Gênero Mycobacterium 4 2013 1

Gênero Mycobacterium spp

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Prof. Marcos JP Gomes

2013


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Prof. Marcos JP Gomes Tuberculoses

Paratuberculoses

ATUALIDADE

Atualmente (2013), na “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature”

do pesquisador J.P. Euzèby há citação de 156 espécies e 13 subespécies no gênero

Clostridium spp, conforme o site www.bacterio.cict.fr/c/clostridium.html

INTRODUÇÃO

As micobactérias pertencem à ordem Actinomycetales, e à família

Mycobacteriaceae. O gênero Mycobacterium inclui:

1-O complexo M. tuberculosis;

2-O complexo M. avium;

3-Outras micobactérias e numerosas espécies saprófitas presentes no solo e na água.

O complexo M. tuberculosis inclui M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M.

canettii, M. caprae, M. microti e M. pinnipedii.

O complexo M. avium inclui M. avium subsp avium, M. avium subsp hominissuis,

M. avium subsp paratuberculosis e M. intracellulare.

Outras micobactérias de importância clínica são: M. chelonae, M. fortuitum, M.

kansasii, M. leprae, M. marinum, M. ulcerans e o M. scrofulaceum.

Muitas espécies foram incluídas a partir dos anos 2000. As últimas espécies

incluídas foram: M. paraffinicum (Toney et al. 2010); M. paraseoulense (Lee et al. 2010);

Mycobacterium abscessus subsp abscessus (Leao et al. 2011); Mycobacterium abscessus

subsp bolletii (Leao et al. 2011); Mycobacterium algericum (Sahraoui et al. 2011);

Mycobacterium europaeum (Tortoli et al. 2011); Mycobacterium sherrisii (van Ingen et al.


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2011); Mycobacterium shinjukuense (Saito et al. 2011); Mycobacterium koreense (Kim et

al. 2012) e Mycobacterium litorale (Zhang et al. 2012);

HISTÓRICO

A tuberculose já era conhecida como causa de morte em algumas múmias egípcias

há 3.000 anos. Recentemente, foram detectadas evidencias de tuberculose pulmonar

incluindo a presença de bastonetes AAR em múmias no Peru datadas de 700 anos DC.

Hipócrates, Celsius e Galeno acreditavam na importância do descanso e ar fresco

como sendo essenciais no tratamento da tuberculose.

Reconhecida como uma doença contagiosa na região do Mediterrâneo, durante o

século 16 e denominada como “tísica” as características anatômicas e patológicas da

tuberculose foram relatadas no tratado Opera Medica de Silvius, em 1679 e foi seguida da

descrição de achados patológicos da tuberculose miliar por Manget, em 1702. A natureza

da tuberculose da tuberculose foi suspeitada pelo médico militar francês Jean-Antoine

Villemin no inicio de 1865 quando uma infecção semelhante à tísica foi reproduzida com

sucesso em coelhos e cobaias que haviam sido inoculadas com lesões suspeitas de

tuberculose.

Conhecida como praga branca, a tuberculose foi a principal de morte na Europa e

Estados Unidos no século 19, com uma taxa de mortalidade estimada em 400/100.000, em

1830, nos Estados Unidos.

Em 1873, o médico Norueguês Gerhard Henrik Armauer Hansen identificou o agente

da responsável pela lepra que posteriormente possuía muita semelhança com bastonete da

tuberculose descoberto 9 anos depois pelo Robert Koch, que foi capaz de cultiva-lo em

meio de soro coagulado assim como visualiza-lo utilizando um método de coloração

especial em 1882. Outro importante avanço na pesquisa da tuberculose inclui a descoberta

da característica AAR desses organismos e as características da coloração de Ziehl-Neelsen

(contribuição de Ehrlich, Ziehl e Neelsen); a diferenciação entre o bacilo aviário e bacilo


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humano realizado, em 1890, por Rivolta e Maffucci; descrição dos postulados de Koch;

preparação da tuberculina, em 1891 e a descrição do bacilo da tuberculose bovina por

Theobald Smith, em 1902.

A mortalidade de tuberculose diminuiu dramaticamente para 200/100.000 devido a

melhoria das condições sanitárias e sociais, melhoria da alimentação e nutrição e o uso de

sanatórios espalhados na Europa e Estados Unidos alem de terapia ativa baseada em

métodos cirúrgicos. A descoberta dos raios X tornou possível o acompanhamento da

progressão da doença pela primeira vez.

Entre 1908 e 1920, Calmette e Guérin do Instituto Pasteur, na França, utilizaram um

meio de cultivo para atenuar a virulência do M. bovis. Este trabalho proporcionou a base

para o desenvolvimento do bacilo da vacina de Calmette e Guérin ou BCG utilizada pela

primeira vez, em 1821 e ainda hoje utilizada. Outro marco importante foi a descoberta de

Waksman que em 1944 descobriu a estreptomicina um antimicrobiano que ainda é utilizado

na quimioterapia da tuberculose. A subseqüente descoberta de outras drogas

antimicobacterianas tais como o ácido para aminosalicílicoem 1949 a isoniazida em 1952 e

a rifampicina em 1967 forneceram a base da quimioterapia contra a tuberculose em que 3 a

4 drogas são administradas por um período de 6 a 9 meses.

CARACTERÍSTICAS GERAIS

Bastonetes retos ou levemente curvos com 0,2 - 0,7μm de diâmetro e 1,0 - 10 m de

comprimento; podem possuir ramificações; crescimento filamentoso ou miceliar que se

fragmenta em bastonetes ou cocos AAR em algum estágio do crescimento; Gram positivo

fraco; imóvel; não esporulados; sem cápsulas; aeróbios e quimiorganotróficos. Crescimento

lento ou muito lento; colônias visíveis após 2 - 20 dias em temperatura ótima; colônias

geralmente róseas, laranjas ou amarelas, especialmente quando expostas à luz; pigmento

não é difuso; superfície grosseira e rugosa; algumas espécies de difícil crescimento,

necessitando de meios especiais; outras não são cultiváveis (M. leprae); catalase positivos;


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arilsulfatase positivo; lisozima resistente; amplamente distribuídos no solo e água; algumas

espécies são parasitas obrigatórios e patógenos de vertebrados.

O grupo contém um único gênero Mycobacterium spp. São bastonetes finos;

Álcool-Ácido-Resistentes (AAR); aeróbios; crescimento lento, geralmente de vida livre ou

patógenos de vertebrados. As espécies de Mycobacterium podem ser confundidas com

outros gêneros relacionados (Corynebacterium spp, Nocardia spp ou Rhodococcus spp).

