FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE … · CULTURA RECIFE Fevereiro/2010 Márcia Maria Costa...

Márcia Maria Costa Assunção

FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE

BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE

ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA

CULTURA

RECIFE

Fevereiro/2010

ASSUNÇÃO, M. M. C. Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE

BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE

ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA

CULTURA

RECIFE

Fevereiro/2010

Márcia Maria Costa Assunção Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Micologia Aplicada Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Menezes


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FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE BANANEIRA (Musa

spp.) E SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA

CULTURA

Márcia Maria Costa Assunção

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES ______________________________________________________________________

Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti (Orientadora) Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Profº. Drº José Luiz Bezerra Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)

Profª. Drª. Leonor Costa Maia Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Profº. Drº João Lúcio de Azevedo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ)

Profº. Drº Ludwig H. Pfenning Universidade Federal de Lavras (UFL)

SUPLENTES

Profª. Drª. Oliane Maria Correia Magalhães Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Profº. Drº Rildo Sartori Barbosa Coelho Instituto de Pesquisa Agropecuária (IPA)


4

Dedicatória A meus pais, Francisco Dias da Costa e Marlene Cardoso da Costa in memoria, por

dar-me a vida, amor e respeito ao próximo.

A eles, que jamais esquecerei.

Meu amor eterno.

Ao marido, companheiro de todas as horas, na alegria e na tristeza, Marcos dos Santos

Assunção, pelo amor e ajuda constante, sempre ao meu lado.

A nossa filha Mariane Costa Assunção, nossa maior vitória, alegria de nossas vidas,

sem ela não haveria felicidade.

Por compreenderem minha ausência e meu amor.

Minha dedicação constante.


5

Menção Especial

A Profª Drª Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti, não apenas pela valiosa

orientação durante a realização deste trabalho, mas pelo conhecimento

científico/micológico, amizade, respeito, presença constante em todos esses anos de

convivência, contribuindo para realizar um sonho, tornou-se uma amiga e um exemplo a

ser seguido. Meus agradecimentos vão muito além da sua orientação e seria impossível

expressá-los com palavras em uma folha de papel.

Logo,

Existem pessoas que lutam um dia e são boas.

Existem pessoas que lutam por algum tempo e são muito boas.

Há pessoas que lutam por muito tempo, e são melhores ainda.

Mas existem aquelas que lutam por toda vida.

Estas são “imprescindíveis.”

Bertold Brecht

Meu eterno reconhecimento


6

Sinceros e especiais agradecimentos

� A Energia Superior que criou todos os seres vivos, principalmente os fungo, sem

os quais não haveria vida na Terra.

� Aos Espíritos de Luz, que nos guiam em todas as jornadas da vida.

� A minha amada família Marcos dos Santos Assunção e Mariane Costa

Assunção, sem eles, este trabalho não seria possível.

� Á Profª Drª Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti pelo privilégio de tê-la

como minha orientadora.

� Á Profª Drª Maria Menezes, pelas orientações, disponibilidade, paciência.

Pessoa de caráter, exemplo de força e perseverança, que traz consigo um coração

bondoso, com conhecimentos extraordinários.

� A minha querida irmã Mércia Cardoso Guimarães e família.

� As Professoras Profª Drª Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos

Fernandes pela identificação do gênero Fusarium e amizade sincera em todos os

momentos.

� À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Micologia da Universidade

Federal de Pernambuco, sob orientação das Professoras Drª Leonor Costa Maia e

Elaine Malloso, pela oportunidade de realização do Curso de Doutorado em

Biologia de Fungos.

� Aos Professores do Doutorado em Biologia de Fungos, que contribuem na

formação dos alunos.

� A amiga Thaís Emanuelle F. de Lima pela grande ajuda nos gráficos.

� Aos companheiros de laboratório, Thaís Emanuelle F. de Lima, Elaisa Cristina

dos Anjos, Renata G. de Souza, Michelline Lins Silvério e Roger Fagner Melo.

� Aos colegas do Doutorado em Biologia de Fungos, em especial a Raquel e

Marta pelos momentos de descontraçã e amizade.

� A Alexsandra Vaz de Araújo Silva e Mariane Costa Assunção pela valiosa ajuda

nas fotos dos pareamentos.

� Ao Drº Venézio Felipe dos Santos pela análise estatítica, pessoa de grande

conhecimento.

� A Giovanna Guterrez secretária do Departamento de Micologia, sempre disposta

e alegre para ajudar.


7

� A Bibliotecária Márcia Solange Mendes Silva de Amorim.

� Á Fundação de Amparo á Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambucoco

(FACEPE) pela concessão da bolsa de estudo (Processo Nº-BPG–0001–

2.12/07).

� A Faculdade de Formação de Professores de Belo Jardim (FABEJA), sob

orientação da Diretora-Presidenta Srª. Bernardina Santos Araújo de Sousa.

� Aos proprietários das áreas de coletas de Belo Jardim Sr. Sebastião da Silva

(sítio Araça), Sr. José Davi de Araújo (sítio Serra dos Ventos), Sra. Dionízia de

Moura Feitosa (sítio Taboquinha) e Sr. Cizenando João da Silva (sítio Freixeira),

que gentilmente disponibilização suas propriedades para as coletas.

� A todos que direta ou indiretamente contribuíram com esta pesquisa.

Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode

começar agora e fazer um novo fim.

Chico Xavier

MUITO OBRIGADA


8

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1 Metodologia utilizada para isolamento dos fungos endofíticos de folhas sadias da bananeira (Musa spp.). A. Discos retirados de folhas sadias; B. Distribuição dos discos em BDA suplementado com 250 mg/L de cloranfenicol; C. Crescimento fúngico nas bordas dos discos foliares; D. Fungos endofíticos purificados e isolados ........................................................

55

Figura 2 Representação esquemática, da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e do fitopatógeno (B), na placa de Petri, para ensaio de antagonismo e medição da velocidade de crescimento, pelo método de pareamento ...............

57

Figura 3 Esquema da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e fitopatógeno (B) na placa de Petri, com uma divisória, para ensaio de antagonismo por metabólitos voláteis............................................................................................

60

Figura 4 Frequência dos grupos de fungos endofíticos isolados de Musa spp.................

64

Figura 5 Frequência de ocorrência dos 24 gêneros de fungos endofíticos isolados em folhas de quatro cultivares de bananeiras, no município de Belo Jardim/PE ...

65

Figura 6 Pareamento dos fungos endofíticos contra Fusarium oxysporum f. sp. cubense (na parte inferior da placa de Petri), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA......................................................................................................

94

Figura 7 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense, cultivados em BDA, aos 14 dias ............

95

Figura 8 Pareamento dos fungos endofíticos contra Colletotrichum musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................

96

Figura 9 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Colletotrichum musae, cultivados em BDA, aos 14 dias..................................

97

Figura 10 Pareamento dos fungos endofíticos contra Pseudocercospora musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................

98

Figura 11 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Pseudocercospora musae, cultivados em BDA, aos 14 dias ............................

99

Figura 12 Pareamento dos fungos endofíticos contra Cladosporium musae (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................

100 Figura 13

Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Cladosporium musae, cultivados em BDA, aos 14 dias ...................................

101


9

Figura 14

Pareamento dos fungos endofíticos contra Deightoniella torulosa (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA................... 102

Figura 15 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Deightoniella torulosa, cultivados em BDA, aos 14 dias .................................

103

Figura 16 Pareamento dos fungos endofíticos contra Mycosphaerella musicola (na parte inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio de BDA...................................................................................................................

104

Figura 17 Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Mycosphaerella musicola, cultivados em BDA, aos 14 dias ............................

105

Figura 18 Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas). a) Acremonium bacillisporum; b) Acremonium strictum, mostrando inibição de crescimento micelial do fitopatógeno ...........................

106

Figura 19 Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas). a) Acremonium pollychoroma; b) Alternaria alternata; c) Xylaria sp.; d) Curvularia lunata var. aeria, mostrando produção de exsudato e um halo escuro por parte do fitopatógeno.........................................

106

Figura 20 Teste de inibição entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior das placas) e a) Fusarium solani; b) Nigrospora oryzae, mostrando produção de exsudato e alterações no crescimento micelial do fitopatógeno........................................................................................................

107

Figura 21 Teste de volatilidade entre Colletotrichum musae (colônias na parte superior das placas). a) Colletotrichum gloeosporioides; b) Nodulisporium gregarium; c) Nigrospora oryzae; d) Alternaria alternata; e) Tritirachium oryzae, mostrando inibição parcial do crescimento micelial do fitopatógeno........................................................................................................

108

Figura 22 Teste por volatilidade entre Mycosphaerella musicola (colônias na parte superior das placas) e: a) Curvularia lunata var. aeria; b) Paecilomyces lilacinus; c) Fusarium solani; d) Xylaria sp., mostrando alterações das colônias do fitopatógeno....................................................................................

109

Figura 23 Teste de volatilidade entre Cladosporium musae (colônias na parte superior das placas) e: a) Alternaria alternata; b) Drechslera hawaiiensis; c) Curvularia eragrostidis, mostrando inibição parcial das colônias do fitopatógeno........................................................................................................

110

Figura 24 Teste de inibição por volatilidade entre Fusarium oxysporum f. sp. cubense (colônias na parte superior das placas) e: a) Nigrospora oryzae; b) Pestalotiopsis maculans; c) Paecilomyces lilacinus; d) Nodulisporium gregarium...........................................................................................................

111


10

LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1 Síntese das características gerais dos locais de coleta no município de Belo Jardim/PE ..........................................................................................................

53

Tabela 2 Notas atribuídas ao grau de crescimento dos fungos endofíticos em direção ao fitopatógeno (Bell et al., 1982).....................................................................

59

Tabela 3 Unidades formadoras de colônias (UFC) e frequência de ocorrência (%) dos fungos endofíticos isolados dos discos foliares de bananeira (Musa spp.), em quatro coletas realizadas no município de Belo Jardim/PE ..............................

67

Tabela 4 Unidades formadoras de colônias e frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp) ................................................

75

Tabela 5 Fungos endofíticos isolados, de discos foliares de bananeira (Musa spp.), em relação à idade fenológica das folhas ................................................................

78

Tabela 6 Número de UFC e Frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em bananeiras nas quatro áreas de coletas, no município de Belo Jardim/PE...........................................................................................................

79

Tabela 7 Unidades formadoras de colônias de fungos endofíticos isolados em quatro áreas de coletas (Araçá, Freixeira, Serra dos Ventos e Taboquinha), no município de Belo Jardim/PE e categorias de constância (S=Acidental, A=Acessória e C=Constante) ............................................................................

81

Tabela 8 Número de espécies de fungos endofíticos associados e comuns e índice de similaridade entre as áreas de coleta, no municípiode Belo Jardim/PE ............

82

Tabela 9 Frequência de ocorrência e unidades formadoras de colônias (%) de fungos endofíticos em folhas de quatro cultivares de bananeira (Musa spp.)....................................................................................................................

84

Tabela 10 fungos endofíticos isolados (UFC) em quatro cultivares (‘Nanicão’, ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), do município de Belo Jardim/PE................

85

Tabela 11 Número de espécies associadas e comuns e índice de similaridade de fungos endofíticos (segundo Sørensen), isolados em quatro cultivares de bananeira (‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE .......................................................................................................... 86


11

Pág. Tabela 12 Número de fungos endofíticos isolados de bananeira (Musa spp.) no

município de Belo Jardim/PE, em quatro coletas, na estação chuvosa e de estiagem .............................................................................................................

87

Tabela 13 Índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM) dos fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em meio de BDA .............................................................................

89

Tabela 14 Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos isolados, de folhas de bananeira com sintomas, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em meio de BDA .............................................................................

90

Tabela 15 Classificação dos fungos endofíticos em relação à inibição de fitopatógenos, segundo teste de antagonismo, em cultivo pareado, por 14 dias, em meio de BDA ..................................................................................................................

92


12

RESUMO

FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE BANANEIRA (Musa spp.) E SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS A FITOPATÓGENOS DESSA

CULTURA

A bananeira (Musa spp.) está presente em todas as regiões tropicais e subtropicais,

sendo a banana a fruta mais conhecida e cultivada. No Brasil a bananicultura é

atividade de importância econômica e social. O fungo endofítico habita o interior dos

tecidos aéreos do hospedeiro, pelo menos durante uma fase do seu ciclo de vida,

desempenhando variadas e estreitas relações ecológicas, sem demonstrar sintomas

visíveis. Com o objetivo de isolar, identificar e avaliar o potencial antagônico dos

fungos endofíticos de folhas de bananeiras contra os fitopatógenos Cladosporium

musae, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Colletotrichum musae, Deightoniella

torulosa, Pseudocercospora musae e Mycosphaerella musicola, através de testes in

vitro, foram realizadas quatro coletas seguindo-se de isolamento e identificação de

fungos endofíticos de folhas sadias (nova, intermediária e velha) de quatro cultivares

de bananeira (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), do município de Belo

Jardim/Pernambuco, no período chuvoso e de estiagem. No total, foram identificadas

40 espécies de fungos endofíticos originadas de 751 colônias a partir de 1728 discos

foliares. Apresentaram maior frequência de ocorrência em relação ao número de

unidades formadoras de colônias: Acremonium polychoroma, Alternaria alternata,

Cladosporium cladosporioides, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum.

musae, Deightoniella torulosa, Fusarium solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium

gregarium, Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans, Guignardia musae. A

maior frequência de colonização por fungos endofíticos foi verificada em folhas

velhas, no cultivar ‘Pacovan’. Maiores índices de frequência foram registrados no

período chuvoso. Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e Nodulisporium

gregarium apresentaram mais eficiência nos testes de antagonismo in vitro contra os

fitopatógenos testados.

Palavras-chave: Fungo endofítico, Musa spp., antagonismo, metabólitos voláteis


13

ABSTRACT

ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED FROM LEAVES OF BANANA TREE (Musa spp.) AND SELECTION OF ANTAGONISTIC ISOLATES A GAINST FUNGAL

PATHOGENS OF THAT CULTURE

The banana (Musa spp.) is present in all tropical and subtropical regions and is the best

known and most cultivated fruit crop worldwide. In Brazil, the banana cultivation is an

activity of economic and social importance. Endophytic fungi live inside the aerial

tissues of the host, at least during one phase of its life cycle, performing many intimate

ecological relationships without producing disease symptoms. In order to isolate,

identify and evaluate the potential antagonistic of fungal endophytes of healthy leaves

of banana plants against the pathogens Cladosporium musae, Fusarium oxysporum f.

sp. cubense, Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Pseudocercospora musae e

Mycosphaerella musicola, through “in vitro” assaus, four samples were taken followed

by isolation and identification of fungal endophytes of healthy leaves (new,

intermediate and old) from four varieties of banana (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Prata-Anã’

and ‘Maçã’), in the municipality of Belo Jardim/Pernambuco, during the rainy and dry

seasons. In total, 40 species of fungal endophytes were isolated from 751 colonies from

1728 leaf discs. The following fungal species showed higher frequency of occurrence in

relation to the number of colony forming unis: Acremonium polychoroma, Alternaria

alternata, Cladosporium cladosporioides, Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Fusarium solani, Nigrospora oryzae,

Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans and

Guignardia musae. The highest frequency of colonization by endophytic fungi was

detected in old leaves of the cultivar ‘Pacovan’. Higher rates of frequency were

registered during the rainy period. Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e

Nodulisporium gregarium showed better performance in tests of antagonism in vitro

against the pathogens.

Key-words: Endophyte fungi, Musa spp., antagonism, volatile metabolites.


14

SUMÁRIO

Pág.

AGRADECIMENTOS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 17

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................... 19

2.1. AGRICULTURA .................................................................................................. 19

2.2. BANANICULTURA ............................................................................................. 20

2.2.1. Origem, evolução e morfologia da bananeira.......................................................... 21

2.2.2. Exigências climáticas da bananeira......................................................................... 23

2.2.3. Utilidades da bananeira........................................................................................... 24

2.3. FUNGOS ENDOFÍTICOS .................................................................................. 25

2.3.1. Conceitos de fungos endofíticos.............................................................................. 25

2.3.2. Importância do estudo dos fungos endofíticos........................................................ 26

2.3.3. Entrada, dispersão e transmissão dos fungos endofíticos........................................ 27

2.3.4. Isolamento e identificação de fungos endofíticos................................................... 28

2.3.5. Interação fungo endofítico /hospedeiro .................................................................. 29

2.3.6. Especificidade do fungo endofítico pelo hospedeiro .............................................. 31

2.3.7. Fungos endofíticos de ambientes tropicais ............................................................. 32

2.3.8. Ocorrência de fungos endofíticos em Musa spp. .................................................... 33

2.4. INTERAÇÃO PLANTA/FITOPATÓGENO .................................................... 34

2.4.1. Principais fitopatógenos da bananeira .................................................................... 35

2.5. CONTROLE BIOLÓGICO ................................................................................ 37

2.5.1. Conceito de controle biológico ............................................................................... 38

2.5.2. Fungos antagonistas ................................................................................................ 39

2.5.3. Controle biológico de fitopatógenos por fungos endofíticos.................................. 41

2.6. FUNGOS ENDOFÍTICOS PRODUTORES DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS ......................................................................................... 42


15

Pág.

2.6.1 Produção de enzimas extracelulares ....................................................................... 44

2.6.2. Produção de metabólitos por fungos ...................................................................... 45

2.6.3. Metabólitos voláteis ................................................................................................ 46

2.7. MÉTODOS DE SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS IN VITRO ....................... 47

2.8. MECANISMO DE AÇÃO ANTAGONISTA CONTRA FITOPATÓGENO 49

2.8.1. Antibiose ................................................................................................................. 49

2.8.2. Competição por espaço e nutrientes ....................................................................... 50

2.8.3. Indução de resistência ............................................................................................. 50

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 52

3.1. Áreas de coletas ...................................................................................................... 52

3.2. Cultivares utilizadas para isolamento dos fungos endofíticos................................. 53

3.3. Isolamento de fungos endofíticos............................................................................ 53

3.4. Identificação dos fungos endofíticos....................................................................... 55

3.5. Seleção de antagonistas in vitro ............................................................................. 56

3.5.1. Obtenção de fungos endofíticos e fitopatógenos utilizados para teste de

antagonismo in vitro ...............................................................................................

56

3.5.2. Determinação do índice de velocidade de crescimento micelial de fungos

endofíticos e fitopatógenos in vitro, em cultivo individual ....................................

56

3.5.3. Seleção de fungos endofíticos isolados contra fungos fitopatogênicos

selecionados, in vitro ..............................................................................................

57

3.5.3.1. Teste de antagonismo, em culturas pareadas .......................................................... 57

3.5.3.2. Efeito in vitro de metabólitos voláteis, produzidos por fungos endofíticos, sobre

o crescimento micelial de fitopatógenos.................................................................

59

3.6. Análise estatística ................................................................................................... 60

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 63

4.1. Fungos endofíticos isolados de folhas sadias de bananeiras .................................. 63

4.2. Fungos endofíticos isolados por estádios fenológicos das folhas de bananeiras .... 75

4.3. Fungos endofíticos isolados por áreas de coletas ................................................... 79

4.4. Isolamento de fungos endofíticos por cultivares .................................................... 83

4.5. Influência da sazonalidade na ocorrência dos fungos endofíticos .......................... 86


16

Pág.

4.6. Índice da velocidade de crescimento dos fungos endofíticos e fitopatógenos,

individualmente .........................................................................................................

88

4.7. Avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra fitopatógenos, in

vitro, em cultura pareada ...........................................................................................

91

4.7.1. Comportamento antagônico dos fungos endofíticos isolados, em relação a

Fusarium oxysporum f. sp. cubense...........................................................................

92


Colletotrichum musae.................................................................................................

95


Pseudocercospora musae...........................................................................................

97


Cladosporium musae..................................................................................................

99


Deightoniella torulosa................................................................................................

101


Mycosphaerella musicola...........................................................................................

103

4.8. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Pseudocercospora

musae..........................................................................................................................

105

4.9. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Colletotrichum

musae..........................................................................................................................

107

4.10. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Mycosphaerella

musicola......................................................................................................................

108

4.11. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Cladosporium

musae.........................................................................................................................

109

4.12. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Fusarium

oxysporum f. sp. cubense................................................. ..........................................

110

5. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 113

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 115


17

1. INTRODUÇÃO

A produção mundial de bananas (Musa spp.) em 2007 foi de aproximadamente

59.496.958 toneladas, sendo o continente asiático o maior produtor (FAO, 2009). O

Brasil destaca-se mundialmente, com produção de 7.098.353 toneladas e área plantada

de 519.187 hectares (IBGE, 2009), colocando-se como segundo maior produtor e

segundo em área plantada no mundo, perdendo apenas para a Índia (FAO, 2009). Os

estados de São Paulo, Bahia, Pará, Santa Catarina, Minas Gerais e Pernambuco são os

mais importantes, tanto em área colhida quanto em produção (IBGE, 2009). O Nordeste

é responsável por 35% da produção nacional de bananas (Soares et al., 2008). Segundo

Silva et al. (2002), as cultivares ‘Prata’ e ‘Pacovan’ são responsáveis por 60% da área

cultivada no Brasil e ‘Nanicão’ corresponde a 47% da produção mundial (Arias et al.,

2004).

Típica planta tropical, a bananeira exige temperaturas entre 20°C e 35ºC, elevada

umidade relativa e precipitações bem distribuídas para produção e desenvolvimento. O

Brasil apresenta condições favoráveis à bananicultura (Alves, 1999), atividade agrícola

de maior expressão econômica e social, contribuindo para a dieta alimentar da

população, principalmente dos mais carentes e reduzindo a fome no mundo (CEAGESP,

2005).

Os fungos constituem os maiores problemas da bananicultura (Silva et al., 2002),

sendo numerosas as investigações sobre enfermidades foliares de origem fúngica,

porém, escassos os relacionados com fungos endofíticos (Urdaneta et al., 2002), que

habitam internamente os tecidos vegetais sem causar danos aparentes (Petrini, 1986). A

maioria dos estudos com fungos endofíticos se concentra em países de clima temperado

(Rodrigues & Petrini, 1997).

Os microrganismos endofíticos habitam o interior de tecidos vegetais pelo menos

durante um período do ciclo de vida, aparentemente sem causar doença (Petrini, 1991),

sendo encontrados especialmente em partes aéreas (Gange et al., 2007). Estudos

moleculares (Rosenblueth & Martínez-Romero, 2006) revelaram riqueza de espécies

endofíticas promovendo aumento da resistência a condições de estresse, alterações

fisiológicas, produção de fitormônios, toxinas, fármacos, imunossupressores,

antitumorais e enzimas (Azevedo et al., 2007), crescimento vegetal, controle de

fitopatógenos, remoção de contaminantes, solubilização de fosfato e assimilação de


18

nitrogênio (Cerigioli, 2005). Por desempenharem variadas e estreitas relações, sem

demonstrar sintomas visíveis, há necessidade de isolamento e cultivo desses fungos em

laboratório (Azevedo & Araújo, 2007).

O uso indiscriminado de agroquímicos contribui para alterar ou eliminar fungos

endofíticos essenciais à manutenção do equilíbrio planta/endófito/ambiente (Glienke,

1995). Forma de aplicação, surgimento de fitopatógenos resistentes e pressões sócio-

econômicas (Johnson & Sanghote, 1994), levam à necessidade do desenvolvimento de

métodos alternativos de controle, que não comprometam a qualidade dos frutos e a

saúde humana. Tratamentos biológicos são utilizados como alternativa aos fungicidas

(CEPEA, 2008), destacando-se os fungos antagonistas, utilizados com êxito, em outras

culturas, em substituição ao controle químico (Sponholz et al., 2004).

Substâncias químicas, produzidas por plantas ou microrganismos, oferecem

novas oportunidades para diversificar o controle de doenças na agricultura, onde fungos

contribuem de forma positiva. A agricultura alternativa busca medidas de proteção das

plantas contra fitopatógenos e o controle biológico aparece como alternativa racional e

necessária à agricultura (Santos et al., 2008).

Considerando a importância da bananicultura para o país e para o mundo, e o

impacto que fungos endofíticos podem apresentar no controle de doenças, à realização

de pesquisas voltadas à associação endófito/planta é relevante podendo contribuir para o

aumento da produção com melhoria ambiental.

O presente trabalho teve por objetivos: isolar e identificar fungos endofíticos de

folhas sadias de bananeiras; analisar a similaridade desses fungos considerando

cultivares, áreas de estudo e efeito da sazonalidade; verificar o índice de crescimento

dos fungos endofíticos e de fitopatógenos da bananeira isoladamente, em meio de

cultura; avaliar o potencial antagônico de fungos endofíticos selecionados, contra

fitopatógenos da bananeira, observando a possível produção de metabólitos voláteis

pelos fungos endofíticos.


19

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. AGRICULTURA

A agricultura originou-se da domesticação de plantas, inicialmente em vários

locais, promovendo mudança na maneira como o homem obtinha seu alimento. O

extrativismo passou a dar lugar à agricultura, transição conhecida como Revolução

Agrícola (Flannery, 1973). A atividade agrícola, documentada pela história e registros

arqueológicos, tem sido inseparável da sociedade humana (Harlan, 1992). Pouco é

conhecido a respeito da dieta dos primeiros homens, mas é aceito que eram caçadores e

coletavam frutas como fonte de alimento. A agricultura modificou a sociedade,

formando a classe dos proprietários de terra, aumentando o impacto do homem sobre a

natureza, substituindo ecossistemas naturais pela produção agrícola (Borém & Milach,

1999).

A globalização do consumo de frutas e procura por produtos naturais saudáveis

requerem segurança na qualidade. No campo, a produtividade das frutas está

relacionada à aplicação de fungicidas, podendo aumentar o nível de contaminantes

químicos. Rotação de cultura, adubação verde e controle biológico levam a uma

agricultura produtiva e equilibrada. Processos biológicos que ocorrem no sistema

solo/planta, efetivado por microrganismos, constituem a base sobre a qual a agricultura

agroecológica se sustenta (Oliveira et al., 2003).

O Brasil tem na agricultura uma das bases mais potentes de economia,

garantindo o fornecimento de cereais, oleaginosas, hortaliças e frutas (Coelho et al.,

2003). É um dos três maiores produtores mundiais de frutas, com produção que supera

34 milhões de toneladas. A cadeia produtiva das frutas abrange 2,2 milhões de hectares,

gera 4 milhões de empregos e um Produto Interno Bruto (PIB) agrícola de US$ 11

bilhões. Em relação às frutas tropicais, o Brasil tem se destacado como importante

produtor e consumidor, expandindo o agronegócio e buscando adequação ao mercado

consumidor. No entanto, o volume de exportação é pequeno, devido a barreiras

comerciais e fitossanitárias, deficiências internas de organização da produção e

comercialização (IBRAF, 2009).

2.2. BANANICULTURA


20

A produção mundial de frutas em 2007 foi em torno de 690.756.513 toneladas

(Nascente, 2007) e a fruta mais produzida foi a banana, com 105,69 milhões de

toneladas, seguida pela melancia e uva (FAO, 2009). A banana é produzida

comercialmente na Austrália, África, Israel, Índia, Uganda, China, Filipinas, Jordânia,

Líbano, Marrocos, Turquia, Egito, Ilhas Canárias (Espanha), Taiwan e Brasil e cultivada

em 124 países, localizados, sobretudo nas regiões tropicais e subtropicais (TodaFruta,

2008).

O Brasil tem destaque no cenário mundial, com produção de 7.208.143 milhões

de toneladas, em área plantada de 527.258 mil hectares (IBGE, 2008), o que o coloca

em segundo lugar em produção e área colhida (FAO, 2006). Embora seja o segundo

maior produtor, sua participação no mercado internacional é pequena, devido à precária

estrutura comercial, baixa qualidade de produção, danos pós-colheita e fatores

fisiológicos e microbiológicos (Rangel et al., 2002).

A banana é cultivada em todos os estados brasileiros, desde a faixa litorânea até

os planaltos do interior (Brasil et al., 2000). A forma como é cultivada varia, desde

plantio sem uso de tecnologia, na maioria dos estados (Souza & Torres Filho, 1999) até

com tecnologias modernas (CEPEA, 2008). A bananicultura brasileira apresenta

características que a diferenciam das regiões produtoras do mundo, tanto em relação à

diversidade climática, quanto ao uso de cultivares e forma de comercialização (Silva,

2000).

O Nordeste brasileiro produz 34% do total nacional, representando a região com

maior potencial para produção de frutas tropicais (SEBRAE, 2005). A região apresenta

atividades com perspectivas, devido às condições edafoclimáticas favoráveis e grande

disponibilidade de área (Lima et al., 2001), permitindo produção de todos os tipos de

frutas: banana, citros, maçã, mamão, manga, melão e uva (Agrosoft Brasil, 2009).

Porém, o mercado nordestino é pouco exigente na qualidade da banana, com produção

de baixa qualidade e poucos investimentos na cultura, favorecendo o surgimento de

doenças e influenciando de forma negativa a qualidade dos frutos (TodaFruta, 2008).

O estado de Pernambuco é o sétimo produtor da Região Nordeste, com 418

toneladas de banana e quinto em área plantada com 39.822 hectares e área colhida em

torno de 36.656 hectares (IBGE, 2008). Os municípios de Petrolina, Vicência, São

Vicente Ferrer, Santa Maria da Boa Vista e Quipapá são os maiores produtores

(Montarroyos, 2005).


21

O município de Belo Jardim possui 400 hectares em área plantada, com

rendimento médio em torno de 25.000 mil kg/ha e produção de 10.000 toneladas

(FIBGE, 2008). A agricultura é a atividade econômica predominante no município,

praticada por pequenos agricultores, sem ocorrência de áreas mecanizadas devido a

solos com declividade, mão-de-obra familiar, com exploração semi-extrativista.

