Gabriela Carvalho Fernandes

Identificação de mulheres em risco para câncer de mama hereditário por mutação nos genes BRCA1 e BRCA2: contribuição dos dados patológicos, história familiar e

modificadores genéticos do risco de câncer.

Barretos, SP 2015

Gabriela Carvalho Fernandes

Identificação de mulheres em risco para câncer de mama hereditário por mutação nos genes BRCA1 e BRCA2: contribuição dos dados patológicos, história familiar e

modificadores genéticos do risco de câncer.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação PIO XII – Hospital de Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Oncologia

Orientador: Profa. Dra. Edenir Inêz Palmero

Barretos, SP 2015

F363i Fernandes, Gabriela Carvalho

Identificação de mulheres em risco para câncer de mama hereditário por mutação nos genes BRCA1 e BRCA2: contribuição dos dados patológicos, história familiar e modificadores genéticos do risco de câncer. / Gabriela Carvalho Fernandes. - Barretos, SP 2015.

173 f. : il.

Orientadora: Edenir Inêz Palmero.

Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos, 2014.

1. Neoplasias da Mama. 2. Neoplasias da mama/triplo negativo. 3. Hereditariedade. 4. Mutação. 5. Genes BRCA1. 6. Genes BRCA2. I. Autor. II. Palmero, Edenir Inês

CDD 616.994 49

Dedicatória

Dedico este trabalho a três pessoas especiais e muito importantes em minha vida, meus pais

Fernandes Antonio Silva e Silvana Carvalho da Silva, e meu noivo Evandro Gonçalves Silva,

pela paciência e também por me ajudarem de todas as maneiras possíveis durante essa

caminhada. Que fique registrado o meu profundo agradecimento e admiração por essas

pessoas maravilhosas que fazem parte da minha vida. Dedico também esse trabalho a uma

quarta pessoa não menos amada, mesmo que não esteja entre nós sempre foi a maior

incentivadora do meu sucesso que fique aqui registrado meu eterno carinho e admiração a

minha avó Terezinha Gonçalves Carvalho que sempre esteve ao meu lado, agradeço a

paciência, as orações, o amor e o carinho que me dedicou em cada dia de sua vida.

Agradecimentos

Agradeço a Deus por sempre iluminar o meu caminho, me ajudando enfrentar cada

batalha, me proporcionando força e determinação nesta etapa tão importante de minha

vida, permitindo a realização deste objetivo tão almejado.

A minha orientadora Prof. Dra. Edenir Inêz Palmero, pela oportunidade e

credibilidade em mim depositada, e também pela dedicação e incansável empenho para o

desenvolvimento desse trabalho, agradeço também os ensinamentos e a amizade que me

dedica.

Aos meus pais Fernandes Antonio da Silva e Silvana Carvalho da Silva, maiores

incentivadores e grandes torcedores do meu sucesso, pelo que investiram em mim, pela

confiança, incentivo durante essa jornada, pelo amor, carinho, paciência, atenção e por

estarem ao meu lado em todos os momentos de alegria e dificuldades vividas nesse período.

Ao meu noivo, Evandro Gonçalves Silva, um agradecimento especial, pela paciência,

compreensão, amor, carinho, companheirismo, incentivo e por nunca deixar-me desanimar.

Aos meus irmãos Anderson Fernandes da Silva, Vinicius Carvalho Fernandes e Luis

Felipe Carvalho Silva, pelo companheirismo, incentivo, união e por toda amizade que me

dedicam.

Ao meu primo Julio Cesar de Souza, por todo apoio e incentivo.

Aos grandes amigos do Centro de Diagnóstico Molecular André, Juliana, Flavia, Thaís,

Adriane, Cristina, Aline e Deise, pelas palavras de incentivo, pelo companheirismo, carinho,

cumplicidade e amizade que me dedicam.

A grande amiga de todas as horas Allini Mafra por todos os socorros prestados fora

de hora com a análise estatística do projeto.

Ao amigo Cleyton Zanardo de Oliveira pelo suporte e auxílio nas análises estatísticas

e pela amizade.

Ao NAP (Núcleo de Apoio ao Pesquisador) por todo suporte prestado.

Ao departamento de Oncogenética pelas informações fornecidas.

Ao departamento de mastologia, em especial ao Dr. Rodrigo Michelli pela

imensurável colaboração na inclusão de pacientes.

As amigas do mestrado Allini Mafra, Camila Crovador, Paula Aguilar, Larissa Kuil,

pelos almoços de sexta e por proporcionarem momentos divertidos e agradáveis mesmo

quando estávamos com a ‘’corda no pescoço’’.

Aos pacientes agradeço pela participação voluntária.

Ao departamento de Pós Graduação (Brenda e Silvana) pela paciência e

esclarecimento de dúvidas.

Aos assessores da banca de acompanhamento Dr. Victor Evangelista e Dr. Rene

Aloisio Vieira pela dedicação e sugestões.

A todos meus amigos e familiares, não menos importantes que de alguma forma

fazem ou fizeram parte da minha vida e me auxiliaram ao longo desse dois longos anos.

“Deus não nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos.”

ALBERT EINSTEIN

Sumário

1. INTRODUÇÃO 18

1.1 Câncer de Mama – Aspectos Gerais 18

1.2 Câncer de Mama – Fatores de Risco 19

1.3 Câncer de Mama Hereditário – Aspectos Gerais 19

1.4 Câncer de Mama Hereditário no Brasil 20

1.5 Câncer de Mama Hereditário – Principais Síndromes de Predisposição Hereditária 24

1.5.1 Síndrome de Predisposição Hereditária ao Câncer de Mama e Ovário 24

1.5.1.1 Aspectos Clínicos 25

1.5.1.2 Aspectos Moleculares 27

1.5.1.3 Diagnóstico Molecular 29

1.5.2 Síndrome de Li-Fraumeni 30

1.5.2.1 Síndrome de Li Fraumeni – Aspectos Moleculares 31

1.5.3 Síndrome de Cowden 32

1.5.4 Síndrome de Prediposição Hereditária ao câncer de Mama e câncer Colorretal 33

1.5.5 Ataxia-Telangiectasia 34

1.5.6 Síndrome de Peutz-Jeghers 34

1.5.7 Câncer Gástrico Difuso Hereditário 35

1.6 Câncer de Mama Hereditário – Identificação das famílias em risco 35

1.6.1 Identificação das famílias em risco – Modelos epidemiológicos para identificação das

famílias em risco 36

1.6.2 Identificação das famílias em risco – Presença de mutações germinativas em genes

de predisposição e/ou suscetibilidade ao câncer 39

1.6.3 Identificação das famílias em risco - História Familiar 39

1.6.4 Identificação das famílias em risco – Contribuição das características histopatológicas

do tumor 40

1.6.5 Identificação das famílias em risco - Polimorfismos: Modificadores Genéticos do

Risco de Câncer 42

2. JUSTIFICATIVA 45

3. OBJETIVOS 46

3.1. Objetivo Geral 46

3.2. Objetivos Específicos 46

4. MATERIAL E MÉTODOS 47

4.1 Delineamento do Estudo 47

4.2 Critérios de inclusão 47

4.3 Critérios de exclusão 48

4.4 Casuística 48

4.5 Metodologia 50

4.5.1 Coleta de dados clínicos e de história familiar 50

4.5.2. Análises Imunohistoquímicas e moleculares 50

4.6 Armazenamento dos Dados e Análise Estatística 54

4.7 Aspectos Éticos 55

4.8 Uso das Informações e Publicações 55

5. RESULTADOS 56

5.1 Caracterização Geral da Amostra 56

5.2 Caracterização do Perfil Histopatológico e Imunohistoquímico das amostras utilizadas 62

5.3 Frequência dos polimorfismos rs2981582 (gene FGFR2), rs3803662 (região contendo

TNRC9), rs889312 (região contendo MAP3K1), rs3817198 (gene LSP1) e rs13281615 70

5.4 Associação entre os polimorfismos rs3803662, rs2981582, rs13281615, rs889312 e

rs3817198 com o perfil histopatológico e imunohistoquímico do tumor e com a história

familiar de câncer 72

5.5 Identificação de indivíduos não-testados para mutações germinativas em BRCA1/2 que

poderiam se beneficiar do teste pela combinação de seus dados histopatológicos e dos

diferentes polimorfismos analisados 96

6. DISCUSSÃO 101

6.1.1 Grupo amostral 101

6.1.2 Características dos tumores 102

6.1.3 História pessoal e familiar de câncer 106

6.1.4 Polimorfismos 109

6.1.5 Características que influenciam na presença de mutações germinativas em

BRCA1/BRCA2 111

7 . CONCLUSÃO 115

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 118

9.ANEXOS 128

Lista de figuras

Figura 1: Representação esquemática dos genes BRCA1 e BRCA2, dos seus exons 28

codificantes, proteínas e domínios funcionais.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificação molecular. 52

Tabela 2: Detalhamento das reações de PCR realizadas. 53

Tabela 3: Caracterização geral da amostra e fatores de risco. 57

Tabela 4: Características anatomopatológicas relacionadas ao câncer de mama geral

e por grupo. 58

Tabela 5: Características da história pessoal e familiar de câncer geral e por grupo. 60

Tabela 6: Probabilidade de mutação dos tumores de mama (por grupo). 62

Tabela 7: Características imunohistoquímicas dos tumores de mama (por grupo). 63

Tabela 8: Suptipo molecular dos tumores de mama (por grupo). 64

Tabela 9: História familiar de câncer conforme subtipo molecular. 65

Tabela 10 : Relação entre Triplo Negatividade e história familiar de câncer. 66

Tabela 11 : História familiar de câncer conforme status do receptor hormonal para as

mulheres TN, por grupo. 67

Tabela 12: Características imunohistoquímicas e subtipo molecular conforme gene

mutado. 69

Tabela 13: Frequência dos polimorfismos rs3803662 no gene TNRC9, rs2981582 no

gene FGFR2, rs13281615, rs889312 no gene MAP3K1 e rs3817198 no gene LSP1, por

grupo. 71

Tabela 14 : Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3803662 no

gene TNRC9 e Receptores Hormonais (geral). 72

Tabela 15: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3803662 no

gene TNRC9 e Receptores Hormonais (por grupo). 73

Tabela 16: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs2981582 no

gene FGFR2 e Receptores Hormonais (geral). 74

Tabela 17: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs2981582 no

gene FGFR2 e Receptores Hormonais (por grupo). 75

Tabela 18: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs13281615 e

Receptores Hormonais (geral). 76

Tabela 19: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs13281615 e

Receptores Hormonais (por grupo). 77

Tabela 20: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs889312 no

gene MAP3K1 e Receptores Hormonais (geral). 78

Tabela 21: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs889312 no

gene MAP3K1 e Receptores Hormonais (por grupo). 79

Tabela 22: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3817198 no

gene LSP1 e Receptores Hormonais (geral). 80

Tabela 23: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3817198 no

gene LSP1 e Receptores Hormonais (por grupo). 81

Tabela 24: Correlação entre frequência do polimorfismo rs3803662 no gene TNRC9

e a história familiar de câncer (por grupo). 84

Tabela 25: Correlação entre frequência do polimorfismo rs2981582 no gene FGFR2 e

a história familiar de câncer (por grupo). 86

Tabela 26: Correlação entre frequência do polimorfismo rs13281615 e a história

familiar de câncer (por grupo). 88

Tabela 27: Correlação entre frequência do polimorfismo rs889312 no gene MAP3K1

e a história familiar de câncer (por grupo). 90

Tabela 28: Correlação entre frequência do polimorfismo rs3817198 no gene LSP1 e a

história familiar de câncer (por grupo). 92

Tabela 29: Características de história familiar do grupo 1 versus os grupos 2, 3 e 4. 96

Tabela 30: Características histopatológicas e imunohistoquímicas do grupo 1 versus

os grupos 2, 3 e 4. 97

LISTA DE ABREVIATURAS

RCV Risco Cumulativo Vital

RE Receptor de Estrógeno

RP Receptor de Progesterona

CK Citoqueratina

SNP Polimorfismo de Nucleotídeo Simples

TN Triplo Negativo

INC Inconclusivo

RR Risco Relativo

CM Câncer de Mama

AG Aconselhamento Genético

NCCN Rede Nacional de Câncer

ASCO Sociedade Americana de Oncologia Clinica

VUS Variante de Significado Clínico Desconhecido

HBOC Câncer de Mama e Ovário Hereditários

aCGH Hibrização Genômica Comparativa

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

SLF Síndrome de Li-Fraumeni

SLFL Síndrome de Li-Fraumeni Like

FISH Hibridização in Situ Fluorescente

HER Fator de Crescimento Epidermal

Resumo

Justificativa: Do total de casos de câncer de mama cerca de 5-10% são causados por

mutações germinativas em genes de predisposição ao câncer. A história familiar de câncer

bem como as características histopatológicas dos tumores BRCA- associados são indicadores

importantes de risco para o câncer de mama hereditário e podem auxiliar na identificação

de indivíduos em risco. Somado a isso, trabalhos recentes identificaram polimorfismos

associados à história familiar de câncer e/ou ao tipo histológico do tumor, que conferem um

aumento na suscetibilidade ao câncer. Objetivo: Dessa forma, o presente projeto teve como

objetivo principal analisar a capacidade preditiva dessas três variantes (história familiar de

câncer, características histopatológicas do tumor e presença de polimorfismos

modificadores do risco de câncer) na identificação de mulheres com câncer de mama

hereditário em quatro grupos de mulheres, todas elas afetadas por câncer de mama.

Materiais e Métodos: As mulheres foram divididas em quatro grupos, i) mulheres com

mutação germinativa deletéria nos genes BRCA1 ou BRCA2; ii) mulheres com Variante de

Significado Clínico Desconhecido (VUS) nos genes BRCA1 e/ou BRCA2; iii) mulheres sem

mutação germinativa e VUS identificada nos genes BRCA1 e BRCA2 e, iv) mulheres com

câncer de mama esporádico e que não foram submetidas a teste genético de BRCA1/BRCA2.

Resultados: Foram incluídas no estudo 287 mulheres: 51 no grupo 1, 53 no grupo 2, 100 no

grupo 3 e 83 mulheres no grupo 4. Observamos que 51,2% das mulheres do grupo 4

possuíam idade superior a 50 anos no momento do diagnóstico (idade média 51,65)

enquanto que nos grupos 1, 2 e 3 a idade média ao diagnóstico era 41,8, 34,9 e 38,3 anos,

respectivamente. A análise imunohistoquímica mostrou que 57 mulheres eram triplo-

negativas (receptor de estrógeno, progesterona e HER2 negativos), sendo 24 delas do grupo

1. Dentre as 24 triplo negativas do grupo 1, 22 eram mutadas no gene BRCA1. Em relação

aos polimorfismos analisados, encontramos associação entre o SNP rs3803662 (no gene

TNRC9) e história familiar de câncer. Também verificamos associação entre o polimorfismo

rs889312 (gene MAP3K1) e presença de câncer de mama bilateral. Com relação ao SNP

rs3817198 (no gene LSP1), uma associação entre a presença do alelo T e aumento no

número de casos de câncer foi observada. Conclusão: Cabe salientar a importância de que

outros fatores, além do número de casos de câncer e da idade ao diagnóstico, sejam levados

em consideração para a identificação das famílias em risco. Além disso, dada a frequência

aumentada da triplo negatividade apenas nos casos BRCA1 mutados sugere-se que os

tumores BRCA1 e BRCA2 mutados apresentam comportamentos distintos (BRCA2 é mais

similar aos tumores esporádicos, com idades mais tardia ao diagnóstico e menor frequência

de triplo negatividade), que devem ser levados em consideração ao identificar as famílias em

risco para câncer hereditário, bem como ao definir a melhor estratégia para a realização do

teste genético para BRCA1 e BRCA2.

Palavras chaves: Câncer de mama, hereditariedade, câncer de mama triplo negativo,

mutação, BRCA1, BRCA2 .

Abstract

Background: Approximately 5-10% of all breast cancer cases are caused by germline

mutations in cancer predisposing genes. Family history of cancer and histopathological

characteristics of BRCA-associated tumors are important indicators of risk for hereditary

breast cancer, and may help in the identification of at-risk individuals. Besides, recent

studies have identified polymorphisms associated with family history of cancer and/or

histological type of tumor. These polimorphisms confer an increased susceptibility to cancer.

Objective: Thus, this project aimed to assess the predictive ability of these three variables

(family history of cancer, histopathological characteristics of the tumor and presence of

specific polimorphisms) in the identification of women with hereditary breast cancer in four

groups (all of them constituted by women with personal history of breast cancer): Material

and Methods: The women were divided into four groups, i) women with deleterious

germline mutation in BRCA1 or BRCA2 genes; ii) women with a variant of unknown

significance (VUS) in BRCA1 and/or BRCA2 genes; iii) women without germline mutation and

VUS identified in the BRCA1 and BRCA2 genes, and iv) women with sporadic breast cancer

who have not undergone genetic testing of BRCA1 / BRCA2. Results: Were included in the

study, 287 women were included: 51 in group 1, 53 in group 2, 100 in group 3 and 83 in the

“control” group. We observe that 51,2% of women in group 4 were older than 50 years at

diagnosis (mean age 51.65 years) while in groups 1, 2 and 3 the mean age at diagnosis was

41.8, 34.9 and 38.3 years, respectively. The immunohistochemical analysis showed that 57

women were triple-negative (estrogen, progesterone and HER2 receptors negative), being

24 from group 1. From these 24 women, 22 were mutated for BRCA1 gene. Regarding the

polymorphisms, an association was found between the SNP rs3803662 (in TNRC9 gene) and

a family history of cancer. We also verified an association between rs889312 polymorphism

(gene MAP3K1) and the presence of bilateral breast cancer. Regarding the SNP rs3817198

(LSP1 gene), an association between the T allele and an increased number of cancer cases

was observed. Conclusions: We should reinforce that, beside the number of cases and age at

diagnosis, other factors should be taken into account for the identification of families at-risk.

In addition, given the increased frequency of triple negativity in BRCA1 mutated cases, we

suggested that BRCA1 and BRCA2-mutated tumors behaves differently (BRCA2 is more

similar to sporadic tumors with later age at diagnosis and lower frequency of triple negative

tumors) which must be taken into consideration when identifying families at risk for

hereditary cancer, as well as to define the best strategy for genetic testing for BRCA1 and

BRCA2.

Key words: Breast cancer, heredity, triple negative breast cancer, mutation, BRCA1, BRCA2.

18

1. Introdução

1.1 Câncer de Mama – Aspectos Gerais

O câncer é considerado um problema de saúde pública há muito tempo em países

desenvolvidos. No entanto, aumento na incidência de câncer tem sido também observado

em países de baixa renda, especialmente na América Latina1.

Devido ao seu prognóstico relativamente bom (dados europeus apontam uma taxa

de sobrevivência de 91% no primeiro ano pós-diagnóstico e de 65% nos 5 anos

subsequentes), o câncer de mama (CM) é hoje o mais prevalente no mundo. Existem,

atualmente, em torno de 3,7 milhões de mulheres “sobreviventes” nos primeiros 5 anos

após o diagnóstico. Este é um número significativo se comparado a outros tumores, como

por exemplo, o câncer de pulmão, que registra 1,3 milhões de “sobreviventes” (homens e

mulheres) após 5 anos do diagnóstico2,3.

No entanto, no Brasil, as neoplasias da mama são a principal causa de mortalidade

por câncer entre mulheres. Conforme o Instituto Nacional de Câncer (INCA), o número de

novos casos de câncer de mama esperados em 2014 é de 57.120, com um risco estimado de

56 casos a cada 100 mil mulheres. Na região Sudeste do Brasil ocorre maior incidência entre

as mulheres com uma taxa estimada de 69 casos novos a cada 100 mil4.

Do total de casos de câncer de mama diagnosticados a cada ano, estima-se que 5%

a 10% sejam hereditários, ou seja, causados por uma alteração genética herdada que

confere a seu portador um risco de câncer significativamente maior que o da população em

geral. Os rápidos avanços em técnicas de biologia molecular nas últimas décadas resultaram

na identificação de genes que, quando alterados, aumentam significativamente o risco de

desenvolver câncer de mama, câncer de ovário e outros tumores, dentre os quais destacam-

se os genes supressores tumorais BRCA1 e BRCA25,6.

19

1.2 Câncer de Mama – Fatores de Risco

O Câncer de mama é uma doença multifatorial. Dentre os fatores de risco associados

encontram-se densidade da mama aumentada, história de menarca precoce (idade da

primeira menstruação) ou menopausa tardia (após os 50 anos de idade), obesidade após a

menopausa, uso de contraceptivos orais ou reposição de hormônios orais (estrogênio e

progesterona) no período pós-menopausa, nuliparidade e primeira gravidez após os 30 anos

de idade4.

Fatores genéticos também estão associados ao maior risco de desenvolvimento de

câncer de mama. Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA) mulheres que apresentam

mutação germinativa nos genes BRCA1 e BRCA2 têm 85% de chance de desenvolver câncer

de mama antes dos 70 anos de idade4. Além disso, estudos apontam que o Risco Relativo

(RR) para desenvolvimento de câncer de mama para quem tem 1 familiar de primeiro grau

com câncer é de 1,25 (0,83-1,87) e de 4,79 (0,77-29,78) para quem tem 2 ou mais familiares

de primeiro grau afetados. Para aquelas pessoas com familiares de primeiro e segundo graus

com câncer, o risco varia de 4,44 (1,49-13,17) para quem tem 2 familiares a 6,14 (1,75-21,56)

para quem tem 4 familiares de primeiro ou segundo graus com CM7.

Visando a redução do risco de câncer de mama algumas estratégias de manutenção

da saúde podem ser utilizadas, tais como realização de atividade física, diminuição da

ingestão de álcool, alimentação regular e a prática regular (conforme sexo e faixa etária) das

diferentes estratégias de detecção precoce preconizadas, tais como mamografia, exame

clínico da mama, auto-exame das mamas7.

1.3 Câncer de Mama Hereditário – Aspectos Gerais

Atualmente estima-se que 5-10% do total de casos de câncer de mama sejam

hereditários. O câncer de mama hereditário acontece no contexto de uma síndrome de

predisposição hereditária ao câncer, condição em que os indivíduos herdam um risco

aumentado para o desenvolvimento de uma ou mais neoplasias. Diversos genes já foram

descobertos e associados a um aumento no risco de desenvolvimento de câncer de mama,

20

sendo a grande maioria deles genes supressores tumorais, como por exemplo os genes

BRCA1 e BRCA25,6.

As famílias com câncer hereditário, de uma forma geral, apresentam uma ou mais

das seguintes características: i) Dois ou mais familiares diagnosticados com câncer; ii) Um

membro da família diagnosticado com câncer antes dos 50 anos de idade; iii) Vários

membros da familia afetados pelo mesmo tipo de câncer; iv) Um familiar afetado por mais

de um tipo de câncer e v) Um ou mais membros da família afetados com um câncer raro8,9.

Uma vez identificadas, essas famílias devem ser encaminhadas a programas especializados

em Genética e Câncer e uma ou mais sessões de aconselhamento genético devem ser

realizadas9. O aconselhamento genético (AG) é um processo de comunicação da

possibilidade de ocorrência de uma doença genética e, no caso do AG para câncer, é

direcionado a indivíduos e famílias com suspeita de desenvolvimento de alguma síndrome

de predisposição hereditária ao câncer. O processo de aconselhamento genético é iniciado

com a identificação de indivíduos em risco para uma síndrome de predisposição hereditária

ao câncer e posterior detalhamento da história familiar através da construção e análise do

heredograma envolvendo o máximo possível de gerações e indivíduos da família em

questão. Além da construção e avaliação detalhada do heredograma, são feitas estimativas

de risco e cálculos da probabilidade de mutação, abordagens essas fundamentais para o

manejo correto do paciente e de seus familiares9. Sempre que possível a suspeita clínica

deve ser confirmada através do teste genético9 .

1.4 Câncer de Mama Hereditário no Brasil

Embora na última década alguns serviços de Genética e Câncer tenham sido criados

no Brasil, ainda existem poucos serviços especializados em oncogenética, sendo que a

maioria deles está localizada nos hospitais universitários de algumas capitais brasileiras,

principalmente nas regiões Sul e Sudeste do Brasil10. Apesar do relativo aumento no

atendimento de oncogenética, o número atual de serviços públicos especializados que são

oferecidos à população está muito abaixo das necessidades do país11,12.

21

Trabalho realizado por Horovitz13 em 2003 mostrou que testes genéticos diagnósticos

estavam disponíveis em apenas 47 dos 66 serviços de Genética e Câncer (públicos)

existentes no Brasil. Dentre os testes oferecidos, 83% oferecem citogenética convencional,

55% citogenética de alta resolução, 36% possuem testes para erros inatos do metabolismo, e

32% realizam triagem pré natal. Apenas cerca de 50% desses laboratórios oferecem técnicas

de biologia molecular para determinados grupos de doenças incluindo retardo mental,

síndromes dismórficas, câncer hereditário, infertilidade, etc.

Conforme destacado por Penchaszadeh14 e colaboradores as principais dificuldades

relacionadas a criação e estabelecimento de centros especializados em oncogenética

residem no fato que as doenças genéticas ainda não são consideradas prioridades. Além

disso ainda existem cuidados a serem tomados em outras áreas da saúde; os serviços

genéticos são caros e voltados principalmente para doenças raras e a população não tem

consciência dos riscos e das possibilidades de prevenção.

Apesar dessas dificuldades os serviços de genética no Brasil vêm crescendo ao longo

do tempo10. Em 2014 foi implementada, pelo Ministério da Saúde, a Política para doenças

raras, que embora não contemple os tumores hereditários, pode ser um primeiro passo para

o reconhecimento da importância das doenças genéticas. Dentro do contexto da nova

portaria, um contexto de atendimento multidisciplinar foi estabelecido, no qual o médico

geneticista apresenta papel fundamental. Paralelamente ao crescimento (mesmo que lento)

dos serviços de genética, ou como uma consequência deles, estudos envolvendo famílias em

risco para câncer de mama hereditário têm surgido, conforme pode ser visto,

resumidamente, no texto abaixo 15.

Estudo realizado por Dufloth e colaboradores, avaliou a presença de mutação nos

genes BRCA1 e BRCA2 em 31 mulheres brasileiras com câncer de mama e história familiar

positiva. Dos casos testados 4 foram positivos, sendo uma mutação no gene BRCA1 e três

em BRCA2. Dessa forma a prevalência de mutação nos genes BRCA1 e BRCA2 encontrada

pelo estudo foi de 13% 16.

A prevalência de mutações em BRCA1 e BRCA2 em pacientes brasileiras com câncer

de mama também foi avaliada em estudo realizado por Gomes17 e colaboradores. Foram

incluídas no estudo 402 mulheres com câncer de mama. Do total de mulheres testadas, 9

(2,3%) eram portadoras de mutação (6 em BRCA1 e 3 em BRCA2). A mutação mais

22

frequentemente encontrada foi a mutação fundadora 5382insC no gene BRCA1 (atualmente

conhecida como c.5266dupC). O estudo sugere que um teste genético rápido e barato pode

ser desenvolvido para o rastreamento dessas mutações fundadoras que são relevantes na

população brasileira17.

Em estudo realizado em 2009 por Palmero e colaboradores18, foi avaliada a

prevalência de câncer de mama hereditário/familial e qual seria a aceitação de um programa

de avaliação de risco de câncer genético (GRCA). O trabalho teve início a partir de uma

coorte criada em 2004 em Porto Alegre chamada de Núcleo Mama – Porto Alegre (NMPOA)

composta por 9.218 mulheres com câncer de mama. Mulheres do NMPOA que foram

identificadas com alguma história familiar positiva de câncer foram encaminhadas para o

GRCA. Das 9.218 mulheres inscritas no NMPOA 1.286 relataram história familiar positiva de

câncer, e destas, 902 mulheres aceitaram ser encaminhadas para o NMPOA. Das 902

mulheres avaliadas, 214 mulheres possuíam história familiar sugestiva de predisposição

hereditária ao câncer de mama, destas 183 tinham critério para síndrome de Li-fraumeni. A

prevalência geral do fenótipo de câncer de mama hereditário foi de 6,2% (IC 95%)18.

A prevalência da mutação fundadora c.5266dupC (gene BRCA1) foi descrita em

trabalho recente realizado por Ewald e colaboradores19 em 137 indivíduos brasileiros em

risco para síndrome de predisposição ao câncer de mama e ovário hereditários (Hereditary

Breast and Ovarian Cancer - HBOC). O estudo avaliou a prevalência de 3 mutações

fundadoras em uma população não Judaica com critérios bem definidos para HBOC. A

freqüência da mutação c.5266dupC foi de 5,2%. No entanto, quando selecionados apenas os

casos com câncer de mama bilateral, a frequência aumentou para 12,1%. As outras duas

mutações avaliadas (c.68_69del no gene BRCA1) e (c.5946del no gene BRCA2) não foram

encontradas nesse grupo amostral. Com isso o estudo conclui que a triagem para as 3

mutações fundadoras não é justificável na nossa população, mas que a avaliação da

presença da mutação c.5266dupC no gene BRCA1 deve ser levada em conta em pacientes de

alto risco devido a sua alta prevalência19.

A frequência de mutações nos genes BRCA1, BRCA2 e TP53 em mulheres jovens foi

investigada por Carraro e colaboradores20. Em estudo publicado pelos referidos autores

foram analisadas 54 mulheres com câncer de mama diagnosticado em idade inferior a 35

anos. Além do status mutacional foram analisadas as características do tumor, tais como

23

positividade/negatividade para os receptores hormonais, estrógeno, progesterona e HER2.

Mutações germinativas foram encontradas em 12 dos 54 pacientes (22%), sendo 7 mutados

em BRCA1, 4 em BRCA2 e 1 mutado em TP53. 31,4% dos pacientes testados apresentavam

história familiar positiva de câncer e, desses, 43,7% eram portadores de mutação

germinativa patogênica (37,5% em BRCA1 e 6,2% em BRCA2). O estudo demonstrou ainda

que 50% dos pacientes com receptores hormonais negativos eram portadores de mutação

em BRCA1, percentual esse que aumentava para 83% quando apenas os casos com história

familiar positiva eram considerados20.

Mais recentemente o câncer de mama e ovário hereditários foram avaliados quanto

a presença de mutações pontuais e variações no número de cópias em pacientes brasileiras

por Silva e colaboradores21. Foram avaliadas por sequenciamento e MLPA 120 pacientes com

critérios clínicos para HBOC quanto a presença de mutações germinativas nos genes,

BRCA1/BRCA2, TP53, CHEK2 1100delC. Na sequência os pacientes foram analisados quanto a

variações no número de cópias em 14 genes de suscetibilidade ao câncer de mama (PTEN,

ATM, NBN, RAD50, RAD51, BRIP1, PALB2, MLH1, MSH2, MSH6, TP53, CDKN2A, CDH1 e

CTNNB1) através de Hibrização Genômica Comparativa (aCGH). A taxa de detecção de

mutações foi de 26%. Dos 31 casos positivos, 20 eram mutados no gene BRCA1, incluindo 2

casos com variação no número de cópias, e 7 tiveram mutação identificada no gene BRCA2.

Além disso, 3 pacientes apresentavam a mutação p. Arg337His no gene TP53, e um paciente

apresentava a mutação c.1100delC em CHEK2. Os resultados do estudo mostraram uma alta

frequência de mutações em BRCA1/BRCA2, notadamente no gene BRCA1 (64,5%). Além

disso, a mutação em TP53 (Arg337His) sugere que todos os pacientes com câncer de mama

com critérios para HBOC e negativos para BRCA1/BRCA2 devem ser testados para a mutação

p.Arg337His no gene TP5321.

A prevalência da mutação p.Arg337His no gene TP53 também foi descrita em famílias

brasileiras com câncer de mama hereditário em trabalho realizado por Cury22 e

colaboradores. O estudo determinou a prevalência dessa mutação em uma população com

câncer de mama e com critério para HBOC e também em uma população saudável

(controle). Do total de casos com câncer de mama a mutação estava presente em dois casos,

e ausente em todos os controles. O trabalho sugere que o rastreamento genético para

pacientes brasileiros que preencham critério para Síndrome de Predisposição ao Câncer de

24

Mama e Ovário Hereditários e com história familiar de tumores relacionados a Síndrome de

Li-fraumeni deve iniciar pela análise da mutação p.Arg337His no gene TP5322.

Embora ainda não se tenha um claro panorama da frequência e prevalência de

mutações germinativas deletérias em toda a população Brasileira, os estudos que vem sendo

realizados e publicados nos últimos anos demonstram uma clara preocupação em modificar

esse cenário de falta de conhecimento acerca da nossa população21.

1.5 Câncer de Mama Hereditário – Principais Síndromes de Predisposição Hereditária

1.5.1 Síndrome de Predisposição Hereditária ao Câncer de Mama e Ovário

A Síndrome de Predisposição ao Câncer de Mama e Ovário Hereditários (HBOC) é

causada, principalmente, por alterações genéticas nos genes supressores tumorais BRCA1 e

BRCA25,6.

Embora existam uma série de estudos investigando o papel de outros genes na

predisposição hereditária ao câncer de mama e de ovário, não há, até o presente momento,

outros genes associados a essa síndrome que confiram um risco de câncer significativamente

aumentado como o causado pela presença de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 23–25.

Acredita-se que o gene BRCA1 seja responsável por cerca de 50% de todos os casos

de câncer de mama hereditário. No entanto, esse percentual depende de uma série de

fatores, como por exemplo dos tipos de tumores presentes nas famílias avaliadas26.

Portadoras de mutação germinativa no gene BRCA1 têm um risco cumulativo vital (RCV) de

desenvolver câncer de mama de 44% a 68% até os 70 anos de idade. Além disso, o RCV para

câncer de ovário nessas pacientes também é significativamente maior, e pode chegar até

60% aos 70 anos de idade26,27. Outros tumores que parecem ser mais frequentes em

portadores (as) de mutações em BRCA1 incluem o câncer de tuba uterina, o câncer de

próstata e tumor de Wilms28. Além disso, diversos estudos relatam um risco aumentado para

câncer de mama masculino associado a mutações germinativas em BRCA1, embora

represente uma associação menos frequente do que a relatada para câncer de mama

masculino e mutações germinativas no gene BRCA229,30.

25

O gene BRCA2, quando alterado, aumenta o risco de desenvolvimento de múltiplos

tumores. BRCA2 é responsável por cerca de 30% a 40% de todos os casos de câncer de

mama hereditários. O RCV para câncer de mama em mulheres portadoras de mutações

germinativas nesse gene é similar ao risco de portadoras de mutações germinativas em

BRCA1 (44% a 68% até os 70 anos de idade)28,31 enquanto que o risco para câncer de ovário

é de 15% a 30%32,33. Embora menor que o RCV para câncer de ovário associado a mutações

germinativas em BRCA1, este risco ainda é 10 vezes maior que o da população em geral34.

Homens com mutações germinativas em BRCA2 têm um RCV significativamente maior que o

da população de desenvolver câncer de mama, cerca de 6% até os 70 anos de idade, o que

representa um aumento de 80-100 vezes o risco para a população em geral33. Além de

câncer de mama e ovário, há um aumento do RCV para diversos outros tumores: tumores de

vias biliares, bexiga, esôfago, pâncreas, próstata, estômago, sistema hematopoiético,

cavidade oral e faringe, e melanoma35,36.

1.5.1.1 Aspectos Clínicos

Segundo a Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO), famílias que

apresentem um ou mais dos critérios listados abaixo são classificadas clinicamente como

portadoras da Síndrome de Predisposição Hereditária ao Câncer de Mama e Ovário e

deverão ser acompanhadas de forma adequada. Os critérios propostos pela ASCO são: 37

Três ou mais casos de câncer de mama e um caso de câncer de ovário em qualquer

idade ou;

Mais de três casos de câncer de mama em idade menor ou igual a 50 anos ou;

Pares de irmãs (ou mãe e filha) com uma das seguintes combinações de tumores

diagnosticados em idade inferior a 50 anos:

- dois casos de câncer de mama ou;

- dois casos de câncer de ovário ou;

- um caso de câncer de mama mais um caso de câncer de ovário.

Além dos critérios preconizados pela ASCO, existem os critérios propostos pela NCCN

(National Comprehensive Cancer Network38, que são mais abrangentes que os propostos

pela ASCO e incluem:

26

Família com mutação detectada em BRCA1 e BRCA2;

História pessoal de câncer de mama associada a um ou mais dos seguintes critérios:

- diagnóstico antes dos 45 anos;

- diagnóstico antes dos 50 anos com:

segundo tumor primário;

1 ou mais familiares com câncer de mama em qualquer idade.

- diagnóstico antes dos 60 anos com:

câncer de mama triplo negativo.

- diagnóstico em qualquer idade com:

1 ou mais familiares com câncer de mama antes dos 50 anos;

2 ou mais familiares com câncer de mama em qualquer idade;

1 ou mais familiares com câncer de ovário epitelial;

2 ou mais familiares com câncer de pâncreas e/ou câncer de próstata em

qualquer idade;

1 caso de câncer de mama masculino;

ascendência étnica associada a uma alta frequência de mutações deletérias.

História pessoal de câncer de ovário do tipo epitelial.

História pessoal de câncer de mama masculino.

História pessoal de câncer de pâncreas ou próstata em qualquer idade com 2

ou mais familiares com câncer de mama e/ou ovário e/ou pâncreas ou próstata em

qualquer idade.

Com relação às estratégias de redução de risco, sabe-se que a mastectomia bilateral

profilatica é a intervenção com maior redução de risco de câncer de mama, principalmente

em mulheres com mutações em BRCA1 e BRCA239,40. Além disso a oforectomia bilateral

profilática também tem um valor significativo para a redução do risco de câncer de ovário

em mulheres mutadas, podendo reduzir em até 90% o risco de câncer de ovário e em 50% o

risco para câncer de mama41.

27

1.5.1.2 Aspectos Moleculares

O gene BRCA1 é um gene supressor tumoral localizado no cromossomo 17, composto

por 22 exons codificantes e codifica para uma proteína de 1863 aminoácidos (Figura1). A

proteína brca1 apresenta em sua estrutura uma região amino-terminal, conhecida como

dedo-de-zinco (‘’Zinc-finger’’) que é caracterizada por uma sequência de aminoácidos com

três cisteínas, uma histidina e quatro cisteínas em proximidade42,43, além de uma

variabilidade no processamento decorrente da heterogeneidade das junções intron-exon da

região 5’ do gene. Além do motivo dedo-de-zinco na região N-terminal, econtram-se, ao

longo do exon 11 dois domínios de localização nuclear. A proteína brca1 apresenta também

uma região de interação com rad51 e, na região carboxi-terminal da proteína, ocorre uma

concentração de aminoácidos de carga negativa que formam dois domínios BRCT, envolvidos

na manutenção da estabilidade da proteína brca143–47.

O supressor tumoral BRCA2 localiza-se no cromossomo 13 e é composto de 26 exons

codificantes que codificam a proteína brca2, a qual apresenta 3418 aminoácidos ao longo de

sua extensão (Figura 1). Essa proteína possui, oito repetições de 30-80 aminoácidos (domínio

BRC) no exon 11 como característica marcante, repetições essas que estão relacionadas com

a interação com a proteína rad51, a qual atua nos processos de reparo e recombinação. A

proteína brca2 apresenta, além desses domínios, uma região de ativação transcricional e

uma região adicional de interação com rad5148. A proteína brca2 juntamente com rad51,

está envolvida na manutenção da estabilidade genômica através de seu papel nos processos

de reparo de quebra das duas fitas de DNA por recombinação homóloga49.

