com o controle isotípico.

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6) DISCUSSÃO

A LAL é um subgrupo peculiar principalmente devido às evidências robustas da

ocorrência pré-natal dos rearranjos do MLL (Ford et al., 1993). Paralelamente, permanece

sem resposta a questão referente à necessidade da presença de alterações genéticas

adicionais no desenvolvimento da leucemia após a aquisição do rearranjo. Como a

superexpressão do FLT3 foi encontrada em LLAs com MLL rearranjado (Armstrong et al.,

2002), o FLT3 foi incluído na lista dos possíveis genes candidatos cuja interação

contribuiria com os fatores atribuídos às diversas etapas do mecanismo de leucemogênese.

Recentemente, Stam RW e colaboradores, depois de rastrearem a região codificadora do

FLT3, proveram dados demonstrando que tanto as crianças com LLA MLL+ com aquelas

com hiperdiploidia possuíam genes FLT3 selvagens, ainda que uma minoria das amostras

contivesse uma alteração genética (Stam et al., 2007). Resumidamente, os dados adquiridos

nos informam que na maioria dos casos de LLA MLL+, a sinalização constitutivamente

ativada da proteína FLT3 é uma conseqüência do alto nível de expressão do FLT3

selvagem, porém não uma conseqüência de mutação.

Com isto, embora as mutações não expliquem a ativação constitutiva de FLT3, elas

ainda podem ser informativas e interessantes porque a leucemia é um processo de eventos

múltiplos. Neste estudo, nós realizamos uma analise das alterações mais freqüentes na

seqüência do FLT3. Esta serie de casos é altamente representativa dos casos nacionais de

LAL, sem viés de seleção, uma vez que estes casos são parte de um estudo epidemiológico

já consolidado (Pombo-De-Oliveira e Koifman, 2006), embora o material analisado

dependeu da disponibilidade de material biológico.

Nossos estudos sugerem que o subtipo de LA e a faixa etária não estão

exclusivamente associados com mutações do FLT3. Além disso, os casos mutados

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apresentam altas contagens leucocitárias devido às células blásticas. Estas características

são freqüentemente encontradas nos casos com MLL rearranjado. Como as mutações foram

encontradas principalmente em lactentes com idade < 4 meses e com subtipos de leucemias

bastante imaturos, nossa hipótese é que o único aspecto que pode estar associado com a

ocorrência das mutações é o status do gene MLL.

Recentemente, foi proposto que a origem pré-natal da LMA pediátrica é menos

freqüente quando comparada aos casos de LLA. No trabalho de Burjanivova e

colaboradores foram rastreados testes neonatais de crianças com LLA e LMA em busca de

seus respectivos marcadores de leucemia. Foram analisados Guthrie cards de 13 pacientes

com LMA. As fusões gênicas PML/RARA (n=4), CBFB/MYH11 (n=3), AML1/ETO (N=2),

MLL/AF6 (n=1), MLL/AF9 (n=1) e MLL/AF10 (n=1) e/ou as DITs-FLT3 (n=2) foram

usadas como mascadores clonotípicos. Nenhum marcador molecular paciente-específico foi

encontrado entre os casos de LMA (Burjanivova et al., 2006). Embora as DITs-FLT3 sejam

freqüentemente encontradas nas LMAs, elas são raramente observadas na LLA pediátrica

(Xu et al., 2000). Interessantemente, entre os dois casos de DIT-FLT3 presentes no nosso

estudo, um foi detectado em uma LLA com imunofenótipo comum (células precursoras B

com expressão de CD10). Infelizmente, este paciente faleceu logo após o diagnóstico.

Considerando-se a faixa etária 1-5 meses, a ausência de rearranjos do MLL nestes pacientes

é intrigante. Este estudo confirma os resultados prévios que indicam que as mutações do

FLT3 são raras em pacientes jovens com LMA.

Embora se saiba que a carcinogênese em geral é resultante de mais de uma alteração

genética, nossos resultados mostram que as alterações do FLT3 não constituem uma

anormalidade genética freqüente em LALs com MLL rearranjado. A atual falta de

evidencias de que outro gene esteja freqüentemente alterado nas LALs MLL+, pode indicar

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que os rearranjos do MLL sejam realmente suficientes para gerar a leucemia.

Alternativamente, pode ser que a segunda alteração genética envolvida seja muito variável,

talvez dependente do parceiro de fusão do MLL. Por isto, é plausível a afirmação de que a

importância do FLT3 nas leucemias pediátricas esteja unicamente associada aos aspectos

prognósticos, pois ele está altamente expresso e pode ser um alvo terapêutico através de

inibidores (Stam et al., 2006).

