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Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Escuela de Ingeniería en Biotecnología “Evaluación del efecto fenotípico y celular provocado por la infección de Flavobacterium psychrophilum en el pez cebra” Daniela Sofía Soto Comte Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión del Director de Tesis Dr. Ariel Reyes, en el laboratorio de Biología del Desarrollo, Universidad Andrés Bello, aprobado por los miembros de la Comisión de evaluación. ____________________ Dr. Ariel Reyes Director de Tesis ____________________ Dr. Daniel Paredes Comisión de Tesis Dr. Juan Antonio Valdez Comisión de Tesis SANTIAGO-CHILE Año 2017
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Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela de Ingeniería en Biotecnología
“Evaluación del efecto fenotípico y celular provocado por la infección de Flavobacterium psychrophilum en el pez cebra”
Daniela Sofía Soto Comte
Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión del Director de Tesis Dr. Ariel Reyes, en el laboratorio de Biología del Desarrollo, Universidad Andrés Bello, aprobado por los miembros de la Comisión de evaluación.
____________________ Dr. Ariel Reyes Director de Tesis ____________________ Dr. Daniel Paredes Comisión de Tesis
Dr. Juan Antonio Valdez Comisión de Tesis
SANTIAGO-CHILE
Año 2017
Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela de Ingeniería en Biotecnología
“Evaluación del efecto fenotípico y celular provocado por la infección de Flavobacterium psychrophilum en el pez cebra”
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al
Grado de Magíster en Biotecnología.
Director de Tesis:
Dr. Ariel E. Reyes
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Andrés Bello
Daniela Sofía Soto Comte
Santiago, Chile
Abril, 2017
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“Buscar significa tener un objetivo. Pero encontrar significa ser libre, estar
abierto, carecer de objetivos.” Hermann Hesse
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DEDICATORIA
Dedicado a mi familia, mis amigos y gente maravillosa que me ha acompañado
en este camino. Les agradezco cada palabra, idea, pensamiento, abrazo y amor
entregado por ustedes ya que cada una de esas cosas me hizo ser la persona que soy
y poder llegar hasta aquí. Gracias.
5
AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Dra. Carmen Feijoo y el Dr. Ariel Reyes por haber hecho posible
el desarrollo de ésta tesis. En particular, al Dr. Ariel Reyes por su constante apoyo, sus
enriquecedores comentarios y consejos que me permitieron ir creciendo a nivel
profesional. Agradezco a los compañeros de laboratorio que fueron importantes para mi
formación, especialmente a Isabella Benavides por su apoyo y trabajo que fue muy
importante para concluir este trabajo. Agradezco también a Catalina Lafourcade por
brindarme su gran conocimiento en este modelo tan hermoso como lo es pez cebra.
Personalmente agradezco a mi familia, mi madre Sheila Comte por su entereza,
amor incondicional, por ser una madre ejemplar siempre preocupada de sus polluelos,
por sus palabras de aliento y su apoyo infinito. A mi hermana Carolina Soto por ser la
mejor hermana y amiga del mundo, su apoyo y compresión incondicional. A mi papá
Ramón Soto, por su compañía, apoyo y amor.
Quiero agradecer a mis ancestros, mis abuelos, aunque no estén aquí siempre
están conmigo. Por permitirme aprender de su cultura y sabiduría universal. A Arturo
Comte por ser como fuiste, por tu sabiduría, tu guía, y tu amor. A Diana Selman por ser
una mujer maravillosa que siempre me apoyó, aconsejó y me regaló el amor por la
cocina enseñándome tantas cosas ricas de su cultura.
Agradezco a mis amigos, a Rodrigo Moraga por ser un gran amigo, consejero,
por esos momentos de conversación profunda, por entenderme y conocerme tan bien y
estar siempre ahí. Fabián Cabezas por su apoyo, amistad y por ser auténtico y fiel a sí
mismo. José Pablo González por su gran humor, su capacidad observadora y amistad
incondicional. A Michelle Eva Gatica por su alegría, entusiasmo y por tener el coraje de
expresar su curiosidad. A Tania Salas y Macarena Vivanco por su amistad, cariño y por
apañarme en todas mis locuras. A Mylen Ibañez por su apoyo incondicional y por ser
una hermosa persona con un corazón gigantesco. A Daniela Salazar por su entusiasmo
y locura, por ser una buena amiga y siempre querer lo mejor para mí.
Esta tesis fue financiada por el Interdisciplinary Center for Aquiculture
Aquaculture Research (INCAR), CONICYT/FONDAP/15110027 y Núcleo Milenio Nº447
FONDECYT 1150816.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA...........................................................................................................................................4
AGRADECIMIENTOS...............................................................................................................................5
ÍNDICE DE CONTENIDOS......................................................................................................................6
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS...........................................................................................................8
ABREVIATURAS.......................................................................................................................................9
1. RESUMEN........................................................................................................................................11
2. ABSTRACT......................................................................................................................................12
3. INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................13
3.1. Importancia de la acuicultura en Chile y en el mundo.................................................13
3.2. Pérdidas en la producción acuícola por enfermedades bacterianas.......................14
3.3. Enfermedad del agua fría.....................................................................................................15
3.4. Flavobacterium psychrophilum.........................................................................................17
3.5. Respuesta inmunológica en peces teleósteos a patógenos bacterianos...............18
3.6. El pez cebra (Danio rerio) como modelo de estudio....................................................19
3.7. Pez cebra como modelo de infección..............................................................................20
4. HIPOTESIS.......................................................................................................................................22
5. OBJETIVOS.....................................................................................................................................22
5.1. Objetivo General....................................................................................................................22
5.2. Objetivos específicos...........................................................................................................22
6. MATERIALES Y MÉTODOS.........................................................................................................23
6.1. Mantención y uso de peces, larvas, y embriones de pez cebra................................23
6.2. Ensayos sobre el efecto de la temperatura en el sistema inmune de larvas de pez
cebra.....................................................................................................................................................23
7
6.3. Ensayo de infección en larvas de pez cebra utilizando cuatro cepas de F.
psychrophilum....................................................................................................................................25
6.4. Estandarización del protocolo de infección para F. psychrophilum en larvas de
pez cebra..............................................................................................................................................25
6.5. Evaluación de la respuesta inmune innata frente a la infección de F.
psychrophilum en larvas de pez cebra........................................................................................27
7. RESULTADOS.................................................................................................................................29
7.1. Efecto sobre el sistema inmune innato provocado por la incubación de larvas de
pez cebra a bajas temperaturas.....................................................................................................29
7.2. Ensayo de infección en larvas de pez cebra utilizando cuatro cepas de
Flavobacterium psychrophilum.....................................................................................................31
7.3. Estandarización del protocolo de infección para F. psychrophilum en larvas de pez
cebra ....................................................................................................................................................35
7.4. Respuesta celular del sistema inmune innato frente a la infección de F.
psychrophilum en larvas de pez cebra........................................................................................36
8. DISCUSIÓN......................................................................................................................................41
9. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES.......................................................................................49
10. REFERENCIAS............................................................................................................................50
8
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Lesión ulcerativa característica de la enfermedad del agua fría en la zona del
pedúnculo de un trucha arcoíris....................................................................................................16
Figura 2. Esquema de la activación del sistema inmune innato representado por la
localización de los neutrófilos.......................................................................................................24
Figura 3. Evaluación del efecto de la temperatura en larvas de pez cebra incubadas a
15°C y 18°C..........................................................................................................................................30
Figura 4. Efectos fenotípicos provocados por la infección de 4 cepas de F. psychrophilum
en larvas de pez cebra......................................................................................................................32
Figura 5. Fenotipos encontrados en larvas de pez cebra posterior a ser infectadas con
F.psychrophilum con la cepa JIP..................................................................................................33
Figura 6. Efectos fenotípicos según nivel de severidad de la infección provocado por F.