A propriedade de AAR está relacionada à grande quantidade de material lipídico da

parede celular, sendo importante na identificação das micobactérias. A técnica de coloração

denominada Ziehl-Neelsen (ZN) deve ser cuidadosamente realizada, pois a coloração

facilmente se desfaz. As micobactérias são bactérias AAR, pois resistem ao efeito

descolorizante do álcool ácido, quando coradas pela carbol-fucsina aquecida. Os

componentes lipídicos da parede celular representam mais de 60% do peso seco. A grande

concentração de lipídios é responsável pela: hidrofobicidade das micobactérias em meio

líquido; crescimento lento; resistência aos ácidos, resistência aos desinfetantes, resistência

aos anticorpos e resistência à dissecação. A parede celular da micobactéria é rica em ácido

micólico e outros lipídios complexos. Os ácidos micólicos conferem a AAR. Os micosídios

são responsáveis pela permeabilidade celular e estão relacionados com a resistência às

enzimas solúveis em água; aos antimicrobianos e aos desinfetantes. O fator corda da parede

celular está relacionado com o crescimento colonial das bactérias virulentas.

As micobactérias são potentes adjuvantes, pois quando inoculadas com outros

antígenos estimulam a produção de anticorpos ao antígeno. Por exemplo, coelhos

inoculados somente com albumina bovina responderam somente para a produção de

anticorpo, mas quando inoculado com albumina bovina e micobactérias, ele desenvolveria

hipersensibilidade retardada à albumina sérica bovina.

As micobactérias requerem métodos especiais para estudo, pois muitas crescem

lentamente; outras necessitam de meios especiais na diferenciação das espécies, sendo


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tarefa geralmente realizada por especialista. As espécies de crescimento rápido podem ser

identificadas com mais facilidade, enquanto que as de crescimento lento são mais difíceis.

A distinção entre as espécies com crescimento lento e rápido é determinada pelos

seguintes critérios:

a) As espécies com crescimento lento requerem mais de sete dias em meios ricos

para produzir colônias, facilmente visíveis de inóculos diluídos.

b) A espécie dita rápida evidencia crescimento em menos de sete dias. Certas

espécies são intermediárias quanto à velocidade de crescimento.

Micobactérias devem ser manipuladas em cabinas de segurança para prevenir a

disseminação de patógenos ao homem. O material deve ser desinfetado pelo calor, pois as

micobactérias são resistentes aos desinfetantes químicos.

As espécies saprófitas podem causar doença, em determinadas condições sendo

consideradas oportunistas. Outras podem causar infecção quando introduzidas em

ferimentos ou em animais tratados com imunossupressivos.

CLASSIFICAÇÃO DAS MICOBACTERIAS

A velocidade de crescimento das micobacterias é lenta com o tempo de geração

variável, entre 2 a 20 horas. As micobactérias podem ser classificadas como micobacterias

de crescimento lento e as de crescimento rápido, tendo como base, o tempo de geração. As

de crescimento lento requerem mais de 7 dias para formar colônias visíveis em meio de

cultivo sólido, enquanto que as de crescimento rápido formam colônias em até 7 dias. As

micobactérias podem também ser classificadas pela

1) Velocidade de crescimento e pigmentação e

2) Relação agente-hospedeiro.

Velocidade de crescimento e pigmentação, conforme Runyon em: Grupo I, Grupo

II, Grupo III e Grupo IV.


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Grupo I: Fotocromogênicas possuem crescimento lento; produzem pigmento

amarelo, quando exposto à luz, em 7 dias ou mais. Ex. M. ulcerans, M. marinum e M.

kansasii.

Grupo II: Escotocromogênicas possuem crescimento lento; produzem pigmento

amarelo-alaranjado, na escuridão. Exemplos M. scrofulaceum e M. xenopi.

Grupo III: Não cromogênicas e não fotocromogênicas possuem crescimento lento;

Não produzem pigmento ou pouco; Assemelham-se ao gênero Nocardia spp; Formam

colônias lisas; São resistentes à isoniazida. Exemplos: M. bovis, complexo M. avium

Grupo IV: Pigmentação variável. Crescimento rápido em menos de uma semana a

25 ou a 37º C. Exemplos M. fortuitum, M. phlei e M. smegmatis.

Relação Agente-Hospedeiro

a) Parasita intracelular obrigatório (M. leprae e M. lepraemurium).

b) Parasita intracelular facultativo; Maioria das micobactérias patogênicas está nesse

grupo; Principal célula que serve de hospedeiro para essas micobactérias são os

macrófagos; São parasitas do sistema fagocítico mononuclear (M. avium, M. bovis, M.

tuberculosis, M. fortuitum, M. marinum, M. ulcerans, M. kansasii, M. intracellulare, M.

scrofulaceum e M. fortuitum) na grande maioria das infecções iniciais.

c) Parasita saprofítico (a maioria das espécies M. phlei, M. smegmatis, M.

butyricum, M. gordonae).

Tabela 1. Classificação clínica das micobactérias.

______________________________________________________________________________

Grupos Exemplos

_______________________________________________________________________________

1. Patógeno Obrigatório M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, Map.

2. Patógeno cutâneo M. marinum, M. ulcerans.

3. Patógeno oportunista M. kansasii, M. avium intracellulare, M. xenopi.

4. Não ou raramente patógeno M. gordonae, M. smegmatis.

5. Patógeno Animal M. lepraemuriu, M.caprae M.pennipedi


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CARACTERISTICAS GERAIS DO GÊNERO

A tuberculose lidera o número de mortes no homem como causada por um único

agente infeccioso. É responsável por mais de 2 milhões de mortes anuais. Ela é causada

primariamente pelo M. tuberculosis. O M. africanum, M. bovis e M. canettii são

responsáveis por menos de 1% das tuberculoses humanas. O M. bovis é bem adaptado aos

bovinos. Entretanto, outras variantes do M. bovis adaptaram-se a outros hospedeiros tais

como o M. pinnipedii (adaptado aos pinípedes) e o M. caprae (adaptado aos caprinos). Uma

amostra de M. bovis foi atenuada pela passagem “in vitro” em rodelas de batata e

posteriormente, utilizadas como vacina humana de uso mundial, conhecida como BCG. O

M. africanum e o M. canettii são patógenos humanos. O M. microti foi isolado de roedores,

do homem e alguns outros animais.

As micobactérias saprófitas possuem propriedades morfotintoriais semelhantes às

patogênicas e, os microbiologistas devem estar preparados e treinados na diferenciação das

espécies, através de técnicas bacteriológicas. A responsabilidade do laboratório é grande ao

isolar e identificar micobactérias de animais vivos ou de tecidos colhidos, durante a

necropsia. É necessário diferenciação entre as espécies patogênicas e oportunistas.

As micobacterias patogênicas produzem lesões granulomatosas em muitas espécies

domésticas e silvestres, alem do homem.

