FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS: AVALIAÇÃO … · imunidade geralmente dura por vários...
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i INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS: AVALIAÇÃO COMO IMUNOESTIMULADOR Alfredo José Ferreira de Melo Nova Odessa FEVEREIRO-2012
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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS:
AVALIAÇÃO COMO IMUNOESTIMULADOR
Alfredo José Ferreira de Melo
Nova Odessa
FEVEREIRO-2012
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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS:
AVALIAÇÃO COMO IMUNOESTIMULADOR
Alfredo José Ferreira de Melo Orientadora:Keila Maria Roncato Duarte
Co-orientador:Rafael Herrera Alvarez
Nova Odessa
Fevereiro, 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.
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Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia
Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166
Melo, Alfredo José Ferreira de
M528u Fosfato de levamisol em vacas leiteiras: Avaliação como imunoestimulador. / Alfredo José Ferreira de Melo. Nova Odessa - SP, 2012.
47p. : il.
Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Prof. Dra. Keila Maria Roncato Duarte.
1. Bovino leiteiro. 2. Imunoglobulinas. 3. Levamisol. I. Duarte, Keila Maria Roncato . II. Título.
CDD 636.234
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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL
Certificado de aprovação
FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS:
AVALIAÇÃO COMO IMUNOESTIMULADOR
Alfredo José Ferreira de Melo Orientadora:Keila Maria Roncato Duarte
Co-orientador:Rafael Herrera Alvarez
Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em \produção Animal sustentável, pela Comissão Examinadora:
Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte
Instituto de Zootecnia – APTA/SAA
Dr. Fabio Morato Monteiro Instituto de Zootecnia – APTA/SAA
Dr. Daniel Jesus Cardoso de Oliveira
Polo de Andradina– APTA/SAA
Data da realização: 08 de fevereiro de 2012 Presidente da Comissão Examinadora
Profa.Dra. Keila Maria Roncato Duarte
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Dedicatória
Dedico minha está tese a meus país que me apoiaram em todos momentos bons e ruins deste trabalho.
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Agradecimentos
Agradeço a Deus e em especial a minha orientadora Dra. Keila e meu co-orientador Dr. Rafael Herrera que sempre estiveram ao meu lado neste trabalho e ao amigo e colega de mestrado Vinicius P oncio pela grande
ajuda .
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Sumário
Lista de Figuras .......................................................................................................... ix
Lista de Tabelas ........................................................................................................... x RESUMO ........................................................................................................................ xi
ABSTRACT ................................................................................................................... xii 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 4
2.1. Patologias reprodutivas mais comuns das vacas leiteiras ..................................... 5
2.1.1 Retenção de placenta ....................................................................................... 6 2.1.2 Endometrite ..................................................................................................... 7
2.2. Atividade imunológica .......................................................................................... 7 2.2.1 Metodologias para medir IgG .......................................................................... 9
2.2.1.1 Colunas de Imunoafinidade - Proteína A .............................................. 10
2.2.1.2 Outras Técnicas para quantificar Imunoglobulinas no soro e colostro . 11
2.2.2 Imunoestimuladores...................................................................................... 13 2.2.2.1 Imunoestimuladores inespecíficos ......................................................... 14
a) Propionibacterium acnes (P.acnes) ................................................................ 14 b) BCG (Bacilo de Calmette-Guerrin)............................................................... 15
c) PIND-ORF (Baypamun®, Bayer) ................................................................. 16
d) Vacina Bacteriana Mista anti – Escherichia coli e Salmonella Dublin(SD) . 17 2.2.2.1 Levamisol ............................................................................................... 18
3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 21 3.1. Animais ................................................................................................................ 21 3.2. Tratamentos ........................................................................................................ 21 3.3. Coleta de amostras .............................................................................................. 22 3.4. Dosagem de IgG ................................................................................................. 22 a) No soro ................................................................................................................... 22
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 26
4.1. Rebanho Holandês ............................................................................................... 26 4.1. Rebanho Jersey .................................................................................................... 29
5. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 33 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 34
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Lista de Figuras
Figura 1. Esquema de captura de IgGs em Coluna de Imunoafinidade de Proteína A, esquerda e ; à direita, eluição das IgGs por diferença de pH..................................... 11 Figura 2 – Esquema de placa com ensaio de imunodifusão radial......................... 12 Figura 3. Soro sendo filtrado na coluna em sistema fechado.................................. 24 Figura 4. Coleta do eluído para leitura no espectrofotômetro ................................. 25 Figura 5. Níveis séricos de IgG do grupo Controle Holandês................................... 27 Figura 6. Índice de Refração do Colostro.................................................................. 27 Figura 7. Níveis séricos de IgG rebanho Jersey........................................................ 29 Figura 8. Dias para o primeiro serviço (1º IA) do Rebanho Jersey............................. 31 Figura 9. Número de serviços por vaca rebanho Jersey............................................... 31
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Lista de Tabelas
Tabela 1 - Análise estatística dos resultados de quantificação de IgG
mg mL -1 (Rebanho Holandês)...................................................................................26
Tabela 2 - Taxa de prenhez de vacas Holandesas tratadas com Levamisol e submetidas a IATF com sêmen sexado..........................................................................................29 Tabela 3 - Análise estatística dos resultados de quantificação de IgG
mg mL -1 (Rebanho Jersey)........................................................................................30 Tabela 4 – Taxa de Prenhez dos animais do rebanho Jersey.......................................32
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FOSFATO DE LEVAMISOL EM VACAS LEITEIRAS: AVALIAÇÃO COMO IMUNOESTIMULADOR
RESUMO
Na atividade leiteira, problemas como retenção de placenta, metrites e
endometrites, que acometem o trato reprodutivo das fêmeas no período pós –
parto, causam grandes prejuízos ao produtor, decorrente da queda na
produção de leite, gastos com medicamentos, descarte do leite e baixo
desempenho reprodutivo. Considerando que as patologias acima mencionadas
geralmente estão relacionados com o estado imunológico sistêmico do animal,
diversos produtos com atividade imunoestimulante têm sido sugeridos para ser
administrados, preventivamente, no período pré-parto. Neste trabalho, dois
rebanhos leiteiros, formados por fêmeas bovinas Jersey e Holandesas, foram
utilizados no intuito de avaliar a ação benéfica do Fosfato de Levamisol,
medicamento comumente utilizado para o controle de parasitas e que provoca,
dentre outros, um aumento na atividade imunológica. Os animais receberam
Fosfato de Levamisol (Ripercol L 150 F – FortDodge Saúde Animal) na
dosagem de 3,5 mL por kg de peso vivo (1 mg do principio ativo) em duas
aplicações no pré-parto. Amostras de sangue foram coletadas quinzenalmente
para quantificar a concentração de imunoglobulinas G no soro pelo método de
imunoafinidade. Adicionalmente, foram analisadas diversas variáveis
reprodutivas (período de serviço, taxa de concepção, incidência de patologias
reprodutivas). Os dados foram analisados utilizando métodos de estatística não
paramétrica. Não houve diferenças estatísitica (valor de P 0,5%) entre os
animais tratados e os que receberam o placebo. Foi concluído que o uso de
Fosfato de Levamisol no período pré-parto não altera a atividade imunológica
nem o desempenho reprodutivo dos animais.
