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Dissertação de Mestrado

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Ramo Tecnologia do Ambiente

Trabalho efetuado sob a orientação da

Doutora Daniela Patrícia Bernardino Mesquita e do Engenheiro Adriano José Pereira de Magalhães

Andreia Filipa Moreira Pereira Dinis Ribeiro

Outubro de 2015

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

Estudo de viabilidade de produçãode polihidroxialcanoatos (PHAs)por culturas microbianas mistasdo tratamento do efluente urbano

DECLARAÇÃO

Nome: Andreia Filipa Moreira Pereira Dinis Ribeiro

Título da dissertação: Estudo de viabilidade de produção de polihidroxialcanoatos (PHAs) por culturas

microbianas mistas do tratamento do efluente urbano

Orientadores: Dr.ª Daniela Patrícia Bernardino Mesquita e Eng.º Adriano José Pereira de Magalhães

Ano de conclusão: 2015

Designação do Mestrado: Dissertação de Mestrado em Engenharia Biológica

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO,

MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.

Universidade do Minho, 24 de novembro de 2015

Assinatura:______________________________________________________________

AGRADECIMENTOS

iii

AGRADECIMENTOS

O espaço limitado desta secção não me permite agradecer e abarcar todos aqueles que me

acompanharam ao longo desta caminhada, no entanto, posso referir que a realização desta tese

de mestrado contou com o apoio e colaboração de pessoas importantes, sem as quais não teria

sido possível concretizar este sonho. Estou-lhes eternamente grata por todo o incentivo e apoio

que me deram.

Deixo um agradecimento muito especial à minha orientadora, Dr.ª Daniela Mesquita, pela

ajuda, transmissão do conhecimento, disponibilidade; pelo saber que me transmitiu, pela forma

tão dedicada com que solucionou as minhas dúvidas e pela amizade com que me presenteou.

Na empresa onde trabalho, Águas do Norte, S.A., agradeço ao meu orientador Eng.ª Adriano

Magalhães por toda a paciência, orientação, incentivo no rigor e clareza com que me auxiliou a

solucionar as dúvidas que surgiam; À Eng.ª Cristiana Barbosa, à Eng.ª Inês Leer pelas palavras de

incentivo que sempre me endereçaram, a todos os meus colegas de trabalho, em especial ao Ivo

Marques e João Castro por toda a disponibilidade, nas trocas de horários e no apoio demonstrado.

À Eng.ª Marília e Eng.ª Cláudia pela ajuda prestada no laboratório da ETAR do Ave.

No Departamento de Engenharia Biológica da Universidade do Minho, agradeço à

Eng.ª Diana Vilas Boas pela ajuda na recolha de imagens de microscopia; à Dr.ª Ana Nicolau pela

ajuda e disponibilidade na identificação dos protozoários; à Eng.ª Salomé, Eng.ª João e

Dr.ª Andreia pela transmissão de conhecimentos e ajuda; ao Professor Doutor Eugénio Ferreira e

a Professora Doutora Madalena Alves pela disponibilidade dos laboratórios e material. Ao

Professor Doutor João Peixoto agradeço a disponibilidade na resposta às minhas dúvidas.

Às colegas Regina Malgueiro, Cátia Braga e Sara Pinela entre outros que não menciono o

nome, mas que sabem quem são. Obrigada pelas palavras de incentivo e pelo companheirismo

ao longo desta caminhada, que teve muitos altos e baixos.

A toda a minha família, pelo carinho e pelas palavras de incentivo, mas especialmente aos

meus pais, António Dinis e Lurdes Silva, que sempre primaram pela minha educação.

AGRADECIMENTOS

iv

Por último, mas sem eles não seria capaz de concretizar este ciclo marcante da minha vida,

ao meu marido, Diamantino Ribeiro e à minha filha, Bruna Ribeiro, pelo amor incondicional e apoio

que me demonstraram ao longo deste trajeto. Amo-vos muito!

RESUMO

v

RESUMO

Estudo de viabilidade de produção de polihidroxialcanoatos (PHAs) por culturas

microbianas mistas do tratamento do efluente urbano.

O plástico convencional produzido através de derivados do petróleo apresenta a

incapacidade de degradar-se, constituindo uma forma de poluição. Por outro lado, é necessário

procurar alternativas ao uso de fontes não-renováveis. Deste modo, a produção de polímeros

biodegradáveis através de microrganismos surge como uma alternativa sustentável para a

substituição dos plásticos convencionais. Dentro dos bioplásticos de base biológica, os PHAs são

os polímeros que possuem propriedades físico-químicas mais semelhantes ao polipropileno (PP),

constituindo assim um potencial candidato à sua substituição.

Globalmente, os objetivos do projeto foram os seguintes: estudo da produção e acumulação

de PHAs a partir de culturas microbianas mistas (lamas ativadas) presentes nos efluentes urbanos

tratados na ETAR de Penices; e comparação do método de cromatografia gasosa com o método

de análise de imagem com coloração de Negro Sudão B (NSB) para análise quantitativa de PHAs.

Neste projeto foram utilizadas culturas mistas para a obtenção de PHAs, tornando-se uma

alternativa mais vantajosa, em relação à utilização de culturas puras a nível industrial, uma vez

que permite o uso de culturas sem qualquer manipulação do meio em que se inserem. Traduz-se

num processo economicamente mais atrativo tanto a nível de adição de substratos específicos

como a nível de condições de esterilização.

Os resultados obtidos a partir da cromatografia gasosa revelaram que a acumulação de PHA

nas lamas ativadas atingiu uma fração mássica máxima de PHA de 5.3 %, em relação ao teor em

biomassa liofilizada, e uma concentração máxima igual a 127 mg L-1. Por outro lado, os resultados

da técnica de coloração NSB demonstraram o mesmo, obtendo-se um coeficiente de correlação

de 0.91 e um erro quadrático médio de previsão (RMSEP) de 5.65 mg L- 1. Assim, apesar do erro

associado, esta última técnica sugere ser uma alternativa viável para a quantificação deste

polímero, sendo mais fácil de operar e menos dispendiosa. Com recurso ao programa SuperPro

Designer® concluiu-se que a produção de PHAs com culturas mistas à escala industrial não é

RESUMO

vi

viável, dadas as baixas quantidades obtidas de polímero, tal como o elevado investimento na

instalação para extração e purificação.

Palavras-chave: Lamas ativadas, polihidroxialcanoatos (PHA), PHV, PHB, análise de imagem, NSB, reator contínuo, águas residuais

ABSTRACT

vii

ABSTRACT

Polyhydroxyalkanoates production feasibility study (PHAs) mixed microbial

cultures for treatment of urban wastewater.

The conventional plastic produced by petroleum presents the inability to degrade,

constituting a form of pollution. On the other hand, it is necessary to seek alternatives to the use

of non-renewable sources. Thus, the production of biodegradable polymers by microorganism

arises as a sustainable alternative for the substitution of conventional plastics. Within the bio-based

bioplastics, the PHAs are polymers that have physicochemical properties more similar to

polypropylene (PP), thus constituting a potential candidate for replacement.

Overall, the project objectives were as follows: study of the production and accumulation of

PHAs from mixed microbial cultures (activated sludge) present in urban wastewater treated in

Penices; and comparing gas chromatographic method with the image analysis method with Sudan

Black B (SSB) stain for quantitative analysis of PHAs.

In this design were used mixed cultures for obtaining PHAs, becoming a more advantageous

alternative, in relation to the use of pure cultures on an industrial scale, since it allows the use of

cultures without any manipulation of the environment in which they operate. Results in an

economically more attractive process both the addition level of specific substrates such as the level

of sterilization conditions.

The results from the gas chromatography revealed that the accumulation of PHA in activated

sludge reached a maximum mass fraction of PHA equal to 5.3 % with respect to the content of

lyophilized biomass, and a maximum concentration equal to 127 mg L-1. Moreover, the results of

NSB staining technique demonstrated the same, obtaining a correlation coefficient of 0.91, and a

root mean squared error of prediction (RMSEP) of 5.65 mg L-1. Thus, despite the associated error,

this latter technique suggested to be a viable alternative for the quantification of polymer, easier to

operate and less expensive. With use of SuperPro Designer® program we concluded that the

production of PHAs with mixed cultures in industrial scale is not reliable, according the low

quantities obtained polymer, such as high investment in the plant for extraction and purification.

ABSTRACT

viii

Keywords: Activated sludge, polyhydroxyalkanoates (PHA), PHV, PHB, image analysis, continuous reactor, wastewaters.

ÍNDICE GERAL

ix

ÍNDICE GERAL

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................ iii

RESUMO ...................................................................................................................................... v

ABSTRACT ..................................................................................................................................vii

ÍNDICE GERAL .............................................................................................................................. ix

ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................... xiii

ÍNDICE DE TABELAS ..................................................................................................................... xix

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .............................................................................................. xxi

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1

1.1. ENQUADRAMENTO E MOTIVAÇÃO ................................................................................ 2

1.1.1. EMPRESA RESPONSÁVEL PELO PROJETO .................................................................. 2

1.1.2. A IMPORTÂNCIA DOS PLÁSTICOS / SUSTENTABILIDADE DA SOCIEDADE ........................... 3

1.2. OBJETIVOS DO PROJETO........................................................................................... 7

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ....................................................................................................... 9

2.1. CARACTERÍSTICAS DA ÁGUA RESIDUAL E VALORES LIMITES DE DESCARGA ......................... 10

2.2. FUNCIONAMENTO DA ETAR DE PENICES ................................................................... 12

2.3. SISTEMA DE TRATAMENTO DO EFLUENTE URBANO COM LAMAS ATIVADAS ........................... 19

2.4. MICROBIOLOGIA DO PROCESSO................................................................................ 21

2.5. PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS) POR CULTURAS MISTAS ........................ 23

2.5.1. PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE PHAS ........................................................................ 27

2.5.2. VANTAGENS DA PRODUÇÃO DE PHAS POR CULTURAS MISTAS .................................... 29

2.5.3. PRODUÇÃO DE PHA À ESCALA LABORATORIAL / PILOTO ........................................... 29

3. PLANIFICAÇÃO, METODOLOGIAS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ............................................... 35

3.1. PLANIFICAÇÃO DO ESTUDO ..................................................................................... 36

DISSERTAÇÃO EM MESTRADO INTEGRADO DE ENGENHARIA BIOLÓGICA 2015

x

3.2. ESTUDO GERAL DO FUNCIONAMENTO DA ETAR .......................................................... 37

3.3. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FÍSICO – QUÍMICOS DURANTE OS 30 DIAS DE

MONITORIZAÇÃO................................................................................................................ 38

3.3.1. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DOS SÓLIDOS TOTAIS (ST) E SÓLIDOS VOLÁTEIS TOTAIS

(SVT) .................................................................................................................... 38

3.3.2. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DO PH, TEMPERATURA (T), POTENCIAL REDOX (ORP),

CONDUTIVIDADE (EC), OXIGÉNIO DISSOLVIDO (OD) ............................................................. 38

3.3.3. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DA PLUVIOSIDADE (P) ......................................... 38

3.4. ÍNDICE BIÓTICO DE LAMAS (IBL) ............................................................................. 40

3.4.1. METODOLOGIA DO MÉTODO IBL ........................................................................... 40

3.4.1. PROCEDIMENTO, MATERIAL DE AMOSTRAGEM E TRANSPORTE ..................................... 41

3.4.2. PROCEDIMENTO PARA OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA E MATERIAL ................................ 41

3.4.3. PROCEDIMENTO DE CONTAGEM MICROSCÓPICA ...................................................... 42

3.5. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE POLÍMEROS DE RESERVA PHB (POLI-3-HIDROXIBUTIRATO) E

PHV (POLI-3-HIDROXIVALERATO) ATRAVÉS DO MÉTODO DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) ................. 44

3.5.1. METODOLOGIA CG ............................................................................................ 44

3.5.2. METODOLOGIA DO PROCESSO DE LIOFILIZAÇÃO ....................................................... 45

3.5.3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DE LIOFILIZAÇÃO..................................................... 45

3.5.4. PROCEDIMENTO DA PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES PADRÃO PARA O TRAÇADO DA CURVA DE

CALIBRAÇÃO DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PHA ............................... 46

3.5.5. METODOLOGIA DA REAÇÃO DE ESTERIFICAÇÃO ........................................................ 46

3.5.6. PROCEDIMENTO PARA A REAÇÃO DE ESTERIFICAÇÃO ................................................. 46

3.5.7. METODOLOGIA DA EXTRAÇÃO LÍQUIDO – LÍQUIDO .................................................... 47

3.5.8. PROCEDIMENTO PARA A EXTRAÇÃO LÍQUIDO – LÍQUIDO ............................................. 47

3.5.9. PROCEDIMENTO PARA ANÁLISE DAS AMOSTRAS ATRAVÉS DE CG ................................. 48

ÍNDICE GERAL

xi

3.6. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PHAS PELO MÉTODO DE ANÁLISE DE IMAGEM ATRAVÉS DA

COLORAÇÃO NEGRO DE SUDÃO B (NSB) ................................................................................ 49

3.6.1. METODOLOGIA DA COLORAÇÃO NSB E AQUISIÇÃO DE IMAGENS .................................. 49

3.6.2. PROCEDIMENTO E MATERIAL DE COLORAÇÃO NSB E AQUISIÇÃO DE IMAGENS ................ 49

3.6.3. PROCEDIMENTO DE ANÁLISE DE IMAGEM ................................................................ 50

3.7. RESUMO DE AMOSTRAGEM DIÁRIA DO CANAL ANÓXICO ................................................. 53

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 55

4.1. ANÁLISE DA MONITORIZAÇÃO ANUAL DA ÁGUA RESIDUAL BRUTA AFLUENTE À ETAR ........... 57

4.1.1. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (CAUDAL ETAR (Q ETAR), CAUDAL MATADOURO (Q MATADOURO) E CAUDAL

TINTURARIA (Q TINTURARIA)) ................................................................................................. 57

4.1.2. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (BIODEGRADABILIDADE, CQO E CBO5) .................................. 58

4.1.3. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (PH, SST, SSV) ............................................................... 59

4.1.4. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (P, N, AZOTO AMONIACAL) ................................................. 61

4.2. ANÁLISE DA MONITORIZAÇÃO ANUAL DA ÁGUA RESIDUAL TRATADA DA ETAR ..................... 62

4.2.1. ÁGUA RESIDUAL TRATADA (PH, CQO, CBO5) ......................................................... 62

4.2.2. ÁGUA RESIDUAL TRATADA (P, N, SST) ................................................................. 62

4.3. MONITORIZAÇÃO ANUAL CANAL ANÓXICO .................................................................. 64

4.3.1. ALIMENTO / MICRORGANISMOS (A/M) E SÓLIDOS (SSV) .......................................... 64

4.4. MONITORIZAÇÃO DO CANAL ANÓXICO DURANTE 30 DIAS ............................................... 66

4.4.1. TEMPERATURA (T) E PH ..................................................................................... 66

4.4.2. POTENCIAL REDOX (ORP) .................................................................................. 67

4.4.3. PLUVIOSIDADE (P) ............................................................................................ 68

4.4.4. OXIGÉNIO DISSOLVIDO (OD) ............................................................................... 69

4.4.5. CONDUTIVIDADE (EC) ........................................................................................ 70

4.4.6. SÓLIDOS TOTAIS (ST) E SÓLIDOS VOLÁTEIS TOTAIS (SVT) ......................................... 71

4.5. OBSERVAÇÃO E CONTAGEM MICROSCÓPICA – IBL ....................................................... 73


xii

4.5.1. CANAL ANÓXICO ............................................................................................... 73

4.5.2. IBL DO CANAL AERÓBIO..................................................................................... 73

4.5.3. PRINCIPAIS PROTOZOÁRIOS / METAZOÁRIOS OBSERVADOS ........................................ 73

4.6. ANÁLISE PRELIMINAR DA PRESENÇA DE PHAS NA ETAR ............................................... 79

4.6.1. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DOS LOCAIS PARA ACUMULAÇÃO DE PHA ...................... 79

4.6.2. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PHAS EM PROFUNDIDADE DO CANAL ANÓXICO .......... 81

4.7. MONITORIZAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PHA ............................................................ 82

4.7.1. PHA DETERMINADO POR CROMATOGRAFIA GASOSA ................................................. 82

4.7.2. PHA POR ANÁLISE DE IMAGEM DA COLORAÇÃO NSB ............................................... 85

4.8. PARÂMETROS OPERATÓRIOS, TEMPO DE RETENÇÃO (TRH), CARGA ORGÂNICA APLICADA

(OLR), PARA A ACUMULAÇÃO DE PHAS ................................................................................. 90

4.9. VISÃO GERAL PARA O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PHAS ............................................ 92

5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .............................................................. 97

BIBLIOGRAFIA ...........................................................................................................................101

ANEXOS ..................................................................................................................................111

ANEXO I – PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DOS SÓLIDOS .............................................................112

ANEXO II – TABELA RELATIVA AOS DIAS DE MONITORIZAÇÃO ...............................................................114

ANEXO III – CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA O MÉTODO DE CROMATOGRAFIA GASOSA ...............................115

ANEXO IV – EXEMPLO DE RELATÓRIO DA CROMATOGRAFIA GASOSA ......................................................116

ANEXO V – EXEMPLOS DE CÁLCULO PARA PHA ...............................................................................117

ANEXO VI – VALORES DAS ÁREAS OBTIDAS PELA LEITURA DOS CROMATOGRAMAS (MÉTODO CG) ................119

ANEXO VII – VALORES DAS ÁREAS OBTIDAS PELO MÉTODO ANÁLISE DE IMAGEM .....................................121

ANEXO VIII – DADOS UTILIZADOS NO SUPERPRO DESIGNER® ............................................................124

ÍNDICE DE FIGURAS

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 – Mapa dos concelhos abrangidos pelas Águas do Norte, como entidade gestora de

água e saneamento. Pode-se observar que compreende grande parte do norte de Portugal, em

exceção a 5 concelhos que se encontram na imagem a branco. ................................................ 2

Figura 1.2 – Classificação quanto à biodegradabilidade em sistema de coordenadas quanto à

fonte e origem dos materiais, sendo apresentado alguns exemplos de plásticos de cada tipo

(European Bioplastics, 2014). ................................................................................................... 6

Figura 2.1 – Esquema das várias etapas de tratamento existentes na ETAR de Penices. .......... 12

Figura 2.2 – Esquema das etapas do tratamento de lamas instalado na ETAR de Penices. ...... 12

Figura 2.3 – Estação elevatória da ETAR de Penices. .............................................................. 12

Figura 2.4 – Gradagem automática (tamisador) e manual da ETAR de Penices. ....................... 13

Figura 2.5 – Tanques do pré-tratamento, com os processos em simultâneo desengorduramento

e desarenamento. ................................................................................................................... 13

Figura 2.6 – Classificador de areias e o concentrador de gorduras da ETAR de Penices. .......... 13

Figura 2.7 – Canais de arejamento (reator anóxico e aeróbio). ................................................ 14

Figura 2.8 – Representação esquemática do reator típico de nitrificação/desnitrificação, com

arejadores de eixo horizontal (rotores) (imagem retirada (Jördening et al., 2005). .................... 14

Figura 2.9 – Decantadores secundários da ETAR. ................................................................... 14

Figura 2.10 – Fotografia relativa aos descarregadores onde o efluente tratado tem como destino

final a descarga no meio hídrico, o Rio Este. ........................................................................... 15

Figura 2.11 – Sistema de filtração e desinfeção da água residual através UV para

reaproveitamento. ................................................................................................................... 15

Figura 2.12 – Tambor rotativo de espessamento Andritz instalado na ETAR de Penices. .......... 15

Figura 2.13 – Centrífuga Andritz instalada na ETAR de Penices. .............................................. 16

Figura 2.14 – Silo de armazenagem de lamas. ....................................................................... 16


xiv

Figura 2.15 – Fotografia aérea da ETAR de Penices ................................................................ 16

Figura 2.16 – Representação esquemática do funcionamento da ETAR de Penices, onde estão

representadas as linhas principais de tratamento. As linhas a azul são referentes ao tratamento

líquido e as linhas representadas a castanho correspondem ao tratamento sólido (lamas). ...... 17

Figura 2.17 – Alguns ciliados comuns e amibas com teca de estações de tratamento de efluente

e o seu hábito alimentar. Imagem retirada de (Mara et al., 2003). ........................................... 22

Figura 2.18 – A classificação de polihidroxialcanoatos (Babel et al., 2001). ............................. 25

Figura 2.19 – Estruturas comuns do monómero de PHA. Os monómeros de cadeia curta:

3- hidroxibutirato (3HB), 3-hidroxivalerato (3HV), monómeros de cadeia média:

3- hidroxi- hexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxidecanoato (3 HD),

3- hidroxidodecanoato (3HDD). .............................................................................................. 26

Figura 2.20 – Imagem de microscopia eletrónica de transmissão de uma secção celular da

Azotobacter chroococcum, onde são visíveis os grânulos de PHA (Nuti et al., 1972) ................ 27

Figura 2.21 – Esquema geral de produção e extração de PHA (exemplo adaptado de

(Chen, 2010)). ...................................................................................................................... 28

Figura 3.1 – Planificação do trabalho de estágio representada em 5 etapas. ........................... 36

Figura 3.2 – Esquema das várias etapas necessárias para o processo de determinação

quantitativa de PHAs por cromatografia gasosa. ...................................................................... 45

Figura 3.3 – Esquema das várias etapas necessárias para o processo de determinação

quantitativa de PHAs por análise de imagem através da coloração NSB. .................................. 49

Figura 3.4 – Reatores biológicos da ETAR de Penices, como o local de recolha de amostras.... 50

Figura 3.5 – Representação esquemática do processo e análise de imagem para a coloração

NSB (Mesquita et al., 2015). .................................................................................................. 52

Figura 3.6 – Imagens representativas das principais etapas do processamento de imagem, (a)

Imagem original de NSB (b) imagem segmentada (c) identificação dos grânulos de PHA (d)

imagem de reconhecimento, imagens retiradas (Mesquita et al., 2013a). ................................ 52

ÍNDICE DE FIGURAS

xv

Figura 3.7 – Resumo do trabalho diário durante uma amostragem de 30 dias consecutivos para

monitorização dos PHAs. ........................................................................................................ 53

Figura 4.1 – Monitorização do caudal diário de entrada na ETAR (Q ETAR), o efluente de um

matadouro (Q Matadouro) e de uma tinturaria (Q Tinturaria), as unidades de medida são expressas

em m3 d-1. ............................................................................................................................. 58

Figura 4.2 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual bruta. Os dados

incluem a concentração da carência biológica de oxigénio ao fim de 5 dias representado por

CBO5 em mg L-1, a concentração da carência química de oxigénio representado por CQO em

mg L-1 e o respetivo quociente (que traduz a biodegradabilidade). ........................................... 59

Figura 4.3 – Resultados relativos a um ano de monitorização semanal da água residual bruta,

pH e a concentração de SST em mg L-1. ................................................................................ 60

Figura 4.4 – Resultados relativos a um ano de monitorização semanal da água residual bruta,

relativamente à concentração dos nutrientes azoto total e fósforo total representados por (CN) e

(CP), respetivamente, e o azoto amoniacal (CN – NH4+) nas unidades mg L- 1. ............................. 61

Figura 4.5 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual tratada, sendo

apresentada a concentração da carência biológica de oxigénio, representado por CBO5 mg L- 1, a

concentração da carência química de oxigénio representado por CQO em mg L-1 e pH. ........... 62

Figura 4.6 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual tratada,

relativamente aos nutrientes azoto total e fósforo total representado por (CN) e (CP)

respetivamente e os sólidos suspensos totais (SST) expressos em mg L-1. ............................... 63

Figura 4.7 – Resultados de um ano de monitorização com amostragem semanal do canal

anóxico. Representação gráfica da taxa (A/M), alimento para os microrganismos,

correspondendo os microrganismos aos sólidos suspensos voláteis (SSV). .............................. 64

Figura 4.8 – Resultados da monitorização do canal anóxico durante o tempo (t) de amostragem

em dias (d), quanto ao pH (na Escala de Sörensen) e à temperatura (T) em °C. ...................... 66

Figura 4.9 – Resultados da monitorização da evolução do ORP no canal anóxico durante o

período de amostragem, em unidades (mV). ........................................................................... 67


xvi

Figura 4.10 – Gráfico retirado da fonte (Mara et al., 2003), onde são demostradas as variações

do efluente em relação a concentração de oxigénio dissolvido e potencial redox. ..................... 68

Figura 4.11 – Resultados da pluviosidade relativa aos 30 dias de amostragem, a qual é mediada

através de um pluviómetro. ..................................................................................................... 69

Figura 4.12 – Resultados da concentração de oxigénio dissolvido (OD), em unidades (mg L-1)

durante o período de tempo de amostragem (t) em dias (d). ................................................... 69

Figura 4.13 – Resultados da condutividade (EC), em unidades (mS cm-1) durante o período de

amostragem (t) em dias (d). .................................................................................................. 70

Figura 4.14 – Resultados da concentração de sólidos totais (ST) e sólidos voláteis totais (SVT)

em unidades (g L-1) durante o período de tempo de amostragem (t) em dias (d). ..................... 71

Figura 4.15 – Aspidisca cicada imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação 100× na

imagem (a) e 400× na imagem (b). ........................................................................................ 75

Figura 4.16 – Aspidisca lynceus imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação a 400×

na imagem (a) e (b). ............................................................................................................... 75

Figura 4.17 – Epistylis sp imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação 100× na

imagem (a) e 400× na imagem (b). ........................................................................................ 75

Figura 4.18 – Na imagem (a) encontra-se uma amiba nua, e na imagem (b) visualiza-se um

flagelado com a ampliação 200×. ........................................................................................... 76

Figura 4.19 – Na imagem (a) encontra-se flocos regulares, e na imagem (b) visualiza-os flocos

com excesso de bactérias filamentosas com a ampliação 100×. ............................................. 76

Figura 4.20 – Nas imagens (a, b) é visível um rotífero digononta, Habrotrocha sp imagens

obtidas durante este trabalho, com ampliação 100× na imagem (a) e 400× na imagem (b). ... 77

Figura 4.21 – Na imagem (a) identifica-se um rotífero digononta, Philodina sp e na imagem (b)

está representado um nematodo imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação a 100×

na imagem (a) e (b). ............................................................................................................... 77

Figura 4.22 – Concentração de PHA l nos vários locais de recolha na ETAR. . ......................... 79

ÍNDICE DE FIGURAS

xvii

Figura 4.23 – Gráfico relativo à fração mássica de PHA l e de SVT das amostras coletadas no

canal anóxico em várias profundidades (h), expressas em metros (m). .................................... 81

Figura 4.24 – Concentração de PHA l relativa ao canal anóxico nos 30 dias consecutivos de

amostragem em mg mg-1 correspondente à fração mássica de PHA por cada mg de biomassa

liofilizada. ............................................................................................................................... 82

Figura 4.25 – Cromatograma do CG obtido durante o trabalho relativo ao dia 13 de amostragem,

dos derivados de ésteres que se extraíram a partir de uma amostra de lamas ativadas do canal

anóxico. Os componentes identificados foram PHB (pico aos 9.547 min), PHV (pico aos

10.119 min) e o ácido benzoico (pico aos 10.798 min) como padrão interno. Os outros picos

não foram identificados. ......................................................................................................... 83

Figura 4.26 – Gráfico relativo à concentração de PHA na biomassa em (mg L-1) relativa ao canal

anóxico nos 30 dias consecutivos de amostragem. .................................................................. 84

Figura 4.27 – Imagens de grânulos de PHA (a, b, c, d), após coloração NSB e visualização

microscópica em imersão de óleo com ampliação 1 000×; estas imagens foram obtidas durante

o trabalho realizado. ............................................................................................................... 86

Figura 4.28 – Área Total de grânulos de PHA obtidos durante a monitorização da concentração

de PHA por análise de imagem. .............................................................................................. 87

Figura 4.29 – Gráfico relativo à monitorização de 30 dias consecutivos das inclusões de PHA

através da análise quantitativa de imagem pela coloração NSB. Relação entre o PHA previsto

(concentração de PHA prevista pela análise de imagens quantitativa) e PHA observado (concentração

obtida através da CG). ............................................................................................................ 89

Figura 4.30 – Visão geral do processo de produção de PHA, consistindo na fermentação, na

recuperação e no processamento mediante a aplicação do polímero (Babel et al., 2001). ....... 92

Figura 4.31 – Esquema geral do mecanismo da extração da biomassa, já existente na ETAR de

Penices. ................................................................................................................................. 93

Figura 4.32 – Esquema geral do mecanismo da extração e purificação de PHAs, para a ETAR de

Penices, esboço realizado através do SuperPro Designer®. ..................................................... 96


xviii

Figura A.1 – Curva de calibração para a concentração de PHV. A ordenada representa a razão

entre as áreas do PHB (APHB) e a área do padrão interno (API) e a abcissa representa a razão

entre a massa de PHB (mPHB) presente na amostra e a concentração padrão interno (CPI)...... 115

Figura A.2 – Curva de calibração para a concentração de PHV. A ordenada representa a razão

entre as áreas do PHV (APHV) e a área do padrão interno (API) e a abcissa representa a razão

entre a massa de PHV (mPHV) presente na amostra e a concentração do padrão interno (CPI) . 115

Figura A.3 – Relatório do CG relativo ao dia 13 de amostragem. ............................................ 116

ÍNDICE DE TABELAS

xix

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2.1 – Valores das características do afluente bruto da ETAR de Penices e os valores

limites de emissão (VLE) definidos na licença de descarga emitida pela APA ........................... 11

Tabela 2.2 – Compostos limitantes que conduzem à formação de PHAs (Babel et al., 2001) ... 24

Tabela 2.3 – Empresas que investigam e produzem PHAs (Chen, 2009; Jacquel et al., 2008;

Avérous et al., 2012) .............................................................................................................. 28

Tabela 2.4 – Alguns estudos realizados sobre a acumulação de PHA em culturas mistas e o

conteúdo máximo obtido, em fração mássica, de PHA por biomassa em relação ao tipo de

cultura, qual o substrato como fonte de carbono e o tipo de processo ..................................... 31

Tabela 3.1 – Tabela de duas entradas para o cálculo do IBL (na qual: S – nº de espécies da

microfauna, excluindo os flagelados e F – nº pequenos flagelados na diagonal da Câmara de

Fuchs-Rosenthal), (Nicolau et al., 2002; Madoni, 1994) .......................................................... 40

