A utilização de microrganismos na biotransformação da matéria vem desde a antiguidade. Através da observação do ambiente ao seu redor, o ser humano passou a perceber que certos processos se desenvolviam devido à presença de microrganismos no meio. A descoberta de microrganismos que podiam modificar um determinado substrato possivelmente foi feita ao acaso, como ao perceber que a carne seca resistia a deteriorização; ou que ao deixar o leite azedar era possível retirar o líquido do coalho para fabricar queijo; ou ainda que ao secar os grão antes da estocagem era possível evitar o aparecimento de fungos. (TORTORA et al., 2006) A partir dessas observações, foi possível estudar mais a fundo e utilizar esses microrganismos de forma a atender da melhor forma as nossas necessidades. Os babilônios e os sumérios usavam leveduras na produção de álcool antes de 6000 AC (NAJAFPOUR, 2007). Já os egípcios, em 2000 AC, utilizavam leveduras para a produção de pães. Na Ásia, antes do nascimento de Cristo, utilizava-se Penicillium rouquefortii na produção de queijos. A 2500 anos atrás, na China, o fungo Aspergillus oryzae era usado no processo de fabricação de koji, que foi levado também para o Japão no século VII (PANDEY et al., 2007). Na metade do século XIX, Luis Pasteur estudou a função de microrganismos na produção de vários produtos como alimentos fermentados, vinho, cervejas, queijo, leite, iogurte, combustíveis e química fina. Ele identificou muitos processos microbiológicos e descobriu um dos principais princípios da fermentação: a utilização de substratos por microrganismos para a produção de metabólitos primários e secundários de interesse ao homem (NAJAFPOUR, 2007). Através do isolamento de alguns microrganismos e cultivo em meio adequado, Pasteur também conseguiu desvendar a base do que hoje recebe o nome de biotecnologia. Para se conseguir um bom rendimento muitas vezes é necessária presença de um cultivo puro com somente um microrganismo isolado e evitar o aparecimento de microrganismos indesejados, que podem alterar o processo. Além disso, uma vez terminado o processo, é necessário que os microrganismos presentes também sejam desativados . Para isso, Pasteur desenvolveu em 1864 o processo de pasteurização, que consiste em aquecer um determinado meio a uma temperatura de 60ºC por 30 minutos (SCHWARTZ, 2001).

Durante a Primeira Guerra Mundial começou-se a utilizar microrganismos para a produção de substâncias como etanol, acetona e ácido cítrico. Foi durante esse período que foi feito pela primeira vez um cultivo microbiológico asséptico em larga escala, quando Chaim Weizmann usou um fermentador líquido para a produção de acetona por Clostridium acetobutylicum (STANBURY et al.,1995). A partir da Segunda Guerra Mundial, os microrganismos tiveram importância na produção em larga escala de antibióticos. (TORTORA et al., 2006) As usinas de bioprocessos são muito importantes na indústria de alimentos, química fina, e farmacêutica. Apesar de que a produção de produtos como cervejas, vinhos e queijos já vêm acontecendo desde a antiguidade, atualmente a produção é muito mais controlada e eficiente (NAJAFPOUR, 2007). Por exemplo, primeiramente, os pães eram fermentados com leveduras presentes no meio ambiente. Mais tarde passou-se a manter uma cultura própria de leveduras, guardando uma parte da produção anterior para servir de inóculo para a próxima. Atualmente pode-se comprar o fermento produzido industrialmente de forma padronizada. (TORTORA et al., 2006) Processos como a produção de pães, vinhos e queijos, que antes eram realizados em casa ou pequenas propriedades, passaram a ser realizados em grades indústrias, evidenciando a grande vantagem que a microbiologia pode dar à indústria (PRESCOTT et al., 1959). Exemplificando, pode-se citar a ação de leveduras em extratos de frutas ou grãos, fazendo

fermentação alcoólica, onde os carboidratos são reduzidos a piruvato e então ocorre a reoxidação da forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e a produção de moléculas de etanol. Outro tipo de fermentação inclui o cultivo de bactérias acéticas na produção de vinagre. Bactérias lácteas são responsáveis pela preservação do leite, produção de iogurte e queijo. Num cultivo pode-se visar também à produção de biomassa, onde as células estão em meio nutritivo que favorece a multiplicação, como na produção de fermento (NAJAFPOUR, 2007). A tabela 1 mostra alguns produtos de fermentação.

Tabela 1- Produtos de origem fermentativa Produto da fermentação Etanol (não utilizado em bebidas) Ácido 2-cetoglucônico Pectinase, protease Amilase bacteriana Protease bacteriana Dextrano Sorbose Cobalamina (vitamina B12) Ácido Glutâmico Ácido glucônico Ácido Lático Ácido cítrico Acetona-butanol Insulina, interferon Início de cultura Microrganismo Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp. Aspergillus niger, A. aureus Bacillus subtilis B. subtillis Leuconostoc mesenteroides Gluconobacter suboxydans Streptomyces olivaceus Brevibacterium sp. Aspergillus niger Rhizopus oryzae Aspergillus niger, A. wentii Clostridium acetobutylicum Aplicação Química fina Intermediário para o ácido Daraboascórbico Agente clarificante em sucos de frutas Amido modificado, tratamento de papel Tratamento de fibras, removedor manchas Estabilizante alimentício Manufatura de ácido ascórbico Suplemento alimentar Aditivo alimentar Produtos farmacêuticos Alimentos e produtos farmacêuticos Alimentos, medicamentos Solventes, intermediários químicos Terapia humana Produção de pães, queijo e iogurte Suplemento alimentar Antibióticos Antibióticos Antibióticos

E. coli recombinante Levedura de pão, Lactobacillus bulgaricus Proteína microbiana Candida utilis Penicilina Penicillium chrysogenum Cefalosporina Cephalosparium ecremonium Eritromicina Streptomyces erythreus Fonte: NAJAFPOUR, 2007

Os microrganismos utilizam uma fonte orgânica e produzem metabólitos primários como o etanol, que são formados durante a fase de crescimento exponencial, ao mesmo tempo em que as novas células são produzidas, e a curva de produção do metabólito segue a curva de crescimento celular quase que paralelo, como mostra o gráfico esquerdo da figura 1. Outros produtos como a penicilina e polissacarídeos são considerados metabólitos secundários, sendo produzidos durante a fase estacionária. A fase de crescimento exponencial anterior a produção de metabólitos secundários é camada de trofofase, e a etapa estacionária em que há produção é chamada de idiofase, como mostra o gráfico da direita da figura 1.