28

Figura 1 - Representação esquemática dos genes BRCA1 e BRCA2, dos seus exons

codificantes, proteínas e domínios funcionais.

Fonte: Palmero EI50

De uma forma geral a função de ambos os supressores tumorais (BRCA1 e BRCA2)

está relacionada a aspectos do metabolismo celular, tais como controle do ciclo celular,

reparo de danos ao DNA e regulação da expressão gênica. Alterações na função da proteína,

na transcrição e também no reparo do DNA são notadas quando mutações patogênicas são

encontradas nesses genes, podendo levar a uma instabilidade genômica, a qual está

diretamente relacionada ao desenvolvimento do câncer. Mutações nos genes BRCA1/BRCA2

conferem um risco aumento de desenvolvimento de câncer, e o acúmulo de alterações

causadas pela inativação desses genes define o destino celular, podendo levar à apoptose,

reparo dos danos sofridos ou proliferação celular descontrolada51.

Muitas similaridades são observadas entre os genes BRCA1/BRCA2: ambos codificam

proteínas extensas, possuem um primeiro exon não codificante e um central (exon 11) que

compreende mais de 60% da região codificadora. Além disso, os dois genes possuem um

29

padrão similar de regulação do ciclo celular e, uma grande heterogeneidade genética, onde a

presença de mutações germinativas ao longo de toda a extensão de ambos leva ao mesmo

fenótipo: uma predisposição aumentada para o câncer de mama e ovário. Os efeitos da

especificidade tecidual dos genes BRCA1/BRCA2 são vistos principalmente em órgãos como

mama, ovário, útero e próstata pois são órgãos hormônio-responsivos52,53.

1.5.1.3 Diagnóstico Molecular

A pesquisa de mutações germinativas em BRCA1 e BRCA2 é considerada como

laboriosa, de alta complexidade e cara. Essa dificuldade deve-se, principalmente, ao

tamanho do gene e extensa heterogeneidade molecular que a doença apresenta. Com

raríssimas excessões (ex. população de judeus Ashkenazi), os genes BRCA1 e BRCA2 não

possuem hotspots, de forma que toda a extensão de ambos os genes deve ser analisada.

Mais de 4.000 alterações pontuais e grandes rearranjos gênicos já foram descritos em ambos

os genes 54.

O padrão ouro para a detecção de mutações germinativas é o sequenciamento

bidirecional convencional (Sanger) de toda a região codificadora dos genes BRCA1 e BRCA2.

Recentemente foram desenvolvidas plataformas de nova geração para realização de

sequenciamento conhecido como NGS – Next Generation Sequencing. As plataformas NGS

são capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida,

auxiliando de forma considerável na realização do teste genético25,55.

Com o surgimento da tecnologia associada aos sequenciadores de nova geração

(NGS), novas estratégias para o teste genético e diagnóstico molecular estão surgindo, as

quais vêm demonstrando algumas vantagens em relação à eletroforese capilar

(sequenciamento Sanger), como, por exemplo, a capacidade de gerar, com a mesma

sensibilidade e especificidade oferecidas pelo sequenciamento convencional (Sanger), vários

Megabases de informação em uma única corrida, bem como a capacidade de testar vários

pacientes em um único experimento e num curto espaço de tempo (uma semana a 10 dias).

A capacidade de multiplexar o experimento, ou seja, analisar vários genes e pacientes em

30

uma mesma “corrida” diminui o custo de realização do teste e amplia o número de

pacientes que podem ser analisados por experimento54,56–58.

De maneira complementar, realiza-se a busca por grandes rearranjos gênicos

(deleções e/ou duplicações), sendo que a principal metodologia utilizada para essa

finalidade é o MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). A técnica de MPLA

é um método sensível que visa a quantificação relativa do número de moléculas

hibridizadas, a técnica descrita por Schouten59 em 2002 e posteriormente comercializada

pela empresa MRC-Holland60 (http://www.mlpa.com) é capaz de detectar quantitativamente

deleções e duplicações. A técnica é constituída de quatro fases: Denaturação, hibridização,

ligação e amplificação, onde um par de primers universais é ligado a uma sonda sequencia

específica, os quais irão amplificar de forma proporcional à quantidade de DNA presente na

amostra que está sendo analisada. Os dados gerados são comparados com de amostras

normais e, na sequencia, resultados acerca da quantidade de cada exon do gene em análise

são liberados.

1.5.2 Síndrome de Li-Fraumeni

A Síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome autossômica dominante, rara, de

predisposição hereditária a vários tipos de câncer, especialmente sarcomas, câncer de

mama, tumores do sistema nervoso central e tumores adrenocorticais em idade jovem. É

uma síndrome caracterizada pela sua alta penetrância, na qual os afetados têm um risco de

cerca de 50% de desenvolver algum tipo de câncer até os 40 anos de idade comparado a 1%

na população em geral e, até os 60 anos esse risco chega a 90%61–63. A incidência dessa

síndrome é maior em mulheres devido à alta frequência de câncer de mama. A síndrome é

causada por mutações germinativas no gene supressor tumoral TP53, considerado o

“guardião do genoma” pelo seu papel central no processo de reparo de danos ao DNA, na

regulação do ciclo celular e na apoptose64,65. Indivíduos portadores de mutações no gene

TP53 tendem a desenvolver tumores em idades extremamente jovens e, além disso, os

portadores apresentam alto risco de ocorrência de múltiplos tumores primários. Visando

abranger famílias com espectro tumoral similar ao das famílias com SLF, mas que não

31

preenchiam os critérios clínicos inicialmente estabelecidos, foram propostos critérios

adicionais, denominados como Síndrome de Li Fraumeni like (LFL). Dentre esses critérios

cabe destacar os propostos por Birch, Eeles e, mais recentemente os critérios de

Chompret66–69.

1.5.2.1 Síndrome de Li Fraumeni – Aspectos Moleculares

O gene TP53 está localizado no braço curto do cromossomo 17 e é composto de

11 exons, sendo o primeiro não-codificante. A proteína p53 apresenta cinco domínios

estruturais e funcionais: a) um domínio de transativação N-terminal (região correspondente

aos aminoácidos 1 a 62); b) um domínio regulatório, rico em prolinas (aminoácidos 63 a 97);

c) um domínio central, de ligação sequência-específica ao DNA (aminoácidos 102 a 292),

domínio esse no qual estão localizadas mais de 90% das mutações somáticas e germinativas

“clássicas” já descritas no gene TP53; d) um domínio de oligomerização (aminoácidos 323 a

356), onde está localizada a mutação fundadora Brasileira p.Arg337His, e um domínio C-

terminal envolvido na regulação da ligação ao DNA (aminoácidos 363 a 393) 70–73. Embora a

grande maioria das mutações já descritas no gene TP53 localizem-se entre os exons 5 a 8

(região correpondente ao domínio de ligação ao DNA), recentemente, diversos estudos têm

descrito mutações em outras regiões do gene, como por exemplo no domínio de

oligomerização (tetramerização), as quais também estão associadas ao desenvolvimento

tumoral. No Brasil, uma mutação particular no exon 10 do gene TP53 (situado na região

correspondente ao domínio de oligomerização da proteína), mais precisamente no códon

337 (c.1010G>A, p.Arg337His) vêm sendo descrita em várias famílias aparentemente não-

relacionadas. A mutação foi primeiramente identificada em crianças com carcinoma

adrenocortical da região de Curitiba, Paraná72. Conforme relatado por Ribeiro72 e

colaboradores, não havia qualquer relato de outros tipos de câncer nas 35 famílias das

crianças identificadas com a mutação p.Arg337His, sugerindo dessa forma que essa mutação

fosse tumor-específica, isto é, estivesse relacionada exclusivamente com um aumento no

risco de câncer adrenocortical, sem aumento de risco para outros tumores relacionados a

SLF/LFL72–74.

32

Posteriormente, em estudo realizado por Achatz75 e colaboradores, 45 famílias

brasileiras (das regiões Sul e Sudeste do Brasil) com critérios clínicos para LFL foram testadas

para a presença de mutações germinativas no gene TP53 e, destas, 6 (13,3%) apresentavam

a mutação descrita por Ribeiro. No entanto, diferentemente das famílias analisadas pelo

grupo de Curitiba, nas famílias descritas por Achatz o espectro tumoral referido era variado,

com famílias com e sem a presença de tumores adrenocorticais75.

Posteriormente, estudo realizado por Palmero74 e colaboradores indicou que a frequência

populacional da mutação p.Arg337His na região Sul do Brasil é de 0,3%. Os pesquisadores

analisaram a frequência da mutação em um grupo de 750 mulheres assintomáticas, com

idade entre 40 e 69 anos, que realizavam rastreamento mamográfico e a mesma foi

detectada em 2 das 750 participantes (frequência alélica de 0,0015). Esse dado de

frequência populacional foi corroborado por uma estimativa recente feita em recém-

nascidos do estado do Paraná, região Sul do Brasil, que também aponta para uma frequência

populacional da mutação p.Arg337His de 0,3% 71.

Considerando a elevada frequência dessa mutação nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, a

presença de um efeito fundador foi investigada por vários pesquisadores. Trabalho realizado

por Garritano76 e colaboradores utilizando um painel de 29 Tag SNPs demonstrou que todos

os portadores da mutação p.Arg337His analisados possuíam o mesmo haplótipo, e que a

mutação estava segregando no mesmo alelo. Ainda, conforme os autores, a probabilidade

de que esta mutação tenha surgido de forma independente em todos os casos analisados é

de 3,1x10-9 comprovando desta forma a presença do efeito fundador e provendo um raro

exemplo de persistência de uma mutação deletéria em uma população miscigenada como a

Brasileira76.

1.5.3 Síndrome de Cowden

A síndrome de Cowden é uma doença genética de herança autossômica dominante,

causada por mutações no gene PTEN. O gene PTEN é um supressor tumoral constituído por

9 exons, está localizado no braço longo do cromossomo 10 e codifica para uma tirosina

fosfatase que atua na manutenção do controle de proliferação celular 77.

33

Aproximadamente 30% das mulheres portadoras de mutação no gene PTEN

desenvolvem câncer de mama (risco cumulativo vital de 25 a 50% na segunda década de

vida). Outros tumores frequentemente diagnosticados em mulheres com mutação nesse

gene são: adenocarcinoma de endométrio e carcinomas de tireóide. Além disso há uma

maior predisposição para doenças malignas da tireóide e para lesões cutâneas tais como

triquilemonas, fibromas, papilomas e queratoses. Cerca de 99% dos indivíduos portadores

de mutações germinativas no gene PTEN apresentam alguma manifestação até a terceira

década de vida77,78.

1.5.4 Síndrome de Prediposição Hereditária ao câncer de Mama e câncer Colorretal

A síndrome de predisposição hereditária aos cânceres de mama e cólon foi descrita

por Meijers-Heijboer79 e colaboradores em 2003, e se caracteriza pela presença de uma

deleção de base única no gene CHEK2 na posição 1100delC. Famílias com essa alteração

apresentam uma predisposição aumentada para o desenvolvimento de câncer de mama e

câncer colorretal e essa famílias não apresentam mutações nos genes relacionados a

síndrome de Lynch ou em BRCA1/BRCA279. Estudos descrevem que mulheres portadoras da

mutação CHEK2 1100 delC tem risco duas vezes maior de desenvolver um segundo câncer de

mama e menor tempo de sobrevida livre de recorrência. Além disso a presença dessa

mutação está associada a um risco três a cinco vezes maior para o desenvolvimento de

câncer de mama 79–81.

O gene CHEK2 é um gene supressor de tumor de baixa penetrância composto de 15

éxons localizado no braço longo do cromossomo 22. O CHEK2 codifica uma proteína quinase

envolvida no controle dos pontos de checagem do ciclo celular. A deleção da Citosina na

posição 1100 no exon 10 do gene CHEK2 resulta na introdução de um codon de parada na

posição 380 e consequente perda da atividade quinase da proteína 79–81.

34

1.5.5 Ataxia-Telangiectasia

A Ataxia-Telangiectasia é um doença com padrão de herança autossômico recessivo

caracterizada por ataxia cerebelar na infância associada à coreoatetose, disartria,

anormalidades no movimento ocular, deterioração neurológica progressiva, telangiectasias

faciais e conjuntivais, imunodeficiência e hiperpigmentação da mácula. A síndrome está

associada a mutações no gene ATM. Indivíduos portadores de mutação no gene ATM têm

uma extrema sensibilidade à radiação ionizante, e um consequente aumento no risco de

desenvolvimento de múltiplos tumores, principalmente leucemias e linfomas (80% dos

casos). Outros tumores descritos em associação com a síndrome incluem câncer de mama,

melanoma, meduloblastoma, glioma, meningioma, carcinoma basocelular,

hepatocarcinoma, disgerminoma de ovário e leiomioma uterino. Homens adultos, têm um

aumento de 70% no risco de câncer gástrico. Apesar de ser uma síndrome autossômica

recessiva, mulheres heterozigotas apresentam risco significativamente aumentado para

câncer de mama em relação às homozigotas para o aleno normal82,83.

O gene ATM está localizado no braço longo do cromossomo 11, possui 63 exons e

está envolvido principalmente na resposta celular a danos ao DNA83.

1.5.6 Síndrome de Peutz-Jeghers

A Síndrome de Peutz-Jeghers é caracterizada pela associação de pólipos

gastrointestinais e a presença de pigmentação mucocutânea. Os pólipos hamartomatosos

são mais comuns no intestino delgado, mas também podem ocorrer no estômago e intestino

grosso. A hiperpigmentação mucocutânea apresenta-se como máculas azuladas a castanho

escuro em torno da boca, mucosa oral, olhos, dedos e região perianal84.

A síndrome é transmitida com padrão de herança autossômico dominante e está

associada a mutações germinativas no gene STK11 (LKB1). Portadores de mutações têm um

risco cumulativo vital aumentado para câncer colorretal, gástrico, pancreático, mamário e

ovariano. Os homens podem ocasionalmente desenvolver tumor de células de Sertoli

calcificante, associado a ginecomastia. O diagnóstico é baseado nos achados clínicos.

35

Naqueles com fenótipo clássico, o resultado molecular é positivo para mutações no gene

STK11 em 100% dos casos. Nos casos sem história familiar, mutações são encontradas em

até 90% dos casos84.

O gene STK11 é um supressor tumoral constituído por 10 exons, localizado no braço

curto do cromossomo 19. Codifica uma proteína quinase envolvida em interações entre

proteínas e na apoptose85.

1.5.7 Câncer Gástrico Difuso Hereditário

A síndrome de câncer gástrico difuso hereditário é uma síndrome com padrão de

herança autossômica dominante e está associada a presença de mutações germinativas no

gene CDH1, o qual codifica a molécula de adesão celular E-caderina. Mutações neste gene

têm sido descritas em 30%-50% das famílias com a síndrome. Os critérios para o diagnóstico

clínico foram estabelecidos pelo International Gastric Cancer Consortium. Em indivíduos

afetados, a maioria dos diagnósticos de câncer gástrico é feita antes dos 40 anos de idade. O

risco cumulativo vital de desenvolver esse tumor é de 67% em homens e 83% em mulheres.

Mulheres afetadas têm um risco cumulativo vital de 40% de desenvolver carcinoma lobular

de mama86,87.

O gene CDH1 é um gene supressor tumoral localizado no braço longo do

cromossomo 16 e apresenta 16 exons. A proteína por ele codificada (e-caderina) é uma

glicoproteína de adesão célula-célula que é cálcio-dependente, composta de cinco

repetições caderina extracelulares, uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática

altamente conservada. A perda de função desse gene está relacionada com aumento da

proliferação e invasão celular e metástase88.

1.6 Câncer de Mama Hereditário – Identificação das famílias em risco

A possibilidade de identificar famílias de risco elevado para o desenvolvimento de

câncer torna possível o emprego de uma abordagem preventiva e de detecção precoce do

36

câncer. Os indivíduos considerados de alto risco devem ser encaminhados para o

aconselhamento genético, onde a hipótese diagnóstica pode ser confirmada bem como

informações sobre a doença, sua forma de herança, estratégias de redução de risco e as

chances de recorrência para outros familiares podem ser transmitidas e discutidas.

A identificação de indivíduos/famílias em risco para câncer hereditário é importante

por várias razões. Primeiro, porque indivíduos afetados apresentam RCV muito superior ao

da população para vários tipos de câncer. Segundo, porque outros familiares de um

indivíduo afetado podem estar em risco para o câncer hereditário. Terceiro, porque medidas

de rastreamento intensivo e intervenções preventivas (cirurgias profiláticas e

quimioprofilaxia) se mostram eficazes em reduzir significativamente o risco de câncer em

portadores de mutação. 89–91. No caso da predisposição hereditária ao câncer de mama, que

é uma doença de início na vida adulta, o diagnóstico pré-sintomático de um indivíduo

afetado tem um enorme potencial para redução do risco de câncer. Por outro lado, a

identificação precisa de um indivíduo não-afetado em uma família de risco permite

tranquilizar o indivíduo e elimina os gastos e complicações de rastreamento e intervenções

preventivas desnecessárias92,93.

1.6.1 Identificação das famílias em risco – Modelos epidemiológicos para identificação das famílias em risco

Alguns modelos estatísticos foram criados para estimar o risco de câncer de mama

ao longo da vida e também auxiliar na decisão de medidas de rastreamento e prevenção

primária para pacientes assintomáticos. Para a maioria dos modelos a história familiar de

câncer é o fator mais importante no cálculo desse risco. Alguns modelos levam em

consideração fatores de risco pessoal associados, como Índice de Massa Corporal (IMC),

idade da menarca e menopausa, uso de terapias de reposição hormonal, etnia e patologias

mamárias prévias.

O modelo de GAIL94 é um dos modelos criados para estimar o risco atual (em 5

anos) e o risco cumulativo vital (até 90 anos de idade) de desenvolver câncer de mama,

considerando para isso o número de familiares de primeiro grau diagnosticados com câncer

37

de mama, além de fatores como idade atual da mulher, idade na primeira menstruação,

idade ao nascimento do primeiro filho, realização de biópsias prévias, etnia, história prévia

de carcinomal ductal ou lobular in situ. A exemplo de outros modelos, o modelo de Gail

também apresenta suas limitações, já que considera apenas os casos de câncer de mama em

primeiro grau, enquanto outros tipos de câncer e grau de parentesco são negligenciados.

Além disso a idade ao diagnóstico não é levada em consideração para o cálculo do risco de

desenvolvimento do câncer de mama94,95.

Outro modelo muito utilizado para estimar o risco de desenvolvimento de câncer

de mama ao longo da vida é o modelo de CLAUS96, criado para estimar o risco cumulativo

em diversas faixas etárias, considerando a idade ao diagnóstico e o número de familiares de

primeiro e segundo grau afetados com câncer de mama. O modelo de CLAUS considera de

uma forma mais completa a história familiar, porém, não inclui em sua estimativa de risco a

presença de câncer de mama bilateral, ovário e câncer de mama masculino96.

Além dos modelos para estimativa de risco de desenvolvimento de câncer ao longo

da vida, existe uma série de modelos desenvolvidos para estimativa da probabilidade de

mutação em genes de predisposição hereditária. No caso dos genes BRCA1 e BRCA2, vários

modelos para estimativa da probabilidade de mutação encontram-se disponíveis na

literatura e auxiliam na indicação do teste molecular para confirmação da suspeita clínica.

Dentre os diversos modelos existentes cabe destacar o modelo desenvolvido pela

Universidade da Pensilvânia, chamado de “modelo de Couch” seguido do “Couch

modificado”97,98, o modelo desenvolvido por Shattuck-Eidens ou “Myriad I” 99, e o “Myriad

II”, que é uma extensão do previamente utilizado Myriad I100 . Além disso, existem ainda os

modelos “BRCAPRO”100,101, o “escore de Manchester” desenvolvido por Evans e

colaboradores102–104 e o BOADICEA, proposto por Antoniou e colaboradores105,106. Além da

diversidade de modelos existentes, há também uma grande diversidade no ponto de corte

utilizado pelos diversos centros que realizam os testes genéticos para os genes BRCA1 e

BRCA2, sendo que alguns centros estabelecem como ponto de corte uma probabilidade

mínima de 10% enquanto outros usam um limiar mínimo de 20% como ponto de corte para

selecionar os indivíduos que serão submetidos ao teste genético107,108.

Cada um dos modelos epidemiológicos acima listados apresenta suas vantagens e

limitações determinadas pelo método, tamanho e tipo da população utilizada para criar o

38

modelo. Dentre as limitações encontradas, está o fato de alguns modelos desconsiderarem a

presença de câncer de mama bilateral, ou ainda a presença na família de casos de câncer de

próstata ou pâncreas (no caso das tabelas de prevalência de mutação Myriad, por exemplo),

previamente associados na literatura a mutações em genes BRCA. Essas informações por

outro lado, são incorporadas no cálculo de probabilidade do modelo de Couch modificado

(Penn II). Uma ressalva importante a ser considerada é que também não há nenhum estudo

de validação destes modelos em mulheres brasileira. Para que estes modelos sejam

realmente considerados aplicáveis à nossa população, a qual é altamente miscigenada,

estudos maiores, com avaliação clínica e molecular completa de famílias com critérios

clínicos para a Síndrome de Predisposição Hereditária ao Câncer de Mama e Ovário terão

que ser conduzidos.

Uma dificuldade adicional na estimativa da probabilidade de mutação é a estrutura

familiar limitada de muitos pacientes, com muitos familiares já falecidos há vários anos,

número reduzido de mulheres em algumas gerações e a baixa penetrância dessas alterações

em homens. Estudo realizado por Weitzel109 e colaboradores definiu como tendo estrutura

limitada aquelas famílias com menos de duas mulheres aparentadas em primeiro ou

segundo graus com idade superior a 45 anos em ambas as linhagens, materna e paterna, de

um caso índice. O estudo relatado por Weitzel e colaboradores incluiu análise dos genes

BRCA1 e BRCA2 em 261 mulheres com câncer de mama antes dos 50 anos de idade e sem

história familiar (primeiro e segundo graus) de câncer. Destas, 50% pertenciam a famílias

com estrutura limitada. Alterações germinativas em BRCA1 ou BRCA2 foram detectadas em

13,7% das pacientes provenientes de famílias com estrutura limitada e em 5,2% daquelas

com estrutura adequada. Após comparação da probabilidade de mutação obtida a partir de

diferentes modelos disponíveis na literatura com a taxa de mutações detectada pelo

sequenciamento dos genes, os autores verificaram a insensibilidade dos diferentes modelos

à presença de uma estrutura familiar limitada109.

Outra limitação que concerne à grande maioria dos modelos atualmente disponíveis

para a estimativa da probabilidade de mutação nos genes BRCA refere-se ao fato de que as

características histopatológicas dos tumores BRCA-associados não são levadas em

consideração (o modelo de Manchester foi apenas recentemente revisado para a

39

incorporação dos dados histopatológicos no escore final que fornece a estimativa da

probabilidade de mutação).

1.6.2 Identificação das famílias em risco – Presença de mutações germinativas em genes de predisposição e/ou suscetibilidade ao câncer

Existem, atualmente mais de 30 loci gênicos associados à suscetibilidade ao câncer de

mama. Dentre esses, conforme mencionado previamente, destacam-se os genes supressores

tumorais BRCA1 e BRCA2, os quais conferem aos portadores de alterações germinativas, um

risco extremamente elevado para o desenvolvimento de câncer de mama e ovário20,21,25,110.

Além dos genes BRCA1/BRCA2, outros genes tais como TP53, PTEN, STK11 e CDH1 estão

associados a um alto risco de desenvolvimento de câncer de mama, provavelmente pelo fato

de que, nas síndromes em que estão envolvidos, o tumor de mama faz parte do espectro

tumoral. Além dos genes associados a um risco elevado de desenvolvimento de câncer de

mama, existe um grupo associado a um risco moderado, estando esses genes envolvidos

principalmente em vias de reparo de danos ao DNA, tais como ATM, CHEK2, BRIP1, PALB2,

NBS1, RAD51C. Algumas dessas variantes são bastante comuns, com frequências alélicas de

até 1%. E, por último, existem cerca de 20 genes de baixo risco (RR entre 1,1 e 1,3), cuja

frequência do menor alelo pode ser de até 5%, e que coletivamente ocasionam um pequeno

aumento na suscetibilidade ao câncer de mama111,112.

1.6.3 Identificação das famílias em risco - História Familiar

A história familiar de câncer de mama e ovário aumento o risco para estes tipos de

câncer. Mulheres com pelo menos um familiar de primeiro grau com câncer de mama tem

um risco de 2 a 4 vezes de desenvolver câncer de mama. Fatores como aumento no número

de familiares afetados e idade jovem ao diagnóstico aumentam o risco113.

A identificação de pacientes com risco aumentado começa pela obtenção da histrória

familiar detalhada e precisa, auxliando assim, a determinar o risco113. Pacientes com

40

aumento no risco de câncer de mama por causa da história familiar devem ser informados e

instruídos quanto aos planos de sobrevida. Idealmente, mulheres com história familiar de

câncer de mama e ovário devem ser referidas para aconselhamento genético e se julgadas

apropriadas, deve-se oferecer o teste genético114.

O teste genético muitas vezes começa por uma pessoa afetada, se a mutação é

identificada em uma pessoa afetada, o teste genético para uma mutação específica pode ser

oferecido para outras pessoas da família (baseado em um padrão autossômico dominante os

filhos de um portador terá 50% de chance de portar a mesma mutação)9.

1.6.4 Identificação das famílias em risco – Contribuição das características histopatológicas do tumor

Além da história familiar, características histopatológicas dos tumores estão

intrinsecamente relacionadas com o câncer de mama hereditário. Indivíduos com mutações

germinativas no gene BRCA1 apresentam um excesso de carcinomas mamários ductais do

tipo medular. Em trabalho realizado por Meyer e colaboradores115 o carcinoma do tipo

medular foi avaliado quanto às suas características mamográficas e ultrasonográficas, e os

autores afirmam que, embora o carcinoma medular apresente marcadores biológicos

compatíveis com alta agressividade ele apresenta um prognóstico intermediário e apesar de

raro na população geral, é encontrado com relativa freqüência em pacientes de alto rsico 115.

Além disso, estudo realizado por Young e colaboradores destacou que mulheres com câncer

de mama triplo-negativo (com negatividade para os receptores hormonais estrógeno (ER) e

progesterona (PR), bem como ausência de amplificação do gene HER2) e diagnosticadas em

idade precoce são candidatas a realização do teste genético para BRCA1, mesmo que não

apresentem história familiar de câncer de mama ou ovário116.

De forma similar ao proposto por Young, diversos estudos apontam para um excesso

de tumores triplo-negativos dentre os pacientes com mutações germinativas no gene

BRCA1117,118. Além disso, tumores associados a BRCA1 expressam normalmente um ou mais

dos marcadores “basais” como citoqueratina 5/6 (CK5/6), 14 (CK14), EGFR, SMA, P-caderina,

caveolina 1. Outro marcador associado à presença de mutações germinativas em BRCA1 é o

41

Ki67, que é um marcador de proliferação celular. Estudos sugerem que a presença de um

Ki67 com expressão superior a 25% é um indicativo da presença de mutações germinativas

em BRCA1119.

Através da utilização única e exclusiva de dados histomorfológicos para classificar

tumores, Liderau120 e colaboradores, bem como Chang121 e colaboradores, utilizando como

amostra indivíduos da população em geral com câncer de mama jovem, independentemente

da história familiar, identificaram mutações germinativas em BRCA1 em 29,6% e 25%

respectivamente. No entanto quando dados da história familiar de câncer foram

incorporados aos modelos, a taxa de detecção de mutações aumentou para 53%.

Outro estudo interessante, realizado por Farshid122 e colaboradores demonstrou que,

utilizando apenas dados histopatológicos, independente da informação clínica ou da história

familiar de câncer, conseguiu-se identificar os tumores associados a mutações germinativas

em BRCA1 com uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 86%. Dessa forma pode-

se concluir que as características morfológicas, a tripla negatividade para os receptores

hormonais, assim como um tumor do tipo “basal-like”(estrógeno negativo, progesterona

negativo, HER-2 negativo, receptor de citoqueratina 5/6 e/ou CK14 positivo e/ou EGFR

positivo) são altamente preditivos para a presença de mutações germinativas em BRCA1.

Em consonância com o acima exposto, estudos apontam que, para o caso hipotético

de uma mulher de 30 anos de idade, a probabilidade de possuir uma mutação germinativa

no gene BRCA1 aumenta em 10 vezes se a paciente for triplo-negativa e, além disso,

apresentar positividade para os marcadores CK5/6 e CK14104. Sendo assim, a incorporação

de dados referentes à patologia do tumor do probando ou de membros da família pode

resultar num aumento da capacidade de distinguir entre indivíduos portadores de mutações

germinativas em BRCA1, BRCA2 daqueles com câncer de mama esporádico ou que ocorrem

por alteração em um supostamente existente gene BRCAX, auxiliando dessa forma na

identificação de indivíduos que melhor se beneficiariam do teste genético de predisposição

ao câncer.

Tendo como referência os receptores hormonais ER, PR, HER2, Ki67 e as

citoqueratinas 5/6, 14 ou ainda EGRF, o câncer de mama vêm sendo classificado em cinco

subtipos distintos: 1) luminal A (ER positivo e/ou PR positivo, HER-2 negativo e Ki-67 <14%),

2) luminal B- her-2 negativo (ER positivo e/ou PR positivo, HER-2 negativo e Ki-67 >14%),

42

luminal B- her-2 positivo (ER positivo e/ou PR positivo, HER-2 positivo e qualquer resultado

de Ki-67), 3) HER-2 ou “HER-2 super expresso” (ER negativo, PR negativo, HER-2 positivo), 4)

basal-like (ER negativo, PR negativo, HER-2 negativo, receptor de citoqueratina 5/6 positiva

e/ou CK14 positivo e/ou EGFR positivo)123.

Diferenças clínicas também são observadas entre os diferentes subtipos moleculares

e tem sido descritas na literatura. Em estudo realizado por Carey124 e colaboradores foi

analisada a sobrevida em cinco anos para pacientes apresentando os diferentes subtipos

moleculares e, a taxa de sobrevida das mulheres do subtipo luminal A foi de 65-94%, para as

luminal B 83-92%, para os casos com superexpressão de HER-2 a taxa de sobrevida foi de 39-

71%, e por fim o subtipo basal-like teve taxa de sobrevida de 51-93%. Adicionalmente,

aquelas com câncer de mama do tipo ‘’normal’’ tiveram uma sobrevida entre 44-91%124.

Cabe destacar que aproximadamente 70% dos tumores triplo-negativos são do subtipo

basal-like dentre as mulheres portadoras de mutação em BRCA125.

1.6.5 Identificação das famílias em risco - Polimorfismos: Modificadores Genéticos do Risco de Câncer

Outro fator de risco importante e que merece ser abordado refere-se à presença de

modificadores genéticos do risco de câncer, tais como polimorfismos, os quais quando

associados a um determinado padrão morfológico podem levar a um aumento no risco de

desenvolvimento do câncer de mama. Dados provenientes de um estudo de associação

realizado por Easton126 e colaboradores envolvendo genotipagem em larga escala em 4.398

casos (mulheres com câncer de mama) e 4.316 controles, seguido de uma etapa de

validação que envolveu 21.860 casos e 22.578 controles identificou polimorfismos de base

única (SNPs) em 5 “loci” associados com risco de desenvolvimento de câncer de mama: 1)

rs2981582 no gene FGFR2, o qual codifica para um receptor de tirosina quinase que atua no

desenvolvimento da glândula mamária; 2) rs3803662 localizado numa região contendo

TNRC9 (também conhecido como TOX3); 3) rs889312 localizado numa região contendo

MAP3K1 além de dois genes hipotéticos, o MGC33648 e o MIER3; 4) rs3817198 no gene

LSP1; e, 5) o SNP rs13281615 o qual está situado em uma região que não contém nenhum

43

gene conhecido (8q24), mas na qual já foram detectadas variantes associadas a risco

aumentado para câncer de próstata e câncer colorretal. Os autores puderam correlacionar a

presença de variantes nas regiões supramencionadas a características histopatológicas como

positividade ou negatividade para os receptores hormonais estrógeno e progesterona, grau

de desenvolvimento do tumor, presença de nódulos, tamanho, histologia e estágio ao

diagnóstico. Dentre os 5 SNPs acima referidos, 3 (rs2981582 em FGFR2, rs3803662 em

TNRC9 e rs889312 em MAP3K1) foram significativamente associados a risco aumentado de

câncer de mama em indivíduos receptores de estrógeno. Mulheres homozigotas para o SNP

rs3803662 e tumores estrógeno-negativos apresentavam um risco 1,28 (95%CI = 1.13–1.45)

vezes maior de desenvolver câncer de mama do que mulheres homozigotas para o alelo

“selvagem” presente em 53% dos controles)126,127.

Além disso, trabalho publicado por Gorodnova128 e colaboradores demonstrou

evidência de associação entre os polimorfismos rs2981582 (P=0.02), rs3803662 (P=0.03) e

rs13281615 (P=0.05) e presença de história familiar positiva de câncer de mama, sendo os

alelos variantes mais frequentemente encontrado em mulheres com familiares de primeiro

grau afetados por câncer quando comparados com mulheres com história pessoal de câncer

de mama, porém com ausência de história familiar para câncer. Outro fato interessante

ressaltado pelo mesmo grupo de pesquisadores foi a associação detectada entre a presença

do SNP rs2981582 e frequência de câncer de mama bilateral. As associações encontradas

são de magnitude similar às já descritas para variantes nos genes CHEK2 e ATM.

Mais recentemente uma revisão de literatura envolvendo esses mesmos

polimorfismos foi desenvolvida por Fanale129 e colaboradores, onde, após avaliação de

estudos de associação envolvendo todo o genoma (GWAS) em câncer de mama observaram

que alguns polimorfismos (SNPs) em cinco genes estavam associados ao desenvolvimento de

câncer de mama: TNRC9, FGFR2, MAP3K1, H19 e LSP1. O SNP mais fortemente associado ao

câncer de mama (rs29811582) está localizado no gene FGFR2, que está amplificado ou super

expresso em 5-10% dos casos de câncer de mama. O SNP rs3803662 no gene TNRC9 mostra

uma associação mais forte com câncer de mama, e parece estar correlacionado com a

presença de metástases ósseas. O SNP rs889312 no gene MAP3K1 mostrou uma associação

com o risco aumento de câncer de mama somente em portadores de mutação no gene

BRCA2, não estando associada com um risco aumentado em portadores de mutação em

44

BRCA1. O SNP rs3817198 em LSP1 foi associado com aumento do risco de desenvolvimento

de câncer de mama em portadores de mutação em BRCA2. O estudo destaca, por fim, a

importância da identificação dos polimorfismos e da sua associação com a doença, bem

como o papel que podem desempenhar para uma melhor compreensão do mecanismo

biológico do câncer de mama, o que pode contribuir para uma melhora na prevenção,

detecção e tratamento precoce da doença129.

Tendo em mente os fatores acima expostos, pretendemos, no presente estudo,

avaliar o impacto de uma história familiar positiva para câncer, de fatores

imunohistoquímicos e histopatológicos, bem como a presença de modificadores genéticos do

risco de câncer na identificação de indivíduos com predisposição hereditária ao câncer de

mama por mutações germinativas nos genes BRCA1 e/ou BRCA2.

45

2. Justificativa

Considerando a alta incidência e prevalência do câncer de mama no Brasil, o fato de

que em torno de 10% desses tumores são causados por alterações germinativas em genes de

predisposição hereditária ao câncer e, a importância de identificar esses indivíduos em risco

pelo potencial de prevenção existente, justifica-se a realização do teste genético para a

identificação de mutações germinativas nos genes BRCA1/BRCA2. No entanto, considerando a

complexidade dos genes envolvidos e o alto custo para a realização do teste genético, assim

como o possível impacto psicológico decorrente do teste, o mesmo não pode ser oferecido

sem distinção a todos os indivíduos com história pessoal de câncer de mama ou de ovário.

Dessa forma, o presente estudo pretende realizar uma ampla caracterização de um grupo

amostral em risco para e/ou com câncer de mama hereditário de forma a compreender o

impacto da história familiar de câncer, das características histopatológicas do tumor assim

como de modificadores genéticos do risco de câncer na identificação de pacientes com câncer

de mama hereditário. Acreditamos que o somatório de fatores relacionados à história familiar

de câncer, padrão histopatológico dos tumores e presença de modificadores genéticos do

risco de câncer (polimorfismos) permitirão uma pré-seleção mais acurada de indivíduos que

melhor se beneficiarão do teste genético de predisposição ao câncer.

46

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

Verificar a presença de história familiar positiva de câncer, características

histopatológicas e imunohistoquímicas dos tumores mamários, bem como a presença de

polimorfismos modificadores do risco de câncer de mama e sua associação com a presença

de mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2 em mulheres com câncer de mama

hereditário.

3.2. Objetivos Específicos

I) Caracterizar um grupo de mulheres com câncer de mama hereditário e/ou em

risco para câncer de mama hereditário quanto a fatores de risco para câncer de mama

(história pessoal e familiar de câncer, exposição hormonal) e quanto a probabilidade de

mutação nos genes BRCA1 e BRCA2);

II) Caracterizar o perfil histopatológico e imunohistoquímico (quanto aos receptores

de Estrógeno, Progesterona, HER2, citoqueratina 5/6, citoqueratina 14 e Ki67) em amostras

tumorais emblocadas em parafina, de mulheres com e sem mutação nos genes BRCA1 e

BRCA2;

III) Avaliar a frequência dos polimorfismos rs2981582 no gene FGFR2; rs3803662

localizado numa região contendo TNRC9; rs889312 localizado numa região contendo

MAP3K1; rs3817198 no gene LSP1; e, rs13281615 em mulheres com câncer de mama com e

sem mutação nos genes BRCA1 e BRCA2;

IV) Correlacionar a frequência dos diferentes polimorfismos com o perfil

histopatológico e imunohistoquímico do tumor e com a história familiar de câncer;

V) Estimar o número de indivíduos não-testados para mutações germinativas em

BRCA1/BRCA2 que poderiam se beneficiar do teste pela combinação de seus dados

histopatológicos e da história familiar de câncer.

47

4. Material e Métodos

4.1 Delineamento do Estudo

Parte I: Estudo de coorte retrospectivo de análise de marcadores

imunohistoquímicos em material biológico já existente (blocos de parafina armazenados

junto ao Setor de Anatomia Patológica do Hospital de Câncer de Barretos). Os materiais

biológicos selecionados conforme critérios de inclusão foram alocados aos grupos de

pesquisa, conforme descrito abaixo (item 4.4 Casuística).

Parte II: Estudo de coorte retrospectivo da frequência de polimorfismos genéticos

em material biológico já existente (DNA extraído de sangue periférico e analisado para a

presença de mutações pontuais e rearranjos nos genes BRCA1 e BRCA2 junto ao Centro de

Diagnóstico Molecular do Hospital de Câncer de Barretos). Os materiais biológicos

selecionados conforme critérios de inclusão foram alocados aos grupos de pesquisa,

conforme descrito abaixo (item 4.4 Casuística).