Tabela 3.2 – Conversão do valor do IBL em classes de qualidade biológica das lamas ativadas e

avaliação da eficiência depuradora do tratamento (Madoni, 1994; Nicolau et al., 2002) .......... 41

Tabela 4.1 – Relatório da observação da microfauna do canal aeróbio determinação do IBL .... 74

Tabela 4.2 – Dados de caudal (Q) e carência química de oxigénio (CQO) resultante da

monitorização da água residual de entrada, carga orgânica aplicada (OLR) e acumulação de PHA

relativamente à monitorização do 1º canal de arejamento (reator anóxico) ............................... 90

Tabela A.1 – Dia de operação da monitorização correspondente à data de operação ............. 114

Tabela A.2 – Valor das áreas obtidas pelo GC, na monitorização de PHA preliminar .............. 119

Tabela A.3 – Valor das áreas obtidas pelo GC, na monitorização do PHA diário ..................... 120

Tabela A.4 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho pequeno

(menos de 100 pixéis) .......................................................................................................... 121

Tabela A.5 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho intermédio

(entre 100 e 400 pixéis) ....................................................................................................... 122


xx

Tabela A.6 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho grande (mais

de 400 pixéis) ...................................................................................................................... 123

Tabela A.7 – Dados Termofísicos para os componentes subjacentes ao processo de extração e

purificação de PHA ............................................................................................................... 124

Tabela A.8 – Preço dos componentes químicos do processo de extração e purificação de PHA

............................................................................................................................................ 124

Tabela A.9 – Balanços mássicos aos processos de extração e purificação de PHA ................. 125

Tabela A.10 – Balanços térmicos do processo de extração e purificação de PHA ................... 125

Tabela A.11 – Custos anuais associados às utilidades do processo de extração e purificação de

PHA ..................................................................................................................................... 125

Tabela A.12 – Tipo de resíduo e quantidade gerada anualmente durante a extração e purificação

de PHA ................................................................................................................................. 126

Tabela A.13 – Custos associados ao consumível do processo de extração de PHA................. 126

Tabela A.14 – Número e respetivo nome dos equipamentos associados ao processo de extração

e purificação de PHA ............................................................................................................ 126

Tabela A.15 – Registo do número de unidades de equipamento necessárias aos processos e

respetivos custos .................................................................................................................. 127

Tabela A.16 – Folha de especificação do extrator sólido – líquido .......................................... 128

Tabela A.17 – Folha de especificação da ultrafiltração ........................................................... 129

Tabela A.18 – Folha de especificação do cristalizador ........................................................... 130

Tabela A.19 – Folha de especificação do secador ................................................................. 131

Tabela A.20 – Folha de especificação do silo de armazenamento .......................................... 131

Tabela A.21 – Custos diretos e indiretos do processo de extração de purificação de PHA ....... 132

Tabela A.22 – Custos anuais de operação no processo de extração de purificação de PHA .... 133

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

xxi


VARIÁVEIS E CONSTANTES

A/M – Taxa de alimentação pelos microrganismos sendo que A é igual ao produto do caudal de

alimentação pela CBO5 e os microrganismos são os SSV, nas seguintes unidades g g-1d-1

APHB – Área obtida no cromatograma da cromatografia gasosa de PHB

API – Área obtida no cromatograma da cromatografia gasosa do padrão interno

– Biodegradabilidade

CBO5 – Carência Bioquímica de Oxigénio ao fim de 5 dias em mg L-1

CN – Azoto Total em mg L-1

CP – Fósforo Total em mg L-1

CPI – Concentração do padrão interno em g L-1

CN-NH4+ - Azoto amoniacal mg L-1

CQO – Carência Química de Oxigénio (CQO) em mg L-1

EC – Condutividade em mS cm-1

h – Profundidade em m

L – Comprimento em pixéis

W – Largura em pixéis

mPHB – Massa de PHB em mg

mPHV – Massa de PHV em mg

OD – Oxigénio Dissolvido em mg L-1

OLR – Organic Loading Rate, Carga orgânica aplicada em mg L-1

ORP – Oxidation Reduction Potencial, Potencial Redox em mV

P – Pluviosidade em mm


xxii

P1 – Peso do cadinho em g

P2 – Peso do cadinho com resíduo seco da amostra após secagem na estufa em g

P3 – Peso do cadinho com cinza após calcinação em g

P4 – Peso do conjunto (cadinho + filtro) em g

P5 – Peso do conjunto (cadinho + filtro) com resíduo seco da amostra após secagem na estufa em g

P6 – Peso do conjunto (cadinho + filtro) peso do cadinho com cinza após calcinação em g

CP – Fósforo Total em mg L-1

PHA l – Fração da concentração de PHA na biomassa liofilizada mg mg-1

PHA S – Produto da concentração de PHA l pela concentração de biomassa (SVT) mg L-1

PHA Observado – Concentração de PHA l em mg L-1 obtida pelo método cromatográfico

PHA Previsto – Concentração de PHA em mg L-1 obtida pelo método de análise de imagem

QETAR – Caudal da ETAR em m3d-1

Q Matadouro – Caudal da ETAR em m3d-1

Q Tinturaria – Caudal da ETAR em m3d-1

ST – Concentração de sólidos totais em g L-1

SST – Concentração de sólidos suspensos totais em g L-1

SSV – Concentração de sólidos suspensos voláteis em mg L-1

SVT – Concentração de sólidos voláteis totais em g L-1

T – Temperatura em °C

t – Tempo

TDS – Concentração total de sólidos dissolvidos

TRH – Tempo de retenção hidráulica

V – Volume de amostra em mL

V1 – Volume de amostra filtrada em mL


xxiii

SIGLAS

AdP – Águas de Portugal

AFR – Anaerobic fermentation reactor, reator com fermentação anaeróbica

APA – Agência Portuguesa do Ambiente

AGV – Ácidos gordos voláteis

CSTR – Continuous stirred-tank reactor model, reator tanque agitado contínuo

d – dia

DCM – Diclorometano

EBPR – Enhanced biological phosphorus removal (system), sistema biológico de remoção de

fósforo

E.E – Estação elevatória

ETAR – Estação de Tratamento de Águas Residuais

CG – Cromatografia gasosa

FID – Flame Ionization Detector, detetor de ionização de chama

h – hora

HCl – Ácido Clorídrico

IBL – Índice biótico de lamas

Ind. – Indivíduos

jun – junho

jul – julho

O2 – Oxigénio

N2 – Azoto Gasoso

NH3 – Amoníaco

NO2- – Nitrito

NO3- – Nitrato


xxiv

N-NH4+ – Azoto amoniacal

NSB – Negro de Sudão B

m – metros

min – minutos

mm – milímetros

MMQP – Método dos mínimos quadrados parciais

P – Fósforo

PA – Poliamida

PBAT – Adipato – tereftalato de polibutileno

PBS – Polibutileno succinato

PCL – Policaprolactona

PE – Polietileno

Peq. – Pequenos

PET – Politereftalato de etileno

PFR – Plug flow reactor, reator de fluxo pistão

PGA – Poliglicolatos

PHAs – Polihidroxialcanoatos

PHB – Poli-β-hidroxibutirato

PHV – Poli-β-hidroxivalerato

PI – Padrão Interno

PLA – Polilactato

PLS – Partial least squares, método dos mínimos quadrados parciais

Poli (HASCL) – PHAs de cadeia curta

Poli (HAMCL) – PHAs de cadeia média


xxv

Poli (3HB) – Poli (3 – hidroxibutirato)

Poli (3HV) – Poli (3 – hidroxivalerato)

Poli (3HB-co-3HV) – Poli ( 3 – hidroxibutirato – co – 3 – hidroxivalerato)

PP – Polipropileno

PTT – Politrimetileno tereftalato

PVA – álcool polivinílico

R2 – Coeficiente de determinação

RGB – Red, green and blue, modelo de cores composto por canais vermelho, verde e azul

RMSEP – Root Mean Square Error of Prediction, erro quadrático médio de previsão

s - segundo

SBR – Sequencing batch reactor, reator descontínuo sequencial

SRT – Solids retention time, tempo de retenção de sólidos

t – tonelada

UE – União Europeia

UV – Ultra Violeta

VLE – Valor Limite de Emissão

µL – microlitros

EXPRESSÕES DO LATIM

e.g. – exempli gratia (por exemplo)

et al – et alii (e outros)

1. INTRODUÇÃO


2

1.1. ENQUADRAMENTO E MOTIVAÇÃO

O estudo da viabilidade de produção de polihidroxialcanoatos (PHAs) por culturas

microbianas mistas, as quais atuam no tratamento de efluentes urbanos, surge no enquadramento

da política das Águas do Norte, S.A. do grupo AdP – Águas de Portugal. Esta nova perspetiva de

produção de PHAs tem o intuito de promover o desenvolvimento de soluções tecnológicas que

contribuam para a otimização e melhoria contínua dos processos operacionais e de gestão

ambiental, já que este tema tem um carácter inovador e sustentável.

1.1.1. EMPRESA RESPONSÁVEL PELO PROJETO

As Águas do Norte do grupo Águas de Portugal é a entidade gestora do sistema

multimunicipal que compreende 80 Municípios, Figura 1.1, correspondendo, aproximadamente,

a 22 % do território nacional. Abrange uma área de 19 687 km2, servindo 3.7 milhões de

habitantes. O sistema está dimensionado para fornecer mais de 170 × 106 m3 ano-1 de água

potável a uma população coberta de 2.9 × 106 habitantes. Por outro lado, encontra-se

dimensionado para recolher e tratar mais de 110 × 106 m3 ano-1 de água residual a uma população

coberta de 2.5 × 106 habitantes-equivalentes (Águas do Norte, 2015).

Figura 1.1 – Mapa dos concelhos abrangidos pelas Águas do Norte, como entidade gestora de água e saneamento. Pode-se

observar que compreende grande parte do norte de Portugal, em exceção a 5 concelhos que se encontram na imagem a branco.

As Águas do Norte, S.A., têm como missão a conceção, construção e exploração das

.

1. INTRODUÇÃO

3

infraestruturas de abastecimento de água e de saneamento do sistema multimunicipal do sistema

de águas da região do norte. A sua missão assenta num quadro de sustentabilidade económica,

social e ambiental, contribuindo para a melhoria da qualidade de vida dos cidadãos e para o

desenvolvimento socioeconómico da região (Águas do Noroeste, S.A; Águas do Norte, 2015).

O conceito de desenvolvimento sustentável baseia-se na observação conjunta da economia,

ambiente e bem-estar: "o desenvolvimento que satisfaz as necessidades da geração presente sem

comprometer a capacidade das gerações futuras de satisfazerem as suas próprias necessidades".

Um aspeto importante do desenvolvimento sustentável é, portanto, a equidade na distribuição de

oportunidades de desenvolvimento nas gerações presentes e nas gerações futuras (Vander, 2003).

1.1.2. A IMPORTÂNCIA DOS PLÁSTICOS / SUSTENTABILIDADE DA SOCIEDADE

O plástico convencional produzido a partir dos derivados do petróleo (fonte não-renovável),

tem a incapacidade de desaparecer rapidamente da terra levantando algumas questões

ambientais de sustentabilidade. Estima-se que são necessários cerca de 450 anos para ocorrer a

sua degradação, originando grandes problemas de contaminação ambiental com carácter

persistente. O plástico representa entre 14 % e 22 % no volume de resíduos sólidos.

No entanto, a reciclagem do plástico pode degradar algumas propriedades, além de serem

difíceis de separar dos outros materiais (Lenntech Water- & Air treatment Holding B.V.). O aumento

da sensibilidade da população relativamente à sustentabilidade ambiental e à proteção da vida

selvagem tem estimulado a pesquisa de estratégias e práticas alternativas com vista a redução da

produção de plásticos convencionais.

Deste modo, surgem diferentes soluções, tais como a redução, a reutilização ou a

reciclagem do plástico, ou a substituição dos plásticos baseados no petróleo por plásticos

produzidos através de recursos renováveis (Accinelli et al., 2012).

Assim, de modo a promover a sustentabilidade da sociedade, é necessário desenvolver

novos métodos de produção de polímeros biodegradáveis, para que os plásticos com origem em

recursos não renováveis possam ser substituídos por plásticos provenientes de recursos

renováveis. Isto torna-se vantajoso visto que ambos apresentam propriedades idênticas, com o

benefício adicional da redução de consumo de recursos fósseis.


4

Os sacos plásticos, por exemplo, desde a sua introdução no final de 1970, tornaram-se um

elemento comum na sociedade. Estima-se que a média de consumo anual de sacos de plástico

na UE seja de 100 × 1012 unidades. As medidas para reduzir o seu uso têm sido consideradas

por um número crescente de governos (Accinelli et al., 2012).

Em fevereiro de 2014, o Estado Português apresentou a proposta do Compromisso para o

“Crescimento Verde” que congrega os esforços de quase uma centena de associações e

representantes da área empresarial, científica, financeira, assim como dos organismos públicos,

fundações e ONG. Os objetivos do crescimento verde são totalmente consistentes com os grandes

desafios colocados à sociedade portuguesa e podem contribuir decisivamente para a obtenção do

crescimento, de emprego, de redução da dependência do exterior, de fiscalidade mais inteligente

(tributando mais o que se degrada e polui, e menos o que se produz e aufere) e de qualidade de

vida. Neste momento, a economia verde representa, globalmente, 4 × 1012 €, crescendo 4 % ano- 1.

Na UE, os sectores verdes já representavam, em 2010, 2.5 % do Produto Interno Bruto (PIB) global

da UE e estima-se um crescimento anual de cerca de 30 % até 2025, constituindo desta forma os

sectores mais dinâmicos da região (Governo de Portugal, 2014). Em Portugal, a importância

económica dos plásticos é muito relevante, visto que as exportações de mercadorias portuguesas

de produtos químicos no primeiro semestre de 2014 atingiram o valor de 3 139 × 106 €, dos

quais 1 238 × 106 € são relativos ao plástico e a produtos à base do plástico (Ministério da

Economia, 2014).

Na Figura 1.2 encontra-se representada a divisão dos diferentes tipos de plásticos, de

acordo com o seu carácter biodegradável (European Bioplastics, 2014). A biodegradação ocorre

quando um produto é convertido em água, dióxido de carbono e biomassa com auxílio de

microrganismos.

Os produtos de base biológica resultam da biomassa ou de monómeros da biomassa, ou

seja, a base biológica refere-se ao teor de carbono de base biológica ou ao teor em massa de base

biológica, apresentado em unidades percentuais. Plásticos biodegradáveis de base biológica são

habitualmente produzidos através de plantas. No entanto, o bioplástico proveniente das plantas

tem a desvantagem da utilização de recursos de produção alimentar, diminuindo as áreas de

cultivo para este fim.

1. INTRODUÇÃO

5

O bioplástico é considerado como a melhor solução para o ambiente em relação ao plástico

à base de petróleo. Atualmente estima-se que a produção de bioplásticos seja cerca de 1 % da

produção de plástico (Johnston, 2014). Inicialmente, os bioplásticos eram vistos com alguma

apreensão, devido a incertezas quanto à sua produção a partir de milho transgénico, e por causa

da suspeita da presença de produtos químicos, tais como herbicidas. Recentemente, existe uma

maior aceitação da produção destes bioprodutos (Johnston, 2014).

Os plásticos de base biológica incluem plásticos à base de amido, proteínas com base

plástica, plásticos e mistura de celulose. Podem também ser misturados com plásticos

convencionais, tais como o polietileno (PE), o polipropileno (PP), e o álcool polivinílico (PVA). No

entanto, esses plásticos de base biológica são apenas parcialmente biodegradáveis. Para produzir

plásticos somente de base biológica que se assemelhem aos plásticos convencionais, são

“empregadas” bactérias.

Os polímeros plásticos de fontes renováveis, são os plásticos que incluem amido, celulose,

ácidos gordos, ou qualquer substrato que as bactérias utilizem para seu crescimento (Chen,

2010). Pela Figura 1.2 verifica-se que os polihidroxialcanoatos (PHAs) são produzidos a partir de

uma fonte biológica e são biodegradáveis, ao contrário do plástico convencional, como

polipropileno (PP), proveniente de fonte fóssil, que é não biodegradável (European Bioplastics,

2014).

No mercado, existem diversos plásticos biodegradáveis, tais como: PHAs, polilactato

(PLA), polibutileno succinato (PBS) e os poliglicolatos (PGA). O presente trabalho centrar-se-á

apenas nos PHAs. Os PHAs são termoplásticos que podem ser moldados a temperaturas elevadas,

com propriedades físico-químicas idênticas ao PP, o que os torna possíveis candidatos para a sua

substituição (European Bioplastics, 2014).

O PP é uma estrutura linear com base no monómero CnH2n, fabricado a partir de propileno

gasoso, na presença de cloreto de titânio como catalisador. É um produto termoplástico semi-

cristalino, de baixo custo, fácil de processar (é um subproduto proveniente do processo de

refinação de petróleo) e de elevada versatilidade. Este polímero apresenta propriedades variadas,

como o toque suave ou a elevada rigidez. A polimerização é alcançada a uma temperatura e a

uma pressão relativamente baixas, sendo o produto produzido translúcido, mas que pode ser


6

facilmente colorido (Poliversal, 2014). As propriedades dos plásticos podem ser alteradas por

diferenças nas condições de produção, como o tipo de catalisador utilizado.

Figura 1.2 – Classificação quanto à biodegradabilidade em sistema de coordenadas quanto à fonte e origem dos materiais,

sendo apresentado alguns exemplos de plásticos de cada tipo (European Bioplastics, 2014).

O PP é utilizado em diversas aplicações, como mobiliário de jardim, peças para a indústria

automóvel, filme com transparência, cápsulas, entre outros (Hingle, 2014). Existem três tipos de

PP, em que cada um combina determinadas especificações e custos. Entre eles, encontram-se os

homopolímeros (que pode ser usado em diferentes aplicações), os copolímeros em bloco

(incorporam (5-15) % de etileno) têm muito melhor resistência ao impacto que se estende a

temperaturas inferiores a -20 °C e os copolímeros aleatórios (contém (1-7) % de etileno) têm ponto

de fusão mais baixo, maior flexibilidade e clareza (Hingle, 2014).

Atualmente, as estratégias de produção dos PHAs englobam processos de fermentação, em

culturas puras de Ralstonia eutropha ou de Escherichia coli recombinante que utilizam a glucose

e o ácido propiónico como substrato, o que aumenta os custos de produção, diminuindo assim a

competitividade destes biopolímeros (Marang et al., 2014). Deste modo, o maior obstáculo à

substituição do PP por PHAs é principalmente de natureza económica. O preço dos PHAs é cerca

de nove vezes, superior ao do polipropileno (9 € kg-1 para o PHB face a 1 € kg-1 para o polipropileno)

(Serafim et al., 2003; Capela, 2009).

1. INTRODUÇÃO

7

1.2. OBJETIVOS DO PROJETO

O presente trabalho tem como objetivo o estudo da produção e acumulação de PHAs, em

culturas microbianas mistas utilizadas no tratamento de efluentes urbanos.

O trabalho desenvolveu-se na Estação de Tratamento de Águas Residuais (ETAR) de

Penices. Pretende-se com este estudo contribuir para uma mudança de paradigma no tratamento

biológico de águas residuais urbanas. Deste modo, o efluente deixa de ser um resíduo e passa,

parcialmente, a ser matéria-prima a custo zero, para a produção de materiais de valor

acrescentado, como os bioplásticos do tipo PHAs. A ETAR de Penices pode reunir as condições

adequadas para a acumulação de PHA, pois receciona efluente de um matadouro rico em

nutrientes juntamente com o efluente doméstico, bem como de outras indústrias como, e.g. a

têxtil.

Assim, o carbono será incluído nos bioplásticos, ao invés de ser libertado para a atmosfera

ou descartado juntamente com as lamas desidratadas que, por sua vez, constituem um custo

elevado para a empresa devido ao encaminhamento para o fim adequado. Desta forma, esta

medida visa proporcionar uma nova abordagem relativa ao conceito de gestão de resíduos, sendo

capaz de converter o desperdício num subproduto, ao mesmo tempo mais atrativo tanto a nível

ambiental, como a nível económico.

Além do objetivo já identificado, pretendeu-se também comparar dois métodos de análise

quantitativa de PHAs: o método por cromatografia gasosa e o método de análise de imagem com

coloração de Negro Sudão B.

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS


10

2.1. CARACTERÍSTICAS DA ÁGUA RESIDUAL E VALORES LIMITES DE

DESCARGA

A água é a base da vida, sendo imprescindível na atividade diária do Homem, não apenas

em ambiente doméstico, mas também no domínio industrial, onde, por vezes, constitui a

substância mais importante dos processos. Contudo, a água poluída que deixa as habitações ou

as instalações industriais, torna-se um agente potencial de degradação dos cursos de água, de

aquíferos e de comunidades aquáticas. A incapacidade dos ecossistemas de repor a situação

existente antes da ação do Homem, com consequente acumulação de poluentes, obrigou ao

desenvolvimento de processos que, por vezes, correspondem a uma imitação “intensificada” do

que faz a Natureza (Cavaleiro et al., 2009).

No âmbito do tratamento das águas residuais, a abordagem de uma gestão integrada com

vista à sua valorização deve ser tida como prioritária. Pretende-se que os sistemas de tratamento

de água residual cumpram inteiramente a sua função removendo diversos poluentes, dos quais

se destacam a, matéria orgânica e outros compostos potencialmente tóxicos (Calheiros et al.,

2014; Wagner et al., 2002). Em muitos países a legislação ambiental tem adotado limites rigorosos

nas concentrações de azoto (N) e de fósforo (P) na água residual tratada, de modo a evitar a

eutrofização dos meios hídricos (Jördening et al., 2005).

A função do tratamento de águas residuais através de processos físico-químicos e/ou

biológicos é proteger o meio recetor da degradação ambiental, garantindo que o impacto do

efluente seja minimizado.

A proteção do meio recetor é alcançada através de normas, sendo estas definidas pela

autoridade reguladora competente, Agência Portuguesa do Ambiente (APA), a qual define a

qualidade mínima que o efluente deve atingir (Mara et al., 2003). O tratamento das águas residuais

representa uma mais-valia na qualidade de vida das populações, permitindo a diminuição no

impacte da descarga do efluente tratado no meio recetor.

Na Tabela 2.1, estão indicadas as características das águas residuais urbanas afluentes à

ETAR de Penices e os valores de emissão aquando da descarga no meio hídrico.


11

Tabela 2.1 – Valores das características do afluente bruto da ETAR de Penices e os valores limites de emissão (VLE) definidos na

licença de descarga emitida pela APA

Parâmetro Características do Afluente Bruto da ETAR

(A. R.H. Norte, 2014)

VLE no meio hídrico

(A. R.H. Norte, 2014)

CBO5 / (mg L-1) 350 25

CBO5 (estiagem) / (mg L-1) _ 15

CQO / (mg L-1) 800 125

CQO (estiagem) / (mg L-1) _ 100

N / (mg L-1) 70 _

P / (mg L-1) 12 _

SST / (mg L-1) _ 35

SST (estiagem) / (mg L-1) _ 30

A ETAR faz a monitorização dos seguintes parâmetros: Carência Bioquímica de Oxigénio ao

fim de 5 dias (CBO5); Carência Química de Oxigénio (CQO); Azoto total (N); Fósforo total (P); e

Sólidos Suspensos Totais (SST). O Decreto-Lei nº 152/97, de 19 de junho, define a época de

estiagem de 1 de junho a 30 de setembro. No entanto, sempre que as condições meteorológicas

o exigirem, poderá a mesma ser alterada após a comunicação à entidade licenciadora.

Nos últimos dois anos, as características do afluente bruto à ETAR foram muito alteradas

devido à entrada de efluente proveniente de um matadouro, o qual se caracteriza por possuir carga

orgânica elevada e ser rico em nutrientes. A ligação do efluente desta empresa, elevou a carga

orgânica da água residual afluente à ETAR, afetando, assim, os custos associados ao tratamento,

nomeadamente o consumo de energia requerida no processo de arejamento e desidratação de

lamas.


12

2.2. FUNCIONAMENTO DA ETAR DE PENICES

A ETAR de Penices situa-se na margem esquerda do rio Este, na freguesia de Gondifelos,

pertencente ao concelho de Vila Nova de Famalicão. A ETAR foi projetada para tratar 6 214 m3d-1

de águas residuais atendendo uma população equivalente a 32 400 habitantes. A água residual

chega à ETAR de Penices por uma rede de intercetores gravíticos, com uma extensão de 26.7 km

e diâmetros entre os (200 – 500) mm, servindo 10 freguesias de Vila Nova de Famalicão e

2 freguesias da Póvoa de Varzim. Na ETAR, a água residual é submetida a um conjunto de

processos físico-químicos e biológicos. De seguida, serão descritos cada uma das etapas

associadas ao seu tratamento Figura 2.1, e o tratamento de lamas associado, Figura 2.2.

Figura 2.1 – Esquema das várias etapas de tratamento existentes na ETAR de Penices.

Figura 2.2 – Esquema das várias etapas do tratamento de lamas instalado na ETAR de Penices.

I Etapa: Tratamento Preliminar

A primeira etapa consiste no tratamento preliminar, onde é rececionado o caudal afluente

pela estação elevatória.

Neste órgão, os sólidos são triturados e

retidos por uma gradagem. De seguida

passam para um tanque de bombagem, o

qual tem ainda como função a equalização da

água residual. Após a elevação do caudal do

tanque de bombagem, Figura 2.3, ocorre a

segunda etapa de tratamento, ou seja, o “pré-

tratamento”. Figura 2.3 – Estação elevatória da ETAR de Penices.


13

II Etapa: Pré-tratamento

Na fase do pré-tratamento, a água residual é tamisada, promovendo a remoção de sólidos

de menor dimensão, Figura 2.4, e distribuída para dois órgãos retangulares em paralelo, Figura

2.5. Nestes órgãos, ocorre simultaneamente o desengorduramento, por flutuação com a

insuflação de ar, e o desarenamento, por decantação das areias.

As gorduras são removidas para um

concentrador de gorduras, Figura 2.6 (b), e

as areias, por sua vez, são extraídas para um

classificador de areias Figura 2.6 (a). As

escorrências referentes à extração de areias

e gorduras voltam a montante da linha

aquosa.

Por outro lado, os resíduos sólidos

provenientes da primeira e segunda etapa

são encaminhados para aterro sanitário.

Decorrido o pré-tratamento da água residual

onde foram removidos os sólidos, areias e

gorduras, esta é encaminhada

gravidicamente para o tratamento

secundário (biológico).

Figura 2.4 – Gradagem automática (tamisador) e manual da

ETAR de Penices.

Figura 2.5 – Tanques do pré-tratamento, com os processos

em simultâneo desengorduramento e desarenamento.

Figura 2.6 – Classificador de areias e o concentrador de gorduras da ETAR de Penices.


14

III Etapa: Tratamento Biológico

O tratamento biológico inicia-se com a entrada da água residual, por ação gravítica num

canal anóxico perfeitamente agitado, ocorrendo, assim, a desnitrificação Figura 2.7.

De seguida a água residual flui para o

canal de arejamento, com o qual possui

ligação hidráulica. Neste canal aeróbio, o

tratamento biológico consiste num sistema

de lamas ativadas em arejamento

prolongado, em canal de oxidação,

procedendo à nitrificação/desnitrificação.

Na Figura 2.8 está representado um reator

típico presente na ETAR com o perfil de

canal de arejamento.

Figura 2.7 – Canais de arejamento (reator anóxico e

aeróbio).

Figura 2.8 – Representação esquemática do reator típico de nitrificação/desnitrificação, com arejadores de eixo horizontal (rotores)

(imagem retirada (Jördening et al., 2005).

A presença de microrganismos nestes órgãos permite a degradação da matéria orgânica

presente na água residual, resultando na formação de produtos oxidados, tais como o dióxido de

carbono, os nitratos, os sulfatos e os fosfatos, bem como na biossíntese de nova biomassa

microbiana (Mara et al., 2003).

Após a passagem pelos dois canais de

arejamento, a água residual aflui, por ação

gravítica para dois decantadores secundários

circulares mecanizados, Figura 2.9. Nestes

órgãos dá- se a separação da biomassa da

fase líquida. O sobrenadante é encaminhado

para o meio recetor, o rio Este, como se pode

observar na Figura 2.10. Figura 2.9 – Decantadores secundários da ETAR.


15

Uma parte da água residual tratada é

posteriormente armazenada e submetida a

um tratamento terciário (filtração através de

filtro pressurizados autolimpantes e uma

desinfeção por UV) para permitir a sua

utilização como águas de serviço, Figura

2.11.

A biomassa removida através da

decantação é reciclada para o reator

biológico, reduzindo a carga de sólidos à

saída. O desempenho do tratamento biológico

depende do tempo médio de permanência

nas células (Idade das lamas) do sistema. As

lamas excedentes são encaminhadas para

um processo de desidratação, dando lugar à

quarta etapa de tratamento, a qual é relativa

ao tratamento da linha sólida.

Figura 2.10 – Fotografia relativa aos descarregadores onde

o efluente tratado tem como destino final a descarga no

meio hídrico, o Rio Este.

Figura 2.11 – Sistema de filtração e desinfeção da água

residual através UV para reaproveitamento.

IV Etapa: Tratamento da Fase Sólida

O tratamento da fase sólida é constituído por espessamento e desidratação mecânica.

O espessamento de lamas é efetuado por um

espessador de tambor rotativo, Figura 2.12,

o qual tem como função o espessamento das

lamas, com auxílio de um polielectrólito para

obter uma concentração de 3 % a 5 % de

matéria seca. As lamas espessadas são

bombeadas para o sistema de desidratação,

enquanto o sobrenadante é enviado para a

linha das escorrências.

Figura 2.12 – Tambor rotativo de espessamento Andritz

instalado na ETAR de Penices.


16

A desidratação é efetuada através de

uma centrífuga, Figura 2.13, com a adição

de polielectrólito para melhorar a eficiência

do processo.

Após a desidratação, as lamas são

encaminhadas para o silo de

armazenamento, Figura 2.14, até serem

transportadas para o destino final,

e.g. compostagem.

O filtrado é encaminhado para as

escorrências, que entram no pré-tratamento

(Águas do Ave, 2006). Na Figura 2.15,

encontra-se uma vista aérea da instalação, e

na Figura 2.16, apresenta-se o esquema

representativo da ETAR de Penices.

Figura 2.13 – Centrífuga Andritz instalada na ETAR de

Penices.

Figura 2.14 – Silo de armazenagem de lamas.