psychrophilum cepa JIP, en larvas de pez cebra......................................................................34
Figura 7. Efecto sobre el sistema inmune innato en larvas previamente infectadas con
dos cepas de F. psychrophilum.....................................................................................................37
Figura 8. Efectos fenotípicos y celulares tras la infección con F. psychrophilum con
distintas cepas de la bacteria en larvas transgénicas de pez cebra....................................38
Figura 9. Cuantificación de neutrófilos en larvas desafiadas, larvas con fenotipo leve y
larvas con fenotipo severo provocado por la infección con F. psychrophilum................39
Figura 10. Ensayo de infección utilizando larvas deficientes en la producción de
neutrófilos...........................................................................................................................................40
Tabla I. Estandarización de los ensayos de infección realizados con F.psychrophilum en
larvas de pez cebra...........................................................................................................................26
Tabla II. Presencia de fenotipo y mortalidad en ensayos de infección realizados con
F.psychrophilum en larvas de pez cebra.....................................................................................35
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ABREVIATURAS
%: porcentaje
°C: grados Celsius
Bac: cromosoma artificial bacteriano
BCWD: enfermedad bacteriana del agua fría (Bacterial Cold-Water Disease)
CaCl2: cloruro de calcio
Cm: centímetro
DNA: ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic Acid)
dpf: días post-fertilización (days post-fertilization)
dpi: días post- infección
EAF: enfermedad de agua fría
E3: medio de incubación de embriones de pez cebra
GFP: proteína fluorescente verde (green fluorescent protein)
Gram: tinción de Gram
h: horas
hpf: horas post-fertilización (hours post-fertilization)
IL-1: Interleucina-1
IL-8: Interleucina-8
KCl: cloruro de potasio
LPS: lipopolisacarido
mL: mililitro
mM: milimolar
MPO: mieloperoxidasa
NaCl: cloruro de sodio
10
nL: nanolitros
PAMPS: patrones moleculares asociados a patógenos (pathogen-associated molecular
patterns)
PCR: reacción de la polimerasa en cadena (polymerase chain reaction)
PFA: paraformaldehído
PRRs: receptor de reconocimiento de patrones (pattern recognition receptors)
RDI: región de interés
RNA: ácido ribonucleico (rybonucleic acid)
ROS: especies reactivas de oxígeno (reactive oxygen species)
RTFS: síndrome de alevines de trucha arcoíris (rainbow trout fry syndrome)
TCH: tejido caudal hematopoyético
Tg: transgénico
TLR: receptor tipo toll (toll-like receptor)
TYES: triptona, extracto de levadura y sales (tryptone yeast extract salts)
UFC: unidad formadora de colonias
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1. RESUMEN
En la última década, la acuicultura ha tenido un importante crecimiento siendo la
competencia directa de la pesca extractiva. Se estima que para el año 2030 la
acuicultura aportará el 62% de la producción destinada al consumo humano. En los
últimos años, se ha intensificado el estudio de enfermedades y patógenos de
importancia comercial con el objetivo de controlar o erradicar estas patologías de los
cultivos.
Dentro de las especies más cultivadas, están la trucha arcoíris (Oncorhynchus
mykiss) y el Salmón coho (Oncorhynchus kisutch). Estas especies se ven afectadas por
diversas enfermedades dentro de las cuales encontramos la enfermedad del agua fría
(EAF). Esta enfermedad, se caracteriza por generar lesiones y úlceras en la piel de los
peces en cultivo, las cuales en su estado severo exponen órganos internos provocando
la muerte del individuo infectado.
El agente responsable de EAF es la bacteria Flavobacterium psychrophilum (F.
psychrophilum). Actualmente, se conoce sólo parte del mecanismo de infección, por lo
que parece importante generar más estudios para definir el proceso y progresión de la
infección, disminuyendo la infección en peces.
Un buen modelo de estudio es el pez cebra, es de tamaño pequeño y presenta
un rápido crecimiento. Es versátil en cuanto a las herramientas celulares y moleculares
que se encuentran disponibles. Ha sido utilizado como modelo de infección en otras
enfermedades importantes para la acuicultura.
En este estudio se utilizo al pez cebra como modelo de infección para F.
psychrophilum para evaluar el efecto a nivel fenotípico y celular. Como resultado,
obtuvimos un fenotipo similar a lo descrito para EAF en otras especies, junto con una
activación del sistema inmune innato frente a la presencia de la bacteria. Por tanto, el
pez cebra es un buen modelo de infección para F. psychrophilum, el cual podría ser de
gran importancia, para establecer formas de control y erradicación de este organismo
infeccioso.
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2. ABSTRACT
In the last decade aquaculture has had an important growth being the direct
competitor of extractive fishing. It is estimated that for the year 2030 aquiculture will
provide 62% of the production destined to human consumption. In recent years, the
study of diseases and pathogens of commercial importance has intensified with the
objective of controlling or eradicate these pathologies from the cultivated fish.
Within the most cultivated species there are the Rainbow Trout (Oncorhynchus
mykiss) and the Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch). These species are affected by
diverse diseases among which we find the Bacterial cold water disease (BCWD). This
disease characterizes itself for generating injuries and ulcers on the skin of the
cultivated fish, which in severe state exposes internal organs resulting in the death of
the infected subject.
The agent responsible of BCWD is Flavobacterium psychrophilum (F.
psychrophilum). Nowadays, only part of the infection mechanism is known, therefore, it
seems important to develop more studies to define the process and progression of the
disease to reduce the infection among the fish.
A good research subject is the Zebrafish, which is small in size and grows rapidly.
Moreover, It is versatile regarding the cellular and molecular structure it possesses. It
has been utilized as a study subject for other important diseases in aquaculture.
In this research the zebrafish was used as a test subject for the infection F.
psychrophilum to evaluate the effect at a phenotypical and cellular level. As a result, we
obtained a similar phenotype to the one described for BCWD in other species, along
with the activation of the innate immune system when confronted with the bacteria.
Consequently, the zebrafish is a good test subject for the infection F. psychrophilum,
which could be of great relevance to stablish ways to control and eradicate this
infectious organism.
13
3. INTRODUCCIÓN 3.1. Importancia de la acuicultura en Chile y en el mundo
La actividad pesquera ha tenido un gran crecimiento en los últimos años
convirtiéndose en un sector importante para la industria alimentaria a nivel mundial.
Como consecuencia de esto, muchos países han invertido en la pesca extractiva
adquiriendo flotas pesqueras y plantas de procesamiento. Sin embargo, los recursos de
la pesca extractiva son finitos y la sobreexplotación es inminente. Es aquí donde la
acuicultura juega un rol fundamental siendo la única forma inmediata de suplir la
demanda mundial de productos del mar (Desarrollo de la Acuicultura, FAO 2011).
En la producción pesquera mundial, la participación de la producción acuícola ha
incrementado en los últimos años. En 2010, se suministraron mundialmente 148
millones de toneladas de pescado, siendo 59 millones (39%) provenientes de la
acuicultura. Para el año 2012, se estableció un máximo histórico de producción
alcanzando 158 millones de toneladas, donde 66 millones (42%) procedieron de la
acuicultura. Estas cifras reflejan la importancia del desarrollo y crecimiento de esta área
debido a la potencialidad y capacidad de sustento en términos de producción. Lo que
no ocurre con la pesca extractiva que estaría siendo desplazada por la acuicultura (El
Estado Mundial de la Pesca y la Acuicultura, FAO 2014).
Respecto a la situación de Chile, el país se encuentra en el octavo lugar dentro
de los 15 más importantes en la producción acuícola mundial, donde en 2012 aportó el
1,6% de la producción mundial total correspondiente a 1.071.421 toneladas (El Estado
Mundial de la Pesca y la Acuicultura, FAO 2014).
En el mundo, se cultivan diversas especies de peces dentro de los cuales
podemos encontrar al salmón del Atlántico (Salmo salar), trucha arcoíris (Oncorhynchus
mykiss) y salmón plateado también conocido como salmón del Pacífico o salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) (El Estado Mundial de la Pesca y la Acuicultura, FAO 2012).
Estas especies son producidas en Chile, donde en el año 2013 la producción de salmón
del Atlántico, salmón del Pacífico y trucha arcoíris alcanzaron valores de 84.000, 64.000
y 31.000 toneladas respectivamente (Subsecretaría de pesca, 2013).
14
Como consecuencia a la alta producción de ejemplares, la aparición de
enfermedades en los cultivos ha aumentado, ocasionando una disminución en la
calidad de la carne y pérdidas millonarias en la producción.