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Um metabólito secundário pode ser a simples conversão de um metabólito primário ou também pode ser originado de outros compostos, mas pode necessitar uma quantidade suficiente de células ou metabólitos primários acumulados

(NAJAFPOUR, 2007; TORTORA et al., 2006).

- Metabólito primário e secundário.

Fonte: TORTORA et al., 2006. Os bioprocessos vêm substituindo uma série de processos que antigamente só podiam ser feitos quimicamente. Eles apresentam

algumas vantagens como a possibilidade de utilizar matéria-prima barata e disponível no mercado (como por exemplo, o bagaço de cana), o processo pode ser desenvolvido sob pressões e temperaturas normais (evitando sistemas pressurizados caros e perigosos), e não há a produção em quantidade de resíduos tóxicos (e quando há a produção, ainda existe a possibilidade de utilizar um outro processo microbiológico no tratamento do resíduo). (TORTORA et al., 2006) Os processos desenvolvidos no cultivo de microrganismos se desenvolvem geralmente em equipamentos denominados biorreatores. Eles consistem em um sistema aberto ou fechado, onde há a manipulação dos parâmetros físicos (pH, concentração de reagentes, transferência de calor e massa, aeração) de forma a regular a catálise, promovendo um melhor rendimento em biomassa e/ou produto, além de tentar minimizar os custos de produção (PURICH & ALLISON, 2000). Eles

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geralmente são tanques cilíndricos que apresentam ou não sistema de agitação, mas também podem ser um simples erlenmeyer. Novos modelos de biorreatores aparecem constantemente, de forma a melhorar a qualidade do processo dependendo do tipo de célula a ser cultivada (bactérias, fungos, tecidos animais ou vegetais, células ou enzimas imobilizadas, etc.) (DORAN, 1995). Ao se utilizar um biorreator, procura-se atender, se não todos, a maioria dos requisitos listados abaixo: O recipiente onde ocorrerá o cultivo deverá permanecer em condições assépticas durante um grande período de tempo. Devem ser promovidas condições adequadas de agitação e areação para satisfazer as condições metabólicas dos microrganismos, mas sem haver danificação mecânica das células dos mesmos devido ao processo. O consumo de energia deve ser minimizado. Deve haver um controle de temperatura e pH. Deve haver uma forma de retirar amostras do fermentado para o controle do processo. Não deve haver perdas excessivas devido à evaporação. Não deve haver a necessidade de uma grande quantidade de trabalhadores para a sua operação, limpeza e manutenção do tanque de fermentação, minimizando assim os custos com relação à mão-de-obra. Materiais mais baratos, mas que ainda propiciam um rendimento desejado, devem ser utilizados. (STANBURY et al.,1995)

O cultivo dos microrganismos pode ocorrer em diferentes tamanhos, como em escala de bancada, piloto ou de planta industrial. Biorreatores de escala laboratorial variam de 2 à 100 litros, mas durante operações em larga escala na indústria eles podem chegar a 100000 litros. Inicialmente utiliza-se biorreatores menores para se investigar qual é o melhor microrganismo a ser utilizado, qual meio de cultivo proporcionará um melhor crescimento e quais condições operacionais são mais favoráveis para a formação do produto desejado. São feitos estudos sobre parâmetros como: transferência de massa, agitação, taxa de cisalhamento, formação de espuma, energia necessária, taxa de diluição, forma e tamanho do biorreator, pH, temperatura, entre outros. Isso

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deve ser feito em pequena escala porque não seria vantajoso fazer esses testes em larga escala, correndo o risco de perder grandes quantidades de material e ter um prejuízo econômico (NAJAFPOUR, 2007). O processo de mudança de escala está exemplificado esquematicamente na figura 2. Após a fase de testes em frascos de 250mL a 1L e análise dos fatores de produção, passa-se para um biorreator de bancada com capacidade de 1 a 2 litros, o qual é normalmente equipado com sensores de ajuste de

temperatura, pH e aeração. Isso propicia uma análise mais cuidadosa de alguns parâmetros e um controle maior sobre o processo do que o cultivo em erlenmeyer. Nessa etapa também deve-se observar se o processo se desenvolve melhor em batelada, semibatelada ou contínuo. Próximo passo é o cultivo em um biorreator em escala piloto de 100 a 1000 litros. A cada processo de aumento de escala deve-se observar se há alguma alteração na resposta celular com relação ao rendimento do processo. Se tudo estiver correto, a etapa final seria um biorreator de escala industrial (DORAN, 1995).

- Processo de aumento de escala

Fonte: Adaptada de DORAN, 1995

Mas ao mudar de escala laboratorial para escala industrial não ocorre somente a mudança do tamanho em proporção. Devem-se preservar alguns parâmetros de forma a continuar tendo um bom processo. Esses parâmetros seriam: Número de Reynolds ou fatores de momento semelhantes. Consumo de energia constante por unidade de volume de líquido. Velocidade da pá de agitação constante. Mistura do líquido e tempos de recirculação semelhantes. Coeficiente volumétrico de transferência de massa constante.