2.2.1. Origem, evolução e morfologia da bananeira

Bananeiras produtoras de frutos comestíveis são da Classe Monocotiledoneae,

Ordem Scitaminales, Família Musaceae, Subfamília Musoideae, Gênero Musa e Seção

Eu-musa, com origem em duas espécies silvestres, M. acuminata Colla (genoma A) e

M. balbisiana Colla (genoma B) (Simmonds & Shepherd, 1955). A palavra banana é

originária das línguas serra-leonesa e liberiana (África), incorporada pelos portugueses

(Dantas et al., 1999).

Tanto o velho testamento como o alcorão, dos árabes, consideram a bananeira

como “árvore do pecado” (Gomes, 1983; Corrêa, 1984). Textos budistas de cerca de

600 a.C, citam que Alexandre, o Grande, comeu banana na Índia em 327 a.C e em 650,

os islâmicos trouxeram banana para a Palestina (CODEVASF, 2008). Os árabes no

século VII levaram-a para a África, onde o seu uso foi difundido. Colombo encontrou

bananeiras nas Antilhas e Vicente Pinzón, na América do Sul (Gomes, 1983).

A determinação da idade por carbono radioativo dos sedimentos arqueológicos

incluindo fitolitos fósseis indica que Eu-musa apareceu pela primeira vez no pântano

Kuk, na Ásia, há aproximadamente 10.000 anos (Golson, 1991). Lentfer & Denham

(2003), na Austrália, realizando estudos arqueológicos e paleoambientais, investigaram

a origem e o desenvolvimento da agricultura na Nova Guiné, com ênfase na banana, e

encontraram fitolitos que permitiram a identificação de Eu-musa, Australimusa,

Ingentimusa e Ensete.

Segundo Corrêa (1984), sua origem é provavelmente na Índia, Malásia e

Filipinas, onde a planta é cultivada há mais de 4.000 anos; provas históricas comprovam

sua Antiguidade e o quase desaparecimento de suas sementes, que eram grandes, hoje

minúsculas e estéreis, devido à dificuldade da fecundação das espécies. Para Lebot

(1999), sua origem foi na Nova Guiné, havendo cruzamentos locais entre M. acuminata

com M. balbisiana silvestre. Devido ao valor comercial e de subsistência, a banana foi

introduzida nos trópicos e subtrópicos (Jeger et al., 1995). Diversos autores indicam que


22

sua origem foi no Sudeste Asiático (Dantas et al., 1999; Ploetz, 2001; Jesus et al.,

2004).

A história e a origem da banana no Brasil são discutidas. A maioria dos autores

considera que a banana foi introduzida nas Américas pelos portugueses. Apesar dos

primeiros registros, no território brasileiro, datarem de 1570, existem evidências de que

índios a cultivavam na Amazônia chamando-a de “pacoba” (Corrêa, 1984; Moreira,

1999).

As primeiras plantações de banana no Brasil datam de 1925, quando o agrônomo

Felisberto Cardoso de Camargo iniciou o plantio com 12 variedades, no Instituto

Agronômico de Campinas (IAC). Em 1931 ocorreram os primeiros experimentos de

fertilizantes e em 1948 surgiu o primeiro híbrido no país (Lima, 2005).

As cultivares de banana apresentam três níveis cromossômicos: diplóide,

triplóide e tetraplóide, respectivamente com dois, três e quatro múltiplos do número

básico de cromossomos e genoma de 11 (x = n). Por meio de cruzamentos

experimentais pode-se constatar que bananeiras triplóides originaram-se a partir de

hibridações entre diplóides e tetraplóides foram gerados a partir de cruzamentos entre

triplóides e diplóides (Dodds, 1943).

Na evolução das bananeiras comestíveis participaram as espécies diplóides

selvagens Musa acuminata e M. balbisiana, de modo que cada cultivar deve conter

combinações variadas de genomas completos dessas espécies parentais. Esses genomas

são denominados pelas letras A (M. acuminata) e B (M. balbisiana), de cujas

combinações resultam os grupos AA, BB, AB, AAA, AAB, ABB, AAAA, AAAB,

AABB e ABBB (Simmonds & Shepherd, 1955).

Morfologicamente, a bananeira consiste de caule curto e subterrâneo (rizoma),

que constitue órgão de reserva, onde se inserem raízes adventícias e fibrosas de um

sistema radicular fasciculado. O pseudocaule é resultante da união das bainhas foliares,

que termina na copa das folhas longas e largas, com nervura central desenvolvida. Do

centro da copa emerge a inflorescência com brácteas ovaladas de coloração roxo-

avermelhada, onde nascem as flores. O grupo de flores reunidas forma uma penca, com

número variável de frutos (Dantas et al., 1999).

O pseudocaule da bananeira é um estipe, formado pelas bainhas das folhas

superpostas. O meristema terminal produz folhas e sucessivamente vão aparecendo

folhas em forma helicoidal e em conjunto, formando o tronco da bananeira ou

pseudocaule, constituído por superposições de folhas, que nascem enroladas abrindo-se


23

paulatinamente. Cada pseudocaule produz uma inflorescência (cacho). A produção fica

assegurada pelo desenvolvimento de outros rebentos lançados pelo rizoma. A

propagação da bananeira é via vegetativa, com plantio de partes do rizoma portadores

de brotos. As bainhas se fixam sobre o rizoma descrevendo círculos concêntricos, em

torno da gema apical de crescimento (Coelho et al., 2001). O caule e o pseudocaule

oferecem apoio á planta e armazena reservas amiláceas, permitindo ás folhas

alcançarem maior altura, para melhor captação de luz solar (Belálcázar, 1998). As raízes

são amareladas e duras (Lavillé, 1964).

O tamanho da bananeira depende da espécie, da cultivar, de condições

edafoclimáticas e de tratos culturais (Soffner, 2001).

2.2.2. Exigências climáticas da bananeira

Planta natural da zona tropical, a bananeira é cultivada entre 35°N e 35°S e

altitudes não superiores a 1500 m. O efeito da altitude está relacionado com fatores

climáticos (temperatura, pluviosidade, umidade relativa e luminosidade), influenciando

na produção da cultura (Soto Ballestero, 1992). A bananeira é exigente quanto ao

cultivo; luminosidade, fertilidade do solo, umidade e densidade populacional são

essenciais para sua produção (Moura et al., 2002).

A temperatura influi diretamente nos processos respiratórios e fotossintéticos da

planta. Em condições de clima favorável, a bananeira apresenta crescimento contínuo e

rápido; em condições adversas (baixas temperaturas e déficit hídrico) seu crescimento é

lento (Alves, 1999). A banana exige temperaturas entre 10ºC e 40ºC; baixas

temperaturas podem ocasionar a "queima" da planta ou dos frutos em crescimento

("chilling" ou "friagem") (Rangel et al., 2002).

O vento causa desde pequenos danos até a destruição do bananal (Moreira,

1999), ventos secos provocam transpiração excessiva das folhas, podendo causar

fendilhamento, reduzindo a fotossíntese, rompimento do sistema radicular e

tombamento das plantas (Souza & Torres Filho, 1999).

Regiões onde a umidade relativa média anual situa-se acima de 80% são mais

favoráveis à bananicultura. Sob condições de baixo teor de umidade as folhas tornam-se

mais coriáceas, com vida curta (Cordeiro & Mesquita, 2000).

Área foliar, ângulo e forma da folha influem no aproveitamento da luminosidade

(Alves, 1999). Superposição de folhas causa problemas na captação de luz, sobretudo


24

quando a intensidade luminosa é baixa, por nebulosidade ou excesso de plantas por

unidade de área (Spedding, 1979).

2.2.3. Utilidades da bananeira

Descrita no século XVIII pelo botânico sueco Carollus Linnaeus, a banana (Musa

sapientum) foi chamada “o fruto do homem inteligente.” A casca protege a polpa, que

tem sabor inigualável e traz benefícios ao organismo (Cordeiro, 2006). A bananeira é

contemporânea do homem primitivo, supondo-se ter sido a primeira planta a fornecer

alimento ao homem (Simmonds, 1966). A banana pode ser consumida in natura ou

produtos industrializados, constituindo parte integrante da alimentação da população

mundial (Souza & Torres Filho, 1997).

A banana apresenta poderes curativos, e é utilizada em caso de desnutrição,

contusões, problemas intestinais, renais e tuberculose (Balbach & Boarim, 1992). É

fruta constante na dieta dos brasileiros devido às características sensoriais, valor

nutritivo e baixo custo. Um fruto supre cerca de 25% da ingestão diária de ácido

ascórbico, vitaminas A e B e minerais como potássio, sódio e ferro. Alimento

energético, com carboidratos facilmente assimiláveis (Medina et al., 1995), apresenta

em média, por 100 g da fruta: 108,2 calorias; 1,2 g de proteína; 0,2 g de gordura; 25,4 g

de carboidratos; 9 mg de cálcio; 27 mg de fósforo; 0,6 mg de ferro; 50 mg de vitamina

A e 11 mg de vitamina C (Nascente, 2007).

Gomez (1967) apresenta a possibilidade nutricional do rizoma e do pseudocaule

da bananeira como alimento humano. Do pseudocaule podem-se extrair fibras para

fabricação de tecidos, alimento para animais doméstico e humano (Moreira, 1999).

A primeira experiência brasileira utilizando bananeira como anti-helmíntico foi

relatada por Vaitsman (1954). Amorin (1987) avaliou sua ação anti-helmíntica sobre

camundongos infectados com oxiurídeos (Syphacia obvelata e Aspiculuris tetraptera),

obtendo resultados positivos. Golin (2000) indica sua utilização como fitoterápico e

forrageira, devido às qualidades nutricionais. Anjaneyalu et al. (1997) demonstraram

que o amido presente no pseudocaule é semelhante ao de cereais e tubérculos.

Apresentam tanino em sua constituição, composto que poderia ser responsável pela

atividade anti-helmíntica (Guarrera, 1999). Olivo et al. (2007) realizaram estudos sobre

o uso da bananeira no controle de parasitas, e concluíram que o consumo das folhas

apresenta efeito anti-helmíntico. Os autores recomendam mais estudos, visando


25

proporcionar técnicas de manejo seguras para utilização da bananeira no controle de

parasitas de animais domésticos.

2.3. FUNGOS ENDOFÍTICOS

2.3.1. Conceito de fungos endofíticos

Na tradução literal, a palavra endófito é derivada do grego (éndon + phytón),

significa 'no interior da planta' e abrange bactérias, fungos, algas, vírus e insetos que

convivem de forma simbiôntica com a planta hospedeira (Schulz & Boyle, 2005). A

aplicabilidade do termo endofítico é referida para bactérias e fungos (Gunatilaka, 2006)

que habitam o interior das plantas durante todo seu ciclo de vida ou parte dele, sem

causar sintomas de doença (Petrini, 1991). A primeira referência de microrganismos

endófitos foi por De Bary (1866, apud GamboaGaitan, 2006) que, ao estudar gramíneas,

considerou endófitos os fungos que vivem no interior dos tecidos das plantas e epifíticos

os que vivem sobre a superfície. Fidalgo & Fidalgo (1967) definem fungo endofítico

como apenas aquele que vive no interior do tecido vegetal. Apesar do termo 'endófito'

ser empregado para todos os organismos que habitam plantas, micologistas têm

utilizado o termo ' fungo endofítico ' para os que habitam plantas sem causar sintomas

visíveis de doença (Schulz & Boyle, 2005).

Segundo Carroll (1986), microrganismos endofíticos são aqueles que, em pelo

menos uma fase de seu ciclo de vida, colonizam o interior de tecidos vegetais aéreos,

sem causar dano aparente. Para Kloepper & Beauchamp (1992), o termo mais adequado

é 'endofítico' podendo ser definido como 'microrganismos que ocorrem no interior dos

tecidos das plantas e aparentemente não causam sintomas de doenças ao hospedeiro'.

Em 1988, Carroll restringiu o termo endofítico a organismos que causam infecção

assintomática nos tecidos internos de plantas, excluindo fitopatógenos, mutualistas e

micorrizas.

Diversos autores (Petrini, 1991; Wilson, 1995; Yates et al., 1997; Hallmann et

al. 1997; Reinhold-Hurek & Hurek, 1998; Azevedo et al., 2007) definem de maneira

mais ou menos idêntica o 'termo endófito', utilizado em trabalhos realizados desde o

século passado.

Guo et al. (2008) conceituam fungos endofíticos aqueles que residem

internamente nos tecidos das plantas, sem causar efeito negativo imediato, sendo


26

encontrados em todas as espécies vegetais examinadas até o momento e reconhecidos

como fontes potenciais de novos produtos naturais para exploração na medicina,

agricultura e indústria.

Os fungos endofíticos se beneficiam grandemente em colonizar plantas devido

aos tecidos internos proporcionarem ambiente protegido das adversidades do meio (raio

ultravioleta, chuvas, flutuações de temperatura, disponibilidade de nutrientes e

competição com outros fungos). Logo, endofitismo pode ser visto como forma de

sobrevivência. Desta íntima associação, muitas vezes mutualística, existe a hipótese de

que fungos endofíticos podem exercer efeitos benéficos nos seus hospedeiros (Mcinroy

& Kloepper, 1995).

Vários autores tentaram ao longo dos anos conceituar fungos endofíticos,

ocorrendo confusão a respeito da amplitude e aplicação do termo, porém todos esses

conceitos requerem mais estudos. O significado deste termo tem variado de acordo com

o avanço do conhecimento nesta área.

2.3.2. Importância do estudo dos fungos endofíticos

O estudo dos fungos endofíticos tem despertado interesse devido ao seu potencial

biológico, econômico e ecológico. O conhecimento atual sobre suas potencialidades

estimula pesquisas, como: tolerância ao ataque de insetos (Clay, 1988); aumento da área

foliar (Read & Camp, 1986); alterações ecológicas causadas pela chuva ácida (Helander

& Rantio-Lehtmäki, 1990); tolerância ao período de estiagem (West et al., 1990);

resistência a doenças (Stovall & Clay, 1991); uso como vetores alternativos para

introdução de genes nas plantas (Murray et al., 1992); quando cultivados in vitro,

podem produzir antibióticos (Stierle et al., 1993), criptocandina, lipopeptídeo,

antimicótico (Strobel et al., 1999); anticancerígeno (Wang et al., 2000), fitohormônio,

toxina, imunossupressor, antitumoral e enzima (Strobel, 2003); promoção do

crescimento vegetal (Neto et al., 2003); agente no controle biológico de pragas e

doenças de espécies cultivadas (Azevedo et al., 2007); aumento da resistência a

condições de estresse e alterações fisiológicas do hospedeiro (Strobel, 2003); remoção

de contaminantes, solubilização de fosfato e assimilação de nitrogênio (Rosenblueth &

Martinez-Romero, 2006); modelo para estudos ecológicos e de biodiversidade (Zhang et

al., 2006) e indicadores de deficiência nutricional da planta (Blodgett et al., 2007).


27

Estudos realizados por Stierle et al. (1993) despertaram o interesse

biotecnológico para o potencial dos fungos endofíticos, ficando evidente que Taxomyces

andreanea, isolado da planta Taxus brevifolia, é capaz de produzir taxol, um

antitumoral. Trabalhos posteriores mostraram que Pestalotiopsis microspora isolado de

T. wallachiana, também produz taxol (Strobel et al., 1996). Com a descoberta de que

fungos endofíticos podem produzir taxol, visualizou-se um processo mais eficiente e

menos dispendioso para produção deste fármaco (Neto et al., 2003).

É importante compreender o papel que os fungos endofíticos desempenham nos

tecidos internos de seus hospedeiros, em ambientes tropicais, onde a diversidade

fúngica é maior.

2.3.3. Entrada, dispersão e transmissão dos fungos endofíticos

Folhas representam porta de entrada para fungos, por possuírem tecidos frágeis,

expostos e presença de estômatos (Souza et al., 2004). O ciclo de vida dos fungos tem

início quando estes entram em contato com a superfície da folha (Carroll, 1988),

germinam e penetram pela cutícula, estômatos (Herre et al., 2005) e secretam enzimas

hidrolíticas (Espósito & Azevedo, 2004). O sucesso da entrada depende da

diferenciação do micélio em apressório, que por força mecânica penetra no tecido. A

melanina tem participação nesse processo, pois apressórios não pigmentados não são

funcionais, tornando o fungo incapaz de penetrar (Dean, 1997). Fungos apresentam

preferência por folhas, representando bioquimicamente hábitats dinâmicos e locais da

fotossíntese (Arnold, 2005). Dentro da planta os fungos podem permanecer próximos ao

local de entrada ou disseminarem-se pelo sistema vascular (Zinniel et al., 2002),

podendo ser intracelulares, limitados a poucas células, intercelulares, localizados inter

e/ou intracelularmente, podendo se desenvolver em qualquer tecido do vegetal (Johri,

2006).

Fungos endofíticos podem ser transmitidos verticalmente quando penetram pelas

sementes ou raiz, horizontalmente quando penetram através dos estômatos ou

diretamente na parede celular utilizando apressórios e haustórios (Saikkonem et al.,

2004). Rodrigues & Samuels (1990) isolaram fungos endofíticos em folhas não

expandidas de Licuala ramsayi e sugeriram sua ocorrência devida à transmissão por


28

sementes. White Jr. et al. (1996) afirmam que Acremonium e Xylaria são transmitidos

verticalmente através das sementes, como outros endófitos mutualísticos.

2.3.4. Isolamento e identificação de fungos endofíticos

O conhecimento da comunidade endofítica começa no isolamento, realizado a

partir de folha, caule, raíz e estruturas florais. Silva et al. (2006) isolaram fungos

endofíticos de folhas, caule e raízes de pinha e graviola, observando variação nas taxas

de colonização em cada parte da planta. Segundo Araújo et al... (2005), plantas

amostradas devem representar da melhor forma possível a variabilidade do hospedeiro,

levando em consideração efeitos climáticos e fases fisiológicas da planta (crescimento,

florescimento e senescência).

Para isolamento do fungo endofítico, por ser assintomático, é necessária

eliminação dos epifíticos, realizando desinfestação, que varia de hospedeiro para

hospedeiro, dependendo da espessura da epiderme (Pereira, 1993). Plantas com folhas

espessas necessitam de desinfecção superficial mais rigorosa em relação às folhas

delicadas, onde maior tempo de exposição aos agentes desinfetantes pode eliminar os

fungos endofíticos (Mendes & Azevedo, 2007). Alguns apresentam crescimento

micelial lento, podendo crescer sobrepostos aos de crescimento mais rápido, ou mesmo,

nem crescer (Guimarães, 1998).

Fator importante para isolamento é a composição do meio de cultura que

estimula o crescimento dos fungos e a produção de compostos bioativos. Os meios mais

utilizados são: extrato de malte, batata-dextrose-ágar e extrato da planta de onde o fungo

foi isolado (Arnold, 2005), sendo acrescentado antibiótico para inibir o crescimento de

bactérias (GamboaGaitan, 2006). Deve-se levar em consideração a idade da planta,

tecidos utilizados, local e época da coleta (Azevedo, 1998).

A técnica mais utilizada para isolamento de fungos endofíticos é a desinfestação

superficial do material vegetal, variando a concentração e tempo de exposição das

substâncias utilizadas. Guo et al., (2001) apresentam técnica alternativa (técnica

molecular PCR) e conseguiram identificar fungos endofíticos pela extração de DNA a

partir de tecido do hospedeiro, sem precisar do crescimento fúngico em meio de cultura.

Técnicas utilizadas para avaliar a comunidade endofítica em plantas não permitem o

estudo de microrganismos não cultiváveis, restringindo os estudos a espécies cultivadas,


29

sendo necessário desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, permitindo o

estudo dos fungos endofíticos em seu habitat (Lavaca et al., 2006).

GamboaGaitan (2006) sugere que a melhor amostragem dos fungos endofíticos

em uma espécie vegetal, é obtida em poucas amostras de muitas plantas. A maioria dos

autores não menciona a importância do tamanho das amostras; porém, trabalhos com

várias espécies tropicais indicam que a subdivisão na folha proporciona maior

diversidade fúngica, sendo importante o tamanho dos segmentos. Maior quantidade de

espécies é obtida dos menores fragmentos; reduzindo o tamanho da amostra e

explorando maior superfície da folha obtem-se melhores resultados.

A maioria dos fungos endofíticos é Ascomycota e seus anamorfos, representando

grupo antigo que coevoluiu com as plantas (Heckman et al., 2001), mas também há

Basidiomycota e Zygomycota. O uso de meios de cultura inespecíficos pode ser o

motivo da menor frequência de registros de Basidiomycota (Berbee, 2001) e

Zygomycota.

Dentre os fungos endofíticos mais frequentemente isolados estão: Colletotrichum

gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz., Cladosporium Link ex Fr., Phomopsis

(Sacc.) Bubák., Fusarium Link:Fr. e Xylaria L. (Araújo et al. 2001; Photita et al. 2001).

2.3.5. Interação fungo endofítico /hospedeiro A ausência de clorofila determinou a obtenção de alimento elaborado a partir do

meio, obrigando fungos a estabelecerem associações com organismos autotróficos e

heterotróficos (Menezes & Oliveira, 1993). A natureza destas associações é diversa e

exibe vários graus de interdependência nutricional (Petrini, 1986).

De Bary (1866, apud Pinto-Coelho, 2006) criou o termo simbiose para designar

toda e qualquer associação permanente entre indivíduos de espécies diferentes que

exerce influência recíproca no metabolismo. O termo simbiose significa literalmente

viver juntos e usualmente é empregado para descrever a biologia de pares de

organismos que vivem juntos, se beneficiando (Pinto-Coelho, 2006).

Nas comunidades bióticas de um ecossistema as formas de interação entre seres

vivos, denominadas relações ecológicas, se diferenciam pelos tipos de dependência que

os organismos mantêm entre si, podendo ser relações harmônicas ou desarmônicas


30

(Lopes, 2004). Interações planta/ fungo endofítico não são fixas em tempo ecológico,

evolutivo ou geograficamente, variando de mutualismo para antagonismo (Faeth &

Bultman, 2002), dependendo da filogenia, genética e condições abióticas dos

integrantes (Gehring et al., 1997). Na maioria dos casos, o hospedeiro ganha vantagem

na colonização pelo fungo. Este benefício é baseado no equilíbrio entre exigências do

invasor e resposta da planta. Se a interação torna-se desequilibrada, aparecem sintomas

da doença ou o fungo é excluído pelas reações de defesa da planta (Kogel et al., 2006).

A seleção da planta hospedeira é crucial para isolamento do fungo endofítico e

obtenção de compostos bioativos. A planta deve ser selecionada com base em seu

ambiente, histórico etnobotânico, endemismo, longevidade e áreas de maior

biodiversidade (Strobel et al., 2004).

A relação planta/ fungo endofítico pode ser: simbiótica, antagônica ou neutra.

Nas interações simbióticas, os fungos produzem ou induzem produção de metabólitos

primários e secundários que conferem vantagens à planta, como diminuição de

herbívoros e insetos e aumento da tolerância ao estresse abiótico (Araújo, 1996).

Neutralismo é, por definição, ausência de interação (Thompson, 1999). Em

comunidades ecológicas, muitos encontros são apenas oportunos, sem maiores

consequências para os indivíduos envolvidos (Costa, 2003). Fungos endofíticos

tropicais podem ser habitantes neutros, passageiros, ecologicamente sem importância ou

importantes habitantes de tecidos vegetais. O neutralismo pode ser a base da origem de

muitas interações. O encontro entre integrantes de duas espécies inicialmente é neutro e

com o passar das gerações a interação pode permanecer como tal ou evoluir (Arnold &

Lutzoni, 2007).

Os fungos endofíticos não induzem sintomas de doença entretanto, mantêm

mecanismos bioquímicos e genéticos requeridos para infecção e colonização das

plantas. De acordo com o comportamento dentro do tecido vegetal, fungos endofíticos

são divididos entre os que: 1) crescem ativamente dentro do hospedeiro, resultando em

extensa colonização; 2) crescem ativamente dentro do hospedeiro, colonizando apenas

áreas limitadas; 3) crescem pouco dentro do hospedeiro, ficando quiescente até a

senescência do vegetal; 4) crescem pouco dentro do hospedeiro, permanecendo

metabolicamente ativos (Rodrigues & Redman, 1997).

Saikkonen (2006) sugere que a natureza mutualística entre fungos

endofíticos/plantas está relacionada a diferenças genéticas dos envolvidos em resposta

às condições ambientais, espaço, estrutura e idade do hospedeiro.


31

2.3.6. Especificidade do fungo endofítico pelo hospedeiro

Em geral as plantas apresentam em seu interior fungos endofíticos, alguns mais

frequentes em determinado tipo vegetal, designados dominantes, em contraposições a

outros mais raros. Segundo Rodrigues & Petrini (1997) condições climáticas podem

influênciar a colonização de plantas por fungos endofíticos.

Entre os simbiontes, especificidade não parece viável, visto que a probabilidade

de contato entre os parceiros é baixa. No entanto, nos trópicos podem existir casos

específicos de fungos endofíticos e hospedeiros naturais (Lodge & Cantrell, 1995).

Padrão de dominância de espécies foi verificado por Petrini et al. (1982), onde o fungo

isolado com maior frequência em um hospedeiro foi menos frequente no outro. Carroll

(1988) sugere que existem fungos endofíticos que apresentam especificidade por um

gênero ou família. San Martín & Rogers (1989), no México e Laessøe & Lodge (1994),

em Porto Rico, observaram especificidade de Xylaria axifera que só produz corpos

frutíferos em Schefflera caribeñas. Segundo estes autores a colonização das folhas de

uma planta hospedeira acontece quando, em condições naturais, o fungo enfrenta

competição de outros microrganismos. Rodrigues (1994) observou que alguns

endosimbiontes de palmeiras preferem tecidos foliares. Fisher et al. (1995), isolaram da

árvore tropical Gynoxis oleifolia (Asteraceae), fungos endofíticos apenas na raiz,

enquanto outras espécies foram isoladas da casca e folhas. Bayman et al. (1998)

isolaram fungos endofíticos em orquídeas, em florestas tropicais, e não encontraram

especificidade dos fungos pelos hospedeiros. Uma possível explicação é a grande

quantidade de espécies de plantas e espaçamento entre indivíduos de uma mesma

espécie. Os autores concluíram que a preferência por tecido vegetal não é universal para

plantas tropicais. Sieber et al. (1991) levantaram a hipótese de que cada espécie vegetal

desenvolve uma comunidade endófita específica.

Fisher & Petrini (1990) observaram especificidade entre tecidos do hospedeiro e

fungos endofíticos, isolando-os somente da casca. Rodrigues (1991) isolou fungos

endofíticos apenas dos vasos condutores, enquanto outros ocorreram na nervura central

das folhas. Pereira (1993) cita os gêneros Colletotrichum e Xylaria como fungos

endofíticos comuns em hospedeiros tropicais sem padrão de dominância, chamando-os

de endófitos ubíquos.

Segundo Rodrigues (1994) pouco se sabe sobre a distribuição de fungos

endofíticos em tecidos do mesmo vegetal, podendo-se encontrar diferentes espécies em


32

cada folha; esta preferência por diferentes tecidos vegetais pode ser interpretada como a

capacidade dos fungos utilizarem substratos específicos.

Gamboa & Bayman (2001) observaram que a especificidade hospedeiro/ fungo

endofítico nos trópicos, apresenta muitas especulações, baseadas em poucas

observações. O problema é o fato de muitos fungos endofíticos não serem identificados

por não esporularem em meios artificiais. A especificidade de tecidos permite melhor

repartição do recurso disponível, diminuindo a competição entre endosimbiontes

(GamboaGaitan, 2006).

2.3.7. Fungos endofíticos de ambientes tropicais

Florestas tropicais têm maior complexidade estrutural do que outros biomas, com

microclimas e microhabitas tanto horizontal como verticalmente (Lodge & Cantrell,

1995). É comum encontrar comunidades de fungos endofíticos que variam de acordo

com os estratos dentro do dossel. Estudos sugerem que existem diferenças na

composição das comunidades verticais endofíticas de diferentes espécies na mesma

floresta (Gamboa, 1998).

A diversidade vegetal em países de clima tropical, como o Brasil, é imensa.

Estima-se que cada espécie vegetal possua fungos endofíticos ainda não classificados e

com propriedades pouco conhecidas (Downing et al., 2000). A diversidade fúngica é

importante na decomposição da matéria orgânica, ciclagem de nutrientes, agregação do

solo e controle de fitopatógenos (Kennedy, 1999).

Hywel-Jones (1993) estima entre 1.5 e 13.5 milhões de fungos. Estimativas

mundiais do número total de espécies de fungos variam entre 1 e 1.5 milhões (Rossman,

1994). Dreyfuss & Chapela (1994) estimam cerca de 1,3 milhões somente de espécies

endofíticas nos trópicos. O cálculo do número total de espécies é baseado em razão

aritmética, entre número de espécies de plantas e fungos, utilizando a relação 6:1

(Lodge et al., 1996). Nenhuma planta estudada deixou de apresentar fungos endofíticos,

fundamentando a conclusão de Sieber et al. (1988) de que a presença dos fungos

endofíticos é fenômeno geral e comum.

A composição de fungos endofíticos é diferente entre zona temperada e tropical,

sendo provável que durante a evolução biológica a relação planta/ fungo endofítico

tenha se originado independentemente, considerando as diferenças climáticas e

biológicas destas regiões (GamboaGaitan, 2006).