Ainda na parte II do presente estudo, no que concerne às mulheres alocadas ao

Grupo 4 (mulheres com história pessoal de câncer de mama porém que não apresentam

critérios para teste genético), a coleta de material biológico foi feita de forma prospectiva,

após o preenchimento do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para a coleta

de sangue e participação no estudo (Ver anexo 1).

4.2 Critérios de inclusão

História pessoal de câncer de mama;

Ter realizado sessão de aconselhamento genético (grupos 1, 2 e 3) para realização de

teste genético para os genes BRCA1/BRCA2 e assinado TCLE específico do

departamento (anexo 2);

Presença de câncer de mama supostamente esporádico (grupo 4);

48

Voluntariedade em participar do estudo (manifestada através do preenchimento do

TCLE, grupos 1, 2, 3 e 4);

Probabilidade de mutação nos genes BRCA1/BRCA2 (estimada pela tabela de

prevalência de mutação Myriad) <5% (grupo 4);

Ausência de história pessoal e familiar de câncer de ovário (grupo 4);

Ausência de história pessoal e familiar de câncer de mama <40 anos (grupo 4).

4.3 Critérios de exclusão

Pacientes que não possuem bloco de parafina na Instituição ou cujo bloco de

parafina não apresente tecido tumoral, ou ainda aqueles cuja utilização do materail

biológico remanescente possa comprometer futuros testes/retestes diagnósticos;

Pacientes portadoras de mutação germinativa, mas com história pessoal de câncer

de ovário.

4.4 Casuística

Tratam-se de grupos amostrais de conveniência, nos quais o material biológico

(material tumoral emblocado parafina e DNA extraído a partir de sangue periférico) era

proveniente de mulheres com as seguintes características:

Grupo 1: 51 mulheres com história pessoal e familiar de câncer de mama com

mutação germinativa patogênica identificada nos genes BRCA1 e/ou BRCA2;

Grupo 2: 53 mulheres com história pessoal e familiar de câncer de mama com

presença de Variante de Significado Clínico Desconhecido (VUS) identificada nos genes

BRCA1 e/ou BRCA2;

49

Grupo 3: 100 mulheres com história pessoal e familiar de câncer de mama sem

mutação patogênica e/ou de significado clínico desconhecido identificada nos genes BRCA1

e/ou BRCA2;

Grupo 4: 83 mulheres com história pessoal de câncer de mama, não selecionadas

pela história familiar de câncer e que não realizaram o teste genético para análise de

mutações nos genes BRCA1 e/ou BRCA2.

As mulheres pertencentes aos grupos 1, 2 e 3 foram selecionadas junto ao

Departamento de Oncogenética do HCB e enviadas para realização de teste genético

(sequenciamento gênico e MLPA) para os genes BRCA1/BRCA2 devido a uma história pessoal

e/ou familiar sugestiva de síndrome de predisposição hereditária ao câncer de mama e

ovário (HBOC). As mulheres do grupo 4 foram selecionadas junto ao Departamento de

Mastologia como um grupo com câncer de mama supostamente esporádico.

Observação 1: Os critérios utilizados pelo Departamento de Oncogenética do HCB para

indicação do teste genético para BRCA1/BRCA2 são: a) História pessoal de câncer de mama

antes dos 40 anos de idade; b) História pessoal de câncer de ovário em qualquer idade, com

história familiar positiva de câncer; c) Critérios clínicos estabelecidos pela Sociedade

Americana de Oncologia Clínica (ASCO); d) Probabilidade de mutação nos genes

BRCA1/BRCA2 (estimada pelas Tabelas de prevalência de Myriad) superior a 30%.

Observação 2: Para a classificação das variantes germinativas identificadas e subsequente

classificação das pacientes como pertencentes ao grupo 1 ou 2, foram utilizados os seguintes

bancos de dados: BIC (Breast Cancer Information Core), HGMD (Human Genome Mutation

Database), e LOVD IARC (Leiden Open Variation Database). No caso de inconsistências entre

os 3 bancos de dados, as informações constantes no LOVD IARC foram priorizadas, seguidas

daquelas disponíveis no HGMD e, apenas nos casos em que ambos os bancos não

contiverem as informações necessárias foram utilizadas as informações disponíveis no banco

de dados BIC.

Observação 3: Todas as mulheres incluídas no estudo estão (ou estavam) em atendimento

junto ao Hospital de Câncer de Barretos, local onde foi realizado o recrutamento das

mesmas bem como a coleta do material biológico (sangue) que foi utilizado no presente

trabalho (no caso do grupo 4 esse recrutamento e coleta foram realizados de maneira

prospectiva).

50

4.5 Metodologia

4.5.1 Coleta de dados clínicos e de história familiar

A coleta de dados clínicos foi realizada através de revisão de prontuário médico

geral. Os dados referentes à história familiar foram obtidos através de revisão do prontuário

do Departamento de Oncogenética. Todos os dados foram coletados em ficha de coleta

específica para o estudo (anexo 3).

4.5.2. Análises Imunohistoquímicas e moleculares

a) Imunohistoquímica

Inicialmente, as lâminas foram desparafinizadas por incubação em xilol 58°C

durante 10 min; seguido de dois banhos de xilol à temperatura ambiente, um banho em

solução de álcool e xilol na proporção de 1:1, um banho em álcool absoluto e banhos

sequenciais em álcool 95%, 90%, 80%, 70% e 50% e em água corrente para hidratação dos

cortes histológicos. Após estes processos foi feita a recuperação antigênica pelo calor, com

banho de imersão das lâminas em solução tampão Citrato de Sódio 10 mM, pH 6,0, seguido

de resfriamento à temperatura ambiente. A seguir, ocorreu o bloqueio da peroxidase com

Peróxido de Hidrogênio (H2O2) 3%, durante 15 minutos, seguido de lavagem das lâminas

com água destilada e tampão Tris-HCl (50 mM, pH 9,5). A seguir, os cortes histológicos foram

lavados em salina tamponada com fosfatos (PBS 10 mM pH 7,4) durante 30 min à

temperatura ambiente, seguido de bloqueio com solução contendo 20 mM tampão fosfato

de sódio, pH 7,4; 0,45M NaCl; 0,3% Triton X-100 e 5% de leite em pó desnatado, por 4 h, à

temperatura ambiente. Posteriormente, foram lavados em água corrente e incubados com o

anticorpo primário (diluído em albumina bovino, conforme o anticorpo e o título), em

câmara úmida a 4°C overnight na geladeira. No dia seguinte, os cortes foram lavados em

água destilada e incubados com o anticorpo secundário biotinilado (Kit LSAB anti-mouse,

rabbit ou goat) por 30 minutos em temperatura ambiente. Para a revelação das reações,

seguiu-se uma lavagem em solução de PBS, seguida de incubação dos cortes com

51

estreptavidina conjugada por 30 minutos em temperatura ambiente, com posterior lavagem

em solução de PBS seguida de aplicação da DAB líquida (DAKO). Seguiu-se com nova

lavagem em água corrente e com a contracoloração com Hematoxilina de Harris; imersão

das lâminas em água amoniacal (solução de hidróxido de amônio a 0,2%) seguida de nova

lavagem em água corrente e desidratação dos cortes em álcool absoluto, finalizando-se com

imersão das lâminas em Xilol e montagem das lamínulas com Entellan (Merck).

Foram utilizados os seguintes anticorpos:

1) Anticorpo monoclonal contra ERα (clone SP1, Neomarkers (Lab Vision),

Fremont, CA, USA, 1:50);

2) Anticorpo monoclonal contra PgR (clone PgR 636, Dako, Glostrup,

Denmark, 1:50);

3) Anticorpo policlonal contra HER2 (HercepTest™ antibody, Dako,

1:500);

4) Anticorpo monoclonal contra Ki67 (clone MIB-1, Dako, 1:50);

5) Anticorpo monoclonal contra CK5/6 (clone D4/16B4, Zymed

(Invitrogen), Carlsbad, CA, USA, 1:25);

6) Anticorpo monoclonal contra CK14 (1:40, clone LL002, Newcastle

(Tyne), Novocastra, reino Unido).

Observação: A confirmação da qualidade e do diagnóstico anátomo-patológico de

todas as amostras foi realizada por um patologista (CSN) do Departamento de Anatomia

Patológica deste Hospital. Em todos os casos foram utilizadas lâminas cujo percentual de

células tumorais correspondia a pelo menos 60% do total de células.

Classificação: Para as análises das reações imunohistoquímicas realizadas, foram

consideradas as seguintes classificações: Para os receptores de estrógeno (ER), progesterona

(PR), citoqueratina 5/6 (CK56), citoqueratina 14 (CK14) foram consideradas duas categorias

(negativo e positivo). Para o marcador de proliferação celular Ki67, os índices de proliferação

celular foram agrupados em duas categorias <=14% e >14%. Para o receptor de HER2, além

das categorias positivo e negativo, foi considerada uma terceira categoria, denominada

inconclusiva, e para esses casos foi realizada análise de HER-2 por FISH (Hibridização in Situ

52

Fluorescente) utilizando Zytovision Zytolight SPEC Her-2/CEN17 Dual Color Probe (conforme

detalhado abaixo).

Tabela 1: Classificação molecular

Luminal A ER e/ou PR positivos, HER2 negativo e ki-67 <14%

Luminal B1 - HER2 negativo ER e/ou PR positivos, HER2 negativo ki-67 >14%

Luminal B2 - HER2 positivo ER e/ou PR positivos, HER2 positivo, independente do resultado de ki-67

HER2 super expresso ER e PR negativos e HER2 positivo

Basal-like ER/PR/HER2 negativos e uma das citoqueratinas CK5/6 e CK14 positiva

Fonte: Goldhirsch WC 123.

b) FISH

A reação de FISH utiliza recursos moleculares para analisar os cromossomos. Para

essa metodologia foram utilizadas lâminas de 5µm, com região tumoral previamente

marcada, seguida de fixação em estufa a 60°C e posterior desparafinização a 80°C. Após

etapa de preparação da lâmina seguiu-se o protocolo de Hibridização in Situ Fluorescente

para tumores sólidos, que consta de uma primeira etapa de pré hibridização, seguida de

hibridização e por fim a pós hibridização. Ao término da reação é realizada a análise

utilizando o microscópio Nikon ECLIPSE 50i no software Apllied Spectral Imaging FISH View

versão 7.0.

c) Extração de DNA genômico e análise de polimorfismos por sequenciamento

bi-direcional

Os DNAs genômicos extraídos (utilizando o Kit QIAamp Blood DNA Mini-Kit, Qiagen)

e quantificados (NanoDrop) foram analisados quanto à presença dos polimorfismos

rs2981582 no gene FGFR2; rs3803662 localizado numa região contendo TNRC9 (também

conhecido como TOX3); rs889312 localizado numa região contendo MAP3K1; rs3817198 no

gene LSP1; e, rs13281615. Para a análise dos polimorfismos em questão, os fragmentos

contendo as regiões de interesse foram amplificados através da reação em cadeia da

53

polimerase (PCR), na seguinte condição: Denaturação inicial (94°C – 3’), denaturação,

anelamento e extensão (94°C – 1’45’’ / temp. de anelamento (conforme tabela2) – 1’ / 72°C

- 1’) por 35 vezes, e extensão final 72°C – 10’. Todos os fragmentos foram amplificados com

a utilização da enzima Hot Star Taq (Qiagen). Após amplificação seguiu-se purificação dos

produtos com a utilização da enzima ExoSap (USD products) e sequenciamento bi-direcional

utilizando o Kit BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, USA). A eletroforese foi

realizada no sequenciador automatizado modelo 3500 (Applied Biosystems,USA).

Tabela 2: Detalhamento das reações de PCR realizadas.

Polimorfismo Primer Forward Primer Reverse

Tamanho

Fragmento

(Pb)

Temperatura

annealing

(°C)

rs3817198 - LSP1 gcctggagccctgttgcagg tgctagccctgtggtggcca 259 70

rs13281615 gctgttgagccaagtagacccac acctggccaagcctacacttcc 400 65

rs889312 – MAP3K1 gggcctgggtccttagcattcc tgccctgaagtgagtagggctgt 430 65

rs2981582 – FGFR2 caccccacgacagagatgtgt cgccggtgtcacagctttggaa 367 60

rs3803662 – TNRC9 ccttcagcaggaggggcccc ccaaagcaccaactatgaga 238 60

d) Análise de mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2

Embora não faça parte do presente trabalho de uma forma direta (essa análise

molecular é realizada pelo Centro de Diagnóstico Molecular do HCB), a investigação de

mutações e rearranjos nos genes BRCA1/BRCA2 (que nos permitiu a classificação do grupo

amostral em grupos) foi feita da seguinte forma:

Investigação de mutações pontuais e pequenos rearranjos foram realizadas através de

amplificação por PCR Multiplex de todos os exons codificantes dos genes BRCA1 (NCBI;

NM_007294.3) e BRCA2 (NCBI; NM_000059.3) e suas respectivas regiões intrônicas

flanqueadoras imediatamente adjacentes, seguido de sequenciamento bi-direcional,

54

utilizando duas plataformas (sequenciador ABI 3500 XL) e sequenciador de nova geração

(Ion Torrent PGM, Applied Biosystems).

A investigação de grandes rearranjos foi realizada através da técnica de MLPA

(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Para o gene BRCA1 foi utilizado o kit

Salsa MLPA P002 Probemix, sendo que todas as alterações encontradas foram confirmadas

pelo kit Salsa MLPA P087 Probemix. Em relação ao BRCA2 o kit utilizado foi o Salsa MLPA

P045 Probemix e o kit utilizado para confirmação seria o kit Salsa MLPA P077 Probemix

(http://www.mlpa.com), no caso de algum rearranjo em BRCA2 ter sido identificado.

4.6 Armazenamento dos Dados e Análise Estatística

Trata-se de uma amostra de conveniência, onde foram incluídas todas as mulheres

com diagnóstico de câncer de mama testadas para BRCA1 e BRCA2 previamente no Centro

de Diagnóstico Molecular, e, conforme o resultado do teste, as mulheres foram alocadas em

um dos grupos do estudo.

Para armazenamento dos dados e análise estatística foi utilizado o programa SPSS

v.21.0 for Windows (Chicago, IL). As variáveis categóricas foram descritas por frequências

absolutas e frequências relativas percentuais. As correlações foram feitas pelo método do

qui-quadrado e método exato de fishser. O nível de significância considerado em todos os

testes foi de 5%.

Com o intuito de se realizar uma análise de regressão logística múltipla a amostra

foi divida em dois grupos (mutados e não mutados) que compôs a resposta do modelo.

Realizamos então uma análise univariada através do teste Qui-quadrado ou Exato de Fisher

para selecionar as variáveis que foram analisadas conjuntamente, considerando para isso

um nível de significância de 0,2, com o intuito de ter mais chance de selecionar as variáveis

que pudessem ser significativas para o estudo. A análise múltipla foi realizada inicialmente

com todas as variáveis selecionadas na análise univariada e as consideradas não

significativas nessa etapa foram retiradas, uma por vez, do modelo, até obtermos um

resultado onde todas as variáveis foram consideradas significativas a um nível de

significância de 0,05.

55

4.7 Aspectos Éticos

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com número 423/2010.

Todas as pacientes incluídas no estudo preencheram o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido antes da sua inclusão no mesmo (Anexos 1 e 2). Os dados contidos nas fichas de

coleta somente poderão ser utilizados/acessados pelos pesquisadores do estudo e comissão

de ética da Instituição em que se realiza o estudo. O registro dos dados e análise dos

mesmos é de responsabilidade dos investigadores principais e foi realizado exclusivamente

pelos mesmos.

4.8 Uso das Informações e Publicações

Os investigadores do estudo têm absoluta responsabilidade pelos dados obtidos e

os resultados não serão publicados ou fornecidos a terceiros, sem o consentimento por

escrito de todos os investigadores.

56

5. Resultados

5.1 Caracterização Geral da Amostra

No presente estudo foram incluídas 287 mulheres com história pessoal de câncer de

mama, sendo 51 no grupo 1 (30 com história positiva de câncer e presença de mutação

germinativa no gene BRCA1 e 21 com história pessoal e familiar de câncer e mutação no

gene BRCA2), 53 no grupo 2 (com história positiva de câncer, com presença de Variante de

Significado Clínico Desconhecido nos genes BRCA1 e/ou BRCA2), 100 no grupo 3 (com

história positiva de câncer sem mutação germinativa patogênica nos genes BRCA1 e BRCA2).

E, no grupo 4, foram incluídas 83 mulheres com diagnóstico de câncer de mama

(supostamente esporádico) não selecionadas pela história familiar de câncer.

A maioria das mulheres participantes do estudo era procedente do estado de São

Paulo (64,8%). As mulheres em sua maioria eram casadas (64,8%), e não fumantes (80,1%).

Com relação aos fatores de risco (hormonais) para câncer de mama, observamos que 23,6%

das mulheres estavam na menopausa no momento do diagnóstico e 79,4% apresentavam

gestação prévia. Outros dados de caracterização da amostra e dos fatores de risco

associados ao câncer de mama encontram-se detalhados na Tabela 3.

Os dados anátomopatológicos das amostras consideradas no estudo encontram-se

sumarizados na Tabela 4.

57

Tabela 3: Caracterização geral da amostra e fatores de risco.

Variável Total N (%)

Procedência

São Paulo 184 (64,8)

Outros 100 (35,2)

Estado Civil

Solteira 54 (19,2)

Casada 182 (64,8)

Divorciada 31 (11,0)

Viúva 14 (5,0)

Escolaridade

Analfabeto 3 (1,1)

Esino fundamental incompleto 14 (5,1)

Esino fundamental completo 40 (14,4)

Ensino médio incompleto 54 (19,5)

Ensino médio completo 90 (32,5)

Superior completo 76 (27,4)

Sexo

Feminino 287 (100,0)

Masculino 0 (0,0)

Idade da menarca

7 a 11 anos 58 (23,8)

12 a 13 anos 114 (46,7)

>14 72 (29,5)

Idade ao nascimento do promeiro filho

<=20 71 (38,6)

>20 e <=24 52 (28,3)

>24 e <=29 38 (20,7)

>29 23 (12,4)

Fumante

Sim 27 (10,4)

Não 205 (80,2)

Ex-fumante 24 (9,4)

Etilista

Sim 5 (2,0)

Não 249 (98,0)

Menopausa ao diagnóstico

Sim 51 (23,6)

Não 165 (76,4)

Gestação prévia

Sim 201 (79,4)

Não 52 (20,6)

58

Tabela 3 (Cont.): Caracterização geral da amostra e fatores de risco.

Variável Total N (%)

Uso de Anticoncepcional Oral

Sim 128 (54,0)

Não 109 (46,0)

Uso de Terapia de Reposição Hormonal

Sim 27 (11,8)

Não 202 (70,4)

Tabela 4: Características anatomopatológicas relacionadas ao câncer de mama (geral e por

grupo).

Variável Grupo 1 N (%)

Grupo 2 N (%)

Grupo 3 N (%)

Grupo 4 N (%)

Total N (%) P valor *

Grau histológico 0,010

Grau I 1 (2,6) 4 (8,5) 10 (11,9) 6 (8,2) 21 (8,6)

Grau II 21 (53,8) 29 (61,7) 39 (46,4) 49 (67,1) 138 (56,8)

Grau III 17 (43,6) 14 (29,8) 35 (41,7) 18 (24,7) 84 (34,6)

Estadio

T patológico 0,040

T1 14 (28,6) 18 (34,6) 33 (37,1) 29 (39,2) 94 (35,6)

T2 16 (32,7) 15 (28,8) 31 (34,8) 28 (37,8) 90 (34,1)

T3 9 (18,4) 11 (21,2) 15 (16,9) 9 (12,2) 44 (16,7)

T4 10 (20,4) 8 (15,4) 10 (11,2) 8 (10,8) 36 (13,6)

N patológico 0,493

N0 26 (52,0) 25 (48,1) 49 (54,4) 48 (65,8) 148 (55,58)

N1 17 (34,0) 22 (42,3) 26 (28,9) 16 (21,9) 81 (30,6)

N2 4 (8,0) 3 (5,8) 11 (12,2) 6 (8,2) 24 (9,1)

N3 3 (6,0) 2 (3,8) 4 (4,4) 3 (4,1) 12 (4,5)

Metástase 0,105

M0 45 (91,8) 52 (100,0) 86 (95,6) 72 (98,6) 255 (96,6)

M1 4 (8,2) 0 (0,0) 4 (4,4) 1 (1,4) 9 (3,4)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

Quando essa mesma análise é realizada considerando o grupo 1 (com mutação) de

forma separada de acordo com o gene mutado, notamos uma pequena diferença no grau

histológico, onde 56,5% das mulheres mutadas em BRCA1 tinham grau histológico 3 vs 25%

59

das mutadas em BRCA2 (p=0,03). As demais variáveis também foram analisadas da mesma

forma porém nenhuma diferença foi notada.

A maioria dos tumores diagnosticados eram do tipo ductal 236 casos (91,8%),

seguido de carcinoma lobular (10 casos, 3,9%) e carcinoma medular (4 casos, 1,6%). Quando

realizamos uma análise detalhada das mulheres com carcinoma medular observamos que

dentre as 4 mulheres com esse diagnóstico, 2 pertenciam ao grupo 1 (com presença de

mutação germinativa), sendo que uma delas apresentava mutação no gene BRCA1 e outra

no gene BRCA2, 1 mulher no grupo 2 (com VUS - Variante Significado Clínico Desconhecido

no gene BRCA1), e por fim, observamos 1 mulher com esse mesmo diagnóstico no grupo 4.

Em relação a idade ao diagnóstico, no grupo 1 a média de idade foi de 41,88 anos

(desvio padrão 10,5 e mediana de 42 anos, variando de 23 a 67 anos), no grupo 2 a média foi

34,91 anos (desvio padrão: 10 e mediana 32 anos, variando de 16 a 63 anos), no grupo 3 a

média de idade foi 38,37 anos (desvio de 10,8 e mediana de 38, intervalo de 20 a 73 anos)

enquanto no grupo 4 a média de idade ao diagnóstico foi 51,65 anos (desvio padrão de 9,9 e

mediana de 51 anos, intervalo de 32 a 74 anos). Informações adicionais sobre a história

pessoal assim como a familiar de câncer (gerais e por grupo) foram obtidos a partir da

análise dos heredogramas e encontram-se detalhadas na Tabela 5.

60

Tabela 5: Características da história pessoal e familiar de câncer (geral e por grupo).

Variável Grupo 1 N (%)

Grupo 2 N (%)

Grupo 3 N (%)

Grupo 4 N (%)

Total N (%)

P valor*

Idade ao diagnóstico <0,001

≤30 8 (15,7) 24 (44,4) 30 (30,3) 0 (0,0) 62 (21,7)

>30 e ≤50 34 (66,7) 25 (46,3) 56 (56,6) 40 (48,8) 155 (54,2)

>50 9 (17,6) 5 (9,3) 13 (13,1) 42 (51,2) 69 (24,1)

Presença de outros tipos de câncer 0,005

Sim 20 (40,8) 16 (30,2) 28 (29,5) 11 (13,4) 75 (26,9)

Não 29 (59,2) 37 (69,8) 67 (70,5) 71 (86,6) 204 (73,1)

Número de gerações afetadas **(ver

rodapé)

1 9 (17,6) 11 (20,4) 16 (16,2) 45 (62,5) 81 (29,3)

2 20 (39,2) 25 (46,3) 50 (50,5) 24 (33,3) 119 (43,1)

3 19 (37,3) 18 (33,3) 30 (30,3) 3 (4,2) 70 (25,4)

4 3 (5,9) 0 (0,0) 3 (3,0) 0 (0,0) 6 (2,2)

Presença de câncer de mama bilateral (na

família)

<0,001

Não 41 (80,4) 49 (90,7) 95 (95,0) 71 (100,0) 256 (92,8)

Sim 10 (19,6) 5 (9,3) 5 (5,0) 0 (0,0) 20 (7,2)

Presença de câncer de mama masculino (na

família)

0,071

Não 51 (100,0) 52 (96,3) 100 (100,0) 71 (100,0) 274 (99,3)

Sim 0 (0,0) 2 (3,7) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (0,7)

Presença de câncer de de ovário (na família) <0,001

Não 38 (74,5) 50 (92,6) 89 (89,0) 71 (100,0) 248 (89,9)

Sim 13 (25,5) 4 (7,4) 11 (11,0) 0 (0,0) 28 (10,1)

Número de casos de câncer (na família) <0,001

≤3 8 (15,7) 18 (33,3) 40 (40,0) 54 (75,0) 120 (43,3)

>3 43 (84,3) 36 (66,7) 60 (60,0) 18 (25,0) 157

(56,47)

Número de casos de câncer de mama (na

família)

<0,001

≤3 23 (45,1) 44 (81,5) 77 (77,8) 72 (100,0) 216 (78,3)

>3 28 (54,9) 10 (18,5) 22 (22,2) 0 (0,0) 60 (21,7)

Número de óbitos por câncer (na família) <0,001

≤3 32 (62,7) 43 (79,6) 90 (90,9) 69 (97,2) 234 (85,1)

>3 19 (37,3) 11 (20,4) 9 (9,1) 2 (2,8) 41 (14,9)

61

Tabela 5 (Cont.): Características da história pessoal e familiar de câncer (geral e por grupo).

Variável Grupo 1 N (%)

Grupo 2 N (%)

Grupo 3 N (%)

Grupo 4 N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de óbitos por câncer de mama (na

família)

0,004

≤3 46 (90,2) 51 (94,4) 98 (99,0) 71 (100,0) 266 (96,7)

>3 5 (9,8) 3 (5,6) 1 (1,0) 0 (0,0) 9 (3,3)

**Dado o número amostral muito baixo em alguns dos grupos, não foi possível realizar o teste estatístico.

*Qi-quadrado / Exato de Fisher

Nota: Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

Ainda como parte da caracterização geral da amostra, utilizamos diferentes modelos

de estimativa de probabilidade de mutação (nos genes BRCA1/BRCA2). A Tabela 6 mostra

um detalhamento, por grupo, das probabilidades obtidas com a utilização dos modelos de

Myriad (tabelas de prevalência de mutação disponibilizada pelos Laboratórios Myriad),

modelo de Penn II e escore de Manchester. Para os modelos de Myriad e Penn II, as

probabilidades foram agrupadas da seguinte forma: até 10% (probabilidade considerada

baixa), entre 10% e 30% (probabilidade moderada) e acima de 30% (probabilidade alta). Para

o escore de Manchester (que atribui pontos e não percentual) a subdivisão foi: até 10

(probabilidade considerada baixa), entre 10 e 30 pontos (probabilidade moderada) e acima

de 17 pontos (probabilidade alta). Dentre as mulheres do grupo 1 notamos que 82,4%

tinham probabilidade moderada (>10% e <=30%), essa mesma tendência não é vista nos

demais grupos, 44,4%, 49,0% e 0% grupos 2, 3 e 4 respectivamente. O mesmo é notado para

os demais modelos de cálculo de probabilidade.

62

Tabela 6: Probabilidade de mutação dos tumores de mama (por grupo).

Probabilidade de mutação Grupo 1 N (%)

Grupo 2 N (%)

Grupo 3 N (%)

Grupo 4 N (%)

P valor*

Myriad <0,001

<=10% 5 (9,8) 30 (55,6) 49 (49,0) 71 (100,0)

>10% e <=30% 42 (82,4) 24 (44,4) 49 (49,0) 0 (0,0)

>30% 4 (7,8) 0 (0,0) 2 (2,0) 0 (0,0)

PEN II-BRCA1 <0,001

<=10% 30 (58,8) 40 (74,1) 74 (74,0) 71 (100,0)

>10% e <=30% 18 (35,3) 13 (24,1) 25 (25,0) 0 (0,0)

>30% 3 (5,9) 1 (1,9) 1 (1,0) 0 (0,0)

PEN II-BRCA2 0,001

<=10% 46 (90,2) 41 (75,9) 88 (88,0) 70 (98,6)

>10% e <=30% 5 (9,8) 13 (24,1) 12 (12,0) 1 (1,4)

>30% 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Manchester-BRCA1 <0,001

<=10 23 (45,1) 42 (77,8) 79 (79,0) 71 (86,6)

>10 e <=17 18 (35,3) 11 (20,4) 17 (17,0) 0 (0,0)

>17 10 (19,6) 1 (1,8) 4 (4,0) 0 (0,0)

Manchester-BRCA2 <0,001

<=10 24 (47,1) 44 (81,5) 80 (80,0) 71 (100,0)

>10 e <=17 22 (43,1) 9 (16,7) 18 (18,0) 0 (0,0)

>17 5 (9,8) 1 (1,9) 2 (2,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado

Nota: Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

5.2 Caracterização do Perfil Histopatológico e Imunohistoquímico das amostras utilizadas

Como mencionado anteriormente o tipo histológico mais frequente identificado foi o

ductal invasivo. Quanto ao padrão imunohistoquímico, não foi possível fazermos a

caracterização de toda a amostra para todos os marcadores em questão, dada a má

qualidade ou má conservação de alguns blocos, bem como devido ao fato que, para vários

espécimes não havia material tumoral remanescente no bloco de parafina. Dados

anatomopatológicos relacionados aos tumores encontram-se na Tabela 4 acima. Os

resultados das análises imunohistoquímicas dos tumores estão descritos na Tabela 7.

63

Tabela 7: Características imunohistoquímicas dos tumores de mama (por grupo).

Variável Grupo 1

N (%) Grupo 2

N (%) Grupo 3

N (%) Grupo 4

N (%) P valor*

Receptor Estrógeno <0,001

Negativo 28 (58,3) 19 (35,8) 32 (34,8) 19 (23,2)

Positivo 20 (41,7) 34 (64,2) 60 (65,2) 63 (76,8)

Receptor Progesterona 0,020

Negativo 28 (58,3) 18 (34,0) 44 (46,8) 33 (40,2)

Positivo 20 (41,7) 35 (66,0) 50 (53,2) 49 (59,8)

Receptor ErbB (HER2) 0,012

Negativo 42 (89,4) 37 (72,5) 59 (64,8) 63 (76,8)

Positivo 4 (8,5) 14 (27,5) 30 (33,0) 19 (23,2)

Inconclusivo** 1 (2,1) 0 (0,0) 2 (2,2) 0 (0,0)

Triplo Negativas <0,001

Sim 24 (51,1) 7 (13,2) 18 (19,6) 8 (9,8)

Não 23 (48,9) 46 (86,8) 74 (80,4) 74 (90,2)

CK5/6 0,002

Negativo 17 (60,7) 24 (92,3) 40 (74,1) 58 (90,6)

Positivo 11 (39,3) 2 (7,7) 14 (25,9) 6 (9,4)

CK14 0,016

Negativo 22 (71,0) 28 (90,3) 43 (75,4) 59 (81,9)

Positivo 9 (29,0) 3 (9,7) 13 (22,8) 13 (18,1)

Ki67 <0,001

<=14% 3 (8,1) 3 (7,7) 12 (16,0) 23 (31,9)

>14% 34 (91,9) 36 (92,3) 63 (84,0) 49 (68,10)

**Amostras cuja análise por FISH não foi realizada dada ausência de tumor no bloco de parafina.

*Qi quadrado / Exato de Fisher

Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

Como pode ser observado na tabela 7 , existe uma diferença importante no perfil dos

quatro grupos. No grupo constituído pelas mulheres com mutações germinativas nos genes

BRCA1 e BRCA2 há um predomínio de negatividade para os receptores hormonais

ER/PR/HER2, quando comparado às mulheres dos três outros grupos do estudo. Além disso

uma maior positividade para os marcadores CK56 e CK14 pôde ser observada no grupo 1

quando comparado aos demais grupos.

Para as mulheres nas quais os resultados de citoqueratina puderam ser obtidos,

realizamos uma classificação conforme o subtipo molecular do tumor, considerando os

seguintes grupos: Luminal A, Luminal B (HER2 negativo), Luminal B (HER2 positivo), HER2

64

super-expresso e basal-like. A classificação adotada para essa subdivisão encontra-se

descrita na Tabela 1, seção da metodologia item 4.5.2 – a. A tabela 8 apresenta os resultados

dessa análise por grupo amostral.

Tabela 8: Suptipo molecular dos tumores de mama (por grupo).

Variável Grupo 1

N (%)

Grupo 2

N (%)

Grupo 3

N (%)

Grupo 4

N (%) P valor

Subtipo Molecular **

Luminal A 1 (3,3) 1 (2,6) 8 (11,0) 19 (26,0)

Luminal B (Her2 negativo) 16 (53,3) 22 (57,9) 25 (34,2) 31 (42,5)

Luminal B (Her2 positivo) 4 (13,3) 9 (23,7) 19 (26,0) 12 (16,4)

HER2 super expresso 0 (0,0) 5 (13,2) 11 (15,1) 7 (9,6)

Basal like 9 (30,0) 1 (2,6) 10 (13,7) 4 (5,5)

**Dado o número amostral muito baixo em alguns dos grupos, não foi possível realizar o teste estatístico.

Ainda em relação ao subtipo molecular, pudemos observar que o subtipo

predominante em todos os grupos foi o Luminal B sem expressão de HER2. Nos grupos 2 e 3,

o segundo subtipo molecular predominante também foi Luminal B, porém com expressão de

HER2. Nos casos de câncer de mama supostamente esporádicos, o segundo subtipo mais

frequente foi o Luminal A. Por outro lado, um número considerável (30%) de famílias do

grupo 1 (com mutação germinativa nos genes BRCA1/BRCA2) foram classificadas como

sendo basal-like. Dessa forma, estratificamos ainda mais o grupo de mulheres mutadas que

foram classificadas como basal-like e vimos que 88,8% destas mulheres eram portadoras de

mutação germinativa no gene BRCA1 e apenas uma mulher (11,2%) apresentava mutação no

gene BRCA2.

Realizamos, na sequência, uma correlação entre dados da história familiar de câncer

e o subtipo molecular dos tumores. Os resultados dessa correlação estão representados na

Tabela 9.

65

Tabela 9: História familiar de câncer conforme subtipo molecular.

Variável Luminal A

N (%)

Luminal HER2 –

N (%)

Luminal

HER2 +

N (%)

Her-2 expresso N (%)

Basal like N (%)

P valor*

Número de casos de

câncer

0,106

<=3 16 (59,3) 40 (43,5) 20 (47,6) 9 (42,9) 7 (30,4)

>3 11 (40,7) 52 (56,5) 22 (52,4) 12 (57,1) 16 (69,6)

Presenca cancer mama

bilateral

0,020

Sim 0 (0,0) 6 (6,5) 4 (9,5) 2 (9,5) 4 (17,4)

Não 26 (100,0) 86 (93,5) 38 (90,5) 19 (90,5) 19 (82,6)

Presença cancer mama

masculino

0,599

Sim 0(0,0) 1 (1,1) 1 (2,4) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 26 (100,0) 91 (98,9) 41 (97,6) 21 (100,0) 23 (100,0)

Número de gerações com

câncer

**

1 11 (40,7) 27 (29,3) 15(36,6) 6 (28,6) 4 (17,4)

2 13 (48,1) 42 (45,7) 17 (41,5) 9 (42,9) 10 (43,5)

3 3 (11,1) 21 (22,8) 8 (19,5) 5 (23,8) 9 (39,1)

4 0 (0,0) 2 (2,2) 1 (2,4) 1 (4,8) 0 (0,0)

Número de casos cancer

de mama

0,022

<=3 25 (92,6) 73 (79,3) 37 (88,1) 17 (81,0) 16 (69,6)

>3 2 (7,4) 19 (20,7) 5 (11,9) 4 (19,0) 7 (30,4)

Idade ao diagnóstico 0,005

<=30 anos 2 (6,9) 20 (21,3) 11 (25,0) 7 (30,4) 10 (41,7)

>30 e <=50 anos 16 (55,2) 46 (48,9) 26 (59,1) 12 (52,2) 10 (41,7)

>50 anos 11 (37,9) 28 (29,8) 7 (15,9) 4 (17,4) 4 (16,7)

**Dado o número amostral muito baixo em alguns dos grupos, não foi possível realizar o teste estatístico.

*Qi-quadrado / Exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

Quando os dados de subtipo molecular são comparados às informações de história

familiar de câncer, observamos que no subtipo basal-like há uma tendência (embora não

estatisticamente significativa) para número de casos de câncer maior que 3, e presença de

câncer de mama bilateral na família e diagnóstico mais precoce do câncer de mama (mais de

40% dos casos diagnosticados em idade inferior a 30 anos), em contraste com os dados dos

66

casos classificados como luminal A, onde há menor número de casos de câncer em geral e

também número de casos de câncer de mama e nenhum caso de câcer de mama bilateral.

Considerando a provável importância da triplo negatividade dentre as mulheres com

mutação germinativa nos genes BRCA1/BRCA2, analisamos a relação entre a triplo

negatividade e a história familiar de câncer, de forma geral (Tabela 10) e também com as

amostras estratificadas por grupo (Tabela 11).

Tabela 10: Relação entre Triplo Negatividade e história familiar de câncer (geral).

Variável TN Não

N (%)

TN Sim

N (%)

P valor*

Número de casos de câncer 0,016

<=3 100 (47,8) 18 (32,7)

>3 109 (52,2) 37 (67,3)

Presenca câncer mama bilateral 0,123

Sim 14 (6,7) 6 (10,9)

Não 194 (93,3) 49 (89,1)

Presença câncer mama masculino 0,625

Sim 2 (1,0) 0 (0,0)

Não 206 (99,0) 55 (100,0)

Número de gerações com câncer 0,016

1 67 (32,2) 13 (23,6)

2 92 (44,2) 23 (41,8)

3 45 (21,6) 17 (30,9)

4 4 (1,9) 2 (3,6)

Número de casos câncer de mama 0,003

<=3 174 (83,3) 36 (65,5)

>3 35 (16,7) 19 (34,5)

Idade ao diagnóstico 0,052

<=30 anos 45 (20,7) 15 (26,3)

>30 e <=50 anos 116 (53,5) 30 (52,6)

>50 anos 56 (25,8) 12 (21,1)

TN= Triplo Negativas

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

67

Tabela 11: História familiar de câncer conforme status do receptor hormonal para as

mulheres TN (por grupo).

Variável TN não N (%)

TN sim N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,019

<=3 7 (30,4) 1 (4,2)

>3 16 (69,6) 23 (95,8)

Grupo 2 0,277

<=3 15 (32,6) 3 (42,9)

>3 31 (67,4) 4 (51,7)

Grupo 3 0,148

<=3 29 (39,2) 9 (50,0)

>3 45 (60,8) 9 (50,0)

Grupo 4 0,364

<=3 49 (74,2) 5 (83,3)

>3 17 (25,8) 1 (16,7)

Presença câncer mama bilateral

Grupo 1 0,230

Sim 4 (17,4) 6 (25,0)

Não 19 (82,6) 18 (75,0)

Grupo 2 0,478

Sim 5 (10,9) 0 (0,0)

Não 41 (89,1) 7 (100,0)

Grupo 3 0,328

Sim 5 (6,8) 0 (0,0)

Não 69 (93,2) 18 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 65 (100,0) 6 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,057

1 6 (26,1) 2 (8,3)

2 10 (43,5) 10 (41,7)

3 5 (21,7) 11 (45,8)

4 2 (8,7) 1 (4,2)

Grupo 2 0,188

1 9 (19,6) 2 (28,6)

2 21 (45,7) 3 (42,8)

3 16 (34,8) 2 (28,6)

4 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,132

1 12 (16,4) 4 (22,2)

2 38 (52,1) 9 (50,0)

3 21 (28,8) 4 (22,2)

4 2 (2,7) 1 (5,6)

68

Tabela 11 (cont.): História familiar de câncer conforme status do receptor hormonal para as

mulheres TN (por grupo).