3.2. Pérdidas en la producción acuícola por enfermedades bacterianas
En la producción acuícola de peces, múltiples patógenos pueden generar
grandes pérdidas en términos de producción, en donde pueden afectar a los peces
desde las etapas de crecimiento y engorda, hasta el período de cosecha y
almacenamiento. Esta merma, no sólo afecta a nivel económico a los productores sino
que también al consumidor, ya que al reducirse la oferta el mercado incrementa su valor
(post-harvest fish loss assessment in small-scale fisheries, FAO 2011). Se estima que
por esta razón, anualmente se pierden 6.000 millones de dólares que corresponden a
un 4,4% de la producción de peces comestibles, equivalente a 137.000 millones de
dólares (El Estado Mundial de la Pesca y la Acuicultura, FAO 2014; World Bank Report,
2014).
Existen diversas variables que facilitan la presencia de patógenos en los cultivos,
dentro de las cuales podemos encontrar el manejo y hacinamiento de los peces, que
provoca estrés y daños físicos en los ejemplares; los cambios en las condiciones
ambientales, los cuales afectan el comportamiento y crecimiento de ejemplares; la
temperatura, fotoperiodo y composición química del agua, las que pueden generar
ambientes propicios para el crecimiento bacteriano en diferentes etapas del desarrollo
de los peces (Rodríguez et al., 2001). Por otra parte, los patógenos oportunistas
proliferan cuando las condiciones ambientales y fisiológicas de los peces son propicias
para infectar. En este grupo podemos encontrar virus, bacterias, parásitos y hongos. La
presencia de estos agentes puede estar sujeta a períodos del año o etapas de
crecimiento de los peces en cultivo (Rodríguez et al., 2001). Los brotes de
enfermedades generan un gran impacto en la producción debido a que producen
mortalidad y disminución del crecimiento en los ejemplares cultivados.
15
Una de las enfermedades presente en los cultivos acuícolas, es la enfermedad
del agua fría (EAF). A pesar que esta patología no está asociada a altas mortalidades
de forma directa, es de gran importancia científica ya que produce lesiones en la piel de
los peces afectados, facilitando así el ingreso de patógenos oportunistas que generan
las mayores pérdidas en estos cultivos.
3.3. Enfermedad del agua fría
Los primeros indicios de esta enfermedad fueron descritos por Davis en 1946,
donde se observaron lesiones en la piel de alevines de trucha arcoíris, que como
característica, dejaban expuesto el músculo de los ejemplares (Davis, 1946).
Coincidentemente, las lesiones se manifestaban en el pedúnculo de los peces, por lo
que se denominó como la “enfermedad del pedúnculo”. En el transcurso de los años,
esta enfermedad ha adoptado diversos nombres donde los más conocidos son el
síndrome de alevines de trucha arcoíris (rainbow trout fry syndrome, RTFS) y la
enfermedad bacteriana del agua fría (bacterial cold-water disease, BCWD) (Cipriano &
Holt, 2005).
Lo característico de esta enfermedad es la presencia de erosiones y úlceras en
la aleta y pedúnculo caudal de los peces afectados. Dependiendo de la gravedad de la
infección, es posible ver el músculo expuesto de los peces, como se muestra en la
Figura 1.
16
Figura 1. Lesión ulcerativa característica de la enfermedad del agua fría en la zona del pedúnculo de trucha arcoíris.
Tomado de Duchaud y cols. (2007).
17
Aunque las lesiones del pedúnculo en los peces son características de la
enfermedad, también se pueden encontrar erosiones en otras zonas del cuerpo, debido
al ingreso de la bacteria por regiones dañadas con anterioridad (Barnes & Brown, 2011;
Lafrentz & Cain, 2004).
La gravedad de la enfermedad tiene estrecha relación con la edad de los peces,
presentándose con mayor intensidad en peces jóvenes, donde se observa una
mortalidad entre 30-50% de alevines. En cambio, en peces adultos se manifiesta con
cambios en el comportamiento, como falta de apetito, aletargamiento y cambio a una
coloración más oscura (Lafrentz & Cain, 2004).
La familia de los salmónidos es la más afectada con la EAF, principalmente la
trucha arcoíris y el salmón coho (Lafrentz & Cain, 2004). Se ha descrito que los brotes
de la enfermedad ocurren en un rango de temperatura entre 4° C a 10° C, pero sus
síntomas son más severos a menor temperatura del agua (Cipriano & Holt, 2005). La
aparición de esta enfermedad se asocia a la presencia del agente patógeno bacteriano
Flavobacterium psychrophilum.
3.4. Flavobacterium psychrophilum
F. psychrophilum es una bacteria Gram negativa, psicrófila, con morfología
filamentosa, color amarillo. Considerada una bacteria fastidiosa ya que es difícil de
cultivar y manejar en laboratorio. Esta es una bacteria ubicua de ambientes acuáticos,
principalmente de agua dulce. Se conoce por ser un patógeno oportunista ya que su
crecimiento se ve favorecido cuando las condiciones ambientales y fisiológicas de los
peces no son óptimas (Barnes & Brown, 2011; Cipriano & Holt, 2005).
Esta bacteria contiene en su genoma factores de virulencia como elementos de
adhesión y de destrucción de tejido, permitiéndole así provocar la enfermedad. La
infección comienza con la adhesión de la bacteria a la piel de los peces (Barnes &
Brown, 2011). Posteriormente, secreta proteasas que destruyen el tejido del hospedero
permitiendo su ingreso (Barnes & Brown, 2011). Finalmente, la bacteria se aloja en el
tejido muscular de los peces, tejido por el que presenta gran afinidad (Barnes & Brown,
18
2011). Esta acción genera destrucción y necrosis en el tejido afectado, causando
lesiones severas en los peces y como consecuencia de esto, ocurre un efecto sistémico
que provoca la muerte de los peces infectados (Barnes & Brown, 2011). Como barrera
de defensa hacia estos patógenos, los peces poseen mecanismos de respuesta
mediante la activación del sistema inmune innato.
Respecto al mecanismo de infección de esta bacteria, se conoce sobre los
elementos de virulencia que posiblemente participan en la infección, como la acción de
enzimas proteolíticas y de adhesión (Barnes & Brown, 2011; Nematollahi et al., 2003).
Actualmente, no se conocen las etapas de infección anteriores a la generación de la
sintomatología clínica.
3.5. Respuesta inmunológica en peces teleósteos a patógenos bacterianos
El sistema inmune puede ser definido como un sistema complejo que protege al
organismo contra organismos o sustancias que puedan generar infección o enfermedad
(Reyes-Cerpa et al., 2013). Este sistema tiene dos tipos de respuesta denominada
innata y adaptativa, las cuales son capaces de reconocer estructuras que activan
diferentes mecanismos celulares y moleculares para la eliminación de agentes
infecciosos (Reyes-Cerpa et al., 2013).
La respuesta inmune innata es la barrera inicial de defensa contra infecciones
que incluye barreras físicas, respuestas de tipo celular y humoral. Por otra parte, la
respuesta inmune adaptativa permite reconocer antígenos de manera específica
(Reyes-Cerpa et al., 2013). En peces, el sistema inmune innato es el principal
mecanismo de defensa contra patógenos. Dentro de los componentes de la respuesta
humoral, encontramos péptidos antimicrobianos y moléculas del sistema del
complemento, mientras que en la respuesta celular encontramos la participación de
macrófagos y neutrófilos (Toledo-ibarra et al., 2013). La principal diferencia entre ambos
tipos se basa en que la respuesta humoral actúa sobre patógenos intracelulares, no así
la respuesta inmune innata celular que actúa sobre patógenos extracelulares (Toledo-
ibarra et al., 2013).
19
Los neutrófilos son las primeras células del sistema inmune innato en migrar al
lugar afectado por la infección y eliminar patógenos a través de diversos mecanismos
como la secreción de enzimas proteolíticas, péptidos antimicrobianos y especies
reactivas de oxigeno (ROS). Adicionalmente, participan en la iniciación del proceso
inflamatorio al secretar moléculas capaces de reclutar y activar otras células del sistema
inmune (Harvie & Huttenlocher, 2015).