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Manter todos os fatores ambientais constantes para o microrganismo. (NAJAFPOUR, 2007)

O cultivo de microrganismos pode ser feito utilizando substratos de baixo valor comercial, muitas vezes podendo ser resíduos de outros processos. A produção de álcool e solventes orgânicos muitas vezes utiliza resíduos como fonte de carbono ou nitrogênio, sendo o bagaço de cana, por exemplo, bem importante na indústria alcooleira. Isso é bastante viável no cultivo de microrganismos, mas já no cultivo de células animais isso já não é possível devido ás várias exigências da célula, o que geralmente encarece o processo de cultivo de células animais (NAJAFPOUR, 2007). O papel de um engenheiro de bioprocessos é entender o mecanismo de produção e selecionar o melhor biocatlisador (microrganismo ou enzima) para tal. Após, deve-se estudar as melhores condições ambientais que propiciam um melhor crescimento e uma melhor produção. Também cabe ao biotecnologista otimizar o processo procurando recursos mais econômicos, mas que ainda produzam um rendimento satisfatório (NAJAFPOUR, 2007). O artigo em anexo mostra a função de um engenheiro de bioprocessos e os conceitos básicos que um profissional dessa área deve ter para o desenvolvimento de um bom trabalho.

2- DEFINIÇÃO DE FERMENTAÇÃO

Antes de se elucidar o papel dos microrganismos na fermentação, ela era definida de forma diferente do conceito aceito atualmente. Por exemplo, em 1839, Liebig definiu o termo fermentação como sendo . a putrefação de substâncias vegetais que se realiza sem que haja a liberação de nenhum odor, ou pelo menos nenhum desagradável. . Já Luis Pasteur tentou associar o processo de fermentação com o desenvolvimento de organismos: . fermentação, longe de ser o fenômeno sem vida, é um processo vivo. todo fenômeno de fermentação é correlacionado com o desenvolvimento de células micodérmicas e plantas, as quais eu preparei e estudei em estado puro e isolado.

(SCHWARTZ, 2001) Atualmente, o termo fermentação pode apresentar diferentes significados dependendo o setor do conhecimento que o utiliza. O sentido geral do termo

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significa qualquer processo de cultivo microbiológico que ocorre com ou sem ar. O significado bioquímico da fermentação é o processo metabólico onde o substrato orgânico atua como doador e como receptor final de elétrons, ocorrendo em condições anaeróbias, mas sem a utilização de uma cadeia respiratória, como acontece na respiração anaeróbia. (TORTORA et al., 2006) O termo fermentador também pode gerar alguma discordância devido a esses conceitos. Ele primeiramente foi utilizado para descrever os tanques onde ocorria o cultivo. Como a maioria dos cultivos realizados nesses tanques era de forma aeróbica, propôs-se um novo nome para não contradizer a definição bioquímica de fermentação. O termo biorreator então começou a ser usado para descrever o local onde eram realizados cultivos de microrganismos em condições aeróbicas e anaeróbicas (NAJAFPOUR, 2007). A fermentação ocorre como uma forma de reoxidar as coenzimas reduzidas NADH e NADPH que são formados durante a glicólise, de forma a manter o balanço de redução-oxidação dentro da célula. Os elétrons são transferidos das coenzimas para um composto orgânico, fornecendo NAD + e NADP+ suficientes para a continuação da glicólise. (TORTORA et al., 2006) Durante uma fermentação, um mesmo composto orgânico pode sofrer uma oxidação ou outras a redução dependendo do microrganismo. Por exemplo, no caso do ácido pirúvico, ele pode sofrer uma oxidação formando ácido acético ou pode sofrer uma redução e formar ácido láctico. (CROCOMO, 1967) O tipo de fermentação realizada vai depender da espécie de microrganismo utilizada, do substrato que está sendo fornecido e dos tipos de enzimas que ele possui e estão ativas. A análise do tipo de produto final formado na fermentação também pode ser utilizada como forma de identificação de microrganismos, realizando testes bioquímicos. A figura 3 mostra o tipo de fermentação que segue alguns microrganismos.

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Produtos finais de fermentação dependendo do microrganismo

Fonte: TORTORA et al., 2006 3- METABOLISMO MICROBIOLÓGICO

Antes do processo metabólico que inclui a fermentação, há as reações de quebra do substrato, que geralmente é a glucose. Essa via recebe o nome de glicólise ou via de Embden-Meyerhof, onde a glucose é catabolisada a piruvato e a energia livre liberada é estocada na forma de ATP e NADH.

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- Glicólise

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

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Como mostra a , a glicólise pode ser dividida em duas etapas, a fase preparatória e a fase de pagamento. Na fase preparatória, inicialmente ocorre a fosforilação da glucose em C-6 através da enzima hexoquinase. Para isso deve haver o gasto de uma molécula de ATP. Há então uma conversão entre glucose-6fosfato em frutose-6-fosfato através da fosfoexose isomerase. Após, a molécula sofre outra fosforilação, mas agora em C-1, formando frutose-1,6-bifosfato. Essa molécula já está pronta para sofrer uma quebra em duas moléculas de três carbonos, uma diidroxiacetona fosfato e um gliceraldeído-3-fosfato. É nesse passo que ocorre a lise da molécula, e por isso ela se chama glicólise. A diidroxiacetona é isomerizada em outro gliceraldeído-3-fosfato. Aqui termina a etapa de preparação, onde a molécula de glucose é preparada com o gasto de 2 ATP, para que depois essa energia armazenada possa gerar lucros energéticos. A fase de pagamento inicia-se com duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato, as quais são oxidadas e fosforiladas por fósforo inorgânico, formando 1,3bifosfoglicerato. A partir desse ponto acontecerá a liberação de energia, onde o pagamento é feito na forma de produção de ATP através da fosforilação à nível de substrato, diferentemente da fosforilação ligada a respiração que ocorre na cadeia respiratória. Um dos fósforos do 1,3-bifosfoglicerato será transferido para uma molécula de ADP através da ação da enzima fosfoglicerato quinase, formando 3fosfoglicerato. A enzima fosfoglicerato mutase irá então fazer uma transferência reversível do grupo fosfato do C-3 para o C-2, sendo que a transferência ocorre em duas etapas. Primeiramente um grupo fosfato presente no sítio ativo da enzima se liga ao C-2 do substrato, e depois o grupo fosfato em C-3 é transferido para a enzima. Depois desse processo tem-se 2-fosfoglicerato. Essa molécula irá então sofrer uma desidratação através da enolase, formando fosfoenolpiruvato (PEP). O PEP é uma molécula de alto potencial de transferência do grupo fosforila, e isso ocorrerá com a ação da enzima piruvato quinase. Esta enzima requer a presença de íons K+ e Mg2+ ou Mn2+, e nesse ponto acontece mais uma fosforilação a nível de substrato, com a formação de mais uma molécula de ATP por PEP. O resultado final é a formação de piruvato. Considerando inicialmente uma molécula de glucose e desconsiderando desvios para outras vias, a cada molécula de glucose metabolizada, tem-se no final duas moléculas de piruvato, dois ATP e dois NADH formados.

