FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA MARCUS VINICIUS …
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FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA MARCUS VINICIUS TENUTA ARAUJO IMPACTO DA TERAPIA DE RADIAÇÃO NA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO DE AQUAPORINAS (AQPs) NA GLÂNDULA SUBMANDIBULAR DE RATOS MARÍLIA 2016
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FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA
MARCUS VINICIUS TENUTA ARAUJO
IMPACTO DA TERAPIA DE RADIAÇÃO NA EXPRESSÃO E
LOCALIZAÇÃO DE AQUAPORINAS (AQPs) NA GLÂNDULA
SUBMANDIBULAR DE RATOS
MARÍLIA
2016
Marcus Vinicius Tenuta Araujo
Impacto da terapia de radiação na expressão e localização de Aquaporinas (AQPs) na
glândula submandibular de ratos
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento”, da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.
Orientadora: Profa. Dra Raquel Fantin Domeniconi.
Co-orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies
Marília
2016
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde
que citada a fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília
Araujo, Marcus Vinicius Tenuta.
Impacto da terapia de radiação na expressão e
localização de Aquaporinas (AQPs) na glândula
submandibular de ratos / Marcus Vinicius Tenuta Araujo. - -
Marília, 2016.
41 f.
Orientadora: Profa. Dra. Raquel Fantin Domeniconi.
Coorientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies.
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e
Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.
1. Glândulas salivares. 2. Radiação. 3. Aquaporina 1. 4.
Aquaporina 5.
A663i
Marcus Vinicius Tenuta Araujo
Impacto da terapia de radiação na expressão e localização de Aquaporinas (AQPs) na
glândula submandibular de ratos
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento”, da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.
Comissão Examinadora:
_______________________________________________
Profa. Dra. Raquel Fantin Domeniconi
Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu
_______________________________________________
Prof. Dr. Bruno César Shimming, MV, PhD
Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu
_______________________________________________
Profa. Isabella Bazzo da Costa, MV, PhD
Faculdades Integradas Ourinhos – FIO
Data de Aprovação: _______________________________
Dedico este trabalho:
A meus pais José Maria Alvares Araujo e Regina Célia Tenuta Araujo, pelo amor,
dedicação e paciência ao longo de toda minha vida.
Aos meus irmãos Luis Gustavo Tenuta Araujo e Beatriz Tenuta Araujo, pelo
companheirismo e apoio incondicional.
A meus sogros Emir Castilho e Carmen Lucia de Souza Castilho, que me acompanharam
nessa caminhada.
Aos meus filhos Laura e João, anjos que iluminam meu caminho.
Em especial à minha esposa Viviane Castilho Araujo, minha companheira, amiga,
apoiadora, conselheira.
E sobretudo a DEUS, Pai misericordioso, que atua em silêncio e faz tudo possível.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Raquel Fantin Domeniconi, pelo apoio, dedicação,
preocupação e transferência de conhecimentos.
Ao co-orientador Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies, inspirado mestre e estimado amigo.
À Profa. Dra. Maria Angelica Spadella Santos, que gentilmente me acolheu e orientou.
Ao Prof. Dr. Gustavo Viani de Arruda, pela dedicação e orientação.
Às colegas e colaboradoras Talita de Mello Santos e Marilia Martins Cavariani doutorandas
do Programa de Biologia Geral e Aplicada - IBB - Unesp - Botucatu.
Aos funcionários do complexo FAMEMA, cuja dedicação à instituição serve de inspiração.
Aos colegas e professores do Programa de Mestrado Acadêmico Saúde e Envelhecimento.
“A persistência é o caminho do êxito”
Charles Chaplin
RESUMO
A prevalência de tumores em cabeça e pescoço é alta e, em geral, o tratamento inclui
radioterapia de maxila, mandíbula e glândulas salivares, podendo gerar consequências
adversas relacionadas à diminuição do volume do fluxo salivar. As glândulas salivares
apresentam elevada permeabilidade para a passagem de água e, portanto, suas células
expressam aquaporinas (AQPs), proteínas que facilitam e regulam o transporte de água
através das membranas celulares. Assim, esse trabalho teve por objetivos analisar as possíveis
alterações na morfologia da glândula salivar de ratos submetidos à radiação, bem como
avaliar o impacto do tratamento com radiação na expressão e localização destas proteínas.
Para tanto, foram utilizados ratos Wistar fêmeas, divididos em grupo controle e grupo
irradiado, que foi exposto à radiação gama. Após o período de experimentação, foram
coletadas amostras da glândula submandibular, as quais foram processadas segundo a rotina
das técnicas de Western blotting, histologia e imuno-histoquímica. A análise dos resultados
permitiu a confirmação da presença da AQP1 no endotélio de vasos de maior calibre e
pequenos capilares e em células sanguíneas na luz desses vasos, amplamente citada na
literatura, e também, de maneira inédita, foi observada marcação intensa e consistente em
grânulos no citoplasma das células ductais da glândula submandibular. Além disso, observou-
se a marcação positiva da AQP5 nas células ductais delimitando o lúmen do ducto
intercalado, controversa na literatura, e no citoplasma e nas membranas apical e basolateral
das células acinares. Por fim, a diminuição da marcação das AQPs, nas glândulas de animais
irradiados, comprovam sua radiosensibilidade. Assim concluimos que a diminuição dos níveis
protéicos de AQP1 no endotélio e de AQP5 nas células ductais das glândulas dos animais
irradiados podem ter prejudicado a remoção de água do lúmen do ducto, causando um atraso
na absorção de água e desencadeando discreto aumento de lúmen verificado na
histomorfometria, sendo que o mecanismo relacionado a esse processo permanece não
identificado.
Palavras-chave: Glândulas salivares. Radiação. Aquaporina 1. Aquaporina 5.
ABSTRACT
The prevalence of Head and Neck tumours is high and treatment usually includes maxilla,
mandible and salivary gland radiotherapy, which may lead to adverse effects related to
salivary flow volume decrease. Salivary glands are highly permeable to water and therefore
its cells express Aquaporins (AQPs), proteins that facilitate and regulate water transport
across cellular membranes. Hence, this paper aims to analyse plausible morphology changes
in rat salivary gland subjected to radiation exposure, as well as to assess the impact of
radiation therapy on the expression and location of these proteins. For this purpose, Wistar
female rat population was divided into a control group and an irradiation group, which was
exposed to gamma radiation. After the experiment period, submandibular gland samples were
collected and then processed according to histology, immunohistochemistry and Western
blotting technique protocols. Data analysis allowed to confirm the presence of AQP1 in the
endothelium of large-calibre and small-calibre blood vessels as well as in blood cells within
those vessels, which was consistent with the background literature. This study also allowed
the observation of intense and steady labelling granules in the cytoplasm of submandibular
gland ductal cells. In addition, contradicting the literature, there was a positive labelling for
AQP5 in ductal cells delimiting the lumens of intercalated duct, in the cytoplasm and apical
and basolateral membrane of acinar cells. Finally, the decrease of AQP labelling in irradiated
animal glands validate their radiosensitivity. Thus, we conclude that the decrease in AQP1
protein levels in the endothelium and AQP5 proteins in gland ductal cells of irradiated
animals may have hindered the removal of water from the lumen of ductal cells, inducing a
delay in the water absorption and triggering a slight lumen increase seen in
histomorphometry, and the mechanism related to this process remains unclear.