El pez cebra es un modelo animal que por sus ventajas experimentales ha
permitido estudiar ampliamente la acción de neutrófilos, en base a su mecanismo de
acción y migración hacia la región afectada. En respuesta a una herida o infección, los
neutrófilos se movilizan desde el tejido caudal hematopoyético (TCH) hacia la región
dañada donde secretan moléculas capaces de erradicar al patógeno y reclutan otros
elementos del sistema inmune para que se dirijan a la región en cuestión (Starnes &
Huttenlocher, 2012). Gracias a las facultades de este modelo, se han podido generar
líneas transgénicas que permiten realizar un seguimiento in vivo del movimiento y
localización de los neutrófilos. Un ejemplo de ellas es la línea transgénica MPO (Harvie
& Huttenlocher, 2015; Renshaw et al., 2006).
3.6. El pez cebra (Danio rerio) como modelo de estudio
El pez cebra es un teleósteo de agua dulce proveniente de Asia y que habita a
28°C. Su desarrollo embrionario es rápido, ya que a las 24 horas post-fertilización (hpf)
el embrión presenta todo el plan del cuerpo desarrollado. A los 3 días post-fertilización
(dpf) alcanza el estadio de larva, siendo capaz de eclosionar y nadar libremente
(Kimmel et al., 1995).
Algunas de las ventajas experimentales que presenta este modelo son: tamaño
pequeño de los adultos (3-5 cm) lo que facilita su crianza; tienen un gran número de
huevos por desove, que fluctúa entre 400-1.000 huevos (Lawrence, 2011), los que en
un alto porcentaje pasan a ser larvas luego de la cruza. Los embriones son
transparentes en los primeros estadios del desarrollo, lo que confiere una ventaja
adicional para estudios in vivo (Fleming et al., 2007). Asimismo, el genoma del pez
20
cebra se encuentra secuenciado y anotado. Al comparar su genoma con el de humano,
se observa que presenta una similitud de 70% (Li & Uitto, 2014). A nivel de biología
molecular, el pez cebra es un modelo fácil de manipular, pudiéndose modificar la
función génica a través de experimentos de falta o ganancia de función (microinyección
de morfolinos o RNAs), realizar marcaje de proteínas específicas que pueden ser
utilizadas para observar linajes celulares mediante líneas transgénicas y además
estudiar la distribución espacio-temporal de transcritos específicos (hibridación in situ) y
proteínas (inmunohistoquímica) (Li & Uitto, 2014; Sullivan & Kim, 2008).
3.7. Pez cebra como modelo de infección
El sistema inmune innato del pez cebra es funcional a las 24 hpf, en cambio, el
sistema inmune adaptativo se desarrolla entre la tercera y cuarta semana post-
fertilización. Esto es una ventaja importante ya que permite estudiar de forma aislada el
sistema inmune innato y entender de mejor forma su contribución frente a la presencia
de un patógeno (Rowe et al., 2014).
El pez cebra ha sido utilizado como modelo de infección para diversos patógenos
como virus, bacterias y hongos. En el caso de los virus, se ha utilizado para el estudio
de la enfermedad infecciosa necrótica de bazo y riñón (Infectious spleen and kidney
necrosis virus, ISKNV) (Xu et al., 2008). Para el estudio de hongos se han reportado
trabajos con Candida albicans donde se describe in vivo la interacción y progresión de
esta infección, proponiendo a pez cebra como un buen modelo para el estudio de este
hongo (Chao et al., 2010). En el caso de las bacterias los estudios son más abundantes
donde utilizan al pez cebra como modelo (Brudal et al., 2014; Lin et al., 2007; Neely, et
al., 2002; Shan et al., 2015; Oyarbide et al., 2015). Para el género Flavobacterium, se
ha estudiado a Flavobacterium columnare (F. columnare) y Flavobacterium johnsoniae
(F. johnsoniae). En el caso de F. columnare, se ha utilizado al pez cebra con el objetivo
de estudiar la adhesión y mecanismos de virulencia (Conrad, 2013; Laanto et al., 2012;
Olivares-Fuster et al., 2011; Zhang et al., 2014). En el caso de F. johnsoniae, los
estudios se enfocan principalmente en la dinámica de desplazamiento de la bacteria
(Braun et al., 2005; Hunnicutt y McBride, 2000; Nelson y McBride, 2006).
21
Los géneros Cytophaga y Flavobacterium carecen de flagelo, por lo que se ha
estudiado la motilidad bacteriana en ausencia de dicha estructura, considerando esta
característica tan particular (McBride, 2004).
Adicionalmente, un estudio utilizó al pez cebra para medir la susceptibilidad de la
infección de F. columnare y F. johnsoniae evaluando distintas metodologías de
infección (Moyer & Hunnicutt, 2007).
El amplio conocimiento de la biología del pez cebra y las herramientas
moleculares disponibles permiten estudiar de forma óptima la progresión de una
enfermedad, obteniendo información in vivo de su proceso y progresión. Su rápido
crecimiento y pequeño tamaño permiten realizar estudios con un gran número de
individuos. Por otra parte, la similitud a nivel anatómico, fisiológico y molecular entre
teleósteos, es una ventaja para poder extrapolar los resultados obtenidos con otras
especies de peces de importancia comercial. Adicionalmente, el pez cebra ha sido
utilizado como modelo de estudio para una gran variedad de patógenos dentro de los
cuales encontramos patógenos que afectan a la acuicultura. Esto implica que pez cebra
podría ser utilizado como un modelo de infección para F. psychrophilum, permitiendo
obtener mayor información sobre la bacteria y su enfermedad definiendo su mecanismo
de entrada, proceso de infección y el desarrollo de la enfermedad en el tiempo.
En base a lo anteriormente mencionado, proponemos que el pez cebra es un
buen modelo para el estudio de F. psychrophilum, considerando el amplio conocimiento
de la biología de este pez y las herramientas moleculares disponibles que permiten
estudiar en forma óptima la progresión de la enfermedad.
22
4. HIPOTESIS
“Flavobacterium psychrophilum infecta al pez cebra induciendo la activación del sistema
inmune innato”.
5. OBJETIVOS 5.1. Objetivo General
Evaluar y describir la capacidad de infección de F. psychrophilum en larvas de pez
cebra, utilizando parámetros celulares.
5.2. Objetivos específicos
1.- Evaluar los efectos de la temperatura sobre el sistema inmune innato del pez cebra.
2.- Caracterizar cambios morfológicos en larvas de pez cebra infectadas con cuatro
cepas distintas de F. psychrophilum.
3.- Estandarizar un protocolo de infección con F. psychrophilum en larvas de pez cebra,
evaluando: temperatura, tiempo de incubación y concentración bacteriana.
4.- Evaluar cambios en el sistema inmune innato generados por la infección de F.
psychrophilum en larvas de pez cebra.
23
6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1. Mantención y uso de peces, larvas, y embriones de pez cebra
Los peces reproductores fueron mantenidos y cuidados de acuerdo a protocolos
establecidos (Westerfield, 2000). Se utilizaron reproductores de líneas silvestres (New
WT y AB) y una línea transgénica MPO Tg(Bacmpo:GFP)i114 (Renshaw et al., 2006).
Los embriones se obtuvieron por cruzas naturales, se recolectaron y mantuvieron
en placas de Petri de plástico, con medio E3 con azul de metileno (NaCl 5 mM; KCl
0,17 mM; CaCl2 0,33 mM; MgSO4 0,33 mM; azul de metileno 0,01%, pH 7,0), con un
máximo de 50 huevos por placa. Los huevos se mantuvieron a 28°C en una estufa.
Se utilizaron larvas de pez cebra de 2 dpf y se incubaron hasta los 6 dpf. Los
estadios larvales fueron determinados de acuerdo a lo descrito por Kimmel y
colaboradores (1995).
6.2. Ensayos sobre el efecto de la temperatura en el sistema inmune de larvas de pez cebra
Se realizaron ensayos de incubación de larvas a 15 y 18°C (control 28°C). Se
utilizaron larvas de 2 dpf obtenidas del cruce de parentales provenientes de la línea
transgénica MPO (Renshaw et al., 2006), esta línea permite visualizar bajo
epifluorescencia los neutrófilos en verde. Se utilizó la localización de neutrófilos como
marcador de la activación del sistema inmune innato en larvas vivas. La Figura 2
explica las condiciones de la distribución de neutrófilos de una larva con su sistema
inmune innato no activado (tejido caudal hematopoyético: TCH) y una distribución de
neutrófilos de una larva con su sistema inmune innato activado (región de interés, RDI).
Se realizó recuento de neutrófilos diario durante 4 días en la RDI.