Palavras-chave: Bovinos leiteiros, imunologia, levamisol, pré-parto
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LEVAMISOLE-PHOSPHATE IN DAIRY COWS: EVALUATION AS IMMUNOPOTENTIATOR
ABSTRACT
In the dairy industry, reproductive problems as metritis, endometrites and
placental retention, can result in milk yield decreasing, medical supplies
expends, milk discard, and the low reproductive performance is mostly due to
the animal immune status. For this reason several products are indicated as
immunopotentiators, especially for females at the pre-parturient period. In this
work, two groups of bovine pre-parturient animals, from Jersey and Holstein
breeds were tested to evaluate the Levamisole phosphate property as
immunpotentiator. Although Levamisole products are recommended for parasite
control, it is recommended by the fabricant as immunopotentiators. The assays
were performed with two levamisol phosphate (Ripercol L 150 F – FortDodge
Saúde Animal) 3,5 mL per kg of live weight (1 mg from active product) on the
pre-parturient period, two applications and three sera harvest . Control group
did not receive any product but sera were also collected. Immunoglobulin G
quantification were obtained by immunoaffinity procedure IgG-protein A. No
statistical differences were observed for the breeds or the control groups, in
comparison to levamisol phosphate groups, for sera IgG quantification, which
agrees with several studies where levamisole products do not present
immunopotentiator activity for bovine females, as well as did not increase the
animals reproductive performance, independent from the breed studied.
Key-words: Dairy cows, immunology, levamisole, pre-parturient period
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1. INTRODUÇÃO
A reprodução tem papel fundamental na atividade leiteira uma vez que,
existe uma íntima relação entre o intervalo entre partos e a produção de leite.
Consequentemente, para que um rebanho leiteiro seja considerado eficiente a
concepção deve ocorrer num período de 85 dias após o parto. Por esse motivo,
as vacas devem retomar rapidamente à atividade reprodutiva pós parto que as
possibilite de uma nova prenhez.
Na atividade leiteira os problemas que acometem o trato reprodutivo das
fêmeas no pós - parto, como a retenção de placenta, metrites e endometrites,
causam grandes prejuízos tais como queda na produção de leite, gastos com
medicamentos, descarte do leite e o baixo desempenho reprodutivo. A
ocorrência desses problemas pós- parto pode ser influenciada pelo estado
imunológico sistêmico do animal.
Após o parto, ocorre uma série de adaptações que levam ao
restabelecimento da atividade ovariana. Durante o puerpério (período que vai
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do parto até involução do útero e dura em torno de 40 dias) é necessário que
haja involução do trato genital (útero e cérvix ) e retorno da atividade ovariana.
Ambas condições fisiológicas dependem do aumento adequado da secreção
de gonadotrofinas e esteróides e fatores associados ao manejo pré e pós parto.
O controle das infecções nos animais é realizado pela imunidade ativa e
passiva. A imunização ativa ocorre quando o próprio sistema imune do
indivíduo, ao entrar em contato com uma substância estranha ao organismo,
responde produzindo anticorpos e células imunes (linfócitos T). Esse tipo de
imunidade geralmente dura por vários anos, às vezes, por toda uma vida. Os
meios de se adquirir imunidade ativa são contraindo uma doença infecciosa e a
vacinação. A imunização passiva é obtida pela transferência ao indivíduo de
anticorpos produzidos por outro indivíduo. Esse tipo de imunidade produz uma
rápida e eficiente proteção, que, contudo, é temporária, durando em média
poucas semanas ou meses. A imunidade passiva natural é o tipo mais comum
de imunidade passiva, sendo caracterizada pela passagem de anticorpos da
mãe para o feto através da placenta e também pelo leite. Essa transferência de
anticorpos ocorre nos últimos 2 meses de gestação, de modo a conferir uma
boa imunidade à cria durante seu primeiro ano de vida.