Variável TN não N (%)

TN sim N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 4 0,188

1 40 (60,6) 5 (83,3)

2 23 (34,8) 1 (16,7)

3 3 (4,5) 0 (0,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0)

Número de casos câncer de mama

Grupo 1 0,101

<=3 13 (56,5) 9 (37,5)

>3 10 (43,5) 15 (62,5)

Grupo 2 0,254

<=3 39 (84,8) 5 (71,4)

>3 7 (15,2) 2 (28,6)

Grupo 3 0,133

<=3 56 (75,4) 16 (88,9)

>3 18 (24,3) 2 (11,1)

Grupo 4 **

<=3 66 (100,0) 6 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,061

<=30 anos 1 (4,3) 5 (20,8)

>30 e <=50 anos 17 (73,9) 15 (66,7)

>50 anos 5 (21,7) 3 (12,5)

Grupo 2 0,226

<=30 anos 21 (45,7) 3 (42,9)

>30 e <=50 anos 21 (45,7) 3 (42,9)

>50 anos 4 (8,7) 1 (14,3)

Grupo 3 0,128

<=30 anos 23 (31,1) 7 (38,9)

>30 e <=50 anos 40 (54,1) 9 (50,0)

>50 anos 11 (14,9) 2 (11,1)

Grupo 4 0,115

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 38 (51,4) 2 (25,0)

>50 anos 36 (48,6) 6 (75,0)

TN= Triplo Negativas

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4.

* Qi-quadrado / Exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

69

Foi observada uma diferença na história familiar (número de casos com câncer)

quando comparamos as mulheres triplo negativas com as não triplo negativas. Quando as

mulheres foram agrupadas (grupos 1 a 4 conforme status mutacional de BRCA1/BRCA2),

pudemos observar que a diferença deve-se ao grupo 1, no qual 95,8% das mulheres triplo

negativas possuem mais de 3 casos de câncer na família. No que se refere a idade ao

diagnóstico, não estratificadas por grupo, nenhuma diferença foi identificada quando

comparadas as mulheres triplo negativas e não triplo negativas. Adicionalmente, pudemos

observar que, embora não tenha tido significância estatística as mulheres triplo negativas do

grupo 1 apresentam mais casos de câncer de mama e um percentual considerável de casos

com idade inferior a 30 anos de idade (20,8%) dos casos.

Dado que o padrão de positividade/negatvividade dos receptores hormonais do

grupo 1 diferiu bastante daquele observado nos demais grupos, optamos por subdividir o

grupo 1 conforme o gene mutado (BRCA1 ou BRCA2) para analisar o padrão de expressão

desses marcadores nesses dois subgrupos de pacientes (tabela 12).

Tabela 12: Características imunohistoquímicas e subtipo molecular conforme gene mutado.

Variável MUTADA BRCA1

N (%)

MUTADA BRCA2

N (%) Total N (%)

Triplo Negativas 22 (91,6) 2 (8,4) 24 (100,0)

CK5/6 Positivo 8 (72,7) 3 (27,3) 11 (100,0)

CK14 Positivo 8 (88,8)() 1 (11,2) 9 (100,0)

Ki-67 >14% 17 (50,0) 17 (50,0) 34 (100,0)

Subtipo molecular

Luminal A 1 (100,0) 0 (0,0) 1 (100,0)

Luminal B – her2 negativo 4 (25,0) 12 (75,0) 16 (100,0)

Luminal B – her2 positivo 0 (0,0) 4 (100,0) 4 (100,0)

HER2 super expresso 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Basal-like 8 (88,8) 1 (11,2) 9 (100,0)

Quando o grupo 1 (com mutação germinativa) foi estratificado em mutadas BRCA1 e

mutadas BRCA2 observamos que 91,6% das mulheres triplo negativas eram mutadas no

gene BRCA1 e apenas 8,4% no gene BRCA2. Adicionalmente, pudemos observar a diferença

do índice de positividade (elevada) para as citoqueratinas 5/6 e 14 para as mulheres

70

mutadas em BRCA1 versus as mulheres mutadas em BRCA2. Em relação ao subtipo

molecular, a maioria das mutadas em BRCA1 foram classificadas como basal-like, enquanto

que nas mutadas em BRCA2 o subtipo predominate foi o luminal B.

5.3 Frequência dos polimorfismos rs2981582 (gene FGFR2), rs3803662 (região contendo

TNRC9), rs889312 (região contendo MAP3K1), rs3817198 (gene LSP1) e rs13281615

Foram considerados no presente estudo os seguintes polimorfismos: rs2981582 no

gene FGFR2, rs3803662 no gene TNRC9, rs13281615, rs889312 no gene MAP3K1 e

rs3817198 no gene LSP1

A Tabela 13 apresenta a frequência genotípica dos 5 polimorfismos avaliados, bem como a

sua distribuição nos diferentes grupos do presente estudo.

71

Tabela 13: Frequência dos polimorfismos rs3803662 (TNRC9), rs2981582 (FGFR2),

rs13281615, rs889312 (MAP3K1) e rs3817198 (LSP1) por grupo.

Variável Grupo 1

N (%) Grupo 2

N (%) Grupo 3

N (%) Grupo 4

N (%) P valor*

rs3803662 (TNRC9) 0,027

AA 5 (9,8) 12 (22,6) 17 (17,3) 16 (19,5)

AG 27 (52,9) 24 (45,3) 47 (48,0) 37 (45,1)

GG 19 (37,3) 17 (32,1) 34 (34,7) 29 (35,4)

rs2981582 (FGFR2) 0,031

AA 14 (27,5) 9 (16,7) 26 (26,3) 19 (23,2)

AG 22 (43,1) 33 (61,1) 49 (49,5) 43 (52,4)

GG 15 (29,4) 12 (22,2) 24 (24,2) 20 (24,4)

rs13281615 0,029

AA 14 (27,5) 11 (20,4) 27 (27,0) 23 (28,0)

AG 24 (47,1) 26 (48,1) 48 (48,0) 37 (45,1)

GG 13 (25,5) 17 (31,5) 25 (25,0) 22 (26,8)

rs889312 (MAP3K1) 0,029

CC 8 (15,7) 8 (14,8) 11 (11,0) 8 (9,8)

CA 21 (41,2) 20 (37,0) 55 (55,0) 36 (43,9)

AA 22 (43,1) 26 (48,1) 34 (34,0) 38 (46,3)

rs3817198 (LSP1) 0,023

TT 26 (51,0) 28 (51,9) 44 (44,4) 38 (46,3)

TC 22 (43,1) 24 (44,4) 43 (43,4) 38 (46,3)

CC 3 (5,9) 2 (3,7) 12 (12,1) 6 (7,3)

*Qi-quadrado

Nota: Nota: Valores em negrito indicam valores com significancia estatística (p<0,05).

Conforme pode ser observado na tabela acima, o genótipo heterozigoto do SNP

rs3803662 foi mais frequente nos 4 grupos. No grupo 1 pudemos observar uma menor

frequência do homozigoto AA quando comparados aos outros 3 grupos. Em relação ao

polimorfismo rs2981582 no gene FGFR2 observamos uma maior prevalência de

heterozigotos nos quatro grupos analisados, tendência essa também observada no SNP

rs13281615. Ainda em relação ao polimorfismo rs13281615 cabe ressaltar uma maior

frequência do genótipo GG (31,5%) no grupo 2 quando comparado aos outros 3 grupos. Já

em relação ao polimorfismo rs889312 no gene MAP3K1 observamos que grande parte das

72

mulheres dos grupos 1, 2 e 3 (43,1%, 48,1% e 46,3) apresentavam homozigose para o alelo

A, enquanto no grupo 3 a maioria das mulheres apresentavam o genótipo heterozigoto CA

(55%). Por último o polimorfismo rs3817198 no gene LSP1 mostrou a presença do alelo T em

homozigose em mais de 50% das mulheres dos grupos 1 e 2. Já para os grupos 3 e 4 a

presença do alelo T em homozigose esteve presente em 44,4% e 46,3% respectivamente,

sendo que no grupo 3 (WT) houve uma freqüência relativamente aumentada do genótipo

CC.

5.4 Associação entre os polimorfismos rs3803662, rs2981582, rs13281615, rs889312 e

rs3817198 com o perfil histopatológico e imunohistoquímico do tumor e com a história

familiar de câncer

Primeiramente verificamos se havia ou não associação entre os polimorfismos

analisados com o perfil imunohistoquímico dos tumores considerados. Os dados das

correlações com o status dos receptores hormonais (ER/PR e HER2) estão detalhados nas

tabelas 14 a 23.

Tabela 14: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3803662 no gene

TNRC9 e Receptores Hormonais (geral).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno 0,035

Negativo 16 (16,3) 42 (42,9) 40 (40,8) 98 (100,0)

Positivo 33 (18,9) 84 (48,3) 57 (32,8) 174 (100,0)

Progesterona 0,068

Negativo 25 (20,5) 51 (41,8) 46 (37,7) 122 (100,0)

Positivo 24 (15,8) 78 (51,3) 50 (32,9) 152 (100,0)

Her-2 0,037

Negativo 32 (16,0) 98 (49,3) 69 (34,7) 199 (100,0)

Positivo 14 (21,2) 26 (39,4) 26 (39,4) 66 (100,0)

Inconclusivo 3 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (100,0)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

73

Tabela 15: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3803662 no gene

TNRC9 e Receptores Hormonais (por grupo).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno

Grupo 1 0,127

Negativo 3 (10,7) 12 (42,9) 13 (46,4) 28 (100,0)

Positivo 2 (10,0) 12 (60,0) 6 (30,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,138

Negativo 3 (15,8) 10 (52,6) 6 (31,6) 19 (100,0)

Positivo 9 (27,3) 13 (39,4) 11 (33,3) 33 (100,0)

Grupo 3 0,114

Negativo 7 (21,8) 11 (34,3) 14 (43,9) 32 (100,0)

Positivo 9 (15,5) 31 (53,4) 18 (31,1) 58 (100,0)

Grupo 4 0,131

Negativo 3 (15,8) 9 (47,3) 7 (36,9) 19 (100,0)

Positivo 13 (20,6) 28 (44,4) 22 (35,0) 63 (100,0)

Progesterona

Grupo 1 0,165

Negativo 3 (10,8) 13 (46,4) 12 (42,8) 28 (100,0)

Positivo 2 (10,0) 11 (55,0) 7 (35,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,106

Negativo 3 (16,6) 8 (44,5) 7 (38,9) 18 (100,0)

Positivo 9 (26,5) 15 (44,1) 10 (29,4) 34 (100,0)

Grupo 3 0,113

Negativo 10 (23,3) 17 (39,5) 16 (37,2) 43 (100,0)

Positivo 6 (12,2) 28 (57,1) 15 (30,7) 49 (100,0)

Grupo 4 0,075

Negativo 9 (27,3) 13 (39,4) 11 (33,3) 33 (100,0)

Positivo 7 (14,3) 24 (49,0) 18 (36,7) 49 (100,0)

Her-2

Grupo 1 0,191

Negativo 4 (9,6) 22 (52,4) 16 (38,0) 42 (100,0)

Positivo 0 (0,0) 1 (25,0) 3 (75,0) 4 (100,0)

Inconclusivo 1 (0,0) 0 (0,0) (0,0) 1 (100,0)

Grupo 2 0,153

Negativo 8 (21,7) 17 (45,9) 12 (32,4) 37 (100,0)

Positivo 4 (30,7) 5 (38,6) 4 (30,7) 13 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,109

Negativo 11 (19,4) 27 (47,3) 19 (33,3) 57 (100,0)

Positivo 3 (10,0) 15 (50,0) 12 (40,0) 30 (100,0)

Inconclusivo 2 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0)

Grupo 4 0,079

Negativo 9 (14,3) 32 (50,8) 22 (34,9) 63 (100,0)

Positivo 7 (36,9) 5 (26,2) 7 (36,9) 19 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

Nota: Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

74

Tabela 16: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs2981582 no gene

FGFR2 e Receptores Hormonais (geral).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno 0,020

Negativo 20 (20,7) 47 (48,4) 30 (30,9) 97 (100,0)

Positivo 45 (25,4) 94 (53,2) 38 (21,4) 177 (100,0)

Progesterona 0,014

Negativo 22 (18,0) 66 (54,0) 34 (28,0) 122 (100,0)

Positivo 43 (28,0) 76 (49,3) 35 (22,7) 154 (100,0)

Her-2 0,025

Negativo 46 (22,9) 100 (49,7) 55 (27,4) 201 (100,0)

Positivo 18 (27,3) 36 (54,5) 12 (18,2) 66 (100,0)

Inconclusivo 1 (33,4) 2 (66,6) 0 (0,0) 3 (100,0)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

75

Tabela 17: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs2981582 no gene

FGFR2 e Receptores Hormonais (por grupo).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno

Grupo 1 0,114

Negativo 7 (25,0) 12 (42,9) 9 (32,1) 28 (100,0)

Positivo 7 (35,0) 8 (40,0) 5 (25,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,038

Negativo 0 (0,0) 14 (73,7) 5 (26,3) 19 (100,0)

Positivo 9 (26,5) 18 (52,9) 7 (20,6) 34 (100,0)

Grupo 3 0,073

Negativo 8 (25,8) 12 (38,7) 11 (35,5) 31 (100,0)

Positivo 15 (25,0) 34 (56,6) 11 (18,3) 60 (100,0)

Grupo 4 0,149

Negativo 5 (26,3) 9 (20,9) 5 (25,0) 19 (100,0)

Positivo 14 (73,7) 34 (79,2) 15 (75,0) 63 (100,0)

Progesterona

Grupo 1 0,080

Negativo 6 (21,4) 13 (46,4) 9 (32,2) 28 (100,0)

Positivo 8 (40,0) 7 (35,0) 5 (25,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,180

Negativo 1 (5,6) 15 (83,3) 2 (11,1) 18 (100,0)

Positivo 8 (22,9) 17 (48,5) 10 (28,6) 35 (100,0)

Grupo 3 0,025

Negativo 9 (20,9) 19 (44,2) 15 (34,9) 43 (100,0)

Positivo 14 (28,0) 28 (56,0) 8 (16,0) 50 (100,0)

Grupo 4 0,113

Negativo 6 (18,2) 19 (57,6) 8 (24,2) 33 (100,0)

Positivo 13 (26,5) 24 (48,9) 12 (24,6) 49 (100,0)

Her-2

Grupo 1 0,082

Negativo 11 (26,2) 19 (45,2) 12 (28,6) 42 (100,0)

Positivo 2 (50,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 4 (100,0)

Inconclusivo 1 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0)

Grupo 2 0,131

Negativo 6 (16,2) 21 (56,7) 10 (27,1) 37 (100,0)

Positivo 3 (21,4) 9 (64,3) 2 (14,3) 14 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,085

Negativo 16 (27,2) 25 (42,3) 18 (30,5) 59 (100,0)

Positivo 7 (24,1) 18 (62,0) 4 (13,9) 29 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0) 2 (100,0)

Grupo 4 0,134

Negativo 13 (20,7) 35 (55,5) 15 (23,8) 63 (100,0)

Positivo 6 (31,6) 8 (42,1) 5 (26,3) 19 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

76

Tabela 18: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs13281615 e

Receptores Hormonais (geral).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno 0,056

Negativo 26 (26,5) 42 (42,8) 30 (30,7) 98 (100,0)

Positivo 47 (26,5) 86 (48,7) 44 (24,8) 177 (100,0)

Progesterona 0,056

Negativo 36 (29,3) 54 (43,9) 33 (26,8) 123 (100,0)

Positivo 38 (24,7) 74 (48,0) 42 (27,3) 154 (100,0)

Her-2 0,056

Negativo 52 (25,9) 93 (46,2) 56 (27,9) 201 (100,0)

Positivo 17 (25,4) 32 (47,7) 18 (26,9) 67 (100,0)

Inconclusivo 2 (66,6) 1 (33,4) 0 (0,0) 3 (100,0)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

77

Tabela 19: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs13281615 e

Receptores Hormonais (por grupo).

Receptores Hormonais AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno

Grupo 1 0,151

Negativo 7 (25,0) 15 (53,6) 6 (21,4) 28 (100,0)

Positivo 7 (35,0) 6 (30,0) 7 (35,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,121

Negativo 4 (21,0) 7 (36,8) 8 (42,2) 19 (100,0)

Positivo 7 (20,6) 18 (52,9) 9 (26,5) 34 (100,0)

Grupo 3 0,100

Negativo 9 (28,1) 13 (40,6) 10 (31,3) 32 (100,0)

Positivo 16 (26,7) 32 (53,3) 12 (20) 60 (100,0)

Grupo 4 0,138

Negativo 6 (31,6) 7 (36,8) 6 (31,6) 19 (100,0)

Positivo 17 (27,0) 30 (47,6) 16 (25,4) 63 (100,0)

Progesterona

Grupo 1 0,132

Negativo 7 (25,0) 16 (57,1) 5 (17,9) 28 (100,0)

Positivo 7 (35,0) 5 (25,0) 8 (40,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,148

Negativo 4 (22,2) 7 (38,9) 7 (38,9) 18 (100,0)

Positivo 7 (20,0) 18 (51,4) 10 (28,6) 35 (100,0)

Grupo 3 0,102

Negativo 15 (34,1) 17 (38,6) 12 (27,3) 44 (100,0)

Positivo 11 (22,0) 28 (56,0) 11 (22,0) 50 (100,0)

Grupo 4 0,118

Negativo 10 (30,3) 14 (42,4) 9 (27,3) 33 (100,0)

Positivo 13 (26,5) 23 (47,0) 13 (26,5) 49 (100,0)

Her-2

Grupo 1 0,169

Negativo 11 (26,2) 19 (45,2) 12 (28,6) 42 (100,0)

Positivo 2 (50,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 4 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0) 1 (100,0)

Grupo 2 0,117

Negativo 7 (19,0) 20 (54,0) 10 (27,0) 37 (100,0)

Positivo 3 (21,4) 4 (28,6) 7 (50,0) 14 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,030

Negativo 14 (23,7) 29 (49,1) 16 (27,2) 59 (100,0)

Positivo 9 (30,0) 15 (50,0) 6 (20,0) 30 (100,0)

Inconclusivo 2 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0)

Grupo 4 0,127

Negativo 20 (31,7) 25 (39,7) 18 (28,6) 63 (100,0)

Positivo 3 (15,8) 12 (63,1) 4 (21,1) 19 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

78

Tabela 20: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs889312 no gene

MAP3K1 e Receptores Hormonais (geral).

Receptores Hormonais CC

N (%) CA

N (%) AA

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno 0,073

Negativo 13 (13,3) 44 (44,9) 41 (41,8) 98 (100,0)

Positivo 22 (12,4) 81 (45,8) 74 (40,6) 177 (100,0)

Progesterona 0,066

Negativo 12 (9,7) 61 (49,5) 50 (43,1) 123 (100,0)

Positivo 23 (14,9) 65 (42,2) 66 (42,9) 154 (100,0)

Her-2 0,062

Negativo 27 (13,4) 90 (44,7) 84 (41,9) 201 (100,0)

Positivo 7 (10,5) 32 (47,7) 28 (41,8) 67 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 1 (33,3) 2 (66,7) 3 (100,0)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

79

Tabela 21: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs889312 no gene

MAP3K1 e Receptores Hormonais (por grupo).

Receptores Hormonais CC

N (%) CA

N (%) AA

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno

Grupo 1 0,141

Negativo 5 (17,8) 11 (39,2) 12 (43,0) 28 (100,0)

Positivo 3 (15,0) 7 (35,0) 10 (50,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,152

Negativo 3 (15,8) 6 (31,6) 10 (52,6) 19 (100,0)

Positivo 5 (14,7) 13 (38,2) 16 (47,1) 34 (100,0)

Grupo 3 0,136

Negativo 4 (12,5) 18 (56,2) 10 (31,3) 32 (100,0)

Positivo 7 (11,7) 34 (56,7) 19 (31,6) 60 (100,0)

Grupo 4

Negativo 1 (5,2) 9 (47,4) 9 (47,4) 19 (100,0) 0,147

Positivo 7 (11,1) 27 (42,9) 29 (46,0) 63 (100,0)

Progesterona

Grupo 1 0,147

Negativo 4 (14,3) 11 (39,3) 13 (46,4) 28 (100,0)

Positivo 4 (20,0) 7 (35,0) 9 (45,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,122

Negativo 2 (11,1) 6 (33,3) 10 (55,6) 18 (100,0)

Positivo 6 (17,1) 13 (37,1) 16 (45,8) 35 (100,0)

Grupo 3 0,124

Negativo 4 (9,1) 28 (63,6) 12 (27,3) 44 (100,0)

Positivo 7 (14,0) 25 (50,0) 18 (36,0) 50 (100,0)

Grupo 4 0,130

Negativo 2 (6,0) 16 (48,5) 15 (45,5) 33 (100,0)

Positivo 6 (12,2) 20 (40,9) 23 (46,9) 49 (100,0)

Her-2

Grupo 1 0,173

Negativo 8 (19,0) 15 (35,7) 19 (45,3) 42 (100,0)

Positivo 0 (0,0) 3 (75,0) 1 (25,0) 4 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 1 (100,0)

Grupo 2 0,046

Negativo 7 (18,9) 13 (35,1) 17 (46,0) 37 (100,0)

Positivo 0 (0,0) 5 (35,7) 9 (64,3) 14 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,107

Negativo 6 (10,1) 33 (55,9) 20 (34,0) 59 (100,0)

Positivo 5 (16,6) 17 (56,7) 8 (26,7) 30 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 1 (50,0) 1 (50,0) 2 (100,0)

Grupo 4 0,147

Negativo 6 (9,5) 29 (46,0) 28 (44,5) 63 (100,0)

Positivo 2 (10,5) 7 (36,9) 10 (52,6) 19 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

80

Tabela 22: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3817198 no gene

LSP1 e Receptores Hormonais (geral).

Receptores Hormonais TT

N (%) TC

N (%) CC

N (%) Total N (%)

P valor*

Estrógeno 0,042

Negativo 51 (52,6) 40 (41,2) 6 (6,2) 97 (100,0)

Positivo 80 (45,2) 83 (46,9) 14 (7,9) 177 (100,0)

Progesterona 0,077

Negativo 61 (50,0) 50 (41,0) 11 (9,0) 122 (100,0)

Positivo 71 (46,1) 74 (48,1) 9 (5,8) 154 (100,0)

HER-2 0,042

Negativo 98 (48,8) 89 (44,3) 14 (6,9) 201 (100,0)

Positivo 39 (51,4) 31 (40,7) 6 (7,9) 76 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 3 (100) 0 (0,0) 3 (100,0)

*Qi-quadrado

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

81

Tabela 23: Correlação entre frequência dos genótipos do polimorfismo rs3817198 no gene

LSP1 e Receptores Hormonais (por grupo).

Receptores Hormonais TT

N (%) TC

N (%) CC

N (%)

P valor*

Estrógeno

Grupo 1 0,109

Negativo 13 (46,4) 12 (42,9) 3 (10,7) 28 (100,0)

Positivo 11 (55,0) 9 (45,0) 0 (0,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,193

Negativo 10 (52,6) 8 (42,1) 1 (5,3) 19 (100,0)

Positivo 18 (53,0) 15 (44,1) 1 (2,9) 34 (100,0)

Grupo 3 0,007

Negativo 19 (61,3) 11 (35,5) 1 (3,2) 31 (100,0)

Positivo 22 (36,6) 30 (50,0) 8 (13,4) 60 (100,0)

Grupo 4 0,162

Negativo 9 (47,3) 9 (47,3) 1 (5,4) 19 (100,0)

Positivo 29 (46,0) 29 (46,0) 5 (8,0) 63 (100,0)

Progesterona

Grupo 1 0,186

Negativo 14 (50,0) 12 (42,8) 2 (7,2) 28 (100,0)

Positivo 10 (50,0) 9 (45,0) 1 (5,0) 20 (100,0)

Grupo 2 0,171

Negativo 10 (55,5) 8 (44,5) 0 (0,0) 18 (100,0)

Positivo 18 (51,4) 15 (42,8) 2 (5,8) 35 (100,0)

Grupo 3 0,024

Negativo 25 (58,1) 14 (32,6) 4 (9,3) 43 (100,0)

Positivo 13 (28,2) 28 (60,9) 5 (10,9) 46 (100,0)

Grupo 4 0,015

Negativo 12 (36,3) 16 (48,5) 5 (15,2) 33 (100,0)

Positivo 26 (53,1) 22 (44,9) 1 (2,0) 49 (100,0)

Her-2

Grupo 1 0,075

Negativo 22 (52,4) 18 (42,9) 2 (4,7) 42 (100,0)

Positivo 1 (25,0) 2 (50,0) 1 (25,0) 4 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 1 (100) 0 (0,0) 1 (100,0)

Grupo 2 0,201

Negativo 20 (54,0) 15 (40,6) 2 (5,4) 37 (100,0)

Positivo 6 (42,9) 8 (57,1) 0 (0,0) 14 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Grupo 3 0,119

Negativo 26 (44,1) 26 (44,1) 7 (11,8) 59 (100,0)

Positivo 14 (48,3) 13 (44,8) 2 (6,9) 29 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0) 2 (100,0)

Grupo 4 0,098

Negativo 30 (47,6) 30 (47,6) 3 (4,8) 63 (100,0)

Positivo 8 (42,1) 8 (42,1) 3 (15,8) 19 (100,0)

Inconclusivo 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

82

Quando realizamos análise dos diferentes polimorfismos com os receptores

hormonais notamos uma frequência aumentada de heterozigose nos indivíduos com

receptor de estrógeno positivo. No caso do SNP rs3803662 no gene TNRC9, um percentual

considerável dos indivíduos cujo receptor hormonal era negativo apresentava homozigose

para o alelo G. Em relação ao Her-2 a associação foi com a negatividade, sendo que 79,9%

desses casos estavam em heterozigose. Quando a mesma análise é realizada com o SNP

rs2981582 no gene FGFR2, notamos a presença do genótipo hetrozigoto AG em 53,2% dos

casos com receptor de estrógeno positivo. Adicionalmente tanto para estrógeno quanto

para progesterona, notamos um aumento na frequência do alelo A nos casos cujo receptor

ER ou PR eram positivos.

O SNP rs3817198 no gene LSP1 apresentou associação com receptor de estrógeno,

estando o alelo T (em homozigose) mais freqüente nos casos cujo receptor de estrógeno era

negativo e a combinação de ambos os alelos (heterozigose) ocorreu com mais freqüência

nos casos ER positivos. Em relação aos SNPs rs13281615 e rs889312, não encontramos

associação da freqüência dos mesmos com os receptores hormonais considerados.

Quando a análise dos polimorfismos com os receptores hormonais é realizada de

forma separada entre os grupos estudados notamos algumas associações. Em relação ao

SNP rs2981582 no gene FGFR2 notamos associação do grupo 2 com o receptor de estrógeno,

onde a presença de homozigotos AA não foi observada e, heterozigose AG estava presente

em 73,7% dos casos estrógeno negativos. Adicionalmente quando essa mesma análise é

realizada para o SNP rs13281615 observamos uma associação com a negatividade de her-2

no grupo 3, sendo que 49,1%, eram heterozigotos AG. Já para o SNP rs889312 no gene

MAP3K1 a associação com her-2 negativo é vista no grupo 2, 46,0%, dos casos negativos

tinha a presença em homozigose do alelo A. E por fim o SNP rs3817198 no gene LSP1

mostrou associação com receptor de estrógeno no grupo 3, onde 50,0% dos casos estrógeno

positivo eram heterozigotos (TC). Por fim, no caso do SNP rs3803662 no gene TNRC9, a

frequência aumentada do alelo G em homozigose fica mais evidente nos grupos 1 e 3, onde

a maioria dos casos cujo receptor de estrógeno é negativo apresentam genótipo GG;

Na sequência, realizamos uma correlação entre os polimorfismos com as

características da história familiar classicamente associadas à presença de síndromes de

83

predisposição hereditária ao câncer de mama (como idade ao diagnóstico, número de

gerações afetadas, número de casos de câncer, número de casos de câncer de mama,

presença de câncer de mama bilateral, câncer de ovário).

Uma análise dos genótipos versus os receptores hormonais foi realizada

considerando separadamente os indivíduos mutados em BRCA1 com aqueles com mutação

identificada no gene BRCA2, porém nenhuma associação foi observada nessa análise (dados

não mostrados).

A análise da história familiar de câncer com os diferentes polimorfimos estudados

encontra-se detalhada nas tabelas 24 a 28.

84

Tabela 24: Correlação entre frequência do polimorfismo rs3803662 no gene TNRC9 e a

história familiar de câncer (por grupo).

História familiar AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,235

<=3 2 (25,0) 2 (25,0) 4 (50,0) 8 (100,0)

>3 3 (7,0) 25 (58,1) 15 (34,9) 43 (100,0)

Grupo 2 0,149

<=3 6 (33,3) 5 (27,7) 7 (38,9) 18 (100,0)

>3 6 (17,1) 19 (54,3) 10 (28,6) 35 (100,0)

Grupo 3 0,055

<=3 5 (12,8) 18 (46,2) 16 (41,0) 39 (100,0)

>3 12 (20,3) 29 (49,2) 18 (30,5) 59 (100,0)

Grupo 4 0,147

<=3 11 (20,4) 24 (44,4) 19 (35,2) 54 (100,0)

>3 3 (16,6) 10 (55,6) 5 (27,8) 18 (100,0)

Presenca câncer mama bilateral

Grupo 1 0,198

Sim 1 (10,0) 6 (60,0) 3 (30,0) 10 (100,0)

Não 4 (9,8) 21 (51,2) 16 (39,0) 41 (100,0)

Grupo 2 0,234

Sim 2 (40,0) 1 (20,0) 2 (40,0) 5 (100,0)

Não 10 (20,8) 23 (48,0) 15 (31,2) 48 (100,0))

Grupo 3 0,253

Sim 1 (20,0) 2 (40,0) 2 (40,0) 5 (100,0)

Não 16 (17,2) 45 (48,4) 32 (34,4) 93 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 13 (18,3) 34 (47,9) 24 (33,8) 71 (100,0)

Presença câncer ovário

Grupo 1 0,098

Sim 0 (0,0) 7 (53,8) 6 (46,2) 13 (100,0)

Não 5 (13,2) 20 (52,6) 13 (34,2) 38 (100,0)

Grupo 2 0,175

Sim 1 (25,0) 3 (75,5) 0 (0,0) 4 (100,0)

Não 11 (22,5) 21 (42,9) 17 (34,6) 49 (100,0)

Grupo 3 0,122

Sim 3 (27,3) 5 (45,4) 3 (27,3) 11 (100,0)

Não 14 (16,1) 42 (48,3) 31 (35,6) 87 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 13 (18,3) 34 (47,9) 24 (33,8) 71 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,086

1 1 (11,1) 3 (33,3) 5 (55,6) 9 (100,0)

2 4 (20,0) 8 (40,0) 8 (40,0) 20 (100,0)

3 0 (0,0) 13 (68,4) 6 (31,6) 19 (100,0)

4 0 (0,0) 3 (100,0) 0 (0,0) 3 (100,0)

Grupo 2 0,039

1 5 (45,5) 4 (36,4) 2 (18,1) 11 (100,0)

2 4 (16,0) 12 (48,0) 9 (36,0) 25 (100,0)

3 3 (17,7) 8 (47,0) 6 (35,3) 17 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

85

Tabela 24 (Cont.): Correlação entre frequência do polimorfismo rs3803662 no gene TNRC9 e

a história familiar de câncer (por grupo).

História familiar AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 3 0,066

1 2 (12,5) 8 (50,0) 6 (37,5) 16 (100,0)

2 9 (18,0) 24 (48,0) 17 (34,0) 50 (100,0)

3 5 (17,9) 14 (50,0) 9 (32,1) 28 (100,0)

4 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,4) 3 (100,0)

Grupo 4 0,107

1 10 (22,2) 18 (40,0) 17 (37,8) 45 (100,0)

2 3 (12,5) 15 (62,5) 6 (25,0) 24 (100,0)

3 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,4) 3 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Número de casos cancer de mama

Grupo 1 0,089

<=3 3 (13,0) 8 (34,8) 12 (52,2) 23 (100,0)

>3 2 (7,1) 19 (67,9) 7 (25,0) 28 (100,0)

Grupo 2 0,167

<=3 11 (25,6) 18 (41,9) 14 (32,5) 43 (100,0)

>3 1 (10,0) 6 (60,0) 3 (30,0) 10 (100,0)

Grupo 3 0,061

<=3 11 (14,5) 37 (48,7) 28 (36,8) 76 (100,0)

>3 6 (28,6) 9 (42,8) 6 (28,6) 21 (100,0)

Grupo 4 **

<=3 14 (19,4) 34 (47,2) 24 (33,4) 72 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,041

<=30 anos 0 (0,0) 4 (50,0) 4 (50,0) 8 (100,0)

>30 e <=50 anos 4 (11,8) 16 (47,0) 14 (41,2) 34 (100,0)

>50 anos 1 (11,1) 7 (77,8) 1 (11,1) 9 (100,0)

Grupo 2 0,083

<=30 anos 4 (16,7) 14 (58,3) 6 (25,0) 24 (100,0)

>30 e <=50 anos 7 (29,2) 10 (41,6) 7 (29,2) 24 (100,0)

>50 anos 1 (20,0) 0 (0,0) 4 (80,0) 5 (100,0)

Grupo 3 0,004

<=30 anos 3 (10,0) 12 (40,0) 15 (50,0) 30 (100,0)

>30 e <=50 anos 9 (16,6) 28 (51,9) 17 (31,5) 54 (100,0)

>50 anos 4 (30,8) 7 (53,9) 2 (15,3) 13 (100,0)

Grupo 4 0,106

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 10 (25,0) 12 (30,0) 18 (45,0) 40 (100,0)

>50 anos 6 (14,3) 25 (59,5) 11 (26,2) 42 (100,0)

*Qi-quadrado / exato de Fisher

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4 para as variáveis presença de câncer de mama bilateral, presença de câncer de ovário e idade ao dignóstico.

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

86

Tabela 25: Correlação entre frequência do polimorfismo rs2981582 no gene FGFR2 e a

história familiar de câncer (por grupo).

História familiar

AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,074

<=3 2 (25,0) 1 (12,5) 5 (62,5) 8 (100,0)

>3 12 (27,9) 21 (48,8) 10 (23,3) 43 (100,0)

Grupo 2 0,164

<=3 4 (22,2) 10 (55,6) 4 (22,2) 18 (100,0)

>3 5 (13,9) 23 (63,9) 8 (22,2) 36 (100,0)

Grupo 3 0,100

<=3 11 (27,5) 17 (42,5) 12 (30,0) 40 (100,0)

>3 15 (25,4) 32 (54,2) 12 (20,4) 59 (100,0)

Grupo 4 0,144

<=3 15 (27,7) 25 (46,3) 14 (26,0) 54 (100,0)

>3 2 (11,1) 13 (72,2) 3 (16,7) 18 (100,0)

Presenca câncer mama bilateral

Grupo 1 0,111

Sim 3 (30,0) 6 (60,0) 1 (10,0) 10 (100,0)

Não 11 (26,8) 16 (39,0) 14 (34,2) 41 (100,0)

Grupo 2 0,257

Sim 0 (0,0) 4 (80,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Não 9 (18,3) 29 (59,2) 11 (22,5) 49 (100,0)

Grupo 3 0,249

Sim 1 (20,0) 3 (60,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Não 25 (26,6) 46 (48,9) 23 (24,5) 94 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 17 (24,0) 38 (53,5) 16 (22,5) 71 (100,0)

Presença câncer ovário

Grupo 1 0,129

Sim 2 (15,4) 7 (53,9) 4 (30,7) 13 (100,0)

Não 12 (31,6) 15 (39,5) 11 (28,9) 38 (100,0)

Grupo 2 0,269

Sim 0 (0,0) 3 (75,0) 1 (25,0) 4 (100,0)

Não 9 (18,0) 30 (60,0) 11 (22,0) 50 (100,0)

Grupo 3 0,111

Sim 0 (0,0) 8 (80,0) 2 (20,0) 10 (100,0)

Não 26 (29,2) 41 (46,1) 22 (24,7) 89 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 17 (24,0) 38 (53,5) 16 (22,5) 71 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,077

1 2 (22,2) 3 (33,3) 4 (44,5) 9 (100,0)

2 8 (40,0) 6 (30,0) 6 (30,0) 20 (100,0)

3 2 (10,5) 13 (68,4) 4 (21,1) 19 (100,0)

4 2 (66,7) 0 (0,0) 1 (33,3) 3 (100,0)

Grupo 2 0,109

1 1 (9,1) 6 (54,5) 4 (36,4) 11 (100,0)

2 6 (24,0) 15 (60,0) 4 (16,0) 25 (100,0)

3 2 (11,1) 12 (66,6) 4 (22,3) 18 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

87

Tabela 25 (Cont.): Correlação entre frequência do polimorfismo rs2981582 no gene FGFR2 e

a história familiar de câncer (por grupo).

História familiar

AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 3 0,035

1 3 (18,7) 7 (43,8) 6 (37,5) 16 (100,0)

2 14 (8,4) 23 (13,7) 13 (77,9) 50 (100,0)

3 8 (27,6) 17 (58,6) 4 (13,8) 29 (100,0)

4 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,4) 3 (100,0)

Grupo 4 0,025

1 14 (31,1) 22 (48,9) 9 (20,0) 45 (100,0)

2 3 (12,5) 14 (58,3) 7 (29,2) 24 (100,0)

3 0 (0,0) 2 (66,3) 1 (33,4) 3 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Número de casos câncer de mama

Grupo 1 0,063

<=3 6 (26,1) 7 (30,4) 10 (43,5) 23 (100,0)

>3 8 (28,6) 15 (53,6) 5 (17,8) 28 (100,0)

Grupo 2 0,162

<=3 9 (20,5) 25 (56,8) 10 (22,7) 44 (100,0)

>3 0 (0,0) 8 (66,6) 4 (33,4) 10 (100,0)

Grupo 3 0,087

<=3 18 (23,7) 38 (50,0) 20 (26,3) 76 (100,0)

>3 7 (31,8) 11 (50,0) 4 (18,2) 22 (100,0)

Grupo 4 **

<=3 17 (23,6) 38 (52,8) 17 (23,6) 72 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,125

<=30 anos 2 (25,0) 4 (50,0) 2 (25,0) 8 (100,0)

>30 e <=50 anos 10 (29,4) 13 (38,2) 11 (32,4) 34 (100,0)

>50 anos 2 (22,2) 5 (55,6) 2 (22,2) 9 (100,0)

Grupo 2 0,080

<=30 anos 6 (25,0) 12 (50,0) 6 (25,0) 24 (100,0)

>30 e <=50 anos 3 (12,0) 18 (72,0) 4 (16,0) 25 (100,0)

>50 anos 0 (0,0) 3 (60,0) 2 (40,0) 5 (100,0)

Grupo 3 0,085

<=30 anos 10 (33,3) 12 (40,0) 8 (26,7) 30 (100,0)

>30 e <=50 anos 13 (23,2) 31 (55,4) 12 (21,4) 56 (100,0)

>50 anos 3 (25,0) 6 (50,0) 3 (25,0) 12 (100,0)

Grupo 4 0,125

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 10 (25,0) 19 (47,5) 11 (27,5) 40 (100,0)

>50 anos 9 (21,4) 24 (57,1) 9 (21,5) 42 (100,0)

* Qi-quadrado / exato de Fisher

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4 para as variáveis presença de câncer de mama bilateral, presença de câncer de ovário e número de casos de câncer de mama.