Informações definitivas sobre a patogênese da tuberculose ainda não são totalmente

conhecidas, embora o bastonete da tuberculose tenha sido descoberto há mais de 129 anos

atrás. Existem diferenças inexplicáveis na suscetibilidade entre os bastonetes AAR e as

diferentes espécies animais, apesar de todo o conhecimento.


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O M. tuberculosis produz doença generalizada e progressiva em primatas não

humanos, caninos, suínos e cobaias, mas bovinos e gatos são mais resistentes. O M.

tuberculosis induz sensibilidade cutânea em bovinos e outros animais.

O M. bovis, agente da tuberculose bovina, é um organismo não fotocromogênico

que causa doença em outros animais domésticos e silvestres, alem de relatos no homem em

muitos países. Testes bioquímicos estão disponíveis na diferenciação do complexo M.

tuberculosis, mas as técnicas moleculares estão somente difundidas em laboratórios de

referência do mundo.

O M. leprae, agente da lepra ou doença de Hansen, é uma doença granulomatosa

crônica. Ela é ainda considerada um problemas de saúde pública em países da África e

Sudeste Asiático, atingindo uma prevalência de 1 caso a cada 10.000 indivíduos. O M.

leprae e a lepra têm sido identificadas, em tatus, nos Estados Unidos. O M. lepraemurium

foi isolado e identificado em lesões semelhantes à lepra em gatos, ratos e camundongos.

O M. chelonei, M. intracellulare, M. marinum, M. nonchromogenicum e outras

micobactérias tem sido isoladas de lesões granulomatosas em animais de sangue frio.

Espécies do complexo M. avium tem o maior número de hospedeiros entre todas as

micobactérias. O M. avium subsp avium (sorovares 1, 2, e 3) foi isolado em lesão

tuberculosa nas aves, nos animais domésticos, nos animais silvestres e no homem. Nas

aves, a doença é progressiva com lesões no fígado e baço, enquanto que as lesões nos

outros animais estão confinadas, geralmente aos linfonodos associados ao trato

gastrintestinal.

O M. avium subsp hominissuis é a subespécie mais frequentemente causadora de

lesões nos suínos e homem e o M. intracellulare causa lesões granulomatosas,

principalmente em animais de sangue frio distribuídos no ambiente. Coelhos são muito

suscetíveis à infecção experimental pelo M. avium subsp avium, mas relativamente

resistente ao M. intracellulare. As aves são suscetíveis ao M. avium subsp avium, mas

resistentes às do complexo M. tuberculosis.


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O M. avium subsp paratuberculosis (Map) causa uma doença infecciosa, intestinal e

crônica conhecida como paratuberculose ou Doença de Johne (DJ) que tem impacto

econômico na pecuária. Bovinos, ovinos, caprinos, bubalinos e outros ruminantes silvestres

são suscetíveis. Alem dessas espécies, existem dados que sugerem que o Map pode ser o

agente etiológico da Doença de Crohn (DC), uma doença intestinal inflamatória do homem,

mas este assunto permanece controverso. Uma característica útil na diferenciação desse

organismo é a sua depência à micobactina, um agente quelante do ferro e substância

necessária no seu cultivo “in vitro”. A micobactina foi inicialmente extraída do M.

tuberculosis, mas logo substituida pelo M. phlei. Mais tarde, a micobactina J e certos

compostos de ligação ao ferro extracelular foram isolados do M. avium. Técnicas

moleculares como a PCR e a análise de restrição da endonuclease foram desenvolvidas para

identificar o Map.

M. ulcerans é o agente etiológico da úlcera de Buruli, uma grave doença crônica

humana. Ela inicia como uma tumoração que ulcera sob uma base necrótica, podendo

atingir a gordura subcutânea. Ela ocorre principalmente na África, Austrália e México. A

infecção por M. ulcerans resulta em necrose severa e persistente, sem uma resposta

inflamatória aguda. A presença de alterações histopatológicas distantes do local de infecção

sugere que a patogênese da toxina pode ser mediada. Um policetídeo macrolídeo chamado

micolactona foi isolada e identificada como citotóxica e responsável pela parada do ciclo

celular das células L929 (fibroblastos murinos). A inoculação intradérmica de toxina

purificada em cobaias produziu uma lesão semelhante à úlcera de Buruli do homem. Essa

toxina pode representar apenas um dentre os fatores de virulência associados às patologias

das doenças micobacterianas como a lepra e a tuberculose. Estudos apontaram que insetos

aquáticos da família Naucoridae são vetores transmissores do M. ulcerans.

M. marinum é um patógeno de peixes e, encontrado nas águas. A infecção pode ser

transmitida ao homem quando inoculado, através da pele, quando tanques de peixes

tropicais são limpos ou quando se banham em piscinas contaminadas. Nódulos cutâneos


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podem ulcerar ou formar abscessos com difusão linfática local. O M. marinum causa

tuberculose em peixes e anfíbios e lesão cutânea granulomatosa no homem, doença

conhecida como granuloma de piscina.

Outras espécies de micobacterias têm sido isoladas de vários animais. O M.

fortuitum, uma micobacteria não cromogênica e de crescimento rápido tem sido isolada de

cães e do homem com lesões pulmonares; de mastite bovina e de linfonodos de bovinos e

suínos, no matadouro. O M. chelonae, uma micobacteria de crescimento rápido foi isolada

de suinos e do homem.

O M. kansasii, uma micobactéria fotocromogênica e de crescimento lento, tem sido

isoladas de lesões granulomatosas em suínos e bovinos, as quais se assemelham às lesões

causadas pelo M. bovis. A infecção pulmonar com o M. kansasii tem início em pacientes

com doença pulmonar previa ou doença pulmonar crônica. Produz uma doença que é

semelhante à tuberculose pulmonar, mas um pouco mais lenta. O organismo pode ser

isolado em suprimentos d’água.

FATORES DE VIRULENCIA

Antigamente, na maioria dos livros didáticos sobre o assunto, se dizia não haver

fator de virulência produzido por micobactérias patogênicas. Não havia endotoxinas,

exotoxinas, enzimas extracelulares, hemolisinas, leucocidinas mesmo quando o fator corda

estivesse associado ao crescimento de bactérias “virulentas”.

Recentemente, muito progresso foi obtido na compreensão da patogenia e dos

fatores de virulência associados às infecções causadas por micobactérias, especialmente na

aplicação de ferramentas moleculares, tais como o sequenciamento completo do genoma e

sua análise comparativa. A ciência genômica tornou possível elucidar o mapa genético de

várias micobactérias importantes (animais homem e ambiente). Sequências genômicas

completas estão disponíveis para o M. abscessus, M. avium subsp hominissuis, M. avium

subsp paratuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. gilvum, M. leprae, M. marinum, M.


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smegmatis, tres linhagens do M. tuberculosis, M. ulcerans, M. vanbaalenii e quatro

micobactérias não classificadas como espécie. Esses genomas possuem alto conteúdo de

GC (∼ 65%).