O uso de imunoestimuladores no pré-parto tem sido indicado por vários
autores e por diversos fabricantes destes produtos como uma alternativa para
melhorar a condição do sistema imune das vacas. Neste trabalho avaliamos a
eficácia do Fosfato de Levamisol (Ripercol 150 L – Fordog Saúde Animal)
como estimulante da condição imunológica quando aplicado no período pré
parto de fêmeas bovinas. Analisou-se a quantidade de imunoglubilinas tipo G
no soro e no colostro, bem com a eficiência reprodutiva no pós parto (dias para
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o 1º serviço, número de serviços, taxa de prenhez e problemas pós – parto)
em comparação a um grupo controle não tratado.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
Problemas reprodutivos no pós - parto resultam em perda econômica
considerável, em consequência da redução da taxa de natalidade, aumento no
intervalo entre partos, maior número de serviços por concepção, queda de
produção de leite, perda de matrizes, além do gasto com medicamentos
(GRUNET e GREGORY, 1984; PALHANO, 2008; ANDRADE et al., 2005).
Na atividade de pecuária leiteira brasileira, muitos criadores utilizam
vacas da raça holandesa por causa de sua alta produção, e persistência, de
leite. Segundo a Associação Brasileira de Criadores de Gado Holandês, cerca
de 84,0% de criadores de gado holandês residem nos estados de São Paulo,
Paraná e Minas Gerais, com produção media em torno 8.047 kg por lactação
(305dias). Os programas de seleção e melhoramento genético fizeram dessa
raça a maior produtora mundial de leite. Contudo, concomitante ao aumento da
produção de leite, observou-se um aumento na incidência de problemas
metabólicos, mastite e problemas no pós - parto que afetam o desempenho
reprodutivo. Devido a estes problemas, o gado holandês é uma raça que
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precisa de um manejo relativamente dispendioso para adequar o ambiente às
necessidade da raça. Diferentemente, a pesar de ter sofrido uma seleção
igualmente intensa para produção de leite, a raça Jersey tem a reputação de
ser mais rústica e tolerante ao calor, estando implicados diferentes
mecanismos de defesa ao ambiente, incluindo diferenças no sistema imune.
Na medicina veterinária existem situações em que se torna desejável
potencializar a reposta imune. Entre essas situações podemos citar o
incremento da resistência às infecções e o tratamento de enfermidades
imunossupressoras ou infecciosas de origem multifatorial. Por outro lado, é
preciso que a vaca produza um colostro de melhor qualidade, com maiores
níveis de imunoglobulinas (CASTRUCCI et al., 1996; TIZARD, 2002).
2.1. Patologias reprodutivas mais comuns das vacas leiteiras
A resposta imune de vacas leiteiras sofre declínio durante o período de
transição que compreende 3 semanas antes do parto e 3 semanas depois do
parto. Kehrli et al. (1989) mostraram que ambos os neutrófilos e linfócitos de
vacas no peri parto ficam reduzidos e diminuindo as respostas imunológicas
após o parto. O estresse do parto causa o aumento da secreção de corticoídes,
o que prejudica o funcionamento das células de defesa.
O comprometimento do sistema imune é associado ao aumento do risco
de metrites, mastistes, ou outras doenças infecciosas. Recentemente a
retenção de placenta foi caracteriza por uma falha do sistema imune materno
(SAUN,. 2007).
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2.1.1 Retenção de placenta
A retenção de placenta resulta da falta de descolamento das
membranas fetais das carúnculas maternas devido à baixa motilidade ou atonia
uterina. Algumas vacas conseguem expelir a placenta após o parto em até 3
horas, mas maioria das vacas expele seus anexos fetais por volta de 6 horas
após o parto e um número pequeno de vacas 12 horas depois do parto.
Considera-se retida a placenta quando não ocorre sua liberação após seis
horas do parto, embora Ruckebusch et al. (1991) adotam 8 a 12 horas e
Esslemont e Peeler (1993) consideram retenção de placenta com mais de 24
horas pós parto.
Em estudo realizado em fazenda comercial localizada no município de
Araras/SP, foi acompanhado o pós-parto de 522 fêmeas Holandesas,
primíparas e multíparas, com produção média diária de 35 kg e média de
produção acumulada aos 305 dias de 10.747 kg. As retenções de placenta e as
metrites foram as doenças mais presentes neste rebanho (CORASSIN et al.,
2011).
Um dos mecanismos que predispõem à retenção de placenta é o
distúrbio na síntese de prostaglandina F2α (PGF2α) (HORTA et al., 1984).
Chassagne e Barnouin (1992) encontraram menor concentração de 13,14-
diidro-15-ceto- PGF2α (PGFM, principal metabólito de PGF2 α) em vacas com
retenção de placenta na hora do parto e Horta et al.(1984) verificaram que a
retenção de placenta foi induzida pela injeção de inibidor de prostaglandina no
momento do parto. Além de acelerar o processo de involução, a prostaglandina
F2a (PGF2a) estimula a atividade da camada muscular uterina (miométrio)
7
após o parto. Esta substância é normalmente produzida pelo útero sendo
responsável pela correta involução uterina pós parto, em tempo normal. Devido
ao papel da PGF2α, no retorno à normalidade fisiológica pós parto, algumas
fazendas adotaram a aplicação preventiva de PGF2α no pós parto. No entanto
os resultados ainda não são completamente satisfatórios( HORTA et al., 1984).
2.1.2 Endometrite A endometrite é o processo infeccioso que ocorre durante o puerpério,
associado ou não à retenção de placenta, tendo como principal fator
predisponente a inércia uterina pós - parto e a contaminação do ambiente
uterino por agentes infeccioso. O animal com infecção uterina apresenta um
quadro de toxemia e septicemia com sintomas de apatia, anorexia, hipertemia
e secreção purulenta vaginal. O tratamento é feito com antibióticos sistêmicos,
junto com lavagem uterina com antisséptico e agentes mucolíticos. O uso de
PGF2α ou seus análogos sintéticos, como cloprostenol sódico, contribui para
melhorar a contratilidade uterina promovendo a luteólise em vacas que
apresentam um corpo lúteo funcional (PALHANO, 2008).