Contudo, dois casos mutados com imunofenótipo pró-B são muito precoces (2 e 5

meses), indicando que tanto o rearranjo do MLL quanto a mutação do FLT3 ocorreram num

período de latência muito curto, sugerindo o surgimento pré-natal das alterações genéticas

que causam a LAL. Apesar das diferenças metodológicas aplicadas e das diferentes origens

genéticas dos pacientes analisados, a freqüência de alterações no FLT3 é similar àquela

encontrada por Stam RW et al., que como no presente estudo, encontrou mutações no FLT3

em 7,5% dos casos MLL rearranjados. Esta porcentagem é menor do que as encontradas nos

primeiros relatos (16%), nos quais um número menor de casos foi analisado (Armstrong et

al., 2004; Stam et al., 2005). Por fim, as particularidades dos casos aqui descritos podem

nos ajudar a elucidar o papel do FLT3 nas LALs, em conjunto com os resultados

emergentes na literatura.

Muitos subtipos leucêmicos expressam CD135. Em muitos deles, a expressão deste

marcador nas células leucêmicas reflete a mesma encontrada nos correspondentes normais.

Desta maneira, o CD135 é expresso em células progenitoras mielóides e linfóides normais e

em células leucêmicas de 70 – 90% dos pacientes com LMA e LLA (Carow et al., 1996;

Rosnet et al., 1996). No nosso estudo, encontramos 60,9% dos pacientes portadores de

LMA expressando o CD135. Nossa análise foi feita em amostras de pacientes que estão

incluídas em um estudo epidemiológico, sem viés de seleção. Rosnet e colaboradores

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utilizaram a mesma metodologia, a citometria de fluxo, porém rastrearam um pequeno

número de casos. O estudo de Carow et al foi feito utilizando Real Time-PCR. Além disso,

estes dados foram gerados em pacientes com LLA e LMA. Nossa análise foi feita em

amostras de LMA infantis.

A imunofenotipagem clássica através da citometria de fluxo gera uma série de

parâmetros que descrevem a expressão de uma dada molécula. O parâmetro mais

comumente utilizado é a porcentagem de células positivas, a média de intensidade de

fluorescência e o canal de pico. A porcentagem de células positivas relete a composição

celular de uma dada população de células, porém não leva em consideração a intensidade

da expressão. Este parâmetro é recomendado de forma concensual nos guidelines (Bene et

al., 1995). O valor de cut-off normalmente utilizado é 20% para as células positivas. A

utilização de valores tão restritos pode tornar obscura a natureza biológica de alguns casos.

A média de intensidade de fluorescência é o principal parâmetro utilizado para medir a

intensidade de expressão antigênica. A MFI depende do número de moléculas de anticorpo

ligados a cada célula. O canal de pico também leva em consideração a intensidade

antigênica. Ele revela o maior valor da intensidade de fluorescência. Nosso estudo, a MFI

se mostrou o padrão mais adequado para avaliar a natureza biológica das mutações do gene

FLT3.

Recentemente, as mutações no gene FLT3 foram encontradas em pacientes com

LLA (1-3%), mielodisplasia (5-10%) e LMA (15-35%), fazendo deste gene um dos mais

mutados nas neoplasias hematológicas. Encontramos 33,9% de mutações na coorte

analisada. A duplicação em tandem responde por 15-35% dos casos mutados em LMA e a

D835 por 5-10% destes (Stirewalt e Radich, 2003). Os dados aqui descritos estão de acordo

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com a literatura e, podem ajudar a responder algumas questões referentes ao papel do FLT3

na leucemogênese.

A fusão AML1/ETO é descrita em cerca de 6% a 12% das LMAs e em 30% das

LMAs do subtipo M2 e sua incidência é maior em crianças (14% das LMAs) (Haferlach et

al., 1996). No total das 78 LMAs estudadas, observou-se que 29,5% (n=23) destas

apresentavam a fusão gênica AML1/ETO e foi quase que exclusivamente observada nas

LMAs do subtipo M2 (n=20) e somente 3 casos do subtipo M4. As correspondências com

os subtipos FAB estão de acordo com o encontrado na literatura, uma vez que esta

translocação é freqüentemente encontrada no subtipo M2 e mais raramente nos subtipos M4

e M1 (Swirsky et al., 1984).

No nosso estudo, a t(15;17) esteve presente em 17,9% (n=14) das LMAs e

exclusivamente nos subtipos FAB M3/M3v. Este percentual é baixo, quando se leva em

consideração o relato da literatura que refere 90% dos pacientes com LMA M3/M3v têm o

rearranjo cromossômico que resulta na fusão PML/RARA. A detecção pelo RT-PCR talvez

não seja indicada como primeira linha de abordagem, pois a LMA-M3 também pode estar

associada a translocações variantes complexas, translocações variantes e translocações

ocultas ou mascaradas (Grimwade et al., 1996). No entanto, nossos resultados foram de

grande valor para a decisão terapêutica.

A inversão do cromossoma 16 e a translocação recíproca, menos comum, entre o

par de cromossomas 16 representam de 3-6% das LMAs e intimamente relacionda ao

subtipo FAB M4Eo (Schnittger et al., 2007). No total das LMAs estudadas a fusão gênica

CBFβ/MYH11 correspondeu a 5,1% (n=4) e esteve presente exclusivamente no subtipo

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FAB M4Eo, mostrando que nossos dados estão de acordo com o encontrado na literatura,

embora o número de casos deste subtipo ainda seja muito pequeno.