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

88

Tabela 26: Correlação entre frequência do polimorfismo rs13281615 e a história familiar de

câncer (por grupo).

História familiar AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,133

<=3 2 (25,0) 6 (75,0) 0 (0,0) 8 (100,0)

>3 12 (27,9) 18 (41,8) 13 (33,3) 43 (100,0)

Grupo 2 0,003

<=3 7 (41,2) 8 (47,0) 2 (11,8) 18 (100,0)

>3 4 (11,1) 17 (47,2) 15 (41,7) 36 (100,0)

Grupo 3 0,039

<=3 12 (30,0) 22 (55,0) 6 (15,0) 40 (100,0)

>3 15 (25,0) 26 (43,3) 19 (31,7) 60 (100,0)

Grupo 4 0,056

<=3 15 (27,8) 27 (50,0) 12 (22,2) 54 (100,0)

>3 3 (16,6) 8 (44,4) 7 (38,8) 18 (100,0)

Presenca câncer mama bilateral

Grupo 1 0,008

Sim 1 (10,0) 3 (30,0) 6 (60,0) 41 (100,0)

Não 13 (31,7) 21 (51,2) 7 (17,1) 10 (100,0)

Grupo 2 0,020

Sim 0 (0,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 5 (100,0)

Não 11 (22,5) 25 (51,0) 13 (26,5) 49 (100,0)

Grupo 3 0,245

Sim 2 (40,0) 1 (20,0) 2 (40,0) 95 (100,0)

Não 25 (26,3) 47 (49,5) 23 (24,2) 5 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 18 (25,3) 34 (47,9) 19 (26,8) 71 (100,0)

Presença câncer ovário

Grupo 1 0,086

Sim 5 (38,5) 6 (46,1) 2 (15,4) 13 (100,0)

Não 9 (23,7) 18 (47,3) 11 (29,0) 38 (100,0)

Grupo 2 0,167

Sim 1 (25,0) 3 (75,0) 0 (0,0) 4 (100,0)

Não 10 (20,0) 23 (46,0) 17 (34,0) 50 (100,0)

Grupo 3 0,130

Sim 5 (45,4) 3 (27,3) 3 (27,3) 11 (100,0)

Não 22 (24,7) 45 (50,6) 22 (24,7) 89 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 18 (25,3) 34 (47,9) 19 (26,8) 71 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,090

1 2 (22,2) 4 (44,5) 3 (33,3) 9 (100,0)

2 3 (15,0) 14 (70,0) 3 (15,0) 20 (100,0))

3 9 (47,4) 5 (26,3) 5 (26,3) 19 (100,0)

4 0 (0,0) 1 (33,3) 2 (66,7) 3 (100,0)

Grupo 2 0,003

1 6 (54,6) 4 (36,3) 1 (9,1) 11 (100,0)

2 3 (12,0) 14 (56,0) 8 (32,0) 25 (100,0)

3 2 (1,2) 8 (44,4) 8 (44,4) 18 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

89

Tabela 26 (Cont.): Correlação entre frequência do polimorfismo rs13281615 e a história

familiar de câncer (por grupo).

História familiar AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 3 0,005

1 6 (37,5) 8 (50,0) 2 (12,5) 16 (100,0)

2 16 (32,0) 23 (46,0) 11 (22,0) 50 (100,0)

3 5 (16,6) 14 (46,7) 11 (36,7) 30 (100,0)

4 0 (0,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (100,0)

Grupo 4 0,033

1 13 (28,9) 24 (53,3) 8 (17,8) 45 (100,0)

2 4 (16,6) 10 (41,7) 10 (41,7) 24 (100,0)

3 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,4) 3 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Número de casos câncer de mama

Grupo 1 0,148

<=3 5 (21,7) 14 (60,9) 4 (17,4) 23 (100,0)

>3 9 (32,1) 10 (35,8) 9 (32,1) 28 (100,0)

Grupo 2 0,130

<=3 10 (22,7) 21 (47,7) 13 (29,6) 44 (100,0)

>3 1 (10,0) 5 (50,0) 4 (40,0) 10 (100,0)

Grupo 3 0,130

<=3 22 (28,6) 35 (45,4) 20 (26,0) 77 (100,0)

>3 5 (22,7) 12 (54,6) 5 (22,7) 22 (100,0)

Grupo 4 **

<=3 18 (25,0) 35 (48,6) 19 (26,4) 72 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,034

<=30 anos 4 (50,0) 4 (50,0) 0 (0,0) 8 (100,0)

>30 e <=50 anos 7 (20,5) 18 (53,0) 9 (26,5) 34 (100,0)

>50 anos 3 (33,3) 2 (22,2) 4 (44,5) 9 (100,0)

Grupo 2 0,097

<=30 anos 8 (33,3) 8 (33,3) 8 (33,4) 24 (100,0)

>30 e <=50 anos 2 (8,0) 15 (60,0) 8 (32,0) 25 (100,0)

>50 anos 1 (20,0) 3 (60,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Grupo 3 0,065

<=30 anos 11 (36,6) 13 (43,4) 6 (20,0) 30 (100,0)

>30 e <=50 anos 13 (23,2) 27 (48,2) 16 (28,6) 56 (100,0)

>50 anos 3 (23,1) 8 (61,5) 2 (15,4) 13 (100,0)

Grupo 4 0,049

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 13 (32,5) 19 (47,5) 8 (20,0) 40 (100,0)

>50 anos 10 (23,8) 18 (42,9) 14 (33,3) 42 (100,0)

* Qi-quadrado / exato de Fisher

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4 para as variáveis presença de câncer de mama bilateral, presença de câncer de ovário e número de casos de câncer de mama.

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

90

Tabela 27: Correlação entre frequência do polimorfismo rs889312 no gene MAP3K1 e a

história familiar de câncer (por grupo).

História familiar CC N (%)

CA N (%)

AA N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,205

<=3 2 (25,0) 2 (25,0) 4 (50,0) 8 (100,0)

>3 6 (14,0) 19 (44,1) 18 (41,9) 43 (100,0)

Grupo 2 0,077

<=3 4 (22,2) 7 (38,9) 7 (38,9) 18 (100,0)

>3 4 (11,1) 13 (36,1) 19 (52,8) 36 (100,0)

Grupo 3 0,109

<=3 5 (12,5) 19 (47,5) 16 (40,0) 40 (100,0)

>3 6 (10,0) 36 (60,0) 18 (30,0) 60 (100,0)

Grupo 4 0,048

<=3 3 (5,6) 24 (44,4) 27 (50,0) 54 (100,0)

>3 3 (16,6) 9 (50,0) 6 (33,4) 18 (100,0)

Presença câncer mama bilateral

Grupo 1 0,079

Sim 2 (20,0) 6 (60,0) 2 (20,0) 10 (100,0)

Não 6 (14,6) 15 (36,6) 20 (48,8) 41 (100,0)

Grupo 2 0,019

Sim 2 (40,0) 3 (60,0) 0 (0,0) 5 (100,0)

Não 6 (12,2) 17 (34,7) 26 (53,1) 49 (100,0)

Grupo 3 0,199

Sim 1 (20,0) 3 (60,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Não 10 (10,5) 52 (54,7) 33 (34,8) 95 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 6 (8,2) 33 (45,2) 34 (46,6) 71 (100,0)

Presença câncer ovário

Grupo 1 0,147

Sim 1 (7,6) 6 (46,2) 6 (46,2) 13 (100,0)

Não 7 (18,4) 15 (39,5) 16 (42,1) 38 (100,0)

Grupo 2 0,164

Sim 0 (0,0) 1 (25,0) 3 (75,0) 4 (100,0)

Não 8 (16,0) 19 (38,0) 23 (46,0) 50 (100,0)

Grupo 3 0,156

Sim 1 (9,0) 5 (45,5) 5 (45,5) 11 (100,0)

Não 10 (11,2) 50 (56,2) 29 (32,6) 89 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 6 (8,4) 33 (46,5) 32 (45,1) 71 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,088

1 0 (0,0) 6 (66,7) 3 (33,3) 9 (100,0)

2 5 (25,0) 4 (20,0) 11 (55,0) 20 (100,0)

3 3 (15,8) 9 (47,3) 7 (36,9) 19 (100,0)

4 0 (0,0) 2 (66,4) 1 (33,3) 3 (100,0)

Grupo 2 0,081

1 3 (27,3) 3 (27,3) 5 (45,4) 11 (100,0)

2 3 (12,0) 10 (40,0) 12 (48,0) 25 (100,0)

3 2 (11,1) 7 (38,9) 9 (50,0) 18 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

91

Tabela 27 (Cont.): Correlação entre frequência do polimorfismo rs889312 no gene MAP3K1

e a história familiar de câncer (por grupo).

História familiar CC N (%)

CA N (%)

AA N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 3 0,023

1 1 (6,3) 9 (56,2) 6 (37,5) 16 (100,0)

2 6 (12,0) 22 (44,0) 22 (44,0) 50 (100,0)

3 4 (13,3) 20 (66,7) 6 (20,0) 30 (100,0)

4 0 (0,0) 3 (100,0) 0 (0,0) 3 (100,0)

Grupo 4 0,031

1 3 (6,7) 18 (40,0) 24 (53,3)

2 2 (8,3) 14 (58,4) 8 (33,3) 45 (100,0)

3 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,4) 24 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (100,0)

Número de casos câncer de mama

Grupo 1 0,103

<=3 5 (21,8) 9 (39,1) 9 (39,1) 23 (100,0)

>3 3 (10,7) 12 (42,8) 13 (46,5) 28 (100,0)

Grupo 2 0,146

<=3 7 (15,9) 17 (38,6) 20 (45,5) 44 (100,0)

>3 1 (10,0) 3 (30,0) 6 (60,0) 10 (100,0)

Grupo 3 0,116

<=3 9 (11,7) 40 (51,9) 28 (36,4) 77 (100,0)

>3 2 (9,1) 15 (68,2) 5 (22,7) 22 (100,0)

Grupo 4 **

<=3 6 (8,4) 33 (45,8) 33 (45,8) 72 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,121

<=30 anos 1 (12,5) 3 (37,5) 4 (50,0) 8 (100,0)

>30 e <=50 anos 6 (17,6) 13 (38,2) 15 (44,2) 34 (100,0)

>50 anos 1 (11,1) 5 (55,5) 3 (33,4) 9 (100,0)

Grupo 2 0,030

<=30 anos 3 (12,5) 7 (29,1) 14 (58,4) 24 (100,0)

>30 e <=50 anos 3 (12,0) 11 (44,0) 11 (44,0) 25 (100,0)

>50 anos 2 (40,0) 2 (40,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Grupo 3 0,085

<=30 anos 5 (16,7) 13 (43,3) 12 (40,0) 30 (100,0)

>30 e <=50 anos 4 (7,1) 34 (60,8) 18 (32,1) 56 (100,0)

>50 anos 2 (15,4) 8 (61,5) 3 (23,1) 13 (100,0)

Grupo 4 0,002

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 1 (2,5) 15 (37,5) 24 (60,0) 40 (100,0)

>50 anos 7 (16,7) 21 (50,0) 14 (33,3) 42 (100,0)

* Qi-quadrado / exato de Fisher

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4 para as variáveis presença de câncer de mama bilateral, presença de câncer de ovário e número de casos de câncer de mama.

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

92

Tabela 28: Correlação entre frequência do polimorfismo rs3817198 no gene LSP1 e a história

familiar de câncer (por grupo).

História familiar TT

N (%)

TC

N (%)

CC

N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de casos de câncer

Grupo 1 0,067

<=3 2 (25,0) 5 (62,5) 1 (12,5) 8 (100,0)

>3 24 (55,9) 17 (39,5) 2 (4,6) 43 (100,0)

Grupo 2 0,196

<=3 10 (55,5) 7 (38,9) 1 (5,5) 18 (100,0)

>3 18 (50,0) 17 (47,2) 1 (2,8) 36 (100,0)

Grupo 3 0,100

<=3 19 (47,5) 13 (32,5) 8 (20,0) 40 (100,0)

>3 25 (42,4) 30 (50,8) 4 (6,8) 59 (100,0)

Grupo 4 0,105

<=3 28 (51,9) 22 (40,7) 4 (7,4) 54 (100,0)

>3 7 (38,9) 9 (50,0) 2 (11,1) 18 (100,0)

Presenca câncer mama bilateral

Grupo 1 0,081

Sim 3 (30,0) 6 (60,0) 1 (10,0) 41 (100,0)

Não 23 (56,1) 16 (39,0) 2 (4,9) 10 (100,0)

Grupo 2 0,292

Sim 2 (40,0) 3 (60,0) 0 (0,0) 5 (100,0)

Não 26 (53,0) 21 (42,9) 2 (4,1) 49 (100,0)

Grupo 3 0,017

Sim 1 (20,0) 1 (20,0) 3 (60,0) 5 (100,0)

Não 43 (45,7) 42 (44,7) 9 (9,6) 94 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 35 (49,3) 30 (42,3) 6 (8,4) 71 (100,0)

Presença câncer ovário

Grupo 1 0,018

Sim 11 (84,6) 1 (7,7) 1 (7,7) 13 (100,0)

Não 15 (39,4) 21 (55,3) 2 (5,3) 38 (100,0)

Grupo 2 0,249

Sim 3 (75,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0)

Não 25 (50,0) 23 (46,0) 2 (4,0) 50 (100,0)

Grupo 3 0,156

Sim 4 (40,0) 4 (40,0) 2 (20,0) 10 (100,0)

Não 40 (45,0) 39 (43,8) 10 (11,2) 89 (100,0)

Grupo 4 **

Sim 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Não 35 (49,3) 30 (42,2) 6 (8,5) 71 (100,0)

Número de gerações com câncer

Grupo 1 0,103

1 6 (66,7) 2 (22,2) 1 (11,1) 9 (100,0)

2 9 (45,0) 10 (50,0) 1 (5,0) 20 (100,0)

3 10 (52,6) 8 (42,1) 1 (5,3) 19 (100,0)

4 1 (33,3) 2 (66,7) 0 (0,0) 3 (100,0)

Grupo 2 0,042

1 4 (36,4) 6 (54,5) 1 (9,1) 11 (100,0)

2 12 (48,0) 13 (52,0) 0 (0,0) 25 (100,0)

3 12 (66,6) 5 (27,8) 1 (5,6) 18 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

93

Tabela 28 (Cont.): Correlação entre frequência do polimorfismo rs3817198 no gene LSP1 e a

história familiar de câncer (por grupo).

História familiar TT

N (%)

TC

N (%)

CC

N (%)

Total N (%)

P valor*

Número de gerações com câncer

Grupo 3 0,007

1 11 (68,8) 5 (31,2) 0 (0,0) 16 (100,0)

2 20 (40,0) 25 (50,0) 5 (10,0) 50 (100,0)

3 11 (37,9) 11 (37,9) 7 (24,2) 29 (100,0)

4 1 (33,3) 2 (66,7) 0 (0,0) 3 (100,0)

Grupo 4 0,020

1 25 (55,5) 17 (37,8) 3 (6,7) 45 (100,0)

2 10 (41,7) 12 (50,0) 2 (8,3) 24 (100,0)

3 0 (0,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (100,0)

4 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Número de casos cancer de mama

Grupo 1 0,175

<=3 13 (56,5) 8 (34,8) 2 (8,7) 23 (100,0)

>3 13 (46,4) 14 (50,0) 1 (3,6) 28 (100,0)

Grupo 2 0,195

<=3 21 (47,7) 22 (50,0) 1 (2,3) 44 (100,0)

>3 7 (70,0) 2 (20,0) 1 (10,0) 10 (100,0)

Grupo 3 0,124

<=3 36 (47,3) 31 (40,8) 9 (11,9) 76 (100,0)

>3 8 (36,4) 12 (54,5) 2 (9,1) 22 (100,0)

Grupo 4 **

<=3 35 (48,6) 31 (43,0) 6 (8,4) 72 (100,0)

>3 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Idade ao diagnóstico

Grupo 1 0,100

<=30 anos 6 (75,0) 1 (12,5) 1 (12,5) 8 (100,0)

>30 e <=50 anos 16 (47,0) 17 (50,0) 1 (3,0) 34 (100,0)

>50 anos 4 (44,4) 4 (44,4) 1 (11,2) 9 (100,0)

Grupo 2 0,109

<=30 anos 10 (41,7) 13 (54,1) 1 (4,2) 24 (100,0)

>30 e <=50 anos 15 (60,0) 10 (40,0) 0 (0,0) 25 (100,0)

>50 anos 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Grupo 3 0,085

<=30 anos 17 (56,7) 11 (36,7) 2 (6,6) 30 (100,0)

>30 e <=50 anos 20 (35,7) 27 (48,2) 9 (16,1) 56 (100,0)

>50 anos 7 (58,3) 5 (41,7) 0 (0,0) 12 (100,0)

Grupo 4 0,120

<=30 anos 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

>30 e <=50 anos 17 (42,5) 20 (50,0) 3 (7,5) 40 (100,0)

>50 anos 21 (50,0) 18 (42,9) 3 (7,1) 42 (100,0)

* Qi-quadrado / exato de Fisher

**Não foi possível realizar a análise comparativa no grupo 4 para as variáveis presença de câncer de mama bilateral, presença de câncer de ovário e número de casos de câncer de mama.

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,05).

94

Quando a comparação entre os diferentes genótipos é realizada contra

características da história familiar de câncer, observamos pelo menos uma associação para

todos os SNPs avaliados no presente estudo. Para o SNP rs3803662 no gene TNRC9

associações foram encontradas com número de gerações afetadas com câncer e idade ao

diagnóstico. Notamos que 45,5% das mulheres do grupo 2 com apenas uma geração afetada

com câncer eram do genótipo AA, sendo que para todos os demais grupos e variáveis o

genótipo predominate foi o AG. No que se refere à idade ao diagnóstico, notamos que 50,0%

das mulheres do grupo 1 e grupo 3 apresentavam homozigose para o alelo G, e, a proporção

de homozigose para esse alelo vai diminuindo à medida em que a idade ao diagnóstico

aumenta (presente em 41,2% daquelas com diagnóstico entre 30 e 50 anos e em 11,1%

daquelas diagnosticadas após os 50 anos de idade).

Quando a comparação da história familiar é feita com o SNP rs2981582 (no gene

FGFR2) embora o dado não tenha apresentado significância estatística, observamos que

mulheres do grupo 1 com genótipo GG apresentavam um menor número de casos de câncer

(62,5% com menos de 3 casos de câncer na família) e menor número de casos de câncer de

mama (43,5% relataram a existência de menos de 3 casos de câncer de mama na família).

Em relação ao SNP rs13281615 uma associação foi encontrada com a presença de

câncer de mama bilateral, sendo que 60,0% dos casos do grupo 1 com câncer de mama

bilateral apresentavam genótipo GG (versus 17,1% ds casos sem história familiar de câncer

de mama bilateral). O mesmo se repetiu nos grupos 2 e 3 (80% de GG nas mulheres com

mama bilateral do grupo 2 vs 26,5% naquelas sem mama bilateral e, no grupo 3 a diferença

foi de 40% para 24,2%). Em relação ao número de casos de câncer observamos que o

genótipo homozigoto G estava presente em 41,7% das famílias do grupo 1 com mais de 3

casos de câncer, em 31,7% e em 38,8% das famílias dos grupos 2 e 3 respectivamente que

apresentavam mais de 3 casos de câncer nas suas famílias. Adicionalmente, embora trate-se

de um número amostral reduzido, cabe destacar que 66,7% das mulheres do grupo 1 com 4

gerações afetadas eram homozigotas GG, ocorrendo uma tendência a um aumento na

freqüência de homozigotas GG à medida em que aumenta o número de gerações afetadas

por câncer. No caso do polimorfismo rs889312 (gene MAP3K1), chamou a nossa atenção o

fato de que a medida em que a idade ao diagnóstico aumenta, diminui a freqüência de

homozigotos para o alelo A nos 4 grupos considerados.

95

No polimorfismo rs3817198 no gene LSP1 notamos a mesma tendência: uma

pequena associação com o número de gerações afetadas com câncer para os grupos 2, 3 e 4.

E a presença de câncer de mama bilateral foi observada no grupo 3 em 60,0% dos casos com

genótipo CC. Já o câncer de ovário esteve presente em 84,6% do grupo 1 com genótipo TT

normal.

Adicionalmente, a comparação da frequência dos diferentes genótipos versus a

história familiar foi realizada considerando separadamente as mulheres com mutação no

gene BRCA1 versus as mutadas no gene BRCA2. Dado o número amostral restrito de

pacientes com mutação deletéria identificada nesses genes, a estratificação em grupos por

gene mutado limitou as análises estatísticas a serem realizadas, no entanto algumas

tendências puderam ser observadas, onde destaca-se o fato de que todas as mulheres

mutadas no gene BRCA2 com câncer de mama bilateral eram homozigotas para o alelo G no

rs132281615 e, dentre as mutadas em BRCA1 e com câncer de mama bilateral, 86%

apresentavam pelo menos um alelo G. Adicionalmente, em relação ao rs3817198, todas as

mulheres com mutação no gene BRCA1 e com câncer de ovário apresentavam pelo menos

um alelo T, (sendo 88,9% homozigotas TT), o mesmo não foi observado para as mutadas em

BRCA2 e com história pessoal de câncer de ovário (p=0,006). No entanto para que

conclusões possam ser realizadas acerca da associação desses polimorfismos com o status

mutacional de BRCA1/2 e com a história familiar de câncer, um número maior de pacientes

com essas características precisa ser genotipado.

Embora esses achados possam ser ocasionais e devidos ao pequeno número amostral

analisado, vários achados merecem destaque e necessitam ser validados em um número

amostral maior, como por exemplo a associação identificada entre o SNP rs13281615 e

achados da história familiar, tais como presença de câncer de mama bilateral, idade ao

diagnóstico e número de casos de câncer presentes na família. Cabe ressaltar que, embora

interessantes e promissores, tratam-se de achados preliminares que necessitam de

confirmações e validações posteriores.

96

5.5 Identificação de indivíduos não-testados para mutações germinativas em BRCA1/2 que

poderiam se beneficiar do teste pela combinação de seus dados histopatológicos e dos

diferentes polimorfismos analisados

Para que os indivíduos não-testados, mas em risco para câncer hereditário, pudessem

ser identificados era necessário que as características que distinguem os grupos (mutados e

não mutados) fossem identificadas. Para tanto realizamos, inicialmente, uma comparação da

história familiar e das características histopatológicas e imunohistoquímicas do grupo 1

versus os grupos 2, 3 e 4. Os resultados dessas comparações encontram-se detalhados nas

tabelas 29 e 30.

97

Tabela 29: Características de história familiar do grupo 1 versus os grupos 2, 3 e 4.

Variável (Grupo 1) Grupo 2 P valor Grupo 3 P valor Grupo 4 P valor

Presença de câncer de mama

bilateral 0,130 0,005 <0,001

Sim 9,3 5,0 0

Não 90,7 95,0 100,0

Presença de câncer de mama

masculino * * *

Sim 0 0 0

Não 100 100 100

Presença de câncer de ovário 0,012 0,021 <0,001

Sim 7,4 11,0 0

Não 92,6 89,0 100

Número de gerações afetadas

com câncer 0,331 0,558 <0,001

1 20,4 16,2 62,5

2 46,3 50,5 33,3

3 33,3 30,3 4,2

4 0 3,0 0

Numero de casos de câncer de

mama <0,001 <0,001 <0,001

<=3 81,5 77,8 100,0

>3 18,5 22,8 0,0

Total de casos de câncer 0,036 0,002 <0,001

<=3 33,3 40,0 75,0

>3 66,7 60,0 25,0

Número de óbitos por câncer de

mama 0,480 0,018 0,011

<=3 94,4 99,0 100

>3 5,6 1,0 0

Total de óbitos por câncer 0,83 <0,001 <0,001

<=3 70,6 90,9 97,2

>3 20,4 9,1 2,8

Idade ao diagnóstico 0,005 0,144 <0,001

<=30 44,4 30,3 0,0

>30 e <=50 46,3 56,6 48,8

>50 9,3 13,1 51,2

*Análise de comparação com correção de Bonferroni

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,02).

98

Tabela 30: Características histopatológicas e imunohistoquímicas do grupo 1 versus os

grupos 2, 3 e 4.

Variável (Grupo 1) Grupo 2 (%) P valor Grupo 3 (%) P valor Grupo4 (%) P valor

Local do tumor 0,619 0,664 0,379

Unilateral 94,4 96,0 100,0

Bilateral 5,6 4,0 0,0

Anatomopatológico 0,317 1,0 1,0

Carcinoma ductal invasivo 85,1 94,4 92,1

Outros 14,9 5,6 7,9

Grau histológico 0,309 0,263 0,090

1 8,5 11,9 8,2

2 61,7 46,4 67,1

3 29,8 41,7 24,7

Receptor de estrógeno 0,024 0,008 <0,001

Negativo 35,8 34,8 23,2

Positivo 64,2 65,2 76,8

Receptor de progesterona 0,014 0,194 0,046

Negativo 34,0 46,8 40,2

Positivo 66,0 53,2 59,8

Her – 2 0,019 0,004 0,030

Negativo 72,5 64,8 76,8

Positivo 27,5 33,0 23,2

Duvidoso 2,2 0,0

Ki-67 1,000 0,378 0,006

<=14 7,7 16,0 31,9

>14 92,3 84,0 68,1

Citoqueratina 5/6 0,007 0,213 0,001

Negativo 92,3 74,1 90,6

Positivo 7,7 25,9 9,4

Citoqueratina 14 0,054 0,748 0,212

Negativo 90,3 76,8 81,9

Positivo 9,7 23,2 18,1

Triplo negativo <0,001 <0,001 <0,001

Sim 13,2 19,6 9,8

Não 86,8 80,4 90,2

Subtipo Molecular 0,004 0,013 0,001

Luminal A 2,6 11,0 26,0

Luminal Her 2 negativo 57,9 34,2 42,5

Luminal Her2 positivo 23,7 26,0 16,4

Basal like 2,6 13,7 5,5

Her 2 superexpresso 13,2 15,1 9,6

*Análise de comparação com correção de Bonferroni

Nota: Valores em negrito indicam valores com significância estatística (p<0,02).

99

Na sequência uma analíse multivariada foi realizada, onde o grupo mutado foi

comparado com os três outros grupos (agrupados sob a classificação de “não-mutados”)

quanto a todas as variáveis presentes nas tabelas 29 e 30 acima. Com essa análise múltipla

pudemos identificar quais características diferiam entre os dois grupos e o “peso” que cada

uma dessas características conferia para a chance de “ser portador de mutação germinativa

nos genes BRCA1/BRCA2’’.

Dentre as variáveis analisadas, as que apresentaram resultados estatisticamente

significativos e que merecem destaque dada sua relação com a presença de mutação

germinativa deletéria nos genes BRCA1/BRCA2 são: triplo negatividade (risco aumentado

(odds ratio) em 5,883 vezes (IC 95%, 2,562 a 13,510, p<0,001); presença na família de câncer

de mama bilateral: aumento no risco de 5,797 vezes (IC 95%, 1,797 a 18,701, p=0,003),

número de casos de câncer de mama: risco aumentado de 5,033 vezes (IC 95%, 2,149 a

11,788, p<0,001), presença de câncer de ovário: risco de 4,412 vezes (IC 95%, 1,531 a

12,716, p=0,006), total de óbitos por câncer: risco de 2,906 vezes (IC 95%, 1,077 a 7,840,

p=0,035).

Considerando as variáveis que se destacaram como relacionadas a um aumento na

chance de possuir mutação germinativa deletéria nos genes BRCA1/BRCA2, analisamos de

forma criteriosa, dentre as mulheres do grupo 4 (não testadas para BRCA1/BRCA2) para

verificar se haveria alguma que, mesmo não tendo preenchido os critérios para teste

genético estabelecidos pelo Departamento de Oncogenética do HCB (probabilidade de

mutação pelas tabelas de prevalência de mutação Myriad superior a 30%, preenchimento de

um ou mais dos critérios clínicos preconizados pela ASCO, além de história pessoal de câncer

de mama em idade inferior a 40 anos e história pessoal ou familiar de câncer de ovário)

possuía um risco aumentado de câncer de mama e/ou ovário hereditários. Dessa forma,

através dessa análise dos heredogramas e laudos anátomo patológicos , identificamos 8

mulheres cujo tumor era triplo negativo. Ao analisar o heredograma dessas 8 famílias

notamos que uma delas apresentava um segundo fator de risco (além da triplo

negatividade), que é a presença de mais de 3 casos de câncer na família. Casos como esse

devem ser encaminhados para a Oncogenética para avaliação de risco genético, dada a

combinação de dados histopatológicos e de história familiar que apresentam.

100

Cabe dessa forma destacar a importância de considerar, para a identificação de

pacientes em risco, não apenas a idade ao diagnóstico, mas outros fatores, tais como

presença de triplo negatividade no tumor, presença de câncer de mama bilateral, associação

de história familiar de câncer de mama e de ovário, múltiplos casos e óbitos na família de

uma mesma patologia (no caso o câncer de mama), de forma a identificar e acompanhar

corretamente as famílias em risco para câncer hereditário.

101

6. Discussão

O presente estudo foi realizado com o objetivo de caracterizar a história familiar de

câncer, as características histopatológicas e imunohistoquímicas dos tumores mamários,

bem como a presença de polimorfismos modificadores do risco de câncer de mama e avaliar

a associação destas variáveis com a presença de mutação germinativa nos genes BRCA1 ou

BRCA2 em mulheres com câncer de mama hereditário.

6.1 Caracterização Geral:

6.1.1 Grupo amostral

Foram incluídas no estudo 287 mulheres com câncer de mama e divididas em 4

grupos como descrito previamente na metodologia. Todas as participantes do estudo foram

tratadas no Hospital de Câncer de Barretos, e em sua maioria eram provenientes do estado

de São Paulo (64,8%). Essa divisão em 4 grupos foi feita no intuito de identificar

características da história familiar, histopatológicas, imunohistoquímicas e relacionadas a

modificadores de risco como polimorfismos, que poderiam estar associadas com a presença

de mutação germinativa deletéria nos genes BRCA1/BRCA2, e que dessa forma poderiam

auxiliar na identificação de indivíduos/famílias em risco para câncer de mama hereditário.

Dentre as 287 mulheres incluídas, 83 foram recrutadas junto ao Departamento de

Mastologia e não foram selecionadas pela história familiar, tendo um papel de grupo

comparativo, cujas características refletiriam padrões frequentes nos tumores de mama

esporádicos. Na verdade, além de não terem sido selecionadas para história familiar, todas

aquelas famílias que, após a confecção do heredograma, preenchiam critérios para HBOC

(seja através de critérios clínicos ASCO, seja pelas tabelas de prevalência myriad, ou ainda

pela simples presença de casos de câncer de ovário, câncer de mama jovem, câncer de

mama masculino) foram excluídas do estudo ou inclusas em um dos outros três grupos caso

viessem a passar pelo Departamento de Oncogenética e fossem referenciadas para

102

realização do teste genético. Nesse caso o grupo para o qual seriam alocadas dependeria do

resultado da análise mutacional de BRCA1 e BRCA2.

No que se refere às demais 204 participantes do estudo, todas foram encaminhadas

pelo Departamento de Oncogenética da Instituição para realização de teste genético para

BRCA1/BRCA2, devido a uma história pessoal e/ou familiar sugestiva de câncer de mama

hereditário. Dados que os critérios utilizados pela clínica são variados (critérios ASCO, myriad

superior a 20%/30%, ou ainda a simples presença de um caso de câncer de ovário, ou um

caso de câncer de mama jovem), a frequência de mutações identificada não foi tão elevada

como seria esperado, já que esta está diretamente relacionada ao rigor dos critérios

utilizados para indicação do teste, e, quanto mais sugestiva for a história familiar, somada a

uma idade jovem e ainda aliada a uma histopatologia sugestiva de hereditariedade, maior a

chance de que a família seja portadora de uma mutação germinativa patogênica (conforme

pode ser observado nos resultados obtidos no presente trabalho).

6.1.2 Características dos tumores

Com relação aos dados anatomopatológicos e aos receptores hormonais, tivemos

uma perda considerável, já que vários pacientes haviam realizado a cirurgia em outras

Instituições e, em consequência não havia material biológico disponível para análise e, em

muitos casos, nem o laudo anátomo-patológico constava no prontuário médico da paciente.

Adicionalmente, vários blocos de parafina apresentavam má qualidade de material ou ainda

má conservação, e em vários espécimes não havia material tumoral remanescente no bloco

de parafina.

O tipo histológico mais frequente diagnosticado entre as mulheres foi o ductal

invasivo (84,4%). Diferentemente do esperado, mesmo para as mulheres com mutação

germinativa identificada, a presença de carcinoma medular foi baixa (1,6%). Em trabalho

realizado pelo grupo CIMBA, no qual foram analisados 4.325 portadores de mutações em

BRCA1 e 2.568 em BRCA2, encontrou-se uma frequência de 9,4% de tumores medulares

dentre os casos mutados em BRCA1 e, 2,2% dentre os mutados em BRCA2130.

103

No que se refere ao grau histológico, observamos em todos os grupos que a maioria

dos tumores apresentava grau II. No entanto, nos grupos 1 (mulheres mutadas) e 3

(mulheres testadas WT para os genes BRCA1/BRCA2) um número grande de casos

apresentava grau III (43,6% e 41,7% do total de cada grupo respectivamente). Conforme

resultados publicados pelo CIMBA no estudo supracitado, 77% das mulheres com mutações

em BRCA1 apresentavam grau III bem como 50% das mutadas em BRCA2130. No presente

estudo, quando estratificadas conforme o gene mutado, 56,5% das mulheres cujo gene

alterado era o BRCA1 apresentavam grau III e 25% das mutadas em BRCA2.

Em relação aos receptores hormonais ER, PR e HER2, observamos que a maioria dos

tumores do grupo 1 eram negativos para estrógeno e progesterona, diferentemente dos

demais grupos, onde a positividade de ambos os receptores prevaleceu. No caso de HER2 a

maior parte das pacientes (independentemente de grupo) apresentava resultados negativos

de expressão. Adicionalmente, conforme esperado, a maioria dos casos triplo negativos

estavam no grupo 1, ou seja, nos indivíduos com mutação germinativa nos genes

BRCA1/BRCA2 (51,1%). No grupo cujos pacientes apresentavam variantes de significado

clínico desconhecido o percentual de triplo negatividade foi levemente superior ao do grupo

supostamente esporádico (13,2% de TN no grupo das mulheres com VUS e 9,8% naquelas

não selecionadas para história familiar e não testadas para mutações nos genes

BRCA1/BRCA2). Nas mulheres testadas negativas o percentual de TN foi de 19,6% .

Quando estratificamos as mulheres mutadas conforme o gene alterado, observamos

que 75,9% das mulheres com tumores triplo negativos eram portadoras de mutação em

BRCA1, enquanto que apenas 11,1% eram mutadas em BRCA2, dados esses que corroboram

achados prévios da literatura, que apontam uma maior incidência de triplo negatividade

naquelas mulheres cuja mutação deletéria afeta o gene BRCA1.

Em estudo realizado por Young e colaboradores o câncer de mama triplo negativo

também foi associado à presença de mutações em BRCA1. Os pesquisadores analisaram 54

mulheres com pouca ou nenhuma história familiar de câncer de mama ou ovário e com

história pessoal de câncer de mama triplo negativo diagnosticado antes do 40 anos de idade.

Essas mulheres foram encaminhadas para teste genético, e, 5 delas apresentaram mutações

deletérias em BRCA1 e apenas uma em BRCA2. Os autores destacam que mulheres com

104

câncer de mama triplo negativo diagnosticados em idade jovem devem ser candidatas à

realização do teste genético em BRCA1, mesmo com ausência de história familiar de câncer

de mama e ovário 116.

Estudo realizado por Mavaddat130 e colaboradores (grupo CIMBA) encontrou uma

frequência de 69% de triplo negativas dentre 3.797 portadores de mutações em BRCA1 e de

16% dentre 2.392 mutados em BRCA2 analisados. Em estudo publicado por Carraro20 e

colaboradores a frequência de triplo negativas dentre as mutadas em BRCA1 foi de 50% (em

mulheres com câncer de mama em idade jovem não selecionadas para história familiar) e,

esse percentual aumentou para 83% naqueles casos com diagnóstico jovem e história

familiar positiva20. Achados semelhantes foram vistos em outro trabalho que avaliou os

casos de câncer de mama triplo negativo em idade jovem, realizado por Robertson131 e

colaboradores. Foram selecionados para o estudo 308 indivíduos com câncer de mama triplo

negativo, desse total dois grupos foram criados, o primeiro composto por 159 indivíduos não

selecionados por idade ou história familiar e o segundo composto por 149 indivíduos

selecionados por idade jovem ao diagnóstico ou presença de alguma história familiar

positiva de câncer. Do total de indivíduos testados 45 mutações foram detectadas em

BRCA1. O estudo evidenciou que indivíduos com câncer de mama triplo negativo

diagnosticado antes dos 50 anos tem uma probabilidade superior a 10% de ser portador de

mutação em BRCA1, e, com base nesses dados, o estudo conclui que mulheres com câncer

de mama triplo negativo e idade jovem ao diagnóstico são candidatas à realização do teste

genético em BRCA1131.

Similarmente aos estudos acima destacados, em nosso estudo também observamos

uma associação entre triplo negatividade e história familiar de câncer. Ao compararmos a

variável triplo negatividade com a história familiar de câncer notamos que 95,8% das

mulheres com câncer de mama triplo negativo do grupo 1 tinham mais de 3 casos de câncer

na família. Quando a mesma comparação é realizada independentemente de grupo,

observamos que 67,3% das mulheres triplo negativas possuíam mais de 3 casos de câncer na

família e 34,5% apresentam 3 ou mais gerações afetadas por câncer. Quando apenas o

câncer de mama é considerado, verificamos que 34,5% das triplo negativas apresentam 3 ou

mais casos de câncer de mama na família, versus 16,7% das não triplo negativas.

105

Para os casos em que o resultado da imunohistoquímica pôde ser obtido, realizamos

uma classificação do subtipo molecular conforme classificação descrita por Goldhirsch 123 e

detalhada na seção de metodologia (item 4.5.2 - A) do presente trabalho. Os dados obtidos

dessa análise mostraram que 30% das mulheres com mutação germinativa nos genes BRCA1

ou BRCA2 foram classificadas como basal-like, o que é uma fração reduzida quando

comparado ao descrito na literatura. Em trabalho publicado por Andrés e colaboradores 92

pacientes foram testados e classificados quanto ao subtipo molecular. Dentre os pacientes

testados, 7 apresentavam mutações deletérias nos genes BRCA1/BRCA2 (7,6%). Do total de

pacientes com mutação 4 eram do tipo basal-like (57,1%)132.

No entanto, ao dividirmos as mulheres do grupo 1 conforme o gene mutado,

observamos que 88,8% das mulheres com o gene BRCA1 mutado possuíam tumor do tipo

basal-like versus 11,2% daquelas mutadas no gene BRCA2.