2.2. Atividade imunológica
Os anticorpos (Ac), formados por imunoglobulinas (Ig) ou
gamaglobulinas, são glicoproteínas sintetizadas e excretadas por células
plasmáticas derivadas dos linfócitos B, os plasmócitos, presentes no plasma,
tecidos e secreções que se ligam a proteínas estranhas ao corpo, chamadas
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de antígenos, realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral).
Depois que o sistema imunológico entra em contato com um antígeno, são
produzidos anticorpos específicos contra ele. Todos os anticorpos são
constituídos da mesma maneira, a partir de quatro cadeias polipeptídicas,
formando cinco classes diferentes denominadas IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. A
IgG é a mais abundante no plasma sanguíneo, sendo produzida em altos níveis
tanto nas respostas imunes primárias como nas secundárias.
A placenta bovina impede a passagem de anticorpos para o feto durante
a gestação (RADOSTITS et al.,2007).Consequentemente, os bezerros
neonatos possuem um sistema imune imaturo, tornando indispensável a
transferência de imunidade através fornecimento de colostro nas primeiras seis
horas de vida para os neonatos (RADOSTITS et al.,2007).
O colostro contém vários elementos imunoprotetores solúveis que são
capazes de conferir imunidade contra uma variedade de microorganismo
patogênicos responsáveis pelos altos índices de morbidade e mortalidade de
neonatos nos rebanhos leiteiros (RADOSTITS et al.,2007).
Segundo Smith et al. (2006), as principais imunoglobulinas
presentes no colostro bovino são : IgG(70-80%), IgM(10-15%) e IgA (10-15%),
sendo que a quantidade de imunoglobulinas do colostro aumenta conforme o
número de lactações. O colostro de novilhas (primiparas) tem baixa
concentração de IgG em relação ao do colostro de vacas mais velhas. Por esse
motivo, recomenda-se que os bezerros devem ser alimentados
preferencialmente com o colostro de vacas com três lactações (DAWES e
TYLER.,2007).
9
2.2.1 Metodologias para medir IgG
Um método direto de quantificação de irnunoglobulinas é a eletroforese
(PFEIFFER et al., 1977). Esta técnica, apesar de ser bastante específica, exige
boa condição técnica e necessita de equipamentos específicos. A eletroforese
é uma técnica de separação de proteínas utilizando-se de forças eletroforéticas
e eletroendosmóticas presentes no sistema. As frações separadas são
visualizadas a partir de corante sensível a proteínas. Os resultados devem ser
sempre expressos sobre forma percentual e de concentração das diversas
frações e em forma gráfica. A amostra de soro sanguíneo, rica em proteínas, é
aplicada sobre um meio composto de acetato de celulose ou gel de agarose e,
em seguida, sofre a ação de um potencial elétrico gerado por um, pólo positivo
(anodo) e outro negativo (catodo).
Esse potencial provoca a migração das proteínas em direção ao anodo
e, de acordo com o peso molecular e carga elétrica deste, elas percorrem
distâncias distintas, gerando diferentes bandas, representadas por albumina e
as globulinas alfa, beta e gamaglobulinas fração formada pelas
imunoglobulinas (Igs).
O método da turvação pelo sulfato de zinco (TSZ), apesar de ser um
método indireto e menos específico que os métodos diretos é uma prova
rápida, com baixo custo (WHITE, 1986). Além disso, Pfeiffer et al.(1977)
demonstraram que este método foi o que apresentou menos distorções em
relação a quantidade real de irnunoglobulinas em amostras de soro bovino,
10
comparado com imunodifusão radial simples, eletroforese e refratometria.
Outros métodos indiretos de quantificação de irnunoglobulinas são a
precipitação pelo sulfito de sódio e a reação de coagulação pelo glutaraldeído .
(PFEIFFER et al., 1977)
2.2.1.1 Colunas de Imunoafinidade - Proteína A
Colunas com proteina A são um dos métodos mais versáteis usados
para purificação de anticorpos (GHETIE et al, 1978). As colunas são fáceis
para preparar, porque as moléculas dos anticorpos são destinadas para a
matriz o gel através do domínio Fc. Anticorpos ligam-se diretamente na
proteína A porque o domínio Fc do anticorpo tem alta afinidade com proteína A
(Figura 1).
A Proteína A é um polipeptídio que encontrado na parede celular da
Staphylococcus aureus aproximadamente 98% das S. aures contém está
proteína. O mecanismo de interação entre o anticorpo e a proteína A ocorre
quando a proteína une-se nos 4 potenciais sítios de ligações dos anticorpos
mas apenas dois deles podem ser usados no mesmo tempo. A proteína A liga-
se no sitio da molécula do anticorpo na segunda e terceira região constante
dos polipepitidios de cadeia pesada (CHAMOW e ASHKENAZI, 1999).
11
Figura 1. Esquema de captura de IgGs em Coluna de I munoafinidade de
Proteína A, `a esquerda e ; à direita, eluição das IgGs por diferença de pH
Fonte: http://www.chromatography.amershambiosciences.com/
2.2.1.2 Outras Técnicas para quantificar Imunoglobulinas no soro e colostro A imunodifusão radial simples (IRS) é usada para quantificação de
antígenos e anticorpos. A precipitação do antígeno-anticorpo torna-se sensível
pela incorporação de anti-soro na solução de ágar antes de tornar-se gel.
Desde modo o anti-soro (que pode ser anti–IgG) é distribuído de forma
uniforme por todo no ágar . O antígeno, então, tem possibilidade de difusão
para poços feitos no gel. Inicialmente o antígeno difunde-se bem para fora do
poço formando um arco em volta do poço inicial. No entanto, na medida em
12
que difunde para mais longe do poço, a concentração começa a cair e a
concentração fica igual ao anticorpo do gel e um arco (disco) de antígeno e
anticorpo (precipitado) é formado ( Figura 2).