Keywords: Salivary glands. Radiation. Aquaporin 1. Aquaporin 5.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ductos, ácinos e estroma observados em MO quantificados pelo método de
contagem planimétrico, que consiste na sobreposição de uma grade que totaliza
168 pontos sobre a imagem capturada, utilizando-se o software Image-Pro
Plus.........................................................................................................................xx
Figura 2 - Método de obtenção das medidas de ducto e lúmen através do software cellSens
Dimension®, Olympus...........................................................................................xx
Figura 3 - Análise imuno-histoquímica para AQP1 e AQP5, nos grupos de animais controle e
irradiado. ...............................................................................................................xx
Figura 4 - Análise dos níveis proteicos de AQP1 e AQP5, em amostras de glândulas
submandibulares. Os gráficos representam a expressão relativa da densidade
óptica integrada para as proteínas AQP1 e AQP5 normalizadas pela GAPDH e
expressa pela média±EPM. ...................................................................................xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Peso dos animais e peso e estereologia de glândula submandibular.........................xx
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão (±) dos valores de diâmetros do ducto e do lúmen,
altura de epitélio do ducto e razão entre altura do epitélio do ducto / lúmen........xx
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AQP - aquaporina
BSA - albumina soro bovino
CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais
cGy/min - centigray por minuto
CO2 - gás carbônico
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
DAB - diaminobenzidina
FAMEMA - Faculdade de Medicina de Marilia
G1 - grupo controle
G2 - grupo irradiado
Gy - gray
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
KDa - quilodalton
M - molar
MeV - megavolt
mg/kg - miligramas por quilogramas
n - tamanho da amostra
NaCl - cloreto de sódio
p - índice de significância
PBS - tampão fosfato salino
pH - potencial hidrogeniônico
SDS - poliacrilamida - dodecil sulfato de poliacrilamaida
μL - microlitro
μm - micrômetro
(v/v) - concentração volume/volume
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 14
1.1 Envelhecimento e saúde bucal .................................................................................. 14
1.2 Glândulas salivares ................................................................................................... 14
1.3 Radioterapia e glândulas salivares .......................................................................... 16
1.4 Aquaporinas, glândulas salivares e radioterapia ................................................... 16
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 20
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 21
3.1 Grupos experimentais ............................................................................................... 21
3.2 Protocolo de radioterapia ......................................................................................... 22
3.3 Processamento de material ....................................................................................... 22
3.4 Análise morfométrica ................................................................................................ 23
3.4.1 Análise do volume – ductos x ácinos x estroma ......................................................... 23
3.4.2 Análise do diâmetro de ductos e lúmen; altura de epitélio e razão altura de
epitélio/lúmen ........................................................................................................................ 24
3.5 Imuno-histoquímica ........................................................................................................ 26
3.6 Western blotting ............................................................................................................... 26
3.7 Forma de análise dos resultados .................................................................................... 27
4. RESULTADOS .................................................................................................................. 28
4.1 Estereologia e histomorfometria .................................................................................... 28
4.2 Imuno-histoquimica ........................................................................................................ 29
4.3 Western blotting ............................................................................................................... 30
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 32
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 37
REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 38
APÊNDICE A......................................................................................................................... 44
APÊNDICE B......................................................................................................................... 44
ANEXO A............................................................................................................................... 44
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Envelhecimento e saúde bucal
A longevidade e o consequente aumento da população idosa é um fenômeno
demográfico bem estabelecido em todo o mundo, principalmente em função do
desenvolvimento da medicina e de novas tecnologias e medicamentos. Em nosso país, dados
do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) demonstram que a expectativa de
vida ao nascer atingiu 75,2 anos no ano de 2014, contra 74,8 anos para o ano de 2013,
evidenciando claramente essa tendência. O aumento da expectativa de vida média da
população traz grande importância para o conceito de saúde e qualidade de vida, sendo que a
saúde bucal tem um papel relevante nesse contexto.(1)
Assim como todo organismo, as estruturas orais sofrem ação do envelhecimento e
os tecidos da cavidade oral refletem esse processo.(1)
Encontra-se bem fundamentada na
literatura essa situação em relação aos tecidos do periodonto de suporte (ligamentos, gengiva
e osso alveolar)(1,3)
, tecidos das articulações temporo mandibulares(1)
, bem como glândulas
salivares(1,3,6,7,9,12,13,14)
. Quanto às glândulas salivares, além de serem afetadas pelo processo
de envelhecimento propriamente dito, podem sofrer alterações que levam à hipofunção devido
a diabetes mellitus, utilização de medicamentos antidepressivos, anti-hipertensivos e
diuréticos, além da irradiação terapêutica no caso de doenças tumorais (1-6)
, ou ainda,
menopausa(7)
e doenças auto-imunes como a Síndrome de Sjögren(8)
.
Liu et al. (6)
realizaram revisão sistemática abrangendo estudos realizados entre
1989 e 2010 buscando avaliar a prevalência e etiologia da hipofunção das glândulas salivares
em idosos vulneráveis com doenças crônicas e polimedicados. Os autores encontraram que a
xerostomia se constitui como a maior queixa relacionada à saúde bucal dessa população, com
índices de prevalência que partem de 55% em idosos acometidos por doenças sistêmicas,
como diabetes, Parkinson e câncer a 80% em idosos com câncer avançado.
1.2 Glândulas salivares
As glândulas salivares são glândulas exócrinas, que produzem saliva, e podem ser
classificadas em glândulas salivares menores e maiores. As glândulas salivares menores são
encontradas dispersas ao longo da cavidade oral, e as glândulas salivares maiores estão
dispostas aos pares e são nomeadas: parótidas, submandibulares e sublinguais(9)
.
13
De forma geral, o parênquima das glândulas salivares maiores é composto por
células acinares serosas e mucosas circundadas por células mioepiteliais e por um sistema de
ductos ramificados que conduzem a saliva para a cavidade oral(10)
.
A produção de saliva se inicia nas células acinares que secretam um fluido
isotônico, rico em NaCl, que se acumula no lúmen e gera um gradiente osmótico que
possibilita a passagem de água e formação da saliva primária. Esse fluido segue então para o
sistema de ductos onde ocorrerão a reabsorção dos íons Na+
e Cl- e o aporte de K
+ e HCO3
-
resultando em um fluido hipotônico, denominado saliva secundária, que seguirá para a
cavidade bucal(10,11)
. Além disso, esse fluido é enriquecido com componentes sólidos,
sobretudo imunoglobulinas e proteínas.(10)
A saliva é, portanto, o conjunto de uma secreção
serosa, caracterizada pela presença de ptialina (ou amilase salivar), enzima destinada à
digestão do amido, e de uma secreção mucosa, que contém mucina para lubrificação e
proteção das superfícies da boca e demais regiões do sistema digestório(11)
. Também é
composta por mais de 99% de água enriquecida com eletrólitos, agregada a um componente
proteico, que inclui imunoglobulinas, enzimas digestivas como a amilase e a lipase e enzimas
com função antibacteriana e antifúngica, como a mucina (12)
.