33

Segundo Hawksworth (2001), a diversidade de fungos é maior em florestas

tropicais, devido à grande quantidade de plantas, onde endófitos, sapróbios (Aptroot,

2001) e fitopatógenos se associam (Shivas & Hyde, 1997). Arnold (2005) concluiu que

fungos endofíticos tropicais podem ser hiperdiversificados. Interações biológicas,

ambiente e fatores históricos, influenciam a distribuição das plantas em florestas

tropicais e a presença dos fungos endofíticos pode estar condicionada à distribuição das

plantas tropicais (Fine et al., 2004). Segundo Piontelli et al. (2006), a presença universal

de fungos endofíticos é influenciada pelo tipo de vegetação, condições climáticas e

latitude. Comunidades de latitudes altas são caracterizadas por apresentar poucas

espécies de Ascomycota, considerando que fungos endofíticos tropicais apresentam

pequeno número de gêneros com grande número de espécies. Fungos endofíticos de

plantas tropicais têm variedade de hospedeiros e apresentam espécies raras, sendo

importante recuperar, identificar e elucidar os papéis ecológicos destes fungos de

florestas tropicais (Arnold & Lutzoni, 2007).

Investigações sobre fungos endofíticos tropicais foram realizadas por diversos

autores, entre os quais Dreyfuss & Petrini (1984); Rodrigues & Samuels (1990); Pereira

et al. (1993); Fisher et al. (1994); Rodrigues (1994); Fisher et al. (1995); Wright (1996).

2.3.8. Ocorrência de fungos endofíticos em Musa spp.

Estudos envolvendo fungos endofíticos em fruteiras são poucos no Brasil, com

relatos em açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) (Rodrigues 1994), coqueiro (Cocus

nucifera L.) (Mariano, 1997), citrus (Citrus limon L.) (Araújo et al. 2001; Dúran et al.

2005), cajá (Spondias mombin L.) (Rodrigues & Samuels 1999) e graviola (Silva et al.,

2006).

Simmonds (1963) isolou fungos endofíticos da raiz de bananeira, sendo

Colletotrichum o gênero mais comum. Brown et al. (1998) isolaram 24 espécies de

fungos endofíticos de folhas de bananeiras, em Hong Kong e na Austrália. Pereira et al.

(1999) isolaram 16 gêneros em folhas de bananeira (Musa acuminata), de três regiões

do estado de São Paulo. Xylaria sp., Colletotrichum musae (Berk. & M.A. Curtis) Arx e

Cordana musae (Zimm.) Höhn., foram os mais frequentes, confirmando que Xylaria é

comum em hospedeiros tropicais; a distribuição dos endófitos foi semelhante nas três

localidades. Segundo Carroll & Petrini (1983) Xylaria é capaz de utilizar celulose e


34

lignina, sendo poderoso decompositor de matéria orgânica após a morte das plantas. O

papel biológico das Xylariaceae é pouco estudado (Petrini & Petrini, 1985), existindo

também espécies fitopatogênicas (Rogers, 1979).

Pocasangre et al. (2000) isolaram 132 endófitos da raiz e rizoma de bananeiras,

de oito localidades da América Central, principalmente representantes dos gêneros

Fusarium, Trichoderma, Verticillium e Acremonium.

Photita et al. (2001) isolaram 61 endófitos de Musa acuminata, na Tailândia.

Xylaria e Guignardia cocoicola Punith. foram mais frequentes nas folhas e ausentes em

raiz e pecíolo. Colletotrichum gloeosporioides, C. musae, G. cocoicola, Mycelia sterilia

e Xylaria sp., foram os mais comuns. Vários endófitos isolados são fitopatógenos

estabelecidos de bananeira, dando apoio à hipótese de que o fungo endofítico é um

fitopatógeno em estado latente.

Cao et al. (2002) isolaram de folhas de bananeira (Musa acuminata), na China,

os seguintes endófitos: Gloeosporium musae, Myxosporium spp., Deightoniella torulosa

(Syd.) M.B. Ellis, Alternaria tenuis Nees, Sphaceloma spp., Aureobasidium spp.,

Meliola spp., Uncinula spp., Penicillium spp., Aspergillus spp., Sarcinella spp.,

Cladosporium sp., Cephalosporium sp. e Mycelia sterilia.

2.4. INTERAÇÃO PLANTA/FITOPATÓGENO

Plantas exibem resistência natural ao ataque de fitopatógenos e a ocorrência de

doenças é mais exceção que regra. A interação fitopatógeno/hospedeiro é luta entre dois

organismos pela própria sobrevivência, em que células vegetais reagem à penetração

através de mecanismos estruturais e/ou bioquímicos (Pascholatti & Leite, 1995).

Interações planta/fitopatógeno são de interesse para a humanidade, uma vez que

grande parte da economia mundial tem por base a utilização de vegetais, que sofrem

danos devido ao ataque de fitopatógenos. A devastação de uma espécie cultivada devido

à ação dos fungos tem como consequência a fome e a extinção do vegetal (Barbiere &

Carvalho, 2001).

O conhecimento de condições favoráveis aos fitopatógenos na interação

patógeno/hospedeiro é importante. O estádio fenológico em que o hospedeiro se torna

mais suscetível, a faixa de temperatura e a porcentagem de umidade relativa do ar, para


35

estabelecimento da doença deve ser definido para cada patossistema (Borges Neto et al.,

2000).

Relações planta/fitopatógeno são classificadas como: compatíveis (patógeno

virulento e hospedeiro suscetível) e incompatíveis (patógeno avirulentos e hospedeiro

resistente). Nas interações incompatíveis, o sistema de defesa da planta é ativado,

conduzindo à resistência, mas é tardiamente ativado ou não ativado em interações

compatíveis, condicionando a doença (Resende et al., 2003). Para ocorrência da doença

é necessário uma planta suscetível, um patógeno virulento e um ambiente favorável

(Agrios, 2005).

Bocchese et al. (2003) sugerem que onde o fungo se desenvolve pode ser fator

importante na virulência, e a interação fitopatógeno/hospedeiro é determinada

geneticamente, através dos mecanismos de ataque do fitopatógeno e defesa da planta.

As enzimas lipase, amilase e protease secretadas por fungos estão relacionadas com a

virulência. A relação virulência/atividade enzimática desempenha importante papel na

interação fitopatógeno/hospedeiro.

A comunidade endofítica, cuja composição varia em função do hospedeiro e das

condições ambientais, tem indivíduos que se inter-relacionam dentro da planta, em

equilíbrio harmônico. O desequilíbrio dessa harmonia afeta o comportamento de todos

os integrantes da comunidade, dando condições para que fungos oportunistas

manifestem seu potencial patológico (Maki, 2006).

De acordo com Chillet et al. (2006), o aumento na temperatura e períodos

chuvosos estão diretamente associada ao desenvolvimento da infecção por

Colletotrichum musae, resaltandos que a temperatura é fator preponderante ao

patossistema, acelerando as perdas provocadas pelo fitopatógeno.

Plantas coevoluíram com fungos e vários produtos excretados por elas favorecem

seu crescimento. Esta associação constante gerou a interdependência entre fungos

endofíticos /hospedeiro, onde a ocorrência de doenças é resultado do desequilíbrio

ecológico, microbiológico e nutricional da planta (Menezes, 2008).

2.4.1. Principais fitopatógenos da bananeira

Fitopatógenos estão entre os principais problemas fitossanitários da

bananicultura brasileira. As perdas podem chegar a 100%, quando o controle não é


36

efetuado corretamente. Danos nas folhas são os mais sérios problemas. Fungos

comprometem a fotossíntese, tamanho do fruto e número de pencas provocando redução

no crescimento das plantas. As doenças fúngicas afetam todo ciclo vegetativo e

produtivo das bananeiras, sendo fatores limitantes da produção (Costa Rabelo, 2007).

Muitas são as causas de perdas em pós-colheita, dentre elas, os de ordem

fitossanitária merecem especial atenção, haja vista ser um dos limitadores à

comercialização do fruto in natura, principalmente as ocasionadas por fungos que

podem chegar até 90% do total das perdas (Gullino, 1994). Duas doenças são

importantes na fase de pós-colheita: podridão da coroa, causada por Fusarium roseum,

Verticillium theobromae e Colletotrichum musae e antracnose, causada por C. musae

(Cordeiro & Matos, 2000).

Mesturino (1988) citou vários fungos associados a podridões em banana, na

Califórnia: Penicillium spp., Alternaria triticina, Cladosporium oxysporium,

Acremonium spp., Fusarium spp. e Eupenicillium, Acremonium strictum, Alternaria sp.,

Cladosporium sp., Curvularia brachyspora, Pestalotiopsis cruenta, Phoma joliana,

Verticillium theobromae, Aspergillus niger, A. flavus e A. fumigatus.

Lutchmeah & Santchurn (1991) realizaram levantamento da incidência de fungos

em banana cv. 'Naine', em Mauritius e constataram que Colletotrichum musae foi o

mais frequente, seguido por Fusarium spp., F. pallidoroseum, B. theobromae e C.

gloesporioides.

Dentre as doenças fúngicas que causam perda na qualidade e produtividade da

banana produzida no Brasil e no mundo, destacam-se: a Sigatoka amarela, causada por

Mycosphaerella musicola (Pseudocercospora musae), a Sigatoka negra, provocada por

M. fijiensis (Paracercospora fijiensis), o mal-do-panamá (Fusarium oxysporum f. sp.

cubense) e a antracnose (Colletotrichum musae) (Cordeiro & Kimati, 1997). M. fijiensis

constitui o principal fator de queda na produtividade dos bananais, com reduções de até

100% na produção comercial de bananas. O fungo necessita de condições ambientais

adequadas para seu desenvolvimento, sendo a temperatura a que afeta diretamente seu

ciclo. Regiões com elevadas temperaturas e umidade são propícias para sua

disseminação (Júnior et al., 2007).

No Brasil, a antracnose e a podridão da coroa são as principais doenças que

ocorrem em pós-colheita de banana, afetando a qualidade dos frutos. Outros

fitopatógenos estão associados a essas podridões em diferentes locais e épocas do ano,

como Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Höhn., Botryodiplodia theobromae Pat.,


37

Verticillium theobromae (Turconi) E.W. Mason & S. Hughes, Penicillium spp.,

Alternaria triticina Prasada & Prabhu, Alternaria sp., Cladosporium oxysporum Berk.

& M.A. Curtis, Cladosporium sp., Acremonium spp., Fusarium spp., Eupenicillium sp.,

Acremonium strictum W. Gams, Curvularia brachyspora Boedijn, Pestalotiopsis

cruenta (Syd.) Steyaert, Phoma jolyana Piroz. & Morgan-Jones, Aspergillus niger

Tiegh., A. flavus Link e A. fumigatus Fresen. (Alves et al., 1995).

A antracnose afeta folhas jovens e as lesões servem como porta de entrada para

fitopatógenos secundários, agravando a doença. Colletotrichum é um dos mais

importantes gêneros de fitopatógenos, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais

do mundo (Mafacioli et al., 2006).

Moraes et al. (2006) determinaram a ocorrência e a frequência de fungos em

banana Prata Anã e o agente causal das podridões em pós-colheita de frutos, em Minas

Gerais, Brasil. Colletotrichum musae, Trichoderma harzianum, Fusarium equisetii,

Penicillium sp. Aspergillus parasiticus, Trichothecium roseum, Colletotrichum

acutatum, Alternaria sp., Cladosporium musae e Curvularia lunata foram os mais

frequentes. O modo de infecção latente, causada por Colletotrichum musae, parece

favorecer, primeiramente, a colonização interna dos tecidos e, posteriormente, a ação

dos fungos oportunistas, que aceleram as podridões.

Assunção et al. (2007) isolaram de folhas de bananeiras, das cultivares

‘Pacovan’, ‘Prata’ e ‘Nanicão’, com sintomas, em Pernambuco, Brasil, os seguintes

fitopatógenos: Pseudocercospora musae, Colletotrichum musae, Fusarium oxysporum,

Deightoniella torulosa e Cladosporium musae.

Medeiros et al. (2008) encontraram alta incidência de manchas e/ou podridões

que comprometeram a qualidade das bananas comercializadas em três estabelecimentos,

em Mossoró, Brasil; os fungos mais encontrados foram Colletotrichum gloeosporioides,

C. musae, Lasiodiplodia theobromae, Fusarium spp., Verticillium theobromae.

A correta identificação dos fitopatógenos da bananeira apresenta-se como objeto

para escolha dos tratamentos a ser utilizado, permitindo recuperação da cultura,

diminuindo os prejuízos.

2.5. CONTROLE BIOLÓGICO

A preocupação dos ambientalistas, autoridades governamentais e exigências dos

países importadores de frutas in natura têm sido crescentes quanto à qualidade do


38

produto (Lapeyre & Mourichon, 1998). Busca-se produção de alimento barato, de

melhor qualidade, sem destruir o ambiente. Alternativa viável e racional é a utilização

do controle biológico nos países em desenvolvimento e com áreas agricultáveis, como o

Brasil (Carvalho et al., 1999).

Produtos químicos têm sido usados na agricultura para proteção contra

fitopatógenos. Entretanto, seus efeitos nocivos têm estimulado a redução de seu uso e

adoção de métodos naturais menos agressivos. Os efeitos dos agroquímicos são: alto

custo, resíduos nos frutos, poluição ambiental, intoxicação do homem e animais,

resistência dos fitopatógenos, contaminação de fontes de água e destruição da

microflora do solo (Vilas Boas et al., 2002). O controle biológico se baseia em métodos

ambientalmente corretos, podendo fazer parte do controle integrado de doenças

(Grigoletti Jr. et al., 2000). Uso indiscriminado de fungicidas, inseticidas e adubações

desequilibradas causam desvios metabólicos nas plantas, reduzindo a biodiversidade

dos ecossistemas (Menezes, 2008).

Para obter um processo saudável de produção agrícola, uma vez que doença de

planta é sinônimo de desequilíbrio, o controle biológico deve ser acompanhado por

outras medidas que tenham por objetivo equilibrar os agroecossistemas (Lucon, 2008).

2.5.1. Conceito de controle biológico

Os primeiros relatos sobre controle biológico datam de 1.200 a.C. , quando

chineses faziam pontes de bambu entre uma árvore e outra, facilitando a passagem de

formigas predadoras de lagartas. O controle biológico com fungos endofíticos teve

início no Havaí, em 1967, com Acremonium sp., contra Kolomona surattensis (erva

daninha), ocorrendo assim, o primeiro controle biológico de sucesso (Trujillo, 2005).

Segundo Carvalho et al. (1999), o controle biológico não é nova descoberta ou

tecnologia, sendo utilizado há mais de 120 anos e os fungos foram os primeiros

microrganismos explorados para o controle biológico (Azevedo et al., 2007), devido à

produção de metabólitos secundários (Pinto et al., 2002).

Baker & Cook (1974) definem controle biológico como 'redução da densidade de

inóculo ou das atividades determinantes da doença provocada por um fitopatógeno ou

parasita nos estados de atividade ou dormência, por um ou mais organismos, realizado

naturalmente ou através da manipulação do ambiente, hospedeiro ou antagonista, ou


39

introdução em massa de um ou mais antagonistas'. Definição simplificada por Cook &

Baker (1983) como 'controle biológico é a redução da soma de inóculo ou das

atividades determinantes da doença provocada por um fitopatógeno, realizada por um

ou mais organismos que não o homem'. Controle biológico é o controle de um

microrganismo através da ação direta de outro microrganismo antagônico, o qual pode

atuar por meio de antibiose, parasitismo, competição, predação ou hipovirulência

(Bettiol & Ghini, 1995). Para Hanson & Hilje (1993), controle biológico parte do

princípio de que na natureza todo organismo tem um ou mais antagonistas que o

eliminam ou competem com ele. Segundo Grønvold et al. (1996), controle biológico é a

utilização de antagonistas naturais, para diminuir a um limite economicamente aceitável

os fitopatógenos. O princípio básico do controle biológico está na ação exercida por

determinados microrganismos, que eliminam, impedem ou reduzem o desenvolvimento

de fitopatógenos (Menten, 1996). Em espécies cultivadas, o controle busca reduzir o uso

de agroquímicos (Azevedo et al., 2007).

Definições de biocontrole diferem entre autores, porém, controle biológico pode

ser definido como a supressão das atividades de um organismo prejudicial por um ou

mais organismos, referidos como inimigos naturais.

2.5.2. Fungos antagonistas

Sikora (1992) define o termo 'antagonista' como microrganismos que atuam

como parasitos, predadores e competidores que repelem, inibem ou matam nematóides,

insetos e fitopatógenos. Os antagonistas dependem das condições ambientais e

mecanismos que atuam no controle de doenças (Howell, 2003).

O termo antagonista emprega-se a agentes biológicos com potencial para

interferir nos processos vitais dos fitopatógenos. Desta forma o nicho ecológico

ocupado pelos fungos endofíticos favorece o controle biológico, pois neste local

competem por nutrientes e espaços com fitopatógenos, produzem substâncias tóxicas ou

induzem a planta a desenvolver resistência às doenças (Melo & Azevedo, 1998). Para

manutenção do sistema biológico, a população fúngica é regulada por antagonistas que

ocorrem na natureza. Na ausência de antagonistas, a população pode aumentar (Mota et

al., 2003).


40

Uma das dificuldades na utilização de antagonistas para controle de

fitopatógenos é a impossibilidade de controle nas condições ambientais (Wilson &

Pusey, 1985). Um fungo pode ser excelente antagonista em laboratório e não

demonstrar atividade na natureza, por não colonizar o hospedeiro (Andrews, 1985).

Casos de controle eficiente foram realizados em condições controladas de casa de

vegetação (Oliveira et al., 2003).

Fungos endofíticos isolados de tecidos de plantas apresentam elevado potencial

como agentes de biocontrole contra fitopatógenos, insetos (Azevedo et al., 2007) e

nematóides (Hallmann et al., 1998). Gêneros citados como controladores de

fitopatógenos são: Acremonium, Anthostomella, Chrysporium, Cladosporium,

Colletotrichum, Coniothyrium, Lasiodiplodia, Libertella, Nodulisporium,

Phaeosphaeria, Phialophora, Phoma, Phomatospora, Phomopsis, Scopulariopsis,

Verticillium e Xylaria (Petrini et al., 1992).

Os seguintes fungos são citados como antagonistas contra fitopatógenos:

Gliocladium no controle de Phytophthora (Smith et al., 1990), Trichoderma harzianum

no controle da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (De Marco et al., 2000). Dicyma

pulvinata no controle do mal-da-serigueira (Mello et al., 2005). Vale salientar que em

90% dos antagonistas utilizados há participação de diferentes espécies do gênero

Trichoderma (Benitez et al., 2004). O comportamento desses fungos como antagonistas

é essencial para seu uso em biocontrole, pois podem atuar utilizando vários mecanismos

(Küçuk & Kivanç, 2003).

No Brasil o controle biológico começou a ser utilizado com Metarhizium

anisopliae (Metschn.) Sorokīn, no controle da cigarrinha da cana-de-açucar (Athayde et

al., 2001). Na cultura do cacau, Trichoderma tem sido utilizado para o controle de

Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, agente causal da vassoura de bruxa, mostrando

ser importante estratégia para redução de compostos químicos (Neto et al., 2003).

As chances de obtenção de microrganismos com potencial antagônico são

aumentadas com isolamentos no próprio ambiente onde serão usados tornando-os

adaptados a sobreviver (Betiol, 1997). Em muitos casos a seleção de antagonistas é

baseada unicamente em ensaios in vitro considerando seu baixo custo e rapidez;

entretanto, há baixa correlação dos resultados obtidos em condições de laboratório com

os observados nas condições de campo. A seleção baseada unicamente em ensaios de

campo, embora possa resultar em dados consistentes, demanda muito espaço

(Macagnan, 2005).


41

Trabalhos sempre mencionam cautela a respeito de metodologias de seleção de

fungos endofíticos e sua inconsistente atividade em condições de campo (Cook, 1993).

Entretanto, não é possível eliminar testes de laboratório como ferramenta para

determinar o possível modo de ação do antagonista (Barretti et al., 2000).

O êxito da maioria dos fungos se deve à alta capacidade de reprodução,

habilidade para sobreviver em condições desfavoráveis, eficiência no uso de nutrientes,

promoção de crescimento e indução dos mecanismos de defesa das plantas (Sikora &

Pocasangre, 2008).

Existem perspectivas para utilização de fungos antagônicos no controle de

fitopatógenos de plantas tropicais. A substituição de fungicidas por fungos endofíticos

constitui fator favorável para a agricultura, em termo de segurança alimentar.

2.5.3. Controle biológico de fitopatógenos por fungos endofíticos

Na natureza ocorrem interações contínuas entre fitopatógenos e antagonistas,

onde o controle biológico funciona naturalmente (Silva & Mello, 2007). A estreita

relação fungos endofíticos /hospedeiro torna-os candidatos naturais, utilizados como

agentes de controle de doenças, por ocuparem o mesmo nicho ecológico dos

fitopatógenos (Hallmann et al., 1997).

A identificação correta do agente causal das doenças constitui base para a

estratégia de controle; o desenvolvimento dessas estratégias requer conhecimento do

ciclo de vida do fitopatógeno, tipo de inóculo, forma de dispersão, modo e momento em

que a infecção ocorre e mecanismos do hospedeiro que regulam a infecção (Johnson &

Sangchote, 1994). Segundo Neto et al. (2003), fungos endofíticos desempenham função

na sanidade vegetal por atuarem como agentes controladores de fitopatógenos. A

capacidade de fungos não patogênicos ou hipovirulentos em proteger plantas contra

fitopatógenos tem sido relatada com importância no desenvolvimento de práticas para a

agricultura (Nel et al., 2006).

Pesquisas demonstram importância e eficiência de alguns fungos no controle

biológico de fitopatógenos, apresentando as seguintes vantagens: alta capacidade

reprodutiva, ciclo de vida curto, coloniza somente o hospedeiro, produz estruturas de

resistência e sobrevive por longo período na ausência do hospedeiro (Kendrick, 1995).

Raramente o controle biológico erradica fitopatógenos, porém, melhora a qualidade de

vida do ambiente. Fungos endofíticos usados no biocontrole são seguros, não poluem,


42

atacam apenas seu alvo, são compatíveis com práticas agrícolas e efetivos em termos de

custos. Ao contrário do químico, não apresenta efeito imediato (Bettiol & Ghini, 1995).

Estudos utilizando fungos endofíticos no controle de fitopatógenos são citados

como medida de controle biológico. Christensen et al. (1991) testaram isolados de

Acremonium, provando in vitro ação inibitória contra os fitopatógenos Puccinia

coronata, Colletotrichum graminicola e Drechslera erythrospila. Reis et al. (1995)

utilizaram Trichoderma spp. na forma de pó biológico para controle de Fusarium

oxysporum f. sp. phaseoli, em casa de vegetação, obtendo resultados positivos na

redução da doença.

A agricultura alternativa busca medidas de proteção das plantas contra

fitopatógenos, utilizando o controle biológico, através dos fungos endofíticos.

2.6. FUNGOS ENDOFÍTICOS PRODUTORES DE SUBSTÂNCIAS

ANTIMICROBIANAS

A indústria farmacêutica tem estudado o potencial dos metabólitos fúngicos para

desenvolvimento de novos fármacos (Singh et al., 2004). A busca de substâncias

naturais para o homem é uma das atividades mais antigas. No Brasil as plantas têm sido

os organismos vivos mais investigados como fonte de produtos naturais (Bras-Filho,

1994). Microrganismos, organismos marinhos e insetos também são fontes de

substâncias para a humanidade (Natori et al., 1981). Como o Brasil ocupa destaque na

biodiversidade, espera-se a descoberta de novas substâncias.

Os fungos endofíticos contribuem para seu hospedeiro, produzindo substâncias

que fornecem proteção e sobrevivência à planta. Estes compostos, uma vez isolados,

podem ter potencial para uso na medicina, agricultura e indústria. Antibióticos,

antimicóticos, imunossupressores e antineoplásicos são alguns exemplos do que foi

encontrado após o isolamento e cultivo desses fungos. Perspectivas de encontrar novos

medicamentos eficazes para tratamento de doenças em seres humanos, plantas e animais

são grandes (Strobel et al., 2004).

Fungos endofíticos são capazes de produzirem anti-helmínticos e inseticidas

(Espósito & Azevedo, 2004), apresentando potencial a ser explorado na agricultura

(Zou & Tan, 2001). Schulz et al. (2002) sugerem que a associação entre fungos

endofíticos e seus hospedeiros conduza à produção de metabólitos secundários com

atividade antimicrobiana e anti-herbicida.


43

Diversos autores relatam à ação antimicrobiana de substâncias produzidas por

fungos endofíticos como Rodrigues et al., (2000), Liu et al. (2001), Stinson et al.

(2003), Bao & Lazarivits (2001), Huang et al., (2001), Strobel (2003), Rodrigues et al.

(2004), Chareprasert et al. (2006).

Fisher et al. (1984) isolaram fungos endofíticos de Ericaceae com atividades

antifúngicas e antibacteriana. Gallagher et al., (1994) isolaram de Lupinus angustifolius,

na Austrália, Phomopsis leptostromiformis (J.G. Kühn) Bubák, produtor de fomopsina,

toxina hepatocarcinógena.

Li et al., (1997) citam Pestalotiopsis guepinii (Desm.) Steyaert, endofítico de

Wolemia nobilis (Araucaraceae), como produtor de taxol. Os autores sugerem que o

fungo tenha adquirido à 'habilidade' de produzir taxol, transferindo-a para W. nobilis.

Peláez et al., (1998) isolaram fungos endofíticos de plantas medicinais, na

Espanha, onde 27% das espécies produziram compostos antimicrobianos.

Rodrigues et al., (2000) pesquisaram compostos bioativos, produzidos por

endófitos isolados da planta medicinal Spondias mombin L. (Anacardiaceae).

Guignardia sp., Phomopsis sp. e Pestalotiopsis guepinii, foram testados contra

actinomicetos, bactérias, leveduras e fungos filamentosos, inibindo o crescimento de

todos os microrganismos.

Liu et al., (2001) constataram atividade antifúngica dos fungos endofíticos

isolados de Artemisia annua sobre os fitopatógenos Gaeumannomyces graminis var.

tritici J. Walker, Fusarium graminearum Schwabe, Rhizoctnia cerealis, Phytophthora

capsici, Helminthosporium sativum e Gerlachia nivalis (Ces. ex Berl. & Voglino) W.

Gams & E. Müll.

Huang et al. (2001) testaram à atividade antitumoral e antifúngica de fungos

endofíticos das plantas medicinais Taxus mairei, Cephalataxus fortunei e Torreya

grandis, na China. Constataram que 52,3% dos isolados inibiram o crescimento de

Fusarium sp. e Paecilomyces.

Cafêu et al. (2005) realizaram estudos químicos dos extratos produzidos por

Xylaria sp., isolada de Palicourea marcgravii obtendo as seguintes substâncias: 7-

declorogriseofulvina, citocalasina B e griseofulvina, que apresentaram atividade

antifúngica contra Cladosporium cladosporioides (Fres) G.A. de Vries e C.

sphaerospermum Penz.

De estudos realizados em folhas saudáveis de Cryptocarya mandioccana, da

Floresta Atlântica, resultou o isolamento de Colletotrichum gloeosporioides; dessa


44

espécie foram isoladas substâncias deoxiscitalona e tetralona, com atividade antifúngica

contra Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum Penz. comparável a

atividade da nistatina (Inácio et al., 2006). Os autores sugerem que a atividade

apresentada pelos metabólitos secundários produzidos por C. gloeosporioides esteja

relacionada à função de proteção da planta contra fitopatógenos, demonstrando

significado ecológico do estudo dos fungos endofíticos.

Gallo et al. (2007) isolaram Papulospora sp. e Curvularia lunata var. aeria,

endofiticamente das folhas de Smallanthus sonchifolius (planta medicinal), que testadas

in vitro sobre células humanas apresentaram elevada citotoxicidade inibindo a

proliferação celular em mais de 75%.

No Brasil vários autores citam a produção de fármacos por fungos endofíticos

como Xylaria sp., Fusarium moniliforme, Colletotrichum sp., Guignardia sp. e

Phomopsis sp. (Gomes, 2008).

Efeitos atribuídos aos fungos endofíticos revelam sua potencialidade como

produtores de metabólitos secundários, apresentando potencial econômico na medicina,

agricultura, indústria alimentícia e farmacêutica (GamboaGaitan, 2006).

2.6.1. Produção de enzimas extracelulares

Produção de enzimas é comum em fungos, tornando-os importantes sob o ponto

de vista industrial. Fungos necessitam de sistema enzimático para degradação de

substâncias, cujos subprodutos utilizam na sua alimentação. As principais fontes

biológicas de enzimas são: fungos filamentosos (60%), bactérias (24%), animal (6%),

planta (4%), levedura (4%), e Streptomyces (2%) (Zaks & Dodds, 1998).

A hifa dos fungos filamentosos está capacitada para utilizar substratos através do

crescimento e penetração. Os fungos são capazes de secretar enzimas, quebrar

compostos macromoleculares e utilizar os produtos para seu crescimento e

metabolismo. Produzem enzimas extracelulares importantes na degradação e transporte

de nutrientes para a célula e no processo de patogênese (Bateman & Basham, 1976),

podendo a produção de enzima extracelular ser indicativa da característica patogênica

dos fungos (Silva et al., 2006).

Diversos autores como Chet (1992); Chet & Inbar (1994); De La Cruz et al.