24
Figura 2. Esquema de la activación del sistema inmune innato representado por la localización de los neutrófilos. En A se muestra la distribución de los neutrófilos cuando el sistema inmune innato se
encuentra inactivado, en estado de homeostasis con la mayoría de los neutrófilos en el tejido caudal
hematopoyético (TCH). En B se muestra la distribución de los neutrófilos cuando el sistema inmune
innato se encuentra activo, los neutrófilos salen del TCH y se mueven a la región de interés (RDI).
25
6.3. Ensayo de infección en larvas de pez cebra utilizando cuatro cepas de F. psychrophilum
Las cepas de referencia de F. psychrophilum (LM-02, LM-06, LM-13 y JIP) y los
aislados chilenos (LM-02, LM-06 y LM-13) fueron facilitados por el Laboratorio del Dr.
Rubén Avendaño. Utilizando cada una de estas cepas, se organizaron placas de 6
pocillos con 15 larvas en cada pocillo, para llevar a cabo los experimentos en duplicado.
Se utilizó un baño de inmersión con 5 mL de F. psychrophilum (108 UFC/ mL) durante 5
h a 15°C. Se monitoreó diariamente las larvas desafiadas por 5 días evaluándose los
cambios de morfología en las larvas infectadas, mediante registro fotográfico.
6.4. Estandarización del protocolo de infección para F. psychrophilum en larvas de pez cebra
Se realizaron ensayos de infección evaluando las variables: temperatura, tiempo
de incubación y concentración bacteriana de F. psychrophilum como se define en la
Tabla I. Los ensayos de infección, se llevaron a cabo con larvas de 48 hpf a través de
un baño de inmersión. Una vez finalizada la incubación se reemplazó el medio con
carga bacteriana, por medio E3 (sin azul de metileno). Posterior a la infección, las
larvas utilizadas se denominaron como larvas desafiadas. Se realizaron monitoreos
diarios de dichas larvas por 5 días donde se evaluaron cambios en la morfología de las
larvas, llevando un registro fotográfico. Para todos los ensayos se utilizó la cepa JIP
(JIP02/86; JF Bernardet), la cual fue secuenciada por Duchaud en 2007 (Duchaud et
al., 2007).
26
Tabla I. Estandarización de los ensayos de infección realizados con F. psychrophilum en larvas de
pez cebra.
Temperatura de ensayo: 15°C Temperatura de ensayo: 18°C
Tiempo de
incubación (h)
Concentración
bacteriana
(UFC/mL)
Tiempo de
incubación (h)
Concentración
bacteriana
(UFC/mL)
5
1*107
5
1*107
5
1*108
5
1*108
24
1*107
24
1*107
24
1*108
24
1*108
27
6.5. Evaluación de la respuesta inmune innata frente a la infección de F. psychrophilum en larvas de pez cebra
Se realizó un ensayo de infección de acuerdo a lo definido en el punto anterior,
utilizando larvas pertenecientes a la línea transgénica MPO y evaluando la presencia de
neutrófilos en larvas con fenotipo.
Posteriormente, se llevó a cabo un ensayo para cuantificar los neutrófilos
presentes en la RDI. Para estos ensayos, se utilizaron larvas provenientes de la línea
transgénica MPO las cuales fueron incubadas con las cepas LM-02 y JIP de F.
psychrophilum. Se realizaron monitoreos diarios de larvas infectadas y control donde se
hizo recuento del número de neutrófilos que se encontraban en RDI, esto se realizó
durante 4 días posterior a la infección (dpi).
Con el objetivo de cuantificar la actividad en los fenotipos leve y severo se
recolectaron larvas previamente desafiadas sin fenotipo, con fenotipo leve y con
fenotipo severo, de acuerdo a lo definido en el punto 4.4. Las larvas fueron fijadas con
paraformaldehido (PFA) al 4%. Posteriormente se realizó la detección de GFP por
inmunohistoquímica (Feijóo et al., 2009). Los anticuerpos utilizados fueron: anti-GFP
rabbit (Santa Cruz Biotech) y Alexa fluor 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen), ambos
anticuerpos se ocuparon en dilución de 1:250.
Debido a la baja aparición de fenotipo en los ensayos de infección, se realizó un
ensayo de infección con larvas deficientes en la producción de neutrófilos con el fin de
disminuir la respuesta del sistema inmune innato. Para esto se utilizó el morfolino Pu.1
(MOPu.1), que se microinyectó en embriones de pez cebra de estadios de una a cuatro
células (1 hpf). Se microinyectaron 5 nL de MOPu.1, según la concentración descrita
por Rhodes y cols. (2005). Las larvas morfantes fueron infectadas con F. psychrophilum
siguiendo el protocolo que se detalla, el ensayo se realizó en placas de seis pocillos en
baño con 3 mL de F. psychrophilum a larvas de pez cebra de 48 hpf por 5 h a 15 °C. El
cultivo bacteriano se usó a concentración de 2x108 en un medio 75% E3/25% TYES
(Tryptone Yeast Extract Salts). Se utilizó el medio de crecimiento TYES ya que es
particular para el crecimiento y mantenimiento de F. psychrophilum.
28
Las larvas control se incubaron en 3 mL. de medio 75% E3/25% TYES en
ausencia de F. psychrophilum. Luego de 5 h de incubación, las larvas control y
desafiadas se lavaron con medio 75% E3/25% TYES estéril y se mantuvieron en este
medio por 24 h luego de finalizada la infección a 15°C, en placas de seis pocillos. Luego
al día 1 dpi, se observaron las larvas y se registraron los fenotipos.
29
7. RESULTADOS 7.1. Efecto sobre el sistema inmune innato provocado por la incubación de larvas de pez cebra a bajas temperaturas
Los resultados de los ensayos de incubación por un período de 4 días para 15°C,
18°C y 28°C, utilizando larvas de 2 dpf obtenidas del cruce de parentales provenientes
de la línea transgénica MPO se muestran en la Figura. 3. Al comparar los resultados
obtenidos a 15 y 18°C respecto de 28°C se observa una disminución en la actividad del
sistema inmune innato respecto al control. Esta disminución puede deberse al efecto de
la temperatura en el periodo de aclimatación de las larvas, sin embargo, no es un factor
que entorpezca nuestro objetivo.
30
31
7.2. Ensayo de infección en larvas de pez cebra utilizando cuatro cepas de F. psychrophilum
La Figura 4 muestra los resultados de los ensayos de infección, utilizando cuatro
cepas de F. psychrophilum, ordenadas de menor a mayor patogenicidad
respectivamente: LM-02, LM-06, LM-13 y JIP. Los fenotipos observados son los
descritos para la enfermedad en otras especies, encontramos daño en la región caudal
en forma de muñón en el caso de LM-06 y JIP (C y E). En el caso de la cepa LM-13 se
observaron fenotipos de ruptura de la musculatura en la región central de la larva (D).
Por otra parte, la cepa LM-02 no presentó fenotipo (B).
Debido al alto grado de patogenicidad de la cepa JIP, se decidió trabajar sólo con
ésta para los siguientes ensayos.
En la Figura 5 se observan los resultados del ensayo de infección utilizando la
cepa JIP de F. psychrophilum. En este ensayo se obtuvieron diversos fenotipos
provocados por la bacteria. Fenotipo con daño en aleta caudal en Figura 5B b1, b2 y
b4. Fenotipo con daño peduncular (Figura 5B b5 y b6) y fenotipo con curvatura de zona
caudal con daño en la parte ventral de la aleta (Figura 5B b3). Se observó, que la
aparición de los fenotipos detallados, ocurre entre el día 1 y 2 después de incubación
con la cepa JIP.
32
Figura 4. Efectos fenotípicos provocados por la de infección de 4 cepas de F. psychrophilum en
larvas de pez cebra. En A se observa una larva control donde la región caudal posee una morfología
normal. En el caso de B, C, D y E se observan el fenotipo encontrado en la infección realizada en larvas
de pez cebra con la cepa LM-02, LM-06, LM-13, y JIP respectivamente.
33
Figura 5. Fenotipos encontrados en larvas de pez cebra posterior a ser infectadas con
F.psychrophilum con la cepa JIP En A se observa la región caudal de una larva control. En B se
observan los distintos fenotipos encontrados posteriores a infección donde se observan daños en la aleta
caudal y pedúnculo caudal 1 al 6.