Assim, a saliva tem por funções a lubrificação do bolo alimentar, proteção dos
tecidos bucais e demais partes do sistema digestório contra injúrias mecânicas e biológicas,
limpeza e manutenção do pH neutro da cavidade oral e prevenção da desmineralização
dentária(13)
.
As alterações nas glândulas salivares e o impacto na qualidade e volume da saliva
trazem consequências deletérias para a cavidade bucal tanto para os indivíduos dentados, onde
a falta de saliva afeta, em especial, a capacidade dos tecidos orais em defender-se de
agressões externas, como para os parcial e totalmente desdentados, onde a saliva, além de
estar relacionada à capacidade de defesa, tem também fundamental importância para
estabilização de aparelhos protéticos removíveis, como as próteses parciais ou totais, sendo
este um fator de grande importância para a saúde, conforto e capacidade de mastigação destes
indivíduos(14)
.
1.3 Radioterapia e glândulas salivares
A prevalência de doenças tumorais em cabeça e pescoço é alta. Estudos
demonstram a ocorrência de até 870 mil casos novos de tumores malignos em vias
14
respiratórias e digestórias superiores por ano no mundo(2)
. O protocolo de tratamento para
estes tipos de tumores pode incluir cirurgia, radioterapia de cavidade bucal, maxila,
mandíbula e glândulas salivares, podendo gerar, como consequência adversa, o aparecimento
de cáries rampantes, mucosites, candidíases, disgeusia, xerostomia(2)
, língua saburrosa, língua
fissurada e estomatite protética(3)
, além da ósteorradionecrose. Todos estes efeitos
intrinsecamente relacionam-se à qualidade e ao volume do fluxo salivar. Vieira et al(4)
., em
um estudo sobre tratamento odontológico em pacientes oncológicos publicado em 2012,
encontraram que 70,58% dos pacientes tratados somente com radioterapia apresentaram
sequelas bucais, em especial mucosite, com prevalência de 23,52% dos casos. Deasy et. al (5)
afirmam ainda que a redução na função salivar pode ter início ao redor de 1 semana após o
início da terapia de irradiação, retornando gradativamente após 2 anos nos casos em que a
radiação não induziu danos severos e irreversíveis às glândulas. Wong (15)
relata índice acima
de 90% de prevalência de algum tipo de prejuízo à cavidade oral após tratamento
radioterápico, sendo a xerostomia a sequela mais comumente relatada.
Por fim, Pinna et al. (16)
, concluem em sua revisão sistemática da literatura, que a
xerostomia induzida por radiação ionizante pode ser considerada uma doença multifatorial
que depende do tipo de tratamento eleito para o câncer assim como da dose de radiação
aplicada nos tecidos.
1.4 Aquaporinas, glândulas salivares e radioterapia
As aquaporinas (AQPs) são canais de água que facilitam e regulam o transporte
de água através das membranas celulares. Constituem uma família de proteínas pequenas,
cujos monômeros têm de 26 a 34 kDa. As proteínas dessa família organizam-se nas
membranas como homotetrâmeros. Cada monômero, consiste de seis domínios “membrane-
spanning” α-hélice, com as extremidades carboxi e aminoterminal orientadas para o
citoplasma, contendo um poro de água distinto(17)
(ANEXO A).
Essas proteínas são expressas na membrana plasmática de tipos celulares
envolvidos no transporte de fluidos, além de estarem presentes na membrana de organelas
intracelulares, regulando assim, o volume da célula e da organela(18)
. As AQPs estão
envolvidas em uma grande variedade de funções fisiológicas como, por exemplo, função
secretória e homeostase de água e solutos, facilitando o transporte transepitelial de fluidos e,
além disso, podem estar envolvidas na migração celular e neuroexcitação. Também
participam de muitos processos patológicos como glaucoma, epilepsia, obesidade e o câncer
15
(19,20). As células epiteliais acinares, de glândulas salivares, apresentam elevada
permeabilidade para a passagem de água e, portanto, estas células apresentam AQPs.
Em mamíferos, dois subgrupos de AQPs foram definidos, as AQP1, AQP2,
AQP4, AQP5, AQP6 e AQP8 que parecem ser altamente seletivas à água, e as
aquagliceroporinas AQP3, AQP7 e AQP9 que transportam também glicerol e outros pequenos
solutos(17)
. Dentre estes subtipos, a AQP5 foi a mais estudada em glândulas salivares e os
trabalhos mostram que esta AQP desempenha papel fundamental na secreção de fluidos neste
tipo de tecido(21,22)
Estudos, com roedores, identificaram a AQP5 nas glândulas parótida, sublingual e
especialmente, na glândula submandibular, onde foi localizada na membrana apical das
células acinares do tipo serosa. Já nas células dos ductos da glândula submandibular, a
presença desta AQP é controversa e ainda necessita ser discutida (revisado por Delporte e
Steinfeld(23)
).
A radiação utilizada no tratamento de câncer de cabeça e pescoço causa danos às
células acinares das glândulas salivares(24)
. Além disso, foi observada a diminuição na
expressão da AQP5 em glândulas salivares de ratos irradiados. A queda desta AQP pode
participar do mecanismo que leva à perda do fluxo salivar. Alterações no padrão de expressão
e de localização da AQP5 também foram observados em pacientes com a síndrome de
Sjögren's, no entanto, para esta síndrome, os dados ainda parecem ser contraditórios(23)
. A
participação da AQP5 nas situações relacionadas à xerostomia também são abordadas por
Matsuzaki et al.(25)
, Takahashi et al. (26)
, Takakura et al.(27)
e Susa et al.(28)
.
Além da AQP5, outras AQPs têm sido localizadas nas glândulas salivares. A
AQP1 está presente nos vasos das glândulas submandibulares de ratos, durante o
desenvolvimento natal e pós-natal. A imunolocalização da AQP1 nas glândulas salivares, em
humanos, mostrou que além de capilares esta AQP também está associada a células
mioepiteliais. Provavelmente, a AQP1 contribua para as rápidas alterações de volume e
contração da célula mioepitelial, contrações essas imprescindíveis para a constrição do lúmen
dos ácinos, o que facilitaria o fluxo da saliva em direção à boca. Em pacientes com a
síndrome de Sjögren's, doença auto-imune de etiopatogenia pouco esclarecida que apresenta
como principal sintoma a hipofunção das glândulas lacrimais e salivares(8)
, observa-se uma
diminuição na expressão da AQP1 nas células mioepiteliais, sugerindo que esta AQP também
esteja envolvida nas disfunções das glândulas salivares(23)
.