(1995); Lima et al. (1999); De Marco et al. (2000), apresentam informações sobre

desempenho das enzimas micolíticas na hidrólise da parede de fitopatógenos.


45

Estudos in vitro mostram que tanto o fungo endofítico como a planta secreta

metabólitos tóxicos para ambos, fato estranho numa interação assintomática; na

interação de patogenicidade o fungo produz metabólito tóxico e em resposta a planta

produz metabólitos de defesa (Agrios, 2005). Schulz & Boyle (2005) concluíram que

colonização assintomática é consequência da interação antagônica balanceada entre o

vegetal e o fungo. Estes autores relatam que fungos endofíticos produzem exoenzimas

necessárias para infectar o hospedeiro e a maioria é capaz de produzir micotoxinas

fitotóxicas. O hospedeiro pode agir com as mesmas defesas contra um fitopatógeno,

com produção de metabólitos e respostas mecânicas, havendo uma estreita harmonia

entre virulência fúngica e defesa da planta. Se esse equilíbrio é afetado, tanto por

diminuição na defesa da planta como por aumento da virulência fúngica, ocorre a

doença.

Espécies de Trichoderma produzem exoglucanases e endoglucanases, celobiase e

quitinase, enzimas utilizadas na degradação e lise da parede celular de fitopatógenos

(Papavizas, 1985). Enzimas hidrolíticas extracelulares produzidas por Trichoderma são

consideradas de importância determinante na habilidade antagonista desse fungo

(Thrane et al.., 2000). O papel de cada proteína parece ser diferente. Quitanases,

celulases, glucanases e proteases quebram as estruturas dos fitopatógenos,

características comuns em agentes de biocontrole (Lorito et al.., 1996). As espécies de

Trichoderma são economicamente importantes devido à produção de enzimas

industriais e antibióticos.

2.6.2. Produção de metabólitos por fungos

fungos endofíticos, fitopatógenos, entomopatógenos, rizosféricos, leveduras do

solo e isolados de organismos marinhos, são os seres vivos que mais fornecem

metabólitos (Takahashi & Lucas, 2008). Fungo endofítico tem capacidade de produzir

alcalóide, peptídeo, esteróide, terpenóide, isocoumarin, quinona, fenilpropanóide,

lignana, fenól, ácido fenólico, composto alifático e lactona (Gallo et al., 2007).

Constituem importantes fontes de substâncias químicas com potencial biológico.

Metabólitos secundários são micromoleculares, não apresentam funções básicas e

sua produção depende do tipo de organismo (Nosov, 1994). A pesquisa de metabólitos

secundários provenientes de fungos endofíticos teve início com plantas medicinais

(Rodrigues & Samuels, 1999).


46

Metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos podem controlar

fitopatógenos (Fisher et al., 1986). A produção de antibióticos como metabólito

secundário é comum para fungos (Bélanger et al., 1995); seu efeito mostra similaridade

com uso de fungicidas, sua produção e permanência na superfície da folha podem

proporcionar eficiente controle de fitopatógenos. Muitos metabólitos secundários

acumulados pelas plantas são induzidos por fitopatógenos, denominados fitoalexinas

(Desjardins et al., 1989).

Evidências sugerem que fungos endofíticos possuem grande diversidade

genética, implicando importância prática com relação à descoberta de novos metabólitos

secundários bioativos (Hellwing et al., 2002).

A grande vantagem da utilização química de metabólitos fúngicos em relação às

demais fontes, é o fato de que microrganismos podem ser cultivados em larga escala em

fermentadores, não havendo prejuízo ao ecossistema, com a retirada de plantas, nem

problemas éticos como os que podem advir da prospecção de metabólitos bioativos a

partir de insetos, anfíbios e outras espécies animais (Takahashi & Lucas, 2008).

Fungos endofíticos podem ser utilizados como fontes de metabólitos primários

(Stamford et al., 1998) e secundários que inibem o desenvolvimento de fitopatógenos

(Li et al., 2001). Considerando-se a grande diversidade fúngica e especificidade pelo

hospedeiro, existem poucos trabalhos em relação aos metabólitos produzidos pelos

fungos endofíticos (Santos et al., 2008).

2.6.3. Metabólitos voláteis

Vários fungos utilizados no controle biológico de fitopatógenos podem sintetizar

metabólitos capazes de promover a fungistase. Esses metabólitos podem ser de natureza

volátil ou não volátil e os primeiros têm maior facilidade de difusão no solo (Junior &

Abreu, 2000).

De acordo com Dennis & Webster (1971a,b), metabólitos voláteis são os gases

etileno, cianeto de hidrogênio, acetaldeído, acetona, etanol e dióxido de carbono, que

afetam o crescimento microbiano. Mangenot & Diem (1979), citam CO2 e amônia como

substâncias voláteis produzidas por antagonistas, e seus efeitos em fungos pode ser

estimulante ou inibitório.

Trichoderma e Acremonium produzem substâncias voláteis e não voláteis (White

Jr. & Cole, 1985), inibindo o crescimento de fungos (Hawker, 1950). A principal


47

substância isolada de Trichoderma é trichodermin (Hutchinson & Cowan, 1972),

eficiente contra fitopatógenos, atuando na produção de metabólitos voláteis e não

voláteis (Claydon et al., 1987). Sunesson et al. (1995) identificaram em Cladosporium

cladosporioides e Paecilomyces variotii, metabólitos voláteis (hidrocarbonetos, álcoois,

cetonas, éteres, ésteres, compostos contendo enxofre, e terpenos), in vitro. Strobel et al.

(2001) isolaram Muscador albus, produtor de substâncias voláteis (álcoois, ésteres,

cetonas, ácidos e lipídios), inibindo fungos. No entanto, em conjunto agem

sinergicamente contra plantas, humanos, fungos e bactérias patogênicas.

Muscodor albus isolada de Cinnamomum zeylnicum (canela) apresentou ação

fungicida, fungistática, bactericida e bacteriostática por emissão de compostos voláteis,

tornando-se importante no controle de doenças pós-colheita (Ezra & Strobel, 2003).

Stinson et al. (2003) isolaram Gliocladium sp. de Eucryphia cordifolia, na

Patagônia, produtor de compostos voláteis, letal para Pythium ultimum Trow e

Verticillum dahliae Kleb. Strobel et al. (2007) isolaram Muscodor albus de Guazuma

ulmifolia (Sterculiaceae), no Equador. O fungo produziu compostos voláteis

(cariofileno; feniletil álcool, ácido acético, éster; bulneseno e ácido propanóico), com

atividade antibiótica. Segundo os autores o fungo pode ser útil na medicina, na

agricultura e na indústria.

Strobel et al. (2008) isolaram Gliocladium roseum em folhas de Eucryphia

(Ulmo) (cordifolia), que produziu hidrocarbonetos voláteis in vitro contra Muscodor

albus. Os autores sugerem que a produção de substâncias voláteis de alta energia é de

interesse, como fonte alternativa de combustível.

2.7. MÉTODOS DE SELEÇÃO DE ANTAGONISTAS IN VITRO

Segundo Díaz & Labrador (1974), para ser eficaz o antagonista deve ser

geneticamente estável, efetivo em baixas concentrações de fácil reprodução em meio de

cultivo artificial, não tóxico para seres vivos e o ambiente, resistente aos pesticidas,

compatível com tratamentos químicos e físicos e ativo contra fitopatógenos.

A seleção de fungos antagônicos pode ser realizada in vitro ou in vivo, em

condições controladas ou condições naturais. Os principais métodos de seleção de

fungos endofíticos in vitro são: pareamento de cultura, papel celofane e placa

sobreposta. A maioria dos trabalhos abrange uma seleção inicial em laboratório, para


48

posteriormente testar in vivo, em casa de vegetação e no campo sob condições

controladas (Mariano, 1993).

Métodos de seleção in vitro podem ser qualitativos e quantitativos. Os

qualitativos são realizados simultaneamente ao isolamento dos antagonistas, com

finalidade de abreviar o processo de seleção. A partir de amostras de solo ou tecidos

vegetais sadios, os antagonistas são pré-selecionados para ensaios quantitativos. Para

seleção de biocontroladores, os métodos qualitativos são menos utilizados que os

quantitativos. Entre os quantitativos, estão os métodos do ágar em placa, do ágar em

lâmina e meio líquido. Dependendo dos objetivos do estudo, pode-se optar pelos

métodos da cultura pareada, do papel celofane e da placa sobreposta (Pileggi, 2006).

O método da cultura pareada ou pareamento é comumente utilizado em estudos

de antagonismo in vitro. Consiste em diversas formas de plaqueamento de antagonista e

fitopatógeno em placas de Petri, contendo meios de cultura adequados ao crescimento

de ambos. Em se tratando de dois fungos, deve-se observar a taxa de crescimento, a fim

de que ocorra igualdade de condições competitivas (Pileggi, 2006).

Microrganismos selecionados como antagonistas, para serem utilizados em

campo, devem possuir especificidade de ação, alta capacidade reprodutiva e suportar

condições ambientais no local em que o controle será realizado. As formulações devem

oferecer segurança aos seres vivos, ao ambiente e ser efetivos para o fitopatógeno

(Grønvold et al., 1996). Critérios de seleção são importantes na escolha de antagonistas,

determinando chances de sucesso do controle biológico. Geralmente a seleção de

antagonistas é baseada em ensaios in vitro considerando seu baixo custo e rapidez

(Bettiol, 1997).

Métodos in vitro são práticos, servem como seleção preliminar para avaliar a

capacidade antagonista e indicar o comportamento do antagonista com relação à sua

capacidade de adaptação, crescimento e reprodução in vitro. Existem restrições com a

realização desses testes para seleção, pois, na maioria das vezes, os resultados positivos

obtidos in vitro, ou em condições controladas, não coincidem ou, às vezes, são opostos

àqueles obtidos in vivo (Grigoletti Jr. et al., 2000).

A seleção baseia-se em evidências de que o fungo endofítico interfere no

desenvolvimento do fitopatógeno, destruindo ou inibindo (Rubini et al., 2005).


49

2.8. MECANISMO DE AÇÃO ANTAGONISTA CONTRA FITOPATÓGENO

Fungos endofíticos podem agir de maneira antagônica, neutra ou benéfica para o

hospedeiro, exibindo graus de interdependência fisiológica e ecológica. Metabólitos

produzidos por fungos podem ser neutros, ter ação antagônica para o hospedeiro ou

importante na produção de fármacos (Pimentel et al., 2006).

Quando o agente de biocontrole é um fungo endofítico, o mecanismo se dá como

resultado de sua habilidade para produzir metabólitos que impedem a germinação dos

conídios, inibindo a ação do fitopatógeno (Benítez et al., 2004).

O antagonismo acontece quando dois microrganismos vivem em um mesmo

ambiente e um deles produz alguma substância que inibe o crescimento do outro

(Brock, 2000). O controle biológico exercido por um ou mais fungos, age reduzindo o

inóculo e a capacidade do fitopatógeno em causar doença (Romeiro, 1995).

Mecanismos básicos de ação dos antagonistas para controlar o crescimento dos

fitopatógenos são: antibiose, competição por espaço e nutrientes, micoparasitismo,

predação, indução de resistência e secreção de substâncias antibióticas (Fernández-

Larrea, 2001). Os mecanismos podem ser influenciados pela temperatura e substratos

que limitam o crescimento do fungo (Howell, 2003), podendo ocorrer simultaneamente

durante o processo de vida do antagonista (Martins-Corder & Melo, 1998).

Os antagonistas não possuem um único modo de ação, e a multiplicidade é

importante para a seleção, pois ao possuir vários modos de ação, são reduzidos os riscos

de resistência do fitopatógeno (Estay, 2006).

2.8.1. Antibiose

Antibiose é o antagonismo entre dois organismos no qual um ou mais

metabólitos são produzidos por um dos organismos envolvidos com efeito negativo

sobre o outro, inibindo atividades celulares vitais (germinação de conídios). Fenômeno

responsável pela atividade biocontroladora de muitos organismos (Guerrero, 2004).

No controle biológico exercido por antibiose existe relação entre densidade de

inóculo dos biocontroladores e efetividade do controle, quer o controle seja exercido por

fungos ou bactérias (Silva et al., 2008).


50

2.8.2. Competição por espaço e nutrientes

Competição por nutrientes está envolvida em situações na qual o antagonista

consome nutriente tornando-os indisponíveis aos fitopatógenos que deles necessitam

para desencadear o processo de patogênese (Edwards & Blakeman, 1984). Köhl &

Fokkema (1998) consideraram a competição por nutrientes importante mecanismo de

biocontrole a ser explorado no controle de fitopatógenos que apresentam fase saprofítica

antes de sua penetração no hospedeiro e que fitopatógenos biotróficos não são afetados

por esse mecanismo de biocontrole.

Os microrganismos que têm capacidade de competir por sítios de infecção e usar

nutrientes disponíveis podem deslocar o fitopatógeno por impedir a germinação de

propágulos ou sua infecção (Punja & Utkhede, 2003).

2.8.3. Indução de resistência

Na planta devem existir mecanismos gerais de resistência, que lhes permitam

manter-se sem sintomas de doenças em presença de grande número de potenciais

agentes patogênicos. Os mecanismos de resistência das plantas às doenças podem

agrupar-se em barreiras morfológicas ou estruturais físicas e barreiras químicas

(Ingham, 1973).

Entende-se por resistência induzida, proteção cruzada ou proteção induzida, a

inoculação prévia no hospedeiro com alguns microrganismos não patogênicos ou raças

avirulentas de vários fitopatógenos para proteger o hospedeiro contra inoculação

subsequente de raças virulentas (Toda Fruta, 2008).

A indução de resistência envolve ativação de mecanismos de defesa latente

existente nas plantas, em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos

(Hammerschmidt & Dann, 1997). Esses mecanismos de resistência induzidos podem ser

estruturas, como papila, lignificação e tilose ou bioquímicos, como acúmulo de

fitoalexinas e proteínas relacionadas à patogênese (Pascholati & Leite, 1995). Essa

ativação pode ser obtida pelo tratamento com agentes bióticos (Stangarlin & Pascholati,

2004) ou abióticos (Hijwegnwn et al., 1996). Moléculas e agentes de origem biótica ou

abiótica, capazes de ativar ou induzir resposta de defesa nas plantas, são chamados de

elicitores (Smith, 1996).


51

A principal característica de indução de resistência está na ação do indutor

sentido no metabolismo do hospedeiro, modificando-o para atuar nas fases de pós-

penetração do fitopatógeno. O fenômeno da resistência não pode ser considerado como

estático ou absoluto. As plantas apresentam diferentes graus de resistência em função da

idade, órgão, nutrição e temperatura. O agente indutor pode ser: ativador químico, luz

ultravioleta, compostos naturais de plantas e microrganismos antagonistas (Benhamou

& Belanger, 1998).

Pêlos e ceras na superfície dos tecidos, espessura e dureza da cutícula, parede

externa das células epidérmicas, tamanho e forma dos estômatos, presença e

distribuição de esclerênquima, são considerados barreiras físicas à entrada do

fitopatógeno (Rodrigues, 1980). Em bananeiras a produção de ceras pelas folhas e

densidade de estômatos na cutícula é citada como mecanismos de resistência à Sigatoka

negra (Ortiz & Vuylsteke, 1994).


52

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Áreas de coletas O município de Belo Jardim situa-se na microrregião do Vale do Ipojuca,

integrando a mesorregião do Agreste Pernambucano. Ocupa 754Km² e 0,77% da área

total do Estado (CONDEPE/FIDEM, 2005). Do ponto de vista climático a região é

considerada intermediária entre áreas de clima úmido (Zona da Mata) e seco (Sertão)

(Cabral et al., 2004).

As microrregiões apresentam clima influenciado pela altitude, devido à posição

elevada de suas terras. O clima, segundo a classificação de Köppen, é do tipo Bshs,

quente semi-árido, com temperatura média em torno de 26ºC, sendo o mês de julho com

as mais baixas temperaturas, 18ºC. A precipitação pluviométrica média anual é de 955,6

milímetros, índice elevado para a região semi-árida, justificado pela presença de

microclimas correspondentes aos brejos e altitude média em torno de 650m acima do

nível do mar (SECTMA-PE, 2008). Período médio chuvoso ocorre de março a julho e

período de estiagem de setembro a fevereiro (Salgueiro, 2005).

A vegetação é formada por Floresta subcaducifólia. A área é considerada brejo de

altitude, devido à presença de fragmentos de floresta tropical úmida similar à Mata

Atlântica, com ambientes considerados "pequenas ilhas de florestas isoladas",

apresentando taxas pluviométricas e higrométricas mais elevadas que nas áreas de

caatinga (Tabarelli & Santos, 2004).

O solo é classificado como Podzólico Amarelo e Vermelho-Amarelo (PA e PV),

com variadas profundidades e texturas, presença de cascalhos, relevo movimentado. O

município está situado sobre o planalto da Borborema, com presença de superfícies

antigas e elevadas, trabalhadas pelo processo erosivo (CONDEPE/FIDEM, 2005). A

geologia é referida ao Pré-Cambriano Indiviso (Ministério de Minas e Energia, 1973) e

ao Quaternário (Reis, 1999).

Foram realizadas quatro coletas, duas no período chuvoso e duas no período de

estiagem, nos anos de 2007 e 2008 nos sítios Araçá, Frexeira, Serra dos Ventos e

Taboquinha, todos microprodutores de banana do município de Belo

Jardim/Pernambuco (Tabela 1).


53

Tabela 1. Síntese das características gerais dos locais de coleta no município de Belo

Jardim/PE

Local/mês de coleta/período

Coordenadas geográficas

Altitude

Cultivares

Araçá (Abril/2007) - chuvoso

8º16’51”S, 36º25’14”W

715

‘Nanicão’/’Pacovan’

Freixeira

(Setembro/2007) - estiagem

8º16’02”S, 36º25’17”W

897

‘Nanicão’/’Prata-Anã’

Serra dos Ventos (Janeiro/2008) - estiagem

8°19’00”S, 36°25’00”W

900

‘Prata-Anã’ /’Maçã’

Taboquinha (Março/2008) - chuvoso

8º26’00”S, 39º50’36”W

617

‘Pacovan’/’Pacovan’

3.2. Cultivares utilizadas para isolamento dos fungos endofíticos

‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’ foram as cultivares selecionadas

para coleta das amostras por serem as mais utilizadas no município e mais difundidas no

Brasil.

Em cada localidade foram selecionados quatro espécimes de bananeira, adultas,

em fase de produção, de diferentes cultivares e retiradas três folhas sadias de cada

planta (nova, intermediária e velha), totalizando 12 folhas/coleta. A determinação dos

estádios fenológicos das folhas, foi realizada com base na posição das mesmas no

pseudocaule, denominadas de folhas novas as dispostas na parte superior (folha vela ou

zero), folhas intermediárias (N°1) encontradas logo abaixo das folhas novas e folhas

velhas (N°2), situadas na parte inferior das intermediárias. As folhas coletadas estavam

aparentemente sadias, sem manchas ou qualquer tipo de lesão causada por insetos ou

danos mecânicos. As folhas foram acondicionadas separadamente, em sacos de papel,

os quais foram fechados e etiquetados, com o objetivo de reduzir a contaminação

externa e evitar o aquecimento das amostras, que foram transportadas até 24 horas ao

laboratório para processamento, após a coleta.

3.3. Isolamento de fungos endofíticos No laboratório, cada folha foi lavada com água corrente e sabão neutro, sem ferir

as amostras, processo que tem por objetivo eliminar comunidades microbianas externas,

mantendo viável a população interna do tecido vegetal.


54

A técnica de isolamento foi por fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al.,

2005). Com auxílio de um furador de rolha metálico esterilizado de 6mm de diâmetro,

foram feitos 36 discos por folha, num total de 108 discos por planta, obtendo-se assim

216 discos para cada cultivar, perfazendo um total de 1728 discos em quatro coletas

realizadas. Os discos foliares foram retirados aleatoriamente, procurando explorar maior

área foliar.

Para isolamento dos fungos endofíticos foi adotado método padrão onde, tecidos

vegetais são desinfestados superficialmente através de lavagens por imersão.

Primeiramente, 1 minuto, em álcool a 70% v/v, para quebra da tensão superficial; 1

minuto, em hipoclorito de sódio (NaOCl) a 3% e duas lavagens consecutivas em água

destilada esterilizada, para retirar resíduos dos agentes esterilizantes, em seguida,

colocados para secar em papel de filtro esterilizado (Pereira et al., 1993). Para conhecer

o grau de contaminação por fungos, retirou-se 0,1 ml da última água da lavagem e

semeou-se em placas contendo BDA (batata-dextrose-ágar).

Após desinfestação, com auxílio de uma pinça flambada e em câmara asséptica,

seis discos foliares foram tranferidos equidistantes para placas de Petri, contendo meio

BDA, suplementado com solução do antibiótico cloranfenicol 250mg/L, para evitar

crescimento de bactérias, em seguida incubados a 23ºC±2ºC, sendo examinada

diariamente, até 30 dias. À medida que surgiam as colônias, as mesmas foram

purificadas em placas de Petri e posteriormente repicadas para tubos de ensaio,

contendo BDA (Figura 1).


55

Figura 1. Metodologia utilizada para isolamento dos fungos endofíticos de folhas

sadias da bananeira (Musa spp.). A. Discos retirados de folhas sadias; B. Distribuição

dos discos em BDA suplementado com 250 mg/L de cloranfenicol; C. Crescimento

fúngico nas bordas dos discos foliares; D. Fungos endofíticos purificados e isolados

3.4. Identificação dos fungos endofíticos

Identificações em nível de gênero e espécie foram realizadas em culturas puras

dos fungos cultivadcs em meios BDA, MA e V8 contidos em placas de Petri. Quando

necessário, utilizou-se a técnica de cultivo em lâmina (Riddell, 1950). A caracterização

morfológica foi procedida através de observações das características macroscópica das

colônias e microscópica das estruturas reprodutivas com base em referências

(A) (B)

(C)

(D)


56

bibliográficas especializadas (Barnett & Hunter, 1972; Ellis, 1976; Sutton, 1980;

Dennis, 1957; Sivanesan, 1984; Hanlin & Menezes, 1996).

3.5. Seleção de antagonistas in vitro

3.5.1. Obtenção de fungos endofíticos e fitopatogênicos utilizados para teste de

antagonismo in vitro

Para determinação de antagonistas, serão selecionados aleatoriamente 20 fungos

endofíticos isolados de folhas sadias de bananeira de quatro cultivares coletadas no

município de Belo Jardim/Pernambuco. Representantes de seis espécies fitopatogênicos:

Cladosporium musae, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Colletotrichum musae,

Deightoniella torulosa, Pseudocercospora musae e Mycosphaerella musicola foram

obtidos de isolamentos originados de folhas de bananeiras com sintomas visíveis,

coletadas no município de Belo Jardim/Pernambuco (Assunção et al., 2007).

3.5.2. Determinação do índice da velocidade do crescimento micelial de fungos

endofíticos e fitopatogênicos in vitro, em cultivo individual

Para cultivo individual, utilizaram-se discos de 6mm de diâmetro retirados das

margens das colônias dos fungos endofíticos selecionados e de fitopatógenos, com sete

dias de cultivo, com auxílio de um furador esterilizado. Os discos foram transferidos

para placas de Petri, contendo BDA, a 1cm da borda, incubadas a temperatura de

23±2°C, por 14 dias.

Na avaliação do crescimento micelial foi observada a dimensão do diâmetro das

colônias, aos sete e 14 dias, dos fungos endofíticos e fitopatógenos, com auxílio de

régua milimetrada, no sentido colônia até sua borda. Os dados foram utilizados no

cálculo do índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM), conforme a fórmula

de Maguire (1962), modificada por Oliveira (1991), para construção das curvas de

crescimento. O índice da velocidade de crescimento foi avaliado como: muito lento,

lento, rápido e muito rápido, de acordo com o diâmetro das colônias (Oliveira, 1991).


57

Onde: IVCM = Índice da velocidade de crescimento micelial (cm/dia).

D = diâmetro da colônia no 14° dia de incubação

Da = diâmetro da colônia no 7° dia de incubação;

N = número de dias após a inoculação.

3.5.3. Seleção de fungos endofíticos isolados contra fungos fitopatogênicos

selecionados, in vitro

A ação dos fungos endofíticos contra os fitopatógenos foi avaliada a partir dos

seguintes testes:

3.5.3.1. Teste de antagonismo, em culturas pareadas

A avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra os

fitopatógenos, foi realizada pelo método de culturas pareadas em placas (Dennis &

Webster, 1971a, b), que consiste no confronto direto do antagonista e fitopatógeno em

placas de Petri de 9mm de diâmetro, em meio BDA. Cada placa recebeu dois discos de

micélio/conídios de 6mm de diâmetro, em pontos equidistantes, a 1cm da borda da

placa, sendo um de um fungo fitopatogênico e outro de fungo endofítico (Figura 2).

Após o pareamento, as placas foram incubadas em condições de laboratório a 23±2ºC,

por 14 dias.

Figura 2. Representação esquemática, da distribuição dos discos dos fungos endofíticos

(A) e fitopatógenos (B), em BDA, para ensaio de antagonismo e medição da velocidade

de crescimento, pelo método de pareamento

IVCM ‗ D – Da N

A B


58

Discos contendo micélio/conídios dos fungos endofíticos e fitopatógenos foram

obtidos de colônias cultivadas em meio de BDA, durante sete dias, mantidas a

temperatura de 23±2ºC. Após esse período foram retirados discos da borda das colônias,

com auxílio de um furador de rolha metálico (6mm de diâmetro).

Os testes foram realizados em duplicata, e como testemunha foram cultivados

isoladamente fitopatógenos e fungos endofíticos, semeando-se um disco de micélio

(6mm de diâmetro) a 1cm das bordas de cada placa de Petri, em meio BDA; as placas

foram mantidas em condições de laboratório a 23±2ºC, por 14 dias.

A avaliação da capacidade antagonística dos fungos endofíticos e fitopatógenos,

diferenciando níveis de antagonismo, com observações no 14° dia, de acordo com o

crescimento pareado em placas de Petri, foi baseada na metodologia estabelecida por

Bell et al. (1982), utilizando uma escala de notas com valores de 1 a 5. Para análise

estatística, as notas foram transformadas em percentagens de colonização, com: 100, 75,

50, 25 e zero, para as notas 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente (Tabela 2). Uma placa

contendo apenas um disco de 6mm de diâmetro com micélio/conídio, serviu de

controle. O período de tempo necessário para que o micélio do fitopatógeno tomasse

toda a superfície da placa, foi o parâmetro para indicar o momento de avaliar a inibição,

realizada através de análise visual, e em apenas uma repetição por isolado.

As interações onde houve um halo de inibição ou inibição à distância, sem

contato micelial, foram também levadas em conta para efeito de seleção das espécies

com potencial antagonístico.


59

Tabela 2. Notas atribuídas ao grau de crescimento do fungo endofítico em direção ao

fitopatógeno (Bell et al., 1982)

Notas Grau de crescimento do fungo endofítico sobre o

fungo fitopatogênico no meio de cultura

Nível 1

O antagonista cobriu 100% da superficie da placa.

Supressão total do crescimento micelial por parte do

antagonista

Nível 2

O antagonista cobriu 75% da superficie da placa.

Nível 3

Antagonista e fitopatógeno colonizam cada um 50%

da superfície da placa.

Nível 4

O antagonista cobriu ao menos 25% da superficie da

placa.

Nível 5

O fitopatógeno cobriu a totalidade da superficie,

anulando o antagonista. Ausência de supressão

micelial por parte do antagonista.

3.5.3.2. Efeito in vitro de metabólitos voláteis, produzidos por fungos endofíticos,

sobre o crescimento micelial de fitopatógenos

Para investigar a possibilidade de produção de substâncias inibidoras voláteis,

foram usados 20 fungos endofíticos contra seis fitopatógenos, utilizando-se, o método

de Dick & Hutchinson (1966), com algumas modificações, utilizando-se placas

descartáveis com uma divisória, impedindo o contato direto entre fungos endofíticos e

fitopatógenos.

O método utilizado consiste em discos de micélio de 6mm de diâmetro dos

fitopatógenos e prováveis antagonistas, inoculados separadamente em BDA no lado de

cada compartimento da placa de Petri, permitindo a evolação de metabólitos voláteis

(Figura 3).

As testemunhas (placa controle) foram representadas pelo crescimento micelial

dos fitopatógenos individualmente, em cada compartimento da placa, em meio BDA,


60

mantidas a temperatura de 23±2ºC, por sete dias. Para avaliação do crescimento micelial

mediu-se o diâmetro das colônias.

Figura 3. Esquema da distribuição dos discos do fungo endofítico (A) e fitopatógeno

(B) em placa de Petri, com uma divisória, para ensaio de antagonismo por metabólitos

voláteis

Para os testes relacionados à seleção de antagonistas contra fitopatógenos in

vitro, foi adotado o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial

6 X 20, cujos tratamentos corresponderam às condições dos seis fitopatógenos e 20

fungos endofíticos, totalizando 120 tratamentos. Cada tratamento constou de duas

repetições, sendo cada repetição correspondente a uma placa de Petri. Testemunhas

constaram do cultivo individual no meio BDA, dos fungos endofíticos e fitopatógenos,

para termo de comparação da inibição e produção de metabólitos voláteis.

Avaliações do potencial de antagonismo e comparação da velocidade de

crescimento micelial radial dos fungos endofíticos contra os fitopatógenos foram

realizadas medindo-se raios das colônias (cm) dos fitopatógenos e fungos endofíticos,

aos 14 dias, comparando-se com testemunhas, incubadas em meio BDA. Para as

avaliações referentes aos efeitos dos metabólitos voláteis, foram realizadas observações

no crescimento micelial de cada fungo envolvido e possíveis alterações morfológicas

das colônias (bordas e pigmentação).