34
La Figura 6 muestra la caracterización del nivel de daño asociado al fenotipo
obtenido por la infección con la cepa JIP. En la Figura 6 (B, C y D) se observan los
daños caudales originados por la infección y en la Figura 6E se señalizan los distintos
niveles de daño y sus correspondientes extensiones de éstos, caracterizando la
gravedad del daño donde un menor daño corresponde a un daño originado en la aleta
caudal (región translucida), un daño leve es un daño más avanzado en la aleta caudal y
un daño severo es un daño donde la infección afecta al pedúnculo caudal (región
pigmentada que une el cuerpo del pez con la cola).
Figura 6. Efectos fenotípicos según nivel de severidad de la infección provocado por F.
psychrophilum cepa JIP en larvas de pez cebra En A se observa una larva control con su correcta
morfología. En B, C y D se observan los distintos niveles de daño provocado por la infección con
F.psychrophilum. En E se muestra una señalización de los niveles de daño observados en la región
peduncular y las extensiones correspondientemente afectadas, donde se describe un daño leve (DL), un
daño medio (DM) y un daño severo (DS) de las larvas afectadas.
35
7.3. Estandarización del protocolo de infección para F. psychrophilum en larvas de pez cebra
La Tabla II muestra las combinaciones realizadas en los ensayos de infección y
sus resultados correspondientes, respecto de la presencia de fenotipo y la mortalidad
obtenida en cada ensayo. Se observan dos combinaciones donde se obtuvieron mayor
porcentaje de fenotipo, correspondientes a una temperatura de 15°C con una carga
bacteriana de 108 UFC/mL, con un tiempo de incubación de 24 h (11% de fenotipo) y a
una temperatura de 15°C con una carga bacteriana de 108 UFC/mL, con un tiempo de
incubación de 5 h (7% de fenotipo).
Tabla II. Presencia de fenotipo y mortalidad en ensayos de infección realizados con F.
psychrophilum en larvas de pez cebra.
Condiciones experimentales
Tiempo de
incubación (h)
Temperatura
(°C)
Concentración
bacteriana
(UFC/mL)
Porcentaje de
fenotipo (%)
Porcentaje de
mortalidad (%)
5
15
1*107 4% 0%
1*108 7% 0%
18
1*107 2% 0%
1*108 2% 0%
24
15
1*107 0% 0%
1*108 11% 16%
18
1*107 2% 0%
1*108 0% 100%
36
7.4. Respuesta celular del sistema inmune innato frente a la infección de F. psychrophilum en larvas de pez cebra
La Figura 7 muestra los resultados de los ensayos de infección con larvas
provenientes de la línea transgénica MPO, con la cuantificación de neutrófilos en la
región de interés, periódicamente durante 4 dpi. Se observan los recuentos obtenidos
para las cepas LM-02 (baja patogenicidad) y JIP (alta patogenecidad) de la bacteria F.
psychrophilum. Se observa el mayor recuento de neutrófilos el primer día después de la
infección, los cuales se localizaron en la región de interés. En los días sucesivos el
conteo de neutrófilos disminuye. Se realizó un T-test para definir la significancia de los
datos obtenidos.
En la Figura 8 se muestran los resultados obtenidos de los ensayos de infección
utilizando larvas provenientes de la línea transgénica MPO utilizando 4 cepas distintas
de la bacteria, LM-02, LM-06, LM-13 y JIP. Se obtuvieron larvas con fenotipo severo,
donde se puede observar la localización de los neutrófilos en la zona dañada, indicando
una activación del sistema inmune innato.
En la Figura 9 se observan los resultados de los ensayos de infección en larvas
desafiadas sin fenotipo y en larvas que presentaron fenotipo leve y severo. Los valores
de recuento de neutrófilos en la región de interés y la zona de daño, no presentaron
diferencias significativas en el recuento de neutrófilos de larvas desafiadas y de larvas
con fenotipo leve, respecto al control. Sin embargo, se observó una diferencia
significativa en el recuentro de neutrófilos realizado en larvas con fenotipo severo,
respecto al control. En el caso de las larvas con fenotipo severo, se encontró un número
3 veces más grande que el promedio de neutrófilos encontrado en larvas controles. Se
realizó un Anova de una vía8 para analizar la significancia de los datos obtenidos.
La Figura 10 muestra los resultados obtenidos en los ensayos con larvas
morfantes (deficientes en la producción de neutrófilos) y larvas control. En B se observa
una diferencia significativa del porcentaje de fenotipo obtenido en el ensayo respecto al
control.
37
Figura 7. Efecto sobre el sistema inmune innato en larvas previamente infectadas con dos cepas
de F. psychrophilum. En A, B, C y D se observa la cuantificación diaria de neutrófilos en larvas
infectadas con LM-02 y JIP durante 4 días posterior a la infección (P<0,05).
38
Figura 8. Efectos fenotípicos y celulares tras la infección con F. psychrophilum con distintas
cepas de la bacteria en larvas transgénicas de pez cebra. En A y B se observa una larva control la
cual presenta correcta morfología (campo claro) y su sistema inmune innato no se encuentra activado
(epifluorecencia). En C y D se muestra una larva que presenta el fenotipo severo, se puede observar la
pérdida de la cola y la localización de los neutrófilos en la región del daño indicando una activación del
sistema inmune innato. En E y F se encuentra una larva con fenotipo severo, en la región peduncular y la
activación del sistema inmune en esta misma región.
39
Figura 9. Cuantificación de neutrófilos en larvas desafiadas, larvas con fenotipo leve y larvas con fenotipo severo provocado por la infección con F. psychrophilum. Se muestra la cuantificación de
neutrófilos realizada en larvas desafiadas (sin fenotipo), larvas con fenotipo leve (daño menor en aleta
caudal) y larvas con fenotipo severo (daño severo en pedúnculo) (P<0,05).
40
Figura 10. Ensayo de infección utilizando larvas deficientes en la producción de neutrófilos. En A
se muestra una larva morfante donde se observa baja presencia de neutrófilos. En B se muestra el
porcentaje de fenotipo encontrados en larvas normales y larvas deficientes en la producción de
neutrófilos.
41
8. DISCUSIÓN
Existen 3 especies del genero Flavobacteirum que actúan como agentes
patogénicos en los cultivos de peces de agua dulce y cultivos silvestres. Flavobacterium
colummnare (F. columnare) causante de la enfermedad columnar; Flavobacterium
branchiophilum (F. branchiophilum) causante de la enfermedad bacteriana de las
branquias; y Flavobacterium psychrophilum (F. psychrophilum) causante de la
enfermedad bacteriana del agua fría (Starliper, 2011). Debido a la diversidad infectiva
de dichas especies, su efecto se hace muy extenso en comparación a cualquier
patógeno bacteriano de peces donde la relación hospedero-región geográfica es muy
amplia (Starliper, 2011).
En el caso particular de F. psychrophilum, ésta ha sido reportada en distintas
regiones geográficas. En el trabajo de Cipriano y Holt de 2005, se reporta un listado de
países donde ésta bacteria está presente y las especies de peces afectadas (Cipriano y
Holt, 2005). Las especies de Flavobacterium son ubicuas de ambientes acuáticos de
agua dulce, están presentes en rangos de temperatura que van por sobre la
temperatura de congelación (F. psychrophilum) hasta los 30°C y/o más (F. columnare).
La mayoría de las especies de peces de agua dulce, pueden verse afectadas por al
menos uno de estos patógenos (Starliper, 2011).
F. psychorphilum es una bacteria que infecta a bajas temperaturas, su
sintomatología ha sido observada en temperaturas desde los 3°C hasta los 21°C (Holt
et al., 1989). Sin embargo, la mayor mortalidad de ejemplares infectados ha sido
observada por debajo de los 15°C (Holt et al., 1989). En el trabajo de Holt y Cipriano de
2005 mencionan que en algunos cultivos de juveniles de trucha arcoíris, la enfermedad
y mortalidad persiste entre 15 a 18°C (Holt et al., 1989; Rucker et al., 1954; Santos et
al., 1992). Por otra parte, los antecedentes muestran que los ejemplares más jóvenes
se ven más afectados (Cipriano y Holt, 2005; Holt et al., 1989; Starliper, 2011; Wood,
1974).