Figura 2.15 – Fotografia aérea da ETAR de Penices


17

Figura 2.16 – Representação esquemática do funcionamento da ETAR de Penices, onde estão representadas as linhas principais de tratamento. As linhas a azul são referentes ao tratamento líquido e as linhas representadas a castanho correspondem ao tratamento sólido (lamas).


19

2.3. SISTEMA DE TRATAMENTO DO EFLUENTE URBANO COM LAMAS ATIVADAS

Os sistemas de lamas ativadas tornaram-se parte integrante no tratamento de vários tipos

de efluentes. Este tipo de tratamento baseia-se no crescimento suspenso de microrganismos, num

reator, onde o oxigénio é continuamente fornecido para permitir a oxidação carbonácea. A

comunidade microbiana de lamas ativadas inclui bactérias, protozoários, fungos, algas e

organismos filamentosos. O processo de lamas ativadas opera com uma lama floculada de

microrganismos para remover matéria orgânica da água residual e reduzir o conteúdo de

nutrientes (N e P), antes da descarga do efluente da estação de tratamento no meio hídrico

(Mara et al., 2003). A principal origem de fósforo em águas residuais domésticas são os

excrementos humanos (50 – 65) % e detergentes sintéticos (30 – 50) %. As concentrações típicas

de P encontram-se na gama de (10 – 30) mg L-1 (Mara et al., 2003). Segundo Bitton, (1999) e

Metcalf et al., (2003), a quantidade típica de azoto no esgoto doméstico é de (20 – 85) mg L-1 e

pode ser encontrado especialmente nas formas de NH4+ e de NH3.

É de notar que em sistemas contínuos, como é o caso de uma ETAR, o processo é mais

eficiente do que quando operado em estado estacionário, sendo importante compreender as

variações do processo que afetam o desempenho do sistema. Os fatores responsáveis pelas

variações na comunidade biológica podem ser: (1) ambientais, causando variações nas

características e no caudal do afluente, (2) parâmetros operacionais, tal como o tempo de

residência das lamas, (3) taxa de fornecimento de nutrientes aos microrganismos, entre outros

(Metcalf et al., 2003).

A matéria orgânica solúvel presente na água residual pode dividir-se em hidratos de

carbono, gorduras e proteínas. A maioria dos microrganismos consegue oxidar diretamente o

carbono orgânico a dióxido de carbono, utilizando o oxigénio, nitritos ou nitratos. Parte do carbono

orgânico, é assimilado pela biomassa, que se multiplica no reator. Enquanto o carbono orgânico

particulado e coloidal, é hidrolisado pelos microrganismos e usado no próprio metabolismo, o

carbono biologicamente não-degradável é incorporado nos flocos de lamas ativadas

(Cavaleiro et al., 2009).

A remoção do azoto é realizada através dos processos de assimilação, nitrificação e

desnitrificação. Os microrganismos presentes no sistema de tratamento necessitam de azoto para


20

a síntese celular, pelo que esta assimilação resulta em remoção de azoto do meio. A nitrificação

biológica baseia-se na transformação do azoto amoniacal (orgânico) em nitrito e

consequentemente em nitrato, processo através do qual os compostos azotados (orgânicos e

inorgânicos) reduzidos são convertidos em formas mais oxidadas. Este processo requer oxigénio

que atua como aceitador de eletrões (Mara et al., 2003).

O processo de nitrificação ocorre em duas etapas: na primeira etapa, as bactérias do género

Nitrosomonas convertem a azoto amoniacal (NH4+) em nitrito (NO2

-), e na segunda etapa, as

bactérias do género Nitrobacter, convertem o NO2- em nitrato (NO3

-). A desnitrificação baseia-se na

utilização do nitrito ou nitrato como recetores finais de eletrões, em condições anóxicas, para

oxidação do carbono orgânico e para a conversão do nitrato em azoto gasoso (N2)

(Cavaleiro et al., 2009). Algumas bactérias, como a Pseudomonas e a Clostridium utilizam

compostos como o nitrito e o nitrato em alternativa ao oxigénio. Estas bactérias consomem

compostos de carbono e quebram as ligações N-O para usarem o oxigénio (na ausência do O2)

(Mara et al., 2003; Cavaleiro et al., 2009). Para efluentes com excesso de material orgânico e

azoto, um dos requisitos para a desnitrificação é a utilização de um sistema aeróbio-anóxico. A

concentração de oxigénio dissolvido no reator é controlada para valores baixos tipicamente

(0.5 – 2.0) mg L-1, para permitir a nitrificação, desnitrificação e degradação orgânica aeróbia

(Mara et al., 2003).

A remoção do fósforo através de um sistema de lamas ativadas consiste na sua captação e

remoção. As lamas passam por uma fase anaeróbia, onde a quantidade de fósforo aumenta no

meio líquido, e por uma fase aeróbia, onde ocorre absorção de fosfato da fase líquida para o

interior das células. A capacidade de libertar ou de alojar o fósforo na biomassa é realizada através

da manipulação da concentração de oxigénio. Em condições anaeróbias, os microrganismos

armazenam ácidos gordos voláteis, sintetizando compostos como por exemplo o

poli- β- hidroxibutirato (PHB). Em condições aeróbias, o PHB é metabolizado pelos

microrganismos para finalidades catabólicas e anabólicas, usando nitrato e oxigénio como

oxidantes. Nesse processo, ocorre absorção de fosfato da fase líquida para o interior dos

microrganismos (Bitton, 1999).


21

2.4. MICROBIOLOGIA DO PROCESSO

O consórcio microbiano instala-se, espontaneamente, no reator de tratamento de águas

residuais e adapta-se em resposta às condições operacionais impostas, bem como em função das

características do efluente. Neste tipo de reatores, não é feita a esterilização do meio, nem do ar

utilizado no arejamento. A biomassa encontra-se em suspensão no líquido, sob a forma de células

isoladas, e pequenos agregados aglomerados mais complexos, como os flocos e os grânulos. Este

consórcio bacteriano tem como função a conversão da matéria orgânica dissolvida e coloidal em

vários gases, compostos inorgânicos e tecido celular (Fonseca et al., 2007).

As culturas mistas instaladas em ETAR que utilizam as lamas ativadas incluem bactérias

(geralmente Gram-), leveduras, fungos, microalgas, protistas celulares e organismos

multicelulares. Apesar dos microrganismos responsáveis pela degradação da contaminação

orgânica de uma água residual serem essencialmente as bactérias, como e.g., os géneros

Zoogloea, Pseudomonas, Acinetobacter e os Alcaligenes, as atividades metabólicas de outros

microrganismos como os protozoários também são relevantes.

Os protozoários são predadores de bactérias, encontrando-se presentes sob forma dispersa,

e os rotíferos consomem pequenos flocos de fraca sedimentabilidade, pelo que estes têm um

papel ativo na afinação do efluente tratado. Assim, a quantificação da concentração de diferentes

espécies de protozoários pode ser empregue como indicador de qualidade da cultura instalada no

reator. A biodiversidade do consórcio microbiano é um fator importante na resposta adaptativa,

quer por competição, quer devido a variações que possam ocorrer no reator, como a composição

dos substratos de alimentação, ou pelos parâmetros operatórios, como a taxa de diluição e a

temperatura (Fonseca et al., 2007).

A maior parte dos ciliados presentes nas lamas ativadas alimentam-se de bactérias

dispersas (bacterívoros), embora haja outros que se alimentam de ciliados e flagelados. Os ciliados

podem ser subdivididos em três grupos funcionais com base no comportamento:

Nadadores (free – swimin), os quais nadam na fração líquida e permanecem uniformemente

dispersos em suspensão no tanque de sedimentação;

Móveis de fundo (Crawling), embora sejam formas livres, habitam a superfície dos flocos;


22

Sésseis (attached), encontram-se fixos ao substrato por meio de uma haste. Estes são

estritamente associados aos flocos, e precipitam durante a sedimentação.

Na Figura 2.17 apresentam-se exemplos mais comuns de protozoários em lamas ativadas:

nadadores, móveis de fundo e sésseis (Nicolau et al., 2002; Mara et al., 2003).

Figura 2.17 – Alguns ciliados comuns e amibas com teca de estações de tratamento de efluente e o seu hábito alimentar. Imagem

retirada de (Mara et al., 2003) em que 1–8 Ciliados carnívoros ou onívoros: (1) Acineta spp.; (2) Podophrya spp.; (3) Tokophrya

spp.; (4) Plagiocampa rouxi; (5) Coleps hirtus; (6) Spathidium spp.; (7) Litonotus spp.; (8) Amphileptus spp. 9–18 Nadadores

bacterívoros (9) Glaucoma spp.; (10) Tetrahymena spp.; (11) Colpidum spp.; (12) Paramecium spp.; (13) Cinetochilum

margaritaceum; (14) Dexiotricha spp.; (15) Uronema spp.; (16) Cyclidium spp.; (17) Pseudocohnilembus pusillum; (18)

Spirostomum teres. 19–26 Móveis de fundo bacterívoros: (19) Chilodonella spp.; (20) Trithigmostoma spp.; (21) Acineria uncinata;

(22) Trochilia minuta; (23) Drepanomonas revolute; (24) Aspidisca spp.; (25) Euplotes spp.; (26) Stylonychia spp. 27–34 Sésseis

bacterivoros: (27) Stentor spp.; (28) Vorticella convallaria; (29) V. microstoma; (30) Carchesium spp.; (31) Zoothamnium spp.; (32)

Epistylis spp.; (33) Opercularia spp.; (34) Vaginicola spp. 35–36 Amibas com Teca: (35) Arcella spp.; (36) Euglypha spp.


23

2.5. PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS) POR CULTURAS

MISTAS

A produção de PHAs por culturas mistas baseia-se no enriquecimento das culturas em

organismos acumuladores de PHAs em condições de “Fome e Fartura”. Como exemplos de

microrganismos que sintetizam PHAs em condições transientes de oxigénio, destacam-se as

bactérias acumuladoras de fósforo, responsáveis pela remoção de concentrações elevadas de

fósforo nas águas residuais. Na estação de tratamento biológico de águas residuais contaminadas

com fósforo, a recirculação contínua de biomassa entre ambientes anaeróbios e aeróbios,

estimula, assim, a síntese de reservas intracelulares (Serafim et al., 2003).

A remoção biológica de fósforo é realizada através do funcionamento do sistema em

condições alternadas de “fartura” e “fome”. Esta estratégia foi desenvolvida para favorecer um

grupo específico de microrganismos que competem com outros organismos pelos substratos

orgânicos. A acumulação, a nível intracelular, de PHAs em vários microrganismos, pode ser muito

variável conforme o género de bactéria bem como o substrato adicionado. Ou seja, por exemplo,

no caso da Ralstroni 3, de acordo com o nutriente limitante, pode atingir os 96 % em peso seco

(Babel et al., 2001). Na fase anaeróbia, os microrganismos de uma cultura mista conseguem

armazenar o conteúdo em PHB nas células em cerca de 78.5 % em peso seco, idêntico ao obtido

por culturas puras, como a Ralstonia eutropha. Foi reportado na literatura que este microrganismo

quando cultivado sob condições limitadas de azoto em diferentes tempos de crescimento,

apresentou nas primeiras fases de acumulação de polímeros um número fixo de grânulos por

célula e a produção de polímero cessou quando atingido um teor de 80 %, em peso seco, de PHB

(Serafim et al., 2003; Babel et al., 2001). Quimicamente, os PHAs são constituídos na maior parte

por PHB e poli-β-hidroxivalerato (PHV) ou por copolímeros (poli-β hidroxibutirato-3-hidroxivalerato)

(Mesquita et al., 2013a; Mesquita et al., 2013b; Babel et al., 2001).

Os PHAs são polímeros armazenados por uma variedade de microrganismos, como reserva

intracelular de carbono e energia. Este tipo de polímero é produzido por mais de 75 tipos de

bactérias gram-positivas e gram-negativas. De um modo geral, as bactérias produtoras de PHAs

podem ser divididas em dois grupos, de acordo com as características de acumulação de PHAs.

O primeiro grupo de bactérias inicia a acumulação de PHAs quando o crescimento celular é


24

interrompido, pela limitação de algum nutriente essencial, como, e.g., N, P, magnésio (Mg),

potássio (K), oxigénio (O) ou enxofre (S), e na presença de excesso de carbono. Um exemplo de

uma bactéria deste grupo é a Ralstonia eutropha. O segundo grupo produz PHAs de forma

associada ao crescimento (e.g., as bactérias Alcaligenes latus, Azotobacter beijerinckii e

Escherichia coli recombinante) (Serafim et al., 2003; Formolo et al., 2003).

Os nutrientes em escassez no meio de crescimento que induzem a produção de polímeros

por vários microrganismos são apresentados na Tabela 2.2 (Babel et al., 2001).

Tabela 2.2 – Compostos limitantes que conduzem à formação de PHAs (Babel et al., 2001)

Componente limitante Organismo

Amónio

Alcaligenes latus

Pseudomonas oleovorans

Pseudomonas cepacia

Ralstonia eutrophus

Rhodobacter sphaeroides

Speudomonas sp. K.

Methylocystus oarvus

Thiosphaera pantotropha

Rhizobium ORS 571

Carbono

Spirillum sp.

Hyphomicrobium sp.

Azospirillum brasiliense

Ferro Pseudomonas sp. K.

Magnésio Pseudomonas sp. K.

Oxigénio

Azotobacter vinelandii

Azobacter beijerinckii

Rhizobium ORS571

Fósforo

Rhodospirillum rubrum

Rhodobacter sphaeroidis

Caulobacter crescentus


Sulfato de potássio

Bacillus thuringiensis

Pseudomonas sp. K.


Rhodospirillum rubrum

Rhodobacter sphaeroids


25

Os resíduos orgânicos contêm tipicamente uma mistura de compostos (ácidos gordos

voláteis, glicerol e lactato) potencialmente produtores de PHAs. No entanto, verificou-se que o

glicerol e o lactato são menos adequados à produção de PHAs, promovendo o enriquecimento de

bactérias ao invés do armazenamento de PHAs, reduzindo assim o teor global de PHAs na cultura

(Marang et al., 2014).

Os PHAs podem ser classificados em vários tipos, de acordo com a estrutura de repetição

de unidades poliméricas, como ilustrado na Figura 2.18 (Babel et al., 2001). Os PHAs produzidos

por bactérias podem ser homopolímeros, copolímeros, ou misturas de ambos. Os tipos de PHAs

presentes podem ser identificados por métodos de fracionamento com base nas diferentes

solubilidades em diversos solventes (Babel et al., 2001).

Figura 2.18 – A classificação de polihidroxialcanoatos (Babel et al., 2001).

Dependendo do substrato e do organismo de síntese, os PHAs são compostos por

monómeros de cadeia com diferentes comprimentos:

PHAs de cadeia curta (PHASCL), constituída por monómeros com 3-5 átomos de carbono;

PHAs de cadeia média (PHAMCL), constituída por monómeros com 6-14 átomos de carbono

(Silva, 2013).

Polih

idro

xialc

anoa

tos

(PH

As) PHAs de cadeia curta, poli (HASCL)

poli (3-hidroxibutirato): poli (3HB)

poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato): poli (3HB-co-3HV)

poli (3-hidroxivalerato): poli (3HV)

poli (HASCL) contendo outras unidades de 3HB e 3HV

Híbrido de poli (HAMCL) E poli (HASCL)

PHAs de cadeia média , poli (HAMCL)

PHAs contendo 3-hidroxi-n-alcanoatos de etilo, poli (nHAMCL)

PHAs contendo 3-hidroxialcanoatos substituídos


26

Os poli (3HB), poli (3HB-co-3HV) e poli (3HV) são exemplos de PHAs de cadeia curta

(poli (HASCL)s), como é ilustrado na Figura 2.19 (Babel et al., 2001).

A maior parte dos grânulos de polímero que ocorrem naturalmente contêm em reserva

apenas poli (3HB), que é um termoplástico com boas propriedades mecânicas semelhantes às do

polipropileno.

Figura 2.19 – Estruturas comuns do monómero de PHA. Os monómeros de cadeia curta: 3-hidroxibutirato (3HB), 3-hidroxivalerato

(3HV), monómeros de cadeia média: 3-hidroxi-hexanoato (3HHx), 3-hidroxioctanoato (3HO), 3-hidroxidecanoato (3 HD),

3- hidroxidodecanoato (3HDD).

Contudo, como plástico, o poli (3HB) é frágil devido ao elevado grau de cristalinidade e à

morfologia altamente esferulítica, onde a temperatura de fusão (180 °C) é próximo da temperatura

de degradação térmica (200 °C). Estas propriedades não são as ideais para o seu processamento,

mas com a incorporação de unidades de 3HV no poliéster, a temperatura de fusão é reduzida,

modificando assim, a sua morfologia. Como resultado, os copolímeros resultantes,

poli (3HB- co- 3- HV) têm significativamente temperaturas mais baixas de processamento e uma

elevada flexibilidade comparativamente com os poli (3HB) (Babel et al., 2001).

No interior do citoplasma celular, os PHAs são sintetizados sob a forma de inclusões

insolúveis, funcionando como material energético de reserva. Estes bioplásticos são visíveis por

microscopia ótica, com recurso a coloração Negro de Sudão B (NSB), e facilmente detetáveis por

microscopia eletrónica, Figura 2.20 (Ferreira et al., 1998; Nuti et al., 1972). O modelo para PHASCL

(cadeia curta) prevê uma monocamada de proteínas e fosfolípidos, onde a espessura da camada

superficial é cerca de (3-4) nm, aproximadamente metade do diâmetro da membrana

citoplasmática (Babel et al., 2001).

PHA de cadeia curta PHA de Cadeia média


27

Figura 2.20 – Imagem de microscopia eletrónica de transmissão de uma secção celular da Azotobacter chroococcum, onde são

visíveis os grânulos de PHA (Nuti et al., 1972)

2.5.1. PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE PHAS

A produção industrial de PHAs é feita normalmente com recurso a culturas puras de

microrganismos, o que torna esta produção pouco apelativa economicamente, quando comparado

com o plástico convencional. A utilização de substratos, provenientes de indústrias ou da

agricultura, usando culturas mistas do tratamento de água residual, podem reduzir os custos em

cerca de 50 %. Atualmente, por exemplo, estão disponíveis na Europa grandes quantidades de

soro de leite na indústria de laticínios, proporcionando lactose para a produção de ácido láctico,

poli (ácido láctico) (PLA), PHAs e bioetanol (Chen, 2010).

A produção de PHAs, de uma forma geral tem as seguintes etapas: fermentação; separação

de biomassa a partir do meio; secagem da biomassa; extração; secagem; e empacotamento, como

se pode observar no exemplo da Figura 2.21. Ao longo de vários anos, algumas empresas têm

investido na investigação & desenvolvimento (I&D) de técnicas de produção de PHA. Algumas

pararam a sua atividade de pesquisa e produção na década de 90, devido ao baixo preço do

petróleo. Por outro lado, houve empresas que retomaram esta atividade quando o preço do

petróleo em meados 2008, atingiu os 124 € por barril (Chen, 2009). Na Tabela 2.3 observam-se

algumas empresas que se destacam ainda hoje no I&D da produção de PHAs.

Apesar de muitos tipos de PHAs terem sido descobertos, apenas alguns foram produzidos

em larga escala para exploração comercial, entre os quais se destacam: P3HB, PHBV e

poli [(R) - 3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato] (P3HB4HB) (Chen, 2010; Avérous et al., 2012).


28

Figura 2.21 – Esquema geral de produção e extração de PHA (exemplo adaptado de (Chen, 2010)).

Tabela 2.3 – Empresas que investigam e produzem PHAs (Chen, 2009; Jacquel et al., 2008; Avérous et al., 2012)

Empresa Tipos de

PHA Preço

Escala de Produção (t ano-1)

Período desde:

Aplicações

Biomer, Alemanha

PHB (3–5) € kg-1

(2010) 50 1990 Embalagens

Metabolix, EUA

Vários PHA (2.20 – 5) € kg-1

(2010) _ 1980 Embalagens

Tepha, EUA

Vários PHA _ PHA para implantes

médicos 1990

Bio implantes médicos

ADM, EUA (com Metabolix)

Vários PHA _ 50 000 2005 Matéria-prima

Meredian, EUA

Vários PHA _ 10 000 2007 Matéria-prima

Kaneka, Japão (com P&G)

Vários PHA _ _ 1990 Embalagens

Biocycles, Brasil

PHB _ 100 1990 Matéria-prima

Bio-On, Itália

PHA _ 10 000 2008 Matéria-prima

Zhejiang Tian An, China

PHBV _ 2 000 1990 Matéria-prima

Yikeman, Shandong, China

PHA _ 3 000 2008 Matéria-prima

Jiang Su Nan Tian, China

PHB _ Escala piloto 1990 Matéria-prima

Shenzhen O’Bioer, China

Vários PHA _ _ 2004 _

Tianjin Green Bio-Science (+DSM)

P3HB4HB _ 10 000 2004 Matéria-prima e

embalagens

Shandong Lukang, China

Vários PHA _ Escala piloto 2005 Matéria-prima e

medicinal


29

Na sua maioria, estas empresas utilizam culturas puras, mantendo condições de

esterilização de espécies de microrganismos geneticamente modificados, de modo a promover

um aumento na produtividade de PHA. Devido à tecnologia de engenharia genética utilizada,

tornou-se necessária a redução dos custos associados à produção de PHAs, recorrendo à utilização

de substratos de baixo custo e sem esterilização (Chen, 2009).

2.5.2. VANTAGENS DA PRODUÇÃO DE PHAS POR CULTURAS MISTAS

A produção de PHAs por culturas mistas aparenta ser mais vantajosa quando comparada

com a produção por culturas puras. No entanto, tem sido desenvolvido um grande esforço na

última década para melhorar o processo usando culturas microbianas mistas. Atualmente, a

produção de PHAs por culturas mistas ainda atinge uma baixa produtividade volumétrica. Com o

processo de culturas mistas pretende-se a utilização das instalações já existentes em ETAR, para

produzir PHAs, como uma tecnologia de baixo custo. Assim, este processo a partir de culturas

mistas pode ser economicamente competitivo e tem a vantagem de ser mais simples, exigindo

menos investimento e custos operacionais (Formolo et al., 2003). Os PHAs podem ser aplicados

em embalagens, tais como: utensílios alimentares, consumíveis diários, aparelhos eletrónicos,

entre outros. Podem ser também usados na indústria fotográfica, na indústria química (como os

adesivos sensíveis ao calor e látex), na indústria têxtil (onde podem ser transformados em fibras

como os nylons), na indústria de química fina (em que podem ser utilizados como materiais para

a síntese de antibióticos), em medicina (podendo ser utilizados como biomaterial para implantes

médicos) (Chen, 2009).

2.5.3. PRODUÇÃO DE PHA À ESCALA LABORATORIAL / PILOTO

Existem alguns trabalhos na área da produção de PHA por culturas mistas, nos quais a

maioria foi desenvolvida em instalações laboratoriais. Chua et al. (2003) verificaram que lamas

ativadas, com um tempo de retenção de sólidos (TRS) de 3 dias, possuíam melhor capacidade de

produção de PHA, ao contrário de uma lama com TRS de 10 dias, a qual tem menor capacidade

de produção. Os investigadores verificaram também que o pH influência a acumulação de PHAs

do seguinte modo: a produção de PHA ocorre a pH entre 7 a 8; quando controlado a pH entre 6

a 7 a sua produção baixa consideravelmente; e quando o pH é mantido entre 8 a 9, a produção


30

de PHAs é estimulada.

No tratamento por lamas ativadas de água residual municipal suplementada com acetato,

as lamas podem acumular PHAs até 30 % em peso seco da biomassa, em comparação com as

lamas ativadas que atuam no tratamento de águas residuais sem a adição de suplementos

alcançando os 20 % do peso seco da biomassa (Chua et al., 2003).

Phasakanona et al. (2014) investigaram a produção de PHAs num reator descontínuo

sequencial (SBR), tendo verificado que o sistema obteve melhores resultados de produção de PHAs

quando alimentado com água residual doméstica sintética, quando combinada com resíduos de

glicerol, ao invés da utilização de água residual sintética. A acumulação de PHA na etapa anóxica

foi superior à obtida na etapa aeróbia, pelo que obtiveram uma concentração e rendimento valores

aproximados de PHA de 1 087 mg L-1 e 61 %, em peso de lama seca, respetivamente.

Silva (2013) verificou maior acumulação de PHAs para a concentração de CQO igual a

14 g L-1 e para a concentração de N igual a 0.06 g L-1, com um tempo de cultura de 57 h, onde

nestas condições o teor de PHA na biomassa atingiu uma fração mássica de 0.086.

Abreu (2013), através da utilização de um SBR, em regime de alimentação dinâmica em

condições aeróbias, usando acetato como fonte de carbono e sem controlo de pH, verificou uma

fração mássica de PHAs por SST de 0.37 máxima com uma concentração de PHAs de

1 785 mg L-1.

Vieira (2005), usando o reator SBR e meio sintético, para simular um efluente doméstico,

verificou uma acumulação significativa de PHB expressa em moles de carbono, igual a

0.12 mol mol-1 na biomassa suspensa. Para a taxa específica de consumo de acetato igual a

0.30 mol mol- 1 h-1, a taxa específica de síntese de PHB foi de 0.22 mol mol-1 h-1 e a fração de

substrato armazenado sob a forma de PHB foi de 0.7 g g-1.

Reddy et al. (2012a) demonstraram que em consórcios mistos de bactérias, sob ambiente

anóxico com elevada concentração de substrato e baixas concentrações de N e P, a acumulação

de PHAs era superior. O PHA produzido era composto pelo copolímero P3 (HB-co-HV), onde a

fração de PHB era superior à de PHV. Também, Pittman et al. (2014) comprovaram que a

produção de PHAs foi fortemente influenciada pelas condições operacionais como temperatura,


31

pH e concentração de substrato.

Albuquerque et al. (2011), verificaram que a utilização da alimentação contínua, em vez de

uma estratégia de alimentação por pulso, atenuou as restrições do processo e permitiu uma maior

absorção do substrato e um maior armazenamento de polímero devido à concentração de

substrato residual constante. Experiências realizadas com outros substratos, tais como ácido

propiónico, ácido acético e ácido butírico, revelaram que os ácidos orgânicos voláteis são

excelentes substratos para a produção de PHAs por culturas mistas. Neste contexto, a produção

de PHAs por culturas mistas abre novas perspetivas à utilização e valorização de resíduos

industriais que possuam, na sua composição, compostos orgânicos fermentáveis (e.g. soro de

leite) ou fermentados (e.g. ácidos orgânicos) (Serafim et al., 2003). Na Tabela 2.4, encontra-se

um resumo de vários estudos realizados na produção de PHAs com culturas mistas e com água

residual.

Tabela 2.4 – Alguns estudos realizados sobre a acumulação de PHA em culturas mistas e o conteúdo máximo obtido, em fração

mássica, de PHA por biomassa em relação ao tipo de cultura, qual o substrato como fonte de carbono e o tipo de processo

Cultura de

microrganismos Substrato Processo

Fração mássica

PHA ou PHB Referência

Lamas ativadas

inoculadas

(de um EBPR

laboratorial)

Acetato e

propionato de

metilo

SBR

(ciclo de 12 h)

(10 d SRT; 1 d TRH)

Escala laboratorial

Limitação de azoto

Regime de

alimentação

dinâmica

(fartura / fome)

0.61 (Lemos et

al., 2006)

Lamas ativadas Água residual real

SBR

(ciclo de 4h)

(6 h TRH; 3 h SRT)

Escala piloto

(fartura / fome) 0.20 (Chua et

al., 2003)

Bacillus

aryabhattai

MSU 504

Água residual

doméstica sintética

combinada com

resíduos de glicerol

SBR

(ciclo de 24 h)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio

(fartura / fome)

0.61

(Phasakan

ona et al.,

2014)

Lamas ativadas Água residual

(industria de papel)

SBR

(ciclo de 12 h)

(1 d SRT)

Limitação de

oxigénio

(fartura / fome)

0.77 (Jiang et al.,

2012)


32

(Continuação da Tabela 2.4)

Cultura de


Fração mássica


Lamas ativadas

Água residual

sintética

enriquecida com

acetato

SBR de biofilme

(ciclo 3.1 h)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio 0.07

(Krasnits et

al., 2013)


municipal

SBR de biofilme

(ciclo de 3.1 h)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio 0.04

(Krasnits et

al., 2013)

Lamas ativadas Acetato

SBR

(ciclo 12 h)

(1 d SRT; 1 d TRH)

Escala laboratorial

Limitação de

amónio, (fartura /

fome)

0.89

(Johnson

et al.,

2010a)

Lamas ativadas Ácido acético e

ácido propiónico Escala laboratorial

Alimentação em

pulsos 0.24

(Janarthan

an et al.,

2014)

Lamas ativadas

Água residual

sintética (azoto e

fósforo)

SBR

Escala laboratorial

Limitação do fósforo

(fartura / fome) 0.54

(Reddy et

al., 2012a)


municipal

(ciclo 24 h)

(2 d TRH; 2 d SRT)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio Regime de

alimentação

dinâmico

(fartura / fome)

0.28

(Pittmann

et al.,

2014)

A. eutrophus

Água residual

com amido

convertido a

ácidos gordos

voláteis (AGV)

UASB

Escala laboratorial Limitação de Azoto 0.34 (Yu, 2001)

Lamas ativadas

Meio de cultura

sintético com

enriquecimento

de acetato e

amoníaco

SBR (ciclo de 6 h)

(SRT 6 d; TRH 12 h)

Escala laboratorial

Limite de substrato

(Regime de

alimentação

dinâmico (fartura /

fome))

0.64 (Bo et al.,

2009)

Plasticicumulans

acidivorans

Água residual

(fabrica de

chocolate)

convertida a AGV

e etanol

SBR

(ciclo de 12 h)

(SRT 24 h; TRH 4 h)

Escala piloto

Limitação de

oxigénio

(fartura / fome)

0.76 (Tamis et

al., 2014)


33


Cultura de


Fração mássica


Lamas ativadas Acetato e

amónio

SBR

(4 d SRT, C/N 11;

1 d SRT; C/N 8;

8 h TRH)

Escala laboratorial

Limitação de Azoto


(Johnson et

al., 2010b)

Lamas ativadas Águas residuais

de lacticínios

ASPR

(1.81 d TRH; 2.96 SRT)

Escala piloto

Sem limitação

reator continuo 0.43

(Chakravarty

et al., 2010)

Lamas ativadas

Águas residuais

do fabrico de

papel conversão

a AGV

Fermentador

acidogénico

(10 d SRT; 16 h TRH)

Escala laboratorial

Limitação de

fósforo (reator

continuou)

0.48 (Bengtsson et

al., 2008)

Lamas ativadas Acetato

SBR

(ciclo 6 h)

(10 d SRT)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio

(descarga

dinâmica aeróbica)

(fartura / fome)

0.74 (Chen et al.,

2015)

Pseudomonas

otitidis

Acetato

propionato

butirato

Bach;

Escala laboratorial

Limitação de

substrato

(fartura / fome)

0.54 (Reddy et al.,

2012b)

Melaço

Os açúcares de

melaço

convertidos a

AGV

SBR

(12 h ciclo)

(10d SRT; 1 d TRH)

(alimentação


Alimentação

continua

0.77 (Albuquerque

et al., 2011)

Lamas ativadas Acetato PFR seguido do CSTR (fartura / fome) 0.57 (Reis et al.,

2003)

Lamas ativadas

(cultura

enriquecida)

Água residual

contendo óleos

minerais.