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Essa é a via pela qual a maioria dos organismos realiza a quebra da glucose. No entanto, alguns microrganismos procariotos utilizam a via de Entner-Doudoroff, pois não apresentam fosfofrutoquinase-1 e não pode converter frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifosfato. No entanto, a via das pentoses-fosfato (ou ciclo da hexose monofosfato) pode ser feita ou não por esses organismos (RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001). Inicialmente, a glucose-6-fosfato é então transformada em ácido 6fosfoglucônico por uma enzima desidrogenase. Esse ácido é então transformado em piruvato através de duas reações:

-HOH

6-P-gluconato 2-ceto-3-desoxi-6-P-gluconato (CDGP) CDGP piruvato + gliceraldeído-3-fosfato (CROCOMO, 1967) A gliceraldeído-3-fosfato irá seguir o resto da via glicolítica normal até chegar a piruvato. A mostra a via Entner-Doudoroff. Essa via é geralmente realizada por organismos como Pseudomonas, Azotobacter, Rhizobium,

Enterococcus faecalis e Zymomonas mobilis.(TORTORA et al., 2006) : Via de Entner-Doudoroff

H+ + NADPH

ATP

ADP

NADP+

Glucose

Glucose-6-P

Ácido 6-fosfoglucônico H2O

Etapas 6 a 10 da glicólise

Ácido Pirúvico

GA-3P

CDGP

Fonte: Adaptada de TORTORA et al., 2006

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Depois de ocorrida a transformação de glucose até piruvato, em condições aeróbias ocorrerá o ciclo de Krebs, como mostra a . Mas como se pode observar, esse ciclo de reações gera muitos NADH os quais seguem para a cadeia respiratória e há a transferência de elétrons, onde o aceptor final é o oxigênio. No entanto, em condições de anaerobiose, a célula não conseguirá manter o balanço adequado de NAD+/NADH, pois não poderá utilizar essa cadeia.

: Ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido cítrico)

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

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Portanto, em condições anaeróbias evita-se o ciclo do ácido cítrico (exceto nos casos de produção de metabólitos para biossíntese), e utiliza-se as vias fermentativas, as quais, apesar de não gerar tantas moléculas de ATP como o ciclo de ácido cítrico, conseguem reoxidar NADH suficientemente para manter o funcionamento celular. A mostra algumas das possíveis vias de fermentação.

- Vias Fermentativas

* Reações em que há reoxidação de NADH

Fonte: RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001

A

seguir

serão

discutidas

em

maiores

detalhes

algumas

dessas

fermentações.

3.1- FERMENTAÇÃO ETANÓLICA

É possível obter etanol de três formas: por via destilatória, por via sintética (a partir de hidrocarbonetos não saturados e de gases de petróleo e da hulha) e por via fermentativa. A forma fermentativa é uma das mais vantajosas aqui no Brasil, pois há uma grande disponibilidade de matéria-prima (LIMA et al., 2001).

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O processo reacional do etanol já começou a ser descrito em 1815 por Gay Lussac através da equação: C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 G=-56000 cal/mol (CROCOMO, 1967) O francês Luis Pasteur provou que a natureza dessa reação é microbiana, e se realiza através de uma fermentação em condições anaeróbias (LIMA et al., 2001). Ele observou que a presença de O2 no meio inibia a formação de etanol, diminuindo o consumo de açúcar pela levedura e aumentando o crescimento celular. Essa propriedade foi chamada de Efeito Pasteur. (CROCOCOMO, 1967) No entanto, o efeito Pasteur é somente observado em culturas quimioestáticas quando a concentração de substrato limita o crescimento ou quando o cultivo é feito na ausência de fontes de nitrogênio (LAGUNAS et al., 1982). Lagunas e colaboradores fizeram experimentos aeróbicos e observaram que S. cerevisiae cultivada na presença de fonte de nitrogênio usava somente 3 a 20% do açúcar metabolizado para respiração, o restante ia para a via fermentativa do etanol. Já leveduras cultivadas em meios sem nitrogênio utilizavam 25 a 100% dos açúcares metabolizados para respiração. No entanto, isso não significava que ouve um aumento da respiração, mas sim uma perda da função fermentativa devido à inativação dos sistemas de transporte de açúcares (LAGUNAS et al., 1982). Com o avanço dos estudos, foram elucidados os mecanismos reacionais intermediários da

produção de etanol a partir de glucose. Até a formação de piruvato a reação segue exatamente igual a glicólise. O ácido pirúvico formado é descarboxilado a acetaldeído e dióxido de carbono. Essa etapa da reação é um processo irreversível que exige a presença da enzima carboxilase, da coenzima difosfato de tiamina e de íons magnésio. O acetaldeído é então reduzido a etanol através da ação da enzima desidrogenase alcoólica, ocorrendo também nessa etapa a reoxidação de um NADH (). O conjunto de reações que resultam na formação de álcool etílico e CO 2 à partir de um carboidrato recebe o nome de via de Embden-Meyer-Parnas. Essa via metabólica foi demonstrada in vitro pela primeira vez em 1950 por Koshland e Westheimer, utilizando glucose com carbono marcado radiativamente em C1, e após o seu consumo por leveduras, verificou-se que havia carbono radioativo na molécula de etanol, mais especificamente nodo grupo metil (CROCOMO, 1967).