Quando comparamos o subtipo molecular com a história familiar de câncer

observamos uma associação do subtipo luminal B (subtipo molecular mais comum nas

mulheres com o gene BRCA2 alterado) com presença de mais de 3 casos de câncer na

família. A mesma tendência foi notada no subtipo her2-superexpresso e luminal A. Por outro

lado, o subtipo basal-like mostrou uma considerável associação com a presença de câncer de

mama bilateral (presente em 17,4% das pacientes com câncer de mama do tipo basal-like),

com presença de mais de 3 casos de câncer de mama na família e, um número expressivo de

indivíduos classificados como basal like tiveram idade ao diagnóstico inferior a 30 anos

(41,7% dos casos), em contraste com os casos classificados como Luminal A, onde uma

grande parcela dos casos foram diagnosticados em idade superior a 50 anos (37,9%).

Similarmente ao nosso estudo, em trabalho realizado por Turkoz 125 e colaboradores foram

avaliados alguns fatores de risco para câncer de mama e sua associação com os diferentes

subtipos moleculares. Esse trabalho envolveu 1.884 casos com câncer de mama e avaliou a

história familiar de câncer. De forma semelhante aos nossos achados, o estudo mostrou que

a idade ao diagnóstico >40 anos pareceu ser um fator de risco para o subtipo luminal A.

Além da idade ao diagnóstico o estudo de Turkoz avaliou outras variáveis relacionadas a

história familiar, porém nenhuma diferença significativa entre os subtipos e história familiar

foi identificada. O estudo destaca também uma limitação (a qual compartilhamos no

presente estudo), acerca da classificação do subtipo molecular basal-like, visto que não foi

106

possível obter resultado de citoqueratina para todos pacientes avaliados, dado que a mesma

não é realizada de maneira rotineira nos casos de câncer de mama na grande maioria dos

serviços de patologia.

6.1.3 História pessoal e familiar de câncer

Além de uma caracterização dos dados tumorais do nosso grupo amostral, revisamos

criteriosamente os heredogramas das famílias incluídas no estudo. Ao compararmos a

história familiar das mulheres alocadas para os grupos 2 e 3 versus aquelas do grupo 1,

observamos que nos dois grupos supramencionados (2 e 3) há uma parcela

significativamente elevada de casos de câncer de mama em idade jovem (inferior a 30 anos

de idade). Uma das possíveis explicações para a não detecção de mutações em um grupo

supostamente em risco está no fato de muitas dessas famílias terem sido referidas para

teste genético por apresentarem história pessoal de câncer de mama jovem, porém sem

história familiar “significativa” de câncer de mama e/ou ovário, o que, aparentemente, não é

um indicador “per si” da presença de mutações germinativas nos genes BRCA. Esse fato pode

ser constatado quando observamos a média de idade ao diagnóstico dos grupos analisados

no presente estudo: enquanto que no grupo 1 a média de idade ao diagnóstico foi de 41,88

anos, no grupo 2 foi de 34,91 e para o grupo 3 a média de idade foi de 38,37 anos. Em

contrapartida, quando a variável em questão é o número de casos de câncer de mama,

54,9% das mulheres do grupo 1 apresentam mais de 3 casos na sua família versus 18,5% e

22,3% nos grupos 2 e 3 respectivamente.

Adicionalmente, notamos que 86,6% das mulheres do grupo 4 não tinham presença

de outros tipos de câncer na família, enquanto que uma história familiar de outros tumores

(excetuando mama) estava presente em 40,8% das famílias do grupo 1. Cabe ainda destacar

que a presença de câncer de mama bilateral e câncer de ovário se constituíram em

características que diferenciaram o grupo 1 dos demais, estando presente em 19,6% e 25,5%

das mulheres do grupo 1 respectivamente, e em menos de 10% (no caso do câncer de mama

bilateral) ou de 15% (no caso do câncer de ovário) das mulheres pertencentes aos demais

grupos.

107

Os dados da história pessoal e familiar de câncer foram utilizados para o cálculo da

probabilidade de mutação nessas famílias. Para isso, conforme detalhado previamente,

diferentes modelos foram utilizados. No que se refere aos dados obtidos a partir das tabelas

de prevalência de mutação Myriad, quando comparamos as mulheres do grupo 1 com as

demais, observamos que a maioria daquelas com mutação identificada nos genes

BRCA1/BRCA2 (82,4%) tinham probabilidade de mutação entre 10% e 30%, o que era

esperado, já que tratam-se de famílias que comprovadamente possuem uma mutação

patogênica segregando nos genes considerados pelo modelo em questão. Pudemos observar

ainda a diversidade existente entre os modelos o que deve ser uma conseqüência das

variáveis que cada um deles considera para o cálculo da probabilidade de mutação bem

como os tipos de escore aplicados para o cálculo da probabilidade final (no caso dos

modelos de Manchester e Penn II), sendo que para ambos os modelos, em todos os grupos

(inclusive no grupo 1) a maioria das participantes foi classificada como risco baixo (inferior a

10% ou a 10 pontos, no caso do Manchester), o que indica uma tendência desses modelos

para subestimar a probabilidade real de mutação, reforçando mais uma vez a necessidade

da utilização concomitante de mais de um modelo quando esse for um critério para seleção

de famílias para realização do teste genético.

A possibilidade de que outros genes possam ser a causa da história familiar de câncer

nos grupos 2 e 3 deve ser cuidadosamente analisada. Sabe-se hoje que os genes BRCA1 e

BRCA2 respondem apenas por uma parcela do total de casos de câncer de mama e ovário

hereditários e diversos esforços vêm sendo realizados por pesquisadores do mundo inteiro

na tentativa de identificar outro(s) genes relacionados a esse tipo de neoplasia. Mutações no

gene BRIP1 (FANCJ) e PALB2 (FANCN) estão associadas a um risco cumulativo vital de câncer

de mama de 20% a 50%. Além disso, a presença de mutações germinativas nos genes TP53,

ATM, PTEN, STK11, CDH1, CHEK2, RAD51C estão associados a um risco moderado a alto de

desenvolvimento de câncer de mama69,87,133–139. Diversos estudos vêm publicando a

utilização de painéis gênicos para investigação da presença de mutações patogênicas em

outros genes que não BRCA em famílias com HBOC. Trabalho publicado por Walsh25 em 2011

selecionou para investigação 273 mulheres com carcinoma de ovário, 48 com carcinoma de

peritônio, 31 com câncer de tuba uterina e 8 com carcinoma de endométrio. Todos os casos

foram selecionados no momento do diagnóstico e não por idade ou histórico familiar. Os

108

carcinomas primários foram relacionados com a presença de mutação, sendo que mais de

30% dos casos com mutação não tinham presença de história familiar de câncer de mama e

ovário. O estudo mostra a importância da realização do teste genético em outros genes além

dos genes BRCA1 e BRCA2 25.

Estudo recentemente realizado por Silva e colaboradores com 120 pacientes com

critério para Síndrome de Predisposição ao câncer de Mama e Ovário Hereditários (HBOC),

investigou a presença de mutação nos genes BRCA1/2, TP53, CHEK2 1100delC, e,

adicionalmente, analisou a presença de variações no número de cópias em 14 genes de

suscetibilidade ao câncer de mama (PTEN, ATM, NBN, Rad50, Rad51, BRIP1, PALB2, MLH1,

MSH2, MSH6, TP53, CDKN2A, CDH1 e CTNNB1). Foram identificadas 31 mutações

patogênicas sendo 20 delas localizadas no gene BRCA1 (incluindo 2 casos com variação no

número de cópias e 18 mutações pontuais) e 7 no gene BRCA2. No estudo também foi

detectado um caso com mutação p.Arg337His em TP53 e um paciente com mutação em

CHEK2 1100delC. Os resultados do estudo mostraram uma alta frequência de mutação em

BRCA1/BRCA2 com alta prevalência de mutações em BRCA1 (64,5%). Além disso a mutação

em TP53 (p.Arg337His) sugere que todos os pacientes com câncer de mama com critérios

para HBOC caso negativos para BRCA1/BRCA2 devem ser testados para TP53 (p.Arg337His).

Apesar da alta frequência de mutação detectada, de maneira similar ao aqui reportado, há

um grande número de pacientes com presença de história familiar positiva de câncer, idade

jovem ao diagnóstico, além de outras características relacionadas ao câncer de mama,

porém, com ausência de mutação germinativa em BRCA1/BRCA221.

A busca contínua por uma melhor compreensão das características das famílias em

risco para câncer de mama hereditário, bem como pela determinação do risco de câncer da

forma mais acurada possível é fundamental. O conhecimento de qual gene está alterado e

qual o risco associado a essa alteração possibilita uma melhora significativa nas decisões

acerca do manejo do risco, bem como pode aumentar a gama de estratégias preventivas e

de redução de risco (exemplo cirurgias profiláticas) a serem oferecidas.

109

6.1.4 Polimorfismos

Polimorfismos genéticos atualmente estão sendo avaliados como modificadores do rsico

genético de doenças por diversos grupos de pesquisa. Estudo realizado pelo grupo CIMBA130

(Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2) avaliou a frequência de cinco

polimorfismos previamente publicados como relacionados a um aumento no risco de câncer

de mama hereditário, em pacientes portadoras de mutação em BRCA1/BRCA2, bem como

em pacientes em risco para câncer hereditário e naqueles com câncer de mama

supostamente esporádico. A análise dos diferentes polimorfismos foi realizada contra

características da história familiar de câncer e contra o status dos receptores hormonais

estrógeno, progesterona e HER2. Notou-se uma relação do receptor de estrógeno negativo

com a idade ao diagnóstico mais jovem ao diagnóstico nos casos com mutação em BRCA1

que nos BRCA2 e essa mesma tendência é notada nos tumores triplo negativos, o grau

histológico mais alto parece estar associado também com os casos estrógeno negativos,

mostrando a relevancia das carcterísticas patológicas, e destacando a impotância dos

modificadores do risco de câncer portadores de mutação em BRCA1/2130.

Ao compararmos a distribuição dos genótipos dos 5 polimorfismos analisados com o

status dos receptores hormonais de estrógeno, progesterona e HER2, notamos que, no caso

do SNP rs3803662 no gene TNRC9 há uma frequência aumentada de homozigotos GG dentre

os indivíduos cujo receptor de estrógeno era negativo (de forma similar ao relatado

previamente por Easton126 e colaboradores em 2007) e, embora não tenha alcançado uma

significância estatística, pudemos observar que essa diferença foi mais acentuada dentre as

mulheres dos grupos 1 e 3. Em relação ao SNP rs2981582 localizado no gene FGFR2,

observamos uma frequência aumentada do alelo A nas mulheres cujos receptores de

estrógeno e progesterona eram positivos (p=0,020 e p=0,014 respectivamente) e esse

aumento de frequência dentre os indivíduos cujo receptor hormonal (ER e PR) eram

positivos foi independente do grupo a que a mulher pertencia. No caso do polimorfismo

rs3817198 no gene LSP1 houve uma menor frequência do homozigoto C em todos os grupos

analisados. Em relação aos demais polimorfismos estudados não encontramos nenhuma

associação estatisticamente significativa quando comparados com o status de receptor

hormonal.

110

Existem, na literatura diversos estudos avaliando o impacto dos polimorfismos no

risco de câncer e sua associação com características tumorais. De acordo o trabalho

publicado por Tapper 140 e colaboradores em 2008, alguns polimorfismos que alteram o risco

de câncer de mama estão sendo descobertos. O trabalho realizado pelo autor supracitado

tinha como objetivo avaliar como essas variantes podem influenciar no prognóstico do

câncer de mama e no risco e, para isso foram analisadas 1.001 mulheres com câncer de

mama invasivo não familiar diagnosticadas em idade precoce, versus um grupo com câncer

de mama hereditário, quanto à presença e freqüência de 206 polimorfismos (SNPs) em 30

genes candidatos. Foi encontrada associação com o aumento do risco de desenvolvimento

de câncer de mama nos SNPs CASP8, TOX3 (anteriormente conhecido como TNRC9) e ESR1.

Os autores relataram ainda uma associação entre oito SNPs em seis genes (MAP3K1, DAPK1,

LSP1, MMP7, TOX3 e ESR1) e outro em uma região sem genes em 8q24, com sobrevida. Para

os SNPs nos genes MMP7, TOX3 e MAP3K1 os efeitos da sobrevida foram independentes dos

principais fatores prognósticos clínicos conhecidos. O efeito do SNP em ESR1 na sobrevida

mostrou-se mais significativo quando foram avaliados apenas os tumores ER-positivos.

Quando os casos foram estratificando de acordo com as características tumorais notou-se

que os SNPs em FGFR2 e TOX3 estão associados à doença. Por fim o estudo demonstrou

que vários SNPs estão associados com a sobrevida. Em alguns casos, pode ser devido a um

efeito sobre as características do tumor que tem impacto no prognóstico; em outros casos, o

efeito parece ser independente destes fatores de prognóstico140.

Resultados publicados por Fanale e colaboradores em 2012 demonstraram

associação de alguns polimorfismos (SNPs) s com câncer de mama. Os genes nos quais os

polimorfismos descritos estão são: TNRC9, FGFR2, MAP3K1, H19 e LSP1. O SNP mais

fortemente associado está localizado no gene FGFR2, o qual está super expresso em 5-10%

dos casos de câncer de mama. O SNP no gene TNRC9 mostra uma associação mais forte com

câncer de mama, e parece estar correlacionado com a presença de metástases ósseas e

receptor de estrógeno positivo. O SNP rs889312 no gene MAP3K1 mostrou uma

sensibilidade somente em portadores de mutação no gene BRCA2, não estando associado

com um risco aumentado em portadores de mutação em BRCA1. Diversos SNPs em LSP1 e

H19 provavelmente foram associados ao risco de desnvolvimento de câncer. O estudo então

conclui que a identificação de polimorfismos modificadores do risco pode levar à uma

111

melhor compreensão do mecanismo biológico do câncer de mama, podendo assim melhorar

a prevenção, a detecção e tratamento precoce da doença129.

Os resultados das análises da presença e frequência dos 5 polimorfismos aqui

considerados foram comparados com a história familiar de câncer. Nessa comparação

diversas associações foram identificadas, tanto com o número de casos de câncer na família

(associados com SNPs rs2981582 e rs13281615), com presença de câncer de mama bilateral

(SNP rs13281615), idade ao diagnóstico (SNP rs3803662, rs889312) e com número de

gerações afetadas por câncer (SNP rs13281615). Muitos dos achados aqui obtidos

corroboram dados da literatura, tal como a associação encontrada entre o SNP rs13281615 e

a história familiar positiva de câncer, correlação essa reportada previamente por Gorodnova

e colaboradores em 2010128.

Os dados obtidos com as análises de polimorfismos necessitam ser validados em um grupo

amostral maior. No entanto, caso essas associações se confirmem, teremos mais um dado

fundamental para a compreensão da epidemiologia do câncer hereditário e também do

câncer familial na nossa população.

6.1.5 Características que influenciam na presença de mutações germinativas em BRCA1/BRCA2

A história familiar de câncer é o principal indicador para realização do teste genético.

No entanto diversos estudos têm apontado para o fato de que muitas mulheres são

candidatas à realização do teste genético pela combinação dos dados histopatológicos e

imunohistoquímicos do tumor, além de fatores relacionados à sua história pessoal e familiar

de câncer.No presente estudo, após uma ampla caracterização do grupo amostral em

questão, realizamos uma ”análise múltipla”, onde comparamos o grupo sabidamente com

câncer de mama hereditário (grupo 1, com mutação germinativa nos genes BRCA1/BRCA2)

quanto a diversas características da história familiar e do tumor (características

histopatológicas e imunohistoquímicas) na tentativa de identificar quais são as variáveis

mais importantes para distinguir esses grupos e consequentemente quais seriam as

112

características a serem observadas em um paciente para indicá-lo ou não para a realização

do teste genético.

Com base nos resultados da análise supracitada notamos uma diferença

estatisticamente significativa para quase todas as variáveis de história familiat analisadas

quando a comparação é feita entre o grupo 1 e o grupo 4, o que seria esperado, já que o

grupo 4 é constituído por mulheres com câncer de mama supostamente esporádico. Quando

a mesma análise é realizada com as características histopatológicas e imunohistoquímicas a

mesma tendência é vista, sendo as características marcantes, o receptor de estrógeno, Ki-67,

triplo negatividade e subtipo molecular com destaque para os casos basal-like presentes

quase que exclusivamente dentre as mulheres do grupo 1.

Quando comparamos o grupo 1 com os grupos 2 e 3, grupos esses em risco para

câncer de mama hereditário, mas sem mutação patogênica identificada nos genes testados,

destacamos quais características diferem entre esses grupos: presença de câncer de mama

bilateral e câncer de ovário, número de casos de câncer de mama e total de casos de câncer,

óbitos por câncer de mama e total de óbitos, idade ao diagnóstico, receptores de estrógeno,

progesterona, Her-2, citoqueratina 5/6, triplo negatividade e subtipo molecular.

Em trabalho realizado pelo grupo CIMBA o câncer de mama e ovário foram

investigados quanto às suas características histopatológicas e imunohistoquímicas em

portadores e não portadores de mutação em BRCA1/BRCA2. Foram avaliados 4,325

portadores de mutação em BRCA1 e 2,568 em BRCA2, e, como resultado, os autores

destacaram uma forte associação com o receptor de estrógeno negativo e idade mais jovem

ao diagnóstico para os casos mutados em BRCA1 quando comparados com os portadores de

mutação em BRCA2. Os autores relatam ainda que a idade ao diagnóstico era menor nos

casos mutados em BRCA1 que nas portadoras de BRCA2. Em ambos, os tumores estrógeno

negativos apresentaram maior grau histológico que os tumores estrógeno positivo. Tumores

lobulares foram mais relacionados com a presença de mutação em BRCA2, já os tumores do

tipo medular foram mais relacionados com a presença de mutação em BRCA1. Em relação ao

câncer de ovário não foi observado diferença significativa entre os portadores de mutação

em BRCA1 e BRCA2. As características patológicas dos tumores associados a BRCA1/2 podem

113

ser relevantes na previsão do risco, nas medidas profiláticas e nas estratégias de

rastreamento clínico.

No presente estudo, considerando todas as variáveis que aparentam estar associadas

ao câncer de mama hereditário, realizamos uma análise multivariada e, obtivemos o

seguinte resultado: triplo negatividade demonstrou estar fortemente associada à presença

de mutações deletérias nos genes BRCA1/BRCA2 e ocasiona um aumento de 5,883 vezes (IC

95%, p<0,001); presença de câncer de mama bilateral com um aumento de 5,797 vezes no

risco (IC 95, p=0,003), número de casos de câncer de mama (aumento de 5,033 vezes (IC

95%, p<0,001)), presença de câncer de ovário (aumento de 4,412 vezes no risco (IC 95%,

p=0,006)), e, por último, total de óbitos por câncer, ocasionando um aumento de 2,906

vezes no risco de ser portador de câncer de mama hereditário (IC 95%, p=0,035).

Em estudo desenvolvido por Robertson e colaboradores o câncer de mama triplo

negativo pode ser um possível indicador de para realização do teste genético em BRCA1 para

indivíduos menores que 50 anos. O estudo realizou o teste genetico em BRCA1 em 308

indivíduos com câncer de mama, 159 com câncer de mama triplo negativo e 149 com idade

jovem ao diagnóstico e história familiar. Dos 308 indivíduos testados 45 eram portadoras de

mutação. O presente estudo mostrou que as mulheres com câncer de mama triplo negativo

antes dos 50 anos de idade tem mais de 10% de probabilidade de mutação, e conclui que

esses indíviduos são candidatos a realização do teste genético.

Estudo realizado por Fostira e colaboradores avaliou em uma coorte de 403 mulheres

a prevalência de mutações em BRCA1 nos casos de câncer de mama triplo-negativo,

independente do fator idade e história familiar de câncer. A média de idade ao diagnóstico

em geral foi de 50 anos, a prevalência de casos de câncer de mama invasivo triplo negativo

foi de 8%, os resultados de mutação em BRCA1 foram obtidos através de sequenciamento

direto. Foram encontradas 65 mutações em BRCA1 dentre os 403 pacientes com câncer de

mama invasivo representando 16%. A média de idade das mulheres portadoras de mutação

foi de 39 anos. De um total de 106 mulheres diagnosticadas com câncer de mama triplo

negativo em idade jovem, 38 (36%) tinham mutação em BRCA1 . Das 65 mulheres

portadoras de mutação 15 (23%) não relataram história familiar de câncer. Dados como esse

indicam que mulheres com câncer de mama triplo negativo diagnosticado em idade jovem

114

são candidatas a realização do teste genético em BRCA1 independente da história familiar

de câncer de mama e ovário141.

Por fim, cabe destacar que apesar dos critérios relativamente restritos aplicados pelo

Departamento de Oncogenética para a seleção dos pacientes que deveriam ser testados e

da ampla metodologia utilizada para análise dos genes envolvidos, o risco alto/moderado de

câncer atribuído às famílias (no caso das famílias dos grupos 2 e 3 do presente estudo)

permanece inexplicado. Parte disso pode ser devido ao fato de que as alterações podem

estar em outros genes ainda não associados ao câncer de mama hereditário ou à presença

de alterações genéticas em genes de risco moderado a alto para as quais as pacientes não

foram testadas (tais como TP53 e PALB2). Adicionalmente cabe destacar a importância de

uma caracterização clínica, patológica e molecular das famílias (tal como a aqui realizada) de

forma a incluir outras variáveis, além da história familiar de câncer, como critério para a

seleção/identificação de mulheres/famílias em risco para câncer de mama hereditário.

Como limitações do presente estudo cabe destacar o número reduzido de tumores

para os quais a análise imunohistoquímica das citoqueratinas pôde ser realizada e, como

consequência, a classificação do subtipo molecular foi realizada para uma pequena parcela

do grupo amostral considerado. Adicionalmente, a análise dos polimorfismos e sua

associação com dados de história familiar bem como com dados do tumor deverá passar por

uma fase de validação em um número amostral maior para que conclusões/especulações

possam ser emitidas.

115

7 . Conclusão

1) Quando realizamos a caracterização das mulheres, em relação aos fatores de risco

(hormonais) para câncer de mama, notamos que 23,6% das mulheres estavam na

menopausa no momento do diagnóstico, mais da metade das mulheres (54%) faziam uso de

anticoncepcional, 79,4% delas tiveram pelo menos uma gestação antes do diagnóstico e

apenas 11,8% realizaram terapia de reposição hormonal. Quando analisamos a história

familiar notamos que as mulheres do grupo 4 tinham em sua grande maioria menos de três

casos de câncer presente na família (75%), já as mulheres dos grupos 1, 2 e 3 tinham 15,7%,

33,3%, 40% respectivamente. Por fim caracterizamos os grupos quanto a probabilidade de

apresentar mutação nos genes BRCA1 e BRCA2 e observamos que 82,4%, 44,4% e 49% das

mulheres dos grupos 1, 2 e 3 apresentavam probabilidade de mutação moderada entre 10 e

30%.

2) Observamos um predomínio de negatividade para os receptores hormonais ER, PR

e HER2 no grupo 1 quando comparado aos grupos 2, 3 e 4. Os grupos 2 e 3 apresentaram um

padrão intermediário entre os grupos 1 e 4. Quando o grupo 1 foi estratificado entre

mutadas em BRCA1 e mutadas em BRCA2, pudemos verificar que grande parte da

negatividade observada para os receptores devia-se aos casos com mutações germinativas

em BRCA1. Além da triplo-negatividade, um número considerável de mulheres do grupo 1

eram basal-like. As famílias das mulheres cujos tumores eram TN apresentavam um número

maior de casos de câncer de mama do que aquelas com pelo menos um dos receptores

positivos.

3) Em relação a análise da frequência dos cinco polimorfismos, observamos que para

o polimorfismo no gene TNRC9 o genótipo heterozigoto foi o mais frequente entre as

mulheres do grupo 1, já o polimorfismo no gene FGFR2 observamos uma maior prevalência

de heterozigotos em todos os grupos analisados, a mesma tendência foi observado para o

polimorfismo rs13281615. Já em relação ao polimorfismo no gene MAP3K1 notamos que

grande parte das mulheres dos grupos 1, 2 e 3 estavam em homozigose para o alelo A. E por

último o polimorfismo no gene LSP1 mostrou presença do alelo T em homozigose na maioria

116

das mulheres dos grupos 1, 2 e 3. Com base nesses resultados observamos correlação na

distribuição dos genótipos dos 5 SNPs analisados quando comparados aos 4 grupos aqui

considerados, então devemos destacar que esses resultados são fundamentais para a

compreensão da epidemiologia do câncer hereditário e também do câncer familial na nossa

população (pois a maioria das associações previamente relatadas na literatura foram entre

as mulheres com câncer aparentemente familial).

4) Quando comparamos os polimorfismos com os receptores imunohistoquímicos,

encontramos associação estatisticamente significativa para alguns dos polimorfismos

analisados, são eles: rs3803662 no gene TNRC9, rs2981582 localizado no gene FGFR2 e o

polimorfismo rs3817198 no gene LSP1. Já em relação aos demais polimorfismos estudados

não encontramos nenhuma associação estatisticamente significativa quando comparados

com o status de receptor hormonal.

Quando avaliamos a distribuição dos genótipos em relação a história familiar

observamos associações para todos os SNPs avaliados no presente estudo. Associação com

número de casos de câncer também foi verificada para os SNPs rs13281615 e rs3803662 (no

gene TNRC9), além de associação com idade ao diagnóstico. Já o polimorfismo rs889312

(gene MAP3K1) apresentou associação com o número de casos de câncer na família,

presença de câncer de mama bilateral, número de gereações afetadas com câncer, e idade

ao diagnóstico. O polimorfismo rs2981582 (gene FGFR2) apresentou associação apenas com

o número de gerações afetadas com câncer. Por fim o SNP rs3817198 (no gene LSP1)

apresentou uma associação com a presença de câncer de mama bilateral, presença de

câncer ovário e número de gerações afetadas com câncer. Esses SNPs se foram relevantes na

análise da história familiar e devem ser validados uma casuística maior.

5) Observamos, dentre os 83 casos do grupo 4 (não selecionados por sua história

familiar), 8 classificadas como triplo negativas, dentre essas apenas uma apresentou mais de

3 casos de câncer presente na família. A triplo negatividade apresentou uma forte relação

com a presença de mutação (risco aumentado (odds ratio) em 5,883 vezes (IC 95%, 2,562 a

13,510, p<0,001). Tendo em vista essas características pelo menos uma das mulheres do

grupo 4 deveria ter sido encaminhada para realização do teste genético.

117

Por fim, dentre as variáveis analisadas, cabe destacar a importância da triplo

negatividade, do número de casos de câncer e de câncer de mama presente na família, a

presença de câncer de ovário e de câncer de mama bilateral e a idade ao diagnóstico. Essas

variáveis devem ser consideradas conjuntamente no momento do aconselhamento

genético. Dessa forma concluímos que, não apenas a história familiar é fundamental para

indicação do teste genético, mas também as características do tumor são importantes e não

devem ser negligenciadas.

Perspectivas: Com base nos resutados obtidos, destacamos algumas características

relevantes, a presença de polimorfismos modificadores do risco parece estar relacionado

com a história familiar de câncer, dados como esse precisam ser validados em uma

casuística maior para validação. As citoqueratinas se mostraram muito importantes para

classificação dos diferentes subtipos, visto que grande parte das mulheres com mutação em

BRCA1 eram do subtipo basal-like, com base nesses achados sugerimos que a realização das

citoqueratinas sejam feitas de rotina proporcionando assim uma classificação molecular

completa.

118

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128

9.Anexos

Anexo 1

TERMO DE INFORMAÇÃO E CONSENTIMENTO PARA GUARDA E UTILIZAÇÃO

DE MATERIAL BIOLÓGICO

Você está sendo admitido (a) neste Hospital para estabelecimento de diagnóstico, fator

prognóstico e/ou tratamento de alguma forma de tumor. Para estes fins pode haver a

necessidade de remoção do tumor e/ou material biológico relacionado à enfermidade. É

prática rotineira, deste hospital, usar parte do tumor e/ou material biológico (saliva, sangue e

outros) retirado para exames clínicos laboratoriais e diagnóstico definitivo. O restante do

tumor ou do material biológico que é retirado e não é utilizado é congelado e armazenado

para novos exames, se necessário, caso contrário, são descartados conforme legislação

sanitária regulamentar sobre o assunto.

Para obter um maior conhecimento sobre o câncer, médicos e pesquisadores deste

Hospital desenvolvem pesquisa clínica e científica. Através dessa pesquisa é possível

conhecer melhor os mecanismos da doença e, portanto, tentar oferecer novas possibilidades

de diagnóstico, prognóstico e tratamento. Estes estudos somente serão possíveis se realizados

em fragmentos de tumores removidos ou em material biológico colhido (saliva, sangue dentre

outros).

Estamos solicitando a sua permissão para guardar e utilizar um fragmento do tumor

e/ou material biológico retirados de você e que não são mais necessários para o seu

diagnóstico. Esclarecemos que a obtenção e o estudo dos referidos fragmentos de tumor e

material biológico não implicarão em riscos adicionais ao seu tratamento, diagnóstico ou

prognóstico, nem tampouco, em aumento no tempo e período para a execução dos

procedimentos necessários.

O depositário destes tecidos será o Banco de Tumores do Hospital de Câncer de

Barretos. Este material poderá ser usado em pesquisas futuras. A eventual inclusão de seu

material em projetos de pesquisa só ocorrerá após apreciação e aprovação da Comissão de

Ética em Pesquisa do Hospital. A utilização para qualquer outro fim deverá ter apreciação e

aprovação do Comitê de Armazenamento e Utilização de Materiais Biológicos desta

Instituição. Sua privacidade e identidade serão sempre preservadas.

A eventual inclusão dos resultados em publicação científica ou outros meios será feita

sempre de modo a manter o seu anonimato, já que todo material do Banco de Tumores é

129

codificado. No entanto, como o Diretor do Banco tem acesso a sua identidade, em casos de

pesquisas genéticas que caracterizam alterações que envolvam riscos para seus familiares

podem lhe ser informados, se esse for seu desejo.

Ressalta-se ainda que não existirá quaisquer benefícios ou direitos financeiros a

receber sobre os eventuais resultados decorrentes da utilização do seu fragmento de tumor

e/ou material biológico. Ressalta-se ainda que, se você não concordar em doar o material para

o Banco de Tumores, sua decisão não influenciará, de nenhum modo, no seu tratamento.

A autorização para armazenamento e utilização destas amostras é por prazo

indeterminado, podendo ser cancelada por aviso escrito ao Diretor do Banco de Tumores

desta Instituição.

Caso você tenha questões a fazer sobre este Termo de Consentimento, ou alguma

dúvida que não tenha sido esclarecida pelo seu médico, por gentileza, entre em contato com a

Comissão de Ética Medica, pelo telefone (17) 3321-6600, ramal 6875.

Você receberá uma cópia deste documento e o original será arquivado em seu

prontuário. Somente assine este se consentir.

Declaração

Eu, ..............................................................declaro estar ciente das informações ora

prestadas, tendo lido atentamente e concordado com todo o teor, DOANDO meu material

biológico (tumor, tecido, sangue, saliva e outros) integralmente para a Fundação Pio XII.

(escrever Sim ou Não) ......................... consinto (concordo) que meu material

biológico, quando não necessário para o meu diagnóstico, possa ser coletado, guardado e

utilizado pelo Banco de Tumores desta Instituição, perante aprovação prévia do Comitê

competente. Autorizo também acesso a meus dados de idade, sexo, fatores epidemiológicos

relacionados, e outras informações do meu prontuário médico, diagnóstico, tratamento e

história familiar e sua utilização, desde que minha identidade seja mantida em

confidencialidade.

Se a resposta anterior for SIM, minha informação e amostra poderão ser usadas em

teste genéticos, que podem identificar risco de doenças genéticas para meus familiares. Nesse

caso (escrever Sim ou Não), ...................... quero ser informado da descoberta.

130

Por expressão de verdade firmo o presente Termo.

Barretos/SP, _________ de _________________________ de ___________

Nome do(a) paciente

Assinatura do(a) paciente

Nome do responsável

Assinatura do responsável

131

Anexo 2

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE MUTAÇÕES EM GENES DE PREDISPOSIÇÃO

HEREDITÁRIA AO CÂNCER

PROCEDIMENTO DA INVESTIGAÇÃO:

Esse é um teste que está sendo oferecido pelo Hospital de Câncer de Barretos e sua

participação não vai influenciar ou modificar seu acesso a qualquer tratamento médico. A sua

participação é voluntária, e dessa forma você tem o direito a se recusar a participar do teste genético, e

você pode desistir de fazê-lo a qualquer momento. Você também tem a opção de realizar o teste

anonimamente, situação em que seu DNA será estudado para identificar alterações em genes de

predisposição ao câncer, mas, nesse caso, não lhe será dito o resultado.

O teste genético pode lhe proporcionar uma estimativa mais precisa do risco de desenvolver

câncer ao longo de sua vida, além de permitir determinar se você tem uma alteração genética que pode

ser transmitida para seus filhos. Este teste não tem uma precisão de 100% e há limitações sobre o ele

pode lhe revelar.

É importante destacar que este teste não vai lhe trazer informações sobre o seu estado de

saúde atual.

Inicialmente você participará de pelo menos duas consultas de aconselhamento genético, onde

terá a oportunidade de discutir os possíveis benefícios, limitações e riscos da análise dos genes de

predisposição hereditária ao câncer em seu caso. Você precisará fornecer informações detalhadas

sobre sua história familiar, inclusive informações sobre parentes que tiveram câncer ao longo de suas

vidas. A princípio, esse aconselhamento é realizado individualmente, mas você poderá trazer um

familiar ou outra pessoa para acompanhar a consulta. Será sugerido que você forneça informações

sobre esta avaliação que está sendo realizada a outros familiares.

O teste genético normalmente requer a retirada de 10 ml de sangue periférico. Em raras

situações será necessário coletar sangue novamente para realizar o teste.

A avaliação psicológica estará disponível antes e após a realização do teste genético.

O teste genético não é pago pelo SUS ou por planos de saúde privados, sendo possibilitado

para você gratuitamente pelo Hospital do Câncer de Barretos (HCB). Não é um teste de rastreamento

de câncer a ser oferecido para a população em geral, somente para pacientes e famílias que preencham

os critérios clínicos pré-estabelecidos pela equipe da Oncogenética.

132

RESULTADOS:

Quando a análise estiver concluída, você será contactado (a) e convidado (a) a marcar uma

consulta para receber o resultado do exame pessoalmente. Nenhuma informação será fornecida por

telefone ou carta, independente do resultado. Quando o resultado do teste laboratorial estiver

disponível, você poderá adiar ou recusar o recebimento destes resultados. Excepcionalmente, o

resultado poderá ser fornecido a um de seus familiares, se autorizado previamente por você e se esta

pessoa estiver acompanhando a investigação.

Quando você receber o resultado de seu teste, terá a opção de transmitir ou não esse resultado

a outros familiares. Se outros familiares tiveram indicação do teste e decidirem participar, eles serão

atendidos pela equipe da Oncogenética para receber explicações e orientações, e então assinar

formulário de consentimento e coleta de sangue para a realização do teste.

Nenhuma informação médica a seu respeito será fornecida a outros familiares durante o

processo de entrevistas sem o seu consentimento expresso e por escrito.

DURANTE O ACONSELHAMENTO, SERÁ EXPLICADO QUE HÁ TRÊS POSSÍVEIS

RESULTADOS:

1) Ter herdado um gene de predisposição ao câncer alterado (mutação genética).

Saiba que, a presença de uma mutação gênica não indica a certeza de desenvolvimento do câncer,

mas sim, uma chance aumentada para o desenvolvimento de diferentes tipos de câncer, que irá variar

dependendo da região do material genético em que estiver a mutação. O risco pode ser diferente para

homens e mulheres, dependendo do tipo de câncer em questão.

2) Não ter herdado um gene de predisposição ao câncer alterado (mutação genética).

Com isso, podemos chegar à conclusão que uma alteração nos genes para as quais você foi

testado não explica sua história pessoal e familiar de câncer. Ainda assim, é possível que você tenha

herdado um outro gene de predisposição ao câncer para o qual ainda não há testes disponíveis.

3) Ser impossível de determinar se você herdou ou não um gene de predisposição ao câncer

alterado (teste inconclusivo).

Se o teste laboratorial for inconclusivo, você terá a opção de repetir o teste em outra data. Neste

caso, o laboratório continuará estudando sua amostra de sangue (DNA) à procura de outros genes

alterados que possam estar contribuindo para a ocorrência de câncer. Porém, se esse for o caso, não há

prazo ou promessa de um resultado conclusivo para essa segunda investigação.

RISCOS E DESCONFORTO:

Normalmente há riscos mínimos e infreqüentes envolvidos na coleta de uma amostra de sangue. Estes riscos incluem: dor no local da coleta, sangramento, hematoma (uma marca roxa na pele) e infecção.

Os riscos do teste genético são primariamente de origem psicológica. Saber que você tem um

gene de predisposição ao câncer alterado poderia causar depressão, ansiedade, raiva e medo do futuro.

Este resultado poderia afetar as suas relações com familiares e entes queridos. Se você descobrir que

133

tem um gene de predisposição alterado, e tornar pública essa informação, isso poderia gerar algum tipo

de discriminação especialmente por companhias de seguro, planos de saúde, empregadores e até

mesmo familiares.

BENEFÍCIOS DA INFORMAÇÃO:

Este teste pode fornecer uma informação que torna possível calcular com maior precisão se

você ou seus parentes, inclusive seus filhos, têm maior risco de desenvolver certos tipos de câncer. Se

este for o caso, vocês serão aconselhados quanto às opções de prevenção do câncer e seguimento a

longo prazo.

Se você descobrir que não herdou um gene alterado, você poderá evitar exames de detecção

precoce ou cirurgias preventivas desnecessárias e, além disso, você não vai transmitir essa alteração

para os seus filhos. O fato de descobrir que você não tem uma predisposição maior ao câncer para o

qual você foi testado poderá lhe trazer uma grande sensação de alívio ao descobrir o resultado do teste.

USO DA AMOSTRA DE SANGUE:

Qualquer amostra de sangue obtida com a finalidade de realizar este teste ficará armazenada no Hospital de Câncer de Barretos. Estamos solicitando também a sua permissão para armazená-lo junto ao Laboratório de Patologia Molecular e utilizá-lo em pesquisas futuras, que tenham como objetivo conhecer melhor os mecanismos do surgimento e progressão do câncer. A eventual inclusão de seu material biológico em projetos de pesquisa só ocorrerá após apreciação e aprovação pela Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos.

CONFIDENCIALIDADE:

O resultado final do teste genético será mantido unicamente em arquivos do Departamento da

Oncogenética. Somente será registrada no prontuário médico a sua participação no teste genético, mas

não o resultado. O resultado somente poderá ser fornecido a qualquer outra pessoa, instituição,

empresa ou seguros de saúde mediante sua autorização por escrito. Os dados usados para pesquisa ou

publicações científicas não terão a identificação dos participantes.

PEDIDO DE MAIS INFORMAÇÕES:

Você pode fazer mais perguntas sobre o teste genético a qualquer momento para qualquer

pessoa da equipe da Oncogenética. Nosso telefone de contato é (17)3321 6600, no Hospital de Câncer

de Barretos, ramal 7059.