3.6. Análise estatística

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em arranjo

fatorial 4×1, correspondendo a quatro cultivares de bananeira (‘Nanicão’, ‘Pacovan’,

Divisória da placa de Petri

A

B


61

‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’) X uma parte da planta (folha), com seis repetições, sendo a

unidade experimental constituída por uma placa com seis discos foliares. Após

crescimento, as colônias foram contadas, identificadas e avaliadas, quanto a:

1. Frequência de ocorrência de cada espécie (FO), calculada por cada unidade

formadora de colônias da espécie, idade fenológica das folhas (nova, intermediária e

velha) e período de coleta (chuvoso e estiagem), expresso pela fórmula (Araújo et al.,

2005).

Onde: FO = Frequência de ocorrência da espécie analisada

Ni = Número de fragmentos foliares com crescimento fúngico da espécie

N = Número total de fragmentos foliares plaqueados A frequência de cada espécie foi expressa em termos percentuais na seguinte

classificação (Schnittler & Stephenson, 2000):

- Abundante: ≥ 3,0%

- Comum: ≥ 1,5% < 3,0%

- Ocasional: ≥ 0,5% < 1,5%

- Rara: < 0,5%

Os fungos endofíticos foram agrupados em categorias de constância, utilizando-

se a fórmula (Dazoz, 1983):

Onde: P = Número de coletas em que o fungo foi encontrado

N = Número total de coletas

Foram consideradas as seguintes categorias de constância:

- Espécie constante (C) presença ≥ 50%

- Espécie acessória (A) presença entre ≥ 25% e < 50%

- Espécie acidental (S) presença quando < 25%

FO ‗ Ni X 100 N

C ‗ P X 100 N


62

2. Índice de similaridade de Sørensen (Müller-Dombois, 1981), aplicado para

verificar similaridade entre as quatro áreas de coletas, e as quatro cultivares, cuja

fórmula é expressa em:

Onde: S = Similaridade;

a = Número de espécies ocorrendo em A

b = Número de espécies ocorrendo em B

W = Número de espécies comuns às duas áreas ou substratos

Para comparação entre Índices de similaridade, utilizou-se o método de treliça

(Silveira Neto et al., 1976).

3. O Teste do Qui-Quadrado de Aderência ou Ajustamento (Snedecor & Cochran,

1980), foi utilizado para testar se existe diferença significativa em relação à idade

fenológica das folhas, e cultivares analisadas.

Onde: X² = Qui-Quadrado

Fo = Frequência observada para cada classe

Fe = Frequência esperada para classe

S ‗ 2w X 100

a + b

X² ‗ Σ (Fο – Fe)²

Fe


63

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Fungos endofíticos isolados de folhas sadias de bananeiras

Foram isolados representantes de 40 espécies de fungos endofíticos originados de

751 colônias, a partir de 1728 discos foliares (Tabela 3). A taxa de colonização dos

isolados, nas quatro cultivares de banana foi considerada alta (751), provavelmente

devido à eficiência da metodologia utilizada e á boa sanidade das cultivares. Segundo

Abreu (2005) e Gamboa et al. (2002), a taxa de colonização por fungos endofíticos é

alta quando em torno de ±600 isolados. Resultados diferentes em relação ao isolamento

de fungos endofíticos de Musa spp. foram obtidos por Brown et al. (1998), que isolaram

apenas 24 espécies do total de 1600 discos foliares, em Hong Kong e Austrália; Pereira

et al. (1999) que isolaram 16 espécies em 2400 fragmentos, em São Paulo, Brasil;

Photita et al. (2001), os quais isolaram 61 espécies a partir de 7500 fragmentos, na

Tailândia; Cao et al. (2002) que isolaram 14 espécies em 200 fragmentos, na China.

A composição de espécies pode variar de acordo com fatores abióticos e bióticos

(Faeth & Fagan, 2002), hospedeiro, distribuição geográfica, idade da planta, condições

ecológicas, sazonalidade, altitude e precipitação (Soares et al., 2007). De acordo com

Moreira et al. (2009), a taxa de colonização por fungos endofíticos muda entre espécies

e tecidos de plantas.

A não identificação de alguns fungos é resultado da falta de esporulação em

meios de cultura artificiais (Wang et al., 2005). Alguns isolados fúngicos foram

desconsiderados por não produzirem estruturas de reprodução nos meios de cultura

utilizados. Lacap et al. (2003) desconsideraram os isolados não esporulados,

denominando-os de micélio estéril. Segundo os autores a falta de esporulação é devida,

provavelmente, ao pouco tempo no laboratório e tipo de substrato utilizado. Petrini

(1981) também cita o tempo como fator importante na indução da esporulação, podendo

os fungos esporular dois, três ou 14 meses depois do isolamento. A presença de fungos

que não esporulam é comum entre isolados endófitos.

As 40 espécies de fungos endofíticos identificadas estão distribuídas em três

grupos: 32 anamorfos (80%), sete Ascomycota (17,5%) e um Basidiomycota (2,5)

(Figura 4).


64

80%

17,50%2,50%

Anamorfo Ascomycota Basidiomycota

Figura 4. Frequência dos grupos de fungos endofíticos isolados de Musa spp

A predominância dos anamorfos nas áreas estudadas reflete sua importância

como decompositores de substratos foliares, fato verificado em diversos trabalhos

(Watson et al., 1974; Maia, 1983; Kuter, 1986; Schoenlein-Crusius, 1993; Venedikian

& Godeas, 1996; Wellbaum et al., 1999; Venedikian et al., 2001, Grandi & Silva,

2006). Através da ação enzimática os fungos atuam como decompositores da matéria

orgânica, facilitando a reincorporação de nutrientes ao solo, constituindo papel

importante para manutenção do equilíbrio dos ecossistemas, através da ciclagem de

nutrientes (Grandi & Gusmão, 2002), penetrando no vegetal durante o crescimento das

raízes, ao sofrerem abrasões (Azevedo, 1998). Encontrados na natureza na forma

assexual, alguns apresentam fase sexual (teleomórfica), representada pelos Filos

Ascomycota e Basidiomycota (Kirk et al., 2008).

Wilson et al. (1991) informaram que em sua maioria os fungos endofíticos são

Ascomycota, ocorrendo em menor frequência Basidiomycota e seus anamorfos. Para

Ploetz (1999), ascósporos são estruturas de disseminação mais importantes em

bananais, embora conídios também os sejam. A fase sexuada permite a sobrevivência do

fungo, quando as condições ambientais não são favoráveis. Fungos endofíticos isolados

de altas latitudes são caracterizados por apresentarem poucas espécies de Ascomycota

(Arnold, 2007).


65

A baixa frequência de Basidiomycota é devida provavelmente, ao meio de

cultura e técnicas utilizadas para isolamento, neste trabalho. Chareprasert et al. (2006) e

Conti (2007) obtiveram baixa ocorrência de Basidiomycota em folhas de Melia

azedarach, Samanea saman e Borreria verticillata, respectivamente. Segundo

Promputtha et al. (2005), o isolamento de Basidiomycota é negligenciado, devido ao

fato das pesquisas não utilizarem caules maduros como fonte de fungos endofíticos.

Crozier et al. (2006) sugerem que as técnicas utilizadas não contribuem para o

isolamento de Basidiomycota, e segundo Thomas et al. (2008) estes recebem pouca

atenção em relação aos Ascomycota.

Dos 24 gêneros de fungos endofíticos, Colletotrichum (23,7%) foi o mais

frequente, diferindo neste aspecto, quanto à frequência de ocorrência dos demais

(Figura 5).

Segundo Arnold & Lutzoni (2007), fungos endofíticos tropicais são

representados por pequeno número de gêneros, com grande número de espécies,

divergindo dos resultados deste trabalho, visto que, nas folhas de bananeira foram

isolados 24 gêneros e 40 espécies.

Figura 5. Frequência de ocorrência dos 24 gêneros de fungos endofíticos isolados em

folhas de quatro cultivares de bananeira, no município de Belo Jardim/PE

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

Col

leto

trichu

mCla

dosp

oriu

mDeigh

toni

ella

Acr

emon

ium

Nig

rosp

ora

Cur

vula

ria

Nod

ulispo

rium

Pae

cilo

myc

esGlo

mer

ella

Alter

naria

Gui

gnar

dia

Fus

ariu

mPes

talo

tiop

sis

Xylar

iaDre

sche

rella

Tritirac

hium

Spor

miella

Scol

ecob

asid

ium

Pho

ma

Cor

dana

Myc

osph

aere

lla

Pap

ulos

pora

Per

icon

ia

Schi

zoph

yllu

m


66

Os fungos endofíticos mais abundantes foram: Colletotrichum musae, C.

gloeosporiodes, Deightoniella torulosa, Nigrospora oryzae, Cladosporium

cladosporioides, Acremonium polychoroma, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces

lilacinus, Alternaria alternata, Guignardia mangifera, Fusarium solani e Pestalotiopsis

maculans. Oito espécies foram comuns, sete ocasionais e treze raras (Tabela 3).


67

Tabela 3. Unidades formadoras de colônias (UFC) e frequência de ocorrência (%) dos

fungos endofíticos isolados dos discos foliares de bananeira (Musa spp.), em quatro

coletas realizadas no município de Belo Jardim/PE

Fungos endofíticos isolados

UFC

Frequência de

ocorrência (%)

♥ Acremonium bacillisporum (Onions & G. L. Barron) W. Gams 10 1,3 ♣ A. strictum W. Gams 2 0,2 ◘ A. polychromum (J.F.H. Beyma) W. Gams 40 5,3 ◘ Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 31 4,1 ◘ Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries. 42 5,7 ▲C. musae Mason 13 1,7 ♣ C. oxysporum Berk. & Curt. 3 0,4 ♣ C. tenuissimum Link 1 0,1 ♣ Colletotrichum dematium (Pers. ex Fr.) Grove 4 0,5 ◘ C. gloeosporioides (Penz.) Sacc. 66 9,0 ◘ C. musae (Berk & M.A.Curtis) Arx. 108 14,3 ♣ Cordana musae (Zimm.) Höhnel 1 0,1 ▲Curvularia eragrostidis (Henn.) J. A. Mey. 20 2,6 ♣ C. lunata var. aeria (Bat., J.A. Lima & C.T. Vasconc.) M.B. Ellis 4 0,5 ♥ C. oryzae Bugnic. 5 0,6 ♥ C. pallescens Boedijn 8 1,0 ♥ C. prasadii R. L. Mathur & B. L. Mathur 7 0,9 ◘ Deightoniella torulosa (Syd.) M. B. Ellis 53 7,0 ▲Drechslera hawaiiensis (Bugnicourt) Subram. & Jain ex M. B. Ellis

19 2,5

◘ Fusarium solani (Mart.) Sacc. 25 3,3 ♥ F. oxysporum E.F. Sm. & Swingle 5 0,6 ▲Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk 19 2,5 ▲G. musarum Petch 15 2,0 ◘ Guignardia mangifera A.J. Roy 30 4,0 ♣ Mycosphaerella musicola R. Leach ex J.L. Mulder 1 0,1 ◘ Nigrospora oryzae (Berkeley & Broome) Petch 50 6,6 ◘ Nodulisporium gregarium (Berk. & Curt.) J. A. Meyer 40 5,3 ◘ Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson 35 4,6 ♣ Papulospora halima Anastasiou 1 0,1 ♣ Periconia digitata (Cooke) Sacc. 1 0,1 ◘ Pestalotiopsis maculans (Corda) Nag Raj 22 3,0 ♣ Phoma capitulum Pawar Mathum & Thirum 1 0,1 ♣ P. sorghina (Sacc.) Boerema, Dorenb. & Kesteren 1 0,1 ♣ P. tracheiphila (Petri) L.A. Kantsch. & Gikaschvili 1 0,1 ♣ Schizophyllum commune Fr. 1 0,1 ♥ Scolecobasidium humicola G.L. Barron & L.V. Busch 10 1,3 ▲Sporormiella mínima (Auersw.) S.I. Ahmed & Cain 12 1,5 ▲Tritirachium oryzae (Vincens) de Hoog 14 2,0 ▲Xylaria sp. Hill ex Schrank 20 2,6 ♥ Xylaria aff. hypoxylon (L.) Grev. 9 1,2 Total de UFC 751 100 Frequência total de ocorrência - 43,5 ♣ = Rara; ♥ = Ocasional; ▲= Comum; ◘ = Abundante.


68

Algumas das espécies identificadas neste trabalho, também foram isoladas como

fungos endofíticos em folhas de Musa acuminata. Colletotrichum gloeosporioides, C.

musae, Xylaria sp., e Nigrospora oryzae foram referidos em bananeiras na Austrália,

China e Tailândia (Brown et al., 1998; Photita et al., 2001); Alternaria alternata,

Cladosporium cladosporioides, Fusarium solani e Glomerella cingulata referidas em

Hong Kong e Austrália (Brown et al., 1998); Cordana musae foi referida isolada na

Tailândia (Photita et al., 2001) e Deightoniella torulosa na China e Tailândia (Photita et

al., 2001; Cao et al., 2002). Alguns autores procedem à identificação na maioria das

vezes até o nível de gênero, o que impede comparação em nível específico. Entretanto,

pode-se observar que algumas espécies identificadas pelos autores acima mencionados,

coincidem com as isoladas na presente pesquisa.

No Brasil Pereira et al. (1999) isolaram Xylaria sp., Colletotrichum musae,

Cordana musae, Nigrospora oryzae e Sporormiella minima.

Colletotrichum musae, Deightoniella torulosa, Cladosporium musae, Fusarium

oxysporum, Cordana musae e Mycosphaerrella musicola, isoladas como endófitos no

presente trabalho, também são citadas como fitopatógenos estabelecidos em bananeira

(Mesturino, 1988; Jimenez et al., 1993; Johnson & Sanghote, 1994; Pineda et al., 1997;

Rivas & Rosales, 2003; Surridge, 2003; Moraes et al., 2006).

Segundo Petrini (1991), tecidos assintomáticos de vegetais no início da

senescência permitem que sapróbios se estabeleçam, iniciando a decomposição.

Evidências sugerem que fungos endofíticos evoluíram diretamente de fitopatógenos

(Carroll, 1988) e a sua fase latente representa condição específica para que o

fitopatógeno não desenvolva sintomas nem cause alterações na fisiologia do hospedeiro

(Romero et al., 2001). Schulz & Boyle (2005) supõem que não há interações neutras

entre fungo endofítico /hospedeiro, havendo equilíbrio antagônico, ocorrendo virulência

por parte do fitopatógeno para causar infecção, e resistência por parte da planta para

limitar o desenvolvimento dos fungos e da doença.

De acordo com Sinclair (1991) ocorre dificuldade em estabelecer limites entre

fungos endofíticos e fitopatógenos latentes. Infecção latente é o estado em que o

hospedeiro é infectado pelo fitopatógeno, sem mostrar sintomas. A infecção é regida por

condições ambientais, nutricionais ou maturidade do hospedeiro ou do fitopatógeno.

Brown et al. (1998) apoiam a idéia de que fitopatógenos podem passar parte de sua vida

como endófitos. De acordo com Photita et al. (2004), fungos endofíticos de Musa

acuminata, podem estar latentes em seu hospedeiro muito antes do aparecimento dos


69

sintomas da doença, sendo complexa e a conceituação de um fungo como endófito ou

como fitopatógeno.

Acremonium é habitante comum do solo e serrapilheira, sendo isolado também

do ar e de diversos substratos (Maia, 1983; Kiffer & Morelet, 1997). Rai et al. (1988)

relataram que algumas espécies possuem forte atividade celulolítica in vitro. Pocasangre

et al. (2000) isolaram Acremonium sp. como fungo endofítico de raízes de bananeira, na

América Central.

Alternaria é habitante do filoplano e colonizador primário nas folhas (Watson et

al., 1974), com distribuição cosmopolita, inclusive na Antártica (Rosa et al., 2009),

apresentando habilidade fitopatogênica em diversos hospedeiros (Rubini et al., 2005).

Alternaria tem como característica comum baixa capacidade ou mesmo ausência de

esporulação em meio de cultura. Vários trabalhos indicam diferentes métodos para

induzir esporulação com variações quanto à luz utilizada, meios de cultura,

temperaturas e idade das colônias (Silva & Melo, 1999). Devido à presença da parede

celular espessa e melanização, Alternaria alternata é resistente à radiação ultravioleta e

tolerante à dessecação (Dickinson, 1981). Produz conídios pigmentados e

multicelulares, permitindo sua permanência na folha durante o processo de senescência,

resistindo a condições adversas (Stone et al., 1996). Sobrevive tanto epifiticamente

quanto endofiticamente nos tecidos das folhas em início de decomposição (Ghizelini et

al., 2006). Alguns autores isolaram A. alternata como espécie endofítica dominante em

folhas de diferentes hospedeiros: tais como: Glycine max (L.) Merr., na Argentina

(Larran et al., 2002); Tectona grandis L. e Samanea saman Merr., na Tailândia

(Chareprasert et al., 2006); Triticum aestivum L., na Argentina (Larran et al., 2007);

Citros (Corrêa, 2008).

Cladosporium é considerado colonizador saprofítico primário (Dickinson, 1976),

ubíquo (Domsch et al., 1980) e fitopatógeno (Brown et al. 1998), presente tanto

epifiticamente quanto endofiticamente durante os primeiros estágios de decomposição

(Petrini, 1991). Descrito por Sadaka & Ponge (2003) como habitante da superfície foliar

e colonizador interno de folhas jovens e senescentes. Apresenta capacidade de crescer

em vários substratos (Zeng et al., 2006). Cladosporium musae atua como antagonista e

sob condições favoráveis torna-se fitopatógeno (De Vries, 1952). Considerado parasito

fraco, causa doenças em folhas velhas de bananeiras, cultivadas em locais de elevada

umidade (Ploetz et al., 1994). C. cladosporioides é fungo comum, com ocorrência

registrada em todas as partes do mundo. Encontrado no ar e alimentos, como endofítico


70

ou como sapróbio com função biológica importante na decomposição de matéria

orgânica, sendo forte competidor com outros microrganismos (Ellis, 1976; Samson et

al., 2000). Isolado em folhas de helicônias como endófito, principalmente quando as

folhas iniciam a senescência (Pereira, 1993), e em folhas sadias de cafeeiro (Chaves et

al., 2002). Fisher et al. (1993) isolaram C. tenuissimum como endófito de folhas de

Eucalyptus nitens, na Austrália e na Inglaterra.

Segundo Freeman et al. (1998) é frequente a ocorrência de mais de uma espécie

de Colletotrichum associada a um mesmo hospedeiro. Caracteres morfológicos, como

forma, tamanho dos conídios, apressórios e hospedeiros são utilizados para definir

espécies de Colletotrichum (Sutton, 1992), porém a biologia molecular é considerada

ferramenta indispensável para diferenciar espécies. Relatado como fungo endofítico em

outros vegetais (Glienke, 1995; Fröhlich et al., 2000; Larran et al., 2001; Cannon &

Simmons, 2002; Arnold et al., 2003; Pimentel et al., 2006; Wang et al., 2008). Devido

ao fácil cultivo e à rápida identificação Colletotrichum destaca-se como gênero

dominante (Pileggi, 2006). Colletotrichum gloeosporioides e C. musae foram isolados

no presente trabalho como abundantes, entretanto C. dematium teve ocorrência rara.

Segundo Menezes (2002), C. musae é específico para Musa spp.

Espécies de Curvularia são sapróbias ou fitopatógenas, ocorrendo em áreas

tropicais e subtropicais, isoladas do solo, ar, matéria orgânica, plantas e animais,

incluindo seres humanos (Freire et al., 1998). Na presente pesquisa foram isoladas cinco

espécies de Curvularia, sendo Curvularia eragrostides de ocorrência comum, C.

oryzae, C. pallescens e C. prasadii ocasionais. Farr et al. (1989) relataram que C.

pallescens ocorre em substratos de gramíneas e comumente isolada do solo e de

vegetais em decomposição. C. lunata é referido como endófito de folhas de Glycine

max (soja), na Argentina (Larran et al., 2002). C. lunata var. aeria foi isolada neste

trabalho como rara.

Fusarium tem ampla distribuição geográfica, ocorrendo em regiões tropicais,

subtropicais e temperadas, em diferentes zonas climáticas do planeta, com distribuição

influênciada pela chuva (Ventura & Costa, 2006). Algumas espécies têm íntima

associação com seus hospedeiros (Burgess et al., 1994). Em relação ao seu habitat

Fusarium pode ser agrupado em: a) do solo, b) da parte aérea de vegetais, c) misto, do

solo e parte aérea. Como habitante do solo, está associado às doenças de raízes.

Habitantes da parte aérea, raramente ocorrem no solo, infectando partes aéreas de

tecidos específicos das plantas (Ventura et al., 2004). Fungo agressivo, responsável pela


71

síndrome da queda dos frutos de várias fruteiras (Mota & Gasparotto, 1998) e

competidor saprofítico em solos (Pugh & William, 1968). Espécies de Fusarium são

comumente isoladas como fungos endofíticos, em ambientes tropicais (Rodrigues &

Samuels, 1990; Bills & Polishook, 1992; Fisher et al., 1994; Suryanaryanan &

Kumaresan, 2000; Photita et al., 2001; Cao et al., 2002; Larran et al., 2002). Fusarium

oxysporum sobrevive na matéria orgânica, produzindo estruturas de resistência que

permitem ao fungo atravessar períodos desfavoráveis no solo durante vários anos (Blum

et al., 2006). Fusarium solani apesar de habitar o solo, nas regiões tropicais tem

ocorrido nas partes aéreas das plantas, demonstrando que o ambiente afeta o processo de

dispersão (Ventura et al., 2004).

Segundo Sivanesan (1984), os principais hospedeiros de Guignardia, fungo

sapróbio ou semiparasita, são folhas de Musa. Meredith (1968) e Liberato et al. (2009)

isolaram Guignardia mangifera de folhas velhas e frutos de bananeiras. Punithalingam

(1981) refere que espécies de Guignardia pouco se diferenciam pelas medidas dos ascos

e ascósporos, sendo a principal separação feita com base no carárter especificidade

quanto ao hospedeiro. Representantes do gênero são isolados de diferentes espécies de

plantas e caracterizados como endófitos (Carroll & Carroll, 1978; Petrini, 1986; Madriz

et al., 1991; Nag Raj, 1993; Rodrigues & Samuels, 1999; Penna, 2000; Glienke-Blanco

et al., 2002; Okane et. al., 2003; Silva & Pereira, 2007; Wickert et al., 2009). De acordo

com Costa (2003), Guignardia é um dos fungos endofíticos mais isolados em vegetais

tropicais. Entretanto, há maior número de trabalhos que tratam este gênero como

fitopatógeno de culturas com importância econômica (Corrêa, 2008). Liberato et al.

(2009) citam que G. citricarpa pode causar infecções assintomáticas em folhas de

bananeira.

Glomerella, gênero cosmopolita, é abundante nos trópicos, com ampla gama de

hospedeiros (Holliday, 1980); encontrado como parasita ou sapróbio em plantas

vasculares (Hanlin & Menezes, 1996), demonstra certa especificidade por determinados

tecidos vegetais (Clay & Schardl, 2002). G. cingulata (Anamorfo: Colletotrichum

gloeosporioides) é citado como endófito em folhas de outros vegetais: Glycine max (L.)

Merr., na Argentina (Larran et al., 2002); Viguiera arenaria (Asteraceae), no Brasil

(Guimarães, 2007). G. musarum (Anamorfo: Colletotrichum musae), tem ampla

distribuição geográfica, ocorrendo onde a bananeira é cultivada (Wardlaw, 1972).

Economicamente é importante por causar prejuízos em pós-colheita (Jeffries et al.,

1990).


72

Segundo Brown et al. (1998), Nigrospora oryzae está adaptado à existência

endofítica. A maioria das espécies possui hábito sapróbio (Tomé, 2005). Salazar &

García (2005) isolaram N. oryzae endofítica de folhas de rosa (Rosa hybrida), na

Colômbia.

Nodulisporium gregarium anamorfo de fungos xilariaceos, é comumente

encontrado nos trópicos como endofítico (Rodrigues & Samuels, 1990; Rodrigues,

1991; Lodge et al., 1996; Bayman et al., 1998).

Paecilomyces lilacinus, espécie dominante no solo (Jatala, 1986), é considerado

sapróbio capaz de utilizar grande faixa de substratos e parasita oportunista com pouca

especificidade de hospedeiro (Goettel et al., 2001). A adaptabilidade à ampla faixa de

pH do solo, torna-o competitivo em solos (Jacobs et al., 2003). A espécie tem

habilidade para colonizar endofiticamente raízes de cevada (Llopez-Lorca et al. 2002) e

de soja (Nunes, 2008). Na China, espécies de Paecilomyces foram isoladas de raízes de

Musa acuminata (Cao et al., 2002) e de folhas de Camptotheca acuminate (Lin et al.,

2007). Neste trabalho se destaca entre as espécies geradoras de antibiose.

Segundo Kohlmeyer & Kohlmeyer (1979), Papulospora, gênero sapróbio

(Gallardo & Piontelli, 2007), geralmente cresce sobre madeira em decomposição de

árvores de espécies temperadas como Arbutus menziesii, Abies alba e outras.

Papulospora halima foi isolada como endofítico de vários vegetais (Fell & Hunter,

1979; Cuomo et al.; 1985; Stchigel et al.; 2007). Gallo et al. (2007) isolaram

Papulospora immersa como endófito de Smallanthus sonchifolius (Poeppig &

Endlicher) H. Robinson (Asteraceae), em São Paulo, Brasil.

Periconia, gênero de clima temperado e tropical é encontrado em vegetais em

decomposição em ecossistemas terrestres (Romero, 1994; Fisher et al., 1995; Photita et

al., 2001; Yanna et al., 2002), de água doce e mangue (Alias & Jones, 2000; Sarma &

Vittal, 2000) e marinhos (Morrison-Gardiner, 2002). Romero et al. (2001) citam o

gênero como fitopatógeno e endofítico. Photita et al. (2003) isolaram Periconia digitata

(32%) como a espécie mais frequentemente associada a folhas em decomposiçao de

Musa acuminata, na Tailândia. Neste trabalho P. digitata foi isolada como espécie rara.

Pestalotiopsis é um gênero complexo, cuja classificação em nível de espécie é

dificultada pela grande variação morfológica (Jeewon et al., 2003). Amplamente

distribuída no mundo com espécies isoladas em regiões subtropicais e tropicais (Wei et

al., 2007), ocorre em vários substratos (Wang et al., 2005). A maioria das espécies é


73

fitopatógena (Zhang et al., 2003), mas há outras sapróbia em restos vegetais (Osono &

Takeda, 2000; Tang et al. 2003). O fungo não apresenta especificidade por hospedeiro

(Wei et al., 2005). Wei et al. (2007) isolaram Pestalotiopsis como fungo endofítico, em

folhas velhas de Podocarpaceae, na China. Rodrigues & Samueles (1990) isolaram

Pestalotiopsis sp. em folhas de Licuala ramsayi (Muell.) Domin (palmeira tropical), na

Austrália, especulando que embora tenha sido isolado endofiticamente, foi

provavelmente transportado pelo ar. No presente trabalho, P. maculans foi isolada como

espécie abundante.

Echandi (1957) cita que espécies de Phoma colonizam folhas mesmo na ausência

de ferimentos, penetrando diretamente pela epiderme. Fungo ubíquo é encontrado em

plantas, solo, seres humanos, animais e no ar. Espécies de Phoma têm ocorrência

limitada por condições ambientais, como: temperatura, umidade relativa do ar,

intensidade luminosa e altitude (Salgado et al., 1997). Pinto et al. (1992) e Oliveira &

Cavalcanti (2005) isolaram P. capitulum do solo da praia de Boa Viagem e de Candeias,

Pernambuco/Brasil. Boerema et al. (2004) isolaram de ambiente marinho e de solo

salino, e de floresta de carvalho, na Índia. Segundo os autores é provavelmente um

fungo "halofílico" que habita o solo. Zimowska (2007) isolou Phoma capitulum como

fungo endofítico de Leonurus motherwort cardiaca L., na Polônia. P. tracheiphila tem

ampla distribuição na região mediterrânea (Mendes & Freitas, 2005). Noronha (2002)

relata não haver registro de P. tracheiphila no Brasil e Estados Unidos. Phoma

sorghina, presente em regiões tropicais e subtropicais, ocorre em vegetais,

principalmente gramíneas (Punithalingam, 1981). Phoma sorghina é citada como

sapróbio (Gruyter & Noordeloos, 1992), endofítico (Suryanarayanan et al., 2005;

Borges & Pupo, 2006) e fitopatógeno facultativo (Pazoutová, 2009). Phoma capitulum,

P. tracheiphila e P. sorghina apresentaram ocorrência rara nesta pesquisa.

A distribuição de Sporormiella minima é influenciada por herbívoros, tipo de

vegetação e condições climáticas (Caretta et al., 1994). Apresenta habitat coprófilo

(Piontelli et al., 2006), sendo isolada também do solo (Davis & Shafer, 2006), de

madeira, folhas em decomposição, raramente em humanos (Barr, 2000) e como endófito

de diferentes vegetais (Suryanarayanan et al., 1998; Pereira et al., 1993; Freire et al.,

2000; Kumaresan & Suryanarayanan, 2002; Costa, 2003). Costa (2003) isolou-o de

espécies de manguezal: Aviccenia schaueriana Stapf., Laguncularia racemosa Gaerth. e

Rhizophora mangle L., no Brasil. Espécies coprófilas exercem intenso antagonismo

entre si, competindo pelo substrato, e produzindo substâncias antifúngicas (Takahashi &


74

Lucas., 2008). Ascósporos de S. minima foram encontrados em amostras antigas de solo

e sedimentos, sendo instrumentos úteis na paleoecologia (Burney et al., 2003). Raper &

Bush (2009) sugerem que ascósporos indicam presença e abundância de

megaherbívoros da pré-história. Esta espécie inibiu alguns fitopatógenos de bananeira

por meio de antibiose, neste trabalho.