SBR

(ciclo de 12 h)

Escala piloto

Limitação de azoto

(fartura / fome) 0.09 (Silva, 2013)

Lamas ativadas

enriquecida com

PHA

Água residual

sintética

enriquecida com

acetato

SBR

(ciclo de 12 h)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio

(fartura / fome)

0.37 (Abreu, 2013)

Bacillus

tequilensis MSU

112

Água Residual

rica em amido

(sintética)

SBR

(ciclo 24 h)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio 0.79

(Chaleomrum

et al., 2014)


34


Cultura de


Fração mássica


Lamas ativadas

ETAR Aveiro

Norte (SIMRIA)

Ácido acético,

xilose e

lenhossulfonatos

SBR

(ciclos 12 h)

(1 d TRH; 5 d SRT)

Escala laboratorial

Limitação de

oxigénio

(alimentação


(fartura / fome)

0.68 (Queirós et

al., 2014)

Lamas ativadas Lamas residuais

(AGV) e azoto

AFR sistema continuo

(2 d TRH)

Escala piloto

Limitação de

substrato (fartura /

fome)

0.59 (Jia et al.,

2014)

Lamas ativadas

ETAR “Roma

Nord” (Itália)

Ácido acético,

ácido propiónico,

e ácido láctico

SBR (ciclo 2 h)

(1 d TRH; 1 d SRT)

Escala laboratorial

Controlo de pH 7.5

(fartura / fome)

Na fase de

enriquecimento

0.13

Fase de

acumulação

0.31

(Villano et

al., 2010)

Lamas ativadas

Água residual

doméstica

sintética

enriquecida com

acetato

SBR de biofilme

(ciclo de 300 min)

(9.2 h TRH; 16.1 d SRT)

Escala laboratorial

Alimentação

descontínua

(fartura / fome)

0.70 (Vieira,

2005)

Lamas ativadas

Ácidos gordos

voláteis

(Acetato,

Propionato e

Lactato)

SBR

(ciclo de 2h)

(1 d TRH; 1 d SRT)

Escala laboratorial

Sem limitação


(Dionisi et

al., 2004)

Lamas ativadas

Água residual

real enriquecida

com acetato

SBR

(ciclo de 4 h)

(6 h TRH; 3 h SRT)

Escala piloto

(fartura / fome) 0.30 (Chua et

al., 2003)

Lamas ativadas Bio óleo puro

SBR

(ciclo de 12 h)

(5 d SRT; 1 d TRH)

Escala laboratorial

(fartura / fome) 0.10 (Fidalgo et

al., 2014)


sintética (AGV)

SBR

(ciclo de 6 h)

(12 h TRH; 8 d SRT)

Escala laboratorial

(fartura / fome) ≈317a

(Mesquita

et al.,

2013b)

a concentração em g L-1 de PHA nos SST

3. PLANIFICAÇÃO, METODOLOGIAS E

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS


36

3.1. PLANIFICAÇÃO DO ESTUDO

Na Figura 3.1 está representada a planificação do trabalho, dividida em cinco etapas. Cada

etapa teve uma duração aproximada de um mês, pelo que foi necessário proceder-se a alguns

ajustes, de acordo com a evolução do trabalho experimental e do tempo disponível para a sua

realização.

Figura 3.1 – Planificação do trabalho de estágio representada em 5 etapas.

março de 2015 – Revisão bibliográfica de métodos de análise:

Índice Biótico de Lamas (IBL);

Procedimentos de coloração e recolha de imagens;

Análise quantitativa de PHAs através de GC;

Estudo do funcionamento geral da ETAR.

abril de 2015 – Preparação das metodologias de análise:

Preparação de material e métodos;

Aquisição de reagentes.

abril a maio 2015 – Microbiologia:

Identificação microscópica da comunidade microbiana presentena biomassa nos canais de arejamento (aeróbio e anóxico);

Caracterização do estado biótico do licor misto;

Análise das dificuldades operaçionais.

junho a julho de 2015 – Avaliação microscópica das lamasativadas:

Cálculo do IBL;

Análise dos flocos e sua abundância de organismos.

julho de 2015 – Monitorização dos PHAs através de:

Cromatografia gasosa;

Análise de imagem.

I

II

III

IV

V

4. PLANIFICAÇÃO, METODOLOGIAS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

37

3.2. ESTUDO GERAL DO FUNCIONAMENTO DA ETAR

O sistema de tratamento da ETAR foi monitorizado semanalmente através da avaliação dos

seguintes parâmetros: CQO; CBO5; SST, SSV; P; N; pH; temperatura (T); potencial redox (ORP);

condutividade (EC); oxigénio dissolvido (OD) e pluviosidade (P).

A recolha de amostras foi efetuada no local de entrada do efluente na ETAR, no canal

anóxico e no local de saída do efluente tratado para o meio hídrico. Os resultados apresentados

são relativos ao ano de 2014 e 2015 (até ao mês de junho) até terminar a monitorização dos

PHAs. Para o canal anóxico, também é apresentada a monitorização anual, com frequência

semanal, da taxa A/M (alimento / microrganismos) e os SSV.

A ETAR é concebida para operar com uma concentração elevada de microrganismos, que

pelo que implica uma concentração limitante de substrato. A velocidade das reações bioquímicas

é afetada pela temperatura, pH, oxigénio dissolvido e concentração de nutrientes (Ferreira et al.,

1998).

Os caudais diários de águas residuais afluentes à ETAR, bem como a parte do efluente

proveniente de um matadouro e de uma tinturaria, foram também monitorizados.


38

3.3. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FÍSICO – QUÍMICOS DURANTE OS

30 DIAS DE MONITORIZAÇÃO

3.3.1. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DOS SÓLIDOS TOTAIS (ST) E

SÓLIDOS VOLÁTEIS TOTAIS (SVT)

A quantificação de sólidos suspensos totais (ST) e voláteis (SVT) foi realizada segundo o

método descrito no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1999).

O método baseia-se na colocação em cadinho de um volume conhecido de amostra e secagem

na estufa a 105 °C para determinação dos sólidos totais. Posteriormente, o mesmo cadinho

contendo a biomassa seca é calcinado na mufla a 500 ºC para determinação dos sólidos voláteis

totais. O procedimento detalhado está descrito no Anexo I.

3.3.2. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DO PH, TEMPERATURA (T),

POTENCIAL REDOX (ORP), CONDUTIVIDADE (EC), OXIGÉNIO

DISSOLVIDO (OD)

As medições de pH, temperatura, potencial redox, condutividade e oxigénio dissolvido foram

efetuadas com o aparelho portátil da HACH LANGE modelo HQ30d. Este aparelho tem integração

completa de medidores estáveis com elétrodos da INTELLICAL, onde armazenam todos os

parâmetros relevantes em formato digital. As leituras foram realizadas no próprio canal anóxico,

aproximadamente na mesma zona de recolha da amostra para determinação de PHAs

armazenados.

3.3.3. PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DA PLUVIOSIDADE (P)

A pluviosidade foi medida com um pluviómetro da RAINWISE® Inc. O RainLogTM da RainWise

fornece um método económico de registar a pluviosidade em local remoto. O pluviómetro, quando

introduzido no local desejado, regista o total de pluviosidade com resolução de um minuto e grava

essa informação.

O RainLogTM contém um microcontrolador que possui um relógio de tempo real, o qual

associará, a esse tempo, o registo correspondente de pluviosidade. Este pode registar


39

continuadamente durante meses até que a capacidade de armazenamento de dados esteja

praticamente cheia. Depois, através da Windows ® com o software TL-Loader V2.2.2, é possível

exportar os registos para visualizar gráfica ou para tabela de dados do Microsoft Excel. A

pluviosidade é fornecida em milímetros, sendo igual à razão do volume de água recolhida (em L)

pela área da abertura do funil (em m2).


40

3.4. ÍNDICE BIÓTICO DE LAMAS (IBL)

3.4.1. METODOLOGIA DO MÉTODO IBL

O IBL é um método que se baseia-se na abundância e diversidade específica da comunidade

de protozoários no canal de arejamento com lamas ativadas. Além disso, baseia-se nas diferentes

sensibilidades reveladas por alguns grupos da microfauna aos fatores físico – químicos

prevalecentes no sistema (Nicolau et al., 2002).

A avaliação é feita através de valores numéricos (entre 0 e 10), o que permite comparar a

qualidade biológica das lamas no canal de arejamento ao longo do tempo com as condições

operacionais da ETAR de Penices. O Índice foi calculado com base na Tabela 3.1 de duas entradas,

tendo em conta as variáveis consideradas, o grupo dominante, número de pequenos flagelados

(F) e diversidade da amostra em espécies (S).

Tabela 3.1 – Tabela de duas entradas para o cálculo do IBL (na qual: S – nº de espécies da microfauna, excluindo os flagelados

e F – nº pequenos flagelados na diagonal da Câmara de Fuchs-Rosenthal), (Nicolau et al., 2002; Madoni, 1994)

Grupo dominante Densidade

Ind L-1

S > 10 8 ≤ S ≤ 10 5 ≤ S ≤ 7 S < 5

F<10 10<F<100 F<10 10<F<100 F <10 10<F<100 F<10 10<F<100

Ciliados Móveis de

Fundo + Sésseis * e/ou

Amibas com teca

≥106 10 8 9 7 8 6 7 5

<106 9 7 8 6 7 5 6 4

Ciliados Sésseis*

> 80 %

≥106 9 7 8 6 7 5 6 4

<106 8 6 7 5 6 4 5 3

Opercularia spp ≥106 7 5 6 4 5 3 4 2

<106 6 4 5 3 4 2 3 1

Vorticella Microstoma ≥106 6 4 5 3 4 2 3 1

<106 5 3 4 2 3 1 2 0

Ciliados Nadadores ≥106 5 3 4 2 3 1 2 0

<106 4 2 6 1 2 0 1 0

Peq. Flagelados (>100

na diagonal da Câmara

de Fuchs-Rosenthal)

≥106 4 3 2 1

<106 3 2 1 0

* Opercularia spp. e Vorticella micróstoma não dominantes

A entrada vertical é feita tendo em consideração a riqueza específica da amostra e o número

de pequenos flagelados na diagonal da câmara de Fuchs-Rosenthal. Na coluna da direita estão

distribuídos diversos grupos da microfauna associados à decrescente qualidade biológica das

lamas. Na entrada horizontal considera-se o grupo dominante no canal de arejamento e a


41

densidade total da microfauna. Se dois ou mais grupos compartilham a dominância da amostra,

será escolhido o grupo que ocupa a posição mais baixa da Tabela 3.1. O valor do IBL é

determinado pela intersecção da coluna e da linha selecionada, obtendo-se um valor numérico

entre 0 e 10, e estes valores são agrupados em quatro classes de qualidade biológica das lamas

as quais permitem dividir em quatro diferentes graus de eficiência para a avaliação do

funcionamento do sistema na Tabela 3.2 (Madoni, 1994).

Tabela 3.2 – Conversão do valor do IBL em classes de qualidade biológica das lamas ativadas e avaliação da eficiência

depuradora do tratamento (Madoni, 1994; Nicolau et al., 2002)

Valor IBL Classe Avaliação

8 – 10 I Lamas bem colonizadas e estáveis; atividade biológica ótima; elevada eficiência depuradora

6 – 7 II Lamas bem colonizadas e estáveis; atividade sub-otimal; eficiência depuradora suficiente

4 – 5 III Atividade biológica insuficiente; eficiência depuradora medíocre

0 – 3 IV Atividade biológica muito baixa; eficiência depuradora baixa

3.4.1. PROCEDIMENTO, MATERIAL DE AMOSTRAGEM E TRANSPORTE

As amostras de lamas ativadas do tanque de arejamento foram recolhidas em pontos

homogeneizados, evitando-se locais vizinhos das paredes do tanque (zonas mortas), locais vizinhos

do sistema de arejamento, locais com espumas e locais vizinhos dos pontos de inserção de lamas

recicladas. As amostras foram recolhidas a cerca de meia profundidade do tanque, tendo-se

utilizado um amostrador automático (Nicolau et al., 2002).

Para manter a atividade biológica durante o transporte, recorreu-se ao arejamento da

amostra, através de uma bomba de ar portátil da Markor AP-2500, injetando 0.5 L min-1, e à

refrigeração da amostra.

3.4.2. PROCEDIMENTO PARA OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA E MATERIAL

A análise microscópica executou-se após a recolha, ou no máximo, nas 5 horas que a

precedem, de modo a evitar uma elevada mortalidade de algumas espécies e o crescimento de

outras.

Antes da observação, as amostras foram bem agitadas para serem representativas.


42

Seguidamente, usando uma pipeta de Pasteur, colocou-se uma gota com cerca de 0.5 mL de licor

misto numa lâmina de vidro, cobrindo-se a zona com uma lamela de 18 mm × 18 mm, e analisou-

se ao microscópio ótico de contraste de fase usando a ampliação de 100×. Esta primeira

identificação dos microrganismos é designada por rastreio e deve ser feito pelo menos uma ou

duas vezes por amostra. A identificação das espécies presentes foi realizada recorrendo a chaves

de classificações de protozoários. Por vezes, tornou-se necessário recorrer ao uso de ampliações

maiores (200× e 400×) para a correta identificação taxonómica. Apesar do grande número de

microrganismos presentes nas lamas ativadas, alguns não são contabilizados por este método,

tais como amibas nuas, algas, crustáceos e insetos. Os grandes e pequenos flagelados, os ciliados,

as amibas com teca, rotíferos, nematodos e gastrotríqueos são os microrganismos incluídos neste

método. Apenas foram contabilizadas como espécies presentes as que permitiam a observação

de pelo menos 2 indivíduos durante o rastreio ou pelo menos um durante a contagem

microscópica (Nicolau et al., 2002).

A visualização da comunidade microbiana foi efetuada recorrendo a um microscópio Motic

BA 200 e a uma câmara fotográfica Moticam 1000 Motic 1.3M pixéis USB 2.0. As imagens foram

visualizadas em campo claro, a uma ampliação total de 100× a 400×, e resolução de

1 380 × 1 024 pixéis, por intermédio do software de aquisição Motic Images Plus 2.0.

3.4.3. PROCEDIMENTO DE CONTAGEM MICROSCÓPICA

Após a identificação das várias espécies e grupos presentes na amostra, estimou-se a sua

abundância relativa, quer das unidades taxonómicas (grupos, géneros ou espécies conforme os

microrganismos), quer dos grupos funcionais (sésseis, nadadores e móveis de fundo dentro dos

ciliados bacteriófagos).

Efetuaram-se contagens dos microrganismos presentes num volume conhecido de cada

amostra do seguinte modo; com uma micropipeta, retiram-se 25 μL da amostra e colocaram-se

numa lâmina de vidro, cobrindo de seguida com uma lamela de 18 mm × 18 mm. Colocou-se a

amostra no microscópio ótico de contraste de fase, sendo usada a ampliação de 100× para contar

o número de indivíduos de cada espécie identificada no rastreio. A contagem foi efetuada da

esquerda para a direita. Repetiu-se a contagem com nova preparação da mesma amostra,

devidamente homogeneizada e determinou-se para cada espécie ou grupo, o nº indivíduos


43

por mL- 1 de lama ativada.

Para estimar a abundância de pequenos flagelados, usou-se uma câmara de

Fuchs- Rosenthal de 3.2 μL. Esta consiste numa célula de contagem quadrangular, com dois

reticulados de 16 × 16 quadrículas de 250 μm de lado. Assim, colocou-se duas gotas de amostra,

uma sob cada reticulado da câmara, e contam-se os pequenos flagelados que se encontram dentro

ou sob as 16 quadrículas (0.2 μL) que formam cada uma das diagonais desta câmara. Após este

procedimento calculou-se a dominância considerando os seguintes grupos: sésseis, amibas com

teca, móveis de fundo, ciliados nadadores e pequenos flagelados.

Durante a contagem não foram contabilizados os indivíduos mortos, formas móveis de

ciliados coloniais (Telotropos), ciliados nadadores que entram no campo de visão provenientes de

zonas já contabilizadas (Nicolau et al., 2002). Esta contagem teve como finalidade a determinação

do Índice Biótico de Lamas (IBL), proposto por Madoni (1994).


44

3.5. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE POLÍMEROS DE RESERVA PHB

(POLI-3-HIDROXIBUTIRATO) E PHV (POLI-3-HIDROXIVALERATO) ATRAVÉS

DO MÉTODO DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)

3.5.1. METODOLOGIA CG

A CG é uma técnica de separação e de análise de misturas de substâncias voláteis, onde a

amostra é vaporizada e introduzida num fluxo de um gás adequado, denominado por fase móvel

ou gás de arraste, o qual passa pelo injetor e transporta os componentes da amostra para a coluna.

O injetor tem como função depositar as amostras dentro da coluna de forma homogénea, para se

obter bandas finas e com uma boa resolução entre os componentes da amostra. Este fluxo de gás

com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase estacionária (coluna

cromatográfica), no qual ocorre a separação da mistura. Os componentes das amostras são

inicialmente separados pela volatilidade do composto e pela temperatura estipulada. Todas as

fases estacionárias degradam-se quando expostas ao oxigénio e a altas temperaturas, pelo que se

deve retirar toda a água presente na amostra. (Costa, 2014). As substâncias separadas saem da

coluna dissolvidas no gás de arraste e passam por um detetor, gerando no dispositivo um sinal

elétrico proporcional à quantidade de material eluído.

O registo deste sinal em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias

aparecem como picos com área proporcional à sua massa, o que possibilita a análise quantitativa.

Os padrões de calibração devem ser injetados antes de cada amostra, da menor para a maior

concentração. A quantificação dos resultados no CG consiste na medição da área dos picos

registrados no cromatograma, sendo proporcional à massa do composto injetada

(Fowlis, 1995; Felizzola et al., 2014).

Na primeira fase, para a determinação de PHAs (PHB e PHV), era necessário saber em que

locais de processo na ETAR os microrganismos se encontravam a acumular PHAs e quais as

quantidades presentes. Para isso, efetuaram-se várias recolhas de amostras de biomassa nos

reatores biológicos em dias alternados. Os locais de recolha foram os seguintes: canal anóxico,

canal aeróbio, recirculação (com funcionamento a 80 % em relação ao caudal de entrada) e uma

amostra de lamas desidratadas, as quais são armazenadas no silo.


45

Na segunda fase, foi determinado o local específico da ETAR, com maior acumulação de

PHAs (fim do canal anóxico). E seguiu-se a monitorização durante 30 dias consecutivos.

Anteriormente à cromatografia gasosa, e para que esta se realize, existem as etapas de preparação

da amostra, Figura 3.2, que são descritas seguidamente.

Figura 3.2 – Esquema das várias etapas necessárias para o processo de determinação quantitativa de PHAs por cromatografia

gasosa.

3.5.2. METODOLOGIA DO PROCESSO DE LIOFILIZAÇÃO

O processo de liofilização é usado para remover a água de produtos sensíveis de origem

biológica, sem danificá-los, para que estes possam ser preservados e posteriormente

reconstituídos, simplesmente pela adição de água. Todo o processo é realizado a baixa

temperatura e pressão. A liofilização é o processo pelo qual a água é removida do produto após

ser congelado e colocado sob vácuo, ocorrendo abaixo do ponto triplo, para permitir a conversão

diretamente do estado sólido (gelo) ao estado de vapor, sem entrar na fase líquida (sublimação).

Após este processo, o produto resultante encontra-se com o teor de humidade desejado,

apresentando uma grande área superficial, a qual promove a dissolução rápida do produto seco.

Com a liofilização, o produto adquire melhor estabilidade a longo prazo. Além desta vantagem, os

produtos liofilizados são de fácil manuseamento durante o armazenamento (Nireesha et al., 2013).

3.5.3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL DE LIOFILIZAÇÃO

A biomassa recolhida em cada fase do processo biológico para um falcon de 10 mL e foi

centrifugada à velocidade de frequência de agitação de 4000 min-1 durante 10 min. Colocou-se na

abertura folha de alumínio e fez-se algumas aberturas com uma agulha, seguidamente colocou-se

a congelar a -80 °C, e posteriormente liofilizada durante 48 h no liofilizador de laboratório ALPHA

1-4 LD plus do CHRIST. Após este processo, os falcons foram retirados do liofilizador e mantidos

no exsicador (até massa constante) até a realização da digestão.


46

3.5.4. PROCEDIMENTO DA PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES PADRÃO PARA O

TRAÇADO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO DO MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO DE PHA

A preparação das soluções padrão, para o traçado da curva de calibração procedeu-se da

seguinte forma:

Numa balança Mettler AE 240, pesou-se o padrão de copolímero PHB / PHV 7:3 (Fluka

Chemika, Switzerland) para frascos de digestão de 10 mL. Os padrões encontravam-se na gama

de 0.0 mg a 2.5 mg de polímero (com intervalos de ≈ 0.25 mg). Efetuou-se o passo de digestão e

extração juntamente com as amostras.

3.5.5. METODOLOGIA DA REAÇÃO DE ESTERIFICAÇÃO

A reação de esterificação consiste numa reação química reversível, na qual um ácido

carboxílico, neste caso o ácido benzoico, reage com um álcool, sendo este o 1-propanol,

produzindo éster e água. Procedeu-se a um aquecimento dos reagentes de forma a acelerar o

processo, porque se trata de uma reação que à temperatura ambiente é muito lenta. Depois de

completa a separação da biomassa do sobrenadante e do seu conteúdo aquoso, iniciou-se o

procedimento de digestão, onde ocorre a hidrólise do polímero.

3.5.6. PROCEDIMENTO PARA A REAÇÃO DE ESTERIFICAÇÃO

Pesou-se numa balança analítica cerca de (4 a 15) mg de biomassa liofilizada e posteriormente

transferiu-se para tubos de digestão (volume, 10 mL) com rolhas roscadas revestidas a teflon.

Preparou-se também um padrão previamente colocado num tubo de digestão e um ensaio em

branco de maneira análoga às amostras. Os padrões de calibração servem para produzir um sinal

pelo detetor e é único para cada composto devendo ser comparado com o padrão conhecido para

identificação e quantificação.

Na hotte, adicionou-se aos tubos de digestão contendo as amostra (biomassa, padrões e

um tubo vazio para o ensaio em branco) um volume igual a 1.5 mL de padrão interno (PI) de ácido

benzoico em diclorometano (1 mg mL-1) e 1.5 mL de solução de 1-propanol:HCl, com a

concentração volumétrica de 3 mL mL-1 de 1-propanol por HCl. O PI é utlizado como “controlo


47

padrão”, ou seja, submete-se ao mesmo processo para determinar os efeitos de preparação da

amostra. O uso de PI corrige erros relacionados a volumes de injeção e é altamente recomendado

por análises em cromatografia gasosa.

Selou-se os tubos com as rolhas apropriadas, verificando-se o bom estado de conservação

das mesmas. Os tubos foram vigorosamente agitados no vortex no sentido de favorecer o contacto

inicial dos reagentes com a biomassa ou com os padrões. De seguida, as misturas foram digeridas

a 100 °C durante 3.5 h, pelo que ao fim deste período de tempo, retiraram-se os tubos do digestor

para arrefecem à temperatura ambiente (Mesquita et al., 2013a).

3.5.7. METODOLOGIA DA EXTRAÇÃO LÍQUIDO – LÍQUIDO

A extração líquido – líquido é um processo para separação de componentes em solução,

que se encontram em duas fases líquidas imiscíveis, utilizando (ou não) solventes. O processo de

extração líquido – líquido envolve a transferência de massa de uma fase líquida para uma segunda

fase líquida imiscível, podendo ser realizado de diferentes formas (Perry et al., 1984).

3.5.8. PROCEDIMENTO PARA A EXTRAÇÃO LÍQUIDO – LÍQUIDO

Da reação de esterificação, efetuada durante este trabalho, resulta o éster metil benzoato

(PI) e o éster hidroxialcanoato (PHB e PHV), identificados e quantificados por cromatografia gasosa

(CG). A extração foi efetuada por transferência do conteúdo dos tubos de digestão, já frios, para

frascos de vidro de 10 mL. Os tubos foram lavados com 2 mL de água ultrapura, por agitação dos

mesmos, para extrair e adicionar os resíduos ao restante conteúdo já existente no interior dos

frascos, diminuindo assim perdas de material.

Os frascos foram selados com rolha butil cinzenta e cápsula de alumínio com auxílio de um

encapsulador. Foi efetuada uma agitação vigorosa, aproximadamente, durante 1 min,

assegurando que as duas fases entrassem completamente em contacto, de modo a otimizar a

extração. Os frascos foram invertidos num suporte durante 20 min para permitir a separação das

fases, onde a fase desejada é a mais pesada, ou seja, a fase orgânica que contém o éster.

Com uma seringa descartável de 2 mL retirou-se com cuidado, aproximadamente, 1.5 mL

da fase inferior (éster), de forma a evitar a mistura das fases. Transferiu-se a fase orgânica para


48

vials de 1.5 mL. Os resíduos celulares localizam-se na interface das duas fases. Adicionou-se

sulfato de sódio (Na2SO4) em quantidade suficiente até formar um precipitado branco,

assegurando-se a desidratação total da fase orgânica. Posteriormente, os vials foram agitados e

procedeu-se à análise cromatográfica (Mesquita et al., 2013a).

3.5.9. PROCEDIMENTO PARA ANÁLISE DAS AMOSTRAS ATRAVÉS DE CG

O conteúdo em PHB e PHV na biomassa foi determinado por CG (Comeau et al., 1988).

Neste trabalho, utilizou-se o equipamento CG VARIAN 3800 equipado com um detetor de ionização

de chama. Em cada injeção, o volume injetado foi de 1 μL (injetor split/splitless em modo splitless)

através de uma seringa de CG. Os polímeros PHB e PHV foram separados, utilizando uma coluna

capilar TRWAX (Teknokroma, Espanha) (30 m x 0.32 mm x 0.25 μm), com hélio como gás de

arraste.

As temperaturas de injeção e do detetor (FID) foram 220 °C e 250 °C, respetivamente. A

temperatura inicial do forno foi de 50 °C durante 2 min, com uma rampa de 15 °C min-1 até

225 °C e temperatura constante dos 12 min aos 17 min, a 225 °C. O caudal de ar, hidrogénio,

gás de arraste (hélio) e gás de make-up (azoto) foram, respetivamente, 250 mL min-1, 30 mL min- 1,

1 mL min-1 (pressão na coluna de 50 KPa) e de 30 mL min-1. A obtenção e a integração dos

cromatogramas foram efetuadas com o auxílio do software de aquisição e integração Star

Chromatography Workstation v. 6.30 (Varian Inc., E.U.A.) (Mesquita et al., 2013a).

Os diferentes PHA foram distinguidos pelos seus tempos de retenção: 9.5 min referente ao

metil-3-hidroxibutirato, 10.1 min para o metil-3-hidroxivalerato e 10.7 min para o PI. A calibração

do método foi efetuada correlacionando a razão entre a área do pico do éster hidroxialcanoato

(PHB ou PHV) e a área do pico do éster metil benzoato (PI) com a massa de PHB e de PHV

correspondente.

O padrão utilizado foi uma mistura de 70 % de PHB com 30 % de PHV. O teor de PHA foi

definido como a fração da concentração de PHA a uma dada concentração de células (peso seco

de células por unidade de volume) (Comeau et al., 1988).


49

3.6. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PHAS PELO MÉTODO DE ANÁLISE

DE IMAGEM ATRAVÉS DA COLORAÇÃO NEGRO DE SUDÃO B (NSB)

3.6.1. METODOLOGIA DA COLORAÇÃO NSB E AQUISIÇÃO DE IMAGENS

O estudo de Mesquita et al., (2015) mostrou que a utilização de técnicas de análise de

imagem, acopladas a microscopia de campo claro e a coloração NSB, é uma técnica promissora.

Através da identificação dos grânulos de PHA por esta metodologia e posterior processamento por

técnicas de estatística multivariável foi possível prever a concentração do PHA intracelular. Para

esse efeito, foi utilizado o método dos mínimos quadrados parciais (MMQP), onde obtiveram o

coeficiente de correlação máximo de 0.90 entre os valores previstos e observados para a

concentrações de PHA. Estes métodos de análise têm sido aprimorados pelos autores “pioneiros”

ao longo dos anos de investigação desenvolvidos neste campo de previsão. O método baseia-se

nas seguintes etapas abaixo descritas Figura 3.3.

Figura 3.3 – Esquema das várias etapas necessárias para o processo de determinação quantitativa de PHAs por análise de imagem

através da coloração NSB.

3.6.2. PROCEDIMENTO E MATERIAL DE COLORAÇÃO NSB E AQUISIÇÃO DE

IMAGENS

O NSB foi utilizado para detetar PHAs como produtos de armazenamento intracelulares

presentes nas culturas mistas da ETAR de Penices. Este corante é utilizado na coloração seletiva

de grânulos de PHA (Jenkins et al., 2003). Colocou-se cuidadosamente a biomassa em suspensão

(200 µL) sobre uma lâmina de vidro e deixou-se exposta ao ar até secar. Seguiu-se a coloração

com NSB a 3 g L-1 em etanol a 600 mL L-1, durante 10 min, e lavou-se com água durante 1 s.

Seguidamente contrastou-se com safranina a 5 g L-1, durante 10 s. Enxaguou-se a lâmina com

água corrente e deixou-se secar. Posteriormente, esta foi examinada com a objetiva de 100× e

com óleo de imersão.