A cepa K-10 do Map foi isolada de uma vaca com paratuberculose e seu

sequenciamento concluído e publicado em 2005. Esta linhagem possuía um baixo número

de passagens “in vitro” e o sistema genético incluía transposon de mutagenese disponível

para a criação de cepas mutantes. O genoma da K-10 é um cromossomo circular com

aproximadamente 4,8 Mb e 4.344 “open reading frames” (ORFs) com 69,3% de GC.

Aproximadamente 60% dos ORFs possuem homólogo conhecido na base de dados,

enquanto que 25 % codificam produção de proteínas de funções ainda desconhecidas.

Aproximadamente, 75% dos genes do Map têm contrapartida no M. tuberculosis.

Entretanto, a maioria deles, não possui homologia com o M. avium subsp hominissuis,

existindo provavelmente 39 proteínas que são únicas no Map. Os ORFs são identificados

pelo número de locação seguindo o padrão de convenções, por exemplo, o Map 1152

significa ORF1152 do ORF0001-DnaA- no sentido horário. O genoma possui alta

redundância por causa da duplicação gênica, especialmente, para aqueles genes envolvidos

no metabolismo dos lipídios e no metabolismo redox. Alem disso, o gene da salicil-MP

ligase (mbtA) é truncado, o que provavelmente justifique o seu defeito na biosíntese da

micobactina. A análise do polimorfismo genético, especialmente aquelas, incluindo grandes

sequências indicaram que o Map originou do M. avium subsp hominissuis num processo

evolucionário bifásico. Primeiro, um clone original patogênico do Map surgiu pela

aquisição de um novo DNA tornando-se polimórfico. Segundo, as cepas de bovinos e

ovinos descendendes desse clone ancestral evoluiram pela subseqüente deleção linhagem-

específica.

O seqüenciamento genômico do M. bovis relizado em 2003, revelando um genoma

com 4.345.492 bp da cepa bovina virulenta AF2122/97; uma versão menor do genoma do

M. tuberculosis (4.411.532 bp do isolado humano H37Rv), possui mais de 99,95% de


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identidade e nenhum material genético novo quando comparado ao M. tuberculosis. As

deleções no M. bovis são as principais contribuições a essas diferenças que podem ser

encontradas afetando os genes envolvidos no transporte, na estrutura da superfície celular e

no metabolismo intermediário. Essas deleções podem remover genes que modificam a

adaptação a um hospedeiro diferente ou a muitos. O ponto de mutação tem um papel

importante na definição do fenótipo como é o caso da resistência à pirazinamida. As

variações seqüenciais têm sido encontradas em genes que codificam proteínas da parede

celular e proteínas secretoras, tais com as famílias de proteínas PE_PGRS e PPE. Outra

mudança é a mutação no gene da piruvato quinase do M. bovis que o tornou incapaz de

utilizar o glicerol como fonte de carbono. Outras mudanças nas sequências envolveram os

genes mestres na expressão de famílias de genes múltiplos. A análise do genoma do M.

bovis desafiou a hipótese epidemiológica de que o M. tuberculosis era uma variante

humana adaptada do M. bovis adquirida de bovinos. A perda irreversível do ADN do M

bovis foi detectada pela análise sistemática e pelo seqüenciamento do polimorfismo num

grande número de cepas levaram ao novo paradigma de que o M. canettii seria espécie

ancestral provável do complexo M. tuberculosis. Sucessivas deleções do ADN, começando

pela perda da região RD9 (RD = regions of difference) levaram a diferenciação do M.

africanum, M. bovis e do M. microti. A cepa do M. bovis BCG sofreu deleções posteriores

com a perda da RD1, implicada como mecanismo de atenuação da virulência ocorrida

durante sua adaptação laboratorial “in vitro”. A evolução dos genomas das micobacterias

envolve um processo de deleções redutivas à semelhança como ocorreu com o Map. Os

estudos genômicos comparativos são mostrados no diagrama do processo genômico

evolutivo das principais micobactérias na Fig.1 abaixo.


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Figura 1. Proposta Evolucionária do complexo M. tuberculosis e do complexo M. avium

Complexo M. tuberculosis

----------------------------------↓---------------------------------------------

M. canettii M. tuberculosis M. africanum

(homens) (homens) (homens)

↓

--------------------------------------------------------------------

M. microti M. bovis M. pinnipedi M. caprae

(roedores) (rumin homens) (penípedes) (caprinos)

_________________________________________________________________________

Complexo M. avium

----------------------------------------↓------------------------------------------

Ma hominissuis M.a. avium M. intracellulare

(homens; suíno; rum) (aves) (aves; homens)

↓

-------------

Map → Doença de Crohn

↓

Linhagens→ Bovinas

↓

Ovinas


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O sequenciamento de micobactérias evoluiu em paralelo aos sistemas genéticos

utilizados para criar mutantes definidos e assim elucidar a função de cada gene na

patofisiologia das micobacterioses. Plasmídios e micobacteriófagos são amplamente

utilizados na construção de cepas mutantes e recombinantes, utilizando todos os meios de

troca genética, incluindo transformação, transdução e conjugação. Uma variedade de genes

repórteres tem sido expressa em algumas micobactérias, incluindo a beta-galactosidase, a

luciferase de vagalume e a proteína fluorescente verde. Além disso, vários vetores para a

expressão condicional ou expressão anti-senso já estão disponíveis. Micobacteriófagos são

particularmente úteis na criação de mutações definidas em muitas espécies desse gênero,

incluindo a recente aplicação dessa tecnologia ao Map uma das espécies de crescimento

mais lento dentre as micobacterias. Finalmente, a tecnologia de mutação por

“Transposition-site-hybridization” (TraSH) tem sido desenvolvidas para definir genes

essenciais sob qualquer condição desejada.

Várias estratégias foram e estão sendo aplicadas na descoberta de determinantes de

virulência ou antígenos de importância diagnóstica nos genomas das micobactérias. Uma

delas procura identificar genes homólogos do Map em outras micobactérias, principalmente

no M. tuberculosis, os quais têm sido apontados como determinantes da virulência. Uma

tirosina fosfatase capaz de interferir na ativação de macrófagos foi identificada no

Map1985 e cujo homólogo no M. tuberculosis é o Rv2232. A secreção dessa tirosina

fosfatase (Map-PtpA) dentro do citoplasma do macrófago sugere que esta proteína media a

interação entre substrato(s) celular (es) do hospedeiro, interferindo na via de eliminação da

bactéria engolfada. Esta interferência, em parte, pode estar associada com a capacidade do

patógeno em sobreviver dentro do macrófago. Há muita curiosidade na identificação de

substratos do hospedeiro capazes de elucidar como a via de transdução do hospedeiro é

bloqueada pela atividade da Map-PtpA e capaz de promover a sobrevivência. As

abordagens gênicas comparativa com outras micobactérias seqüenciadas identificaram no

Map um conjunto de 39 genes únicos, os quais codificam proteínas específicas para o


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diagnóstico laboratorial do Map. A triagem de uma coleção de transposons do M. avium

subsp hominissuis levou à identificação de uma ilha de patogenicidade que carreia

determinantes de virulência envolvidos nos processos de fagocitose bacteriana pelos

macrófagos. Hibridação genômica comparativa identificou ilhas no genoma do Map

diferentes do M. avium subsp hominissuis.