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Transformação de piruvato a etanol

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

Nesse tipo de fermentação há um rendimento de 2 ATP por molécula de glucose consumida, pois são gastos dois ATP na reação da hexoquinase, mas são formados quatro ATP (na reação de formação de ácido 3-fosfoglicérico e na formação de piruvato). As leveduras podem consumir além da glucose outros açúcares, como manose e galactose. A manose sofre uma fosforilação através da hexoquinase, formando manose-6-fosfato, que por sua vez é transformada em frutose-6-fosfato pela isomerase de manosefosfato, possibilitando assim a sua entrada na glicólise. Já a galactose sofre uma transfosforilação, formando galactose-1-fosfato (CROCOMO, 1967). Também podem ser utilizados açúcares exógenos como maltose e sacarose, e endógenos como glicogênio e trealose, como mostra a figura 9. Durante o cultivo, pode ocorrer também a formação de produtos secundários através de outras vias metabólicas realizadas para a o crescimento celular e produção de biomassa. Estima-se que 95% dos açúcares metabolizados tem como destino a produção de etanol e CO2. Os outros 5% são desviados para a formação de glicerol, ácidos orgânicos (como ácido succínico, acético e pirúvico), álcoois superiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, entre outros (LIMA et al., 2001). A fermentação alcoólica é realizada normalmente por leveduras como Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus, S. carlbergensis e S. warum, e bactérias como Zymomonas mobilis, sendo que as leveduras são os microrganismos mais utilizados na indústria.

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- Utilização de outros carboidratos na fermentação por Saccharomyces

Fonte: LIMA et al., 2001

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3.2- FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO

O ácido lático foi isolado pela primeira vez a partir do leite azedo por Scheele. Pasteur também realizou estudos com relação à fermentação láctica. Ele observou que assim como é sempre encontrada levedura na produção de cerveja, onde o fermento promove a conversão de açúcares em álcool e dióxido de carbono, deve haver um fermento que produza ácido láctico - a levedura láctica - convertendo açúcares em lactato. Ele também verificou que nessa fermentação o produto principal é o ácido láctico, mas também é possível encontrar no caldo fermentado outros produtos como ácido butírico, álcool e manitol, sendo que suas proporções podem variar (PASTEUR, 1857). Evitar essas outras vias e direcionar os compostos de carbono somente para a produção de lactato é uma forma de otimizar a sua produção.

- L-lactato a partir de piruvato

Fonte: LEHNINGER et al., 2006

O ácido lático pode ser produzido através da fermentação de bactérias como os bactérias homofermentativos (Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L. pentosus, L. casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras e ficomicetos, e também de algumas algas. Ele também pode ser produzido de forma sintética, através da hidrólise da lactonitrila (LIMA et al., 2001). O ácido lático pode apresentar duas formas esterioquímicas, devido ao carbono quiral presente. Durante a fermentação são formadas as duas formas, formando uma mistura racêmica (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação ocorre em temperaturas relativamente altas e dependerá do microrganismo utilizado. Lactobacillus delbrueckii cresce bem à temperatura de 45ºC; L. bulgaricus, pode ser incubado em 45-50ºC; já L. pentosus, L. casei, e Streptococcus lactis podem ser cultivados em 30ºC (PRESCOTT et al, 1959).

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O ácido lático é bastante utilizado na indústria de alimentos como acidulante e conservante de refrigerantes, geléias, xaropes e sucos de frutas (LIMA et al., 2001).

3.3- FERMENTAÇÃO DO GLICEROL

O glicerol é usado amplamente como solvente, adoçante, constituinte de loções, anti-sépticos, adesivos, tintas, agente anti-congelante. Ele também é utilizado na preparação de meios nutritivos biológicos e na produção de nitroglicerina, borracha sintética e massa de modelar (PRESCOTT et al., 1959). Ao estudar vinhos e cervejas, Luis Pasteur observou que leveduras regularmente formavam glicerol. Um pouco antes da Primeira Guerra Mundial, Neuberg, ao tentar elucidar a fermentação alcoólica através da suplementação do meio de cultivo com sulfito de sódio, acabou descobrindo que dessa forma havia um incremento na produção de glicerol por leveduras (PRESCOTT et al., 1959). Normalmente, produz-se cerca de 3% de glicerol durante a fermentação alcoólica, mas, ao se alterar o pH através da adição de sais alcalinos (carbonato de amônio, bicarbonato de sódio, acetato de sódio ou fosfato dissódico), é possível obter de 9 a 16% de glicerol (CROCOMO, 1967). Segundo os trabalhos de Neuberg, a produção de glicerol pode ser feita de quatro maneiras: fermentação alcoólica normal, presença de sulfito, soluções alcalinas ou soluções neutras. No primeiro caso (), durante a fermentação alcoólica, pode ser desviado um pouco de gliceraldeído 3-fosfato, transformado em diidroxiacetona fosfato. Esta, por sua vez, sofre a ação de

desidrogenase de glicerofosfato, reduzindo um NADH e formando glicerol 3-fosfato. A enzima fosfatase retira o fosfato desse composto e forma o glicerol. (CROCOCOMO, 1967)

- Produção de glicerol durante a fermentação alcoólica

Fonte: Adaptado de CROCOMO, 1967.