A AQP8 foi imunolocalizada nas células mioepiteliais ao redor dos ácinos das
glândulas salivares maiores, mas não em células acinares(29,30)
. Análises da expressão gênica
16
revelaram que a AQP8 diminui em ratos envelhecidos, no entanto, faltam dados na literatura a
respeito da expressão proteica desta AQP, bem como das consequências da diminuição da
expressão gênica da AQP8 em ratos envelhecidos (revisado por Delporte e Steinfeld (23)
) ou
submetidos a tratamentos que reduzam o fluxo de saliva.
Recentemente, as AQPs 7 e 9 também foram detectadas nas glândulas salivares de
camundongos adultos normais. A AQP7 foi localizada em células endoteliais, dividindo o
mesmo domínio de membrana da AQP1, e a AQP9 foi detectada com auxílio da técnica de
Western blot(22)
.
Apesar dos trabalhos citados, pouco se sabe sobre o papel das AQPs nas glândulas
salivares e, de forma geral, observamos que os estudos publicados trazem dados
contraditórios a respeito da expressão e/ou localização de alguns subtipos de AQPs. Além
disso, há escassez de estudos experimentais, na literatura científica, que descrevam o impacto
dos tratamentos por radiação na dinâmica e sistemática dos canais de água presentes nas
glândulas salivares.
Em geral, para outros tecidos do corpo, foi descrito que as redundâncias na
expressão de AQPs dividindo um mesmo domínio de membrana ou coexistindo em um
mesmo tecido, são, presumivelmente em parte, um meio para assegurar que a disfunção de
qualquer uma das AQPs não impeça a capacidade deste tecido em transportar água e manter o
balanço iônico do fluido em níveis ótimos para o desempenho de suas funções.
Assim, propusemos esta investigação para sistematizar a expressão proteica de
diferentes subtipos de AQPs na glândula submandibular; e, para entender de que forma o
tratamento com radiação pode alterar a dinâmica dos diferentes subtipos de AQPs,
correlacionando com possíveis alterações morfológicas decorrentes da radiação.
17
2 OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
- Localizar as AQPs 1 e 5 na glândula submandibular dos ratos dos grupos
experimentais;
- Avaliar o efeito da radiação na expressão e localização destas AQPs na glândula
submandibular de ratos;
- Sistematizar a dinâmica dos canais de água, mediante ao tratamento com
radiação, correlacionando com possíveis alterações de morfologia geral e morfometria destas
glândulas.
18
3 MATERIAL E MÉTODOS
Para este estudo foram utilizados 12 ratos Wistar fêmeas, com 10 semanas de
vida, virgens, obtidos no Biotério Central da Faculdade de Medicina de Marília (FAMEMA).
Os animais permaneceram, durante o período de experimentação, no biotério de apoio, ligado
ao Laboratório de Farmacologia da mesma Instituição, sendo mantidos em gaiolas plásticas
(30x16x19 cm) com 3 animais por gaiola, alimentados com dieta comum sólida e água ad
libitum e sob condições adequadas de luminosidade (ciclo claro/escuro 12 horas) e
temperatura (23 à 25°C). Todo o experimento e os procedimentos cirúrgicos deste trabalho
foram submetidos e aprovados junto ao Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
FAMEMA, sob o Protocolo de Estudo no 414/15. A pesquisa foi realizada de acordo com os
princípios éticos em pesquisa animal adotados pelo Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA). Ressalta-se, ainda, que todos os resíduos químicos
gerados nos laboratórios do Departamento de Anatomia da UNESP foram segregados,
acondicionados e transportados adequadamente para o Entreposto de Resíduos Químicos do
Campus de Botucatu – UNESP, de acordo com o Plano de Gerenciamento de Resíduos
Analíticos (PGRA), identificado por AMBICAMP PGRA nº AMB-A 014-0108-00399.
3.1 Grupos experimentais
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais (6 animais cada), sendo
um grupo controle (G1) e outro grupo submetido à radiação (G2).
Tanto os animais submetidos à radiação (G2) quanto grupo controle (G1) foram
anestesiados com quetamina-xilazina (v/v) 70 mg/kg – 7 mg/kg. Para serem submetidos ao
procedimento com radiação, após indução da anestesia, os animais foram fixados a uma
plataforma e expostos à radiação gama emitida a partir de uma fonte radioativa de cobalto
posicionado a uma distância de 20 cm da superfície da pele. A dose entregue foi de 7,5 Gy em
dose única, seguindo-se um período experimental de 14 dias.
3.2 Protocolo de radioterapia
No grupo submetido à radioterapia, os ratos foram colocados em uma caixa na posição
de tratamento, ou seja, com os membros abduzidos e o pescoço hiperextendido. Todos os
ratos foram anestesiados, para impedir movimentações durante o período de emissão do feixe
19
de irradiação. A região do pescoço foi irradiada, após a colocação de cone de chumbo, com o
intuito de blindar a passagem da radiação, permitindo que apenas a região do pescoço na
região da glândula submandibular tenha sido irradiada. Os ratos foram irradiados com uma
dose única de 7,5 Gy de radiação gama a partir de um acelerador linear, marca VARIAN
6EX. Foi realizada tomografia do animal na região cervical, com a finalidade de garantir que
a dose prescrita tenha sido entregue ao órgão alvo evitando-se ao máximo a exposição das
estruturas ao redor (cavidade oral, esôfago e traquéia). Os ratos do grupo controle não foram
irradiados. Depois de um período de 14 dias após a irradiação do pescoço, os ratos, tanto do
grupo controle (n = 6), quanto do grupo experimental (n=6) foram submetidos à eutanásia
com uso de câmara de CO2, para coleta das glândulas e análise microscópica dos tecidos.
Ao longo do protocolo experimental foi realizado monitoramento diário dos
animais para quantificação da ingesta de água e ração, bem como do peso corporal dos
animais, sendo que não foram observadas quaisquer modificações significativas nesses
parâmetros, que poderiam indicar sofrimento dos animais. Por conseguinte, o experimento
seguiu o período previsto.
3.3 Processamento do material
Após o período de experimentação foram coletadas, dissecadas e pesadas as
glândulas submandibulares dos dois antímeros sendo que, as glândulas submandibulares do
antímero direito foram congeladas imediatamente em nitrogênio liquido e armazenadas em
freezer com temperatura -80°C, e do antímero esquerdo foram fixadas em solução de fixação
de glutaraldeído 2% e paraformaldeído 4% em tampão fosfato Sorensen 0,1M, pH 7,3, por
pelo menos 24 horas. Após a fixação, as glândulas foram desidratadas em série crescente de
concentração de alcoóis (70%, 80% e 90%) e mantidas em álcool 95% por 4 horas. Nas
amostras destinadas à análise morfométrica, procedeu-se a infiltração em mistura 1:1 de
álcool 95% e resina plástica por 4 horas; infiltração em resina de infiltração por 4 horas ou
overnight e por fim, inclusão em metacrilato glicol (Leica Historesin – Embedding Kit).