Pez cebra, en su ambiente natural, posee un amplio rango de tolerancia a los
cambios de temperatura, en las regiones donde habita se han registrado fluctuaciones
de temperatura desde los 14,2°C hasta los 33°C (López-Olmeda y Sánchez-Vázquez,
42
2011). Los registros de temperatura fluctúan dependiendo de la estación del año, en
invierno puede alcanzar 6°C y en verano hasta 38°C (Spence et al., 2008). Es un pez
ectotermo, lo que quiere decir que es capaz de adaptarse a los cambios de temperatura
del ambiente (López-Olmeda y Sánchez-Vázquez, 2011). Esta capacidad le permite
tolerar las fluctuaciones de temperatura y aclimatarse con facilidad (López-Olmeda y
Sánchez-Vázquez, 2011). La exposición de larvas de pez cebra a temperaturas
variadas gradualmente, en condiciones de laboratorio, genera una mejor respuesta de
adaptación en comparación a larvas expuestas a cambios bruscos de temperatura
(Long et al., 2013; Wang et al., 2014).
El cambio de temperatura genera efectos a nivel fisiológicos en los peces,
afectando el desarrollo, crecimiento, metabolismo entre otros (López-Olmeda y
Sánchez-Vázquez, 2011). En el caso de pez cebra, los estudios disponibles se enfocan
en identificar y estudiar los efectos provocados por los cambios de temperatura a nivel
transcripcional en estadios larvales (Long et al. 2012; Long et al. 2013), y cómo influyen
los cambios de temperatura en estadios embrionarios (Scott y Johnston, 2012).
Adicionalmente, en el trabajo de Schaefer y Ryan en 2006 evalúan el concepto de
plasticidad de desarrollo el cual se define como cambios fenotípicos permanentes
generados en respuesta a cambios en las condiciones ambientales durante el
crecimiento (Kinne, 1962). En este trabajo, se utilizaron 5 regímenes termales donde los
peces fueron expuestos desde la fertilización hasta la adultez en dichos regímenes.
Como resultado, se observó que peces expuestos a temperatura más variables poseen
una mayor tolerancia a los cambios ambientales que peces expuestos a temperaturas
más estables (Schaefer y Ryan, 2006).
Actualmente, no hay estudios disponibles enfocados en la temática de esta tesis
y a las temperaturas utilizadas en este trabajo (15 y 18°C) por lo que los resultados
obtenidos son un avance para descifrar el comportamiento de pez cebra bajo las
condiciones evaluadas.
Nuestros ensayos de incubación de larvas de pez cebra a bajas temperaturas
demuestran que no existe un efecto a nivel morfológico. Respecto a la activación del
sistema inmune innato bajo estas condiciones, se observó una disminución de la
43
actividad reflejada en el número de neutrófilos respecto a los controles. La disminución
para 15°C ocurrió los primeros días de incubación y para 18°C se observó en los
últimos días de incubación.
F. psychrophilum es el causante de la enfermedad del agua fría, esta
enfermedad ocasiona pérdidas en los cultivos de peces y afecta principalmente en la
región caudal de los peces generando úlceras en dicho tejido (Barnes y Brown, 2011).
Ha sido reportada en diversas especies, siendo las más afectadas Salmón coho y
Trucha arcoíris (Barnes y Brown, 2011; Cipriano y Holt, 2005)
En la actualidad, se tiene poco conocimiento sobre los mecanismos de infección
de F. psychrophilum y aún no se ha establecido un modelo que explique las etapas por
las cuales se lleva a cabo la infección (Barnes y Brown, 2011; Cipriano y Holt, 2005).
Un acercamiento a este conocimiento fue la secuenciación de la cepa JIP02/86(ATCC
49511) de F. psychrophilum realizada por Duchaud y cols. en 2007 (Duchaud et al.,
2007). Esta cepa fue identificada por Bernadet y Kerouault en 1989 en Francia, donde
se realizó una comparación entre 7 cepas de las cuales 5 eran aislados provenientes de
distintas partes de Francia y las 2 últimas corresponden a aislados provenientes de dos
lugares de Estados Unidos (Oregon y Washington). Los resultados arrojaron una
similitud fenotípica y genómica entre dichas cepas, donde la similitud genómica es
superior a un 90%. (Bernadet y Kerouault, 1989).
En estudios anteriores se determinó la actividad proteolítica de F.
psychrophilum, que destruye el tejido del hospedero, siendo un factor importante en la
patogenicidad de dicha bacteria (Barnes y Brown, 2011). Se identificaron 13 proteasas
putativas que probablemente estén involucradas en la virulencia y/o destrucción de
tejido del hospedero (Duchaud et al., 2007). Entre ellas se encuentran dos
metaloproteasas correspondientes a Fpp1 (Secades et al., 2001) y Fpp2 (Secades et
al., 2003) que hidrolizan una gama de sustratos dentro de los cuales se encuentran
elementos básicos de tejidos musculares (Duchaud et al., 2007)
Otras características que se relaciona con la patogenicidad de una bacteria son
la motilidad, adhesión y formación de biofilm (Duchaud et al., 2007). En el caso de F.
psychrophilum, no posee elementos de movimiento activos como pili o flagelo, por lo
44
cual la bacteria se desliza sobre las superficies celulares, este concepto se denomina
deslizamiento bacteriano (gliding motility) (Álvarez et al., 2006; Duchaud et al., 2007).
En el trabajo de Duchaud y cols. en 2007, indica que en la cepa JIP02/86 no se
encontraron genes que codifican para pili o flagelo ni organelos de motilidad. Por otra
parte, se encontraron 13 de 15 genes gld involucrados en el desplazamiento bacteriano
de F. johnsoniae (Duchaud et al., 2007).
Con respecto a la adhesión, se ha reportado la capacidad de F. psychrophilum
para adherirse a la superficie celular del cuerpo de los peces, branquias y huevos
(Kondo et al., 2002). Duchaud y cols. lograron identificar 27 genes que posiblemente
estén involucrados en la adhesión bacteriana de F. psychrophilum (Duchaud et al.,
2007).
La formación de biofilm es importante para muchas bacterias patogénicas,
especialmente para las que viven en el agua ya que aumenta la habilidad de persistir
condiciones ambientales adversas. El biofilm generalmente involucra el entrelazamiento
de las células mediante la formación de una matriz extracelular compuesta de
polisacáridos (Duchaud et al., 2007). Sobre la capacidad de formación de biofilm en F.
psychrophilum se conoce muy poco, solo se ha observado en ensayos in vitro, pero se
desconoce sobre el rol que juega el biofilm en la supervivencia de las células
bacterianas bajo condiciones desfavorables (Sundell y Wiklund, 2011).
En nuestro trabajo, encontramos una sintomatología fenotípica similar a lo que
está descrito en la literatura para otras especies afectadas por la enfermedad
provocada por F. psychrophilum (Cipriano y Holt, 2005; Holt et al., 1989; Nematollahi et
al., 2003; Starliper, 2011). Observamos distintas manifestaciones de la enfermedad
siendo más predominante el daño en la aleta y pedúnculo caudal de pez cebra, que
corresponden a la región posterior de las larvas, lo que se observa en las Figuras 4, 5 y
6. Estos, son los primeros resultados obtenidos en pez cebra. Actualmente no hay otros
antecedentes del efecto fenotípico de F. psychorphilum en esta especie.
Un aspecto importante sobre la aparición del fenotipo que encontramos se
enfoca en cómo es la respuesta del sistema inmune frente la presencia del fenotipo. El
sistema inmune innato es el principal mecanismo de defensa de los peces y el primero
45
en actuar frente a la presencia de patógenos (Rauta et al., 2012). En los últimos años
se ha intensificado su estudio asociado a la defensa frente a enfermedades que afectan
a especies de importancia comercial como consecuencia del gran crecimiento de la
acuicultura en la última década (Secombes y Wang, 2012).
Existen diversos patógenos asociados a estas enfermedades provenientes de
diferentes orígenes. En el caso de los patógenos bacterianos, su sintomatología clínica
(interna y/o externa) varía según la especie afectada, el estadio de crecimiento del
ejemplar y de la etapa en la que se encuentra la enfermedad (Toranzo et al., 2005).