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Já na presença de sulfito, haverá acúmulo maior de glicerol. Isso ocorre devido a fixação do acetaldeído pelo sulfito de sódio, através da reação: CH3-CHO + Na2SO3 + H2O CH3-CHO-HSO3Na + NaOH (PRESCOTT et al, 1959) Normalmente o acetaldeído é transformado em etanol, mas como ele está sendo fixado e a redução a etanol não acontece, uma outra molécula faz o papel de aceptor de hidrogênio do NADH. Isso faz com que a via de formação de glicerol seja favorecida (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação utilizando sulfito foi utilizada pelos alemães durante a Primeira Guerra Mundial. Outros agentes que impeçam a transformação de aldeído a álcool também podem ser utilizados, como carvão, hidrazidas e oxalato de fenilhidrazina, desde que não haja impedimento de outras reações in vivo (CROCOMO, 1967). Quando a fermentação ocorre em meio alcalino, há uma alteração no curso normal da fermentação, gerando a produção de etanol, ácido acético, glicerol e CO 2. Nessas condições, o acetaldeído não é reduzido a etanol, mas sim sofre a ação da mutase aldeídica, formando ácido acético e etanol (). Como não ocorreu a reoxidação do NADH, a formação do glicerol a partir de diidroxiacetona fosfato é favorecida (CROCOMO, 1967).

- Ação da mutase aldeídica

Fonte: CROCOMO, 1967.

A última forma de fermentação seria em meio neutro. Nesse caso não haverá produção de etanol nem CO2, sendo acumulados glicerol e ácido pirúvico. Essa reação ainda não está muito bem elucidada, mas é representada como: C6H12O6 CH3-CO-COOH + CH2OH-CH2OH-CH2OH

(CROCOMO, 1967)

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3.4- FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA

Pasteur foi o primeiro pesquisador a mostrar que o álcool butílico era um produto direto da fermentação, através dos seus experimentos da fermentação butírica do ácido lático e do lactato de cálcio em 1861: M. Pasteur. croit pouvoir affirmer que l alcool butylique est um produit ordinaire de la fermentation butyrique. (PRESCOTT et al., 1959). No entanto, foi somente em 1905 que Schardinger notificou a produção de acetona através da fermentação (JONES & WOODS, 1986). A partir de 1910, o químico Chaim Weizmann trabalhou junto com outros pesquisadores no processo de fabricação de borracha sintética. Para isso seriam necessários compostos como butanol e isoamil, que

seriam produzidos através de microrganismos. Em 1910 eles acharam um microrganismo capaz de produzir butanol quando cultivado em batatas. Entre 1912 e 1914 Weizmann isolou várias culturas, as quais ele chamou de BY (e que atualmente são classificadas como bactérias da espécie Clostridium acetobutylicum). Durante a Primeira Guerra Mundial a Inglaterra precisou de grandes quantidades de acetona, e foi o microrganismo isolado por Weizmann que propiciou um aumento na produção. Como durante esse período não houve necessidade de butanol, ele foi estocado em grandes quantidade, sendo ele posteriormente a guerra muito utilizado como solvente na indústria automobilística (JONES & WOODS, 1986). A produção desses solventes em escala industrial era feita antigamente na forma de batelada, usando fermentadores sem agitação mecânica e com capacidade de 50000 a 200000 galões. Os fermentadores eram enchidos de 90 a 95% de sua capacidade e o restante era preenchido com uma camada gasosa de dióxido de carbono estéril. O dióxido de carbono também era borbulhado antes e depois da inoculação para facilitar a mistura (JONES & WOODS, 1986). As bactérias freqüentemente utilizadas para a fermentação acetona-butanol são do gênero Clostridium. Esses microrganismos são esporulados, apresentam uma forma de bastão e são sacarolíticos (fermentam açúcares). Devido a esses fatores o isolamento dessas bactérias é relativamente fácil. Elas são geralmente encontradas em associação com plantas como batatas, raízes de legumes e cereais. (JONES & WOODS, 1986). Cada empresa que produz esses solventes pode possuir uma cepa de bactérias diferente. A maioria dessas culturas é utilizada em processos já

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patentiados (BEESCH, 1952). As diferenças que as cepas de Clostridium podem apresentar podem ser com relação à proporção de solventes que produzem, como, por exemplo: C. beijeirinckii (C. butylicum) produz solventes na mesma proporção que C. acetobutylicum, mas ao invés de acetona produz isopropanol; C. aurantibutyricum produz tanto acetona quanto isopropanol junto com butanol; já C. tetanomorphum produz quantidades equimolares de butanol e etanol (JONES & WOODS, 1986). A temperatura ótima para a fermentação aceto-butanólica é em torno de 30,6ºC, podendo variar de 28,9 até 33,3ºC tomando as devidas precauções de controle do processo. Os microrganismos são estritamente anaeróbios e tem um maior rendimento em condições anaeróbias. O pH pode variar de 5 a 7, dependendo da cepa. Usualmente utiliza-se um pH inicial de 5,5-6,5 e final de 5,2-6,2 (BEESCH, 1952). A maioria das bactérias desse gênero necessita de nitrogênio de proteínas degradadas no meio nutritivo para otimizar o processo fermentativo. Essa fonte de nitrogênio inclui produtos intermediários de degradação de proteínas, como polipeptídeos e aminoácidos, e também produtos finais de degradação como amônia e seus sais. Os sais de amônia e a própria amônia dão resultados satisfatórios, mas é preferível utilizar a amônia acompanhada de outros compostos nitrogenados mais complexos. Elas também precisam de uma fonte de fosfato, caso as fontes de carbono utilizadas (como melaço ou bagaço) não contenham quantidades mínimas necessárias (BEESCH, 1952). A via metabólica de produção de acetona e butanol está presente na figura 13. Durante a fase inicial de crescimento (também chamada de fase acidogênica), a bactéria produz hidrogênio, dióxido de carbono, acetato e butirato, resultando na diminuição do pH do meio. Quando o cultivo entra em fase estacionária (chamada também de fase solventogênica), o metabolismo passa a produzir solventes como acetona e butanol, e também ocorre a reassimilação dos ácidos produzidos na primeira fase, ocasionando a elevação do pH (JONES & WOODS, 1986).

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- Produção de Acetona-Butanol

Fonte: RHEM & REED, 1981.