Secções de 5µm de espessura foram obtidas em micrótomo Leica RM2245, equipado com
navalha de vidro. As secções foram submetidas à coloração por Hematoxilina e Eosina. Já as
amostras destinadas ao estudo imuno-histoquímico, foram fixadas por imersão em
Paraformoldeído 4% PBS por 24 horas, desidratadas em etanol e seguiram rotina para
inclusão em Paraplast (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, USA), sendo posteriormente
20
seccionadas a 4 μm de espessura em micrótomo e coletadas em lâminas silanizadas para
serem armazenadas até o momento de uso.
3.4 Análise morfométrica
As lâminas obtidas foram analisadas e fotomicrografadas em microscópio
Olympus, modelo BX41 acoplado à câmera de vídeo digital, marca Olympus, modelo DP 25,
Software DP2-BSW-Olympus, e as imagens obtidas seguiram para as análises dos seguintes
parâmetros: volume do tecido, e diâmetros de ductos e lúmen.
3.4.1 Análise do volume – ductos x ácinos x estroma
As lâminas destinadas para análise morfométrica de volume do material foram
avaliadas considerando o percentual equivalente de ductos, ácinos e estroma, obtidos através
da contagem de pontos pelo método de contagem planimétrico, que consiste na sobreposição
de uma grade que totaliza 168 pontos sobre a imagem capturada, utilizando-se o software
Image-Pro Plus (Figura 1).
Figura 1 - Ductos, ácinos e estroma observados em MO quantificados pelo método de
contagem planimétrico, que consiste na sobreposição de uma grade que totaliza 168 pontos
sobre a imagem capturada, utilizando-se o software Image-Pro Plus®.
21
Para tanto, foram analisadas 2 lâminas de cada animal, sendo 6 animais por grupo
experimental, obtendo-se 36 campos histológicos por animal, de maneira aleatória e evitando-
se áreas com artefatos de preparo. Os dados obtidos foram tabulados chegando a uma
porcentagem referente a ductos, ácinos e estroma por animal, seguindo a fórmula:
PORCENTAGEM (ácino/ducto/estroma) = número de pontos coincidentes x
100/168
3.4.2 Análise do diâmetro de ductos e lúmen; altura de epitélio e razão altura de
epitélio/lúmen
Para a análise do diâmetro, foram capturados aleatoriamente 36 campos
histológicos por animal, sendo 6 animais por grupo experimental, onde foram obtidas as
medidas de área, perímetro, diâmetro máximo, mínimo e médio de ducto e lúmen, através do
software cellSens Dimension®, Olympus (Figura 2).
Figura 2. Fotomicrografia ilustrando o método utilizado para obtenção das medidas de
diâmetro do ducto e lúmen.
22
Os dados coletados foram exportados para a planilha Microsoft Excel, onde foram
obtidos, através de médias aritméticas, os respectivos valores médios. Para a análise estatística
foi utilizado o software GraphPad Prism® e o teste utilizado foi o teste T. Foram
considerados os valores médios de diâmetro máximo de ducto e lúmen e também os valores
médios do diâmetro médio do lúmen. Através desses dados foram obtidos os valores de altura
de epitélio do ducto e razão altura de epitélio/luz, através das fórmulas:
ALTURA DE EPITÉLIO (AE) = média aritmética diâmetro máximo ducto –
média aritmética diâmetro máximo lúmen
RAZÃO ALTURA DE EPITÉLIO/LUZ = EP / diâmetro médio lúmen
3.5 Imuno-histoquímica
Para a imunolocalização das AQPs 1 e 5, os cortes foram desparafinizados e
submetidos à recuperação da atividade antigênica em tampão Citrato de Sódio pH=6,0 por 15
minutos no microondas. Após lavagem em água destilada, os cortes foram submetidos ao
bloqueio da peroxidase endógena (peróxido de hidrogênio em metanol 3%) por 15 minutos no
escuro e ao bloqueio de proteínas inespecíficas com leite desnatado (MOLICO®) a 3% em
tampão PBS por 1 hora. Após esses procedimentos, os cortes foram incubados com os
anticorpos primários anti-Aquaporina 1 (concentração 1:200; Milipore®, Temecula, USA) e
anti-Aquaporina 5 (concentração 1:200 Milipore® Temecula, USA). Após a incubação
overnigth na geladeira com os anticorpos primários, os cortes foram lavados em tampão PBS
e, em seguida incubados com os anticorpos secundários anticoelho (concentração 1:200 HRP
SIGMA®, USA) por duas horas em temperatura ambiente. Após a reação, os cortes foram
revelados com cromógeno DAB (3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, SIGMA®, USA)
e contrastados com Hematoxilina por 1 minuto. Por fim, as lâminas foram montadas com
lamínulas e na sequência observadas e analisadas.
23
3.6 Western Blotting
Com o objetivo de quantificar o nível protéico das amostras, realizou-se a técnica
de Western Blotting. Para isto, os fragmentos das glândulas submandibulares congelados
foram homogeneizados a 4°C em tampão RIPA (Pierce Biothecnology, Rockford, IL, USA) e
inibidores de protease (Sigma Chemical Co) na proporção de 30 mg de tecido/100 l de
tampão de extração em homogeneizador do tipo Tureaux em 3 ciclos de 5 segundos. O
homogeneizado foi centrifugado a 15.000 rpm por 20 minutos a 4°C e o sobrenadante foi
coletado. A quantificação das proteínas foi realizada em placas de ELISA com 96 poços e a
leitura feita em leitor de ELISA pelo método de Bradford (1976)(31)
. As alíquotas (30 μg de
proteína) foram tratadas com solução tampão para corrida em gel (Laemli SampleBuffer –
BioRad®) e β-mercaptoetanol a 95 °C por 5 minutos. Em seguida, as proteínas foram
separadas por eletroforese vertical em gel de poliacrilamida SDS-PAGE de 12% e após a
eletroforese, transferidas para a membrana de nitrocelulose em sistema úmido de
transferência. Os procedimentos de bloqueio, lavagem e incubação dos anticorpos primários e
secundários foram realizados conforme recomendado pelo fabricante dos anticorpos. A
ligação inespecífica de proteínas foi bloqueada em leite desnatado (MOLICO®) a 3% em
tampão TBST por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram
incubadas overnigth com os anticorpos primários anti-Aquaporina 1 (concentração 1:1000;
Milipore® Temecula, USA) e anti-Aquaporina 5 (concentração 1:500 Milipore® Temecula,
USA) que foram diluídos em TBS-T. Posteriormente, as membranas foram lavadas em TBS-T
3 vezes de 10 minutos. Após a lavagem, foram incubados os anticorpos secundários anti-
coelho (concentração 1:200 HRP SIGMA®, USA), específico para cada anticorpo primário,
diluídos em TBS-T por 2 horas e em seguida, foram lavadas com TBS-T 3 vezes de 10
minutos. Os componentes imunorreativos foram revelados pelo kit luminescente
(Amersham™ ECL Select Western Blotting Detection Reagent) da GE Healthcare® e a
densidade óptica de cada banda foi avaliada pelo software ImageJ® para Windows®,
normalizada pela densidade do GAPDH (concentração 1:800; G9545, SIGMA®, USA), em
seguida, os resultados foram comparados entre os grupos.