Outra abordagem tem sido com os transposons mutantes. Um desses estudos

sequenciou diretamente os transposons mutantes da cepa ATCC 19698 e os classificou em

grupos funcionais. Baseados na análise bioinformática, 11 mutantes foram selecionados e

utilizados em experimentos de virulência em camundongos, na tentativa de determinar seu

papel na patogenia. Esta análise permitiu a identificação dos genes: gcpE, pstA, kdpC,

papA2, impA, umaA1 e fabG2_2.

Uma abordagem molecular recente utilizado na identificação determinantes de

virulência envolve análise transcripcional e mutagenese “Transposition-site-hybridization”

(TraSH).

RESISTÊNCIA

No Brasil, o Ministério da Saúde, em seu manual sobre tuberculose (1994) instituiu

um protocolo padrão de procedimentos para o diagnóstico da tuberculose, ressaltando que a

resistência às drogas antituberculosas têm oscilado entre 10 - 15% das amostras testadas. O

trabalho conjunto das diversas instituições envolvidas com epidemiologia da tuberculose no

Brasil resultou em pesquisa do gene de expressão da catalase (KatG) em cepas de M.

tuberculosis-MRD (resistentes a múltiplas drogas); resistência à estreptomicina (genes rpsL

e rrs), à rifampicina (gene rpoB) e à isoniazida (gene KatG e inhA). A resistência a

pirazinamida é característica do M. bovis por mutações do gene pncA e OxiR, enquanto a

resistência à estreptomicina, geralmente está associada à redução da associação do rRNA

16S e a proteína S12 ribossomal.


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O método de rotina para avaliar resistência de amostras de micobactérias mais

utilizado tem sido: O método da concentração absoluta ou concentração inibitória mínima

(“MIC”) e o método das proporções.

No método das proporções, as diluições da cultura recente do complexo M.

tuberculosis são semeadas em meio de cultura com concentração fixa da droga (0,2 g /

mL de meio de cultura) e avaliadas quanto à proporção de desenvolvimento de colônias

resistentes frente a diluições da mesma cultura em meio de cultura sem droga. O método de

MIC utiliza concentração fixa de micobactérias e concentrações variadas de droga.

DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL

O diagnóstico clínico tem como base: a anamnese, a apresentação e sinais clínicos.

O diagnóstico laboratorial pode ser realizado, através da necropsia. A colheita de amostra

suspeita deve ser com coradas pelo Ziehl-Neelsen (ZN).

A confirmação laboratorial é importante pelas implicações em saúde pública. O

cultivo, o isolamento e a identificação são as técnicas diagnósticas aplicadas. A tipificação

da amostra como M. bovis tem como base sua sensibilidade à hidrazida, pirazinamida,

cicloserina e preferência de crescimento. O diagnóstico do agente contempla o uso de

ferramentas moleculares, tais como: seqüenciamento de ácidos nucléicos; cromatografia de

alta eficiência; cromatografia de camada delgada; PCR; RFLP; aálise de oligonucleotídeos

entre seqüências repetitivas diretas (“spoligotyping”) entre outras, conforme Tab.1 abaixo


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Tabela 1 Características diferenciais entre espécies do complexo M. tuberculosis

Características comuns: a) Caract. Positivas: presença das sequências gênicas IS6110, IS1081 e MPB70

b) Caract Negativas: pigmentação das colônias, catalase termoestável, arilsulfatase (não estudado no M.

pinnipedii), crescimento na presença de 500 µg/mL de p-nitrobenzoato (caract. não estudado no M.

pinnipedii), crescimento na presença de 5% de NaCl (caract. não estudado no M. pinnipedii), crescimento a

45 °C.

Caract diferenciais M. africanum M. bovis* M. caprae M. microti M. pinnipedii M. tuberculosis

Presença sequência genética mtp40

+ - - - + +

Códon 57 do gene

pncA (amino ácido)

CAC

(histidina)

GAC

(ácido aspártico)

CAC

(histidina)

CAC

(histidina)

CAC

(histidina)

CAC

(histidina)

Códon 463 do gene

katG (amino ácido)

CTG

(leucina)

CTG

(leucina)

CTG

(leucina)

CTG

(leucina)

CTG

(leucina)

CGG ou CTG

(arginina ou leucina)

Base em posição

285 do gene oxyR

G A A G G G

Códon 95 do gene

gyrA (amino ácido)

ACC

(treonina)

ACC

(treonina)

ACC

(treonina)

ACC

(treonina)

ACC

(treonina)

AGC ou ACC

(serina ou treonina)

Códon 756 do gene

gyrB

G A A G G


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Caract. dos

spoligotipos

Presença de ao

menos um

desses

espaçadores 39-43

Ausência de

espaçadores

3, 9, 16 e 39-43

Ausência de

espaçadores

1, 3-16, 30-33 e 39-43

Biovar

ratazanas:

presença

somente

espaçadores

37 e 38

Biovar

Lhama

presença dos

espaçadores

37, 38, 26,

24, 23 e 07/05.

Ausência dos

espaçadores

39-43.

Existência de

4 spoligotipos

diferentes.

Presença de ao

menos um desses

espaçadores 39-43

Excreção do

antígeno MPB70**

- + - - -

Aspecto das

colônias

Disgônica Disgônica Disgônica Disgônica Eugônica

Tipo respiratório Microaerófilo Microaerófilo Microaerófilo Aeróbio

Niacina d - - + Geral - +

Redução de nitratos d - - - - +

Fosfatase ácida d + d

Hidrólise do Tween

80 d d + (fraco) - - d



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Cresc. presença de

1 µg/mL de

TCH***

d - +**** - -***** +

Cresc. presença de

50 ou de 100

µg/mL de

pirazinamida

- + - - - -

Cresc. presença de

500 µg/mL

hidroxilamina

- - - -

Cresc. presença de

0,2 % de ácido

pícrico

d - d

Cresc. presença de

250 µg/mL de ácido oléico

d - d

Crescimento 25 °C - - -

Crescimento 30 °C d + - - (33 °C) +


* Niemann et al. mostraram que as cepas de Mycobacterium bovis sensíveis à pirazinamida e um

spoligotipo original (ausência de espaçadores 3 a 16 e 18 a 43). Estas estirpes podem representar

subespécie do Mycobacterium bovis, uma nova espécie do “Complexo Mycobacterium

tuberculosis". No entanto, para Aranaz et al. 2003, estas estirpes pertencem a espécie

Mycobacterium caprae. **: Detecção por ensaio imunoenzimático (ELISA). *** : TCH = hidrazida

do ácido tiofeno-2-carboxílico. **** : Mycobacterium caprae é resistente a 1 e 2 µg de TCH mL-1

,

mas sensível a 5 e a 10 µg de TCH mL-1

. ***** : As Cepas isoladas da Nova Zelândia resistem a 1

µg/mL de THC, mas são sensíveis a 10 µg/mL de THC.