50

As amostras coradas com NSB foram examinadas através de um microscópio ótico Olympus

BX51 e as imagens foram adquiridas com uma câmara Olympus DP72. Foram adquiridas

50 imagens com resolução 2 040 × 1 536 pixéis e formato RGB de 24 bits (os canais de 8 bits

vermelho, 8 bit verde e 8 bit azuis), usando software de aquisição Cell^B. As imagens obtidas em

microscópio ótico foram posteriormente analisadas usando um programa de análise de imagem

quantitativa (Mesquita et al., 2013a).

O local de amostragem de biomassa encontra-se identificado na Figura 3.4 no reator

anóxico. Este local escolhido coincide com um dos sítios da amostragem preliminar da acumulação

de PHA, realizada aos vários pontos da ETAR, verificando-se maior quantidade de PHAs por CG.

Figura 3.4 – Reatores biológicos da ETAR de Penices, como o local de recolha de amostras.

3.6.3. PROCEDIMENTO DE ANÁLISE DE IMAGEM

O processamento de análise de imagens baseou-se na identificação e quantificação de

grânulos de PHA através do Matlab 7.8.0. (The Mathworks, Natick, MA).

No primeiro passo, o programa de processamento de imagem divide a imagem RGB nos

seus três canais (vermelho, verde e azul). Posteriormente, apenas se utilizou o canal vermelho

dado que o corante NSB cora os grânulos de PHA em cor azul/preto. Para aumentar o contraste

da imagem e consequentemente aumentar a definição dos contornos dos grânulos de PHA,

realizou-se a transformação logarítmica (logaritmo natural seguido de normalização). Esta

transformação foi executada por um filtro de realce do contraste (3-por-3 pixéis). Seguidamente,

foi utilizado um filtro de Gauss de 50 pixéis (sigma = 20). Este procedimento permitiu a criação

de uma cor uniforme na imagem que contém todos os grânulos através da utilização de um

threshold simples na etapa de segmentação.

Local de

recolha


51

Após a primeira segmentação grosseira, procedeu-se a uma segmentação adaptativa do

algoritmo de threshold que separou as informações necessárias a partir do fundo usado.

Nas culturas mistas, a estrutura da biomassa é consideravelmente diferente entre as

amostras, devido à extensa fração de flocos e à quantidade de grânulos de PHA, sendo

considerados como clusters. Assim, para superar a complexidade da segmentação de imagens,

todos os pixéis relacionados com a cor vermelha ou verde foram removidos.

A segmentação de cor foi baseada na determinação os rácios de azul/ vermelho e de

verde / azul. Considerou-se que os pixéis relacionados com a cor vermelho, apresentaram um

rácio azul / vermelho abaixo de 0.9, ao passo que os pixéis relacionados com a cor verde

apresentou rácio de verde / azul acima de 1.1. Depois, em 2-por-2 pixéis, aplicou-se a erosão

guiada pelo brilho para a separação individual dos grânulos de PHA. Para a separação dos

grânulos, implementa-se o algoritmo com base na transformação da distância, para uma solidez

(abaixo 0.8) em conjunto com uma área superior a 100 pixéis.

Os grânulos identificados foram posteriormente tratados, tendo sido eliminados os detritos

3-por-3 pixéis, por dilatação e enchimento. No último passo, é efetuada uma erosão baseada no

brilho, já que alguns grânulos não são foram perfeitamente segmentados, de modo a eliminar a

parte externa que normalmente é muito brilhante.

Nos grânulos de PHA identificados, a partir das imagens recolhidas, foram caracterizados

os seguintes parâmetros morfológicos: área total e real, arredondamento, diâmetro, perímetro,

comprimento, largura, fator forma; e foram quantificados a intensidade de cor azul para cada

grânulo PHA. Os grânulos de PHA também foram classificados de acordo com o tamanho: grânulos

pequenos (menos de 100 pixéis), grânulos intermediários (entre 100 e 400 pixéis), e grânulos

grandes (mais de 400 pixéis) (Mesquita et al., 2015; Mesquita et al., 2013a).

A Figura 3.5 apresenta uma representação esquemática sequencial das etapas do

processamento de imagem e na Figura 3.6 encontram-se as imagens das principais etapas desse

procedimento (Mesquita et al., 2013a; Mesquita et al., 2015).


52

Figura 3.5 – Representação esquemática do processo e análise de imagem para a coloração NSB (Mesquita et al., 2015).

Figura 3.6 – Imagens representativas das principais etapas do processamento de imagem, (a) Imagem original de NSB (b) imagem

segmentada (c) identificação dos grânulos de PHA (d) imagem de reconhecimento, imagens retiradas (Mesquita et al., 2013a).

Imagem Original (RGB)

Canal R

Logaritmo natural

Filtragem de Nitidez

Filtro gaussiano

Determinação dos rácios de B/R e G/B

Segmentação treshold

Masking

Erosão guidada por brilho

Segmentação baseado em transformação da

distância

Eliminação de detritosInclusões de PHA


53

3.7. RESUMO DE AMOSTRAGEM DIÁRIA DO CANAL ANÓXICO

Na Figura 3.7 apresenta-se o processo de amostragem durante os 30 dias consecutivos de

avaliação quantitativa de PHAs.

Figura 3.7 – Resumo do trabalho diário durante uma amostragem de 30 dias consecutivos para monitorização dos PHAs.

Amostra do licor misto do reator anóxico

Fixação de 200 µL em lâmina e

armazenamento para posterior

recolha de imagem

Coloração NSB

Recolha de 50 imagens de cada

lâmina

Leitura das imagens pelo programa de

MatLab

Determinação dos ST e os SVT

Centrifugação de 9 mL durante 10 min a

4000 min-1

Congelação da amosta, para posterior processo

de liofilização

Preparação da amostra e determinação quantitativa

de PHA por GC

Leitura dos cromatogramas

Controlo operacional: pH, T, ORP, EC, OD

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO


56

Neste capítulo, são apresentados e discutidos os resultados obtidos:

Valores relativos ao caudal total de água residual bruta afluente à ETAR, e caudais parciais

de efluentes industriais;

No controlo operacional anual da biodegradabilidade, CQO, CBO5, SST, SSV, pH, P, N e o

azoto amoniacal da água residual bruta afluente à ETAR;

Os resultados do controlo operacional anual da CQO, CBO5, SSV, pH, P e o N da água

residual tratada;

No controlo operacional anual do alimento/microrganismos (A/M), e dos SSV do canal

anóxico;

Na monitorização durante 30 dias consecutivos da temperatura (T), pH, potencial redox

(ORP), pluviosidade (P), oxigénio dissolvido (OD), sólidos totais (ST), sólidos voláteis totais

(SVT);

Observação da comunidade de protozoários e contagem destes no canal aeróbio e

determinação do IBL;

Na quantificação de PHAs durante a monitorização diária, através de dois métodos de

quantificação a CG e a análise de imagem através da coloração NSB;

Influência do tempo de retenção hidráulica (TRH), carga orgânica aplicada (OLR) na

produção de PHAs.

5. CONCLUSÕES

57

4.1. ANÁLISE DA MONITORIZAÇÃO ANUAL DA ÁGUA RESIDUAL BRUTA

AFLUENTE À ETAR

4.1.1. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (CAUDAL ETAR (Q ETAR), CAUDAL MATADOURO

(Q MATADOURO) E CAUDAL TINTURARIA (Q TINTURARIA))

O aumento da afluência de águas residuais à ETAR, pode ser aliada a um elevado período

de consumo de água, ou devido à junção de águas pluviais à linha fluentes, provocando assim um

choque hidráulico. O choque hidráulico pode vir acompanhado com uma sobrecarga orgânica se

a concentração da alimentação se manter constante. Estes picos de caudal são fundamentais no

estudo da ETAR, para avaliação e alteração dos parâmetros operacionais, para que a elevada

entrada de caudal não prejudique o tratamento biológico (Metcalf et al., 2003).

Neste estudo avaliou-se a acumulação de PHA na biomassa e a produção desta depende

do substrato, como é o caso da matéria orgânica e nutrientes presentes na água residual. As

variações de caudal vão influenciar a carga orgânica aplicada, onde a afluência elevada de águas

residuais, pode variar parâmetros físico – químicos como a CQO e o TRH entre outros,

provocando variações na matéria orgânica a ser degradada, consequentemente também

alterações na produção de PHA.

Na Figura 4.1, são apresentados os caudais diários, registados no último ano de

monitorização da ETAR. Encontram-se representados três caudais diferentes: o total e os caudais

parciais provenientes de duas indústrias, nomeadamente o caudal afluente à ETAR de um

matadouro e o caudal de uma empresa têxtil (tinturaria / lavandaria).

Pela análise da Figura 4.1, constata-se que existem alguns picos de caudal elevado afluente

à ETAR. Estes picos devem-se às chuvas intensas. Esta entrada de água pluvial no sistema de

tratamento pode ser devida a infiltrações nos intercetores ou através da ligação da rede de

saneamento municipal ao intercetor principal. Com estas infiltrações, pode-se atingir caudais a

que a ETAR não está preparada, podendo ocorrer a lavagem da biomassa presente nos reatores

biológicos, bem como uma diminuição da carga orgânica aplicada. O caudal de entrada na ETAR

pode variar entre um caudal máximo de 8 446 m3 d-1 e um caudal mínimo de 656 m3 d-1. Ao excluir-


58

se os dias com elevada pluviosidade, o caudal diário de chegada à ETAR varia, aproximadamente,

entre (1000 – 2000) m3.

Figura 4.1 – Monitorização do caudal diário de entrada na ETAR (Q ETAR), o efluente de um matadouro (Q Matadouro) e de uma

tinturaria (Q Tinturaria), as unidades de medida são expressas em m3 d-1.

Quanto ao efluente da tinturaria, pela observação da Figura 4.1, verifica-se que atinge um

máximo de 589 m3. Relativamente ao efluente do matadouro, este produz um caudal máximo de

água residual diário afluente à ETAR de cerca de 256 m3, mas em média ronda os 100 m3 d-1. No

entanto, nas duas indústrias, o volume efluente produzido varia com a produção, com o período

laboral (5 dias por semana) e com a época (existe também variação sazonal de produção).

4.1.2. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (BIODEGRADABILIDADE, CQO E CBO5)

A Figura 4.2 apresenta a caracterização do efluente à entrada da ETAR em termos de CBO5

e CQO, bem como a razão entre eles.

Em termos qualitativos, conclui-se que em ambos parâmetros semanalmente, os valores de

CBO5 e CQO, são maioritariamente mais elevados do que os apresentados para a licença de

descarga da A.R.H. Norte. O valor previsto de admissão da licença para a CQO é de 800 mg L-1 e

para a CBO5 é de 350 mg L-1. Na Figura 4.2, tanto a CBO5 como a CQO apresentam valores mais

elevados, podendo dever-se à alteração promovida pela receção da água residual proveniente do

matadouro.

Os resultados obtidos para a razão de na Figura 4.2 revelam uma elevada

5. CONCLUSÕES

59

biodegradabilidade da água residual, pelo que a razão apresenta valores de 0.3 a 0.8, segundo

Metcalf et al. (2003).

Figura 4.2 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual bruta. Os dados incluem a concentração da

carência biológica de oxigénio ao fim de 5 dias representado por CBO5 em mg L-1, a concentração da carência química de oxigénio

representado por CQO em mg L-1 e o respetivo quociente (que traduz a biodegradabilidade).

Quando a biodegradabilidade atinge valores iguais ou superiores a 0.5, considera-se que a

água residual apresenta uma elevada taxa de sucesso por tratamento biológico. Por outro lado,

quando esta razão se reduz para valores inferiores a 0.3, o efluente a tratar pode conter

componentes tóxicos que podem prejudicar o tratamento biológico. Como se pode observar na

Figura 4.2, a biodegradabilidade prevista da matéria orgânica, durante um ano de monitorização,

apresentou valores iguais ou superiores a 0.5, com exceção de três períodos.

4.1.3. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (PH, SST, SSV)

Na Figura 4.3 apresenta-se a evolução anual dos parâmetros pH, SST e os SSV à entrada

da ETAR.

À entrada na ETAR apresentou pH entre 6 e 9 na escala de Sörensen, não necessitando de

acerto de pH. Deste modo, a água residual à entrada já se encontrava no intervalo de pH, com a

concentração de iões de hidrogénio. Ou seja, águas residuais fora deste intervalo são extramente

difíceis de tratar através de meios biológicos (Metcalf et al., 2003).


60

Figura 4.3 – Resultados relativos a um ano de monitorização semanal da água residual bruta, pH e a concentração de SST

em mg L-1.

Contudo, na Figura 4.3 observam-se 4 dias em que o pH da água residual à entrada da

ETAR atinge valores superiores a pH 9. Estas oscilações podem ser devidas aos produtos de

lavagens mais alcalinos presentes no efluente doméstico. Outra possível razão para o elevado valor

de pH pode ser atribuído à chegada de efluente da tinturaria, uma vez que esta utiliza produtos

químicos para os seus processos, como o branqueamento e tingimento, traduzindo-se em

alterações das propriedades físicas e químicas do efluente. A utilização de carbonato de sódio,

cloreto de sódio, soda cáustica, hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio, provoca uma

elevação do pH da água residual de neutro para alcalino.

Quanto aos SST à entrada da ETAR de Penices, o seu valor é muito variável, sendo que o

valor mais baixo foi de 45 mg L-1 e o mais elevado foi de 3 570 mg L-1. Segundo

Metcalf et al., (2003), as concentrações típicas dos SST no efluente doméstico encontam-se na

gama de (120 – 400) mg L-1, para efluente têxtil, os SST rondam uma média anual de

93.4 mg L- 1 , com um máximo diário de 860 mg L- 1. Comparando estes valores típicos com os

obtidos na monitorização anual da ETAR, em média, eles aproximam-se normalmente do máximo

diário da industria têxtil e, por vezes, ultrapassam esse mesmo valor. Após a entrada do efluente

na ETAR, os sólidos suspensos são removidos parcialmente, os restantes prosseguem para o

tratamento secundário. Parte deles é matéria orgânica residual que permanece na forma solúvel

ou em suspensão (Ferreira et al., 1998).

5. CONCLUSÕES

61

4.1.4. ÁGUA RESIDUAL BRUTA (P, N, AZOTO AMONIACAL)

Na Figura 4.4, encontra-se a concentração de alguns nutrientes presentes na água residual

à entrada da ETAR, de acordo com a monitorização anual.

Figura 4.4 – Resultados relativos a um ano de monitorização semanal da água residual bruta, relativamente à concentração dos

nutrientes azoto total e fósforo total representados por (CN) e (CP), respetivamente, e o azoto amoniacal (CN – NH4+) nas

unidades mg L- 1.

Pela observação da Figura 4.4, verifica-se que na entrada de afluente bruto à ETAR há uma

elevada concentração de nutrientes. O azoto e o fósforo apresentaram valores mais elevados do

que o normal, comparando com os valores da Tabela 2.1 emitida pela APA, de acordo com a qual

a água residual bruta apresenta os valores típicos de P igual a 12 mg L-1 e de N igual a 70 mg L-1.

Comparando os valores do fósforo total com os dados bibliográficos de Mara et al., (2003),

os quais variam entre (10 – 30) mg L-1, os valores obtidos à entrada da ETAR para este nutriente

encontra-se dentro dessa gama, mas muitas vezes são inferiores ao esperado para este tipo de

efluente. Quanto ao azoto, segundo Metcalf et al., (2003) e Bitton, (1999), este varia entre os

(20 – 85) mg L-1. Comparando com os valores obtidos à entrada da água residual na ETAR, estes

excedem na maioria das amostras.


62

4.2. ANÁLISE DA MONITORIZAÇÃO ANUAL DA ÁGUA RESIDUAL TRATADA DA

ETAR

4.2.1. ÁGUA RESIDUAL TRATADA (PH, CQO, CBO5)

Na Figura 4.5 é apresentada a caracterização do efluente tratado em termos de CBO5 e

CQO e pH.

Figura 4.5 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual tratada, sendo apresentada a concentração da

carência biológica de oxigénio, representado por CBO5 em mg L-1, a concentração da carência química de oxigénio representado

por CQO em mg L-1 e pH.

Como se pode observar na Figura 4.5, os parâmetros monitorizados semanalmente

cumprem com a legislação. Também com a licença de descarga, os resultados cumprem com os

valores presentes na Tabela 2.1 CBO5 inferior a 25 mg L-1 e CQO inferior a 125 mg L-1.

Em relação à água residual bruta, obtém-se uma média de remoção da CQO em cerca de

95 %, enquanto a percentagem de remoção da CBO5 ronda os 98 %. Ou seja, a matéria orgânica

é degradada biologicamente muito facilmente, já que na sua maior parte corresponde a SSV como

se pode observar na Figura 4.3.

4.2.2. ÁGUA RESIDUAL TRATADA (P, N, SST)

Na Figura 4.6 encontram-se os valores obtidos para o N e para o P, bem como para os SST,

5. CONCLUSÕES

63

presentes na água residual tratada.

Figura 4.6 – Resultados de um ano de monitorização semanal da água residual tratada, relativamente aos nutrientes azoto total e

fósforo total representado por (CN) e (CP) respetivamente e os sólidos suspensos totais (SST) expressos em mg L-1.

Pela observação da Figura 4.6, foram detetados picos acentuados para os nutrientes fósforo

e azoto. Os picos obtidos na água residual tratada, comparados com os valores obtidos na

Figura 4.2 e Figura 4.4, podem dever-se provavelmente à entrada de água residual com excesso

de matéria orgânica e nutrientes. Por outro lado, o tratamento biológico para a remoção de

nutrientes pode não ter funcionado corretamente, deixando escapar alguns desses nutrientes para

o meio hídrico. A licença de descarga emitida pela APA não contempla valores limites para o

P e N, pelo que não é objetivo a remoção destes elementos.


64

4.3. MONITORIZAÇÃO ANUAL CANAL ANÓXICO

4.3.1. ALIMENTO / MICRORGANISMOS (A/M) E SÓLIDOS (SSV)

A razão entre a quantidade de matéria orgânica disponível para os microrganismos e a

quantidade de sólidos voláteis no canal anóxico está representada pela relação (A/M), em que (A)

é o alimento, isto é, a CBO5 presente na água residual bruta, e (M) os microrganismos, ou seja,

os SSV existentes no licor misto. Na Figura 4.7, observa-se a variação da alimentação de acordo

com os microrganismos presentes no canal anóxico (A/M).

Figura 4.7 – Resultados de um ano de monitorização com amostragem semanal do canal anóxico. Representação gráfica da taxa

(A/M), alimento para os microrganismos, correspondendo os microrganismos aos sólidos suspensos voláteis (SSV).

Como se pode observar na Figura 4.7, a razão A/M no canal anóxico mantém-se

normalmente acima dos 0.04 g g-1d-1 e abaixo dos 1 g g-1d-1. É importante que os valores deste

quociente se mantenham dentro da gama de (0.04 a 1) g g-1d-1 de substrato por biomassa

(Metcalf et al., 2003), porque nestas condições os microrganismos aglomeram-se, ocorrendo uma

boa floculação, facilitando a sedimentação. Caso contrário, podem sair juntamente com a água

residual já tratada para o meio recetor, poluindo-o (Cavaleiro et al., 2009; Bitton, 1999).

Na Figura 4.7, existem 3 amostras que se encontram fora dos limites deste intervalo. No

início de novembro de 2014, uma amostra encontra-se abaixo do limite inferior, com 0.01 g g- 1 d- 1,

valor afetado pela baixa concentração de CBO5. Por outro lado, outras duas amostras, uma em

5. CONCLUSÕES

65

janeiro e a outra em fevereiro, encontram-se acima de 1 g g-1 d-1 devido à elevada concentração de

CBO5 (superior a 1 500 g m-3) na água residual de entrada na ETAR e à uma diminuição dos sólidos

suspensos voláteis no canal anóxico.

Assim, quando a taxa de (A/M) é alta, os microrganismos estão na sua fase exponencial de

crescimento, mas nestas condições não floculam, encontrando-se geralmente dispersos, o que

torna difícil a sua sedimentação (Nicolau et al., 2002).

Por outro lado, quando a taxa de (A/M) é baixa, os microrganismos estão submetidos a um

ambiente de limitação de substratos e o seu metabolismo decresce até atingir a fase endógena,

ocorrendo a oxidação total da matéria orgânica, o que resulta em boas características de

sedimentabilidade (Nicolau et al., 2002).


66

4.4. MONITORIZAÇÃO DO CANAL ANÓXICO DURANTE 30 DIAS

4.4.1. TEMPERATURA (T) E PH

A temperatura e o pH são determinantes no funcionamento de sistemas de tratamento

biológico, pois estes parâmetros afetam as atividades metabólicas da população de

microrganismos (Metcalf et al., 2003).

Em relação à monitorização do pH e T do licor misto no canal anóxico, as leituras destes

parâmetros eram realizadas no local da recolha da amostra. A Figura 4.8 apresenta os valores

obtidos para a monitorização do pH e T.

Figura 4.8 – Resultados da monitorização do canal anóxico durante o tempo (t) de amostragem em dias (d), quanto ao pH (na

Escala de Sörensen) e à temperatura (T) em °C.

Durante do período de monitorização, entre 12 de junho e 11 de julho, o pH do licor misto

apresentou-se estável com uma variação entre 7.35 e 7.98 sendo o valor médio de (7.68 ± 0.16),

como se pode verificar no gráfico da Figura 4.8.

Quanto à temperatura, esta já presentou uma maior variação devido à alteração da

temperatura ambiental ao longo do dia. A temperatura variou entre 20.8 °C a 27.3 °C, com o

valor médio de (24.5 ± 1.5) °C.

5. CONCLUSÕES

67

4.4.2. POTENCIAL REDOX (ORP)

Este reator biológico tal como se referiu anteriormente é operado em sistema anóxico, isto

é, caracterizado por um ORP baixo, ou seja, com valores variáveis entre (-100 a 50) mV. Embora

os valores obtidos na monitorização aproximam-se muitas das vezes dos -250.0 mV, valor típico

para um sistema anaeróbio. Os reatores que operam em condições de anaerobiose estrita, os

organismos são muito sensíveis à exposição ao oxigénio. Para ocorrer a produção de metano, seria

necessário um ORP ótimo entre (- 530 a - 520) mV, sendo limitante a valores superiores a

- 350 mV. Contudo, neste tipo de meio há bactérias facultativas que consomem o oxigénio

proveniente da alimentação do reator. As bactérias anaeróbias existem em comunidades

estruturadas (e.g., grânulos, flocos), em que as células exteriores são responsáveis pela criação

de uma zona anóxica ou anaeróbia, protegendo a zona mais sensível (Mara et al., 2003). Na

Figura 4.9, apresenta-se a evolução do ORP no canal anóxico durante o período de 30 dias.

Figura 4.9 – Resultados da monitorização da evolução do ORP no canal anóxico durante o período de amostragem, em unidades

(mV).

Na Figura 4.9, verifica-se que o ORP varia bastante ao longo tempo. Estas situações são

esperadas em sistemas anóxicos, que são influenciados por vários fatores, como a pluviosidade

ou a dissolução do O2. O ORP variou entre os valores de (-387.2 a 8.7) mV, sendo o valor médio

de (-199.4 ± 101.6) mV. Os valores de ORP enquadram-se no estado de anaerobiose, que

proporcionam condições para que as bactérias libertem fósforo para o meio ambiente e acumulem


68

PHA (Mara et al., 2003). A manutenção do sistema anóxico na ETAR, origina frequentemente

maus odores. Com um ORP de cerca de -200 mV, as bactérias redutoras de sulfato desenvolvem-

se Figura 4.10. A redução do sulfato ocorre a um ORP dentro do intervalo de (- 200 a - 300) mV,

dependendo dos intervalos de valor 6.5 ≤ pH ≤ 8.0 como se verificar na Figura 4.10.

Figura 4.10 – Gráfico retirado da fonte (Mara et al., 2003), onde são demostradas as variações do efluente em relação a

concentração de oxigénio dissolvido e potencial redox.

4.4.3. PLUVIOSIDADE (P)

A Figura 4.11 representa a P durante o tempo de amostragem. Verifica-se alguma P, nos

dias 2, 3 e 8, de monitorização podendo-se, assim, prever alguma entrada de águas pluviais no

sistema de tratamento, diretamente nos próprios canais de arejamento ou através de infiltrações

nos intercetores gravíticos da água residual.

Comparando os resultados obtidos apresentados nas Figuras 4.9 e 4.11, a evolução do

ORP com a P e verifica-se que estão interligados. Após 1 dia de P é visível a alteração no sistema

de tratamento biológico, onde o ORP tende a subir.

5. CONCLUSÕES

69

Figura 4.11 – Resultados da pluviosidade relativa aos 30 dias de amostragem, a qual é mediada através de um pluviómetro.

4.4.4. OXIGÉNIO DISSOLVIDO (OD)

A Figura 4.12, é relativa à concentração de OD no canal anóxico.

Figura 4.12 – Resultados da concentração de oxigénio dissolvido (OD), em unidades (mg L-1) durante o período de tempo de

amostragem (t) em dias (d).

Previa-se que a concentração de OD fosse quase nula, e esta apenas variava com o efeito

da temperatura, pelo que temperaturas mais baixas facilitam a dissolução do oxigénio (Metcalf et

al., 2003). Verificou-se que em períodos de significativa pluviosidade, há entrada de água residual


70

mais diluída, devido a infiltrações de água pluvial nas redes de saneamento, as concentrações de

oxigénio dissolvido como se pode verificar na Figura 4.12, aumentavam em resposta.

4.4.5. CONDUTIVIDADE (EC)

A condutividade elétrica no canal anóxico, Figura 4.13, indica a capacidade de permitir a

passagem de corrente elétrica no licor misto graças aos iões em solução (salinidade). Este valor

medido (EC) pode ser usado como uma medida substituta da concentração total de sólidos

dissolvidos (TDS) (Metcalf et al., 2003). Embora no caso da utilização desta possibilidade, seria

necessário para cada situação a determinação da relação entre a EC e TDS.

Assim com a condutividade é possível obter a concentração de SDT através da próxima

Equação 1 (Metcalf et al., 2003), então, também seria possível calcular os SST Equação 2. Como

os SDT correspondem a iões, estes acabam por não interferir na produção de PHA.

gL = �� × . a . (Equação 1)

gL = gL − gL (Equação 2)

Figura 4.13 – Resultados da condutividade (EC), em unidades (mS cm-1) durante o período de amostragem (t) em dias (d).

Na Figura 4.13, pode-se observar uma elevada condutividade, isto devido às caraterísticas

do efluente industrial. Parte destes sais, podem ser provenientes da tinturaria/lavandaria, a qual

5. CONCLUSÕES

71

utiliza sal para a fixação do corante ao tecido, aumentando, deste modo, a quantidade de iões no

efluente.

4.4.6. SÓLIDOS TOTAIS (ST) E SÓLIDOS VOLÁTEIS TOTAIS (SVT)

Nesta monitorização, foi efetuado um controlo de processo sobre a concentração de ST e

de SVT. Não foram considerados os sólidos SST e os SSV, embora estes também tenham sido

analisados em algumas amostras, com valores próximos aos ST e SVT. Por este motivo com intuito

de reduzir o tempo para a realização dos ensaios e pela falta do material requerido, optou-se

apenas por se realizar, nos 30 dias de amostragem, os ST e SVT presentes na Figura 4.14.

Figura 4.14 – Resultados da concentração de sólidos totais (ST) e sólidos voláteis totais (SVT) em unidades (g L-1) durante o período

de tempo de amostragem (t) em dias (d).

De acordo com os resultados obtidos, a média da concentração de ST foi de

(4.04 ± 0.06) g L-1 e de SVT foi aproximadamente (2.23 ± 0.03) g L-1, durante os 30 dias de

monitorização, com variabilidade inferior a 10 % e 3 %, respectivamente. Em relação à

concentração de SST no reator, rondou os (3.32 ± 0.03) g L-1 e a concentração de SSV foi de

(2.53 ± 0.02) g L-1. Em conclusão no reator, mais de 55 % dos ST são voláteis, ou seja,


72

biodegradáveis.

Por outro lado, poder-se-á ter em conta as análises do laboratório interno, embora as

análises sejam apenas de 8 em 8 dias. As amostras que vão para o laboratório interno são

retiradas todas as terças feiras, portanto, os dias para esta comparação são 16, 23 e 30 de junho

e 7 de julho, como representado na análise do canal anóxico na Figura 4.7. Os valores obtidos

para os SSV nesse gráfico são, respetivamente, 1.81 g L-1, 2.00 g L-1, 1.44 g L-1, 2.17 g L-1. Os

valores obtidos para sólidos SVT foram respetivamente para os mesmos dias de operação

(2.07 ± 0.02) g L-1, (1.92 ± 0.01) g L-1, (2.21 ± 0.07) g L-1 e (2.22 ± 0.05) g L-1. Assim, pode-se

avaliar que aproximadamente, 90 % dos SVT são SSV, pelo que apenas no dia 23 de junho ocorreu

uma diferença negativa entre a amostra recolhida para o laboratório interno com os sólidos

monitorizados em laboratório para o estudo. Esta diferença pode ser indicativa de uma colheita de

amostra muito à superfície, apenas a 1 m de profundidade, ou devido à má homogeneização antes

da determinação.

5. CONCLUSÕES

73

4.5. OBSERVAÇÃO E CONTAGEM MICROSCÓPICA – IBL

4.5.1. CANAL ANÓXICO

No canal anóxico o IBL não é aplicável, pois este método de avaliação da caracterização

dos microrganismos, apenas se aplica em sistemas de lamas ativadas (sistemas arejados). Na

comunidade macrobiótica da biomassa verifica-se pouca diversidade e densidade de protozoários.

Durante a contagem foram observados protozoários Epistyles, Acineria e como protozoários

dominantes, os pequenos flagelados. Nas lamas ativadas os pequenos flagelados heterotróficos,

são muito comuns e numerosos, normalmente presentes em lamas fortemente carregadas (cargas

superiores de CBO5 a 0.9 kg kg-1 por SSV dia). Esta visualização neste caso é perfeitamente

aceitável visto que temos a entrada de água residual apresenta, por vezes, uma carga orgânica

elevada devido à proveniência do matadouro.

4.5.2. IBL DO CANAL AERÓBIO

A contagem microscópica do canal aeróbio, para a determinação do IBL é apontada na

Tabela 4.1 na biomassa presente, a microfauna não apresenta grupos dominantes. Neste caso,

como a percentagem de ciliados móveis de fundo + sésseis é muito próxima, esta determina a

entrada na Tabela 3.1.