ACOMPANHAMENTO MÉDICO

Você e seus familiares em risco para câncer poderão ser acompanhados periodicamente pela

equipe da Oncogenética se assim o desejarem, inclusive realizando os exames necessários conforme os

protocolos pré-estabelecidos para cada caso..

134

DOCUMENTAÇÃO DE CONSENTIMENTO:

Recebi uma cópia deste termo de consentimento livre e esclarecido para manter comigo. Uma outra

cópia deste consentimento será mantida pelo Departamento de Oncogenética e uma terceira cópia será

mantida no laboratório de Patologia Molecular do Hospital de Câncer de Barretos.

1. Eu gostaria de saber os resultados de meu teste genético, os quais poderão me dar informações

sobre o risco de ter um gene alterado que aumenta o risco de desenvolvimento de câncer.

Marque com um X:

Sim ( ) Não ( )

2. Eu dou permissão para que minha amostra seja estocada para futuras pesquisas na área de genética

e câncer no Hospital de Câncer de Barretos.

Marque com um X:

Sim ( ) Não ( )

3. No caso de novas informações sobre o risco de câncer, mais especificamente sobre os tipos de

câncer que ocorrem na minha família, ou de novas pesquisas nessa área das quais eu poderia

participar, gostaria que a equipe da Oncogenética entrasse em contato comigo.

Marque com um X:

Sim ( ) Não ( )

4. Em caso de impossibilidade de receber o resultado do teste genético, autorizo a seguinte pessoa a

recebê-lo por mim (pessoalmente):

Nome:__________________________________________________________________

RG:_______________________________CPF:__________________________________

Endereço:________________________________________________________________

Eu concordo em realizar a análise genética e aceito os riscos. Eu entendo as informações fornecida

por este documento e eu tive a oportunidade de fazer perguntas e esclarecer dúvidas que eu tinha sobre

o teste, o procedimento, os riscos associados e as alternativas.

______________________________ _________________ _________________

Participante Data Data de Nascimento

______________________________ _________________

Testemunha Data

_______________________________ __________________

Equipe Oncogenética Data

135

Anexo 3

IDENTIFICAÇÃO

1 Nome

2 RGH

3 Data de Nascimento DD-MM-AAAA

4 Data de Admissão Hospitalar DD-MM-AAAA

5 Sexo 1- Feminino; 2- Masculino

6 Cor - Padrão IBGE ou exterior

1- Branco; 2- Pardo; 3- Negro; 4- Amarelo; 99- Ignorado

7 Estado Civil 0- Solteiro; 1-Casado / União estável; 2- Separado / Divorciado; 3-Viúvo; 99- Ignorado

8 Escolaridade

1- Analfabeto; 2- 1 Grau Incompleto; 3- 1º Grau Completo;

4- 2º Grau Incompleto; 5- 2º Grau Completo; 6- Superior; 99-ignorado

9 Profissão

10 Procedencia

11 Tem diagnóstico de câncer

0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

12

1- Múltiplos tumores primários

2- Tumor em idade jovem

3- Tumor bilateral

4- Multifocalidade/sincronicidade

5- Sítio tumoral não usual

6- Histologia rara

7- Tumor de mama masculino

8- Tumor em associação com doença genética/anomalia congênita

9- História familial

10- Outros 99- Ignorado

13 Qual o sítio do tumor primário? (se tiver mais que um descrever o mais recente primeiro)

14 Ano do diagnóstico

15 Idade ao diagnóstico

16 Descrever o anatomopatológico (Tipo, Grau)

17 Receptor de estrógeno

18 Receptor de progesterona

19 Her-2

20 Estadiamento (TNM)

21 Já teve outro tipo de câncer, em outra parte do corpo

0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

22 Quantos outros primários?

23 Já teve algum tipo de Tumor Benigno?

0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

24 Qual o sítio do tumor benigno

1- Rim 7- Meningeoma

ETIQUETA

136

2- Suprarrenal 8- Mioma

3- Pâncreas 9- Lipoma

4- Hipófise 10-Cerebelo

5- Osso 11- Outros____________________

6- Tireóide 99- Ignorado

25

Lesões benignas da mama 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

26 Biópsia de mama por lesão suspeita 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

27 Cirurgias

28 Mamografia regularmente 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

29 Menarca

30 Menopausa

31 Idade primeira gestação

32 Parto normal

33 Cesária

34 Aborto

35 Anticoncepcional

36 Reposição hormonal

37 Fumante

0- Não; 1- Sim

38

Etilista 0- Não; 1- Sim

137

Anexo 4

138

Anexo 5

Manuscrito submetido para Hereditary Cancer in Clinical Practice.

Association of polymorphisms with a family history of cancer and the presence of germline

mutations in the BRCA1/BRCA2 genes

Gabriela Carvalho Fernandes1,2, Rodrigo AD Michelli, MD3, Cristovam Scapulatempo-

Neto1,2,4, Edenir I Palmero, PhD1,2,3,5.

Authors Primary Affiliations:

1. Molecular Oncology Research Center, Barretos Cancer Hospital, Brazil.

2. Post-Graduate Program in Oncology, Barretos Cancer Hospital, Brazil.

3. Oncogenetics Department, Barretos Cancer Hospital, Brazil.

4. Pathology Department, Barretos Cancer Hospital, Brazil.

5. Barretos School of Health Sciences, Dr. Paulo Prata – FACISB, Brazil.

Acknowledgements

This project was financially supported by CNPq and Barretos Cancer Hospital internal

research funds (PAIP).

Correspondence to:

Edenir Inêz Palmero, PhD

Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular, Hospital de Câncer de Barretos

Av Antenor Duarte Vilela, 1331 – Barretos, SP, Brazil, CEP 14784-400

Telephone number: + 55 17 3321 6600 ext 7057

Fax number: + 55 17 3321 6600

Email: edenirip@yahoo.com.br

Running head: Polymorphisms in Hereditary Breast Cancer.

139

Disclaimer: This study does not have any conflicts of interest.

Abstract:

Introduction: Breast cancer (BC) is an important public health problem worldwide. In Brazil,

breast cancer is the most frequently diagnosed tumor and the leading cause of cancer death

in women. Hereditary cancer represents approximately 5 to 10% of BC cases. Even outside

the hereditary cancer context, the presence of polymorphisms acting as genetic modifiers

may contribute to a better or worse prognosis. Not much is known about the hereditary BC

epidemiology in Brazil or about the influence of polymorphisms on hereditary

predisposition. Objective: This study examined the role of five different polymorphisms in

four groups of women with BC: Group 1: women with a germline mutation in the BRCA1/2

genes; Group 2: women with variants of uncertain significance in BRCA1/2; Group 3: women

with no mutations in BRCA1/2; and Group 4: "sporadic BC“. Patients and methods: The

women included in groups 1, 2 and 3 were patients from the Department of Oncogenetics of

the Barretos Cancer Hospital who had undergone genetic testing because of a clinical

suspicion of hereditary predisposition syndrome. Group 4 included women from the

Department of Mastology at the same institution. The constitutive DNA was analyzed for the

presence of polymorphisms at rs2981582 (FGFR2 gene); rs3803662 (TNRC9); rs889312

(MAP3K1); rs3817198 (LSP1 gene); and rs13281615 (8Q24). The analyses were performed

using PCR amplification and bi-directional sequencing.

Results: No differences were identified in the frequency of the polymorphisms that were

analyzed among the four groups. However, some associations were identified, such as the

occurrence of bilateral breast cancer and homozygosity for the G allele in rs13281615 as well

as the correlation between the SNPs rs2981582 and rs13281615 and the number of cancer

cases in the family. Regarding the G allele of rs13281615, we observed that the proportion

of individuals who were homozygous for this allele increased with the number of

generations affected by cancer. Regarding the hormone receptors, we observed an

increased frequency in G homozygotes (rs3803662) among estrogen receptor-negative

individuals. For rs2981582 (FGFR2), we observed an increased frequency of the T allele in

140

women who were positive for the estrogen and progesterone receptors (p=0.020 and

p=0.014, respectively).

Conclusion: The results presented here provide interesting data on the modifying effect of

polymorphisms on a family history of cancer; this may be a variable to consider in the

analysis of tumor diversity, and of the family history observed in families with hereditary

breast cancer (even in those harboring the same type of genetic alteration).

141

Introduction

In Brazil, breast neoplasms are the main cause of death by cancer among women (1).

It is currently estimated that 5-10% of the total number of breast cancer (BC) cases are

hereditary. BRCA1 and BRCA2 are among the genes associated with hereditary breast cancer

(2, 3). Women harboring a germline mutation in the BRCA1 gene show a lifetime cumulative

risk (LCR) between 44 and 68% of developing breast cancer until 70 years of age. Moreover,

the LCR for ovarian cancer in these patients is also significantly higher and may reach 60% by

70 years of age (4, 5). The BRCA2 gene, when altered, is responsible for approximately 30 to

40% of all cases of hereditary breast cancer. The LCR for breast cancer in women harboring

germline mutations in this gene is similar to the risk of carriers of germline mutations in

BRCA1 (44 to 68% until 70 years of age) (6, 7), whereas the risk of ovarian cancer ranges

from 15 to 30% (8, 9). Families with mutations in BRCA1/2 differ in terms of age at diagnosis,

the number of family members affected, and tumor prognosis. Currently, several reports in

the literature point to the role of polymorphisms as genetic modifiers of the risk of cancer in

families and as responsible factors for part of this diversity identified in the families with

known mutations.

In 2007, a large study was conducted by Easton and collaborators (10) involving

genome-wide association studies (GWAS) of 4,398 cases (women with breast cancer) and

4,316 controls, followed by a validation step involving 21,860 cases and 22,578 controls. This

study identified single nucleotide polymorphisms (SNPs) in five loci that were associated

with the risk of developing breast cancer: 1) rs2981582 (C>T) in gene FGFR2, which encodes

a tyrosine kinase receptor that acts in the development of the mammary glands; 2)

rs3803662 (C>T), localized in a region that includes TNRC9; 3) rs889312 (A>C), localized in a

region that includes MAP3K1 in addition to two putative genes, MGC33648 and MIER3; 4)

rs3817198 (T>C) in gene LSP1; and 5) rs13281615 (A>G), which resides in a region that does

not include any known gene (8q24) but where variants associated with an increased risk of

prostate and colorectal cancer have been identified. The authors correlated the presence of

the above mentioned polymorphisms with histopathological characteristics such as positivity

or negativity for the estrogen and progesterone hormone receptors, stage of tumor

development, nodes, size, histology and stage at diagnosis. Among the five SNPs mentioned

above, three (rs2981582, rs3803662 and rs889312) were significantly associated with an

142

increased risk of breast cancer in estrogen receptor-positive individuals. Women who were

TT homozygous in SNP rs3803662 and who had estrogen-negative tumors exhibited a risk of

developing breast cancer that was 1.28-fold (95% CI = 1.13–1.45) higher than women who

were homozygous for the wild-type allele (present in 53% of the controls). Additionally, a

study involving 1,267 patients with breast cancer identified that individuals who were CT

heterozygous or TT homozygous for rs3803662 exhibited a higher probability of having

breast cancer diagnosed before the age of 60 years (p=0.025) (11).

Studies involving rs3817198 have found that the least frequent allele (C) leads to an

increase of approximately 10% in the risk of breast cancer in Caucasian women; however,

the same allele has a protective effect among women of African ascent (12, 13).

Considering the factors described above and the possible modifying effect conferred

by polymorphisms, the objective of this study was to evaluate the frequency of the

polymorphisms rs2981582, rs3803662, rs889312, rs3817198, and rs13281615 in women with

breast cancer, with or without mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, and to correlate the

frequency of the different polymorphisms with the family history of cancer and with the

histopathological features of the tumors.

Materials and Methods

Cases

This project was approved by the Research Ethics Committee of the Barretos Cancer

Hospital. All the participants in the study were treated at this institution and signed an

informed consent form. The women from the oncogenetics department underwent genetic

testing for mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes and, based on the results, were

allocated to three different groups: a) Group 1: 51 women with a personal and family history

of breast cancer with a pathogenic germline mutation in the BRCA1 and/or BRCA2 genes; b)

Group 2: 53 women with a personal and family history of breast cancer with the presence of

a variant of unknown clinical significance (VUS) identified in the BRCA1 and/or BRCA2 genes;

c) Group 3: 100 women with a personal and family history of breast cancer without a

pathogenic mutation and/or mutation of unknown clinical significance identified in the

BRCA1 and/or BRCA2 genes. Additionally, there were 83 women included with a personal

history of breast cancer who were not selected according to their cancer family history and

143

who did not undergo genetic testing for the analysis of mutations in the BRCA1 and/or

BRCA2 genes (“sporadic” group).

Molecular Analysis

For the polymorphism analysis, DNA was extracted using the QIAamp Blood DNA

Mini-Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Genotyping was performed

through PCR amplification using the Hot Start Taq enzyme (Qiagen). Following amplification,

the products were purified with the ExoSap enzyme (USB products) and sequenced

bidirectionally using the BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems, USA).

Electrophoresis was run in the automated sequencer model 3500 (Applied Biosystems, USA).

For the analysis of mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes and the subsequent

separation of the participants into the three study groups, a multiplex PCR amplification of

all coding exons of the BRCA1 (NCBI; NM_007294.3) and BRCA2 (NCBI; NM_000059.3) genes

and their respective flanking intronic regions was performed, followed by bidirectional

sequencing using two platforms (ABI 3500 XL sequencer) and a new generation sequencer

(Ion Torrent PGM, Applied Biosystems). In addition, large rearrangements were investigated

using the multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) technique.

Statistical Analysis

The program SPSS v.21.0 for Windows (Chicago, IL) was used for the statistical analysis.

The categorical variables were described using absolute frequencies and relative percentage

frequencies. The correlations were obtained using the Chi-square and Fisher’s exact tests.

The level of significance adopted in all the tests was 5%.

Results

The following polymorphisms were considered in this study: rs2981582 in gene FGFR2,

rs3803662 in gene TNRC9, rs13281615 and rs889312 in gene MAP3K1 and rs3817198 in

gene LSP1.

144

Table 1 presents the genotype frequency of the five polymorphisms that were

evaluated and their distribution in the different study groups.

Table 1: Frequency of polymorphisms rs3803662 (TNRC9), rs2981582 (FGFR2), rs13281615,

rs889312 (MAP3K1) and rs3817198 (LSP1) per group.

Variable Group 1

N (%) Group 2

N (%) Group 3

N (%) Group 4

N (%) P value*

rs3803662 (TNRC9) 0.027

TT 5 (9.8) 12 (22.6) 17 (17.3) 16 (19.5)

CT 27 (52.9) 24 (45.3) 47 (48.0) 37 (45.1)

CC 19 (37.3) 17 (32.1) 34 (34.7) 29 (35.4)

rs2981582 (FGFR2) 0.031

TT 14 (27.5) 9 (16.7) 26 (26.3) 19 (23.2)

CT 22 (43.1) 33 (61.1) 49 (49.5) 43 (52.4)

CC 15 (29.4) 12 (22.2) 24 (24.2) 20 (24.4)

rs13281615 (8q24) 0.029

AA 14 (27.5) 11 (20.4) 27 (27.0) 23 (28.0)

AG 24 (47.1) 26 (48.1) 48 (48.0) 37 (45.1)

GG 13 (25.5) 17 (31.5) 25 (25.0) 22 (26.8)

rs889312 (MAP3K1) 0.029

CC 8 (15.7) 8 (14.8) 11 (11.0) 8 (9.8)

CA 21 (41.2) 20 (37.0) 55 (55.0) 36 (43.9)

AA 22 (43.1) 26 (48.1) 34 (34.0) 38 (46.3)

rs3817198 (LSP1) 0.023

TT 26 (51.0) 28 (51.9) 44 (44.4) 38 (46.3)

TC 22 (43.1) 24 (44.4) 43 (43.4) 38 (46.3)

CC 3 (5.9) 2 (3.7) 12 (12.1) 6 (7.3)

*Chi-square

Group 1: women with germline mutations in the BRCA1/BRCA2 genes; Group 2: women with VUS in the BRCA1/BRCA2 genes; Group 3: women WT for the BRCA1/BRCA2 genes; Group 4: control, sporadic group.

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

Although there were no marked differences in the frequency of the polymorphisms

studied among the four groups, some findings are noteworthy: i) there was a higher

frequency of TT homozygotes for rs3803662 in the groups comprising women without

mutations in the BRCA1/BRCA2 genes; ii) regarding rs889312, an increase was observed in

145

the frequency of heterozygous individuals among those without mutations or VUS in

BRCA1/2; and iii) the groups with mutations and VUS had higher frequencies of

homozygosity for the “normal” allele and of heterozygosity for the SNP rs3817198 compared

to the WT and sporadic groups, which had a relatively increased frequency of CC

homozygotes compared to groups 1 and 2.

The analysis of the family history of cancer according to the different polymorphisms

studied is detailed in Table 2.

146

Table 2: Correlations between the genotype frequencies of the polymorphisms and the

family history of cancer (overall).

Number of cancer

cases

Presence of bilateral breast

cancer

Presence of ovarian cancer

Number of generations with cancer

Number of breast cancer

cases

Polymorphism ≤3 >3 Yes No Yes No 1 2 3 4 ≤3 >3

rs3803662 - TT N (%)

24 (20.2)

24 (15.5)

4 (20.0)

43 (17.0)

4 (14.3)

43 (17.5)

18 (22.2)

20 (16.8)

9 (13.4)

1 (16.7)

39 (18.2)

9 (15.2)

rs3803662 - TC N (%)

49 (41.2)

83 (53.6)

9 (45.0)

123 (48.6)

15 (53.6)

117 (47.6)

33 (40.7)

59 (49.6)

36 (53.7)

4 (66.6)

97 (45.3)

34 (57.6)

rs3803662 - CC N (%)

46 (38.6)

48 (30.9)

7 (35.0)

87 (34.4)

9 (32.1)

85 (34.7)

30 (37.1)

40 (33.6)

22 (32.9)

1 (16.7)

78 (36.5)

16 (27.2)

Total N (%) 119

(100.0) 155

(100.0 20

(100.0) 253

(100) 28

(100) 245

(100.0) 81

(100) 119

(100) 67

(100) 6

(100) 214

(100) 59

(100)

P value* (p=0.729) (p=0.883) (p=0.959) (p=0.885) (p=0.538)

rs2981582 - TT N (%)

32 (26.6)

34 (21.8)

4 (20.0)

62 (24.3)

2 (7.5)

64 (25.8)

20 (24,7)

31 (26,0)

12 (17,4)

3 (50,0)

50 (23,3)

15 (25,0)

rs2981582 - TC N (%)

53 (44.2)

89 (57.1)

13 (65.0)

129 (50.6)

18 (66.6)

124 (50.0)

38 (46.9)

58 (48.7)

44 (63.7)

1 (16.6)

108 (50.2)

34 (56.6)

rs2981582 - CC N (%)

35 (29.2)

33 (21.1)

3 (15.0)

64 (25.1)

7 (25.9)

60 (24.2)

23 (28.4)

30 (25.3)

13 (18.9)

2 (33.4)

57 (26.5)

11 (18.4)

Total N (%) 120

(100.0) 156

(100) 20

(100.0) 255

(100) 27

(100) 248

(100.0) 81

(100) 119

(100) 69

(100) 6

(100) 215

(100) 60

(100)

P value* (p=0.729) (p=0.721) (p=0.154) (p=0.665) (p=0.329)

rs13281615 - AA N (%)

36 (30.0)

34 (21.7)

3 (15.0)

67 (26.1)

11 (39.3)

59 (23.8)

27 (33.3)

26 (21.8)

17 (24.3)

0 (0.0)

55 (25.5)

15 (25.0)

rs13281615 - AG N (%)

64 (53.3)

69 (43.9)

5 (25.0)

127 (49.6)

12 (42.8)

120 (48.4)

40 (49.4)

61 (51.3)

28 (40.0)

3 (50.0)

105 (48.6)

27 (45.0)

rs13281615 -GG N (%)

20 (16.7)

54 (34.4)

12 (60.0)

62 (24.3)

5 (17.9)

69 (27.8)

14 (17.3)

32 (26.9)

25 (35.7)

3 (50.0)

56 (25.9)

18 (30.0)

Total N (%) 120

(100) 157

(100) 20

(100.0) 256

(100) 28

(100) 248

(100) 81

(100) 119

(100) 70

(100) 6

(100) 216

(100) 60

(100)

P value* 0.003 0.005 0.078 0.005 0.667

rs889312 - CC N (%)

14 (11.6)

19 (12.1)

5 (25.0)

28 (10.9)

2 (7.1)

31 (12.5)

7 (8.7)

16 (13.4)

10 (14.4)

0 (0.0)

27 (12.5)

6 (10.0)

rs889312 - CA N (%)

52 (43.4)

77 (49.0)

12 (60.0)

117 (45.7)

12 (42.9)

117 (47.2)

36 (44.4)

50 (42.0)

37 (52.8)

5 (83.3)

99 (45.8)

30 (50.0)

rs889312 - AA N (%)

54 (45.0)

61 (38.9)

3 (15.0)

111 (43.4)

14 (50.0)

100 (40.3)

38 (46.9)

53 (44.6)

23 (32.8)

1 (16.7)

90 (41.6)

24 (40.0)

Total N (%) 120

(100) 157

(100) 20

(100) 256

(100) 28

(100) 248

(100) 81

(100) 119

(100) 70

(100) 6

(100) 216

(100) 60

(100)

P value* 0.469 0.006 0.260 0.066 0.932

rs3817198 - TT N (%)

59 (49.1)

74 (47.4)

6 (30.0)

127 (49.8)

18 (66.7)

115 (46.3)

46 (56.8)

51 (42.9)

33 (47.8)

2 (33.3)

105 (48.8)

28 (46.7)

rs3817198 - TC N (%)

47 (39.2)

73 (49.8)

10 (50.0)

109 (42.7)

6 (22.2)

113 (45.6)

30 (37.1)

60 (50.4)

26 (37.7)

4 (66.7)

92 (42.8)

28 (46.7)

rs3817198 - CC N (%)

14 (11.7)

9 (5.8)

4 (20.0)

19 (7.5)

3 (11.1)

20 (8.1)

5 (6.1)

8 (6.7)

10 (14.5)

0 (0.0)

18 (8.4)

4 (6.6)

Total N (%) 120

(100) 156

(100) 20

(100) 255

(100) 27

(100) 248

(100) 81

(100) 119

(100) 69

(100) 6

(100) 215

(100) 60

(100)

P value* 0.635 0.029 0.183 0.097 0.960

*Chi-square

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

147

When comparing the genotypes with the family history of cancer, some potential

associations were identified, including the occurrence of bilateral breast cancer and

homozygosity for the G allele in rs13281615 and rs889312 in which 85% of women with

bilateral breast cancer had at least one C allele versus 57% of those with unilateral breast

cancer. Likewise, 85% of the women with bilateral breast cancer had at least one T allele in

rs2981582. Furthermore, regarding allele G in rs13281615, we observed that the proportion of

individuals who were homozygous for this allele increased with the number of generations

affected by cancer. Moreover, we observed that in the case of rs3803662 and rs2981582,

heterozygous TC individuals presented a higher number of cancer cases (in general) and a

higher number of breast cancer cases.

Detailed data on the frequency of the different genotypes versus the family history of

cancer with the women subgrouped according to their BRCA1 and BRCA2 gene mutation status

are found in supplemental Tables 1 to 5.

In addition, the frequency of the different genotypes was compared to the family

history by separately considering the women with a mutation in BRCA1 to those with mutations

in BRCA2. Given the limited sample size of patients with a deleterious mutation identified in

these genes, the group stratification per mutated gene limited the statistical analyses that were

conducted. However, some trends could be observed, for example, all of the women with

mutations in the BRCA2 gene with bilateral breast cancer were homozygous for the G allele in

rs132281615, and among those with mutations in BRCA1 and with bilateral breast cancer, 86%

had at least one G allele. Moreover, in regard to rs3817198, all of the women with mutations in

BRCA1 and with ovarian cancer had at least one T allele (with 88.9% being TT homozygotes);

however, the same pattern was not observed for the women with mutations in BRCA2 and a

personal history of ovarian cancer (p=0.006). To reach a conclusion on the association of these

polymorphisms with the BRCA1/2 mutational status and with a family history of cancer, more

patients with these characteristics must be genotyped.

The data correlating the genotypes of the five polymorphisms that were analyzed

with the status of the hormone receptors (estrogen, progesterone and HER2) are shown in

Table 3.

148

Table 3: Correlation between the genotype frequencies of the polymorphisms and the

hormone receptors (overall).

Estrogen Progesterone Her-2

Polymorphisms Negative Positive Negative Positive Negative Positive Inconclusive

rs3803662 - TT N (%)

16 (16.3) 33 (18.9) 25 (20.5) 24 (15.8) 32 (16.0) 14 (21.2) 3 (100.0)

rs3803662 - TC N (%)

42 (42.9) 84 (48.3) 51 (41.8) 78 (51.3) 98 (49.3) 26 (39.4) 0 (0.0)

rs3803662 - CC N (%)

40 (40.8) 57 (32.8) 46 (37.7) 50 (32.9) 69 (34.7) 26 (39.4) 0 (0.0)

Total 98 (100.0) 174 (100.0) 122 (100.0) 152 (100.0) 199 (100.0) 66 (100.0) 3 (100.0)

P value* 0.035 0.068 0.037

rs2981582 - TT N (%)

20 (20.7) 45 (25.4) 22 (18.0) 43 (28.0) 46 (22.9) 18 (27.3) 1 (33.4)

rs2981582 – CT N (%)

47 (48.4) 94 (53.2) 66 (54.0) 76 (49.3) 100 (49.7) 36 (54.5) 2 (66.6)

rs2981582 – CC N (%)

30 (30.9) 38 (21.4) 34 (28.0) 35 (22.7) 55 (27.4) 12 (18.2) 0 (0.0)

Total 97 (100.0) 177 (100.0) 122 (100.0) 154 (100.0) 201 (100.0) 66 (100.0) 3 (100.0)

P value* 0.020 0.014 0.025

rs13281615 - AA N (%)

26 (26.5) 47 (26.5) 36 (29.3) 38 (24.7) 52 (25.9) 17 (25.4) 2 (66.6)

rs13281615 - AG N (%)

42 (42.8) 86 (48.7) 54 (43.9) 74 (48.0) 93 (46.2) 32 (47.7) 1 (33.4)

rs13281615 - GG N (%)

30 (30.7) 44 (24.8) 33 (26.8) 42 (27.3) 56 (27.9) 18 (26.9) 0 (0.0)

Total 98 (100.0) 177 (100.0) 123 (100.0) 154 (100.0) 201 (100.0) 67 (100.0) 3 (100.0)

P value* 0.056 0.056 0.056

rs889312 - CC N (%)

13 (13.3) 22 (12.4) 12 (9.7) 23 (14.9) 27 (13.4) 7 (10.5) 0 (0.0)

rs889312 - CA N (%)

44 (44.9) 81 (45.8) 61 (49.5) 65 (42.2) 90 (44.7) 32 (47.7) 1 (33.3)

rs889312 - AA N (%)

41 (41.8) 74 (40.6) 50 (43.1) 66 (42.9) 84 (41.9) 28 (41.8) 2 (66.7)

Total 98 (100.0) 177 (100.0) 123 (100.0) 154 (100.0) 201 (100.0) 67 (100.0) 3 (100.0)

P value* 0.073 0.066 0.062

rs3817198 - TT N (%)

51 (52.6) 80 (45.2) 61 (50.0) 71 (46.1) 98 (48.8) 39 (51.4) 0 (0.0)

rs3817198 - TC N (%)

40 (41.2) 83 (46.9) 50 (41.0) 74 (48.1) 89 (44.3) 31 (40.7) 3 (100)

rs3817198 - CC N (%)

6 (6.2) 14 (7.9) 11 (9.0) 9 (5.8) 14 (6.9) 6 (7.9) 0 (0.0)

Total 97 (100.0) 177 (100.0) 122 (100.0) 154 (100.0) 201 (100.0) 76 (100.0) 3 (100.0)

P value* 0.042 0.077 0.042

*Chi-square

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

149

When the different polymorphisms were analyzed with the hormone receptors, we

observed an increased frequency of heterozygotes for rs3803662 in individuals with

estrogen receptor (ER)-positive tumors, in individuals with progesterone receptor (PR)-

positive tumors and in individuals who were negative for the HER2 receptor. Regarding

rs2981582, individuals with at least one T allele more frequently exhibited positivity for the

three receptors (ER, PR and HER2). We also observed an increased frequency of the WT

allele among ER-negative individuals. For the SNPs rs13281615 and rs889312, no association

was found between their frequencies and the hormone receptors considered.

When the analysis of the polymorphisms with the hormone receptors was conducted

separately for the groups studied (supplementary Tables 6 to 10), we noted some

associations. Regarding the SNP rs2981582 in gene FGFR2, we observed an association

between group 2 (with VUS in the BRCA1/2 genes) with the ER in which the presence of TT

homozygotes was not observed, and TC heterozygosity was present in 73.7% of the ER-

negative cases. Additionally, when this analysis was performed for the SNP rs13281615, we

observed an association with HER-2 negativity in group 3 (WT for BRCA1/2), with 49.1% of

individuals being AG heterozygotes. For the SNP rs889312 in gene MAP3K1, an association

with HER-2-negative tumors was observed in group 2, and 46.0% of the negative cases were

homozygous for the A allele. The SNP rs3817198 in gene LSP1 showed an association with

the ER in group 3 (WT), in which 50.0% of the ER-positive cases were heterozygous (TC).

Finally, in the case of the SNP rs3803662 in gene TNRC9, the increased frequency of allele C

homozygosity was more evident in groups 1 and 3, in which most cases of ER-negative

tumors have the CC genotype.

An analysis of genotypes versus hormone receptors was conducted by separately

considering the individuals with BRCA1 mutations and those with identified mutations in

BRCA2, but no association was observed in this analysis (data not shown).

The association between the genotypes in the five SNPs considered and the age at

diagnosis was evaluated. Although no significant association was identified, these data are

shown in Table 4.

150

Table 4: Mean age of the polymorphism genotypes.

Polymorphism Mean Age Standard Deviation

rs889312 (MAP3K1)

CC 42.11 14.937

CA 43.67 11.628

AA 40.48 11.726

rs13281615 (8q24) AA 41.09 13.669

AG 41.92 11.003

GG 43.61 12.573

rs2981582 (FGFR2)

AA 41.12 12.189

AG 42.42 12.184

GG 42.33 12.113

rs3803662 (TNRC9)

AA 43.06 10.707

AG 43.00 13.239

GG 40.73 11.374

rs3817198 (LSP1)

TT 41.68 12.642

TC 42.27 11.672

CC 43.55 11.995

Discussion

Genetic polymorphisms are being widely evaluated as modifiers of the genetic risk of

disease by several research groups. A study conducted by Garcia-Closas and collaborators

(14) evaluated the frequency of five polymorphisms that were previously reported to be

associated with an increased risk of breast cancer (10) and investigated whether the

association between these polymorphisms and the risk of breast cancer was somehow

influenced by clinically relevant tumoral features in 23,039 cases of invasive breast cancer

and in 26,273 controls from 20 different studies. The authors found that common genetic

variants (polymorphisms) influenced the pathological tumor subtype, which provided

additional evidence of the biologically distinct behavior of ER-positive versus ER-negative

tumors.

In this study, we compared the genotype distribution of the five polymorphisms that

were previously reported in the literature to be associated with the risk of breast cancer (10,

151

14, 15) in three groups of women: women with putative hereditary breast cancer, with or

without germline mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes, women with VUS identified in

one of those genes, and women with putative sporadic breast cancer. The genotype data

from the five polymorphisms were then correlated with the family history of cancer and the

histopathological features of the tumors, always considering a possible influence of the

mutational status of BRCA1/2.

When we compared the genotypes of the polymorphisms analyzed with the

pathological characteristics of the tumors, we noted that, in the case of the SNP rs3803662

in gene TNRC9, there was an increased frequency of GG homozygotes among ER-negative

individuals (as previously reported by Easton and collaborators (10) in 2007), and although

the difference was not statistically significant, it was possible to observe that this difference

was stronger among women in groups 1 (with mutations) and 3 (WT). Regarding the SNP

rs2981582, which was localized in gene FGFR2, we observed an increased frequency of the T

allele in women who were positive for the estrogen and progesterone receptors (p=0.020

and p=0.014, respectively); this increase in frequency among individuals positive for the

hormone receptors (ER and PR) did not depend on the group to which the women belonged.

There are several studies evaluating the effects of polymorphisms on the risk of

cancer and their association with tumoral features. According to the study published by

Tapper and collaborators (16) in 2008, some polymorphisms capable of altering the risk of

breast cancer are being discovered. The study conducted by the above mentioned authors

had the objective of evaluating how those variants may influence the prognosis and risk of

developing breast cancer. For this purpose, 1,001 women with non-familial, invasive breast

cancer that was diagnosed at early age were analyzed compared to a group of women with

hereditary breast cancer; the presence and frequency of 206 SNPs in 30 candidate genes

were evaluated in the two groups. An association with an increased risk of developing breast

cancer was found in the SNPs localized in the CASP8, TNRC9 and ESR1 genes. The authors

also reported an association between survival and eight SNPs in six genes (MAP3K1, DAPK1,

LSP1, MMP7, TOX3 and ESR1) and another SNP in a gene-free region in 8q24. For the SNPs in

genes MMP7, TOX3 and MAP3K1, the survival effects did not depend on the known main

clinical prognosis factors. The effect of the SNP in ESR1 on survival was more significant

when only ER-positive tumors were evaluated. When the cases were stratified according to

152

tumor features, it was observed that the SNPs in FGFR2 and TOX3 were associated with the

disease. Finally, the study showed that several SNPs were associated with survival. In some

cases, this association may occur because of an effect on the tumor characteristics that has

an impact on prognosis; in other cases, the effect appears to be independent of these

prognostic factors (16).

Results published by Fanale and collaborators (17) in 2012 demonstrated the

association of some SNPs with breast cancer. The genes in which the polymorphisms

described reside in are TNRC9, FGFR2, MAP3K1, H19 and LSP1. The most strongly associated

SNP is localized in gene FGFR2, which was overexpressed in 5-10% of the cases of breast

cancer. The SNP in gene TNRC9 showed a stronger association with breast cancer and

appeared to be correlated with the presence of bone metastases and positivity for the

estrogen receptor. The SNP rs889312 in gene MAP3K1 showed sensitivity only in individuals

harboring mutations in BRCA2, and it was not associated with an increased risk in carriers of

BRCA1 mutations. Several SNPs in LSP1 and H19 were most likely associated with the risk of

developing cancer. Therefore, the study concluded that the identification of risk-modifying

polymorphisms may lead to a better understanding of the biological mechanism of breast

cancer, thus improving the prevention, detection and early treatment of the disease.

The results of the analyses of the presence and frequency of the five polymorphisms

considered here were compared to the family history of cancer. Several associations were

identified in that comparison, either with the number of cancer cases in the family

(associated with the SNPs rs2981582 and rs13281615), with the presence of bilateral breast

cancer (SNP rs13281615) or with the number of generations affected by cancer (SNP

rs13281615). Moreover, regarding allele G of rs13281615, we observed that the proportion

of individuals who were homozygous for this allele increased as the number of generations

affected by cancer increased. Many of the findings described here corroborate data in the

literature, such as the association found between SNP rs13281615 and a positive family

history of cancer, which was a correlation previously reported by Gorodnova and

collaborators in 2010 (18).

The effect of polymorphisms on the family history of cancer was also reported by

Huijts and collaborators (19), who showed an association between rs2981582 in gene FGFR2

153

and the average number of first- and second-degree relatives with breast and/or ovarian

cancers (P = 0.05). The authors also found an association with the age at diagnosis, in which

individuals who were heterozygous or homozygous for the least frequent allele for

rs3803662 had a higher probability of having the cancer diagnosed at an age younger than

60 years.

An association with age at diagnosis was not observed in this study for any of the five

polymorphisms considered. However, the data obtained and the possible associations

identified with the tumor pathological features and with the family history of cancer must be

validated using a larger sample size. Nonetheless, if these associations are confirmed, we will

have additional data to understand the epidemiology of hereditary and familial cancer in our

population.

Conclusion

Some potential associations were found between the five polymorphisms analyzed in

this study previously reported in the literature as being associated and an increase in the risk

of breast cancer, with an emphasis placed on the effect of these polymorphisms on the

family history of cancer and on hormone receptor positivity/negativity. These findings must

be interpreted with caution because of the limited sample size in this study. The data must

be validated with a larger number of cases and, if confirmed, the clinical relevance of the

associations identified and their applicability in medical practice must be considered

carefully. However, the results presented here provide interesting information on the

modifying effect of polymorphisms on the family history of cancer and may be a variable to

consider in the analysis of tumor diversity, and of the family history observed in families with

hereditary breast cancer (even in those harboring the same type of genetic alteration).

Acknowledgments

This study was supported by a grant from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq), Edital MCT/CNPq 14/2010, processo 480760/2010-1.

154

References

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155

19. Huijts PE, Vreeswijk MP, Kroeze-Jansema KH, Jacobi CE, Seynaeve C, Krol-Warmerdam EM, et al. Clinical correlates of low-risk variants in FGFR2, TNRC9, MAP3K1, LSP1 and 8q24 in a Dutch cohort of incident breast cancer cases. Breast Cancer Res. 2007;9(6):R78.

156

Supplemental material tables

Table 1 Correlation between the frequency of polymorphism rs3803662 in gene TNRC9 and the

family history of cancer (per group).

Family history AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P value*

Number of cancer cases

Group 1 0.235

<=3 2 (25.0) 2 (25.0) 4 (50.0) 8 (100.0)

>3 3 (7.0) 25 (58.1) 15 (34.9) 43 (100.0)

Group 2 0.149

<=3 6 (33.3) 5 (27.7) 7 (38.9) 18 (100.0)

>3 6 (17.1) 19 (54.3) 10 (28.6) 35 (100.0)

Group 3 0.055

<=3 5 (12.8) 18 (46.2) 16 (41.0) 39 (100.0)

>3 12 (20.3) 29 (49.2) 18 (30.5) 59 (100.0)

Group 4 0.147

<=3 11 (20.4) 24 (44.4) 19 (35.2) 54 (100.0)

>3 3 (16.6) 10 (55.6) 5 (27.8) 18 (100.0)

Presence of bilateral breast cancer

Group 1 0.198

Yes 1 (10.0) 6 (60.0) 3 (30.0) 10 (100.0)

No 4 (9.8) 21 (51.2) 16 (39.0) 41 (100.0)

Group 2 0.234

Yes 2 (40.0) 1 (20.0) 2 (40.0) 5 (100.0)

No 10 (20.8) 23 (48.0) 15 (31.2) 48 (100.0)

Group 3 0.253

Yes 1 (20.0) 2 (40.0) 2 (40.0) 5 (100.0)

No 16 (17.2) 45 (48.4) 32 (34.4) 93 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 13 (18.3) 34 (47.9) 24 (33.8) 71 (100.0)

Presence of ovarian cancer

Group 1 0.098

Yes 0 (0.0) 7 (53.8) 6 (46.2) 13 (100.0)

No 5 (13.2) 20 (52.6) 13 (34.2) 38 (100.0)

Group 2 0.175

Yes 1 (25.0) 3 (75.5) 0 (0.0) 4 (100.0)

No 11 (22.5) 21 (42.9) 17 (34.6) 49 (100.0)

Group 3 0.122

Yes 3 (27.3) 5 (45.4) 3 (27.3) 11 (100.0)

No 14 (16.1) 42 (48.3) 31 (35.6) 87 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 13 (18.3) 34 (47.9) 24 (33.8) 71 (100.0)

Number of generations with cancer

Group 1 0.086

1 1 (11.1) 3 (33.3) 5 (55.6) 9 (100.0)

2 4 (20.0) 8 (40.0) 8 (40.0) 20 (100.0)

3 0 (0.0) 13 (68.4) 6 (31.6) 19 (100.0)

4 0 (0.0) 3 (100.0) 0 (0.0) 3 (100.0)

Group 2 0.039

1 5 (45.5) 4 (36.4) 2 (18.1) 11 (100.0)

2 4 (16.0) 12 (48.0) 9 (36.0) 25 (100.0)

3 3 (17.7) 8 (47.0) 6 (35.3) 17 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

157

Table 1 (Cont.): Correlation between the frequency of polymorphism rs3803662 in gene

TNRC9 and the family history of cancer (per group).