Figura 2 – Esquema de placa com ensaio de imunodifu são radial ( ROITT et al, 1989).
O colostrômetro é um método simples para estimar rapidamente, por via
indireta, a quantidade de anticorpos presentes no colostro. A medição pelo
colostrômetro é feita através de miligramas por mililitro de imunoglobulinas
(anticorpos), sendo que um colostro de boa qualidade tem que ter de IgG 50-
140mg mL –1 ou mais, de qualidade regular de 20-50 mg mL –1 e
considerado ruim abaixo de 20 mg mL –1 (MECHOR et al.,1992).
Um método mais preciso para avaliar o teor de Ig do colostro é a
Imunodifusão Radial –RID é o método padrão (FLEENOR E STOTT,1981 ).
Entretanto, precisa–se de uma estrutura de laboratório e requer em torno 24
horas para obtenção dos resultados, sendo uma técnica de difícil aplicação nas
fazendas .
13
Outro equipamento de vem sendo utilizado para avaliação da qualidade
do colostro e refratômetro (óptico e digital). O principio de funcionamento do
equipamento consiste em medir a refração do feixe de luz quando este passa
através de uma amostra de líquido. O equipamento então mede a quantidade
de luz que é refratada, ou seja, "desviada" durante o caminho do feixe de luz
pelos constituintes da amostra. Assim, quanto maior a quantidade de proteína
da amostra, mais luz é "desviada" e, assim, o refratômetro faz a leitura
(BIELMAN et al., 2010).
Outro método para avaliar a concentração de IgG no colostro é através
do método de turvação pelo sulfato de zinco (TSZ), também chamada de
reação de KUNKEL (BÉRTOLI, 1973). A avaliação do grau de imunização
passiva é feita através da turbidez desenvolvida pela precipitação do soro
sangüíneo com sulfato de zinco. A intensidade da turbidez permite determinar a
concentração de imunoglobulinas séricas. O controle positivo é uma mistura de
soros sangüíneos de bovinos adultos e o controle negativo é soro fetal bovino
sem imunoglobulinas (FLEENOR e STOTT, 1980).
2.2.2 Imunoestimuladores Os imunoestimuladores ou imunomoduladores são substâncias que
atuam no sistema imunológico conferindo aumento da resposta orgânica contra
determinados microorganismos, incluindo vírus, bactérias e protozoários,
mediante à produção de interferon e seus indutores. Os imunomoduladores
podem ser ativos específicos, ativos inespecíficos e passivos. A maior parte
dos imunomoduladores proporciona incremento ativo e não-específico da
resposta imune dos indivíduos (SPINOSA,1999). Alguns destes são: interferons
14
e indutores de interferon, as interleucinas, o bacilo de Calmett-Guérin (BCG) e
seus derivados, o Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum), vacina
bacteriana mista, PIND-ORF, Phosprenyl, Quillaja saponis, Bordetella
pertussis, componentes da parede de Staphylococcus aureus, avridina e o
levamisol.
Segundo Spinosa (1999), os imunoestimuladores possuem ações
específicas, que inibem ou estimulam a produção de proteínas; induzem
receptores para Imunoglobulinas do tipo G (IgG) e Fixadores de Complemento
(FC) em monócitos e macrófagos além, de estimularem os macrófagos. As
interleucinas possuem ação mitógena dos timócitos (células precursoras das
células T), estimulando a resposta na fase aguda e a proliferação e ativação de
linfócitos T e B e, assim como interferons e indutores de interferon, estimulam
os macrófagos as células exterminadoras naturais ou células NK (do inglês N atural
Killer Cell). O Bacilo de Calmett-Guerrin (cepa viva atenuada de Mycobacterium
bovis) e seus derivados ativam células T e B, liberando linfocinas e recrutando
macrófagos, resultando em ação granulomatosa.
2.2.2.1 Imunoestimuladores inespecíficos
a) Propionibacterium acnes (P.acnes) Propionibacterium acnes é uma bactéria Gram-positiva, residente natural
da glândula sebácias do folículo piloso da pele humana; vivem em ambiente de
anaerobiose, crescendo de maneira mais eficaz neste, no entanto, algumas
cepas são aerotolerantes (BRANNAN, 2005). Como todas as bactérias, o P.
acnes promove a formação de anticorpos quando administrada como uma
suspensão inativada sendo rapidamente fagocitada pelos macrófagos,
15
estimulando a síntese de citocinas. Possui uma atividade complexa, já que
estimula os macrófagos e a resposta de anticorpos aos antígenos timo-
dependentes, mas possui efeito variado na resposta aos antígenos timo -
independentes. Essa bactéria possui ação imunoestimulante geral que leva à
potencialização da atividade antibacteriana e antitumoral (TIZARD, 2002).
Especificamente, aumenta a produção de linfócitos T e B, aumentando,
portando, a imunidade mediada por células, facilitando a função de macrófagos
e células NK (SPINOSA, 1999). Davis et al. (2003) relataram o uso do P. acnes
na profilaxia das inflamações pulmonares crônicas em eqüinos. Nos estudos
realizados com estes animais tratados houve um aumento de IFN, NK e células
monucleares da circulação periférica. Os autores sugerem que a ação
imunomoduladores do P. acnes se dá pelo aumento da produção de IL-1, IFN e
NK. O P. acnes foi utilizado com sucesso na terapia de endometrites,
osteomielite em equinos e no tratamento de feridas (VAN KAMPEN, 1997). Hall
et al. (1994) apresentaram resultados positivos no uso do P. acnes no
tratamento de Papiloma Bovino, com aplicações intralesionais. Os animais
apresentaram regressão completa das lesões em 15 semanas.
b) BCG (Bacilo de Calmette-Guerrin) O BCG constitui-se de uma cepa vacinal atenuada do Mycobacterium
bovis é um dos mais potentes potencializadores da síntese de citocinas, devido
à ativação de macrófagos, mas também exerce uma potencialização
generalizada da fagocitose, das respostas mediadas por células B e células T
(TIZARD, 2002).