3.7 Forma de análise dos resultados
As lâminas, obtidas a partir da rotina imuno-histoquímica, foram analisadas e
fotografadas em fotomicroscópio Axiophot – 2, com câmera digital, modelo AxioCam HR,
24
Zeiss do Departamento de Anatomia, Instituto de Biociências – UNESP - Campus de
Botucatu. Em seguida, foram analisadas, visando identificar possíveis alterações nas
marcações referentes às AQPs nos diferentes grupos de estudo. Com o objetivo de confirmar a
reação específica e a eficiência da técnica e dos reagentes empregados, controles negativo e
positivo foram utilizados.
Para os resultados obtidos em Western blotting foram realizadas análises
semiquantitativas por densitometria das bandas e a intensidade da marcação da banda da
GAPDH (anti-GAPDH, Sigma, St. Louis, M, USA) foi utilizada para a normalização da
intensidade das bandas entre as amostras.
Os dados obtidos foram expressos pela média ± erro padrão da média (EPM). As
comparações entre os grupos de animais foram feitas através do teste t de Student. Diferenças
nos valores de p<0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.
25
4 RESULTADOS
4.1. Estereologia e histomorfometria
O peso dos animais ao fim do período experimental não apresentou diferença
significativa entre os grupos. No entanto, houve redução significativa no peso das glândulas
submandibulares dos animais do grupo irradiado em relação aos animais do grupo controle
(Tabela 1).
Os resultados estereológicos mostraram que o tratamento de irradiação (7,5 Gy
em dose única) não alterou a porcentagem de volume de área dos ductos, ácino e estroma,
quando comparados ao grupo controle (Tabela 1).
Os dados referentes aos valores médios de diâmetro do ducto e lúmen, bem como
a altura do epitélio ductal também não apresentaram diferenças significativas. No entanto, a
análise da razão altura de epitélio/lúmen apresentou diferença significativa (p=0,0266), como
pode ser observado na tabela 2.
Tabela 1 - Peso dos animais e peso e estereologia de glândula submandibular
Parâmetros
Grupo
Controle (n=6) Irradiado (n=6)
Peso animais (g) 195,80 ± 2,39 196,70 ± 4,77
Peso de glândula
submandibular (mg) 182,70 ± 14,83 159,40 ± 3,63*
Volume ácinos (%) 60,66 ± 2,09 59,14 ± 1,77
Volume ductos (%) 23,94 ± 2,42 23,67 ± 1,89
Volume estroma (%) 15,41 ± 0,48 17,19 ± 1,24
Valores expressos em Média ± Erro Padrão da Média, p ˂0,05. Teste t de Student. *p= 0,0078.
Tabela 2. Valores médios e desvio padrão (±) dos valores de diâmetros do ducto e do
lúmen, altura de epitélio do ducto e razão entre altura do epitélio do ducto / lúmen.
Parâmetros (μm)
Grupo
Controle (n=6) Irradiado (n=6)
Ducto 48,71 ± 1,82 47,90 ± 1,33
Lúmen 6,93 ± 0,47 7,90 ± 0,48
Altura de epitélio 45,63 ± 1,62 43,22 ± 1,29
Razão epitélio/lúmen 6,68 ± 0,35 5,54 ± 0,26*
Valores expressos em Média ± Erro Padrão da Média, p ˂0,05. Teste t de Student. *p= 0,0266.
26
4.2. Imuno-histoquímica
A análise de lâminas preparadas para imunolocalização da AQP1 dos animais do
grupo controle demonstrou presença desta proteína no endotélio de canais vasculares ao redor
dos ácinos. Também foi detectada reatividade para AQP1 em células sanguíneas na luz desses
vasos. Além disso, há evidente marcação citoplasmática para a AQP1, com aparência de
grânulos, nas células ductais, sem marcação específica nas membranas apical e basal. Por
outro lado, não foi observada imunomarcação no citoplasma e nas membranas de células
acinares (Figura 3A).
Por fim, os animais do grupo irradiado mantiveram o mesmo padrão de
localização para a AQP1 no epitélio glandular, com diminuição na intensidade da marcação
imuno-histoquímica, especialmente no endotélio, quando comparados ao grupo controle
(Figura 3B).
Nos animais do grupo controle, intensa marcação para a AQP5 foi observada nas
membranas apicais e basolaterais de células acinares da glândula submandibular e, marcação
mais dispersa foi observada no citoplasma dessas células. Além disso, fraca marcação para a
AQP5 foi observada na região apical das células dos ductos intercalados (Figura 3C).
A análise imuno-histoquímica para a AQP5 na glândula submandibular de animais
submetidos ao protocolo de irradiação, evidenciou padrão de distribuição para esta AQP
semelhante ao observado no grupo controle, porém, a intensidade da marcação foi
drasticamente reduzida (Figura 3D).
27
Figura 3 - Análise imuno-histoquímica para AQP1 (A e B) e AQP5 (C e D), nos grupos
de animais controle (A e C) e irradiado (B e D). Bar = 20µm.
4.3 Western blotting
Através da técnica de Western blotting, foi confirmada a queda nos níveis
protéicos da AQP1 na glândula submandibular no grupo de animais submetidos à irradiação,
quando comparados aos animais do grupo controle, conforme observado na imuno-
histoquímica. Os resultados relativos aos níveis protéicos da AQP5, na glândula
submandibular, revelaram alteração dos níveis dessa proteína entre os grupos controle e
tratado. No entanto, não houve resultado estatístico significativo (Figura 4). Esse resultado
contrapõe à evidência de queda brusca na marcação da AQP5, claramente detectada pela
técnica de imuno-histoquímica (Figura 3C e 3D). Apesar da discrepância de resultados entre
as técnicas imuno-histoquímica e de Western blotting, optamos por respeitar o efeito
biológico claramente observado na técnica de imuno-hitoquímica sem, no entanto,
AQP1
AQP5
Grupo Controle Grupo Irradiado
28
desconsiderar a estatística utilizada para quantificação de níveis protéicos da técnica de
Western blotting.
Figura 4 - Análise dos níveis proteicos de AQP1 e AQP5, em amostras de glândulas
submandibulares. Os gráficos representam a expressão relativa da densidade óptica integrada
para as proteínas AQP1 e AQP5 normalizadas pela GAPDH e expressa pela média±EPM. O
asterisco representa a diferença estatística do grupo irradiado em relação ao grupo controle
(p<0,05).
Irradiado Controle
AQP- 1
AQP- 5
37 kDa
28,8 kDa
28,8 kDa
GAPDH
29
5 DISCUSSÃO
Diversos estudos demonstram que a radiação pode causar danos ao epitélio
glandular(33-43)
, tendo como consequência hipofunção das glândulas salivares e xerostomia.