3.5- FERMENTAÇÃO BUTANOL-ISOPROPANÓLICA

A formação de butanol e isopropanol como produtos principais ocorre através do microrganismo Clostridium butyricum, que é uma bactéria anaeróbia formadora de esporos, com temperatura ótima de 37ºC, flagelada e Gram-positiva em culturas jovens (podendo ser Gram-negativa em culturas mais velhas). Durante a Segunda Guerra Mundial utilizava-se Clostridium toanum para esse processo. Em 1926, Morikawa também isolou um microrganismo que produzia isopropanol e butanol denominado Bacillus technicus (PRESCOTT et al, 1959). Os produtos finais da fermentação incluem butanol, isopropanol, dióxido de carbono, hidrogênio, pequenas quantidades de ácido acético e butírico, e possivelmente traços de acetona e ácido fórmico (PRESCOTT et al, 1959). O rendimento da fermentação é de aproximadamente 53-65% de butanol, 19-44% de isopropanol, 1-24% de acetona e 3% de etanol (LIMA et al., 2001). O caminho metabólico seguido até a formação de isopropanol e butanol está exemplificado na figura 14.

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A fermentação é otimizada quando o suprimento de nitrogênio é feito através de proteínas parcialmente hidrolisadas (como no caso anterior) e a adição de malte, extrato de leveduras, peptonas, água de maceração de milho ou glúten. A adição de acetona ou de outros aceptores de hidrogênio aumentam o teor de isopropanol no meio fermentado (LIMA et al, 2001). Certas substâncias podem inibir a formação de alguns produtos. A adição de bicarbonato de sódio durante a fermentação pode inibir a formação de solventes, principalmente o isopropanol, formando mais sais de ácidos acético, lático, pirúvico e fórmico (LIMA et al, 2001)

- Fermentação Butanol-isopropanólica

Fonte: Adaptada de RHEM & REED, 1981.

3.6- FERMENTAÇÃO ACETONA-ETANÓLICA

A produção de acetona e etanol em conjunto acontece por microrganismos como Bacillus macerans e Bacillus acetoethylicus. No final da fermentação pode-se ter como produtos a acetona, o etanol, o ácido acético e o ácido fórmico (LIMA et al., 2001). Schardinger em 1905 foi o primeiro a descobrir a acetona como produto de uma fermentação bacteriana. O microrganismo por ele isolado era o Bacillus

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macerans. Essa é uma bactéria móvel, esporulada, Gram-negativa e anaeróbia facultativa (PRESCOTT et al, 1959). A temperatura ideal para a fermentação varia entre 40 e 43ºC e a fermentação dura aproximadamente 6 dias. O pH do meio influencia o

produto formado. Em pH elevado há a formação de mais ácidos voláteis e menos etanol, enquanto em pH 5,8-6,0 há estímulo da produção de solventes (LIMA et al., 2001). No entanto, o pH ótimo de crescimento para B. aceoethylicus é 8-9. (PRESCOTT et al, 1959). Ao meio de cultura é geralmente adicionado carbonato de cálcio para neutralizar os ácidos formados.

3.7- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÔNICO

Bactérias produtoras de ácido propiônico, em geral, podem ser caracterizadas como Gram-positivas, catalase positivas, não-esporuladas, imóveis, e aeróbicas facultativas. Alguns exemplos são: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. peterssonii, P. shermanii, P. pentosaceum, P. rubrum, P. technicum, P. thoenii, P. raffinosaceum, P. arabinosum e P. zeae. Elas podem ser isoladas de fontes como leite, queijo, solo, silagem, e excreta de gado (PRESCOTT et al., 1959). Micrococcus lactilycus (Veillonella gazogenes) e Clostridium propionicum também fazem esse tipo de fermentação (CROCOMO, 1967). As bactérias que produzem ácido propiônico podem fermentar um grande número de carboidratos, polióis e ácidos orgânicos, como pentose, 2-cetogluconato, lactato, piruvato, glucose, galactose, lactose, maltose, malato, sorbitol, manitol, glicerol, entre outros. Abaixo há a estequiometria de algumas dessas fermentações a partir de diferentes substratos: 3 glucose 2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 lactato 2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 piruvato + HOH propionato + 2 acetato +2 CO2 glicerol propionato + HOH (CROCOMO, 1967)

A figura 15 mostra a formação de propionato a partir de glicerol ou glucose. Já a figura 16 mostra em mais detalhe a formação de propionato e acetato a partir de ácido lático.

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- Produção de Propionato

- Produção de Propionato

Fonte: CROCOMO, 1967.

Fonte: RHEM & REED, 1981.

Além da produção de propionato, podem aparecer como subprodutos de fermentação o acetato e o dióxido de carbono.

3.8- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO CÍTRICO

O ácido cítrico é normalmente encontrado em frutas cítricas, abacaxis, pêras, figos e pêssegos. Wehmer em 1893 demonstrou a ocorrência de ácido cítrico como metabólito microbiano de Citromyces pfefferianus e C. glaber em meio contendo sacarose e carbonato de cálcio (PRESCOTT et al, 1959). Em 1922, Mollinard descobriu culturas de Aspergillus niger que produziam ácido cítrico em condições de deficiência de fosfato. Até 1953, o ácido cítrico era obtido a partir de citrato de cálcio. Com a descoberta de microrganismos capazes de produzi-lo, passou-se a utilizar a via fermentativa. Há três processos fermentativos que podem ser utilizados: o processo Koji (em substrato sólido utilizando uma cepa específica de Aspergillus niger), a

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fermentação em superfície (o micélio de A. niger cresce sobre um meio de cultura estático, sendo o produto recolhido do meio) e a fermentação submersa (meio de cultura líquido sob agitação) (LIMA et al., 2001). As espécies Aspergillus niger, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Paecilomyces divacatum, Mucor piriformis e Ustilina vulagris são usadas em laboratório ou comercialmente para a produção desse ácido, mas a importância maior cabe ao A. niger. O pH influencia fortemente a produção de ácido cítrico. A partir do controle do pH com sais inorgânicos é possível variar a proporção de ácido cítrico e oxálico formados. Um pH mais baixo favorece a formação de citrato e suprime a formação oxalato, além de minimizar as chances de contaminação (PRESCOTT et al., 1959). 4- CULTIVO DE CÉLULAS MICROBIANAS