Com excessão de algumas proteínas resultantes de rearranjos gênicos específicos

(Viswanatha et al., 1998; Wuchter et al., 2000) ou do aumento da expressão gênica

(Menssen et al., 2000), os blastos leucêmicos nas LLAs e LMAs expressam antigenos

normais de diferenciação linfóide e mielóide, respectivamente. No entanto, os fenótipos

associados a leukemia podem ser identificados através da co-expressão de marcadores que

raramente ou nunca apareceriam simultaneamente na diferenciação hematopoietica normal,

da superexpressão de marcadores aberrantes e da falta de marcadores de diferenciação. Este

fenótipo leucêmico é reflexo das alterações moleculares que os blastos sofreram durante o

processo leucêmico. Nosso estudo mostrou que a media de intensidade de fluorescência do

CD 135 foi capaz de diferenciar os casos que apresentaram o FLT3 selvagem dos que

apresentavam a mutação neste gene, tanto a DIT, quanto a D835. As amostras selvagens

apresentaram uma MFI maior do que as amostras com DIT, porém menor do que as

amostras com D835. Estes resultados podem ser explicados quando se estuda a biologia do

receptor. O receptor FLT3 selvagem e inativo se localiza na membrana celular de forma

monomérica. Quando se liga ao domínio extracelular do receptor FLT3, o seu ligante induz

mudanças conformacionais e estabiliza a dimerização do receptor. Esta dimerização

aproxima os domínios quinase e subseqüentemente promove a autofosforilação dos

resíduos de tirosina, aumentando assim a atividade quinase do receptor. O receptor ativado

fosforila e/ou liga moléculas sinalizadoras, permitindo a proliferação, diferenciação e

sobrevivência celular (Stirewalt e Radich, 2003). O receptor dimerizado é então

rapidamente internalizado e degradado. Quando ocorre uma mutação no gene, o receptor se

torna constutivamente ativo na membrana celular, independentemente do acoplamento do

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ligante, e não é internalizado. Estudos indicam que receptores com DIT-FLT3 não

requerem uma dimerização para estarem constitutivamente ativados (Gille et al., 2000).

Como essa dimerização é importante para a estabilidade do receptor, a falta deste evento

pode dificultar o reconhecimento do anticorpo, o que justificaria a menor intensidade de

fluorescência do CD135 nestes casos. Já as mutações no domínio tirosina quinase

provavelmente aumentam os níveis de atividade tirosina quinase intracelular, sem alterar a

dimerização do receptor, o que ajudaria na sua estabilidade e, conseqüentemente,

reconhecimento do CD135 (Moriyama et al., 1996; Morley et al., 1999).

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7) CONCLUSÕES

♦ Cerca de 7,5% dos pacientes continham anormalidades no FLT3. Dentre os pacientes

MLL positivos, a mutação do FLT3 esteve presente em 6% dos casos. O que nos faz

pensar queimportância do FLT3 nas leucemias de lactentes esteja unicamente associada

aos aspectos prognósticos, pois ele está altamente expresso e pode ser um alvo

terapêutico através de inibidores.

♦ Utilizando a citometria de fluxo, encontramos 60,9% das amostras de crianças

portadoras de LMA expressando o CD135.

♦ A MFI se mostrou o padrão mais adequado para avaliar a natureza biológica das

mutações do gene FLT3.

♦ As mutações no gene FLT3 foram encontradas em 33,9% pacientes com LMA,

indicando que este gene tem um papel importante no desenvolvimento deste subtipo

leucêmico.

♦ As amostras com FLT3 selvagens apresentaram uma média de intensidade de

fluorescência do CD135 maior do que as amostras com DIT, porém menor do que as

amostras com D835.

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8) PERSPECTIVAS

♦ Dados da literatura mostram que os paciente com mutações no gene FLT3 apresentam

respostas distintas aos protocolos terapêuticos. Uma das hipóteses levantadas é de que outras

alterações genéticas possam estar envolvidas na leucemogênese destes pacientes. Sabemos

que nas LMAs , as DITS-FLT3 são mas freqüentemente encontradas em pacientes com

LMA-M3 e PML/RARA positivo. Desta forma seria interessante resgatar os casos foram

incluídos nessa análise e que não pudemos rastrear as fusões gênicas para compará-las com o

status do FLT3 e expressão do CD135.

♦ Sabe-se que o FLT3 selvagem e o mutado atuam em vias de sinalização distintas. Como o

FLT3 e o gene RAS fazem parte da mesma via de sinalização, poderíamos complementar o

estudo com uma outra abordagem através do status do RAS e avaliar a interação com o FLT3.

♦ Avaliar o impacto do padrão de expressão do CD135 e das mutações do FLT3 na sobrevida

dos pacientes com LMA.

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8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9) ANEXOS I

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10) ANEXOS II

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11) ANEXOS III

Aceito para publicação em outubro de 2009 na Cancer Genetics and Cytogenetics.

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