No canal aeróbio, o IBL foi calculado de acordo com o método proposto por Madoni, em

1994, usando-se para isso a Tabela 3.1 e Tabela 3.2 para obtenção do índice, apresentando um

valor de 7, pelo que pertence à classe de qualidade II, indicando lamas bem colonizadas e estáveis

uma atividade sub-otimal e uma eficiência depuradora suficiente, e apresenta também uma

relativa baixa densidade e diversidade (Madoni, 2004). Embora este valor IBL seja relativamente

alto, muito devido a alguma resistência de alguns indivíduos.

4.5.3. PRINCIPAIS PROTOZOÁRIOS / METAZOÁRIOS OBSERVADOS

Durante a contagem deste canal aeróbio foram detetadas os seguintes protozoários:

Acineria, Chilodonella, Epistyles e Vorticella convallaria, e, quanto aos metazoários, os rotíferos


74

digononta. Durante 5 meses foram observados os microrganismos das lamas ativadas do 2º canal,

embora a avaliação do IBL só tenham sido realizado no 5º mês.

Tabela 4.1 – Relatório da observação da microfauna do canal aeróbio para determinação do IBL. Como a microfauna não apresenta

grupos dominantes, neste caso sendo a percentagem nos ciliados móveis + sésseis mais ou menos igual então a entrada na

Tabela 3.1.

Taxa Em 25 µL Nº indivíduos mL-1 %

Ciliados móveis de fundo

Acineria 15 600 46

Chilodonella 1 40 3

Ciliados sésseis

Vorticella convallaria 4 160 12

Epistylis 9 360 27

Rotíferos

Rotífero digononta, Philodina sp 2 80 6

Rotífero digononta, Habrotrocha sp 2 80 6

Total de microfauna 33 1320 100

Pequenos flagelados 8

Ciliados móveis de fundo 16 640 49

Ciliados sésseis 13 520 39

Rotíferos 4 160 12

Grupo dominante: Ciliados móveis de fundo + sésseis

Densidade total: > 106 L-1

Número total de taxa: 6

Pequenos flagelados: <10

IBL: 7

Classe de qualidade: II

Vários indivíduos que foram detetados em grande abundância, no início da monitorização,

ao longo dos meses de observação encontravam-se com menos frequência. Os protozoários que

quase desapareceram eram bons indicadores da eficiência da biomassa. Esta variação de

protozoários na biomassa pode ser devida a vários fatores extrínsecos à afluência de água residual.

Um exemplo, destes fatores é a temperatura ambiente que aumentou e o oxigénio que tem maior

dificuldade em dissolução, diminuindo, assim, a sua concentração presente no meio.

Outros indivíduos continuam presentes na biomassa, embora em baixa frequência, como

os ciliados sésseis, a Epistylis sp, presente na Figura 4.17 (a) e (b), ao contrário do início, que se

encontravam em grande quantidade. Por outro lado, acabaram por desaparecer os ciliados móveis

5. CONCLUSÕES

75

de fundo, a Aspidisca cicada, na Figura 4.15 (a) e (b), e a Aspidisca lynceus, na Figura

4.16 (a), (b).

Figura 4.15 – Aspidisca cicada imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação 100× na imagem (a) e 400× na imagem (b).

Figura 4.16 – Aspidisca lynceus imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação a 400× na imagem (a) e (b).

Figura 4.17 – Epistylis sp imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação 100× na imagem (a) e 400× na imagem (b).

(a) (b)

(a) (b)

(a) (b)


76

Ao mesmo tempo que desapareceram algumas espécies de protozoários, surgiram outras

não observadas no início da monitorização tais como as amibas nuas e flagelados médios, como

se observa na Figura 4.18.

Figura 4.18 – Na imagem (a) encontra-se uma amiba nua, e na imagem (b) visualiza-se um flagelado com a ampliação 200×.

Durante as observações microscópicas da microfauna, detetou-se diferentes tipos de flocos.

Assim, durante a monitorização foi possível a observação de flocos com estrutura compacta e

flocos de estrutura porosa com muitas bactérias filamentosas de difícil sedimentação

(Figura 4.19).

Figura 4.19 – Na imagem (a) encontra-se flocos regulares, e na imagem (b) visualiza-os flocos com excesso de bactérias

filamentosas com a ampliação 100×.

Embora esporadicamente, observou-se também agregados de bactérias filamentosas. Na

ETAR não foi detetado bulking filamentoso ou outro problema associado ao excesso de

filamentosas.

(a) (b)

(a) (b)

5. CONCLUSÕES

77

Além das bactérias e protozoários, nas lamas ativadas estão também presentes os rotíferos

e nematodos. Os rotíferos atuam sobre as partículas em suspensão, consumindo as bactérias

dispersas, contribuindo para a sedimentação e favorecendo a agregação de flocos. Os nematodos

encontram-se com menos frequência na microfauna presente no sistema de lamas ativadas, sendo

a sua presença é limitada pelo tempo de retenção. Nas Figura 4.20 (a, b) e Figura 4.21 (a) estão

presentes duas espécies de rotíferos, enquanto a Figura 4.21 (b) apresenta um nematodo presente

no canal aeróbio.

Figura 4.20 – Nas imagens (a, b) é visível um rotífero digononta, Habrotrocha sp imagens obtidas durante este trabalho, com

ampliação 100× na imagem (a) e 400× na imagem (b).

Figura 4.21 – Na imagem (a) identifica-se um rotífero digononta, Philodina sp e na imagem (b) está representado um nematodo

imagens obtidas durante este trabalho, com ampliação a 100× na imagem (a) e (b).

Um sistema de lamas ativadas eficiente apresenta características de elevada densidade de

microfauna (≥106 organismos L-1), onde na sua maioria é composta por móveis de fundo e sésseis

com uma baixa frequência de flagelados. Quando estas condições não são observadas, o grupo

(a) (b)

(a) (b)


78

dominante dá indicação para o diagnóstico do funcionamento do sistema. Por exemplo, com

grupos dominantes, como os pequenos flagelados, a eficiência é má e as causas possíveis podem

ser lamas pouco oxigenadas e/ou entrada de substâncias em vias de fermentação. Quando se

observa grande frequência de amibas nuas e flageladas, indica uma má eficiência devido à carga

elevada e/ou dificilmente degradável. Quanto aos pequenos ciliados nadadores, estes indicam

uma eficiência de tratamento medíocre, devido ou à permanência breve das lamas, devido a lamas

pouco oxigenadas ou ainda devido a cargas demasiadamente altas. Quando o grupo dominante

são ciliados móveis de fundo ou associados aos ciliados sésseis, as lamas ativadas têm uma boa

eficiência (Nicolau et al., 2002). Pelas observações realizadas à microfauna do canal aeróbio, esta

apresenta microrganismos que conferem à água residual, que está a ser tratada, uma boa

remoção da matéria orgânica. Como já demonstrado por Nicolau et al., (2002), em que todos os

ciliados bacterívoros criam uma corrente ciliar que direciona as bactérias suspensas na fração

líquida para a sua boca, onde são filtradas.

Durante a monitorização do canal aeróbio (sistema tradicional de lamas ativadas) observou-

se que os nadadores e os sésseis estão em competição pelas bactérias em dispersão na fração

líquida, enquanto os móveis de fundo situados muito próximos da superfície do floco, acabando

por se alimentar das bactérias que estão agarradas ao floco. Como já foi demonstrado noutros

estudos, como o de Madoni, (1994) e Nicolau et al., (2002), a presença de protozoários ciliados

como se observaram neste reator biológico aeróbio, melhoram a qualidade do efluente através da

predação de bactérias dispersas que entram continuadamente no efluente, obtendo-se uma água

residual tratada clarificada após decantação no sedimentador.

No canal anóxico usado para o estudo da acumulação de PHA, verifica-se pouca frequência,

de protozoários ciliados, bem como a quase ausência dos protozoários em comparação ao canal

aeróbio, devido à falta de arejamento, observando-se grande densidade de pequenos flagelados.

Ou seja, o efluente neste canal é caracterizado por uma elevada CBO5 e alta turbidez. No reator

anóxico, a água residual é sujeita a um pré-tratamento biológico para redução de matéria orgânica,

cor e nutrientes antes da entrada no reator aeróbio onde a turbidez é posteriormente removida.

5. CONCLUSÕES

79

4.6. ANÁLISE PRELIMINAR DA PRESENÇA DE PHAS NA ETAR

4.6.1. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DOS LOCAIS PARA ACUMULAÇÃO DE

PHA

A CG foi efetuada para quantificar os PHAs em diversos pontos de recolha na ETAR, de

modo a confirmar a presença deste polímero intracelular, bem como as possíveis quantidades

existentes (Figura 4.22). As áreas obtidas encontram-se no Anexo VI.

Figura 4.22 – Concentração de PHA l nos vários locais de recolha na ETAR, seguindo a sua identificação: 1 e 2 canal anóxico

próximo do local de entrada (inicio do tratamento biológico), 3 e 4 canal anóxico ao final do reator biológico na ausência de O2, e

perto da entrada para o reator aeróbio, 5 e 6 canal aeróbio, 7, 8, 11, 12 amostras retiradas da recirculação, 9 e 10 amostras

retiradas junto aos descarregadores (fechados) e por último 13 e 14 amostras retiradas no canal aeróbio antes da descarga para

os decantadores secundários e a amostra 15 corresponde às lamas desidratadas.

Como se pode verificar na Figura 4.22, a presença deste polímero foi confirmada, embora

em pequenas quantidades, pelo que a quantidade máxima atingida foi de 0.03 mg mg-1. Quando

comparado com os resultados de vários estudos mencionados na literatura, o valor obtido é muito

inferior ao previsto como, por exemplo, 0.28 mg mg-1 de (Pittmann et al., 2014), 0.59 mg mg-1 de

(Jia et al., 2014) e 0.77 mg mg-1 (Jiang et al., 2012), entre outros estudos descritos na Tabela 2.4.

Por observação da Figura 4.22, o canal anóxico apresenta resultados mais elevados em


80

relação ao canal aeróbio. Estes resultados podem ser explicados pelo metabolismo microbiano

das comunidades, uma vez que é na fase anaeróbia, que ocorre o armazenamento do PHA. É

possível ainda verificar que na recirculação foram obtidos resultados idênticos. A amostra 12 não

corresponde a esse padrão, talvez pelo maior tempo de recirculação ou de falhas no procedimento

laboratorial.

Relativamente à fração encontrada de PHB e PHV, existem algumas variações. O canal

aeróbio, tratando-se de uma zona arejada na qual ocorre a nitrificação, demonstra que ainda é

acumulado PHB, embora em quantidade residual, sendo o PHV é basicamente nulo. Assim,

demonstra-se que grupos distintos de populações microbianas, presentes em culturas mistas,

podem gerar PHA com composição de copolímero diferente.

O presente estudo tem algumas particularidades que o diferencia de outros já realizados.

Pretende-se encontrar a sustentabilidade do processo com o aproveitamento de um subproduto,

presente na ETAR. Na consulta de vários artigos de estudos efetuados com culturas mistas para a

produção de PHA, verificou-se que são normalmente utilizados reatores piloto com efluentes

sintéticos. O efluente real nunca é exatamente igual e os seus parâmetros variam sempre ao longo

do tempo.

Este estudo teve como objetivo a avaliação do processo contínuo num reator biológico à

escala industrial, com o intuito de aproveitar um subproduto. Deste modo, foram mantidas as

condições habituais de tratamento das águas residuais neste tipo de processo, ou seja, não foram

proporcionadas condições de favoráveis à produção deste polímero intracelular. Normalmente os

parâmetros alterados para promover a acumulação de PHA são o pH, a temperatura e a adição

de substratos, como o acetato, o propionato e o butirato, os quais implicam custos associados ao

processo. Outras investigações têm sido realizadas em reatores com diferente tipo de operação,

como o reator descontínuo sequencial (SBR). Neste estudo, trata-se de um reator contínuo em que

não existe uma fase anaeróbia total, mas sim uma fase anóxica. Existem, portanto, vários fatores

que podem prejudicar ou implicar a produção de PHAs.

5. CONCLUSÕES

81

4.6.2. DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PHAS EM PROFUNDIDADE DO

CANAL ANÓXICO

Após a escolha do melhor local de amostragem, recolheram-se amostras em várias

profundidades com um amostrador automático. O canal tem 3.3 m de profundidade. Foram

recolhidas amostras nas seguintes profundidades: 2.5 m, 2.0 m, 1.0 m e a 0.5 m. Para cada

amostra, foram determinadas as concentrações de SVT e de PHA através do CG. Na Figura 4.23

encontram-se os respetivos resultados, da quantidade de SVT e da acumulação de PHA l.

Figura 4.23 – Gráfico relativo à fração mássica de PHA l e de SVT das amostras coletadas no canal anóxico em várias profundidades

(h), expressas em metros (m).

Na Figura 4.23, apresenta-se a evolução da concentração de SVT ao longo da profundidade

do canal bem como a influência que esta pode ter sobre a produção de PHA l. Segundo a

Figura 4.23, existe uma alteração mínima da concentração de SVT ao longo da profundidade do

canal, variando entre (2.36 ± 0.03 e 2.33 ± 0.01) g L-1.

Segundo os resultados obtidos, não há interferência dos SVT na produção de PHA l já que

a amostra retirada a 2.5 m com os SVT mais elevados acaba por ter uma fração mássica de 0.06,

inferior à obtida na amostra retirada a 2.0 m, acabando por descer à medida que se diminui a

profundidade.


82

4.7. MONITORIZAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PHA

4.7.1. PHA DETERMINADO POR CROMATOGRAFIA GASOSA

A Figura 4.24 mostra o comportamento da concentração de PHA l (soma de PHB com PHV),

durante o período de monitorização. Em relação aos resultados obtidos, pela análise de

cromatografia gasosa, no final da fase anóxica, verifica-se que as frações mássicas de PHA mais

elevadas foram alcançadas aos 22 dias de monitorização, com a concentração de PHA l igual a

0.053 mg mg-1.

Figura 4.24 – Concentração de PHA l relativa ao canal anóxico nos 30 dias consecutivos de amostragem em mg mg-1

correspondente à fração mássica de PHA por cada mg de biomassa liofilizada.

Ao longo dos 30 dias de monitorização o PHA variou entre um mínimo de 0.018 mg mg-1 e

um máximo de 0.053 mg mg-1. Verificou-se também que a quantidade de PHB era superior à

quantidade de PHV. Comparando os resultados apresentados na Figura 4.24 com os resultados

da monitorização do ORP da Figura 4.9, ao longo dos 30 dias, verifica-se que quando o ORP

aumenta, a produção de PHA tende a baixar. Os valores obtidos na acumulação de PHA pela

biomassa, encontram-se bem próximos dos valores apresentados por Krasnits et al.,(2013) com

águas residuais sintéticas enriquecidas com acetato (0.07 mg mg- 1) e superou a produção de água

residual real (0.04 mg mg-1). Os resultados atuais aproximam-se dos obtidos por

5. CONCLUSÕES

83

Fidalgo, et al., (2014) onde se efetuou o aproveitamento de residual com bio-óleo resultando

numa produção de PHA de 0.10 mg mg-1. Em relação à maioria dos estudos à escala laboratorial

ou piloto, descritos na Tabela 2.4, este trabalho alcançou as percentagens mínimas de

acumulação de PHA, podendo ser apresentados vários motivos para estes valores. No presente

estudo não foram selecionados microrganismos específicos para elevar a produtividade e

acumulação de PHA. À escala laboratorial é mais fácil o controlo dos parâmetros operacionais de

equilíbrio e de estabilidade de produção de PHA o que não ocorreu neste estudo. Também é

prática comum o enriquecimento dos meios de alimentação (efluentes reais ou sintéticos) com

substratos que favorecem a produção de PHA (ácidos gordos voláteis, entre outros), bem como a

adição de inibidores da nitrificação (aliltiureia) (Johnson et al., 2010a).

As concentrações de PHA foram obtidas após leitura das áreas dos cromatogramas do CG

e calculadas através das curvas de calibração, presentes no Anexo III Figura A.1 e a Figura A.2.

Na Figura 4.25, apresenta-se um dos cromatogramas obtidos durante os ensaios laboratoriais de

uma amostra de biomassa suspensa.

Figura 4.25 – Cromatograma do CG obtido durante o trabalho relativo ao dia 13 de amostragem, dos derivados de ésteres que se

extraíram a partir de uma amostra de lamas ativadas do canal anóxico. Os componentes identificados foram PHB (pico aos

9.547 min), PHV (pico aos 10.119 min) e o ácido benzoico (pico aos 10.798 min) como padrão interno. Os outros picos não

foram identificados.

A identificação dos picos é realizada a partir dos tempos de retenção dos padrões respetivos.

Na curva de calibração do método correlaciona-se a razão entre a área do pico do PHB ou PHV e

a área do pico do padrão interno com a massa de polímero (PHB e PHV) correspondente. Deve-

se ter em conta que o padrão utilizado é uma mistura de PHB e PHV na razão 7:3. Ou seja, quando


84

se utiliza um padrão com a massa de 1 mg, esta contém 0.7 mg de PHB e 0.3 mg de PHV. Como

se pode observar na Figura 4.25, o primeiro pico aos 9.547 min corresponde ao PHB, depois,

aproximadamente, aos 10.119 min, é visível o pico correspondente ao PHV, e, posteriormente,

aos 10.798 min, observa-se o pico associado ao PI. Os outros picos presentes no cromatograma

não foram identificados.

Para o cálculo da concentração mássica da acumulação de PHAS, normalmente são

utilizados os dados relativos aos SSV do reator que correspondem à biomassa ativa. Neste caso

de estudo, considerou-se para o cálculo da acumulação de PHAS, a concentração dos SVT

presentes no Anexo V.

Após obter-se a fração mássica entre o PHA e a biomassa liofilizada, efetuou-se a correlação

entre a concentração de PHA e os SVT como mostra na Figura 4.26.

Figura 4.26 – Gráfico relativo à concentração de PHA na biomassa em (mg L-1) relativa ao canal anóxico nos 30 dias consecutivos

de amostragem.

Segundo os resultados obtidos e presentes na Figura 4.26, verifica-se que a concentração

de PHAS na biomassa é bastante variável ao longo dos dias de monitorização. A concentração de

PHAS tende a aumentar mediante a descida do ORP. Quando o ORP tende a aumentar, também

5. CONCLUSÕES

85

são visíveis oscilações na Figura 4.26, por uma redução da acumulação do PHA pela biomassa.

Assim, como exemplos mais notórios desta correlação, salientam-se os dias 4 e 18 de operação,

quando comparados com a Figura 4.9. Neste gráfico, pode-se observar variações entre um mínimo

de 36 mg L-1 e um máximo de 127 mg L-1, ou seja, atinge uma acumulação média de PHA,

aproximadamente, 90 mg L-1.

Comparando com o estudo realizado por Mesquita et al., (2015), o máximo de acumulação

de PHA foi de 317 mg L-1 de SST. Assim sendo, as quantidades para este tipo de reator contínuo,

bem como as condições operatórias, não são propícias à acumulação de PHA, pelo menos em

grande concentração. Deste modo, foram atingidas apenas concentrações mínimas.

Segundo Chua et al., (2003), o pH também influencia na acumulação de PHA, pelo que a

sua produção ocorre normalmente a valores de pH entre 7 e 8, o que vai de encontro ao pH

verificado durante o estudo. No entanto, esta produção poderia ser estimulada com aumento da

alcalinidade para valores de pH compreendidos entre 8 e 9. Embora, comparando graficamente

as Figura 4.26 e a Figura 4.8 entre a relação da acumulação de PHA e o pH, por exemplo, ao

quarto dia de monitorização o pH é baixo e, consequentemente a concentração de PHA também,

o mesmo já não acontece nos últimos dias do estudo, em que o pH tende a baixar, mas a

acumulação de PHA tende a aumentar.

4.7.2. PHA POR ANÁLISE DE IMAGEM DA COLORAÇÃO NSB

Neste trabalho investigou-se o uso de análise de imagem quantitativa para identificação das

inclusões e quantificação de PHA. A monitorização dos PHAs através da análise de imagem

decorreu durante os 30 dias consecutivos, onde para cada dia avaliou-se 50 imagens.

Como se pode visualizar nas Figura 4.27 (a, b, c, d), tal como descritos pela bibliografia,

após a coloração com NSB, os grânulos da acumulação intracelular foram identificados pela cor

azul enquanto o citoplasma do organismo é corado a vermelho. Em mais de 1 500 imagens obtidas

foi possível visualizar esta situação, embora em algumas amostras apareçam com mais frequência

do que outras. Um dos grandes problemas identificados foram os grandes flocos, que por serem

tão densos, foi quase impossível visualizar uma destas cores, adquirindo a característica cor preta,

dificultando o tratamento de imagem.


86

A metodologia tradicional de coloração de PHAs por NSB pode ser difícil de implementar

devido a um passo de descoloração meticuloso. Esta pode estar limitada também quando se trata

de flocos grandes e densos cuja descoloração poderá ser problemática. O NSB é também usado

para a coloração de lípidos podendo interferir na quantificação dos PHAs. Nesse sentido, a

viabilidade de utilizar o processamento de imagens com a coloração NSB foi avaliada relacionando

os resultados obtidos por este método com os resultados obtidos por cromatografia gasosa.

Figura 4.27 – Imagens de grânulos de PHA (a, b, c, d), após coloração NSB e visualização microscópica em imersão de óleo com

ampliação 1 000×; estas imagens foram obtidas durante o trabalho realizado.

Como se pode observar, os grânulos foram acumulados por vários tipos de bactérias, as

quais se agregavam de forma diferente entre si. Não se procedeu à identificação das espécies

bacterianas devido aos métodos serem muito laboriosos e altamente dependentes da experiência

de reconhecimento. Além disso, a fisiologia de parte das bactérias é ainda desconhecida para

muitas espécies e de difícil obtenção em culturas puras. Na observação microscópica da coloração

NSB, como na Figura 4.27 (d), algumas bactérias filamentosas, eram encontradas frequentemente

e visíveis os grânulos de cor escura, que constituem uma estrutura de reserva.

(a)

(c)

(b)

(d)

5. CONCLUSÕES

87

As bactérias filamentosas podem ser consideradas como parte integrante da comunidade

microbiológica do processo de lamas ativadas. As bactérias filamentosas têm um papel

fundamental na formação de flocos na capacidade de sedimentação. Quando surgem flocos sem

um esqueleto filamentoso ou com crescimento insuficiente, os flocos acabam por perder

resistência a perturbações do meio diminuindo a sua capacidade de sedimentação. Quando, por

outro lado, surgem perturbações no balanço normal da comunidade deste sistema as bactérias

filamentosas podem proliferar, causando problemas como o bulking e o foaming

(Jenkins et al., 1993).

Após a recolha de imagens, fez-se a sua análise com auxílio do programa desenvolvido na

Universidade do Minho. O processamento automático de imagens tem a vantagem de ser mais

expedito que os métodos convencionais onde as análises são trabalhosas, demoradas, e por vezes

não estão adequadas a ser realizadas em ETAR (Mesquita et al., 2013a).

Em relação aos parâmetros da análise das imagens obtidas pela coloração de NSB, os

resultados em termos de área total de PHA encontram-se na Figura 4.28, sendo avaliados os

grânulos pequenos, intermédios e grandes de PHA do canal em condições anóxicas Anexo VII.

Figura 4.28 – Área Total de grânulos de PHA obtidos durante a monitorização da concentração de PHA por análise de imagem.


88

No que diz respeito à distribuição dos grânulos na área total, existe uma maior diferença

nos grânulos pequenos, sendo os grânulos grandes e intermediários os que se encontram em

maior quantidade. Isto pode ser explicado pelo facto de durante esta fase, os microrganismos

envolvidos no processo de conversão de substratos orgânicos em armazenamento intracelular

polímeros (PHA) sob a forma de grânulos estavam em condições anaeróbias. Na Figura 4.28 do

método NSB, observou-se que nos dias 4, 24 e 25 a área de grânulos grandes desce

consideravelmente, em relação aos grânulos pequenos e intermediários. Quando comparada com

as Figuras 4.24 e 4.26, verificou-se que a acumulação de PHA desceu também nesses dias.

Através da análise de imagens, obtidas por microscopia de campo claro da coloração NSB

das amostras de licor misto, foi possível prever a concentração intracelular de PHA utilizando as

ferramentas de estatística multivariável, com o método dos mínimos quadrados parciais (PLS).

Esta análise foi realizada combinando análise de imagem de coloração NSB e os parâmetros

analíticos padrão, fornecidos pela análise de cromatografia gasosa. Os resultados da análise de

imagem parecem ir de encontro aos resultados analíticos do método de CG.

A Figura 4.29 representa a correlação entre as concentrações intracelulares de PHA

previstas (PHA previsto) e observadas (PHA observada), obtidas a partir da análise de PLS ao conjunto

dos dados obtidos na monitorização durante 30 dias do canal anóxico. Note-se que a concentração

de PHA prevista é obtida através da aquisição e análise de imagens da coloração de NSB e o PHA

observado é a concentração obtida pelo método de cromatografia gasosa.

Para os resultados obtidos por análise de imagem quantitativa encontrou-se uma previsão

adequada entre a concentração de PHA medidos e previstos, sendo traduzida pela seguinte

relação: PHA previsto = 0.9962× PHA observado. O coeficiente de regressão (R2) obtido foi de 0.91, ou

seja, muito próximo de 1 e o erro quadrático médio de previsão (RMSEP) foi de 5.65 mg L- 1.

Em comparação com estudos realizados nesta área do modelo de previsão da concentração

de PHA pelos PLS, como Abreu, (2013) em que atingiu um R2 máximo de 0.72 verificou-se uma

melhoria significativa. Para a previsão de Mesquita et al.,(2013b), num conjunto de dados limitado,

obtiveram um valor de R2 igual a 0.84. Por outro lado, quando a amostragem era mais significativa

com análise anaeróbio/aeróbio o coeficiente tende a baixar, mas quando o PLS é aplicado apenas

à fase anaeróbia o valor limite para deteção do PHA intracelular passa a ser, aproximadamente,

5. CONCLUSÕES

89

1 250 mg L-1 obtendo um valor de R2 de 0.50 (Mesquita et al., 2013b), ao contrário deste estudo

em que a máxima aconcentração mássica atingida foi de 127 mg L-1.

Figura 4.29 – Gráfico relativo à monitorização de 30 dias consecutivos das inclusões de PHA através da análise quantitativa de

imagem pela coloração NSB. Relação entre o PHA previsto (concentração de PHA prevista pela análise de imagens quantitativa) e

PHA observado (concentração obtida através da CG).

Comparando com o estudo Mesquita et al., (2015) o valor obtido para o R2 foi de 0.90,

sendo praticamente igual, o que assegura a aplicabilidade desta correlação. Existe uma pequena

diferença, entre o método CG e a análise de imagem, dado pelo coeficiente de correlação, este

desvio, pode ser o resultado de o método da coloração de NSB, ser também compatível com a

coloração de lípidos. Assim, por este método, pode sempre existir na mesma amostra, o

reconhecimento de lípidos e de PHA, em que apenas estes últimos são identificados através de

uma análise por cromatografia gasosa.

Com este estudo, foi possível obter dados reais na ETAR, e validar que através das

concentrações de PHA intracelular obtidas e do coeficiente de correlação, é possível prever,

adequadamente, a concentração de PHA intracelular. Assim, o método de coloração NSB e

processamento de imagem pode ser visto como alternativa à metodologia para determinação de

PHA clássica.


90

4.8. PARÂMETROS OPERATÓRIOS, TEMPO DE RETENÇÃO (TRH), CARGA

ORGÂNICA APLICADA (OLR), PARA A ACUMULAÇÃO DE PHAS

A Tabela 4.2, apresenta uma complicação dos dados operatórios. Resumidamente, a carga

orgânica aplicada ao canal anóxico variou entre (0.50 – 2.09) kg m-3 d-1, com tempo de retenção

hidráulica (TRH) variável mas aproximadamente igual a 1.5 d.

Tabela 4.2 – Dados de caudal (Q) e carência química de oxigénio (CQO) resultante da monitorização da água residual de entrada,

carga orgânica aplicada (OLR) e acumulação de PHA relativamente à monitorização do 1º canal de arejamento (reator anóxico)

Dia Q / (m3 d-1) CQO / (mg L-1) TRH /d OLR / (kg m-3 d-1) PHA / (mg L-1) (PHA/CQO) / (kg kg-1)

5 2 030 3 085 1.48 2.09 83 0.03

12 1 950 984 1.54 0.64 91 0.10

19 2 008 743 1.49 0.50 89 0.12

26 1 777 1 980 1.69 1.17 106 0.05

Os dados relativos à CQO foram obtidos através das análises realizadas semanalmente pelo

laboratório e fez-se a correspondência entre os dados da monitorização da acumulação de PHA.

Observando a Tabela 4.2, a acumulação máxima por cada kg de CQO degradada é cerca de

0.12 kg de PHA, sendo a produtividade próxima de Bengtsson et al., (2008). De acordo com estes

autores, pode-se atingir os 0.11 kg de PHA por cada kg de CQO da entrada de água residual

proveniente do fabrico de papel convertido a ácidos gordos voláteis, como o acetato, o proprionato,

o valerato e o butirato, embora a acumulação de PHA atingisse um máximo de 0.48 g g -1 na

matéria seca de biomassa, aquando da limitação do fósforo com um TRH apenas de 16 h, e uma

CQO de 8 750 mg L-1.

Reis et al., (2003) produziram PHA através do processo “fartura/fome”, utilizando o acetato

como substrato. Neste estudo, foi atingido o equivalente a 0.40 kg kg-1 de PHA por CQO tratada

valor muito superior ao do presente estudo. A sua elevada acumulação de PHA, cerca de

0.57 g g- 1 em matéria seca, foi associada aos dois reatores utilizados no estudo: o plug flow

reactor (PFR) e o continuous stirred-tank reactor model (CSTR).

Quanto ao estudo de Chakravarty et al., (2010), no tratamento de águas residuais de

laticinios em reator contínuo activated sludge production reactor (ASPR) com um TRH de 1.81 d e

com o substrato igual a 3 178 mg L-1 de CQO, atingiram 0.25 kg kg-1 de PHA por CQO degradada.

5. CONCLUSÕES

91

Assim, avaliando os resultados obtidos, a produção de PHA por cada kg de CQO neste

processo é variável, atingindo valores mais elevados quando a carga orgânica aplicada é mais

baixa e descendo a sua produção quando correlacionada com as cargas orgânicas mais elevadas.