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Mycobacterium bovis


Tuberculose Animais

Tuberculose Bovina

AGENTE.

O M. bovis é o agente da tuberculose em bovinos, suínos, felinos, eqüinos, primatas,

caninos, ovinos e caprinos. Não acomete as aves.

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO.

O M. bovis são bastonetes curtos; gordos em esfregaços de tecidos; são maiores e

mais finos, em meio líquido; cora-se em vermelho pelo Ziehl-Neelsen (A.A.R.).

CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E BIOQUÍMICAS

Os meios de cultivo mais utilizados são: Dorset, Coletsos e Stonebrinks os quais

incorporam gema de ovo, tampão fosfato, sal de magnésio, piruvato de sódio e

ocasionalmente, aminoácidos. O glicerol é omitido por ser um inibidor desta micobactéria.

Os cultivos requerem aproximadamente 3 a 4 semanas em incubação a 37ºC antes das

colônias se tornarem visíveis.

No meio líquido, o crescimento é restrito à superfície a menos que o detergente

aniônico seja incorporado ao meio (Tween 80).

O M. bovis é estritamente aeróbio, com crescimento ótimo a 37º C; não cresce a 25º

C; não reduz o nitrato; resistente à pirazinamida; não reduz niacina e é sensível a hidrazida.

A tuberculoproteína (tuberculina) é uma proteína liberada no meio de cultivo, pelo M. bovis

e ativa em reações de hipersensibilidade do tipo retardada (Tipo IV).

Animais sensibilizados ao M. bovis evidenciam uma reação cutânea quando

inoculados com a tuberculoproteina, arma importante no combate desta infecção.


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RESISTÊNCIA

Destruído pela luz solar, mas resiste bastante à dissecação, ao ácido e ao básico.

PREJUÍZOS ECONÔMICOS

As perdas econômicas determinadas pela tuberculose incluem a morte e redução de

10-20% na eficiência produtiva (infertilidade e condenação de carcaças).

Na Argentina, calcula-se um decréscimo em 18% na produção de vacas (leite)

quando comparadas com animais sadios. Alem disso, o leite e a carne originários de países

onde há tuberculose bovina não podem ser exportados para países onde ela é controlada,

causando prejuízos à economia nacional pela menor cotação do produto e perda de mercado

para as exportações.

EPIDEMIOLOGIA

Os dados da situação no Brasil no período de 1989 e 1998 estão no PNCEBT

(2001), indicando oficialmente uma prevalência de 1,3% de animais infectados. Nesta

mesma publicação a epidemiologia da tuberculose bovina desperta maior atenção quando

verificamos que, no Estado de Minas Gerais, maior produtor de leite no país, propriedades

produtoras de leite tecnificadas registraram prevalências de 15% das propriedades com pelo

menos um animal positivo para o teste intradérmico. Os dados sugerem que há risco de

infecção direta para a população humana numericamente significativa quer sejam

trabalhador rural da indústria de carnes ou veterinários.

Na Província de Santa Fé, constatou-se entre 1984 e 1998, percentagens de infecção

por M. bovis de 2,4% e 6,2% entre os casos de tuberculose humana do período, destacando

a infecção de trabalhadores ligados às atividades que envolvem trabalho com bovinos e

seus derivados (Zanini, 2002).


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ETIOPATOGENIA

A principal via de transmissão é aerógena, embora seja possível a transmissão

através do leite, congênita e sexual. Tradicionalmente, bovinos leiteiros possuem uma taxa

de infecção maior que os bovinos de corte. O homem infectado pode albergar os

microrganismos em lesões pulmonares abertas, podendo ser fonte de infecção para bovinos.

Bezerros podem ser infectados intrauterinamente ou pelo leite de vacas com infecção no

úbere. Há isolamentos do M. bovis do prepúcio, sugerindo que a transmissão venérea seja

possível, em bovinos. O M. bovis não elabora toxina ou outro fator de virulência celular,

embora o "fator corda" esteja presente em cepas virulentas e não presentes em cepas

avirulentas. Seu papel sobre a virulência não é compreendido, mas se acredita que tenha

importância na estimulação da resposta granulomatosa.

Inalação; as bactérias são depositadas nos sacos alveolares Ingestão

macrófagos alveolares Multiplicação lenta que mata o macrófago Reingerido

pelo macrófago hemático (monócito) Resposta inflamatória no local primário da

infecção Escapam são filtrados por linfonodos regionais Multiplicação

intracelular Vasos linfáticos eferentes Corrente circulatória

Disseminação da doença.

O M. bovis pode sobreviver e multiplicar-se em macrófagos, não permitindo a fusão

do lisossomo com o fagossoma, evitando a digestão intracelular e morte.

A lesão primária das micobactérias é o granuloma, o qual detectado nos tecidos

afetados e linfonodos. Ele é constituído por um núcleo de macrófagos infectados,

macrófagos-derivados de células gigantes rodeados por células T, células B, neutrófilos e

tecido fibrótico. A estrutura granulomatosa impede que as micobactérias se espalhem para

outras áreas, mas também oferece um nicho onde a bacteria fica protegida do sistema

imune. As micobactérias podem permanecer em quiescência por muitos anos enquanto que

o granuloma aparece como uma estrutura dinâmica onde o equilíbrio de citocinas parece ser


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importante no controle da infecção. Na maioria dos casos, a micobactéria está contida

dentro do granuloma e a infecção está sob controle, sendo chamada de "tuberculose

latente", no homem. Se a latência é uma característica de animais infectados com o M.

bovis, ela é ainda uma questão aberta. Existem animais que apresentam teste cutâneo e/ou

γ-IFN positivo, mas nenhuma lesão é detectada, e isso pode refletir a latência. Além disso,

durante o programa australiano de erradicação da tuberculose, os animais previamente

negativos desenvolveram a infecção muitos anos após o rebanho ser declarado livre de

tuberculose. Esses animais poderiam representar a possivel fonte de re-infecção com a

reativação da latência ou de uma infecção crônica e muito lenta. O mecanismo exato pelo

qual alguns indivíduos perdem o controle do foco primário não é claro, mas é fundamental

para a compreensão das infecções por micobactérias. É provável que haja muitas e

complexas interações, especialmente muitas formas de imunosupressão possam levar a

progressão da doença. Este fato pode ser ilustrado na infecção pelo HIV, no homem, onde

uma queda nos níveis de células T CD4 + resulta na reativação da tuberculose. A reativação

da tuberculose em pessoas idosas sugere uma resposta imunológica menos eficiente,

podendo levar à perda do controle da infecção dormente.