16
Segundo Van Kampen (1997) o BCG tem sido usado com sucesso no
tratamento de diarréias causadas por Escherichia coli em bezerro. Os animais
tratados apresentam melhora nos sintomas clínicos, além de haver diminuição
na taxa de mortalidade.
c) PIND-ORF (Baypamun®, Bayer) PIND – ORF, comercialmente conhecido como Baypamun® é um
imunomodulador constituído da estirpe viral D1701 do Parapoxvírus que
acomete os ovinos, e como outros imunomoduladores, ativa os mecanismos
imunes antígeno–independentes, como a produção de interferon pelas células
mononuclerares infectadas por vírus; diferenciação de células imaturas em
células maduras e proliferação dos linfócitos. Em trabalhos realizados por
Castrucci et al.(2000) verificou-se a efetividade do imunomodulador
Baypamun® , limitando a disseminação do HBV-1 (Herpesvírus Bovino tipo-1).
Bovinos infectados experimentalmente com HBV-1 foram divididos em grupos
tratados e não tratados com imunomodulador. Os animais infectados e que
receberam Baypamun® apresentaram sinais clínicos da doença. No mesmo
experimento, animais saudáveis coabitaram com um animal infectado sendo
que apenas metade dos animais saudáveis receberam Baypamun®; como
resultado, os animais não- tratados desenvolveram sintomatologia da clássica
e severa da doença, enquanto os animais que receberam imunomodulador
forma apenas parcialmente afetados (CASTRUCCI et al., 1996).
Bovinos infectados experimentalmente com BHV-1, após alguns dias,
apresentaram a forma clássica da Rinotraqueíte Infecciosa. Permitiu–se que
estes animais enfermos permanecessem em contato com animais saudáveis
17
receberam tratamento com Baypamun® em diferentes protocolos de
administração e em diferentes tempos. Todos os animais tratados por 4 dias
consecutivos não demonstraram qualquer sinal da doença (CASTRUCCI et al.,
1998).
d) Vacina Bacteriana Mista anti – Escherichia coli e Salmonella Dublin(SD) A salmonelose e a colibacilose são enfermidades bacterianas infecto-
contagiosas ocasionadas por estirpes patogênicas de Salmonella Dublin (SD) e
Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) que afetam os bovinos
lactantes,ocasionando elevados prejuízos econômicos (WITTUM et al., 1993).
A Escherichia coli enterotoxigênica ETEC causa diarréia em bezerros com
menos de duas semanas de idade e a SD acima de duas semanas.
A vacinação de fêmeas prenhes, usando células mortas de Salmonella
sp. adsorvidas em diferentes adjuvantes, tem demonstrado que estas
produzem anticorpos (MORTOLA et al.,1992). Duas doses de bacterina de SD,
por via subcutânea, nos últimos meses de gestação de fêmeas e uma dose nos
bezerros entre 15 a 30 dias de vida, foram suficientes para redução da taxa de
mortalidade.
No caso da Escherichia coli, as vacinas podem ser mais específicas, se
preparadas com a presença do antígeno K99 (MYERS,1980;GARCIA et
al.,1994). Quando são emulsionadas em óleo mineral ou adsorvidas em
hidróxido de alumínio, determinam o aumento na duração da imunidade de
vacas e reduzem a mortalidade em bezerros. No Brasil, Ávila et al. (1986)
verificaram que estas vacinas induzem à produção de anticorpos nas vacas
18
vacinadas e que estes são transferidos para os bezerros através do colostro.
Alguns autores como Kiddy et al. (1974) afirmam que a concentração de
imunoglobulinas séricas de vacas diminuí acentuadamente nas últimas cinco
semanas antes do parto , ao passo que outros pesquisadores acreditam que a
transferência máxima de imunoglobulinas da corrente sanguínea para glândula
mamária ocorre num período mais curto , entre duas e três semanas antes do
parto (BRANDOM et al ., 1971).
2.2.2.1 Levamisol
O levamisol é um fármaco anti-helmíntico de amplo espectro utilizado no
tratamento de parasitoses intestinais Oliveira e Freitas (1998) relataram as
vantagens do uso de levamisol, comparado com a doramectina no controle de
parasitos em bovinos, podendo trazer outros benefícios ao rebanho, que
poderiam ou não ser atribuídos ao uso dos medicamentos para o controle de
parasitas, como ganho de peso do rebanho. Seu uso como imunopotenciador
foi descoberto em 1974 (RENOUX e RENOUX, 1974), em camundongos
infectados com Brucella abortus. Concomitantemente à ação anti-helmíntica,
este fármaco atua no sistema imunológico de maneira semelhante ao hormônio
timopoietina, produzido no timo que influi na maturação dos linfócitos T.
Estimula a ação de células T e a resposta aos antígenos, potencializa a
produção de interferons e aumenta a atividade fagocitária de macrófagos e
neutrófilos, estimula a citotoxicidade mediada por células, a produção de
linfócitos (TIZARD, 2002).
19
Além de suas funções no controle de parasitas (MONTENEGRO et al,
1991), o levamisol tem sido utilizado como imunopotenciador, devido às suas
propriedades na restauração de neutrófilos defeituosos e na fagocitose
(MONTENEGRO et al., 1992) . No entanto, ainda existem divergências quanto
a ação do esse medicamento na imunidade do hospedeiro.
Weckx et al. (2009) avaliaram a eficácia do levamisol no tratamento
profilático de estomatite, esperando aumento na capacidade imunológica do
grupo que recebeu levamisol como droga estimuladora, contudo os resultados
não foram significativos, comparados ao grupo controle, que recebeu placebo.