Uma explicação possível para esta relação, pode dever-se ao facto do canal anóxico corresponder

num processo “fartura/fome” ao período de abundância. Neste estudo o TRH manteve-se idêntico

em vários dias de operação (cerca de 1.5 d). Quando o sistema é submetido a uma carga orgânica

aplicada elevada o sistema não consegue levar à exaustão do substrato (Reis, et al., 2003), ou

seja, dever-se-ia aplicar um TRH superior para que todo o substrato fosse consumido. Assim com

uma entrada de CQO mais baixa, atinge-se rapidamente a exaustão do substrato ao contrário de

quando o sistema é submetido a uma carga orgânica mais elevada.


92

4.9. VISÃO GERAL PARA O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PHAS

Na Figura 4.30, é apresentada uma visão geral de um processo de produção de PHA. Todos

os processos de produção de PHA consistem num passo de fermentação e num passo de

recuperação, seguido de processamento de polímeros para cada aplicação específica. Em muitos

casos, a fermentação é dividida em duas fases: uma para a produção de biomassa e outra para

acumulação de PHA. Quanto à recuperação de PHA, existem vários métodos, uns à base de

solventes e outros que evitam a sua aplicação.

Figura 4.30 – Visão geral do processo de produção de PHA, consistindo na fermentação, na recuperação e no processamento

mediante a aplicação do polímero (Babel et al., 2001).

Aplicações

Mercadorias

puro, em compósitos ou revestimentos

Especialidades

por exemplo, dispositivos médicos

Recuperação

Base não solvente

*solubilização de biomassa (não - PHA)

*centrifugação e ultrafiltração

Base solvente

*extração de PHA com solventes

*precipitação com metanol/água

Fermentação

Etapa I - produção da biomassa

(proliferação de células sob condições de crescimento equilibrado)

Etapa II - acumulação de PHA

(armazenamento de

polímero sob condições de crescimento limitado em nutrientes)

5. CONCLUSÕES

93

Na Figura 4.31 está representado um exemplo de produção microbiana de PHA, por

fermentação, com recuperação da biomassa para extração baseada no exemplo real da ETAR em

estudo.

Figura 4.31 – Esquema geral do mecanismo da extração da biomassa, já existente na ETAR de Penices. O processo existente

passa pela purga de lamas, espessamento, desidratação e armazenado num silo, tendo como destino final a compostagem por

uma empresa externa de tratamento de resíduos. Deste modo, o destino das lamas constitui um custo adicional associado ao

processo de tratamento de águas residuais.

O método desenvolvido para o estudo de viabilidade de produção de polihidroxialcanoatos

(PHAs), por culturas microbianas mistas teve por base o método descrito na Figura 2.21,

diferenciado em vários passos como a fermentação, a extração e a purificação.

A ETAR já possui um mecanismo de extração, espessamento e desidratação para o

tratamento da linha sólida. A Figura 4.31 mostra um esquema geral desse mecanismo, com a

diferença em que o licor misto extraído é proveniente do canal anóxico (representado na imagem


94

pela reação anóxica). No projeto real, após o tratamento biológico (canal anóxico) a água residual

é encaminhada para um segundo canal onde ocorre a reação anóxica e aeróbia.

Para manter as condições de acumulação de PHA, será impraticável que a biomassa

progrida diretamente ao canal aeróbio, de modo a evitar a nitrificação, reduzindo a fração mássica

de PHA acumulada nos microrganismos. Por outro lado, todo o processo de extração a partir do

decantador, espessamento, desidratação e armazenamento de lamas mantém-se como o

processo existente na ETAR. Esta parte inicial, quanto ao processo de produção e à recuperação

da biomassa para extração, não foi considerada nos custos, uma vez que se trata de um

procedimento diário de purga de lamas.

Etapas do processo de extração e purificação

Após a etapa de fermentação, as células contendo PHA são separadas do licor misto pelo

procedimento convencional, a centrifugação. Em seguida, as células são rompidas para

recuperação do polímero.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para a recuperação do PHA, a maioria das vezes

estes métodos envolvem a extração do polímero a partir da biomassa com solventes

(e.g., clorofórmio, cloreto de metileno, carbonato de propileno, dicloroetano) (Babel et al., 2001).

Após a concentração da biomassa, é necessário um tratamento posterior, no qual o PHB é

purificado num processo de ciclo fechado, extraindo-o através de um solvente orgânico, como o

diclorometano. Para processar o PHB dissolvido, é necessário separar a fase aquosa dos detritos

da biomassa e do precipitado por ação do solvente orgânico. O precipitado é recolhido, separado

e seco em secadores industriais convencionais. O produto final padrão é um pó branco e inodoro.

O precipitado recolhido tem o ponto de fusão a 172 °C e o peso molecular é de cerca de

750 000 g mol-1. A cromatografia gasosa indica que o produto deve ter uma pureza superior a

99 %. O processo incluiu também a recuperação do solvente (Hanggi, 1990).

Projeto de extração e purificação

Para este estudo, foi adotada a produção anual da ETAR de Penices, no ano de 2014,

aproximadamente, igual a 1 630 t o que equivale a cerca de 31.4 t por semana, com teor de

5. CONCLUSÕES

95

matéria entre 18 % e 20 %. O máximo de acumulação de PHA verificado, na análise da

monitorização diária, através da cromatografia gasosa, foi de 0.053 mg mg-1 de PHA por massa

liofilizada, no qual a composição do PHA é de cerca de 56 % de PHB e de 44 % PHV. Sendo

atribuído um preço de referência, para venda, segundo dados bibliográficos (SECOM, 2007)

de 3.5 €.

Na Figura 4.32, acrescentam-se ao tratamento de lamas da ETAR os mecanismos

associados exclusivamente à extração e purificação de PHA, os quais não existem na ETAR. Esta

é a proposta inicial para o estudo da viabilidade da produção de PHA a partir de culturas mistas.

Para a extração de purificação, foi proposto o projeto de uma instalação que fosse capaz de

obter o máximo de PHA acumulado na biomassa proveniente do tratamento do efluente urbano.

O processo proposto encontra-se a jusante da desidratação de biomassa e do seu armazenamento.

Para recolher o PHA acumulado na biomassa, optou-se pelas seguintes operações: extração

sólido – líquido, ultrafiltração, precipitação PHA, secagem do PHA e o seu armazenamento.

Na extração sólido – líquido recorre-se à adição de diclorometano às 5 t h-1 de biomassa na

entrada do extrator. Após este processo surgem duas correntes de saída, sendo um desses caudais

descartado, o qual é constituído principalmente por biomassa, a qual é posteriormente tratada. O

outro caudal possui uma maior quantidade de solvente e de PHA, embora também contenha uma

grande quantidade de água. Após o processo de extração, procede-se à remoção parcial da água,

presente nesta última corrente, através de uma ultrafiltração. Depois destas duas fases de

processamento é necessário precipitar o PHA presente na corrente aquosa, através de um

cristalizador. Além disso, nesta unidade também se procede a uma evaporação do diclorometano,

o qual é posteriormente reciclado para o mesmo processo. Deste cristalizador sai apenas uma

corrente com o PHA precipitado, mas com alguma presença de água, seguindo para um secador

onde é removida a restante humidade. Obtém-se assim o PHA seco que é posteriormente

armazenado.

O diagrama de fluxo do processo de extração e de purificação de PHA apresentado realizou-

se no SuperPro Designer®, bem como os custos associados a este processo. Para a simulação

do projeto da extração de PHA, considerou-se um caudal de entrada de biomassa,

aproximadamente, de 5 t h-1, obtendo-se no final do processo 13 kg h-1 de PHA pronto para venda.


96

Figura 4.32 – Esquema geral do mecanismo da extração e purificação de PHAs, para a ETAR de Penices, esboço realizado

através do SuperPro Designer®.

O investimento em capital necessário para contruir esta instalação é 5 506 000 € e os

custos de operação anuais que lhes são inerentes são 3 454 000 €, os quais correspondem

principalmente aos custos de mão-de-obra, aos custos de manutenção da instalação e aos custos

de tratamento e deposição em aterro da biomassa representando, respetivamente, 24.54 %,

27.48 % e 41.09 % do total.

Os principais indicadores económicos, o valor atual líquido (VAL), à taxa de juro de 7 %, e a

taxa interna de rentabilidade (TIR), foram determinados para este projeto, sendo obtido valor

negativo para o VAL, e não há TIR. Como o VAL é negativo, o investimento não gera cash- flows,

pelo que a recuperação do valor investido não é possível. Ou seja, este projeto, nas condições em

que foi elaborado, não gera lucro o que não o tornando economicamente atrativo e viável. Esta

inviabilidade devesse a vários fatores, como por exemplo, o elevado investimento inicial para uma

baixa produtividade de PHA, aos custos de operação devido principalmente aos custos associados

ao tratamento e deposição de lamas em aterro.

5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA

TRABALHOS FUTUROS


98

A ETAR de Penices apresentou grandes variações diárias de caudal durante o ano, devido

em parte à pluviosidade que tende a duplicar o caudal diário, variando entre os

1 000 m3 e 2 000 m3. O caudal diário depende também do tempo e dias de laboração das

indústrias servidas de tratamento de águas residuais.

No caso do pH à entrada da ETAR, variou entre 6.85 e 9.38 escala de Sörensen, ajudando

deste modo a manter o pH dentro do reator biológico entre 7 e 8, privilegiando as atividades

metabólicas dos microrganismos, consequentemente, acumulando PHA.

Durante os 30 dias em que se monitorizou a CQO variou entre 743 mg L-1 e 3 085 mg L-1,

tendo sido verificado também que parte dos sólidos suspensos totais são na sua maioria voláteis,

quer nas análises realizadas à entrada da água residual, quer no reator biológico. Por outro lado,

a razão , assumiu valores superiores a 0.5, indicando uma boa biodegradabilidade da água

residual e elevada taxa de sucesso no tratamento por processos biológicos.

Relativamente aos nutrientes existentes à entrada do reator biológico, no período de

monitorização da acumulação de PHA, obteve-se 7.2 mg L-1 a 18.5 mg L-1 de fósforo, corroborando

os resultados de Mara et al., (2003). No caso do azoto total foram obtidos valores entre

75.6 mg L- 1 e 147.0 mg L-1, superiores à gama apresentada por Mara et al., (2003).

Os resultados analíticos da água residual tratada indicam uma elevada remoção de

nutrientes, de matéria orgânica e de sólidos totais, superiores a 95 %, admissíveis para descarga

em meio hídrico.

Quanto à carga mássica aplicada ao canal anóxico, esta localizou-se dentro da gama

(0.04 a 1) g g-1 d-1, facilitando um boa floculação no reator (Metcalf et al., 2003).

Na análise preliminar, através da cromatografia gasosa as amostras colhidas em vários

locais da ETAR, identificou-se o local onde a acumulação de PHA pelos microrganismos era mais

elevada, as condições anóxicas eram mais acentuadas com potencial redox mais baixo.

O objetivo principal deste trabalho centrou-se na acumulação de PHA em lamas ativadas

presentes na ETAR municipal, com uma alimentação de água residual urbana, como fonte de

carbono, e sem enriquecimento do substrato, ou condições operatórias favoráveis à acumulação

5. CONCLUSÕES

99

de PHA. De acordo com os resultados, o máximo de fração mássica de PHA foi de 0.053, por

biomassa liofilizada, que, em termos de concentração de biomassa, corresponde a pelo menos

5.3 %, do peso seco com concentração 127 mg L-1. Comparando com os dados reportados na

literatura apresentados na Tabela 2.4, verificou-se que os resultados obtidos ficaram aquém do

esperado Durante a monitorização, observou-se também alterações da acumulação de PHA,

relacionados com a variação do ORP. Quando este parâmetro tende a aumentar, o valor da fração

mássica de PHA tem tendência a diminuir.

No presente trabalho, verificou-se que na coloração NSB eram detetadas as inclusões de

PHA em vários microrganismos. Através da regressão de mínimos quadrados parciais (PLS),

verificou-se a previsão das concentrações de PHA, quando comparada com o método tradicional

de cromatografia gasosa, em que o coeficiente de regressão foi de 0.91, Verificou-se a utilidade

da coloração NSB, acoplada à análise de imagem quantitativa. Esta pode ser uma metodologia

utilizada na pesquisa da produção de PHA em culturas microbianas mistas envolvidas no

tratamento de águas residuais.

Quanto ao canal aeróbio, sendo este posterior ao canal anóxico, por observação dos

protozoários, obteve-se um IBL de 7 indicando lamas bem colonizadas e estáveis com eficiência

depuradora suficiente.

De acordo com o estudo da viabilidade económica do processo de obtenção de PHA, através

do programa SuperPro Designer® concluiu-se que o elevado investimento na instalação não é

rentável, dado que não é gerado lucro.

Num próximo trabalho, seria de ponderar o estudo em ETAR com o sistema de tratamento

idêntico aos referenciados na literatura, por exemplo, como nas investigações efetuadas com o

SBR. Contudo, caso seja uma ETAR de sistema continuo, deverá ter-se em conta a fonte de

carbono, substrato, uma vez que a utilização apenas da água residual pode não ser o suficiente

para a acumulação de PHA.

BIBLIOGRAFIA


102

Águas do Ave da Empreitada de Execução das ETAR de Mosteiro - FD 1, Santo Emilião - FD 2,

Água Longa - FD 7 e Penices FD 8 (2006). Guimarães.

Ministério da Economia Sínteses Estatísticas - Gabinete de Estratégia e Estudos, (2014). Síntese

Estatística de Comércio Internacional, disponível em http://www.peprobe.com/wp-

content/uploads/2014/02/02-2014-GEE-Com%C3%A9rcio-Internacional-.pdf, (acedido a 14 de

dezembro de 2014)

Administração da Região Hidrográfica Norte, (2014). Licença de Utilização dos Recursos Hídrico:

Rejeição de Águas Residuais, Processo nº450.10.04.022727.2013.RH2, Utilização

nºL001371.2014.RH2.

Abreu, Hugo M. L. C. (2013). Obtenção e identificação de grânulos de polihidroxialcanoatos (PHA)

presentes em biomassa de um reator descontínuo sequencial (SBR) com tratamento de águas

residuais. Dissertação de Mestrado, Instituto Superior de Engenharia de Coimbra.

Accinelli, C., Saccà, M.L., Mencarelli, M. & Vicari, A. (2012). Deterioration of bioplastic carrier bags

in the environment and assessment of a new recycling alternative. Chemosphere, 89, 136–143.

Águas do Noroeste S.A, disponível em: http://www.adnoroeste.pt/, (acedido em 30 de Dezembro

de 2014).

Águas do Norte Águas do Norte S.A., disponível em: http://www.adnorte.pt. (acedido em18 de

julho de 2015).

Albuquerque M.G.E. Martino, V., Pollet, E., Avérous, L. & Reis, M.A.M. (2011). Mixed culture

polyhydroxyalkanoate (PHA) production from volatile fatty acid (VFA) -rich streams: Effect of

substrate composition and feeding regime on PHA productivity, composition and properties.

Journal of Biotechnology,151, 66–76.

APHA (1999). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20 edition.

American Water Works Assn.

Avérous Luc & Pollet Eric (2001). Environmental silicate nano-biocomposites. Springer – Verlag,

London.

BIBLIOGRAFIA

103

Babel, W. & Steinbuchel, A. (2001). Advances in biochemical engineering / Biotechnology,

biopolyesters. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, NewYork, vol.71.

Bengtsson, S., Werker, A.; Christensson, M. & Welander, T. (2008). Production of

polyhydroxyalkanoates by activated sludge treating a paper mill wastewater. Bioresource

Technology, 99, 509–516.

Bioplastics European European Bioplastics, driving the evolution of plastics, disponível em:

http://en.european-bioplastics.org (acedido a 30 de dezembro de 2014).

Bitton, G. (1999). Wastewater microbiology. Second edition. Gainesville, John Wiley & Sons, Inc.

Bo Qu & JunXin Liu (2009). Determination of optimum operating conditions for production of

polyhydroxybutyrate by activated sludge submitted to dynamic feeding regime. Chinese Science

Bulletin, 54, 142–149.

Calheiros, C. S. C., Amorim, C. L. & Castro, P. M. L. (2014). Tratamento biológico de água residual,

soluções para diferentes tipologias, engenharia 2020 - Uma estratégia para Portugal. INGENIUM,

144.

Capela, P. F., CESAM, Ecobiotecnologia baseada no uso de culturas microbianas mistas para

produção de PHA a partir de resíduos orgânicos, disponível em:

http://www.cesam.ua.pt/index.php?menu=82&tabela=projectosdetail&projectid=424&language=

pt (acedida a 30 de dezembro de 2014).

Cavaleiro, A. & Neves, L. (2009). Manual de Reatores Biológicos, AFTEBI.

Chakravarty, P., Mhaisalkar, V. & Chakrabarti, T. (2010). Study on poly-hydroxyalkanoate (PHA)

production in pilot scale continuous mode wastewater treatment system. Bioresource Technology,

101, 2896–2899.

Chaleomrum, N., Chookietwattana, K. & Dararat, S, (2014). Production of PHA from Cassava

Starch Wastewater in Sequencing Batch Reactor Treatment System. APCBEE Procedia, 8,

167– 172.

http://en.european-bioplastics.org/


104

Chen, G. & Guo-Qiang (2010). Plastics from Bacteria: Natural Functions and Applications.

Department of Biological Sciences and Biotechnology, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, Vol. 14.

Chen, Guo-Qiang (2009). A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials

industry. Chemical Society Reviews, 38, 2434–2446.

Chen, Z., Guo, Z., Wen, Q., Huang, L., Bakke, R. & Du, M. (2015). A new method for

polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulating bacteria selection under physical selective pressure.

International Journal of Biological Macromolecules, 72, 1329–1334.

Chua, A. S.M., Takabatake, H, Satoh, H. & Mino, T. (2003). Production of polyhydroxyalkanoates

(PHA) by activated sludge treating municipal wastewater: effect of pH, sludge retention time (SRT),

and acetate concentration in influent. Water Research, 37, 3602–3611.

Comeau, Y., Hall, K.J. & Oldham, W.K. (1988). Determination of Poly-3-Hydroxybutyrate and Poly-

3-Hydroxyvalerate in Activated Sludge by Gas-Liquid Chromatography. Applied and Enviromental

Microbiology, 54, 2325–2327.

Costa T. (2014) Cromatografia Gasosa, curso de química industrial na CEFET/MG.

Demain, A.L., Davies, J.E. & Atlas R.M. (1999). Manual of Industrial Microbiology and

Biotechnology, Vol. II.

Dionisi, D., Majone, M., Papa, V. & Beccari, M. (2004). Biodegradable Polymers From Organic

Acids by Using Activated Sludge Enriched by Aerobic Periodic Feeding. Biotecnholigy and

Bioengineering (Wiley InterScience), 85, 569–579.

European Bioplastics, disponível em http://en.european-bioplastics.org/, (acedido a 14 de

dezembro de 2014).

Felizzola, J. F., Costa C. F. G. & Vasconcelos S. S. (2014). Passo a passo para o uso do

cromatógrafo gasoso modelo CG-CP3800 Varian para Análises de Gases de Efeito Estufa (GEEs).

Belém, PA.

Ferreira, W. F. C. & Sousa, J. C. F. (1998). Microbiologia. Lidel, Edições Técnicas, Vol. I., Porto.

BIBLIOGRAFIA

105

Fidalgo, R. M., Ortigueira, J., Freches, A., Pelica, J., Goncalves, M., Mendes, B., Lemos, P. C.

(2014). Bio-oil upgrading strategies to improve PHA production from selected aerobic mixed

cultures. New Biotechnology, 31, (4).

Fonseca, M. M. & Teixeira, J. A. (2007). Reactores biológicos - Fundamentos e aplicações. Lidel,

Edições Técnicas Lda, Vol. 1º, Lisboa.

Estatística de Comércio Internacional do Ministério da Economia, disponível em:

http://www.peprobe.com/wp-content/uploads/2014/02/02-2014-GEE-Com%C3%A9rcio-

Internacional-.pdf. (acedida a 14 de dezembro de 2014).

Formolo, M. C., Duarte, M. A. T., Schneider, A. L., Furlan, S. A. & Pezzin, A. P. T (2003).

Polidroxialcanoatos: biopoliésteres produzidos a partir de fontes renováveis. Health and

Environment Journal, Vol. IV.

Fowlis, I. A. (1995). Gas Chromatography, Second Edition. John Wiley Sons, UK.

Governo de Portugal-Ministério do Ambiente, Ordenamento do Território e Energia, disponível em:

http://www.portugal.gov.pt/pt/os-ministerios/ministerio-do-ambiente-ordenamento-do-territorio-

e-energia/quero-saber-mais/sobre-o-ministerio/consulta-publica-crescimento-verde/consulta-

publica-crescimento-verde.aspx. (acedida a 29 de dezembro de 2014).

Hanggi J (1990). Pilot scale production of PHB with Alcaligenes latus. Kluwer Academic Publishers,

65–-70.

Hingle, C., BPF disponível em: http://www.bpf.co.uk/plastipedia/polymers/pp.aspx., (acedida a

14 de dezembro de 2014).

Jacquel, N., Lo, C., Wei, Y., Wu, H. & Wang, S. S. (2008). Isolation and purification of bacterial

poly (3-hydroxyalkanoates). Biochemical Engineering Journal 39, 15–27.

Janarthanan, O. M., Yu, Y., Laycock, B., Werker, A. & Pratt, S. (2014). Fractionation of microbial

populations in a PHA accumulating mixed mixedculture and associated PHA content and

composition. International Journal of Biological Macromolecules, 71, 53–58.


106

Jenkins, D., Richard, M. G. & Daigger, G. T. (1993). Manual on the causes and control of activated

sludge bulking and foaming. USA, Lewis Publishers, Vol. 2.

Jenkins, D., Richard, M.G. & Daigger, G. (2003). Manual on the causes and control of activated

sludge bulking, fand other solids separation problems.

Jia, Q., Xiong, H., Wang, H., Shi, H., Sheng, X., Sun, R., Chen, G. (2014). Production of

polyhydroxyalkanoates (PHA) by bacterial consortium from excess sludge fermentation liquid at

laboratory and pilot scales. Bioresource Technology, 171, 159–167.

Jiang Yang [et al.] (2012). Waste to resource: Converting paper mill wastewater to bioplastic. Water

Research, 46, 5517–5530.

Johnson, K., Kleerebezem, R. & Loosdrecht, M. C.M. (2010a). Influence of ammonium on the

accumulation of polyhydroxybutyrate (PHB) in aerobic open mixed cultures. Journal of

Biotechnology, 147, 73–79.

Johnson, K., Kleerebezem, R. & Loosdrecht M. C.M. (2010b). Influence of the C/N ratio on the

performance of polyhydroxybutyrate (PHB) producing sequencing batch reactors at short SRTs.

Water research, 44, 2141–2152.

Johnston, R., disponível em: http://www.praguepost.com/technology/40774-pilot-project-turns-

wastewater-to-bioplastic, (acedida a 7 de agosto de 2014).

Jördening, H. J. & Winter, J. (2005). Environmental Biotechnology. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.

KGaA, Weinheim.

Krasnits, E., Beliavsky, M., Tarre, S. & Green, M. (2013). PHA based denitrification: Municipal

wastewater vs. Acetate. Bioresource Technology, 132, 28–37.

Lemos, P. C., Serafim, L. S. & Reis, A.M. M. (2006). Synthesis of polyhydroxyalkanoates from

different short-chain fatty acids by mixed cultures submitted to aerobic dynamic feeding: Journal

of Biotechnology, 122, 226–238.

Lenntech Water & Air treatment Holding B.V., disponível em:

http://www.lenntech.com/polypropylene.htm. (acedida a 29 de dezembro de 2014).

BIBLIOGRAFIA

107

Madoni, P. A., (1994). Sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of

activated sludge based on the microfauna analysis. Wat. Res, 28, 67–75.

Madoni, Paolo (2004). Applicazione dell’ indice biotico del fango (SBI) nel processo di depurazione

a fanghi attivi. Dipartimento di Scienze Ambientali.

Mara, D. & Horan, N. (2003) Handbook of Water and Wastewater Microbiology. UK

Marang, L. Jiang, Y., Loosdrech, M.C.M. & Kleerebezem, R. (2014). Impact of non-storing biomass

on PHA production: An enrichment culture on acetate and methanol. International Journal of

Biological Macromolecules, 71.

Mesquita, D.P., Selvaggio, G., Cunha, J.R. Leal, C.S. & Ferreira, E.C (2013a). Image analysis for

automatic characterization of polyhydroxyalcanoates granules. Lect. Notes Comput. Sci. 7950,

790–797.

Mesquita, D. P., Amaral, A. L., Leal, C., Oehmen, A., Reis, M. A.M. & Ferreira, E C. (2015).

Polyhydroxyalkanoate granules quantification in mixed microbial cultures using image analysis:

Sudan Black B versus Nile Blue A staining. Analytica Chimica Acta, 865, 8–15.

Mesquita, D.P., Leal, C., Cunha, J.R., Oehmen, A., Amaral, A. L., Reis, M.A.M., Ferreira, E.C.

(2013b). Prediction of intracellular storage polymers using quantitative image analysis in enhanced

biological phosphorus removal systems. Analytica Chimica Acta, 770, 36–44.

Metcalf & Eddy (2003). Wastewater Engineering, treatment and reuse. Fourth edition. McGraw-Hill,

New York.

Nicolau, A., Martins, M. J., Mota, M. & Lima, N. (1999). Estudo da Comunidade de Protozoários

Exposta a Tóxicos em Estações de Tratamento de Águas Residuais. 6ª Conferência Nacional sobre

a Qualidade do Ambiente, 2, 659–668.

Nicolau, A., Martins, M. J., Mota, M. & Lima, N. (2002). A importância da microfauna como

ferramenta de trabalho em estações de tratamento de águas residuais, disponível em:

https://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/3688/1/T2-2.2_174%5B1%5D.pdf,

(acedida a 1 de maio de 2015).


108

Nireesha, G., Divya, L., Sowmya, C., Venkateshan, N., Babu, N. & Lavakumar, V. (2013).

Lyophilization/Freeze Drying - An Review. International Journal of Novel Trends in Pharmaceutical

Sciences, 3.

Nuti, M. P., Bertoldi, M. & Lepidi, A. A. (1972). Influence of phenylacetic acid on poly-beta-

hydroxybutyrate (PHB) polymerization and cell elongation in Azotobacter chroococcum Beij.

Canadian Journal of Microbiology18, 1257–1261.

Perry Robert H. & Green Don Perry's (1984). Chemical Engineers' Handbook. Singapure, McGraw-

Hill Book Company,6 edição.

Phasakanona, J., Chookietwattana, K. & Dararatc, S. (2014). Polyhydroxyalkanoate Production

from Sequencing Batch Reactor System Treating Domestic Wastewater Mixed with Glycerol Waste.

APCBEE Procedia, 8, 161–166.

Pittmann T. & Steinmetz H. (2014). Polyhydroxyalkanoate production as a side stream process on

a municipal waste water treatment plant. Bioresource Technology, 167, 297–302.

Poliversal disponível em: http://www.poliversal.pt/pt/landing-pages/tipos-de-plasticos/pp---

polipropileno-36.html, (acedido a 14 de dezembro de 2014)

Queirós D., Rossetti S. & Serafim, L. S. (2014). PHA production by mixed cultures: A way to valorize

wastes from pulp industry. Bioresource Technology, 157, 197–205.

Reddy, M. V. & Mohan, S. V. (2012a). Effect of substrate load and nutrients concentration on the

polyhydroxyalkanoates (PHA) production using mixed consortia through wastewater treatment.

Bioresource Technology, 114, 573–582.

Reddy, M. V., Nikhil, G.N., Mohan, S. V., Swamy, Y.V. & Sarma, P.N. (2012b) Pseudomonas otitidis

as a potential biocatalyst for polyhydroxyalkanoates (PHA) synthesis using synthetic wastewater

and acidogenic effluents. Bioresource Technology, 123, 471 – 479.

Reis, M.A.M., Serafim, L.S., Lemos, P.C., Ramos, A.M., Aguiar, F.R., Loosdrecht, M.C.M.V. (2003).

Production of polyhydroxyalkanoates by mixed microbial cultures. Bioprocess Biosyst Eng., 25,

377–385.

BIBLIOGRAFIA

109

Robert, S. B., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G. & Sayler, G. (1998). Techniques in Microbial Ecology.

Roda D. T. Polirpopileno, disponível em: http://www.tudosobreplasticos.com/materiais/

polipropileno.asp. (acedida a 14 de dezembro de 2014)

SECOM (2007). Estudo de mercado bioplástico. Embaixada do Brasil em Tóquio.

Serafim, L. S., Lemos, P. C. & Reis, M. A .M. (2003). Production of polyhydroxyalkanoates by mixed

microbial cultures. Bioprocess Biosyst Eng., 25, 377–385.

Silva, P. T. S. (2013). Production of bacterial reserve compounds from industrial wastewaters.

Dissertação de Mestrado, Universidade do Minho. Braga.

Tamis, J., Luˇzkov, K., Jiang, Y., Loosdrecht, M. C.M. & Kleerebezem, R. (2014). Enrichment of

plasticicumulans acidivorans at pilot-scale for PHA production on industrial wastewater. Journal of


Vander, der V. A. J., (2003). Sustainable wastewater treatment, developing a methodology and

selecting promising systems. Eindhoven.

Vieira, M. M. C. (2005). Estudo da cinética de acumulação e consumo de polímeros de reserva

num reactor de biofilmes para a remoção do azoto. Dissertação de Mestrado, Universidade do

Minho.

Villano, M.; Beccari, M.; Dionisi, D.; Lampis, S.; Miccheli, A.; Vallini, G.; Majone, M. (2010).Effect

of pH on the production of bacterial polyhydroxyalkanoates by mixed cultures enriched under

periodic feeding. Process Biochemistry, 45, 714–723.

Wagner, M., Loy, A., Nogueira, R., Purkhold, U., Lee, N. & Daims, H. (2002) Microbial community

composition and function in wastewater treatment plants. Freising: Kluwer Academic Publishers,

665–680.

Yu, Jian (2001). Production of PHA from starchy wastewater via organic acids. Journal of


ANEXOS


112

ANEXO I – PROCEDIMENTO DE DETERMINAÇÃO DOS SÓLIDOS

Sólidos Totais (ST)

Os Sólidos Totais (ST) correspondem a um material residual que fica no cadinho após a

secagem, até peso constante, numa estufa a uma temperatura entre (103 e 105) °C de um

determinado volume de uma amostra de água residual. Efetuou-se as determinações em triplicado.