Parece ser provável que o prejuízo funcional instalado ocorra por alterações estruturais
impostas a esses tecidos pela radiação e que, por conseguinte, ocorram alterações no
parênquima e estroma das glândulas. De maneira geral, os estudos descrevem como achado
histológico mais frequente atrofia acinar(33,35,36,37,39,40,41)
, que é caracterizada por redução do
tamanho dos ácinos ou perda de parênquima, acompanhada de fibrose ou aumento de tecido
conjuntivo intersticial(33,41)
. Também são relatadas alterações inflamatórias do estroma(37)
,
vacuolização do citoplasma e apoptose(34,42,43)
.
Quanto ao protocolo de irradiação, cabe ressaltar que os estudos divergem em
relação à intensidade e ao fracionamento da dose, de forma que enquanto alguns experimentos
utilizaram dose única(39,40)
, outros fracionaram a entrega de radiação(33,35,37,41)
. Assim, parece
ser consenso que há relação entre a dose e o dano provocado, de modo que transformações
mais intensas são observadas em resposta a doses mais altas.
Partindo dessas premissas, o presente estudo propôs, inicialmente, investigar as
repercussões funcionais e identificar possíveis alterações morfológicas induzidas pela
radiação na glândula submandibular de ratos.
Após a análise dos dados obtidos para avaliação do volume de parênquima e
estroma, não foi encontrada diferença significativa entre os grupos, em contraponto com a
literatura. Essa contraposição pode ser explicada levando-se em consideração que a dose de
radiação utilizada no experimento - única de 7,5 Gy - é menor que a dose utilizada nos
experimentos selecionados na literatura que variaram de 15 a 76,5 Gy.
Também não foram encontradas diferenças significativas na análise dos valores
médios de diâmetro e lúmen e na altura da parede ou epitélio ductal. No entanto, foi
encontrada diferença significativa (p=0,0266) na relação altura de epitélio/lúmen, que sugere
adelgaçamento da parede do ducto. Essa diferença parece ser explicada pelo fato de que as
medidas da altura de epitélio apresentaram discreta diminuição em contraposição a um ligeiro
aumento das medidas de lúmen, que embora não fossem evidentes isoladamente, quando
somadas demonstraram diferença significativa. Sendo assim, esse resultado somado à
evidência de diminuição de peso da glândula, corroboram com a tese, frequentemente
encontrada na literatura, de que a irradiação pode levar à atrofia tecidual. Por fim, outro dado
30
relevante é que a irradiação não alterou o peso dos animais ao final do tratamento, mostrando
um efeito isolado sobre a glândula submandibular.
Em relação às AQPs, observamos em nossa revisão da literatura que existem
aspectos de consenso bem como controversos quanto à expressão e localização desta família
de proteínas na glândula submandibular.
Nossos dados mostraram presença da AQP1 em eritrócitos e no endotélio de vasos
ao redor dos ductos e ácinos da glândula submandibular de animais de ambos os grupos,
controle e irradiado. Parece ser claro e amplamente aceito na literatura esse padrão de
localização da AQP1 em eritrócitos(22,44)
e em células endoteliais de vasos e capilares que
irrigam o tecido glandular de ratos e camundongos(21,22,44)
e humanos(21,45)
. Provavelmente, a
presença da AQP1 nesses vasos esteja relacionada à remoção de água deste tecido, após
reabsorção realizada pelas células epiteliais.
Em humanos, conforme revisado por Delporte(21)
, a localização da AQP1 não fica
restrita a células endoteliais, mas também está associada às células mioepiteliais que
circundam os ácinos das glândulas submandibular e parótida. Nesse caso, a presença de AQP1
nas células mioepiteliais deve estar relacionada à capacidade de contração dessas células, que
resultaria na constrição acinar para impulsionar a salivar primária em direção aos ductos,
facilitando o fluxo salivar em direção à boca(23)
.
Assim, para todos os estudos até o momento, a AQP1 não foi localizada nas
células do epitélio de glândulas salivares, sugerindo papel secundário desta proteína na
produção de saliva em condições normais(21,22,23,45)
.
No entanto, em contraponto à literatura, identificamos grânulos com marcação
intensa e consistente para AQP1, no citoplasma das células ductais de grande parte dos ductos
da glândula submandibular. Nossa hipótese para explicar a presença desses grânulos, é que,
provavelmente, sejam vesículas intracelulares para estocagem de AQP1, para possível
reciclagem rápida dessa proteína. Ou ainda, seriam vesículas intracelulares, positivas para
AQP1, com a função de controlar o volume das células ductais, já que as aquaporinas, de
forma geral, podem estar presentes nas membranas de organelas intracelulares, regulando
assim o volume da célula e da organela(18)
.
Em nosso estudo, o padrão de localização para a AQP1 na glândula
submandibular de animais, do grupo irradiado, manteve-se semelhante ao observado nos
animais do grupo controle. Porém, foi detectada diminuição na intensidade da marcação e nos
níveis proteicos de AQP1 nos animais irradiados quando comparados aos animais do grupo
controle. Resultados diferentes foram descritos por Li et al.(44)
, onde os autores relatam que
31
não houve diferença na intensidade de reação da AQP1 em glândulas salivares de ratos
expostos à radiação de 15 Gy em dose única, quando comparado ao grupo controle. Os relatos
divergentes acerca da intensidade da AQP1 poderiam ser explicados pelas diferenças na
escolha dos protocolos experimentais utilizados em cada estudo.
Assim, de acordo com nossos dados, a diminuição na imuno-reatividade para
AQP1 no endotélio pode ter prejudicado, indiretamente, a remoção de água do lúmen do
ducto. Tendo em vista que a remoção de água do lúmen para o epitélio, realizada por outro
canal de água, é absorvida pelos canais vasculares periductais para ser eliminada; um atraso
na absorção de água, causada pela redução da atividade da AQP1 no endotélio, explicaria o
discreto aumento de lúmen verificado na histomorfometria.
Assim, de forma inédita, nossos resultados sugerem que as alterações nos níveis
protéicos de AQP1, na glândula salivar irradiada, poderiam ser responsáveis por desencadear
alterações morfológicas na glândula. Talvez esse processo possa ser progressivo e acentuado
de forma dependente da dose e tempo de exposição à radiação.
Nossos achados evidenciaram marcação para AQP5 na membrana apical das
células ductais, delimitando o lúmen do ducto intercalado, e nas membranas das células
acinares, com discreta marcação citoplasmática.
A presença de AQP5 nas células acinares e ductais foi amplamente discutida na
literatura, porém sua localização e papel na fisiologia de produção de saliva envolvem
aspectos controversos. De maneira geral, a AQP5 é descrita na membrana apical das células
acinares de roedores(21,23,25,26,27,28,44,46,47)
e humanos(21,23,45)
, sendo que alguns autores também
a descrevem na membrana basolateral(25,28,46)
e citoplasma (46)
destas células. Em relação às
células ductais, diversos estudos divergem quanto à sua ocorrência(23,25,27,28,46)
ou
ausência(44,47)
no ducto intercalado.