LESÕES

Tubérculos são agregados de macrófagos, linfócitos e outros leucócitos que são

formados no local primário da infecção, no linfonodo regional e nos locais secundários e

metastáticos. Macroscopicamente, a lesão é translúcida e semelhante a uma pérola. Mais

tarde, as lesões crescem, havendo necrose central de aparência amarelo-esbranquiçada.

Logo após, surgem as células de Langhans, que são macrófagos que se fusionam ou

multiplicam continuamente, sem divisão do citoplasma. O citoplasma destas células é claro

e o seu núcleo (2 a 10) é arranjado em forma de círculos crescentes. Os bastonetes são

vistos dentro destas células. À medida que a massa cresce, o centro necrótico torna-se

maior e mais células gigantes são observadas, em volta do processo granulomatoso. As


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massas tuberculosas antigas podem envolver o lobo pulmonar inteiro e grandes áreas do

fígado, baço e linfonodos (20X o tamanho normal). A porção central consiste de um

material seco e semelhante a queijo “lesões caseosas” em que há depósito de cálcio,

produzindo um barulho característico ao corte. As lesões são envolvidas por um tecido

conetivo denso.

Lesões nos bovinos: linfonodos bronquiais, mediastínicos, submaxilares e

retrofaríngeos.

Lesão ativa: São aquelas em que há evidência de hiperemia, nas áreas de lesão

caseosa.

Lesão inativa: São aquelas áreas em que há lesão calcária e muito encapsulada. Os

bastonetes são de difícil visualização pela microscopia, mas o cultivo e a inoculação em

cobaia são positivos.

Pleurite tuberculosa e peritonite tuberculosa são freqüentes em áreas endêmicas. As

massas são semelhantes a uvas, revestindo as serosas. Geralmente, o tecido pulmonar não é

afetado. Em áreas onde há grande ocorrência de tuberculose, a doença causa adesão dos

pulmões à parede torácica, sendo o tecido tão forte que os pulmões só podem ser removidos

da cavidade pelo corte. Os órgãos menos envolvidos são: fígado, baço e linfonodos

mesentéricos.

A infecção do úbere é constatada em menos de 1% das vacas com pleurite ou

peritonite tuberculosa. Quando há envolvimento, os bastonetes podem ser detectados nos

ductos lactíferos e o leite conter um grande número de bastonetes. Bezerros alimentados

com leite infectado podem desenvolver a doença (lesão 1ª) na cavidade abdominal e

torácica.

A lesão nos suínos pode ser progressiva e as lesões mais freqüentes são nos

linfonodos da cabeça, pescoço e abdômen, acompanhando a porta de entrada da infecção.


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A lesão de tuberculose nos eqüinos está localizada na região faríngea, mesentérica,

pulmonar, fígado e baço. A lesão é bastante semelhante com neoplasia e evidenciam

necrose caseosa.

A lesão nos ovinos e caprinos é principalmente pulmonar. A doença é progressiva

só nos jovens.

Gatos são altamente suscetíveis ao M. bovis, contraindo a tuberculose pela ingestão

de leite "in natura" de vacas tuberculosas ou comendo carne contaminada. A lesão primária

ocorre nos órgãos abdominais e secundariamente no pulmão, muito semelhante ao

linfossarcoma felino (neoplasia).

IMUNIDADE

O resultado das infecções por micobactérias é dependente de uma complexa

interação entre as bactérias invasoras e a resposta imune do hospedeiro. A resposta imune

tem sido extensivamente estudada nas infecções do complexo M. tuberculosis utilizando o

modelo murino ou em cobaias.

Após a infecção ocorre uma interação entre a resposta inata, atraves dos macrófagos

e as micobactérias, desencadeando uma série de eventos decorrentes desse encontro. Os

bastonetes podem ser mortos e eliminados; podem permanecer quiescentes; podem ativar o

desenvolvimento ativo da tuberculose ou reativar a dormencia em algum momento do

futuro. Recentemente, foi demonstrado que espécies do gênero Mycobacterium formam

esporos (Ghosh et al 2009, entretanto o papel dessa estrutura não foi ainda elucidado.

O M. bovis provoca uma reação de hipersensibilidade retardada e o reconhecimento

de células T aos antígenos desse agente é a principal resposta imune para a tuberculose.

A reação alérgica é tida como indicadora da resposta immune em consequencia da

infecção ou doença de diferentes micobactérias.

Pollock e Neill, em 2002, mensurou o papel das células B, relatando que estas

células induziu resposta humoral somente em estágios avançados da tuberculose bovina.


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Welsh, em 2005, documentou a passagem da resposta celular para a respsota humoral nos

animais tuberculosos. Inicialmente, os animais desenvolveram uma forte resposta celular,

mas com a progressão da doença, a resposta celular diminui enquanto que a resposta

humoral aumenta com a produção de IgG1. A resposta humoral não parece ser capaz de

controlar a infecção; a progressão da patologia e a aumento da eliminação do agente.

Waters e colaboradores, em 2006, relataram que em bovinos experimentalmente

infectados há uma produção de anticorpos precoce com produção de anticorpos específicos

IgM e IgG. A progressão da doença pode explicar a Anergia em alguns animais infectados

aos testes baseados na resposta celular. A ausência da resposta celular nos animais

infectados ocorre quando a eliminação bacteriana é grande.

Denis e colaboradores, em 2007, postularam que os bovinos anérgicos pertencem a

um grupo de animais em que esses componentes antinflamatórios são recrutados,

prevenindo a expressão de marcadores da imunidade da tuberculose, através da resposta à

PPD. Dados recentes obtidos na tuberculose bovina sugerem que há uma liberação de IL-10

associado com a progressão da doença e relacionando o envolvimento da IL-10 na anergia à

PPD. A perda de resposta à PPD pode estar ligada ao aumento da ativação de monócitos e

macrófagos, especialmente na liberação de substancias oxidantes ou prostaglandinas

reduzindo a proliferação de linfócitos T e liberação de citocinas.

Informações consideráveis estão disponíveis e teorias bem documentadas na

interação entre o agente e o sistema imune do hospedeiro infectado têm sido propostas. No

entanto, quando se aplicam essas hipóteses obtidas em camundongos puros para o ser

humano não consanguineo ou bovinos, o resultado é mais complexo.