O cadinho de porcelana de fundo plano foi pesado e anotou-se o peso (P1). A amostra de

água residual a analisar foi convenientemente homogeneizada e, posteriormente, pipetadapara o

cadinho, com um volume correspondente de amostra igual a 20 mL. O volume V da amostra deve

ser tal que o resíduo total deve estar entre 2 mg e 200 mg. O cadinho contendo a amostra foi

colocado na estufa a (103 – 105) °C e deixou-se de um dia para o outro, até peso constante. No

dia seguinte, retirou-se o cadinho da estufa e colocou-se no exsicador. Após o arrefecimento,

pesou-se o cadinho e anotou-se o peso (P2). Calculou-se os sólidos através da Equação (3).

= − ×� (Equação 3)

Sólidos Voláteis Totais (SVT)

A análise dos Sólidos Voláteis Totais (SVT) indica a quantidade de sólidos que pode ser

potencialmente destruída por via química ou biológica, ou seja, a biodegradabilidade da água

residual. Efetuou-se as determinações em triplicado. Após a pesagem do cadinho utilizado para a

determinação dos Sólidos Totais (ST), colocou-se o cadinho que contém o resíduo seco numa

mufla a 550 °C. Deixou-se durante 2 horas até se obter peso constante. Após esse período, retirou-

se o cadinho da mufla e colocou-se no exsicador. Após o arrefecimento, pesou-se o cadinho e

anotou-se o peso (P3). Calculou-se os sólidos através da seguinte Equação (4).

� = − ×� (Equação 4)

ANEXOS

113

Sólidos Suspensos Totais (SST) Sólidos Suspensos Voláteis (SSV)

Os Sólidos Suspensos Totais (SST) são a porção de sólidos totais que fica retida numa

membrana filtrante com porosidade de 0.45 µm. Efetuou-se as determinações em triplicado. Os

filtros de fibra de vidro foram lavados com 3 porções de 20 mL de água destilada e colocados em

cadinhos de alumínio previamente numerados. De seguida, o conjunto (filtro + cadinho) foi

introduzido na mufla durante cerca de 30 min. Após este período de tempo, retirou-se da mufla o

cadinho com o filtro a deixou-se arrefecer num exsicador, até peso constante. Pesou-se o conjunto

cadinho + filtro (P4). O filtro foi colocado num sistema de filtração por vácuo a amostra foi filtrada

com um volume V (tal como já mencionado, o volume da amostra deve ser tal que o resíduo total

deve estar entre 2 mg e 200 mg). O cadinho com o filtro foi introduzido na estufa a 105 °C, para

secagem, até ser atingido um peso constante (variação <4 %). Colocou-se no exsicador. Pesou-se

o cadinho com o filtro depois de arrefecer (P5) e calculou-se os SST através da Equação (5). Para

se determinar os SSV colocou-se o cadinho com o filtro na mufla a 550 °C, durante 2 h. Pesou-se

o cadinho com o filtro após arrefecimento num exsicador (P3), e calculou-se o valor SSV pela

Equação (6).

= − ×� (Equação 5)

� = − ×� (Equação 6)


114

ANEXO II – TABELA RELATIVA AOS DIAS DE MONITORIZAÇÃO

A Tabela A.1 apresenta os respetivos dias de monitorização do canal anóxico em relação à

data da realização das operações, para auxílio dos gráficos anteriores.

Tabela A.1 – Dia de operação da monitorização correspondente à data de operação

Dia de operação Data

1 12-jun-15

2 13-jun-15 3 14-jun-15 4 15-jun-15 5 16-jun-15

6 17-jun-15 7 18-jun-15 8 19-jun-15

9 20-jun-15 10 21-jun-15 11 22-jun-15 12 23-jun-15

13 24-jun-15 14 25-jun-15 15 26-jun-15 16 27-jun-15

17 28-jun-15 18 29-jun-15 19 30-jun-15 20 1-jul-15

21 2-jul-15 22 3-jul-15 23 4-jul-15 24 5-jul-15

25 6-jul-15 26 7-jul-15 27 8-jul-15 28 9-jul-15

29 10-jul-15 30 11-jul-15

ANEXOS

115

ANEXO III – CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA O MÉTODO DE CROMATOGRAFIA GASOSA

Nas Figura A.1 e a Figura A.2 estão representadas as curvas de calibração para a

quantificação de PHB e PHV respetivamente, através do método de cromatografia gasosa.

Figura A.1 – Curva de calibração para a concentração de PHV. A ordenada representa a razão entre as áreas do PHB (APHB) e a

área do padrão interno (API) e a abcissa representa a razão entre a massa de PHB (mPHB) presente na amostra e a concentração

do padrão interno (CPI).

Figura A.2 – Curva de calibração para a concentração de PHV. A ordenada representa a razão entre as áreas do PHV (APHV) e a

área do padrão interno (API) e a abcissa representa a razão entre a massa de PHV (mPHV) presente na amostra e a concentração

do padrão interno (CPI)


116

ANEXO IV – EXEMPLO DE RELATÓRIO DA CROMATOGRAFIA GASOSA

Na Figura A.3 encontra-se um relatório da cromatografia gasosa relativamente à amostra, a

13, A amostra a qual corresponde ao dia de operação 24 de junho de 2015. Através deste, e dos

respetivos cromatogramas da Figura 4.8, foram feitas as correlações entre as leituras dos picos

de e das áreas do PHB, do PHV e do PI para posterior cálculo através das curvas de calibração

(Anexo V).

Figura A.3 – Relatório do CG relativo ao dia 13 de amostragem.

ANEXOS

117

ANEXO V – EXEMPLOS DE CÁLCULO PARA PHA

Um cromatograma típico está representado na Figura 4.25. A identidade dos picos foram

estabelecidos por espectrometria de massa CG (Comeau et al., 1988). Para o processo, construiu-

se duas curvas de calibração, uma para a concentração de PHB e outra para a concentração de

PHV através de soluções com concentração conhecida de PHB e de PHV. Na leitura dos

cromatogramas, através do tempo de retenção, obtiveram-se as respetivas áreas do PHB, do PHV

e do PI, bem a massa de PHB e de PHV e a concentração de PI são conhecidas, podendo-se,

então, traçar as respetivas curvas de calibração demonstradas nas Equações 7 e 8,

respetivamente.

P B P = . P BP (Equação 7)

P V P = . P VP (Equação 8)

Após a obtenção da curva de calibração, procedeu-se à leitura dos cromatogramas das

amostras da biomassa liofilizada, onde se obtiveram as áreas através dos tempos de retenção

específicos do PHB, do PHV e do PI. Através da correlação com as curvas de calibração obteve-se

a concentração mássica.

Como exemplo para amostra 13 correspondente ao dia 24 de junho de 2015, pela leitura

do relatório do cromatograma da Figura A.3, obtém-se as seguintes áreas: 46 560, 31 113 e

318 243 para o PHB, o PHV e o PI, respetivamente, sabendo que a massa liofilizada foi de

11.2 mg.

Cálculos CPI: �T a a çã = �P + � a : L = . mL + . mL = mL

P = �P�T a a çã = . mL mL = O.


118

Cálculos PHB:

P B P = . P BP ag8 ag = . P B. P = . mg

�� = P�� = . mg. mg = . 9 mg mg−

Cálculos PHV:

P V P = . P VP ag8 ag = . P V. P V = . mg

�� = P V�� = . mg. mg = . mg mg−

Cálculos PHA:

�� = �� + �� = . 9 mgmg + . mgmg = . 9 mg mg−

�� = �� × � = . 9 mgmg × mgL = . mg L−

ANEXOS

119

ANEXO VI – VALORES DAS ÁREAS OBTIDAS PELA LEITURA DOS CROMATOGRAMAS

(MÉTODO CG)

Na Tabela A.2 e Tabela A.3 encontram-se os valores obtidos para o PHB, o PHV e o PI através

da cromatografia gasosa.

Tabela A.2 – Valor das áreas obtidas pelo GC, na monitorização de PHA preliminar

Amostras Nº Peso/ mg Área

PHB PHV PI

Canal Anóxico (17-03-2015)

1 4.4 17549 8006 486298

2 4.0 9596 3964 389941


3 4.1 15706 6192 436106

4 5.0 21120 8196 404028

Canal Aeróbio (18-03-2015)

5 4.0 3975 1021 337029

6 4.8 12668 3421 509214

Recirculação (18-03-2015)

7 5.0 10371 3408 517892

8 4.0 8582 3435 327928


9 4.0 12220 5130 326625

10 4.0 14458 6187 347585

Recirculação (19-03-2015)

11 4.3 20320 9063 505417

12 4.5 3110 1226 274547

Canal Aeróbio (19-03-2015)

13 4.6 4670 0 284913

14 5.0 4220 0 350537

Amostra lamas (19-03-2015)

15 32.6 25304 26190 433952


120

Tabela A.3 – Valor das áreas obtidas pelo GC, na monitorização do PHA diário

Amostras Peso / mg Área

PHB PHV PI

1 14.5 24898 25704 323890

2 10.4 23511 21707 334816

3 11.8 29029 26676 403042

4 10.7 17973 16985 415850

5 11.6 37410 32816 343889

6 10.4 52291 38021 476193

7 10.2 46748 36320 409657

8 10.3 43938 27511 341721

9 11.4 45822 30068 353877

10 11.2 75534 41733 590171

11 12.1 28098 20562 264558

12 11.6 91279 55802 602346

13 11.2 46560 31113 318243

14 14.0 49842 28179 266314

15 10.6 38738 23859 299787

16 14.0 42448 24940 256136

17 15.7 36381 25045 269202

18 13.8 27763 22042 292883

19 15.9 61425 43402 379486

20 12.1 44809 28712 295760

21 15.8 51080 32631 295760

22 15.2 65999 50696 326535

23 15.2 39247 26207 194089

24 19.5 70745 47141 365755

25 15.7 64836 53372 438505

26 10.6 27590 21195 221371

27 12.8 36856 27033 237116

28 10.2 27606 20984 242692

29 9.60 30588 21741 283690

30 14.1 82416 59247 467484

ANEXOS

121

ANEXO VII – VALORES DAS ÁREAS OBTIDAS PELO MÉTODO ANÁLISE DE IMAGEM

Através a análise de imagem quantitativa, identificou-se os grânulos de PHA, e foram

caracterizados os seguintes parâmetros morfológicos: área total e real, arredondamento, diâmetro,

perímetro, comprimento (L), largura (W), fator forma; e foram quantificados a intensidade de cor

azul para cada grânulo PHA obtendo-se os seguintes valores, onde os quais estão divididos quanto

ao tamanho dos grânulos, grânulos pequenos Tabela A.4, grânulos intermediários Tabela A.5 e

grânulos grandes Tabela A.6.

Tabela A.4 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho pequeno (menos de 100 pixéis)

Amostra Área Total

Área Real

Pontos L W Perímetro Arredondamento Diâmetro Fator Forma

Intensidade de azul

1 1009323 997441 19148 8.133 8.246 24.644 0.666 7.958 0.953 75.286

2 424221 416738 8748 7.856 7.852 23.567 0.666 7.594 0.952 77.129

3 852857 836294 16627 8.140 8.149 24.526 0.686 7.803 0.976 71.500

4 604218 590616 12211 7.927 7.935 23.865 0.671 7.645 0.962 81.611

5 952680 939454 18004 8.172 8.157 24.460 0.653 7.972 0.937 74.195

6 403202 395712 8242 7.898 7.900 23.781 0.675 7.614 0.963 56.866

7 735746 722853 14220 8.093 8.079 24.300 0.665 7.849 0.950 88.337

8 290926 283620 5919 7.925 7.855 23.709 0.672 7.604 0.959 48.904

9 836507 824718 16090 8.076 8.088 24.180 0.650 7.903 0.931 81.081

10 473086 463290 9732 7.860 7.861 23.602 0.670 7.581 0.956 88.088

11 1102119 1084402 20810 8.096 8.240 24.532 0.659 7.959 0.944 62.197

12 892527 879356 16890 8.102 8.220 24.538 0.662 7.957 0.945 72.238

13 1037426 1021089 19731 8.061 8.217 24.461 0.658 7.931 0.945 71.322

14 865911 851380 16529 8.066 8.164 24.383 0.659 7.908 0.944 61.506

15 777611 764261 14729 8.075 8.227 24.495 0.662 7.941 0.945 65.008

16 877112 863259 16867 8.042 8.143 24.323 0.662 7.879 0.946 55.287

17 948539 932798 18138 8.069 8.186 24.436 0.665 7.899 0.950 57.422

18 1088232 1069446 20563 8.083 8.274 24.621 0.666 7.942 0.954 59.758

19 926593 913720 17485 8.128 8.259 24.657 0.664 7.969 0.951 63.438

20 810852 799172 15402 8.046 8.290 24.580 0.666 7.931 0.953 63.996

21 479187 468274 9642 7.911 7.983 23.879 0.671 7.659 0.959 80.379

22 518729 505551 10589 7.873 7.892 23.721 0.677 7.586 0.963 80.508

23 494069 483862 9955 7.949 7.952 23.931 0.671 7.667 0.962 76.792

24 802996 786053 15949 7.996 7.995 24.067 0.661 7.718 0.960 88.406

25 488962 478940 9827 7.948 7.967 23.957 0.673 7.674 0.963 80.530

26 1093831 1077817 20151 8.252 8.271 24.782 0.653 8.070 0.939 83.217

27 517953 506656 10647 7.902 7.842 23.643 0.674 7.587 0.959 86.720

28 628287 613399 12724 7.962 7.897 23.880 0.675 7.627 0.966 84.617

29 1359700 1334993 24757 8.303 8.311 24.924 0.654 8.096 0.942 81.956

30 320674 314629 5860 8.243 8.292 24.788 0.646 8.076 0.937 83.302


122

Tabela A.5 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho intermédio (entre 100 e 400 pixéis)

Amostra Área Total

Área Real


Intensidade de azul

1 1838501 1802687 9438 17.798 18.103 59.835 0.802 15.298 1.536 68.034

2 471203 455339 2564 17.525 17.471 59.010 0.795 14.759 1.607 72.625

3 1070171 1031059 5860 17.606 17.677 59.717 0.816 14.699 1.653 63.315

4 759020 728503 4041 17.739 17.675 60.009 0.798 14.871 1.637 77.920

5 1689874 1650882 8678 17.711 17.643 58.045 0.789 15.262 1.455 71.712

6 604266 581069 3026 18.272 18.164 62.384 0.786 15.332 1.667 48.442

7 1274451 1234090 6460 18.051 18.011 60.470 0.806 15.291 1.568 84.126

8 467172 445035 2330 18.187 17.819 61.672 0.782 15.285 1.636 38.002

9 1183125 1144036 6170 17.515 17.608 57.890 0.800 15.068 1.482 72.179

10 615461 592590 3142 17.993 18.174 61.160 0.794 15.196 1.631 82.455

11 1871033 1820875 9657 17.550 17.891 58.667 0.797 15.197 1.495 57.321

12 1426322 1383986 7498 17.515 17.825 58.407 0.808 15.047 1.512 68.265

13 1803289 1749215 9215 17.652 18.036 59.288 0.800 15.251 1.517 64.749

14 1625914 1586918 8227 17.772 17.986 59.507 0.793 15.368 1.506 58.285

15 1417317 1380737 7210 17.715 17.994 59.292 0.795 15.319 1.506 61.612

16 1729096 1681447 8599 17.941 18.172 60.231 0.792 15.472 1.522 49.600

17 1997394 1938830 9863 18.040 18.181 60.397 0.795 15.510 1.523 51.542

18 2327765 2261223 11486 17.970 18.385 60.620 0.799 15.527 1.531 56.117

19 1911835 1861396 9609 17.749 17.997 59.346 0.788 15.409 1.491 61.968

20 1763906 1720501 8882 17.574 18.313 59.595 0.794 15.407 1.505 58.923

21 738643 703315 3731 18.095 17.858 61.253 0.789 15.198 1.633 74.149

22 745439 711241 3816 17.974 17.953 61.099 0.792 15.113 1.646 73.744

23 705185 675440 3665 17.889 17.820 60.331 0.798 15.025 1.619 67.581

24 1040217 1001216 5553 17.801 17.679 60.396 0.799 14.878 1.654 84.521

25 687173 658629 3572 17.732 17.734 60.286 0.786 15.036 1.616 75.949

26 2289180 2237953 11680 17.768 17.711 58.387 0.791 15.326 1.458 80.795

27 638563 616324 3389 17.801 17.720 59.665 0.791 14.935 1.609 74.399

28 934814 900212 4799 18.232 17.999 61.259 0.792 15.165 1.644 75.087

29 3408426 3308434 16704 18.009 17.983 59.601 0.782 15.572 1.471 81.128

30 779849 751406 3801 17.786 18.002 59.122 0.777 15.559 1.450 80.251

ANEXOS

123

Tabela A.6 – Valores obtidos da caracterização dos grânulos de PHA de tamanho grande (mais de 400 pixéis)

Amostra Área Total

Área Real


Intensidade de azul

1 1823236 1734044 2318 37.385 37.569 145.841 0.768 30.000 2.418 47.325

2 258690 226501 328 36.396 36.195 145.402 0.776 28.588 2.669 51.628

3 461233 426643 661 37.490 36.891 157.045 0.785 28.083 3.207 46.761

4 535951 483391 705 36.189 35.455 144.243 0.758 28.871 2.599 56.879

5 1619751 1548031 2147 36.654 35.952 136.656 0.760 29.545 2.197 56.824

6 646287 593126 793 37.590 37.093 154.209 0.752 29.899 2.749 33.311

7 1648559 1551358 1984 38.049 37.787 148.126 0.755 30.605 2.435 87.145

8 790095 665098 804 38.836 38.453 157.069 0.740 31.422 2.591 26.431

9 1445353 1345174 1557 39.186 38.496 147.356 0.758 31.897 2.194 45.193

10 627508 578857 762 37.559 37.293 149.866 0.752 30.259 2.550 52.746

11 2524835 2331937 2830 38.874 38.198 150.472 0.750 31.273 2.372 33.229

12 1507272 1393153 1727 38.815 38.064 149.605 0.758 30.956 2.397 41.370

13 2134175 1961533 2479 38.172 37.998 148.477 0.761 30.773 2.383 42.257

14 2445787 2204101 2713 38.421 38.325 149.326 0.758 31.103 2.363 38.207

15 1828503 1674999 2055 38.587 38.104 149.852 0.761 31.047 2.379 39.490

16 2477722 2309462 2793 39.057 38.281 151.516 0.756 31.286 2.417 32.220

17 3017637 2805753 3517 38.703 38.159 149.976 0.766 30.896 2.413 31.461

18 3313208 3077972 3736 38.784 38.845 151.193 0.764 31.294 2.394 33.847

19 2174162 1996732 2640 37.539 37.612 145.812 0.772 30.155 2.389 43.090

20 2533049 2336704 2908 38.345 38.163 149.519 0.765 30.881 2.391 36.847

21 624015 569232 768 37.707 37.039 152.392 0.758 29.879 2.696 52.356

22 811690 719997 931 38.117 37.753 153.552 0.749 30.463 2.628 56.175

23 499112 444366 653 36.714 36.358 147.564 0.776 28.731 2.713 43.486

24 586628 508405 747 36.798 36.062 148.929 0.761 28.764 2.784 63.890

25 603798 563582 777 36.752 37.214 149.553 0.773 29.666 2.646 53.061

26 2211881 2092689 2802 37.791 36.708 142.149 0.772 29.982 2.301 53.510

27 499655 459796 626 37.911 36.973 150.889 0.758 29.808 2.652 43.745

28 659707 609760 880 37.501 36.148 150.182 0.780 28.955 2.775 48.025

29 4306208 4001482 5186 38.214 37.247 145.273 0.773 30.395 2.334 60.345

30 953478 882293 1099 38.292 37.786 145.645 0.774 30.896 2.270 53.206


124

ANEXO VIII – DADOS UTILIZADOS NO SUPERPRO DESIGNER®

Principais Dados Termofísicos

Os principais dados termofísicos usados para o desenvolvimento do processo de extração e

purificação de PHA, encontram-se descritos na Tabela A.7. Estes dados são a massa molar (M), a

temperatura de ebulição (Teb), a temperatura de fusão (Tf ) e a entalpia de formação (∆Hform).

Tabela A.7 – Dados Termofísicos para os componentes subjacentes ao processo de extração e purificação de PHA

Componente Fórmula M/(g/g mol-1) Teb / °C Tf / °C ∆Hform / (J/g mol-1)

Biomassa CH1.8O0.5N0.2 24.63 526.85 - 273.15 0.00

Diclorometano CH2Cl2 84.93 40.55 - 95.14 - 124 265.00

PHA - 89.12 100.00 -172.00 -750 000.00

Azoto N2 28.01 - 195.76 - 210.00 0.00

Oxigénio O2 32.00 - 182.84 - 218.79 0.00

Água H2O 18.02 100.00 0.00 - 285 830.00

Preço dos Componentes Químicos

Na Tabela A.8 encontram-se descritos os preços de compra ou de tratamento e os preços

de venda dos componentes químicos necessários para o desenvolvimento dos processos de

extração e purificação.

Tabela A.8 – Preço dos componentes químicos do processo de extração e purificação de PHA

Componente Preço de Compra ou Tratamento Preço de Venda

PHA (€ / kg-1) _ 3.50

Biomassa (Revenue) (€ / kg-1) _ 0.02

Diclorometano (€ / m-3) 0.01 _

Biomassa (contaminada) (€ / kg-1) 0.06 _

Balanços Mássicos aos Processos de extração e purificação de PHA

Para a extração e purificação de PHA, são necessárias matérias-primas e reagentes, ao

mesmo tempo que é formado o componente de interesse e subprodutos. As entradas (E) e saídas

(S), assim como a variação (∆), destes componentes no processo produtivo estão sumariadas na

Tabela A.9.

ANEXOS

125

Tabela A.9 – Balanços mássicos aos processos de extração e purificação de PHA

Componentes E / (kg ano-1) S / (kg ano-1) ∆ / (kg ano-1)

Ar 23 557 524 23 557 524

Água 28 739 611 28 739 611

Biomassa 7 089 703 7 089 703

Diclorometano 31 322 31 322

PHA 95 200 1 894 -93 305

PHA sólido 93 305 93 305

Total 59 513 360 59 513 360 0

Balanços Energéticos e Requisitos em Utilidades

Na Tabela A.10 encontram-se sumariadas, para cada etapa dos processos de extração e

purificação do PHA as temperaturas das correntes de entrada (Te), as temperaturas das correntes

de saída (Ts) e respetiva variação (∆T).

Tabela A.10 – Balanços térmicos do processo de extração e purificação de PHA

Secção Te / °C Ts / °C ∆T / °C

Extração do PHA 25.00 25.60 0.60

Purificação do PHA 25.60 70.00 44.4

Na Tabela A.11 encontram-se sumários os custos anuais, referentes às utilidades, com

energia, vapor e água de arrefecimento, assim como a respetiva percentagem do custo total.

Tabela A.11 – Custos anuais associados às utilidades do processo de extração e purificação de PHA

Utilidade Custo Anual / € %

Energia / kWh 243 476 16.74

Vapor / Mt 9 603 79.24

Água de Arrefecimento / Mt 14 620 4.02

Total 101 871 100.00


126

O processo de extração e purificação de PHA, para além do produto de interesse, contribui

para a formação de resíduos, os quais são diferenciados e quantificados na Tabela A.12.

Tabela A.12 – Tipo de resíduo e quantidade gerada anualmente durante a extração e purificação de PHA

Resíduo Quantidade gerada / (kg ano-1)

Resíduo aquoso 9 658 301

Resíduo sólido 21 460 703

Emissões gasosas 28 269 029

Total 59 388 080

Na Tabela A.13 encontra-se o custo anual, referente ao consumível, com membranas da

ultrafiltração (UF) assim como a respetiva percentagem do custo total.

Tabela A.13 – Custos associados ao consumível do processo de extração de PHA

Consumível Custo Anual / (€) %

Membrana Dft UF 136 035 100

Lista de Equipamentos e Operações Unitárias

Na Tabela A.14 estão representados o número e o nome dos equipamentos necessários ao

processo, assim como uma pequena descrição das operações unitárias a eles subjacentes.

Tabela A.14 – Número e respetivo nome dos equipamentos associados ao processo de extração e purificação de PHA

Número do Item Equipamento Descrição das operações unitárias

UF – 101 Ultrafiltração Separação da água da mistura

CR – 101 Cristalizador Cristalização do PHA

SDR – 101 Secador Secagem do PHA

SL – 101 Silo Armazenamento do PHA sólido

SMSX – 101 Extrator Extração do PHA da biomassa com recurso ao solvente diclorometano

ANEXOS

127

Tabela Sumária dos Custos dos Equipamentos

Na Tabela A.15 encontram-se os valores gerais para cada equipamento para extração e

purificação de PHA.

Tabela A.15 – Registo do número de unidades de equipamento necessárias aos processos e respetivos custos

Número do Item Equipamento Custo Unitário / (€) Quantidade Custo total / (€)

UF – 101 Ultrafiltração 89 000 1 89 000

CR – 101 Cristalizador 405 000 1 405 000

SDR – 101 Secador 122 000 1 122 000

SL – 101 Silo 52 000 1 52 000

SMSX – 101 Extrator 6 000 1 6 000


128

Folhas de Especificações

As folhas de especificações relativas a cada equipamento utilizado no processo de extração

e purificação do PHA a partir da biomassa proveniente do tratamento de efluente urbano são a

seguir apresentadas.

Tabela A.16 – Folha de especificação do extrator sólido – liquido

Extrator sólido – líquido SMSX-101

Modo de operação Contínuo

Função Extração do PHA da biomassa

Dados do Projeto

Nº de unidades 1

Material de Construção SS316

Volume do misturador / (m3) 0.15

Volume do extrator / (m3) 0.75

Rendimento nominal/ (m3 h-1) 4.52

Fator de manutenção 1.00

Fator de Instalação 0.10

Correntes

Entrada Saída

DCM Biomassa DCM / Água / PHA Água

Caudal / (kg h-1) 3.96 4 534.92 1 830.19 1 219.48

Composição / (%)

Biomassa 0.00 895.17 0.01 0.01

Diclorometano 3.96 0.00 3.92 0.00

PHA 0.00 12.02 11.90 0.00

Água 0.00 3 628.74 1 814.37 1 219.48

Temperatura / (°C) 25.00 25.00 25.01 25.60

ANEXOS

129

Tabela A.17 – Folha de especificação da ultrafiltração

Ultrafiltração UF-101

Modo de operação Batch

Função Separar o permeado e concentrado

Dados do Projeto

Nº de unidades 1

Material de construção SS316


Fator de instalação 0.50

Correntes

Entrada Saída

DCM / Água / PHA Água PHA solução

Caudal / (kgh-1) 1 830.19 694.89

Composição / (%)

Biomassa 0.01 0.01 0.00

Diclorometano 3.92 0.00 3.92

PHA 11.90 0.00 11.90

Água 1 814.37 1 219. 48 0.00

Temperatura / (°C) 25.01 25.60 25.60

Consumíveis

Nome da membrana Dft

Área da membrana/ (m2) 61.30


130

Tabela A.18 – Folha de especificação do cristalizador

Cristalizador SL-101


Função Cristalização do PHA

Dados do Projeto

Nº de unidades 1

Material de construção SS316

Diâmetro / (m) 0.89

Altura / (m) 2.21

Volume / (m3) 1.36

Pressão / (MPa) 0.15



Correntes

Entrada Saída

PHA solução Ar PHA precipitado Recuperação de

DCM

Caudal / (kg h-1) 694.89 2 974.44 606.790 3.92

Composição / (%)

Ar 0.00 2 281.74 0.00 0.00

Biomassa 0.00 0.00 0.00 0.00

Diclorometano 3.92 0.00 0.00 3.92

PHA 11.90 0.00 0.119 0.00

PHA sólido 0.00 0.00 11.78 0.00

Temperatura/ (°C) 25.60 25.00 25.00 40.55

ANEXOS

131

Tabela A.19 – Folha de especificação do secador

Secador SDR-101


Função Secagem do PHA

Dados do Projeto

Nº de unidades 1

Material de Construção SS316


Altura / (m) 4.09

Volume / (m3) 5.95

Capacidade de secagem / (kg h-1) 595.89


Fator de Instalação 0.10

Correntes

Entrada Saída

PHA seco Vapor PHA

Caudal / (kg h-1) 11.90 3 569.32 11.90

Composição / (%)

Ar 0.00 2 974.44 0.00

Água 0.00 594.89 0.00

PHA sólido 11.78 0.00 0.00

PHA 0.12 0.00 11.90

Temperatura / (°C) 70.00 70.00 70.00

Tabela A.20 – Folha de especificação do silo de armazenamento

Silo SL-101


Função Armazenamento do PHA sólido

Dados do Projeto

Nº de unidades 1

Material de construção Concreto


Altura / (m) 0.56

Volume / (m3) 0.02

Pressão / (MPa) 0.11




132

Sumário do Investimento em Capital Fixo

Os custos diretos, dependentes da quantidade produzida, assim como os custos indiretos

relativos à engenharia e construção, são equacionados no custo das instalações total, valores

presentes na Tabela A.21.

Tabela A.21 – Custos diretos e indiretos do processo de extração de purificação de PHA

Custo Direto das Instalações Total (CDIT)

Custo de compra do equipamento / € 842 000

Instalação / € 314 000

Tubagens / € 295 000

Instrumentação / € 314 000

Isolamento / € 25 000

Parte Elétrica / € 89 000

Edifícios / € 379 000

Melhoramento de terrenos / € 126 000

Instalações auxiliares / € 337 000

CDIT / € 2 739 000

Custo Indireto das Instalações Total (CIIT)

Engenharia / € 685 000

Construção / € 958 000

CIIT / € 1 643 000

Custo das Instalações Total (CIT=CDIT+CIIT)

CIT / € 4 382 000

Taxa de Reembolso e Contratante e Contingência (TRCC)

Taxa de Reembolso do Contratante / € 219 000

Contingências / € 438 000

TRCC / € 657 000

Custo de Capital Fixo Direto (CFD)

CFD / € 5 039 000

ANEXOS

133

Custos de Operação

Na Tabela A.22 estão descritos os custos de operação anual no processo geral de extração

e purificação de PHA.

Tabela A.22 – Custos anuais de operação no processo de extração de purificação de PHA

Custos de operação anual €

Salários 848 000

Manutenção das instalações 949 000

Consumíveis 136 000

Tratamento e eliminação de resíduos 1 419 000

Utilidades 102 000

Total 3 454 000

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