Estudos com camundongos Knockout para AQP5 mostraram que a ausência deste
subtipo de AQP leva à redução de aproximadamente 60% da secreção de saliva e aumento na
viscosidade(48)
. Assim, é sugerido para essa AQP papel crucial na secreção de saliva. Além
disso, a presença de AQP5 nos ductos intercalados da glândula submandibular de rato sugere
que essa proteína esteja envolvida na absorção e/ou secreção de pequenos solutos, fato esse
que merece ser investigado23
.
Matsuzaki(25)
analisou a presença de AQP5 nas glândulas parótidas, sublinguais e
submandibulares em ratos e camundongos e a localizou no ácino de todas as glândulas, com a
particularidade de que sua marcação foi discreta e localizada apenas na membrana apical em
ratos, e mais evidente e também localizada nas membranas basolaterais em camundongos.
32
Quanto às células ductais, o autor descreveu marcação fortemente positiva de AQP5 na
membrana apical das células do ducto intercalado somente na glândula submandibular e
negativa para os ductos estriados e excretores de ambas as glândulas em ratos, enquanto que
para camundongos a marcação foi discreta no ducto intercalado e negativa nos demais ductos.
A presença de AQP5 somente nos ductos intercalados tanto de ratos como de
camundongos, e não nos demais, pode ser explicada quando se analisa a fisiologia de
produção da saliva. Assim, no ducto intercalado ocorre a transformação da saliva primária,
produzida pelas células acinares, em saliva secundária, através de trocas iônicas mediadas por
gradiente de concentração osmótica. Dessa forma, Na+
e Cl- são reabsorvidos e K
+ e HCO3
-
são incorporados, transformando o fluído, originalmente isotônico, em hipotônico. Nesse
panorama, torna-se evidente a necessidade de permeabilidade dos ductos intercalados
enquanto os ductos estriados e excretores mostram-se potencialmente impermeáveis visto que
sua função se limita a conduzir o fluido à cavidade bucal, sem haver outras alterações em sua
composição(23)
.
Buscando compreender a dinâmica dos canais de água na glândula salivar, vários
experimentos foram realizados com intuito de avaliar o efeito da irradiação sobre as AQPs,
considerando a radiosensibilidade dessas proteínas e o papel isolado de cada AQP na
hipofunção das glândulas salivares. Encontra-se bem estabelecido na literatura que a
irradiação altera a função das glândulas salivares, resultando em alterações no padrão de
volume e na composição da saliva(2-6,9,12,13,15,16,24,26,27,33-43,44,49)
e, portanto, as AQPs podem ter
papel relevante nesse contexto. No presente estudo, as glândulas submandibulares
apresentaram queda na marcação para a AQP5, após exposição à irradiação.
Delporte(21)
e Delporte e Steinfeld(23)
revisaram a literatura e estabeleceram
relação entre a deficiência do fluxo salivar e a diminuição da expressão de AQP5 nos ductos
intercalados e células acinares em ratos irradiados. Li et al(44)
em seu estudo, avaliaram a
reação da AQP5 em ratos expostos à radiação de 15 Gy em dose única, e encontraram
marcação de AQP5 aproximadamente 60% menor 3 dias após o protocolo de irradiação e
44% menor após 30 dias, quando comparados ao grupo não irradiado. Assim, os autores
concluíram que a queda dos níveis da AQP5 deve participar do processo de redução do fluxo
salivar em glândulas salivares irradiadas. Outros experimentos(27,49)
também demonstram que
a AQP5 sofre acentuada diminuição de imunolocalização após irradiação. Takakura et al(27)
demonstraram queda da imunofluorescência tanto da AQP5 como AQP5mRNA nas células
acinares de camundongos expostos a 15Gy de radiação X. Asari et al (49)
, analisando glândulas
33
parótidas de ratos também relataram diminuição da expressão de AQP5 após 15 Gy de
irradiação em dose única.
Em resumo, podemos confirmar a presença da AQP1 no endotélio de vasos de
maior calibre e pequenos capilares e em células sanguíneas na luz desses vasos e, de AQP5
nas células ductais delimitando o lúmen do ducto intercalado e no citoplasma e nas
membranas apical e basolateral das células acinares. Além disso, parece ser clara a
radiosensibilidade dessas proteínas, comprovada pela diminuição de suas marcações em
glândulas de animais irradiados, sendo que o mecanismo relacionado a esse processo
permanece não identificado.
Por fim, sabe-se para outros tecidos que diferentes AQPs podem ocupar um
mesmo domínio de membrana e atuar de forma dinâmica a fim de manter a homeostase dos
tecidos. Assim, provavelmente, os animais submetidos à irradiação, não apresentaram severas
alterações morfológicas e estruturais na glândula submandibular, devido a possíveis alterações
na dinâmica desses canais de água como tentativa de preservar sua fisiologia normal. Além
disso, baseado em nossos achados, podemos sugerir que a presença da AQP1 é fundamental
para manutenção estrutural da glândula submandibular. E ainda, com base em nossos
resultados, também é possível concluir que a irradiação mesmo em dose única e baixa, leva a
alterações de função da glândula salivar, tendo em vista a diminuição na intensidade da
AQP5.
34
6 CONCLUSÕES
Baseado em nossos dados, foi possível concluir que:
- O padrão de localização das AQPs 1 e 5 na glândula submandibular de rato foi
esclarecido, tendo sido, em grande parte, semelhante ao descrito na literatura;
- A irradiação - 7,5 Gy em dose única - não leva a severas alterações morfológicas
na glândula submandibular, porém é suficiente para alterar a função da glândula salivar;
- A terapia de radiação altera os padrões de intensidade de marcação das AQPs 1 e
5;
- Alterações de níveis protéicos da AQP1 devem desencadear alterações
estruturais na glândula submandibular.
35
REFERÊNCIAS
*CONFERIR TÍTULO ABREVIADO DOS PERIÓDICOS
http://portal.revistas.bvs.br/index.php?lang=pt
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39
APÊNDICE A
Tomografia computadorizada realizada previamente ao protocolo de irradiação, para
delimitação da área alvo, a fim de minimizar danos aos tecidos não-alvo. Na sequência,
protocolo de irradiação sendo realizado.
40
APÊNDICE B
Gráfico de evolução do peso dos animais dos grupos controle e irradiado ao longo do período
experimental.
41
ANEXO A
Estrutura proposta para as aquaporinas. Cada isoforma é composta por cadeia
polipeptídica simples com seis domínios que atravessam a membrana e as extremidades
carboxi (COOH) e amino (H2N) terminais voltadas para o citoplasma
Adaptado de: Agre P, Brown D, Nielsen S. Aquaporin water channels: unanswered
questions and unresolved controversies. Curr Opin Cell Biol. 1995;7(4):472-83.
Membrana
Citoplasma