Schizophyllum commune foi único Basidiomycota isolado como endófito em

folha velha tendo, formado basidiocarpo e grampo de conexão em meio BDA. Fisher et

al. (1993) isolaram como endófito de folhas de Eucalyptus nitens, na Austrália.

Dentre os fungos endofíticos, Xylaria é o gênero com maior frequência de

isolamento e diversidade ecológica em regiões tropicais (Rodrigues-Heerklotz &

Pfenning, 2009). Apesar de ter apresentado estromas típicos da fase teleomórfica em

meio de cultura no presente trabalho tornou-se difícil sua identificação ao nível de

espécie, pela ausência de ascomas férteis no estroma. De acordo com Petrini & Petrini

(1985), Xylaria leva até seis meses para esporular, nas melhores condições, tornando-se

problemática sua identificação, em meios de cultura. Resultados semelhantes foram

obtidos por Lodge et al. (1996); Arnold et al. (2000); Davis et al. (2003), em relação à

esporulação de Xylaria. Rodrigues (1994) identificou espécies de Xylaria através de

estruturas reprodutivas em meio de cultura, sendo um dos poucos autores que conseguiu

este efeito. Rodrigues & Samuels (1999) relatam maior frequência de Xylaria em

plantas tropicais, em relação às regiões temperadas. Davis et al. (2003) isolaram Xylaria

sp. como fungo endofítico de hepática, na Jamaica.

Vários trabalhos registram Xylaria como endófito em folhas de diferentes

espécies vegetais, em várias localidades (Petrini et al., 1982; Clay, 1987; Bertoni &

Cabral, 1988; Clay, 1989; Petrini & Fisher, 1990; Rodrigues, 1991; Fisher & Petrini,

1992; Pereira et al., 1993; Rodrigues, 1994; Lodge et al., 1996; Rodriguez & Samuels,

1999; Arnold et al., 2000; Cannon & Simmons, 2002; Glienke-Blanco et al., 2002;

Suryanarayanan et al., 2005; Gao et al., 2005; Salazar & García, 2005; Silva et al.,

2006; Pileggi, 2006; Pimentel et al., 2006; Chareprasert et al., 2006; Gama et al., 2008;

Osono, 2008; Magalhães et al., 2008; Wang et al., 2008), demonstrando que a

distribuição do gênero como fungo endofítico não está restrita a determinadas regiões e

hospedeiros. Pouquíssimos trabalhos estão relacionados ao isolamento de Xylaria em

folhas sadias de bananeira com registros apenas no Brasil (Pereira et al. 1999); Hong


75

Kong e Austrália (Brown et al., 1998) e Tailândia (Photita et al., 2001), tornando-se

necessários mais estudos.

4.2. Fungos endofíticos isolados por estádios fenológicos das folhas de bananeiras

A frequência de colonização dos fungos endofíticos nas folhas novas foi 21%,

nas intermediárias 36% e nas velhas 42%. Folhas novas, intermediárias e velhas,

apresentaram respectivamente 159, 271 e 321 UFC (Tabela 4). As folhas velhas

destacaram-se pela maior frequência de colonização, em comparação com as novas e

intermediárias, com diferença estatisticamente significativa, ocorrendo aumento na

diversidade fúngica. Este padrão de aumento de riqueza de fungos em relação à idade

foliar foi observado em outras espécies vegetais por vários autores (Fisher et al., 1986;

Arnold et al., 2000; Frohlich et al., 2000; Bussaban et al., 2001; Photita et al., 2001;

Gamboa & Bayman, 2001; Kumaresan & Surynaraynan, 2002; Arnold et al., 2003;

Arnold & Herre, 2003; Chareprasert et al., 2006; Pimentel et al., 2006; Conti, 2007;

Osono, 2008). Brown et al. (1998) observaram em folhas jovens de Musa acuminata,

em Hong Kong, menor taxa de colonização (29,6%) em relação às folhas velhas.

Fatores ecológicos, idade da folha (Petrini, 1991) e tipo de tecido (Fisher et al.,

1995) podem afetar a comunidade de fungos endofíticos, sugerindo que estes se

estabelecem dentro das folhas em condições específicas de temperatura, umidade,

altitude e idade fenológica.

Tabela 4. Unidades formadoras de colônias e frequência de ocorrência (%) de fungos

endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.)

Idade fenológica das folhas UFC Frequência de ocorrência (%)

Novas 159c 21

Intermediárias 271b 36

Velhas 321a 43

UFC 751 - UFC = Unidades formadoras de colônias. * Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, não diferem entre si (P<0,0001). Soma das Categorias = 751 Qui-Quadrado = 59,977 Grau de Liberdade = 2 (p) = 0,0000


76

A população endofítica é encontrada com maior frequência nas partes mais

velhas da planta em relação às mais novas. Meredith (1968) isolou Guignardia musae

em folhas velhas da bananeira, no Havaí. Stover (1972) isolou Deightoniella torulosa

de folhas jovens e velhas de bananeira. Wilson & Carroll (1999) descrevem alta

frequência de fungos em folhas velhas de Quercus garryana. Kumaresan &

Surynayanan (2002) observaram que a colonização por Cladosporium cladosporioides e

Sporormiella minima, aumentou à medida que a folha envelhecia.

As diferenças na diversidade de fungos endofíticos com a idade fenológica das

folhas, segundo Soares et al. (2007) podem, estar relacionada, com particularidades nas

características morfológicas, nutricionais e químicas de cada fase do desenvolvimento

foliar. Para Moreira et al. (2009) é devido à existência de inúmeros metabólitos

liberados em maior quantidade nas folhas velhas.

Folhas posssuem nutrientes orgânicos e inorgânicos e representam porta de

entrada para fungos (Souza et al., 2004). A preferência dos fungos endofíticos para

colonizar um determinado tecido reflete sua capacidade de utilizar certo substrato

específico (Rodrigues & Samuels, 1990). A química da folha influencia as interações

competitivas entre endófitos, modificando a composição de espécies endofíticas (Arnold

et al., 2003). A preferência por folhas, das espécies endofíticas, deve-se ao fato dos

tecidos foliares serem um substrato bioquimicamente dinâmico em função da

fotossíntese (Arnold, 2005).

Vários fatores podem levar à redução na quantidade de fungos endofíticos em

folhas novas, entre estes: superposição de folhas, excesso de plantas por unidade de

área, concentrações fenolíticas, taninos e ambientes ensolarados (Spedding, 1979). Área

foliar, ângulo e forma da folha influem no aproveitamento da luminosidade (Alves,

1999).

À medida que o vegetal envelhece ocorre translocação de nutrientes para regiões

de crescimento. O processo de senescência modifica o nicho ecológico, permitindo

desenvolvimento de fungos adaptados à vida saprobiótica (Mattos et al., 2009). Fungos

de ocorrência em folhas velhas são considerados sapróbios primários, colonizadores

iniciais depois da abscisão foliar (Frankland, 1998). Assim, o primeiro estágio de

decomposição começa ainda no vegetal (Ghizelini et al., 2006).


77

Hyde & Alias (2000) relataram que diferentes partes do vegetal abrigam

diferentes fungos, indicando que certos fungos endofíticos podem ter preferência por

diferentes tipos de tecido.

As diferenças refletem a heterogeneidade dos microhabitats nas folhas e as

necessidades de cada fungo endofítico por determinadas condições nutricionais e

crescimento (Tabela 5).


78

Tabela 5. Fungos endofíticos isolados de discos foliares de bananeira (Musa spp.), em

relação à idade fenológica das folhas

Estádio fenológico das folhas fungos endofíticoF Novaª Intermediáriaª Velhaª

Acremonium bacillisporum + +♣ + A. strictum - - + A. polychoroma +♣ + + Alternaria alternata + + +♣ Cladosporium cladosporioides +♣ + + C. musae + + +♣ C. oxysporum - + - C. tenuissimum + - - Colletotrichum dematium + + +♣ C. gloeosporioides + + +♣ C. musae + + +♣ Cordana musae - - + Curvularia eragrostidis + +♣ - C. lunata var. aeria - + - C. oryzae - - + C. pallescens + - - C. prasadii + + +♣ Deightoniella torulosa + + +♣ Drechslera hawaiiensis + +♣ + Fusarium solani + +♣ + F. oxysporum +♣ - + Glomerella cingulata + + +♣ G. musarum - + +♣ Guignardia mangifera + + +♣ Mycosphaerella musicola + - - Nigrospora oryzae + +♣ + Nodulisporium gregarium - + +♣ Paecilomyces lilacinus + +♣ + Papulospora halima + - - Periconia digitata - + - Pestalotiopsis maculans - + +♣ Phoma capitulum - + - P. tracheiphila + - - P. sorghina + - - Schizophyllum commune - - + Scolecobasidium humicola + + +♣ Sporormiella mínima + + +♣ Tritirachium oryzae +♣ + + Xylaria sp. - + +♣ Xylaria aff. hypoxylon - - +♣ Total de ocorrência 27 28 29 (ª) Os sinais mais (+) e menos (-) representam presença ou ausência na folha, respectivamente. (♣) Maior ocorrência de colônias fúngicas.


79

4.3. Fungos endofíticos isolados por áreas de coletas

Taboquinha foi o local com maior frequência de isolados de fungos endofíticos

de bananeira (40%), seguido dos sítios Freixeira (27%), Araçá (19%) e Serra dos

Ventos com menor frequência de isolados (14%) (Tabela 6). Em relação às unidades

formadoras de colônias (UFC) de fungos endofíticos em bananeiras, observou-se por

ordem decrescente: Taboquinha (305), Freixeira (200), Araçá (143) e Serra dos Ventos

(103). Resultados semelhantes foram obtidos por Brown et al. (1998) ao isolarem

fungos endofíticos de folhas de Musa spp., em localidades diferentes, em Hong Kong e

na Austrália. Segundo os autores, as condições ambientais afetam a diversidade de

fungos endofíticos. Cannon & Simmons (2002) sugerem que fatores geográficos podem

ser mais importantes na determinação da composição endofítica. Segundo Lehtonen et

al. (2005) a fertilidade do solo é fator chave na interação planta/ fungo endofítico.

A maior produtividade da bananeira em Taboquinha pode estar relacionada às

condições físicas, químicas e biológicas das plantações, influenciada pelo solo e clima

da região. É provável que a maior ocorrência de fungos endofíticos (305 UFC), tenha

relação com essas características.

Os sítios Freixeira e Serra dos Ventos apresentam clima do tipo Bshs, quente

semi-árido, influenciado pela altitude devido à posição elevada de suas terras. São áreas

topográficas, com leve declividade e afloramento de rochas, solo com lixiviação, não

havendo consórcio com outras frutíferas. As áreas encontram-se em estado de

degradação, substituída pela monocultura. É provável que esses fatores tenham

influenciado na UFC dos fungos endofíticos.

Tabela 6. Número de UFC e Frequência de ocorrência (%) de fungos endofíticos em

bananeiras nas quatro áreas de coletas, no município de Belo Jardim/PE

Áreas de coleta Períodos de coletas UFC Frequência de ocorrência (%)

Araçá Chuvoso 143 19

Freixeira Estiagem 200 27

Serra dos Ventos Estiagem 103 14

Taboquinha Chuvoso 305 40


80

A comunidade endofítica varia em função do hospedeiro e das condições

ambientais, e as espécies se inter-relacionam dentro da planta, buscando o equilíbrio. O

desequilíbrio afeta o comportamento das espécies endofíticas, dando condições para que

fungos oportunistas manifestem seu potencial patológico (Maki, 2006). Fatores

climáticos, interação planta/ fungo endofítico, correspondência genômica e ambiente

podem mudar a natureza endofítica, transformando o fungo em fitopatógeno oportunista

(Moricca & Ragazzi, 2008).

Das 40 espécies de fungos endofíticos identificados nas folhas, 30 foram

registradas em bananeiras do sítio Taboquinha e 21 em bananeiras do sítio Araçá; 16

espécies foram registradas nos demais sítios. Apenas três espécies foram comuns às

quatro áreas (Tabela 7).

A distribuição das espécies por classes de constância revelou não haver

predominância de classe: 14 espécies foram consideradas acidentais (35%), 12

acessórias (30%) e 14 constantes (35%) (Tabela 7).


81

Tabela 7. Unidades formadoras de colônias de fungos endofíticos isolados em quatro

áreas de coleta (Araçá, Freixeira, Serra dos Ventos e Taboquinha), no município de

Belo Jardim/PE e categorias de constância (S=Acidental, A=Acessória e C=Constante)

Áreas de coleta

Fungos endofíticos isolados

Araçá

Freixeira

Serra dos Ventos

Taboquinha

Categoria de

constância

Acremonium bacillisporum 2 4 2 2 C A. strictum 0 0 0 2 S A. polychoroma 0 4 3 34 C Alternaria alternata 15 4 0 13 C Cladosporium cladosporioides

12 8 2 20 C

C. musae 4 6 3 0 C C. oxysporum 0 0 0 3 S C. tenuissimum 1 0 0 0 S Colletotrichum dematium 1 0 0 3 A C. gloeosporioides 14 10 6 35 C C. musae 13 73 0 20 C Cordana musae 0 1 0 0 S Curvularia eragrostidis 10 0 0 10 A C. lunata var. aeria 0 0 0 5 S C. oryzae 0 0 0 5 S C. pallescens 1 0 4 3 C C. prasadii 6 0 0 1 A Deightoniella torulosa 11 4 0 38 C Drechslera hawaiiensis 16 2 0 0 A Fusarium solani 6 0 5 14 C F. oxysporum 0 0 3 2 A Glomerella cingulata 4 0 0 15 A G. musarum 4 5 0 7 C Guignardia mangifera 12 9 0 9 C Mycosphaerella musicola 0 0 0 1 S Nigrospora oryzae 4 0 20 25 C Nodulisporium gregarium 0 35 0 3 A Paecilomyces lilacinus 0 0 33 0 S Periconia digitata 2 0 0 0 S Papulospora halima 0 0 0 2 S Pestalotiopsis maculans 3 12 0 8 C Phoma capitulum 1 0 0 0 S P. tracheiphila 0 0 1 0 S P. sorghina 0 0 0 2 S Schizophyllum commune 0 0 0 2 S Scolecobasidium humicola 0 0 2 8 A Sporormiella minima 0 0 5 7 A Tritirachium oryzae 0 0 4 10 A Xylaria sp. 0 18 2 0 A Xylaria aff. hypoxylon 0 5 4 0 A

Número de UFC 143 200 103 305 0 = Não ocorrência


82

Verificou-se que as populações de fungos endofíticos mais similares,

comparadas pelo Índice de Sørensen, foram dos sítios Araçá/Taboquinha (62%),

seguidas pelos de Araçá/Freixeira (59%), Freixeira/Taboquinha (47%). As populações

de Serra dos Ventos/Taboquinha (43%) e Araçá/Serra dos Ventos e Freixeira/Serra dos

Ventos (37%), apresentaram similaridade menor. Três espécies foram comuns às quatro

áreas de coletas: Acremonium bacillisporum, Cladosporium cladosporioides e

Colletotrichum gloeosporioides (Tabela 7). Segundo Müller-Dombois & Ellenberg

(1974), duas comunidades podem ser consideradas similares quando o índice de

Sørensen for superior a 50%, caso observado em três áreas estudadas.

Provavelmente estes resultados são devidos às diferenças existentes nas

cultivares de bananeira e condições ambientais entre as quatro áreas de coletas,

refletindo características de cada ambiente. Segundo Polishook et al. (1996), uma

mesma espécie vegetal tende a ter alta similaridade entre si, comparada a amostras de

diferentes espécies vegetais em uma mesma área. O predomínio de uma espécie está

ligado aos fatores climáticos e físico-químicos dos substratos na área investigada

(Marques et al., 2008).

Tabela 8. Número de espécies de fungos endofíticos associadas e comuns e índice de

similaridade entre as áreas de coleta, no município de Belo Jardim/PE

Áreas de coleta N° de espécies

Índice de similaridade

de Sørensen (%)

Associados a Araçá 21 _

Associados a Freixeira 16 _

Associados a Serra dos Ventos 16 _

Associados a Taboquinha 30 _

Comuns Araçá/Freixeira 11 59

Comuns a Araçá/Serra dos Ventos 7 37

Comuns a Araçá/Taboquinha 16 62

Comuns a Freixeira/Serra dos Ventos 6 37

Comuns a Freixeira/Taboquinha 11 47

Comuns a Serra dos Ventos/Taboquinha 10 43


83

4.4. Isolamento de fungos endofíticos por cultivares

As cultivares ‘Maçã’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Pacovan’ apresentaram

respectivamente 17,8%, 19,6%, 22,0% e 40,6% do percentual total de isolados, sendo o

de maior percentual de colonização no cultivar “Pacovan” devido provavelmente às

condições ambientais do local da coleta (Tabela 9).

Conforme Borges et al. (2000) ocorrem diferenças entre cultivares, até mesmo

dentro do grupo genômico. Aspectos como altura da planta, tamanho, formato das

folhas e suscetibilidade às doenças variam de cultivar para cultivar (Coelho et al.,

2002). Alguns fatores interferem qualitativa e quantitativamente na diversidade dos

fungos endofíticos, destacando-se: hospedeiro, distribuição geográfica, condições

ecológicas, sazonais, altitude, precipitação, idade do vegetal e o tempo até serem

submetidas ao isolamento (Peixoto Neto et al., 2004).

Em relação ao Teste do Qui-Quadrado (X²), como o valor de P<0,01, rejeita-se a

hipótese de nulidade (Ho), isto é, a hipótese de ser a mesma a porcentagem das

cultivares em relação às idades fenológicas das folhas. As cultivares ‘Maçã’ (165),

‘Nanicão’ (147) e ‘Prata-Anã’ (134) não apresentaram diferenças estatisticamente

significativas, quando comparadas, entretanto, com a cultivar ‘Pacovan’ (305), a

diferença é altamente significativa. A frequência de ocorrência em relação à idade

fenológica das folhas nova (159), intermediária (271) e velha (321) diferiu

significativamente. Em relação às frequências observadas e esperadas das idades das

folhas das cultivares observaram-se diferenças significativas (Tabela 9).


84

Tabela 9. Frequência de ocorrência e unidades formadoras de colônias (%) de fungos

endofíticos em folhas de quatro cultivares de bananeira (Musa spp.)

Cultivares Idade fenológica das folhas ‘Maçã’ ‘Prata-Anã’ ‘Nanicão’ ‘Pacovan’

UFC(%)

Nova 32(34,93)

28(28,37)

13(31,12)

86(64,57)

159c

Intermediária 62(59,54)

42(48,35)

52(53,05)

115(110,06)

271b

Velha 71(70,53)

64(57,28)

82(62,83)

104(130,37)

321a

UFC 165

22,0% 134

17,8% 147

19,6% 305

40,6% 751

UFC = Unidades formadoras de colônias. * Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, não diferem entre si (P<0,0001). Qui-Quadrado (X²) = Σ (Fο – Fe)/Fe, Tabela de Contingência = 4 X 3 Qui-Quadrado (X²) = 31,065 ** Graus de Liberdade = 6 (p) < 0,0001

A Tabela 10 mostra as unidades formadoras de colônias (UFC) de fungos

endofíticos isolados em cada cultivar, com destaque para a cultivar “Pacovan”, com 305

UFC. O número de espécies associadas às cultivares ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’

e ‘Maçã’ foi, respectivamente: 29, 27, 20 e 25. Cladosporium cladosporioides,

Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, Deightoniella torulosa,

Fusarium solani e Nigrospora oryzae foram comuns as quatro cultivares.


85

Tabela 10. Fungos endofíticos isolados (UFC) em quatro cultivares de bananeira

(‘Nanicão’, ‘Pacovan’, ‘Prata-Anã’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE

UFC

Fungos endofíticos

Nanicão

Pacovan

Prata-Anã

Maçã

Acremonium bacillisporum 4 4 0 2 A. strictum 0 2 0 0 A. polychoroma 0 35 3 2 Alternaria alternata 10 18 3 0 Cladosporium cladosporioides 4 20 5 13 C. musae 1 0 6 6 C. oxysporum 0 3 0 0 C. tenuissimum 0 0 1 0 Colletotrichum dematium 1 3 0 0 C. gloeosporioides 12 32 10 12 C. musae 31 26 40 11 Cordana musae 0 0 1 0 Curvularia eragrostidis 1 10 1 8 C. lunata var. aeria 0 5 1 0 C. oryzae 0 5 0 0 C. pallescens 0 5 2 1 C. prasadii 1 3 3 0 Deightoniella torulosa 1 36 7 9 Drechslera hawaiiensis 9 0 3 7 Fusarium solani 4 16 1 4 F. oxysporum 0 2 2 1 Glomerella cingulata 5 11 2 1 G. musarum 3 4 4 4 Guignardia mangifera 6 11 0 13 Mycosphaerella musicola 0 1 0 0 Nigrospora oryzae 3 25 8 14 Nodulisporium gregarium 32 3 0 5 Paecilomyces lilacinus 0 0 9 26 Periconia digitata 0 0 1 0 Papulospora halima 0 1 0 0 Pestalotiopsis maculans Phoma capitulum

3 0

4 0

7 1

7 0

P. tracheiphila 0 0 0 1 P. sorghina 0 0 0 1 Schizophyllum commune 0 1 0 0 Scolecobasidium humicola 0 2 0 8 Sporormiella minima 0 7 3 2 Tritirachium oryzae 0 10 2 2 Xylaria sp. 11 0 4 5 Xylaria aff. Hypoxylon 5 0 4 0 Número de unidades formadoras de

colônias/cultivar 147 305 134 165

O = Não ocorrência


86

Populações de endófitos mais similares (>60%) foram encontrados nas

cultivares ‘Pacovan’ X ‘Prata-Anã’ (65,5% de similaridade), ‘Pacovan’ X ‘Nanicão’

(65,3%) e ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ (61,2%). A similaridade entre as demais cultivares

foi menor que 50% (Tabela 11). Entre as cultivares estudadas, a similaridade entre as

espécies de fungos endofíticos foi considerada alta.

Tabela 11. Número de espécies associados e comuns e índice de similaridade de fungos

endofíticos (segundo Sørensen) isolados em quatro cultivares de bananeira (‘Pacovan’,

‘Prata-Anã’, ‘Nanicão’ e ‘Maçã’), no município de Belo Jardim/PE

Cultivares

N° de espécies

Índice de Similaridade

(%)

Associados a ‘Pacovan’ 29 _

Associados a ‘Prata-Anã’ 29 _

Associados a ‘Nanicão’ 20 _

Associados a ‘Maçã’ 16 _

Comuns Pacovan X Prata-Anã 19 65,5

Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Nanicão’ 16 65,3

Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Maçã’ 10 44,4

Comuns a ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ 15 61,2

Comuns a ‘Prata-Anã’ X ‘Maçã’ 11 48,8

Comuns a ‘Nanicão’ X ‘Maçã’ 8 44,4

Comuns a ‘Pacovan’ X ‘Prata-Anã’ X ‘Nanicão’ X

‘Maçã’

6 _

4.5. Influência da sazonalidade na ocorrência dos fungos endofíticos

A ocorrência dos fungos endofíticos foi maior no período chuvoso, com

formação de 448 colônias (59,7%), em relação ao período de estiagem, com 303

colônias (40,3%) (Tabela 12).

Na estação chuvosa foram identificadas 51 espécies de fungos endofíticos,

enquanto na estação de estiagem foram isoladas 32 espécies, com diferença significativa


87

na composição dos fungos, o que pode ser explicado pelo fato de que no verão a

temperatura, umidade e radiação ultravioleta são altas, afetando a esporulação, a

germinação e a entrada do fungo nas folhas de bananeira.

Tabela 12. Número de fungos endofíticos isolados de bananeira (Musa spp.) no

município de Belo Jardim/PE, em quatro coletas, na estação chuvosa e de estiagem

Período de coleta

Períodos de coleta Chuvosa Estiagem N° de espécies isoladas/coletas

Abril/2007 143 0 21

Setembro/2007 0 200 16

Janeiro/2008 0 103 16

Março/2008 305 0 30

Total de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

448 303 -

Frequência de ocorrência (%) 59,7 40,3 -

O = Não ocorrência

Observa-se na estação chuvosa maior número de UFC e maior diversidade de

fungos endofíticos. Alguns autores obtiveram maior frequência de fungos endofíticos na

estação de estiagem, diferindo dos resultados do presente estudo (Hallmann et al., 1998;

Gao et al., 2005).

Altas temperaturas reduzem o número de conídios viáveis e sua atividade varia

devido a mudanças na temperatura e disponibilidade de água (Virzo de Santo et al.,

1976). Condições ambientais afetam o crescimento dos fungos endofíticos (Griffin,

1994), que conforme Pelczar et al. (1996) crescem em ampla faixa de temperatura.

Segundo Fryar et al. (2004) diferenças sazonais podem alterar a diversidade fúngica.

Observa-se que a riqueza e a composição de fungos endofíticos estão relacionadas às

estações do ano.

Zaemey et al. (1994) e Pessoa et al. (2007) estudaram o efeito da temperatura e

de outras condições ambientais sobre o desenvolvimento de Colletotrichum musae, na

banana, havendo influência no crescimento fúngico. De acordo com Chillet et al.

(2006), aumento na temperatura e período chuvoso estão diretamente associados ao

crescimento de C. musae.


88

4.6. Índice da velocidade de crescimento dos fungos endofíticos e fitopatógenos,

individualmente

A velocidade de crescimento dos fungos endofíticos variou de 0,07cm/dia a

0,53cm/dia. Em relação à velocidade e crescimento micelial os fungos endofíticos

foram separados em quatro grupos (Oliveira, 1991): A) dez espécies apresentaram

crescimento micelial de 7,0cm a 7,5cm, sendo consideradas fungos de crescimento

muito rápido, B) três foram classificadas como de crescimento rápido; C) cinco

apresentaram crescimento micelial lento; D) duas tiveram crescimento muito lento (1,0

e 1,5cm, respectivamente) (Tabela 13).


89

Tabela 13. Índice da velocidade de crescimento micelial (IVCM) dos fungos

endofíticos isolados de folhas de bananeira, aos 14 dias de incubação, em meio BDA

Fungos endofíticos

Crescimento

micelial (cm)¹

IVCM

(cm/dia)² Grupos

Colletotrichum gloeosporioides 7,5 0,53 Muito rápido

Curvularia eragrostidis 7,5 0,53 Muito rápido

C. prasadii 7,5 0,53 Muito rápido

Guignardia mangifera 7,5 0,53 Muito rápido

Nigrospora oryzae 7,5 0,53 Muito rápido

Nodulisporium gregarium 7,5 0,53 Muito rápido

Pestalotiopsis maculans 7,5 0,53 Muito rápido

Curvularia lunata var. aeria 7,0 0,50 Muito rápido

Drechslera hawaiiensis 7,0 0,50 Muito rápido

Fusarium solani 7,0 0,50 Muito rápido

Alternaria alternata 6,0 0,42 Rápido

Xylaria sp. 5,5 0,39 Rápido

Xylaria af.hypoxylon 5,0 0,35 Rápido

Sporormiella minima 3,5 0,25 Lento

Paecilomyces lilacinus 3,0 0,20 Lento

Acremonium bacillisporum 2,0 0,14 Lento

Acremonium strictum 2,0 0,14 Lento

Acremonium polychoroma 2,0 0,14 Lento

Scolecobasidium humicola 1,5 0,10 Muito lento

Tritirachium oryzae 1,0 0,07 Muito lento

1. Média de três repetições.

2. Índice da velocidade de crescimento micelial, calculado com dados nas leituras de sétimo e 14° dias de

incubação, empregando-se a fórmula adaptada por Oliveira (1991).

O crescimento micelial de Alternaria alternata foi classificado como rápido,

confirmando os resultados de Larone (1995), porém, diferindo dos dados de Silva &

Melo (1999) que observaram crescimento lento e baixa esporulação para os isolados

estudados por eles.

A diferença no crescimento micelial varia, sendo característica genética inerente

a cada espécie (Lilly & Barnett, 1951). Dias (2002) relata que diferentes isolados

apresentam diferenças significativas na velocidade de crescimento micelial, em meio de

cultura. Segundo Carabi-Adell et al. (2003) geralmente o crescimento dos fungos


90

endofíticos é rápido. Em condições naturais, esses fungos muitas vezes são bons

colonizadores e crescem rapidamente in vitro. Os que crescem lentamente in vitro

muitas vezes não são bons colonizadores (Mejía et al., 2008).

O Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos variou de

0,07cm/dia a 0,50cm/dia. Os fitopatógenos foram separados em três grupos (Tabela 14):

A) Fusarium oxysporum, Deightoniella torulosa e Colletotrichum musae apresentaram

os maiores valores de crescimento micelial, sendo considerados de crescimento muito

rápido; B) Mycosphaerella musicola e Cladosporium musae apresentaram crescimento

rápido; C) Pseudocercospora musae teve crescimento muito lento (1,0cm/dia). P.

musae apresenta crescimento lento e baixa esporulação em substratos artificiais (Nagel,

1934; Dantas, 1948).