Existen casos donde la sintomatología es más bien interna y presenta una apariencia
externa saludable, este es el caso de la Piscirickettsiosis la cual genera una alta
mortalidad sin evidenciar su presencia en el exterior de los ejemplares. En contraste,
existen enfermedades que tiene una sintomatología clínica externa (lesiones, úlceras,
entre otros) y bajas mortalidades como es el caso de la Flexibacteriosis (Toranzo et al.,
2005).
En nuestros resultados, además de observar un fenotipo asociado a la infección
de F. psychrophilum, vimos que la presencia de esta bacteria genera una activación del
sistema inmune innato en las larvas incubadas (estas larvas no presentaron fenotipo).
Esta activación está presente durante el día 1 posterior a la infección (Figura 7). En el
caso de larvas que presentaron fenotipo del tipo severo, observamos que la distribución
de neutrófilos se concentra de manera evidente en la región dañada (Figura 8). Este
hecho se condice con lo que esta descrito respecto al movimiento y la localización de
los neutrófilos que migran hacia la región dañada (Novoa y Figueras, 2012).
Respecto a la mortalidad obtenida en nuestros ensayos, una vez que definimos
las condiciones óptimas de trabajo, ésta ya no estuvo presente. Cabe mencionar que
para la enfermedad del agua fría se describe una mortalidad asociada la cual es
variable dependiendo de la especie afectada. Se han registrado desde un 10% hasta un
90% de mortalidad de ejemplares infectados (Barnes & Brown, 2011).
Es importante mencionar que F. psychrophilum no está descrito como un
patógeno natural de pez cebra por lo que se podría pensar que no es capaz de
infectarlo. Esto se debe a que F. psychrophilum crece a temperaturas diferentes a la
46
temperatura ambiental en la que pez cebra habita. Se ha descrito que una bacteria del
mismo género, F. columnare, es capaz de infectar a pez cebra (Conrad et al., 2013). En
este caso, F. columnare habita en temperaturas similares a las temperaturas
ambientales donde se encuentra pez cebra (Moyer y Hunnicutt, 2007).
Respecto a la presencia de fenotipo, en nuestros resultados obtuvimos larvas
con fenotipo de características similares a las que están descritas para la enfermedad
del agua fría en otras especies (Cipriano y Holt, 2005; Nematollahi et al., 2003;
Starliper, 2011). El porcentaje de fenotipo obtenido estuvo entre un 2% hasta un 11%.
Con el objetivo de potenciar nuestro estudio respecto a la aparición de fenotipo
en larvas infectadas, realizamos un ensayo de infección con larvas deficientes en la
producción de neutrófilos. Nuestros resultados arrojaron un mayor número de larvas
con fenotipo en comparación a larvas en su estado normal (Figura 10).
Respecto a la susceptibilidad y resistencia de los peces frente a la infección,
existen estudios donde se utilizan líneas de peces susceptibles y resistentes a F.
psychrophilum. En el caso de Langevin y cols. (2012), utilizaron líneas de peces
susceptibles o resistentes, las cuales fueron seleccionadas acorde al comportamiento
que mostraron frente a la infección con ésta bacteria. Se evaluó la expresión relativa de
genes donde se encontró una mayor expresión de factores solubles involucrados con el
sistema inmune (IL-1, IL-8), metaloproteinasas de matriz (mmp9, mmp13) involucradas
en la detección de patógenos mediante vía TLR (Langevin et al., 2012). En el caso de
Marancik y col. (2014) y Kutyrev y col. (2016), los estudios se enfocaron en establecer y
validar una línea de peces resistente a la EAF, esto se realizó por medio de un
programa de cruzamiento selectivo (selective breeding program), en los ensayos
realizados se evaluó la expresión relativa de genes donde el enfoque fue elementos del
sistema inmune y su comportamiento antes y después de la infección con F.
pschrophilum (Kutyrev et al., 2016; Marancik et al., 2014).
El conocimiento sobre F. psychrophilum es una herramienta fundamental para el
desarrollo de nuevas estrategias tanto de detección, como de generación de
tratamientos y métodos de contención. La detección de F. psychrophilum en los cultivos
es uno de los problemas principales en el estudio de esta bacteria ya que es difícil
47
distinguir filogenéticamente y fenotípicamente las especies del genero Flavobacterium.
Una manera de lograr la identificación es mediante la técnica de PCR, específicamente
la identificación del gen 16s rRNA. Esta metodología, es la más adecuada para
identificar y diagnosticar la presencia bacteriana de manera temprana (Toranzo et al.,
2005).
Una manera de tener ventaja frente a la acción de F. psychrophilum en los
cultivos de peces es la compresión y conocimiento sobre los mecanismos de virulencia
de dicha bacteria que en el caso de Duchaud y cols. se pudo llevar a cabo para la cepa
JIP02/86. Esta información proporciona una base para el desarrollo de nuevas
estrategias de control (Duchaud et al., 2007).
Respecto a pez cebra, es un modelo animal que ha sido ampliamente utilizado
en biomedicina y para estudiar infección de patógenos humanos y los que afectan
cultivos acuícolas (Rowe et al., 2014).
El hecho de ser un modelo muy versátil y fácil de cultivar lo hace atractivo para
ser utilizado en investigación. Las ventajas que presenta permiten proyectar su uso en
diversas áreas de la acuicultura, como la caracterización de enfermedades acuícolas,
responsables de pérdidas monetarias importantes. Más específicamente, se puede
lograr obtener un mayor conocimiento sobre los mecanismos infectivos involucrados y
las condiciones donde son gatillados. Con esta información, se pueden generar
conocimiento sobre la detección de agentes patogénicos y nuevas estrategias de
control y/o tratamiento.
Actualmente, en nuestro laboratorio se realizó un estudio en el cual se evaluó el
comportamiento del sistema inmune de pez cebra frente a la exposición a distintas
vacunas contra F. psychrophilum (Solís et al., 2015). Como resultado, se obtuvo una
activación del sistema inmune similar a la descrita anteriormente en trucha arcoíris por
Madetoja y cols. en 2006. Este hecho avala a pez cebra como un buen modelo de
estudio y permite tener como proyección el uso de este modelo para probar futuros
tratamientos.
48
Finalmente, esta tesis presenta una base en el conocimiento de F. psychrophilum
y su enfermedad, postulando así al pez cebra como un modelo de estudio integral y
confiable para posteriores estudios tanto de esta bacteria como de otros patógenos
importantes para la acuicultura.
49
9. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
En nuestro trabajo logramos evaluar el efecto de las bajas temperaturas en
larvas de pez cebra, entendiendo que para las condiciones y estadios utilizados la
temperatura no afecta en su morfología y no activa la respuesta del sistema inmune
innato. Por lo tanto, el sistema inmune innato de pez cebra no se ve activado en las
temperaturas evaluadas. Estos resultados son importantes para comprender la
plasticidad de pez cebra frente a los cambios de temperatura, principalmente el
comportamiento a bajas temperaturas lo cual está escasamente descrito.
Adicionalmente, esta información permitiría trabajar con otras bacterias que afecten en
este rango de temperatura y que sean de interés comercial.
Encontramos que F. psychrophilum es capaz de infectar a pez cebra simulando
lo que esta descrito para otras especies. Esto es de suma importancia ya que no estaba
descrito que F. psychrophilum fuera capaz de infectar a pez cebra. Respecto a pez
cebra como modelo de infección, nuestro trabajo avala al pez cebra como un modelo
versátil, integral y manejable permitiendo realizar estudio de manera eficiente y
confiable.
Logramos adecuar una metodología de infección para F. psychrophilum en larvas
de pez cebra utilizando metodología de inmersión por baño. Esto no estaba descrito
anteriormente para esta bacteria en pez cebra por lo que este conocimiento entrega
una ventaja para posteriores estudios tanto en esta bacteria como en otras bacterias
que posean características similares.
Finalmente, observamos que la infección mediada por F.psychrophilum en
larvas de pez cebra activa el sistema inmune innato en respuesta de la presencia de
dicha bacteria.
Como proyección, nuestro estudio deja los cimientos para posteriores
investigaciones sobre los mecanismos y progresión de la infección siendo esto
fundamental para plantear a futuro soluciones de manejo en cultivos como lo es tener
indicadores tempranos de la presencia de la bacteria y tratamientos que permitan
contener y/o erradicar ésta de los cultivos de peces de importancia para la acuicultura.
50
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