Family history AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P value*

Number of generations with cancer

Group 3 0.066

1 2 (12.5) 8 (50.0) 6 (37.5) 16 (100.0)

2 9 (18.0) 24 (48.0) 17 (34.0) 50 (100.0)

3 5 (17.9) 14 (50.0) 9 (32.1) 28 (100.0)

4 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.4) 3 (100.0)

Group 4 0.107

1 10 (22.2) 18 (40.0) 17 (37.8) 45 (100.0)

2 3 (12.5) 15 (62.5) 6 (25.0) 24 (100.0)

3 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.4) 3 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Number of breast cancer cases

Group 1 0.089

<=3 3 (13.0) 8 (34.8) 12 (52.2) 23 (100.0)

>3 2 (7.1) 19 (67.9) 7 (25.0) 28 (100.0)

Group 2 0.167

<=3 11 (25.6) 18 (41.9) 14 (32.5) 43 (100.0)

>3 1 (10.0) 6 (60.0) 3 (30.0) 10 (100.0)

Group 3 0.061

<=3 11 (14.5) 37 (48.7) 28 (36.8) 76 (100.0)

>3 6 (28.6) 9 (42.8) 6 (28.6) 21 (100.0)

Group 4 **

<=3 14 (19.4) 34 (47.2) 24 (33.4) 72 (100.0)

>3 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Age at diagnosis

Group 1 0.041

<=30 years 0 (0.0) 4 (50.0) 4 (50.0) 8 (100.0)

>30 and <=50 years 4 (11.8) 16 (47.0) 14 (41.2) 34 (100.0)

>50 years 1 (11.1) 7 (77.8) 1 (11.1) 9 (100.0)

Group 2 0.083

<=30 years 4 (16.7) 14 (58.3) 6 (25.0) 24 (100.0)

>30 and <=50 years 7 (29.2) 10 (41.6) 7 (29.2) 24 (100.0)

>50 years 1 (20.0) 0 (0.0) 4 (80.0) 5 (100.0)

Group 3 0.004

<=30 years 3 (10.0) 12 (40.0) 15 (50.0) 30 (100.0)

>30 and <=50 years 9 (16.6) 28 (51.9) 17 (31.5) 54 (100.0)

>50 years 4 (30.8) 7 (53.9) 2 (15.3) 13 (100.0)

Group 4 0.106

<=30 years 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

>30 and <=50 years 10 (25.0) 12 (30.0) 18 (45.0) 40 (100.0)

>50 years 6 (14.3) 25 (59.5) 11 (26.2) 42 (100.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

**It was not possible to conduct a comparative analysis in group 4 for the following variables: presence of bilateral breast cancer, presence of ovarian cancer and age at diagnosis.

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

158

Table 2: Correlation between the frequency of polymorphism rs2981582 in gene FGFR2 and

the family history of cancer (per group).

Family history

AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P value*

Number of cancer cases

Group 1 0.074

<=3 2 (25.0) 1 (12.5) 5 (62.5) 8 (100.0)

>3 12 (27.9) 21 (48.8) 10 (23.3) 43 (100.0)

Group 2 0.164

<=3 4 (22.2) 10 (55.6) 4 (22.2) 18 (100.0)

>3 5 (13.9) 23 (63.9) 8 (22.2) 36 (100.0)

Group 3 0.100

<=3 11 (27.5) 17 (42.5) 12 (30.0) 40 (100.0)

>3 15 (25.4) 32 (54.2) 12 (20.4) 59 (100.0)

Group 4 0.144

<=3 15 (27.7) 25 (46.3) 14 (26.0) 54 (100.0)

>3 2 (11.1) 13 (72.2) 3 (16.7) 18 (100.0)

Presence of bilateral breast cancer

Group 1 0.111

Yes 3 (30.0) 6 (60.0) 1 (10.0) 10 (100.0)

No 11 (26.8) 16 (39.0) 14 (34.2) 41 (100.0)

Group 2 0.257

Yes 0 (0.0) 4 (80.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

No 9 (18.3) 29 (59.2) 11 (22.5) 49 (100.0)

Group 3 0.249

Yes 1 (20.0) 3 (60.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

No 25 (26.6) 46 (48.9) 23 (24.5) 94 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 17 (24.0) 38 (53.5) 16 (22.5) 71 (100.0)

Presence of ovarian cancer

Group 1 0.129

Yes 2 (15.4) 7 (53.9) 4 (30.7) 13 (100.0)

No 12 (31.6) 15 (39.5) 11 (28.9) 38 (100.0)

Group 2 0.269

Yes 0 (0.0) 3 (75.0) 1 (25.0) 4 (100.0)

No 9 (18.0) 30 (60.0) 11 (22.0) 50 (100.0)

Group 3 0.111

Yes 0 (0.0) 8 (80.0) 2 (20.0) 10 (100.0)

No 26 (29.2) 41 (46.1) 22 (24.7) 89 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 17 (24.0) 38 (53.5) 16 (22.5) 71 (100.0)

Number of generations with cancer

Group 1 0.077

1 2 (22.2) 3 (33.3) 4 (44.5) 9 (100.0)

2 8 (40.0) 6 (30.0) 6 (30.0) 20 (100.0)

3 2 (10.5) 13 (68.4) 4 (21.1) 19 (100.0)

4 2 (66.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 3 (100.0)

Group 2 0.109

1 1 (9.1) 6 (54.5) 4 (36.4) 11 (100.0)

2 6 (24.0) 15 (60.0) 4 (16.0) 25 (100.0)

3 2 (11.1) 12 (66.6) 4 (22.3) 18 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

159

Table 2 (Cont.): Correlation between the frequency of polymorphism rs2981582 in gene

FGFR2 and the family history of cancer (per group).

Family history

AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P value*

Number of generations with cancer

Group 3 0.035

1 3 (18.7) 7 (43.8) 6 (37.5) 16 (100.0)

2 14 (8.4) 23 (13.7) 13 (77.9) 50 (100.0)

3 8 (27.6) 17 (58.6) 4 (13.8) 29 (100.0)

4 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.4) 3 (100.0)

Group 4 0.025

1 14 (31.1) 22 (48.9) 9 (20.0) 45 (100.0)

2 3 (12.5) 14 (58.3) 7 (29.2) 24 (100.0)

3 0 (0.0) 2 (66.3) 1 (33.4) 3 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Number of breast cancer cases

Group 1 0.063

<=3 6 (26.1) 7 (30.4) 10 (43.5) 23 (100.0)

>3 8 (28.6) 15 (53.6) 5 (17.8) 28 (100.0)

Group 2 0.162

<=3 9 (20.5) 25 (56.8) 10 (22.7) 44 (100.0)

>3 0 (0.0) 8 (66.6) 4 (33.4) 10 (100.0)

Group 3 0.087

<=3 18 (23.7) 38 (50.0) 20 (26.3) 76 (100.0)

>3 7 (31.8) 11 (50.0) 4 (18.2) 22 (100.0)

Group 4 **

<=3 17 (23.6) 38 (52.8) 17 (23.6) 72 (100.0)

>3 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Age at diagnosis

Group 1 0.125

<=30 years 2 (25.0) 4 (50.0) 2 (25.0) 8 (100.0)

>30 and <=50 years 10 (29.4) 13 (38.2) 11 (32.4) 34 (100.0)

>50 years 2 (22.2) 5 (55.6) 2 (22.2) 9 (100.0)

Group 2 0.080

<=30 years 6 (25.0) 12 (50.0) 6 (25.0) 24 (100.0)

>30 and <=50 years 3 (12.0) 18 (72.0) 4 (16.0) 25 (100.0)

>50 years 0 (0.0) 3 (60.0) 2 (40.0) 5 (100.0)

Group 3 0.085

<=30 years 10 (33.3) 12 (40.0) 8 (26.7) 30 (100.0)

>30 and <=50 years 13 (23.2) 31 (55.4) 12 (21.4) 56 (100.0)

>50 years 3 (25.0) 6 (50.0) 3 (25.0) 12 (100.0)

Group 4 0.125

<=30 years 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

>30 and <=50 years 10 (25.0) 19 (47.5) 11 (27.5) 40 (100.0)

>50 years 9 (21.4) 24 (57.1) 9 (21.5) 42 (100.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

**It was not possible to conduct a comparative analysis in Group 4 for the following variables: presence of bilateral breast cancer, presence of ovarian cancer and number of breast cancer cases.

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

160

Table 3: Correlation between the frequency of polymorphism rs13281615 and the family

history of cancer (per group).

Family history AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P value*

Number of cancer cases

Group 1 0.133

<=3 2 (25.0) 6 (75.0) 0 (0.0) 8 (100.0)

>3 12 (27.9) 18 (41.8) 13 (33.3) 43 (100.0)

Group 2 0.003

<=3 7 (41.2) 8 (47.0) 2 (11.8) 18 (100.0)

>3 4 (11.1) 17 (47.2) 15 (41.7) 36 (100.0)

Group 3 0.039

<=3 12 (30.0) 22 (55.0) 6 (15.0) 40 (100.0)

>3 15 (25.0) 26 (43.3) 19 (31.7) 60 (100.0)

Group 4 0.056

<=3 15 (27.8) 27 (50.0) 12 (22.2) 54 (100.0)

>3 3 (16.6) 8 (44.4) 7 (38.8) 18 (100.0)

Presence of bilateral breast cancer

Group 1 0.008

Yes 1 (10.0) 3 (30.0) 6 (60.0) 41 (100.0)

No 13 (31.7) 21 (51.2) 7 (17.1) 10 (100.0)

Group 2 0.020

Yes 0 (0.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 5 (100.0)

No 11 (22.5) 25 (51.0) 13 (26.5) 49 (100.0)

Group 3 0.245

Yes 2 (40.0) 1 (20.0) 2 (40.0) 95 (100.0)

No 25 (26.3) 47 (49.5) 23 (24.2) 5 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 18 (25.3) 34 (47.9) 19 (26.8) 71 (100.0)

Presence of ovarian cancer

Group 1 0.086

Yes 5 (38.5) 6 (46.1) 2 (15.4) 13 (100.0)

No 9 (23.7) 18 (47.3) 11 (29.0) 38 (100.0)

Group 2 0.167

Yes 1 (25.0) 3 (75.0) 0 (0.0) 4 (100.0)

No 10 (20.0) 23 (46.0) 17 (34.0) 50 (100.0)

Group 3 0.130

Yes 5 (45.4) 3 (27.3) 3 (27.3) 11 (100.0)

No 22 (24.7) 45 (50.6) 22 (24.7) 89 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 18 (25.3) 34 (47.9) 19 (26.8) 71 (100.0)

Number of generations with cancer

Group 1 0.090

1 2 (22.2) 4 (44.5) 3 (33.3) 9 (100.0)

2 3 (15.0) 14 (70.0) 3 (15.0) 20 (100.0))

3 9 (47.4) 5 (26.3) 5 (26.3) 19 (100.0)

4 0 (0.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 3 (100.0)

Group 2 0.003

1 6 (54.6) 4 (36.3) 1 (9.1) 11 (100.0)

2 3 (12.0) 14 (56.0) 8 (32.0) 25 (100.0)

3 2 (1.2) 8 (44.4) 8 (44.4) 18 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

161

Table 3 (Cont.): Correlation between the frequency of polymorphism rs13281615 and the

family history of cancer (per group).

Family history AA N (%)

AG N (%)

GG N (%)

Total N (%)

P value*

Number of generations with cancer

Group 3 0.005

1 6 (37.5) 8 (50.0) 2 (12.5) 16 (100.0)

2 16 (32.0) 23 (46.0) 11 (22.0) 50 (100.0)

3 5 (16.6) 14 (46.7) 11 (36.7) 30 (100.0)

4 0 (0.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 3 (100.0)

Group 4 0.033

1 13 (28.9) 24 (53.3) 8 (17.8) 45 (100.0)

2 4 (16.6) 10 (41.7) 10 (41.7) 24 (100.0)

3 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.4) 3 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Number of breast cancer cases

Group 1 0.148

<=3 5 (21.7) 14 (60.9) 4 (17.4) 23 (100.0)

>3 9 (32.1) 10 (35.8) 9 (32.1) 28 (100.0)

Group 2 0.130

<=3 10 (22.7) 21 (47.7) 13 (29.6) 44 (100.0)

>3 1 (10.0) 5 (50.0) 4 (40.0) 10 (100.0)

Group 3 0.130

<=3 22 (28.6) 35 (45.4) 20 (26.0) 77 (100.0)

>3 5 (22.7) 12 (54.6) 5 (22.7) 22 (100.0)

Group 4 **

<=3 18 (25.0) 35 (48.6) 19 (26.4) 72 (100.0)

>3 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Age at diagnosis

Group 1 0.034

<=30 years 4 (50.0) 4 (50.0) 0 (0.0) 8 (100.0)

>30 and <=50 years 7 (20.5) 18 (53.0) 9 (26.5) 34 (100.0)

>50 years 3 (33.3) 2 (22.2) 4 (44.5) 9 (100.0)

Group 2 0.097

<=30 years 8 (33.3) 8 (33.3) 8 (33.4) 24 (100.0)

>30 and <=50 years 2 (8.0) 15 (60.0) 8 (32.0) 25 (100.0)

>50 years 1 (20.0) 3 (60.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

Group 3 0.065

<=30 years 11 (36.6) 13 (43.4) 6 (20.0) 30 (100.0)

>30 and <=50 years 13 (23.2) 27 (48.2) 16 (28.6) 56 (100.0)

>50 years 3 (23.1) 8 (61.5) 2 (15.4) 13 (100.0)

Group 4 0.049

<=30 years 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

>30 and <=50 years 13 (32.5) 19 (47.5) 8 (20.0) 40 (100.0)

>50 years 10 (23.8) 18 (42.9) 14 (33.3) 42 (100.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

**It was not possible to conduct a comparative analysis in group 4 for the following variables: presence of bilateral breast cancer, presence of ovarian cancer and number of breast cancer cases.

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

162

Table 4: Correlation between the frequency of polymorphism rs889312 in gene MAP3K1 and

the family history of cancer (per group).

Family history CC N (%)

CA N (%)

AA N (%)

Total N (%)

P value*

Number of cancer cases

Group 1 0.205

<=3 2 (25.0) 2 (25.0) 4 (50.0) 8 (100.0)

>3 6 (14.0) 19 (44.1) 18 (41.9) 43 (100.0)

Group 2 0.077

<=3 4 (22.2) 7 (38.9) 7 (38.9) 18 (100.0)

>3 4 (11.1) 13 (36.1) 19 (52.8) 36 (100.0)

Group 3 0.109

<=3 5 (12.5) 19 (47.5) 16 (40.0) 40 (100.0)

>3 6 (10.0) 36 (60.0) 18 (30.0) 60 (100.0)

Group 4 0.048

<=3 3 (5.6) 24 (44.4) 27 (50.0) 54 (100.0)

>3 3 (16.6) 9 (50.0) 6 (33.4) 18 (100.0)

Presence of bilateral breast cancer

Group 1 0.079

Yes 2 (20.0) 6 (60.0) 2 (20.0) 10 (100.0)

No 6 (14.6) 15 (36.6) 20 (48.8) 41 (100.0)

Group 2 0.019

Yes 2 (40.0) 3 (60.0) 0 (0.0) 5 (100.0)

No 6 (12.2) 17 (34.7) 26 (53.1) 49 (100.0)

Group 3 0.199

Yes 1 (20.0) 3 (60.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

No 10 (10.5) 52 (54.7) 33 (34.8) 95 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 6 (8.2) 33 (45.2) 34 (46.6) 71 (100.0)

Presence of ovarian cancer

Group 1 0.147

Yes 1 (7.6) 6 (46.2) 6 (46.2) 13 (100.0)

No 7 (18.4) 15 (39.5) 16 (42.1) 38 (100.0)

Group 2 0.164

Yes 0 (0.0) 1 (25.0) 3 (75.0) 4 (100.0)

No 8 (16.0) 19 (38.0) 23 (46.0) 50 (100.0)

Group 3 0.156

Yes 1 (9.0) 5 (45.5) 5 (45.5) 11 (100.0)

No 10 (11.2) 50 (56.2) 29 (32.6) 89 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 6 (8.4) 33 (46.5) 32 (45.1) 71 (100.0)

Number of generations with cancer

Group 1 0.088

1 0 (0.0) 6 (66.7) 3 (33.3) 9 (100.0)

2 5 (25.0) 4 (20.0) 11 (55.0) 20 (100.0)

3 3 (15.8) 9 (47.3) 7 (36.9) 19 (100.0)

4 0 (0.0) 2 (66.4) 1 (33.3) 3 (100.0)

Group 2 0.081

1 3 (27.3) 3 (27.3) 5 (45.4) 11 (100.0)

2 3 (12.0) 10 (40.0) 12 (48.0) 25 (100.0)

3 2 (11.1) 7 (38.9) 9 (50.0) 18 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

163

Table 4 (Cont.): Correlation between the frequency of polymorphism rs889312 in gene

MAP3K1 and the family history of cancer (per group).

Family history CC N (%)

CA N (%)

AA N (%)

Total N (%)

P value*

Number of generations with cancer

Group 3 0.023

1 1 (6.3) 9 (56.2) 6 (37.5) 16 (100.0)

2 6 (12.0) 22 (44.0) 22 (44.0) 50 (100.0)

3 4 (13.3) 20 (66.7) 6 (20.0) 30 (100.0)

4 0 (0.0) 3 (100.0) 0 (0.0) 3 (100.0)

Group 4 0.031

1 3 (6.7) 18 (40.0) 24 (53.3)

2 2 (8.3) 14 (58.4) 8 (33.3) 45 (100.0)

3 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.4) 24 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (100.0)

Number of breast cancer cases

Group 1 0.103

<=3 5 (21.8) 9 (39.1) 9 (39.1) 23 (100.0)

>3 3 (10.7) 12 (42.8) 13 (46.5) 28 (100.0)

Group 2 0.146

<=3 7 (15.9) 17 (38.6) 20 (45.5) 44 (100.0)

>3 1 (10.0) 3 (30.0) 6 (60.0) 10 (100.0)

Group 3 0.116

<=3 9 (11.7) 40 (51.9) 28 (36.4) 77 (100.0)

>3 2 (9.1) 15 (68.2) 5 (22.7) 22 (100.0)

Group 4 **

<=3 6 (8.4) 33 (45.8) 33 (45.8) 72 (100.0)

>3 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Age at diagnosis

Group 1 0.121

<=30 years 1 (12.5) 3 (37.5) 4 (50.0) 8 (100.0)

>30 and <=50 years 6 (17.6) 13 (38.2) 15 (44.2) 34 (100.0)

>50 years 1 (11.1) 5 (55.5) 3 (33.4) 9 (100.0)

Group 2 0.030

<=30 years 3 (12.5) 7 (29.1) 14 (58.4) 24 (100.0)

>30 and <=50 years 3 (12.0) 11 (44.0) 11 (44.0) 25 (100.0)

>50 years 2 (40.0) 2 (40.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

Group 3 0.085

<=30 years 5 (16.7) 13 (43.3) 12 (40.0) 30 (100.0)

>30 and <=50 years 4 (7.1) 34 (60.8) 18 (32.1) 56 (100.0)

>50 years 2 (15.4) 8 (61.5) 3 (23.1) 13 (100.0)

Group 4 0.002

<=30 years 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

>30 and <=50 years 1 (2.5) 15 (37.5) 24 (60.0) 40 (100.0)

>50 years 7 (16.7) 21 (50.0) 14 (33.3) 42 (100.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

**It was not possible to conduct a comparative analysis in group 4 for the following variables: presence of bilateral breast cancer, presence of ovarian cancer and number of breast cancer cases.

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

164

Table 5: Correlation between the frequency of polymorphism rs3817198 in gene LSP1 and

the family history of cancer (per group).

Family history TT

N (%)

TC

N (%)

CC

N (%)

Total N (%)

P value*

Number of cancer cases

Group 1 0.067

<=3 2 (25.0) 5 (62.5) 1 (12.5) 8 (100.0)

>3 24 (55.9) 17 (39.5) 2 (4.6) 43 (100.0)

Group 2 0.196

<=3 10 (55.5) 7 (38.9) 1 (5.5) 18 (100.0)

>3 18 (50.0) 17 (47.2) 1 (2.8) 36 (100.0)

Group 3 0.100

<=3 19 (47.5) 13 (32.5) 8 (20.0) 40 (100.0)

>3 25 (42.4) 30 (50.8) 4 (6.8) 59 (100.0)

Group 4 0.105

<=3 28 (51.9) 22 (40.7) 4 (7.4) 54 (100.0)

>3 7 (38.9) 9 (50.0) 2 (11.1) 18 (100.0)

Presence of bilateral breast cancer

Group 1 0.081

Yes 3 (30.0) 6 (60.0) 1 (10.0) 41 (100.0)

No 23 (56.1) 16 (39.0) 2 (4.9) 10 (100.0)

Group 2 0.292

Yes 2 (40.0) 3 (60.0) 0 (0.0) 5 (100.0)

No 26 (53.0) 21 (42.9) 2 (4.1) 49 (100.0)

Group 3 0.017

Yes 1 (20.0) 1 (20.0) 3 (60.0) 5 (100.0)

No 43 (45.7) 42 (44.7) 9 (9.6) 94 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 35 (49.3) 30 (42.3) 6 (8.4) 71 (100.0)

Presence of ovarian cancer

Group 1 0.018

Yes 11 (84.6) 1 (7.7) 1 (7.7) 13 (100.0)

No 15 (39.4) 21 (55.3) 2 (5.3) 38 (100.0)

Group 2 0.249

Yes 3 (75.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0)

No 25 (50.0) 23 (46.0) 2 (4.0) 50 (100.0)

Group 3 0.156

Yes 4 (40.0) 4 (40.0) 2 (20.0) 10 (100.0)

No 40 (45.0) 39 (43.8) 10 (11.2) 89 (100.0)

Group 4 **

Yes 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

No 35 (49.3) 30 (42.2) 6 (8.5) 71 (100.0)

Number of generations with cancer

Group 1 0.103

1 6 (66.7) 2 (22.2) 1 (11.1) 9 (100.0)

2 9 (45.0) 10 (50.0) 1 (5.0) 20 (100.0)

3 10 (52.6) 8 (42.1) 1 (5.3) 19 (100.0)

4 1 (33.3) 2 (66.7) 0 (0.0) 3 (100.0)

Group 2 0.042

1 4 (36.4) 6 (54.5) 1 (9.1) 11 (100.0)

2 12 (48.0) 13 (52.0) 0 (0.0) 25 (100.0)

3 12 (66.6) 5 (27.8) 1 (5.6) 18 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

165

Table 5 (Cont.): Correlation between the frequency of polymorphism rs3817198 in gene

LSP1 and the family history of cancer (per group).

Family history TT

N (%)

TC

N (%)

CC

N (%)

Total N (%)

P value*

Number of generations with cancer

Group 3 0.007

1 11 (68.8) 5 (31.2) 0 (0.0) 16 (100.0)

2 20 (40.0) 25 (50.0) 5 (10.0) 50 (100.0)

3 11 (37.9) 11 (37.9) 7 (24.2) 29 (100.0)

4 1 (33.3) 2 (66.7) 0 (0.0) 3 (100.0)

Group 4 0.020

1 25 (55.5) 17 (37.8) 3 (6.7) 45 (100.0)

2 10 (41.7) 12 (50.0) 2 (8.3) 24 (100.0)

3 0 (0.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 3 (100.0)

4 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Number of breast cancer cases

Group 1 0.175

<=3 13 (56.5) 8 (34.8) 2 (8.7) 23 (100.0)

>3 13 (46.4) 14 (50.0) 1 (3.6) 28 (100.0)

Group 2 0.195

<=3 21 (47.7) 22 (50.0) 1 (2.3) 44 (100.0)

>3 7 (70.0) 2 (20.0) 1 (10.0) 10 (100.0)

Group 3 0.124

<=3 36 (47.3) 31 (40.8) 9 (11.9) 76 (100.0)

>3 8 (36.4) 12 (54.5) 2 (9.1) 22 (100.0)

Group 4 **

<=3 35 (48.6) 31 (43.0) 6 (8.4) 72 (100.0)

>3 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Age at diagnosis

Group 1 0.100

<=30 years 6 (75.0) 1 (12.5) 1 (12.5) 8 (100.0)

>30 and <=50 years 16 (47.0) 17 (50.0) 1 (3.0) 34 (100.0)

>50 years 4 (44.4) 4 (44.4) 1 (11.2) 9 (100.0)

Group 2 0.109

<=30 years 10 (41.7) 13 (54.1) 1 (4.2) 24 (100.0)

>30 and <=50 years 15 (60.0) 10 (40.0) 0 (0.0) 25 (100.0)

>50 years 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 5 (100.0)

Group 3 0.085

<=30 years 17 (56.7) 11 (36.7) 2 (6.6) 30 (100.0)

>30 and <=50 years 20 (35.7) 27 (48.2) 9 (16.1) 56 (100.0)

>50 years 7 (58.3) 5 (41.7) 0 (0.0) 12 (100.0)

Group 4 0.120

<=30 years 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

>30 and <=50 years 17 (42.5) 20 (50.0) 3 (7.5) 40 (100.0)

>50 years 21 (50.0) 18 (42.9) 3 (7.1) 42 (100.0)

166

Table 6: Correlation between the genotype frequency of polymorphism rs3803662 in gene

TNRC9 and the hormone receptors (per group).

Hormone Receptors AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P value*

Estrogen

Group 1 0.127

Negative 3 (10.7) 12 (42.9) 13 (46.4) 28 (100.0)

Positive 2 (10.0) 12 (60.0) 6 (30.0) 20 (100.0)

Group 2 0.138

Negative 3 (15.8) 10 (52.6) 6 (31.6) 19 (100.0)

Positive 9 (27.3) 13 (39.4) 11 (33.3) 33 (100.0)

Group 3 0.114

Negative 7 (21.8) 11 (34.3) 14 (43.9) 32 (100.0)

Positive 9 (15.5) 31 (53.4) 18 (31.1) 58 (100.0)

Group 4 0.131

Negative 3 (15.8) 9 (47.3) 7 (36.9) 19 (100.0)

Positive 13 (20.6) 28 (44.4) 22 (35.0) 63 (100.0)

Progesterone

Group 1 0.165

Negative 3 (10.8) 13 (46.4) 12 (42.8) 28 (100.0)

Positive 2 (10.0) 11 (55.0) 7 (35.0) 20 (100.0)

Group 2 0.106

Negative 3 (16.6) 8 (44.5) 7 (38.9) 18 (100.0)

Positive 9 (26.5) 15 (44.1) 10 (29.4) 34 (100.0)

Group 3 0.113

Negative 10 (23.3) 17 (39.5) 16 (37.2) 43 (100.0)

Positive 6 (12.2) 28 (57.1) 15 (30.7) 49 (100.0)

Group 4 0.075

Negative 9 (27.3) 13 (39.4) 11 (33.3) 33 (100.0)

Positive 7 (14.3) 24 (49.0) 18 (36.7) 49 (100.0)

Her-2

Group 1 0.191

Negative 4 (9.6) 22 (52.4) 16 (38.0) 42 (100.0)

Positive 0 (0.0) 1 (25.0) 3 (75.0) 4 (100.0)

Inconclusive 1 (0.0) 0 (0.0) (0.0) 1 (100.0)

Group 2 0.153

Negative 8 (21.7) 17 (45.9) 12 (32.4) 37 (100.0)

Positive 4 (30.7) 5 (38.6) 4 (30.7) 13 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Group 3 0.109

Negative 11 (19.4) 27 (47.3) 19 (33.3) 57 (100.0)

Positive 3 (10.0) 15 (50.0) 12 (40.0) 30 (100.0)

Inconclusive 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0)

Group 4 0.079

Negative 9 (14.3) 32 (50.8) 22 (34.9) 63 (100.0)

Positive 7 (36.9) 5 (26.2) 7 (36.9) 19 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

167

Table 7: Correlation between the genotype frequency of polymorphism rs2981582 in gene

FGFR2 and the hormone receptors (per group).

Hormone Receptors AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P value*

Estrogen

Group 1 0.114

Negative 7 (25.0) 12 (42.9) 9 (32.1) 28 (100.0)

Positive 7 (35.0) 8 (40.0) 5 (25.0) 20 (100.0)

Group 2 0.038

Negative 0 (0.0) 14 (73.7) 5 (26.3) 19 (100.0)

Positive 9 (26.5) 18 (52.9) 7 (20.6) 34 (100.0)

Group 3 0.073

Negative 8 (25.8) 12 (38.7) 11 (35.5) 31 (100.0)

Positive 15 (25.0) 34 (56.6) 11 (18.3) 60 (100.0)

Group 4 0.149

Negative 5 (26.3) 9 (20.9) 5 (25.0) 19 (100.0)

Positive 14 (73.7) 34 (79.2) 15 (75.0) 63 (100.0)

Progesterone

Group 1 0.080

Negative 6 (21.4) 13 (46.4) 9 (32.2) 28 (100.0)

Positive 8 (40.0) 7 (35.0) 5 (25.0) 20 (100.0)

Group 2 0.180

Negative 1 (5.6) 15 (83.3) 2 (11.1) 18 (100.0)

Positive 8 (22.9) 17 (48.5) 10 (28.6) 35 (100.0)

Group 3 0.025

Negative 9 (20.9) 19 (44.2) 15 (34.9) 43 (100.0)

Positive 14 (28.0) 28 (56.0) 8 (16.0) 50 (100.0)

Group 4 0.113

Negative 6 (18.2) 19 (57.6) 8 (24.2) 33 (100.0)

Positive 13 (26.5) 24 (48.9) 12 (24.6) 49 (100.0)

Her-2

Group 1 0.082

Negative 11 (26.2) 19 (45.2) 12 (28.6) 42 (100.0)

Positive 2 (50.0) 1 (25.0) 1 (25.0) 4 (100.0)

Inconclusive 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0)

Group 2 0.131

Negative 6 (16.2) 21 (56.7) 10 (27.1) 37 (100.0)

Positive 3 (21.4) 9 (64.3) 2 (14.3) 14 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Group 3 0.085

Negative 16 (27.2) 25 (42.3) 18 (30.5) 59 (100.0)

Positive 7 (24.1) 18 (62.0) 4 (13.9) 29 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0) 2 (100.0)

Group 4 0.134

Negative 13 (20.7) 35 (55.5) 15 (23.8) 63 (100.0)

Positive 6 (31.6) 8 (42.1) 5 (26.3) 19 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

168

Table 8: Correlation between the genotype frequency of polymorphism rs13281615 and the

hormone receptors (per group).

Hormone Receptors AA

N (%) AG

N (%) GG

N (%) Total N (%)

P value*

Estrogen

Group 1 0.151

Negative 7 (25.0) 15 (53.6) 6 (21.4) 28 (100.0)

Positive 7 (35.0) 6 (30.0) 7 (35.0) 20 (100.0)

Group 2 0.121

Negative 4 (21.0) 7 (36.8) 8 (42.2) 19 (100.0)

Positive 7 (20.6) 18 (52.9) 9 (26.5) 34 (100.0)

Group 3 0.100

Negative 9 (28.1) 13 (40.6) 10 (31.3) 32 (100.0)

Positive 16 (26.7) 32 (53.3) 12 (20) 60 (100.0)

Group 4 0.138

Negative 6 (31.6) 7 (36.8) 6 (31.6) 19 (100.0)

Positive 17 (27.0) 30 (47.6) 16 (25.4) 63 (100.0)

Progesterone

Group 1 0.132

Negative 7 (25.0) 16 (57.1) 5 (17.9) 28 (100.0)

Positive 7 (35.0) 5 (25.0) 8 (40.0) 20 (100.0)

Group 2 0.148

Negative 4 (22.2) 7 (38.9) 7 (38.9) 18 (100.0)

Positive 7 (20.0) 18 (51.4) 10 (28.6) 35 (100.0)

Group 3 0.102

Negative 15 (34.1) 17 (38.6) 12 (27.3) 44 (100.0)

Positive 11 (22.0) 28 (56.0) 11 (22.0) 50 (100.0)

Group 4 0.118

Negative 10 (30.3) 14 (42.4) 9 (27.3) 33 (100.0)

Positive 13 (26.5) 23 (47.0) 13 (26.5) 49 (100.0)

Her-2

Group 1 0.169

Negative 11 (26.2) 19 (45.2) 12 (28.6) 42 (100.0)

Positive 2 (50.0) 1 (25.0) 1 (25.0) 4 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0) 1 (100.0)

Group 2 0.117

Negative 7 (19.0) 20 (54.0) 10 (27.0) 37 (100.0)

Positive 3 (21.4) 4 (28.6) 7 (50.0) 14 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Group 3 0.030

Negative 14 (23.7) 29 (49.1) 16 (27.2) 59 (100.0)

Positive 9 (30.0) 15 (50.0) 6 (20.0) 30 (100.0)

Inconclusive 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0)

Group 4 0.127

Negative 20 (31.7) 25 (39.7) 18 (28.6) 63 (100.0)

Positive 3 (15.8) 12 (63.1) 4 (21.1) 19 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

169

Table 9: Correlation between the genotype frequency of polymorphism rs889312 in gene

MAP3K1 and the hormone receptors (per group).

Hormone Receptors CC

N (%) CA

N (%) AA

N (%) Total N (%)

P value*

Estrogen

Group 1 0.141

Negative 5 (17.8) 11 (39.2) 12 (43.0) 28 (100.0)

Positive 3 (15.0) 7 (35.0) 10 (50.0) 20 (100.0)

Group 2 0.152

Negative 3 (15.8) 6 (31.6) 10 (52.6) 19 (100.0)

Positive 5 (14.7) 13 (38.2) 16 (47.1) 34 (100.0)

Group 3 0.136

Negative 4 (12.5) 18 (56.2) 10 (31.3) 32 (100.0)

Positive 7 (11.7) 34 (56.7) 19 (31.6) 60 (100.0)

Group 4

Negative 1 (5.2) 9 (47.4) 9 (47.4) 19 (100.0) 0.147

Positive 7 (11.1) 27 (42.9) 29 (46.0) 63 (100.0)

Progesterone

Group 1 0.147

Negative 4 (14.3) 11 (39.3) 13 (46.4) 28 (100.0)

Positive 4 (20.0) 7 (35.0) 9 (45.0) 20 (100.0)

Group 2 0.122

Negative 2 (11.1) 6 (33.3) 10 (55.6) 18 (100.0)

Positive 6 (17.1) 13 (37.1) 16 (45.8) 35 (100.0)

Group 3 0.124

Negative 4 (9.1) 28 (63.6) 12 (27.3) 44 (100.0)

Positive 7 (14.0) 25 (50.0) 18 (36.0) 50 (100.0)

Group 4 0.130

Negative 2 (6.0) 16 (48.5) 15 (45.5) 33 (100.0)

Positive 6 (12.2) 20 (40.9) 23 (46.9) 49 (100.0)

Her-2

Group 1 0.173

Negative 8 (19.0) 15 (35.7) 19 (45.3) 42 (100.0)

Positive 0 (0.0) 3 (75.0) 1 (25.0) 4 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 1 (100.0)

Group 2 0.046

Negative 7 (18.9) 13 (35.1) 17 (46.0) 37 (100.0)

Positive 0 (0.0) 5 (35.7) 9 (64.3) 14 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Group 3 0.107

Negative 6 (10.1) 33 (55.9) 20 (34.0) 59 (100.0)

Positive 5 (16.6) 17 (56.7) 8 (26.7) 30 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 1 (50.0) 1 (50.0) 2 (100.0)

Group 4 0.147

Negative 6 (9.5) 29 (46.0) 28 (44.5) 63 (100.0)

Positive 2 (10.5) 7 (36.9) 10 (52.6) 19 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

*Chi-square/ Fisher’s exact

Note: Values in bold indicate statistical significance (p<0.05).

170

Table 10: Correlation between the genotype frequency of polymorphism rs3817198 in gene

LSP1 and the hormone receptors (per group).

Hormone Receptors TT

N (%) TC

N (%) CC

N (%)

P value*

Estrogen

Group 1 0.109

Negative 13 (46.4) 12 (42.9) 3 (10.7) 28 (100.0)

Positive 11 (55.0) 9 (45.0) 0 (0.0) 20 (100.0)

Group 2 0.193

Negative 10 (52.6) 8 (42.1) 1 (5.3) 19 (100.0)

Positive 18 (53.0) 15 (44.1) 1 (2.9) 34 (100.0)

Group 3 0.007

Negative 19 (61.3) 11 (35.5) 1 (3.2) 31 (100.0)

Positive 22 (36.6) 30 (50.0) 8 (13.4) 60 (100.0)

Group 4 0.162

Negative 9 (47.3) 9 (47.3) 1 (5.4) 19 (100.0)

Positive 29 (46.0) 29 (46.0) 5 (8.0) 63 (100.0)

Progesterone

Group 1 0.186

Negative 14 (50.0) 12 (42.8) 2 (7.2) 28 (100.0)

Positive 10 (50.0) 9 (45.0) 1 (5.0) 20 (100.0)

Group 2 0.171

Negative 10 (55.5) 8 (44.5) 0 (0.0) 18 (100.0)

Positive 18 (51.4) 15 (42.8) 2 (5.8) 35 (100.0)

Group 3 0.024

Negative 25 (58.1) 14 (32.6) 4 (9.3) 43 (100.0)

Positive 13 (28.2) 28 (60.9) 5 (10.9) 46 (100.0)

Group 4 0.015

Negative 12 (36.3) 16 (48.5) 5 (15.2) 33 (100.0)

Positive 26 (53.1) 22 (44.9) 1 (2.0) 49 (100.0)

Her-2

Group 1 0.075

Negative 22 (52.4) 18 (42.9) 2 (4.7) 42 (100.0)

Positive 1 (25.0) 2 (50.0) 1 (25.0) 4 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 1 (100) 0 (0.0) 1 (100.0)

Group 2 0.201

Negative 20 (54.0) 15 (40.6) 2 (5.4) 37 (100.0)

Positive 6 (42.9) 8 (57.1) 0 (0.0) 14 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

Group 3 0.119

Negative 26 (44.1) 26 (44.1) 7 (11.8) 59 (100.0)

Positive 14 (48.3) 13 (44.8) 2 (6.9) 29 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0) 2 (100.0)

Group 4 0.098

Negative 30 (47.6) 30 (47.6) 3 (4.8) 63 (100.0)

Positive 8 (42.1) 8 (42.1) 3 (15.8) 19 (100.0)

Inconclusive 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

171

Anexo 6