Embora o levamisol seja indicado para restauração da resposta imunológica
celular, trabalhos vem sendo revisados e há discussões sobre o real efeito do
levamisol na reprodução.
VOJTIC,(1998) tratou vacas de leite com retenção de placenta ou
descarga uterina purulenta e obteve uma reação imune reforçada levando a um
aumento significativo na circulação de neutrófilos e eosinófilos no pós-parto.
Aplicações de levamisol durante o período pré-parto (em torno seis
semanas antes do parto) diminuiu significativamente a incidência de mastite,
mortes fetais e metrite devido a sua atividade imunoestimuladora em vacas
(GURBULAK et al.,2004) .
Recentemente, PARNACI et al (2009) estudaram o efeito benéfico do
levamisol em um grupo de vacas (n = 20) tratadas com o fármaco na dosagem
de 2,5 mg Kg -1 de PV. O grupo controle (n=13) recebeu a mesma dosagem de
solução salina. As vacas receberam o levamisol seis e duas semanas antes do
parto previsto. Os animais tratados com levamisol apresentaram melhor
20
involução uterina e inicio da atividade ovariana mais cedo no pós-parto em
relação aos animais do grupo controle.
Do acima exposto, infere-se que as substancias com atividade
imunoestimulante inespecífica podem ser utilizadas para melhorar a função
reprodutiva no pós-parto. Dessa forma, o presente trabalho objetiva contribuir
para um melhor conhecimento do efeito do Levamisol na função imunológica e
na reprodução pós-parto.
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais O experimento foi realizado em dois rebanhos leiteiros em boas
condições sanitárias e nutricionais. O primeiro rebanho, pertencente ao
CAPTA/Leite do Instituto de Zootecnia, em Americana/SP, era formado por
vacas Holandesas e o segundo rebanho, da Estação Experimental do Pólo do
Centro Leste, da APTA Regional de Ribeirão Preto/SP, era formado por vacas
Jersey. De cada rebanho foram selecionadas vacas no terço final de gestação,
sendo 16 vacas da raça Holandesa e 14 da raça Jersey, para aplicação dos
tratamentos experimentais.
3.2. Tratamentos O ensaio foi delineado da seguinte forma:
Grupo 1: Formado de oito vacas Holandesas e sete Jersey. Seis semanas
antes da data prevista do parto, os animais receberam um injeção
intramuscular (IM) de 3,75mg Kg -1 de PV ( 1 mg do princípio ativo Fosfato de
22
Levamisol- Ripercol L-150, Fort Dodge Saúde Animal), com reforço da mesma
dosagem 21 dias após.
Grupo 2 (Controle): Semelhante ao Grupo 1, substituindo o Levamisol por
solução salina.
3.3. Coleta de amostras Amostras de sangue foram coletadas da veia jugular utilizando tubos
vacutainer V&D seco (Greiner) de todas as vacas no momento da primeira
(dia 0) e segunda injeção (dia 21) e logo após o parto. Após centrifugação o
soro foi separado e estocado congelado (-20 0C) até posterior analise.
Adicionalmente, amostras de colostro foram coletadas logo após o parto em
garrafas plásticas de 200mL cada e armazenado a – 80 0C.
3.4. Dosagem de IgG
a) No soro As amostras individuais de soro foram descongeladas e eluidas em
coluna de sefarose – proteína A (HiTrap Protein A agarose HP 1mL, GE
Healthcare) segundo o procedimento abaixo ( OI e HEZENBERG.,1980): a
coluna preparada com 2 cm de gel de agarose, foi lavada com 20 mL de
solução tampão PBS (Solução tampão fosfato), pulsionada por bomba
peristáltica (Modelo Pump – P-1, Fabricante Pharmacia Biotech,) com fluxo de
6 mL por hora A cada 1,5mL de soro foram adicionados, 4mL de solução de
PBS e filtrado em membrana millipore de 0,22µm.
23
A seguir, o soro filtrado (5,5 mL) foi colocado na coluna (HiTrap Protein
A agarose HP 1mL, GE Healthcare) em sistema fechado, por 6 horas
utilizando uma bomba peristáltica (vazão de 10 mL por hora). Após este
período, a coluna foi lavada com 20 mL de tampão PBS, ficando retidos na
coluna apenas imunoglobulinas do tipo IgG ligadas na proteína A da coluna.
O terceiro passo foi lavar a coluna com Tampão Glicina – NaHCL pH3
para que as Imunoglobulinas fossem desprendidas da proteina A. Alíquotas de
2 mL foram coletadas em série, em tubos marcados de 1 a 9 contendo 50µL
do Tampão Tris – HCL, pH 9,0. O tubo controle recebeu 50µL do tampão Tris –
HCL mais 2mL de tampão Glicina. Após a eluição, a coluna foi novamente
lavada por uma hora com solução de PBS e timerosal 0,1 % para ser
acondicionada até o próximo dia.
De cada tubo de ensaio foi retirada 1 mL do eluido e foi realizada a
leitura em espectrofotômetro (Modelo Genesys 10 uv, Fabricante Thermo
Scientifitic) a 280 nm. A correlação de absorbância: mg de IgG mL-1 foi
calculada em 1,3:1.
24
Figura 3. Soro sendo filtrado na coluna em sistema fechado.
Figura 4. Coleta do eluído para leitura no espectro fotômetro
25
b) No colostro
As amostras de colostro total foram descongeladas em temperatura
ambiente e homogeneizadas. Para o teste do refratômetro, 1mL de colostro foi
separado e observado em refratômetro óptico Brix 0 -32 (EXTECH MODELO
2132, JAPAN) segundo Bielmann et al.(2010 ).
Os dados referentes ao desempenho reprodutivo (data de parição,
período de serviço e taxa de prenhez) e as eventuais patologias no pós- parto
foram anotadas nas fichas zootécnicas dos animais e a analise dos dados foi
realizada utilizando o teste no paramétrico de Chi quadrado, com a correção de
Yates (GOMES, 1999).