4.1- BACTÉRIAS

Bactérias são organismos unicelulares e sem compartimentalização interna por um sistema de membranas, ou seja, são procarióticos. Elas são envolvidas por uma parede celular peptidioglicana, sendo que elas podem apresentar várias formas, como bacilos, cocos ou espirilos. O crescimento bacteriano ocorre com o aumento do número de células, e não com o aumento do volume de uma célula. Elas se reproduzem normalmente por divisão binária, mas algumas podem fazer brotamento. Outras podem ainda se fragmentar e a partir de cada fragmento se inicia uma nova célula (TORTORA et al., 2006). Uma cultura bacteriana apresenta inicialmente uma fase lag, quando as bactérias ainda não se multiplicam e sofrem somente pequenas variações para se adaptar ao novo meio de cultivo. Elas se encontram em um estado de latência. Após determinado tempo, podendo levar de horas a dias, a cultura passa para a fase log, ou crescimento exponencial. Nesse período os mecanismos de reprodução

encontram-se amplamente ativos e são bastante sensíveis a mudanças ambientais. Depois de um longo período de crescimento ocorre a fase estacionária, e a taxa de divisão se torna equivalente a taxa de mortalidade. Isso pode ocorrer devido ao término de nutrientes, ao acúmulo de produtos de degradação ou a mudanças no pH

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danosas à célula. Em determinado momento, a população microbiana entra em fase de morte celular (ou declínio), quando o número de mortes excede a produção de novas células (TORTORA et al., 2006). A maioria das bactérias cresce em pH perto da neutralidade (6,5-7,5), sendo que poucas delas (as acidófilas) conseguem crescer em pH 4. Elas podem ser cultivadas tanto em meio sólido quanto em meio líquido (TORTORA et al., 2006).

4.2- FUNGOS

Os fungos pertencem ao reino Fungi e são organismos eucarióticos, quimioheterotróficos, multicelulares (exceto leveduras), e com parede celular formada de glicanas, mananas e quitina. Os fungos multicelulares são classificados com relação a sua morfologia da colônia e dos esporos reprodutivos (TORTORA et al. 2006). No seu ciclo de vida pode acontecer a reprodução assexuada, através da fragmentação de suas hifas ou pela formação de esporos assexuais, e também a reprodução sexuada, através

de esporos sexuais. Os fungos filamentosos suportam ambientes que poderiam ser hostis a bactérias. Eles conseguem suportar uma variação de pH maior que as bactérias, mas os valores ótimos se encontram geralmente em pH 5-6. Eles são mais resistentes à pressão osmótica, sendo que alguns podem crescer em concentrações relativamente altas de sais e açúcares. Substratos com atividade de água muito baixa também podem favorecer o crescimento de fungos. A maioria deles possui metabolismo aeróbico. Eles também conseguem metabolizar carboidratos mais complexos que as bactérias já não têm capacidade, como, por exemplo, degradar a lignina (TORTORA et al., 2006).

4.3- LEVEDURAS

Leveduras são organismos eucarióticos, unicelulares, não filamentosos, e de forma oval que pertencem ao reino dos fungos. Esses organismos estariam entre as bactérias e os macro-fungos (PRESCOTT et al., 1959). Assim como as bactérias, a identificação de leveduras pode ser feita através de testes bioquímicos. (TORTORA et al., 2006)

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Elas podem apresentam como forma de propagação vegetativa o brotamento (gemulação), sendo que algumas podem sofrer fissão binária, como

Schizosaccharonyces (PRESCOTT et al., 1959). Em algumas espécies, como Candida albicans, o broto pode não se separar da célula mãe, formando o que pode ser chamado de pseudo-hifa. (TORTORA et al., 2006) As células de levedura são capazes de realizar metabolismo anaeróbico facultativo, podendo utilizar tanto o oxigênio quanto outros compostos orgânicos como aceptor final de elétrons. Elas vêm sendo bastante estudadas por serem organismos eucarióticos relativamente fáceis de manipular, sendo então consideradas como modelo metabólico, molecular e genético para os eucariotos assim como a bactéria Escherichia coli é considerada como modelo para os procariotos (BADOTTI et al., 2008). Leveduras como Saccharomyces cerevisiae são utilizadas em vários processos, como a produção de fermento de pão, extrato de levedura, cerveja, aditivos alimentícios (vitaminas, proteínas, enzimas), proteínas heterólogas (vacinas e outros componentes terapêuticos), e produtos de interesse farmacêutico através da manipulação de novas vias metabólicas e do aumento da produção com a engenharia genética, uma vez que o genoma de leveduras já foi inteiramente seqüenciado (BADOTTI et al., 2008). Para se cultivar leveduras pode-se utilizar vários meios de cultivo. Em meio sólido, as células de levedura formam colônias semelhantes às de bactérias (TORTORA et al., 2006). A maioria deles consiste em uma formulação que dispõe dos nutrientes necessários para o crescimento de leveduras e ingredientes que inibem o desenvolvimento de bactérias e bolores. Um dos meios bastante indicados para o isolamento de leveduras é o YM (yeast malt extract medium). Sendo organismo saprófitos, as leveduras exigem a presença de uma fonte de carbono elaborada para conseguir energia. Também pode ser necessária a adição de vitaminas (tiamina e ácido pantotênico), de nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, cálcio, zinco, manganês, cobre, ferro, cobalto, iodo e outros elementos traço (LIMA et al., 2001). As leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae utilizam nitrogênio na forma amoniacal (NH4+), amídica (uréia) ou amínica (na forma de aminoácidos), não

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conseguindo metabolizar nitrato ou proteínas do meio. O fósforo é absorvido na forma de H2PO4-, e o enxofre na forma de sulfato, sulfito ou tiosulfato. Elas são microrganismos mesófilos, com temperatura ótima em aproximadamente 26 a