Tabela 14. Índice da velocidade de crescimento micelial dos fitopatógenos isolados de

folhas de bananeira com sintomas, em cultivo individual, aos 14 dias de incubação, em

meio BDA

Fitopatógenos

Crescimento

micelial (cm)¹

IVCM (cm/dia)² Grupos de

IVCM

Colletotrichum musae 7,0 0,50 Muito rápido

Deightoniella torulosa 7,0 0,50 Muito rápido

Fusarium oxysporum 7,0 0,50 Muito rápido

Mycosphaerella musicola 5,5 0,39 Rápido

Cladosporium musae 4,0 0,28 Rápido

Pseudocercospora musae 1,0 0,07 Muito lento

(¹) Média de duas repetições. (²) Índice da velocidade de crescimento, foi calculado com dados nas leituras de sétimo e 14° dias de incubação, empregando-se a fórmula adaptada por Oliveira (1991).

No presente trabalho alguns fungos endofíticos apresentaram velocidade de

crescimento micelial igual ou superior à dos fitopatógenos, destacando-se: Alternaria

alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostides, C. lunata var.

aeria, C. prasadii, Drechslera hawaiiensis, Fusarium solani, Guignardia mangifera,

Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium e Pestalotiopsis maculans (Tabela 14),

não diferindo entre si, porém, mostraram diferença significativa quanto aos demais

fungos endofíticos.


91

Segundo Medeiros (1988), a capacidade dos fungos endofíticos de crescerem

mais rapidamente em relação aos fitopatógenos é característica comum, sendo

importante, por conferir maior possibilidade de competição por espaço e nutrientes,

onde os fungos de crescimento rápido têm mais chance de predominar no ambiente. A

taxa de crescimento micelial pode indicar uma maior capacidade para colonizar

substratos e competir pela habilidade saprofítica com outros fungos (Melo, 1998).

4.7. Avaliação da atividade antagônica dos fungos endofíticos contra fitopatógenos,

in vitro, em cultura pareada

Dos 20 fungos endofíticos testados, apenas nove (Alternaria alternata,

Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C.

prasadii, Fusarium solani, Guignardia mangifera, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis

maculans) conseguiram inibir em 100% o crescimento de Pseudocercospora musae,

recebendo nota 1 (antagonistas com alta capacidade para controle biológico). Os que

obtiveram notas 2 e 3 são considerados prováveis antagonistas, sendo indicados para o

controle biológico; porém os fungos endofíticos que obtiveram notas 4 e 5, não são

indicados como antagonistas de fitopatógenos da bananeira (Tabelas 2 e 15). Esses

resultados obtidos in vitro devem ser interpretados como de valor relativo para o

controle a nível de campo (Bettiol et al., 2009).


92

Tabela 15. Classificação dos fungos endofíticos em relação à inibição de fitopatógenos,

segundo teste de antagonismo, em cultivo pareado, por 14 dias, em meio BDA

FF

FE

A

B

C

D

E

F

Acremonium bacillisporum 5 5 4 4 4 4

Acremonium strictum 5 5 4 4 4 4

Acremonium polychoroma 5 5 4 4 4 4

Alternaria alternata 4 3 1 2 3 1

Colletotrichum gloeosporioides

3 3 1 2 3 2

Curvularia eragrostidis 3 3 1 2 2 2

Curvularia lunata var. aeria

3 3 1 2 3 2

Curvularia prasadii 4 3 1 2 2 2

Drechslera hawaiiensis 4 4 2 4 3 3

Fusarium solani 3 3 1 3 3 2

Guignardia mangifera 4 4 1 2 3 2

Nigrospora oryzae 2 3 1 1 1 1

Nodulisporium gregarium 5 3 2 2 1 3

Paecilomyces lilacinus 4 3 2 3 3 3

Pestalotiopsis maculans 3 2 1 2 2 1

Scolecobasidium humicola 5 5 4 4 5 4

Sporormiella minima 4 5 2 4 5 4

Tritirachium oryzae 4 4 4 4 5 4

Xylaria sp. 5 4 4 3 4 4

Xylaria aff. hypoxylon 4 3 4 4 3 3

Os números 1 (100%), 2 (75%), 3 (50%), 4 (25%) e 5 (0%) referem-se às notas para classificação, conforme Bell et al. (1982).

FE= fungos endofíticos e FF= Fitopatógenos

A= Fusarium oxysporum, B= Colletotrichum musae, C= Pseudocercospora musae, D= Cladosporium

musae, E= Deightoniella totulosa e F= Mycosphaerella musicola


Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Apenas Nigrospora oryzae obteve nota 2, por inibir o crescimento de Fusarium

oxysporum com sobreposição de hifas (Figura 6). Brown et al. (1998), informam que

Nigrospora apresenta potencial para controle biológico, por produzir o composto


93

bioativo, citocalasina. Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C.

lunata var. aeria, Fusarium solani, Pestalotiopsis maculans e Xylaria aff. hypoxylon

receberam nota 3, por inibir o crescimento do fitopatógeno, colonizando cada um 50%

da superfície da placa, ocorrendo paralização do seu crescimento, sem sobreposição de

hifas. Gallo et al. (2007) isolaram de folhas sadias de Smallanthus sonchifolius,

Curvularia lunata var. aeria, testada in vitro sobre células humanas, que apresentou

citotoxicidade inibindo a proliferação dessas culturas e sendo considerada fonte

promissora de metabólitos secundários anticancerígenos. Aos demais isolados foram

atribuídas notas 4 e 5, com ausência de inibição de crescimento do fitopatógeno.

Provavelmente a falta de inibição por parte de Acremonium bacillisporum, A. strictum,

A. polychoroma, Scolecobasidium humicola, Sporormiella mínima e Tritirachium

oryzae, tenha ocorrido pelo fato destes fungos apresentarem crescimento lento.

Alternaria alternata, Curvularia prasadii, Drechslera hawaiiensis, Guignardia

mangifera, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. Hypoxylon,

apesar de terem crescimento rápido, não inibiram Fusarium oxysporum, provavelmente

devido à produção de metabólitos por parte do Fusarium, que segundo Acuña et al.

(2005), produz diversos metabólitos como: tricotecenos, zearalenona, fumonisinas B1 e

B2. A. pollychoroma e Tritirachium oryzae produziram pigmentação no meio de

cultura, quando pareados com F. oxysporum f. sp. cubense.

Segundo Choudhury & Oliveira (1983) antagônicos não produtores de

pigmentação são mais eficientes no controle biológico, quando comparados com

produtores de pigmentos, o que foi confirmado por (Pessoa, 1986). Segundo Lilly &

Barnett (1951) e Cochrane (1958), nos fungos, alguns pigmentos são acumulados no

micélio e esporos, enquanto outros se difundem no meio de cultura. Os fatores

nutricionais que fazem com que os fungos produzam pigmentos no meio de cultura são

os microelementos essenciais, as fontes de carbono e nitrogênio, o pH inicial do meio e

a temperatura. Alguns pigmentos são conhecidos por serem antibióticos; outros, como o

caroteno, são provitaminas, mas em geral, as funções desses pigmentos permanecem

desconhecidas (Griffin, 1994).


94

Figura 6. Pareamento de fungos endofíticos contra Fusarium oxysporum f. sp. cubense

(na parte inferior da placa de Petri), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1.

Acremonium bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria,

5. Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.

prasadii, 9. Drechslera hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12.

Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium, 14. Paecilomyces lilacinus, 15.

Pestalotiopsis maculans, 16. Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18.

Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon.

A comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos

pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Figura 7) mostra variações no

diâmetro das colônias dos fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se

Tritirachium oryzae (0,5cm), que apresentou menor crescimento micelial em relação à

Nigrospora oryzae (4,5cm), Pestalotiopsis maculans (3,7cm) e Curvularia eragrostidis

(3,5cm) que se destacaram com os maiores crescimentos miceliais.


95

Figura 7. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Fusarium oxysporum f. sp. cubense, cultivados em BDA, aos 14 dias

0

2

4

6

8

10

12

Acremo

nium

bacillisporum

Acremo

nium

strictum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alternata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria eragrostidis

Curvular

ia lunata var. aeria

Curvula

ria pr

asadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guign

ardia m

usae

Nigrospora or

yzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiop

sis macula

ns

Scole

cobasid

ium hu

micola

Sporormiella m

inima

Tritirachium

oryzae

Xylar

ia sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n

Fusariu

m oxysporum f. sp. c...

Crescimento micelial radial (cm)

Fitopatógeno

Endófito


Colletotrichum musae

Na comparação entre Colletotrichum musae e os 20 fungos endofíticos (Figura

8), apenas Pestalotiopsis maculans obteve nota 2, inibindo o crescimento micelial de C.

musae, sem sobreposição das hifas, devido provavelmente à produção de metabólitos.

Santos et al. (2008) isolaram ergosterol e peróxido de ergosterol de

Pestalotiopsis guepinii e quando os metabólitos foram testados isoladamente,

apresentaram potencial inibitório abaixo de 35%. Quando testados juntas houve

aumento na atividade inibitória. Os autores atribuem esses efeitos à existência de

sinergismo entre as substâncias testadas. Segundo Vokou et al. (2003), substâncias

químicas, quando em combinação aos pares, tendem a evidenciar maior potencial

inibitório do que quando testadas isoladamente. Alternaria alternata, Colletotrichum

gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium

solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria

aff. hypoxylon receberam nota 3, por inibirem o crescimento do fitopatógeno, ocorrendo

paralização do seu crescimento, sem sobreposição de hifas.

Nuangmek et al. (2008) utilizaram Nodulisporium sp. como antagonista contra

Colletotrichum musae, in vitro, o qual apresentou resultados positivos. Segundo os

autores ocorreu inibição competitiva devido provavelmente ao rápido crescimento e

produção de antibiótico por Nodulisporium sp., destacando sua possibilidade como


96

agente de controle biológico para antracnose da banana. Segundo Polishook et al.

(2001), Nodulisporium sp. produz o ácido nodulispórico, com propriedade inseticida.

Aos demais isolados foram atribuídas notas 4 e 5, com ausência de inibição por

parte de Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Drechslera

hawaiiensis, Guignardia mangifera, Scolecobasidium humicola, Sporormiella mínima,

Tritirachium oryzae e Xylaria sp. Apesar de Drechslera hawaiiensis e Guignardia

mangifera terem crescimento muito rápido, não inibiram Colletotrichum musae, que

também apresenta crescimento muito rápido, devido provavelmente à produção de

metabólitos produzidos pelo fitopatógeno.

Figura 8. Pareamento de fungos endofíticos contra Colletotrichum musae (na parte

inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em meio BDA: 1. Acremonium

bacillisporum, 2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5.

Colletotrichium gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C.


Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium 14. Paecilomyces lilacinus, 15.




97

Na comparação da velocidade de crescimento micelial dos 20 fungos endofíticos

pareados com Colletotrichum musae, aos 14 dias, observa-se variação no diâmetro das

colônias, destacando-se Acremonium strictum (0,7cm), com menor crescimento micelial

em relação à Pestalotiopsis maculans (4,5cm), que se destacou com maior crescimento

micelial (Figura 9). O maior crescimento micelial do possível antagonista não indica

atividade inibitória efetiva. No caso de Pestalotiopsis maculans a reação entre os

micélios (AXP) foi de impasse. Já Acremonium strictum pouco cresceu mas inibiu à

distância o crescimento do fitopatógeno. Acremonium é um agente de controle biológico

comprovado em várias culturas.

Figura 9. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Colletotrichum musae , cultivados em BDA, aos 14 dias

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Acremo

nium

bacillisporum

Acremo

nium

strictum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alternata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria eragrostidis

Curvular


Curvularia prasadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guign

ardia m

usae

Nigrospora or

yzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiop

sis maculans

Scolecobasidium

hum

icola

Sporormiella minim

a

Tritirachium

oryzae

Xylar

ia sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n

Colletotrichum

musae


Fitopatógeno

Endófito


Pseudocercospora musae

Nos resultados obtidos no cultivo pareado com Pseudocercospora musae, os

fungos endofíticos (Figura 10), Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides,

Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium solani, Guignardia

mangifera, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 1, inibindo o

crescimento micelial de P. musae, com sobreposição das hifas. Guignardia mangifera

apresentou potencial para controle de Pseudocercospora musae, porém eventualmente

G. mangifera pode tornar-se fitopatógeno. Ensaios futuros para testar o controle

biológico em campo mostram-se necessários. Drechslera hawaiiensis, Nodulisporium

gregarium, Paecilomyces lilacinus e Sporormiella minima, obtiveram a nota 2.

Acremonium bacillisporium, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,


98

Tritirachium oryzae, Xylaria sp. e Xylaria aff. hypoxylon obtiveram a nota 4 (Tabela 2 e

16).

Segundo Baker & Cook (1974), entre os efeitos dos fungos estão redução ou

paralização do crescimento micelial e germinação de conídios, distorções nas hifas e

endólise. A maioria dos fungos produz e secreta um ou mais compostos com atividade

antibiótica (Pal & Gardener, 2006).

Figura 10. Pareamento de fungos endofíticos contra Pseudocercospora musae (na parte





Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium 14. Paecilomyces lilacinus, 15.



Hatory et al. (2004) isolaram de Sporormiella minima o composto FR171456,

que inibiu a síntese do colesterol em humanos, in vitro. Sporormiella produz

metabólitos secundários, como fitotóxicos, antifúngicos, antibactericidas e inibidores da


99

biossíntese de colesterol. Sporormiella mínima mostrou ação inibitória contra

Colletotrichum musae (Figura 8-17) e contra Pseudocercospora musae (Figura 10-19).


pareados com Pseudocercospora musae (Figura 11) mostra variação no diâmetro das

colônias dos fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se Tritirachium oryzae

(1,0cm) que apresentou o menor crescimento micelial em relação à Colletotrichum

gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Fusarium

solani, Guignardia mangifera, Nigrospora oryzae, todos com (7,0cm), que se

destacaram pelo maior crescimento micelial.

Figura 11. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Pseudocercospora musae , cultivados em BDA, aos 14 dias

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Acremo

nium

bacillisp

orum

Acremo

nium

strictum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alternata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria eragrostidis

Curvular


Curvula

ria prasadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guign

ardia m

usae

Nigrospora oryzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiopsis ma

culans

Scole

cobasid

ium hu

micola

Sporormiella minim

a

Tritirachium

oryzae

Xylar

ia sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n



Fitopatógeno

Endófito


Cladosporium musae

No cultivo pareado de Cladosporium musae com fungos endofíticos (Figura 12),

apenas Nigrospora oryzae obteve nota 1, inibindo o crescimento micelial de

Cladosporium musae, com sobreposição das hifas. Alternaria alternata, Colletotrichum

gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C. prasadii, Guignardia

mangifera, Nodulisporium gregarium e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 2.

Fusarium solani, Paecilomyces lilacinus e Xylaria sp. obtiveram nota 3. Os demais

fungos foram classificados com a nota 4 (Tabelas 2 e 16).


100

Figura 12. Pareamento de fungos endofíticos contra Cladosporium musae (na parte





Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium sp., 14. Paecilomyces lilacinus, 15.


Tritirachium oryzae, 19. Xylaria sp. e 20. Xylaria aff. hypoxylon

Oh et al. (1999) isolaram Colletotrichum gloeosporioides endofiticamente de

Cryptocarya mandioccana, na Floresta Atlântica brasileira, e este isolado produziu

deoxiscitalona e tetralona. Estas substâncias apresentaram atividade antifúngica contra

Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum, comparável com atividade da

nistatina (Inácio et al., 2006). Os autores sugerem que a atividade apresentada pelos

metabólitos secundários produzidos por C. gloeosporioides está relacionada à função de

proteção do hospedeiro contra fitopatógenos, demonstrando o significado ecológico do

estudo deste fungo.

De acordo com Dennis & Webster (1971a), isolados de uma mesma espécie,

embora morfologicamente semelhantes, podem diferir fisiologicamente e atuar de

maneiras diferentes quanto ao antagonismo, dependendo das características fisiológicas

do fitopatógeno e da possível variabilidade genética inerente a cada isolado e existem


101

fatores externos como equilíbrio nutricional e influência da temperatura que afetam o

desenvolvimento dos fungos.

No pareamento, houve produção de substância avermelhada por Tritirachium

oryzae e Acremonium polychoroma no meio de cultura, resultando na formação de um

halo (Figura 12: n° 3 e 18) que não impediu o crescimento de Cladosporium musae;

porém, foram observadas alterações na coloração das colônias.


pareados com Cladosporium musae, mostra variação no diâmetro das colônias dos

fungos endofíticos e fitopatógenos, destacando-se Tritirachium oryzae (0,5cm) que

apresentou o menor crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (6,2cm), que

se destacou com maior crescimento micelial (Figura 13).

Figura 13. Comparação do crescimento micelial dos 20 fungos endófitos pareados com Cladosporium musae cultivados em BDA, aos 14 dias

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Acremo

nium

bacillisporum

Acremo

nium

stric

tum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alter

nata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria eragrostidis

Curvular


Curvula

ria pr

asadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guign

ardia m

usae

Nigrospora or

yzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiop

sis macula

ns

Scole

cobasid

ium hu

micola

Sporormiella m

inima

Tritirachium

oryzae

Xylar

ia sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n

Cladosporiu

m mu

sae


Fitopatógeno

Endófito


Deightoniella torulosa

No cultivo pareado de Deightoniella torulosa com fungos endofíticos (Figura

14), apenas Nigrospora oryzae e Nodulisporium gregarium, obtiveram nota 1.

Curvularia eragrostides, C. prasadii, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium e

Pestalotiopsis maculans obtiveram nota 2, inibindo o crescimento micelial de D.

torulosa com sobreposição das hifas. Alternaria alternata, Colletotrichum

gloeosporioides, C. lunata var. aeria, Drechslera hawaiiensis, Fusarium solani,

Guignardia mangifera, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. hypoxylon obtiveram nota


102

3. Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,

Sporormiella mínima, Tritirachium oryzae e Xylaria sp. obtiveram notas 4 e 5 (Tabela 2

e 16).

Figura 14. Pareamento de fungos endofíticos contra Deightoniella torulosa (na parte





Nigrospora oryzae, 13. Nodulisporium gregarium, 14. Paecilomyces lilacinus, 15.




pareados com Deightoniella torulosa mostrou variação no diâmetro das colônias dos

fungos endofíticos e fitopatógenos, onde, Tritirachium oryzae (0,5cm) apresentou

menor crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (6,0cm), que se destacou

com maior crescimento micelial (Figura 15).


103

Figura 15. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endófitos pareados com Deightoniella torulosa , cultivados em BDA, aos 14 dias

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Acremo

nium

bacillisp

orum

Acremo

nium

strictum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alternata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria eragrostidis

Curvularia

lunata var. aeria

Curvula

ria prasadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guignardia musae

Nigrospora oryzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiopsis ma

culans

Scole

cobasid

ium humicola

Sporormiella minim

a

Tritirachium

oryzae

Xylaria

sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n

Deigh

toniella torulosa


Fitopatógeno

Endófito


Mycosphaerella musicola

No cultivo pareado de Mycosphaerella musicola com fungos endofíticos (Figura

16), Alternaria alternata, Nigrospora oryzae e Pestalotiopsis maculans obtiveram nota

1, inibindo o crescimento micelial de M. musicola, com sobreposição das hifas.

Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. lunata var. aeria, C.

prasadii, Fusarium solani e Guignardia mangifera obtiveram nota 2. Drechslera

hawaiiensis, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus e Xylaria aff. hypoxylon

obtiveram nota 3. Notas 4 e 5 foram obtidas pelos seguinte fungos endofíticos:

Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Scolecobasidium humicola,

Sporormiella minima, Tritirachium oryzae e Xylaria sp. (Tabelas 2 e 16).


104

Figura 16. Pareamento de fungos endofíticos contra Mycosphaerella musicola (na parte

inferior da placa), após 14 dias de crescimento, em BDA: 1. Acremonium bacillisporum,

2. A. strictum, 3. A. pollychoroma, 4. Alternaria alternaria, 5. Colletotrichium

gloeosporioides, 6. Curvularia eragrostidis, 7. C. lunata, 8. C. prasadii, 9. Drechslera

hawaiiensis, 10. Fusarium solani, 11. Guignardia mangifera, 12. Nigrospora oryzae,

13. Nodulisporium sp., 14. Paecilomyces lilacinus, 15. Pestalotiopsis maculans, 16.

Scolecobasidium humicola, 17. Sporormiella mínima, 18. Tritirachium oryzae, 19.

Xylaria sp. (19) e 20. Xylaria aff. (17)


pareados com Mycosphaerella musicola mostrou variação no diâmetro das colônias dos

fungos endofíticos e fitopatógenos. Tritirachium oryzae (0,7cm) apresentou o menor

crescimento micelial em relação à Nigrospora oryzae (5,7cm), que se destacou com

maior crescimento micelial (Figura 17).


105

Figura 17. Comparação do crescimento micelial de 20 fungos endofíticos pareados com Mycosphaerella musicola , cultivados em BDA, aos 14 dias

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Acremo

nium

bacillisporum

Acremo

nium

stric

tum

Acremo

nium

polyc

horoma

Alternaria

alternata

Colletotrichum

gloeosporio

ides

Curvula

ria er

agrostidis

Curvular


Curvula

ria pr

asadii

Drescherella h

awaiiensis

Fusariu

m solan

i

Guign

ardia m

usae

Nigrospora or

yzae

Nodulisporiu

m gregarium

Paecilomy

ces lilacin

us

Pesta

lotiop

sis maculans

Scolecobasidium

humicola

Sporormiella m

inima

Tritirachium

oryzae

Xylar

ia sp.

Xylar

ia af. hypoxylo

n

Mycosphaerella musico

la


Fitopatógeno

Endófito

Weller (1988) cita como fatores responsáveis pelo desempenho de um

biocontrolador, a perda da competitividade ecológica devido à alteração de alguma

característica do fungo, variação na colonização pelo antagonista e interferência de

fatores bióticos e abióticos. Geralmente biocontroladores não alcançam percentuais

elevados (Silva et al., 2008) e o biocontrole raramente dá bons resultados (Bettiol,

1991).

4.8. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra


Acremonium bacillisporum e A. strictum foram os únicos que inibiram o

crescimento micelial de Pseudocercospora musae (Figuras 18, 19 e 20), no teste de

inibição por volatilidade, provavelmente pela produção de substâncias no meio, visto

que não houve contato micelial entre os fungos. Representantes do gênero Acremonium

produzem substâncias voláteis (White Jr. & Cole, 1985), que inibem o crescimento

fúngico (Hawker, 1950).


106

Figura 18. Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte

inferior das placas). a) Acremonium bacillisporum; b) Acremonium strictum, mostrando

inibição de crescimento micelial do fitopatógeno

Acremonium polychoroma, Alternaria alternata, Xylaria sp. e Curvularia lunata

var. aeria não foram capazes de inibi o crescimento micelial do fitopatógeno, porém,

Pseudocercospora musae produziu exsudato, nos quatro pareamentos (Figura 19),

indicativo de alteração na fisiologia do fitopatógeno.

Figura 19. Teste de volatilidade entre Pseudocercospora musae (colônias na parte

inferior das placas). a) Acremonium pollychoroma; b) Alternaria alternata; c) Xylaria

sp.; d) Curvularia lunata var. aeria, mostrando produção de exsudato e um halo escuro

por parte do fitopatógeno.


107

Fusarium solani e Nigrospora oryzae alteraram o crescimento micelial do

fitopatógeno no teste de volatilidade, mas ultrapassando a divisória da placa, com

contato direto entre os fungos. Assim não é possível sugerir que os fungos endofíticos

produziram substâncias bioativas. Ocorreu, porém, produção de exsudato nas colônias

do fitopatógeno (Figura 20). A produção de exsudato por parte do fitopatógeno torna o

resultado obtido neste trabalho interessante e merecedor de investigações mais

aprofundadas.

Figura 20. Teste de inibição entre Pseudocercospora musae (colônias na parte inferior

das placas). a) Fusarium solani; b) Nigrospora oryzae, mostrando produção de exsudato

e inibição do crescimento micelial do fitopatógeno

Colletotrichium gloeosporioides, Curvularia eragrostidis, C. prasadii,

Drechslera hawaiiensis, Guignardia mangifera, Nodulisporium gregarium,

Paecilomyces lilacinus, Pestalotiopsis maculans, Scolecobasidium humicola,

Sporormiella mínima, Tritirachium oryzae e Xylaria aff. hypoxylon, não apresentaram

inibição sobre o crescimento micelial de Pseudocercospora musae, portanto não

apresentando poencial para controle biológico da Sigatoka amarela, pelo teste de

produção de metabólitos voláteis, embora, também se mostrados promissores pelo teste

de pareamento.

4.9. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Colletotrichum

musae

Colletotrichum gloeosporioides, Nodulisporium gregarium, Nigrospora oryzae,

Alternaria alternata e Tritirachium oryzae inibiram parcialmente o crescimento micelial


108

de Colletotrichum musae (Figura 21). Os demais fungos endofíticos não apresentaram

qualquer alteração no crescimento micelial do fitopatógeno. Estudando C. musae

proveniente de frutos de bananeira, Couto (2002), observou a produção de lipase,

amilase, celulase e protease nos isolados testados, variando de acordo com o substrato

utilizado e com o período de incubação.

Figura 21. Teste de volatilidade entre Colletotrichum musae (colônias na parte superior

das placas) e: a) Colletotrichum gloeosporioides; b) Nodulisporium gregarium; c)

Nigrospora oryzae; d) Alternaria alternata; e) Tritirachium oryzae, mostrando inibição

parcial do crescimento micelial do fitopatógeno

4.10. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra

Mycosphaerella musicola

O antagonismo contra Mycosphaerella musicola (Figura 22) revelou inibição do

crescimento micelial frente à Curvularia prasadii, Paecilomyces lilacinus, Fusarium

solani e Xylaria sp., sendo observado alterações tanto na coloração como na forma das

colônias do fitopatógeno. Mangenot & Diem (1979) citam CO2 e amônia como

substâncias voláteis produzidas por antagonistas e seus efeitos em fungos pode ser

estimulante ou inibitório.


109

Figura 22. Teste por volatilidade entre Mycosphaerella musicola (colônias na parte

superior das placas) e: a) Curvularia lunata var. aeria; b) Paecilomyces lilacinus; c)

Fusarium solani; d) Xylaria sp., mostrando alterações das colônias do fitopatógeno

4.11. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Cladosporium

musae

Alternaria alternata, Drechslera hawaiiensis e Curvularia eragrostidis inibiram

o crescimento micelial de Cladosporium musae (Figura 23), provavelmente pela

produção de substâncias voláteis, já que não houve contato micelial entre fungos. Os

demais fungos endofíticos não foram capazes de inibir o crescimento do fitopatógeno.


110

Figura 23. Teste de volatilidade entre Cladosporium musae (colônias na parte superior

das placas) e: a) Alternaria alternata; b) Drechslera hawaiiensis; c) Curvularia

eragrostidis, mostrando inibição parcial das colônias do fitopatógeno

4.12. Produção de metabólitos voláteis por fungos endofíticos contra Fusarium

oxysporum f. sp. cubense

Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans, Paecilomyces lilacinus e

Nodulisporium gregarium produziram pouca inibição no crescimento micelial de

Fusarium oxysporum f. sp. cubense, provavelmente pela produção de substâncias

voláteis, já que não houve contato entre os fungos. Foram observadas alterações na

coloração das colônias tanto do fitopatógeno quanto dos fungos endofíticos (Figura 24).

Fusarium tem a capacidade de produzir uma variedade de micotoxinas, sendo as

mais importantes: tricotecenos, fumonisinas, fusariotoxina, moniliformina e o ácido

fusárico (Santin et al., 2001). O ácido fusárico possui a capacidade de aumentar a

toxicidade de outras micotoxinas (Bacon et al., 1995).

Pestalotiopsis é frequentemente citado na literatura como produtor de compostos

bioativos (Rodrigues et al., 2000; Li & Strobel, 2001; Strobel et al., 2002).


111

Figura 24. Teste de inibição por volatilidade entre Fusarium oxysporum f. sp. cubense

(colônias na parte superior das placas) e: a) Nigrospora oryzae; b) Pestalotiopsis

maculans; c) Paecilomyces lilacinus; d) Nodulisporium gregarium

De um modo geral, o potencial antagônico dos fungos endofíticos foi variado

apresentando pouca eficiência para controle biológico. Porém, é interessante ressaltar a

importância desses resultados, devido ao fato dos fungos endofíticos ocuparem o

mesmo nicho dos fitopatógenos dentro da planta, podendo ser considerados homólogos

ecológicos.

O entendimento sobre a ecologia do fitopatógeno e do antagonista é necessária

para o pleno sucesso do controle biológico. Muitos fungos, quando preservados, podem

perder ou reduzir sua capacidade patogênica, diminuindo a eficiência e a credibilidade

do controle (Grigoletti Jr. et al, 2000).

O antagonista é importante para que o biocontrole seja efetivo contra

fitopatógenos, pois as chances de sucesso nos programas de controle biológico estão no

isolamento e na seleção de microrganismos antagônicos eficientes, porém, segundo

Ghini & Nakamura (2001) nem sempre apresentam correlação com os resultados

obtidos em condições de campo.