26
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Rebanho Holandês
Os animais apresentarem níveis de IgG entre 0,200 e 0,250 mg mL -1,
(Figura 5). Esses valores estão abaixo dos níveis de referência relatados por
Harlow e Lane (1988) os quais encontraram uma concentração de IgG no soro
sanguíneo entre 8 e16 mg mL -1 nos bovino.
Tabela 1 - Análise estatística dos resultados de qu antificação de IgG
mg mL -1 (Rebanho Holandês).
Coleta Grupo 1 2 3 Tratamento 0,21a 0,23a 0,20a Controle 0,25a 0,24a 0,22a *Teste t a 5 % de significancia. Letras iguais não diferem estatisticamente
27
Figura 5. Níveis séricos de IgG d o rebanho Holandês
Os níveis de IgG do grupo controle foram maiores que o grupo tratado
(P<0,05). (Figura 6)
Figura 6. Índice de Refração do Colost ro
0 2 4 6 8
10
12
14
16
Tratamento Controle
Grupos
%
Refratometro %
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
1 2 3
Coleta
mg mL -1
Tratamento
Controle
28
Fleenor e Stott (1980) classificaram colostros com teores abaixo de 21,8
mg Ig. mL –1 como de baixo valor imunológico e acima de 49,82 mg Ig. mL –1
de alto valor imunológico. Outros autores encontraram valores mais elevados
que variam entre 50 e 90 mg Ig. mL –1 (MORIN et al.,2001). O valor Brix de
22% corresponde a 50 mg IgG mL –1 , ou seja, o colostro com um valor Brix
acima deste ponto de corte pode ser considerado colostro de alta qualidade
(BIELMAN et al., 2010).
Com relação às patologias pós parto do rebanho Holandês, foi registrado
um caso de retenção de placenta em cada grupo experimental.
Finalmente, por motivos de interesse institucional o rebanho Holandês
foi preparado para ser inseminado em tempo fixo (IATF), utilizando um
protocolos de sincronização hormonal da ovulação e inseminação com sêmen
sexado. Essa situação não permitiu fazer uma analise da eficiência reprodutiva
decorrente do tratamento com Levamisol ou comparar os resultados com o
rebanho Jersey. De qualquer forma, os resultados da IATF foram analisados,
sendo que não houve influencia do tratamento com Levamisol na taxa de
prenhez (Tabela 2).
29
Tabela 2 - Taxa de prenhez de vacas Holandesas trat adas com Levamisol
e submetidas a IATF com sêmen sexado
Grupo Vacas Prenhas Taxa Prenhez Tratamento (4/8) 50% Controle (3/8) 37% Total (7/16) 43%
4.1. Rebanho Jersey O rebanho das vacas Jersey apresentou níveis de IgG entre 0,5 e 1,3
mg mL -1 (Figura 7).
Figura 7. Níveis séricos de IgG do rebanho Jersey
Da mesma forma que as vacas Holandesas, esses valores estão
abaixo dos níveis de referência (HARLOW e LANE., 1988).
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3
Coletas
mg mL -1
Tratamento
Controle
30
Tabela 3 - Análise estatística dos resultados de qu antificação de IgG
mg mL -1 (Rebanho Jersey).
Coleta
Grupo 1 2 3 Tratamento 0,24b 0,28b 0,59b Controle 0,52b 0,85b 1,23b *Teste t a 5 % de significancia. Letras iguais não diferem estatisticamente
Alguns autores acreditam que a transferência de imunoglobulinas da
corrente sanguínea para glândula mamária para formação do colostro seja a
causa da queda acentuada dos níveis de imunoglobulinas sanguíneos entre
duas a três semanas antes do parto (BRANDON et al., 1971). No entanto, a
analise de IgG no colostro não foi correlacionada com a queda de IgG no soro.
O período de serviço é o tempo transcorrido entre o parto e a primeira
inseminação. Dessa forma, o período de serviço não pode ultrapassar 90 dias
para se obter um intervalo entre partos de 12 meses, ou seja, uma cria por ano
(AZEVEDO et al., 2001). O tratamento com Levamisol pareceu não influenciar
esse parâmetro reprodutivo, uma vez que o grupo controle levou em média 82
dias contra 92 dias para a primeira IA após o parto (Figura 8).
31
Figura 8. Dias para o primeiro serviço (1a IA) do R ebanho Jersey
O número de serviços por concepção foi 1,5 para o grupo controle e 1,3
para o tratado com Levamisol (Figura 9). Ambos resultados estão dentro da
meta de 1,8 a 2,2 considerada ótima no manejo reprodutivo dos rebanhos
(ALVAREZ, 2008).
Figura 9. Número de serviços por vaca do rebanho Je rsey
32
Não foram registradas patologias reprodutivas no rebanho Jersey, com
exceção de uma vaca com retenção de placenta do grupo tratado com
Levamisol.
As vacas do rebanho Jersey foram inseminadas no primeiro cio natural,
sendo a taxa de prenhez dos dois grupos de 64%( 9/14). Não houve diferença
significativa (P>0,5) na taxa de prenhez do grupo controle (71%) em
comparação ao grupo tratado com Levamisol (57%) (Tabela 4).
Tabela 4. Taxa de Prenhez dos animais do rebanho Je rsey
Grupo Vacas Prenhas Taxa de Prenhez
Levamisol (4/7) 57%
Controle (5/7) 71%
Total (9/14) 64%
33
5. CONCLUSÕES
-O uso de fosfato de Levamisol não alterou os níveis de IgG no plasma
ou no colostro de animais tratados no pré-parto.
-Novos estudos são necessários para verificar a capacidade
imunoestimuladora do Levamisol.
.
34
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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