112

Explicações podem ser levantadas para justificar a ineficácia de alguns dos

fungos endofíticos testados. Segundo Melo & Faull (2000), as associações

micoparasíticas são afetadas por fatores ambientais como temperatura, pH, umidade,

tipo de solo, radiação solar e nutrição. Os fungos endofíticos isolados e selecionados

para controlar certos fitopatógenos, possivelmente expressariam ou não seus potenciais

biotecnológicos.

Pode-se também considerar que interações fitopatógeno/antagonista/ambiente

podem ser desfavoráveis ao aparecimento do antagonismo in vitro, sendo necessários

estudos in vivo e in sito.


113

5. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:

� Os 24 gêneros e 40 espécies de fungos endofíticos isolados de folhas sadias de

bananeira comportam-se tanto como sapróbios quanto fitopatógenos.

� Acremonium polychoroma, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides,

Colletotrichum gloeosporioides, C. musae, Deightoniella torulosa, Fusarium

solani, Nigrospora oryzae, Nodulisporium gregarium, Paecilomyces lilacinus,

Pestalotiopsis maculans e Guignardia mangifera apresentam frequência

abundante.

� Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Nodulisporium

gregarium, Paecilomyces lilacinus, Guignardia mangifera, Pestalotiopsis

maculans, Drechslera hawaiiensis, Glomerella musarum, Tritirachium oryzae,

Scolecobasidium humicola, Curvularia eragrostidis, C. oryzae, C. prasadii, C.

pallescens, C. lunata var. aeria, Xylaria aff. hypoxylon, Cladosporium

tenuissimum, Periconia digitata, Papulospora halima, Phoma capitulum, P.

sorghina, P. tracheiphila e Schizophyllum commune e Colletotrichum dematium

são citados pela primeira vez como endófitos em bananeira.

� As folhas velhas de bananeira apresentam-se mais colonizadas por fungos

endofíticos, em relação às novas e intermediárias.

� Das quatro cultivares testadas, a ‘Pacovan’ é mais propícia à colonização por

fungos endofíticos.

� No período chuvoso ocorre maior frequência de fungos endofíticos em folhas de

bananeira.

� Nigrospora oryzae, Pestalotiopsis maculans e Nodulisporium gregarium são mais

eficientes nos testes de antagonismo in vitro contra os fitopatógenos testados.


114

� Acremonium bacillisporum, A. strictum, A. polychoroma, Alternaria alternata,

Xylaria sp., Curvularia lunata var. aeria, C. eragrostidis, Paecilomyces lilacinus,

Fusarium solani e Drechslera hawaiiensis inibem o crescimento micelial de

fitopatógenos, com provável produção de metabólitos voláteis.


115

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abreu, L.M. 2005. Diversidade de fungos endófitos associados à planta parasita Phoradendron perrottetti (DC.) Eichler e sua hospedeira Tapirira guianensis Aubl. Lavras, Brasil, 86p. (Dissertação. Universidade Federal de Lavras). Acuña, A., Lozano, M.C., García, M.C., Diaz, G.J. 2005. Prevalence of Fusariu species of the Liseola section on selected Colombian animal feedstuffs and their ability to produce fumonisins. Mycopathologia 160 (1): 63-66. Agrios, G.N. Plant Pathology. 2005. 5 ed. San Diego: Academic Press.

AGROSOFT BRASIL. 2009. Disponível em: www.agrosoft.org.br/?q=node/28698. Acesso em: 15 novembro 2009.

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116

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153

ANEXOS


154

SCHIZOPHYLLUM COMMUNE FRIES ISOLADO COMO

ENDÓFITO DE FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.) EM

PERNAMBUCO, BRASIL ²

² Trabalho aceito para publicação, como: Assunção, M.M.C.; Cavalcanti, M.A.Q.; Menezes, M. 2009. Schizophyllum commune Fries isolado como endófito de folhas de bananeira (Musa spp.) em Pernambuco, Brasil. Revista Agrotrópica.


155

SCHIZOPHYLLUM COMMUNE FRIES ISOLADO COMO

ENDÓFITO DE FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.)

EM PERNAMBUCO, BRASIL

RESUMO

Objetivando isolar endófitos de folhas de bananeiras (Musa spp.) aparentemente sadias,

utilizou-se a técnica de isolamento por fragmentação do tecido vegetal. Dentre os

isolados, foi identificado Schizophyllum commune Fries. Trata-se da primeira referência

deste fungo como endófito de bananeira para o Brasil e para o mundo.

Palavras-chave: Endófito, Musa, Basidiomycota, Schizophyllum commune.

ABSTRACT

Aiming at to isolate endophyte of leaves of banana trees (Musa spp.), seemingly

healthy, the isolation technique was used by fragmentation of the vegetable fabric.

Among the isolated ones, it was identified Schizophyllum commune Fries. It is treated of

the first reference of this mushroom as banana tree endophyte to Brazil and for the

world.

Key words: Endophyte, Musa spp., Basidiomycota, Schizophyllum commune.

Introdução

A bananeira (Musa spp.) é uma planta de grande importância econômica e social,

tanto no Brasil como no mundo (Brasil et al., 2000). A bananicultura brasileira

apresenta características que a diferencia das principais regiões produtoras do mundo,

em relação à diversidade climática, ao sistema de exploração, ao uso de cultivares,

formas de comercialização e exigências do mercado consumidor (Silva, 2000).


156

Fungos endofíticos colonizam intra e/ou intercelularmente tecidos sadios de plantas,

durante todo seu ciclo de vida ou parte dele, sem causar doença (Petrini, 1991). Os

endófitos estão na forma micelial, em associação biológica com a planta (Bacon, 2000).

Portanto, para que seja um endófito, as hifas devem estar dentro do tecido vegetal

(Maheshwari, 2006). Azevedo & Araújo (2007) definem endófito, como os que podem

ou não crescer em meios de cultura, habitando o interior de tecidos vegetais sem causar

prejuízos ao hospedeiro.

Fungos de vários grupos, principalmente anamorfos de Ascomycota, têm sido

identificados como endófitos. Em relação aos Basidiomycota, poucos estudos os

mencionam como endófitos (Wang et al., 2005) especialmente em regiões tropicais

(Vallinga, 2004). Entre esses, há menção de Schizophyllum commune Fries (Agaricales),

fungo cosmopolita, que ocorre em todos os continentes, exceto na Antártica (Cooke,

1961), reconhecido como eficiente degradador de matéria orgânica (Fernandes et al.,

2005).

Tabata et al.. (1981) citam schizophyllan, produzida por S. commune, como

antitumoral. O fungo também produz escleroglucana, um polissacarídio extracelular,

utilizado na indústria (Barbosa et al., 2004) e posteriormente denominado esquizofilana

(Corradi et al., 2006). S. commune é relatado causando infecções fúngicas em humanos

(Roh et al., 2005), sinusite é a mais freqüente, ocorrendo por inalação dos basidiósporos

(Lacaz et al., 1996). O consumo de S. commune ocorre na Tanzânia (Harkonen et al.,

1993), Índia (Longvah and Deosthale, 1998), Golfo do México (Ruan-Soto et al., 2004)

e Nigéria (Adejoye et al., 2007; Oso, 1977). Registros sobre o consumo parecem estar

restritos a zonas tropicais (Olivo Aranda and Herrera, 1994).

Na natureza, S. commune apresenta-se com frutificação acinzentada a

esbranquiçada, crescendo em grupos sobre troncos de árvores vivas ou mortas, postes,

ferrovias e cercas de madeira, em regiões temperadas e tropicais. Esta espécie tem sido

utilizada para investigações biológicas, especialmente sobre genética, devido à

facilidade do cultivo e rápido desenvolvimento (Herrera and Ulloa, 1998).

No Brasil e no mundo não existem trabalhos referentes ao isolamento de S.

commune como endófito de bananeira. Este trabalho relata a ocorrência de S. commune

como endófito, isolado de folhas sadias de bananeira, contribuindo e fornecendo

subsídios para o desenvolvimento de pesquisas futuras.


157

Material e Métodos

Área de estudo

Foi procedido o isolamento de endófitos, de bananeiras cultivadas na

microrregião de Taboquinha (7º26’00” S, 39º50’36” W.), município de Belo

Jardim/Pernambuco, com altitude de 650m, temperatura média de 23C e precipitação de

955,6mm anuais O clima do local segundo a classificação de Köppen é do tipo Bshs,

quente semi-árido (FIAM, 1997).

Isolamento e coletas

A coleta do material vegetal foi realizada no mês de março (período chuvoso) de

2008. Três folhas (nova, intermediária e velha) de duas bananeiras da cultivar ‘Prata’,

aparentemente sadias, coletadas aleatoriamente, colocadas separadamente em sacos de

papel e transportadas em 24h ao laboratório.

Para isolamento dos endófitos, utilizou-se a técnica de isolamento por

fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al., 2005). Cada folha lavada com água

corrente e sabão. Com auxílio de um furador de rolha metálico esterilizado, de 6mm de

diâmetro, foram feitos 36 discos por folha, perfazendo um total de 108 discos por

planta, totalizando 216 discos. Os discos foliares, retirados das regiões centrais e

periféricas da folha, foram imersos por 1min em álcool a 70%, em seguida imersos por

1 a 2min em solução aquosa de hipoclorito de sódio (1:3) e por ultimo, submetidos a

duas lavagens consecutivas em água destilada esterilizada (Pereira et al., 1993). Com

auxílio de uma pinça flambada, em câmara asséptica, fez-se a transferência dos discos

foliares para placas de Petri contendo meio BDA (batata-dextrose-ágar) suplementado

com antibiótico azitromicina 250mg (100mg/l). Cada placa recebeu seis discos

distribuídos eqüidistantes. As placas foram incubadas em temperatura ambiente (TA

28ºC ± 2ºC) e examinadas diariamente, durante vinte dias. Inóculos dos fungos

crescidos nas bordas dos discos foram transferidos, para placas de Petri contendo meio

de cultura batata-dextrose-ágar (BDA).

Resultados e Discussão

Dentre as espécies isoladas, foi identificado Schizophyllum commune

(Agaricomycetes, Agaricales, Schizophyllaceae) (Kirk et al., 2008).


158

Em estudos preliminares com endófitos de banana (Musa acuminata) em Hong

Kong e na Austrália, Brown et al. (1998) isolaram os seguintes Basidiomycota:

Armillaria tabescens (Scop.) Emel, Marasmiellus semiustus (Berk. & M.A. Curtis)

Singer, Uredo musae Cummins e Uromyces musae Henn. e um Ascomycota

Haplobasidion musae M.B. Ellis.

Jesus & Bononi (1991) citam a ocorrência de Schizophyllum commune em

diferentes espécies florestais vivas como: Alexa grandiflora Ducke, Aspidosperma

obscurinervium Azambuja, Brosimum rubescens Taubert, Brosimum sp. Trec, Carapa

guianensis (Aubl.) Steud., Cedrelinga integrifolia Ducke, Hymenae intermedia Linn,

Licaria sp. (Louro), Tabebuia amara (Vahl) Nich., Vataireopsis heteroptera Ducke.

Schizophyllum commune foi isolado como endófito do caule de Eucalipto niten,

na Austrália e Inglaterra (Fisher et al., 1993) e como endófito de folhas de Pinus

tabulaeformis, na China (Wang et al., 2005).

O isolamento de S. commune em folhas maduras de Tecton grandis L., durante a

estação chuvosa, na Tailândia, foi relatado por Chareprasert et al... (2006); a

identificação foi baseada na presença de grampo de conexão e na produção de

basidioma no meio de cultura. No presente trabalho o isolamento de S. commune

ocorreu também em folhas maduras e no período chuvoso. Os resultados estão

conforme a maioria das pesquisas, com outras plantas hospedeiras de outras localidades,

nas quais folhas maduras tendem a apresentar maior freqüência de endófitos (Bussaban

et al., 2001).

Os endófitos constituem um grupo caracterizado por poucas espécies dominantes

ou acidentais que são representadas por apenas um ou dois isolados entre centenas (Bills

& Polishook, 1992). Neste trabalho, o isolamento de S. commune pode ser considerado

acidental, visto que ocorreu apenas em um disco dos 36 semeados em meio de cultura.

Provavelmente o isolamento esteja relacionado às condições pluviométricas e à

disponibilidade de matéria orgânica em decomposição presente no bananal.

Schizophyllum commune está sendo descrito pela primeira vez para o Brasil

como endófito de bananeira, havendo apenas três ocorrências para o mundo (Austrália,

Tailândia e China) como endófito em outros hospedeiros. Portanto esta é a primeira

ocorrência para o Brasil e a quarta para a comunidade científica, contribuindo para

estudos em estimativas regionais e globais.


159

Agradecimentos

O primeiro autor agradece a Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

Pernambuco (Facepe), pela bolsa concedida.

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161

ASCOMYCOTAS ENDOFÍTICOS EM FOLHAS DE BANANEIRA (MUSA spp.), NO MUNICÍPIO DE BELO JARDIM, PERNAMBUCO, BRASIL ²

² Trabalho a ser submetido para publicação na Mycotaxon, como:Assunção, M.M.C.;Cavalcanti, M.A.Q.; Menezes, M. Ascomycotas endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.), no município de Belo Jardim, Pernambuco, Brasil.


162

Ascomycotas endofíticos em folhas de bananeira (Musa spp.), no município de Belo Jardim, Pernambuco, Brasil

Resumo - Com o objetivo de isolar endófitos de folhas de bananeiras (Musa spp.)

aparentemente sadias das cultivares (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Maçã’ e ‘Prata-Anã’),

utilizando a técnica de isolamento por fragmentação do tecido vegetal, foram isoladas e

identificadas às espécies de Ascomycota: Glomerella musarum, G. cingulata,

Guignardia musae, Mycosphaerella musicoa, Sporormiella minima e Xylaria aff.

hypoxylon.

Palavras-chave: Endófito, Musa spp., Ascomycota.

Introdução

A banana é cultivada em todos estados brasileiros, desde a faixa litorânea até os

planaltos do interior (Brasil et al. 2000). Sua forma de cultivo varia, desde plantios sem

uso de tecnologia, na maioria dos estados (Souza & Torres Filho, 1999) até com

tecnologias modernas (CEPEA, 2008). A bananicultura brasileira apresenta

características que a diferenciam das regiões produtoras do mundo, tanto em relação à

diversidade climática, quanto ao uso de cultivares e forma de comercialização (Silva,

2000). O Brasil destaca-se com produção anual de 7.098.353 milhões de toneladas, em

área cultivada de 519.187 mil hectares (IBGE, 2009), o que coloca o país como segundo

maior produtor mundial e segundo em área plantada no mundo, perdendo apenas para a

Índia (FAO, 2009).

Fungo endofítico é aquele que habita o interior dos tecidos aéreos do hospedeiro, pelo

menos durante uma fase do seu ciclo de vida. Desempenham variadas e estreitas

relações ecológicas, sem demonstrar sintomas visíveis. Essa característica dificulta sua

avaliação, havendo necessidade de isolamento e cultivo em laboratório (Araújo et al.

2005). Arnold (2007) define fungos endofíticos, como grupo diversificado de

Ascomycota e seus anamorfos, definido pela ocorrência no interior de tecidos de plantas

assintomáticos, presente em todas as plantas terrestres, desde o ártico até os trópicos.

Poucos são os trabalhos relacionados com diversidade, quantidade de hospedeiros e

distribuições geográficas dos fungos endofíticos, principalmente em regiões tropicais.


163

Regiões tropicais, como Agreste de Pernambucano, apresentam biodiversidade,

porém, pouco estudada. Embora a região produza banana, quase nada se sabe sobre

fungos endofíticos associados à cultura. O conhecimento das espécies e suas

interrelações são importantes no processo de avaliação da biodiversidade e o papel que

os fungos desempenham no ecossistema. Este trabalho teve como objetivo isolar e

identificar fungos endofíticos pertencentes ao Filo Ascomycota, de folhas

aparentemente sadias de bananeira (Musa spp.), do Município de Belo

Jardim/Pernambuco.

Materiais e Métodos

Caracterização das áreas de coletas Belo Jardim ocupa 754Km² da área total do estado de Pernambuco. Considerado

brejo de altitude (Melo & Andrade, 1961). Vegetação formada por Floresta

subcaducifólia. Precitipação pluviométrica média anual de 955,6 milímetros. Altitude

média em torno de 650m ao nível do mar. Coordenadas geográficas 8º20’58”, 4 de

latitude sul, 36º22’50”, 8 de longitude O. Gr.–rumo NO ((FIAM, 1997). Do ponto de

vista climático é uma região considerada intermediária entre áreas de clima úmido

(Zona da Mata) e seco (Sertão) (Cabral et al., 2004), com período chuvoso (março a

julho) e seco (setembro a fevereiro) (Salgueiro, 2005). Solo classificado como

Podzólicos Amarelo e Vermelho-Amarelo (PA e PV), com variadas profundidades e

texturas, presença de cascalhos, relevo movimentado (CONDEPE/FIDEM, 2005).

Foram realizadas quatro coletas, duas na estação chuvosa e duas na estação seca, nos

sítios Araçá, Freixeira, Taboquinha e Serra dos Ventos, ambas de microprodutores de

banana do município do Belo Jardim/Pernambuco. De cada localidade foram coletados,

quatro exemplares de bananeira, de cultivares diferentes (‘Pacovan’, ‘Nanicão’, ‘Maçã’

e ‘Prata-Anã’), adultas em fase de produção, e utilizadas três folhas (nova, intermediária

e velha), totalizando 12 folhas (por coleta). As folhas aparentemente sadias, sem

manchas ou qualquer tipo de lesão causada por insetos ou danos mecânicos, foram

acondicionadas separadamente, em sacos de papel, fechados e etiquetados, levados

dentro de 24 horas ao laboratório de Micologia para processamento.

Isolamento de tecido foliar da bananeira

No laboratório, cada folha foi lavada com água corrente e sabão, utilizando-se para

isolamento a técnica por fragmentação do tecido vegetal (Araújo et al. 2005). Com


164

auxílio de um furador metálico esterilizado (6mm de diâmetro), foram feitos 36 discos

por folha, um total de 108 discos por planta obtendo-se assim 216 discos para cada

cultivar, perfazendo um total de 1728 discos em quatro coletas. Após desinfestação,

com auxílio de uma pinça flambada e em câmara asséptica, fez-se transferência dos

discos foliares para placas de Petri, contendo meio batata-dextrose-ágar (BDA)

suplementado com solução de antibiótico cloranfenicol 500mg (100mg/Lˉ¹). Cada placa

recebeu seis discos, distribuídos eqüidistantes, incubados a temperatura de laboratório

(28ºC±2ºC), examinadas diariamente, até 30 dias.

Identificação dos fungos isolados

Identificações em nível de gênero e espécie foram realizadas com fungos purificados,

quando necessário, utilizou-se a técnica de cultivo em lâmina (Riddell, 1950),

utilizando-se também bibliografias especializadas (Ellis, 1976; Sutton, 1980; Dennis,

1957; Sivanesan, 1984; Hanlin & Menezes, 1996).


165

Resultados e Discussão

Foram identificadas seis espécies de Ascomycota endofíticos, em folhas

aparentemente sadias, de bananeira: Glomerella musarum, G. cingulata, Guignardia

musae, Mycosphaerella musicoa, Sporormiella minima e Xylaria aff. hypoxylon.

Chave para Ascomycota endofítico em folhas de bananeira (Musa spp.), em

Pernambuco/Brasil.

1’ Ascomas produzidos em estromas clavados em meio de cultura......................Xylaria aff. hypoxylon

1” Ascomas não produzidos em meio de cultura ................................................................................... 2

2’ Ascomas do tipo peritécio, ascos unitunicados................................................................................... 3

2” Ascomas do tipo pseudotécio, ascos bitunicados............................................................................... 4

3’ Anamorfo Colletotrichum gloeosporioides/conídios 9-24 X 3-4,5µ...................Glomerella cingulata

3” Anamorfo Colletotrichum musae/conídios 12-17 X 4,5-5,5µ.............................Glomerella musarum

4’ Ascos obclavados, aparafisados, ascósporos 1-septados, hialinos ...... .......Mycosphaerella musicola

4” Ascos cilíndricos a clavados, ascósporos unicelulares ou multicelulares.......................................... 5

5’ Pseudotécios imersos, ascósporos unicelulares, hialinos.........................................Guignardia musae

5” Pseudotécios superficiais, ascósporos multicelulares, escuros,..........................Sporormiella mínima

Glomerella cingulata (Stoneman) Spaulding & H. Schrenk (1903)

Glomerella musarum Petch (1917)

Espécies de Glomerella são encontradas como parasitas ou sapróbios em tecidos de

plantas vasculares (Hanlin & Menezes, 1996). Demonstram certa especificidade por

determinados órgãos vegetais (Clay & Schardl, 2002). É um gênero conhecido como

cosmopolita, abundante nos trópicos, com ampla gama de hospedeiros (Holliday, 1980).

Caracteres morfológicos, como forma, tamanho dos conídios, apressórios e hospedeiros

são utilizados para classificar os estádios anamórficos correspondentes ao gênero

colletotrichum (Sutton, 1992), porém esses marcadores morfológicos são insuficientes

para separar todas as espécies, tendo se recorrido recentemente a marcadores

moleculares.


166

Glomerella cingulata (Stonem) Spauld. & Schrenk (Anamorfo: Colletotrichum

gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc.) foi isolado endofiticamente de folhas de Musa

acuminata, por Brown et al. (1998), em Hong Kong e Austrália. É citado como fungo

endofítico, em folhas de outros vegetais, Glycine max (L.) merr., na argentina (Larran et

al., 2002); Viguiera arenaria (Asteraceae), como espécie dominante (Guimarães, 2007).

Glomerella musarum (Anamorfo: Colletotrichum musae (Berk. & Curt.) von Arx.).

Causa antracnose em frutos de banana (Musa spp.), sendo de comum ocorrência onde a

bananeira é cultivada (Wardlaw, 1972) e possuindo ampla distribuição geográfica.

Economicamente é importante por causar prejuízos em pós-colheita (Jeffries et al...

1990). Assunção et al. (2007) isolaram a espécie no Brasil de folhas de bananeira (Musa

spp.), com sintomas de doença. Trabalhos disponíveis na literatura (Couto & Menezes,

2004; Sponholz et al. 2004; Pessoa et al. 2007), estão relacionados com estadio

anamórfico, causando antracnose, porém, não há relato até o momento, de G. musarum

como fungo endofítico de Musa spp., sendo este o primeiro registro deste fungo como

endófito desta cultura.

Guignardia musae Racib., Bull. int. Acad. Sci. Lett. Cracovie, Cl. sci. math. nat.

(1909).

Espécies de Guignardia são geralmente sapróbias ou semiparasitas de folhas

(Sivanesan, 1984) e também como endofíticas em diferentes espécies de plantas. no

brasil, o gênero guignardia tem sido detectado em plantas, porém sem determinação

específica, não havendo trabalhos publicados sobre a especificidade do fungo com

relação aos hospedeiros nem sobre a diversidade genética das populações do fungo em

cada hospedeiro (Wickert et al. 2009).

No Japão, espécies de Guignardia foram isoladas de folhas saudáveis de 94 espécies

de plantas pertencentes a 69 diferentes gêneros (Okane et. al. 2003), levando a supor

que o número de hospedeiros de Guignardia no Brasil é elevado.

Há relatos de Guignardia como endofítico, a partir de diferentes plantas

aparentemente sadias (Carroll & Carroll, 1978; Petrini, 1986; Madriz et al. 1991; Nag

Raj, 1993; Penna, 2000; Glienke-Blanco et al. 2002). Espécies de Guignardia são

isoladas endofiticamente de Musa spp., entre elas: G. cocoicola e G. citricarpa em

folhas de Musa acuminata, na Tailândia (Photita et al. 2001); G. mangiferae, no Novo

Gales (Baayen et al. 2002). Liberato et al. (2009) cita que, ao contrário de G. citricarpa,

não há evidência da existência endofítica de G. mangifera, não sabendo se G. musae

pode causar infecções assintomáticas em folhas de bananeira.


167

O isolamento de Guignardia musae, no presente trabalho, como endofítico da

bananeira constitui nova informação.

Mycosphaerella musicola R. Leach ex J.L. Mulder (1976)

Mycosphaerella musicola (anamorfo Pseudocercospora musae (Zimm.) Deighton)

(Jones, 2003), causador da doença Sigatoka amarela, constitui-se um dos principais

problemas da bananicultura no Brasil (Pereira et al., 2003).

A presença de Mycosphaerella musicola isolada endofiticamente na cultivar

‘Pacovan’, no período chuvoso e em folha nova, comprova que fungos endofíticos

vivem assintomáticos nos vegetais, como patógeno latentes. E a passagem de endófito

para fitopatógeno depende das condições ambientais, principalmente temperatura, que

segundo Pereira et al. (1999), temperaturas baixas (21°C) limitam o desenvolvimento de

doença.

Trata-se da primeira ocorrência de M. musicola como endofítico, em folhas de

bananeira; também não existem relatos do anamorfo Pseudocercospora musae como

endofítico em vegetais.

Sporormiella minima (Auersw.) S.I. Ahmed & Cain (1970).

Espécies de Sporormiella são comumente encontradas em vários tipos de estrume

animal, no solo, madeira, vegetais em decomposição e raramente, no humano.

Ascósporos podem ser encontrados em amostras antigas de solo e sedimentos, sendo

instrumentos úteis na paleoecologia (Burney et al. 2003). Pereira et al. (1999) isolaram

como fungo endofítico, em Musa acuminata, no Estado de São Paulo, Brasil.

Xylaria aff. hypoxylon

Dentre espécies endofíticas isoladas de plantas tropicais, o grupo taxonômico com

maior frequência de isolamento pertence à família Xylariaceae (Carmona et al. 2009).

Sua identificação é problemática, devido à raridade com que seus teleomorfos são

formados em meio de cultura. Os anamorfos produzidos apresentam similaridade entre

si, tornando-se necessária a combinação de caracteres morfológicos com análises

bioquímicas para diferenciação (Rodrigues et al. 1993). Segundo Rodrigues (1994),

Xylaria apresenta biologia intrigante, constância de isolamento e alta frequência em

relação a outros fungos endofíticos de folhas, nos trópicos. A espécie endofítica de

Xylaria apresenta características associadas com mutualismo e não parasitismo latente.

Suas relações simbióticas são pouco conhecidas (Davis et al. 2003).

Vários trabalhos registram o gênero Xylaria como fungo endofítico em folhas, de

diferentes espécies vegetais. Xylaria foi isolada de açaizeiro (Euterpe oleracea)


168

(Rodrigues, 1991); Quercus e Sylvatica (Fagaceae), Betula, Corylus e Alnus

(Betulaceae), Acer (Sapindaceae); Fraxinus (Oleaceae), Rhizophora e Bruguiera

(Rhizophoraceae); Avicennia (Avicenniaceae), Picea e Pinus (Pinaceae) e Nicotiana

(Solanaceae), coníferas, monocotiledôneas (Brunner & Petrini, 1992); Schefflera

(Araliaceae) (Laessøe & Lodge, 1994); hepáticas (Hymenoscyphus ericae) (Duckett &

Read, 1995); bromélias e samambaias (Richardson & Currah, 1995); Manilkara

bidentata (Sapotaceae) (Lodge et al., 1996); Lepanthes (Orchidaceae) (Bayman et al.,

1997); Manilkara (Sapotaceae) e Casuarina (Casuarinaceae) (Bayman et al., 1998);

Heisteria (Olacaceae) e Ouratea (Ochnaceae) (Arnold et al., 2000), palmeira, Euterpe,

Trachycarpus e Livistona (Arecaceae) (Guo et al., 2001); carvalho (Collado et al.,

2002); hepática (Davis et al., 2003), rosa (Rosa hybrida) (Salazar & García, 2005);

Tectona grandis L. e Samanea saman Merr. (Chareprasert et al. 2006), Eremanthus

erythropappus (DC.) Macleish (candeia) (Magalhães et al., 2008). Estas informações

sugerem que distribuição de Xylaria não depende da geografia nem da morfologia e da

origem do hospedeiro.

Poucos são os trabalhos relacionados ao isolamento de Xylaria como fungo

endofítico em folhas de bananeira. Existe uma referência para o Brasil (Pereira et al.,

1999), e outras para Hong Kong e Austrália (Brown et al. 1998) e Tailândia (Photita et

al., 2001), ambas para Musa acuminata.

Segundo San Martín & Rogers (1995), espécies de Xylaria passam parte do seu ciclo

de vida como endofíticas, não havendo estudos da sua fisiologia e seu papel no

hospedeiro. De acordo com Rogers (2000), o papel de Xylaria isolado como endófito, é

que, o fungo se alterna entre hospedeiros: em determinado hospedeiro, ocorre como

fungo endofítico, em outro como sapróbio ou fitopatógeno, ou que endófitos existem

apenas como endófitos, tendo-se especializado para este ambiente.

Agradecimentos

O primeiro autor agradece á Fundação de Amparo á Ciência e Tecnologia do Estado de

Pernambucoco (FACEPE), pela concessão da bolsa de estudo (Processo Nº-BPG–0001–

2.12/07).

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Assunção, Márcia Maria Costa Fungos endofíticos isolados de folhas de bananeira (Musa spp.) e seleção de antagonistas a fitopatógenos dessa cultura / Márcia Maria Costa Assunção. – Recife: O Autor, 2010. 171 folhas : Il., fig., tab.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Pós-graduação em Biologia de Fungos, 2010.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Fungos 2. Fungos fitopatogênicos 3. Microrganismos – Cultura e meio de cultura 4. Banana I. Título. 579.5 CDD (22.ed.) UFPE/ CCB – 2010- 072

FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE FOLHAS DE … · CULTURA RECIFE Fevereiro/2010 Márcia Maria Costa...

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