A dificuldade em dissecar o papel individual do tipo celular e de citocinas são, em

parte, devido à redundância do sistema imunológico. A sobreposição de funções dos

componentes do sistema imune é, provavelmente, uma grande vantagem para o hospedeiro

contra as infecções por micobactérias e, na maioria dos indivíduos infectados, o hospedeiro

ganha a batalha. No entanto, é provável que haja também redundância e complexidade nos


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fatores envolvidos na virulência de bactérias, tornando a compreensão da relação íntima

entre agente-hospedeiro fascinante.

Após quatro (3 - 6) semanas da infecção, há o desenvolvimento da resposta mediada

por células, resultando no aumento da morte intracelular. A difusão da infecção no

organismo é reduzida ou suspensa. Algumas vezes, os microrganismos da lesão primária e

dos linfonodos regionais são completamente eliminados. Há ativação dos macrófagos por

meio de linfocinas liberadas pelos linfócitos sensibilizados pelos antígenos do M. bovis. A

atividade bactericida dos macrófagos não é específica e pode ser expresso contra outras

bactérias intracelulares. Há evidência de produção de linfocina específica contra o M. bovis,

inibindo a multiplicação intracelular deste microrganismo. As linfocinas de linfócitos T

sensibilizados são também responsáveis pelo processo de necrose caseosa observadas

dentro dos tubérculos. A imunidade protetora, geralmente não elimina todos os organismos

dos tecidos, havendo sempre o risco de futura reativação da infecção ou convivência com o

agente (portador).

Os linfócitos T permanecem sensibilizados pelo resto da vida e a re-infecção resulta

numa rápida ativação de macrófagos e destruição dos bastonetes invasores, efeito

conhecido como fenômeno de KOCH.

Os anticorpos formados durante a infecção podem ser mensurados por meio de

testes sorológicos, incluindo precipitação, fixação do complemento, ELISA e

hemaglutinação. Os anticorpos séricos estão diminuídos, nos animais tuberculosos; não

estando associado com a resistência do indivíduo. Alguns animais não possuem uma

resposta protetora efetiva, desenvolvendo uma tuberculose generalizada com debilitamento

(caquexia) e morte. A inoculação em animais experimentais é importante como mostra o

quadro 1.


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Quadro 1. Prova Biológica (Experimental) das micobactérias

__________________________________________________________________________

Espécie(s) cobaia coelho ave

__________________________________________________________________________

M. tuberculosis + - -

M. bovis + + -

M. avium - + +

CONTROLE

As doenças micobacterianas são normalmente progressivas e com um grande

número de animais subclinicamente infectados. A identificação desses animais é difícil,

com os testes diagnósticos disponíveis. O agente pode sobreviver no ambiente e muitas

espécies de animais silvestres podem ser infectadas. Estes fatores fazem da tuberculose

bovina e da paratuberculose um grande desafio no seu controle. A maioria dos países

desenvolvidos tem programas de controle da tuberculose bovina, devido ao risco zoonótico

que representa o M. bovis. Estes programas estão geralmente baseados no teste-e-abate e

restrição de circulação de animais.

O teste utilizado é o teste alérgico intradérmico, em que o derivado protéico

purificado (PPD) do M. bovis é inoculado intradermicamente e posteriormente 72h +/- 6h

são mensuradas em mm, o aumento diferencial da espessura da pele como um índice de

infecção. Apesar desses programas de controle, vários países não conseguiram erradicar a

tuberculose bovina. Isto é particularmente verdadeiro para os países que possuem um

reservatório de vida selvagem, como o Reino Unido, Irlanda e Nova Zelândia. O M. bovis e

Map podem infectar uma grande variedade de animais domésticos e silvestres. Até que


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ponto a vida selvagem constitui uma ameaça para os animais domésticos depende da

habilidade da espécie para atuar como hospedeiro de manutenção ou como hospedeito de

passagem. No hospedeiro de manutenção, a infecção pode persistir pela transmissão intra-

espécies sozinha, enquanto que no hospedeiro de passagem, a infecção não persiste

indefinidamente a menos que haja reinfecção de outro hospedeiro. É importante focalizar

nos animais silvestres para controlar a infecção nos animais domésticos. As espécies que

são importantes para a disseminação da tuberculose bovina são os texugos (Meles meles) no

Reino Unido e na Irlanda; o gambá rabo-de-pincel (Trichosurus vulpecula), na Nova

Zelândia e os cervos de cauda branca (Odocoileus virginianus), em Michigan. O Map tem

sido isolado de uma vasta gama de espécies e com maior freqüência de veados e coelhos. A

paratuberculose em criação de cervos e nas reservas de veados é prevalente em algumas

áreas, parecendo claro que os animais podem manter a infecção em populações com alta

densidade. No entanto, o significado dos cervos selvagens e outros animais selvagens para

a continuação ou a propagação de paratuberculose em animais não está clara.

Uma alternativa na estratégia da redução da propagação da tuberculose é a

vacinação dos animais silvestres. Essas vacinas injectáveis são a melhor opção, mas não é

uma alternativa realista para outros animais domésticos, exceto nos ensaios de pesquisa. A

BCG, uma vacina oral contra Tb humana, formulada com liberação lipídica reduziu a

gravidade da doença em um modelo animal com desafio, atraves de aerossóis. A resposta

parcial obtida pode levar a uma redução na excreção de bactérias e, consequentemente,

diminuiu a disseminação da infecção para os animais. A vacinação dos animais silvestres

em conjunto com melhorias no manejo quando complementadas com os programas de

controle atuais pode reduzir a transmissão e controlar a tuberculose nos bovinos. Outra

causa para a propagação da infecção por micobactérias é o comércio de animais.

O período de incubação longo e a progressão lenta da doença juntamente com testes

com qualidade inferior tornam dificil à identificação de todos os infectados.

Consequentemente, sempre haverá risco na compra animais de um rebanho com histórico


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de infecção. É difícil quantificar a da disseminação da tuberculose, especialmente se ela foi

causada pelo trânsito de animais; se pela infecção pelos animais silvestres ou pela

sobrevivencia do agente no ambiente.

O diagnóstico "in vivo" está baseado na reação de hipersensibilidade retardada

quando da inoculação intradérmica de tuberculina (derivada do M. bovis). A tuberculina

PPD bovina com princípio ativo de tubérculo-proteína é obtida, através de cultura de

amostra AN5 do M. bovis, em meio de Dorset e Henley modificado cuja concentração

protéica e sua potência são aferidas por testes químicos e biológicos. A aplicação é

intradérmica na derme da região cervical ou na região escapular, ao lado da crista

acromiana da omoplata. Determina-se o local da inoculação pelo corte dos pêlos

(tricotomia) em área de um quadrado com quatro cm de lado. Antes da inoculação mede-se

a espessura da derme com um cutímetro de pressão. Após a inoculação, deve ocorrer a

formação de uma pápula, o que caracteriza a inoculação correta (intradérmica).

Inocula-se dose única de 0,1 ml de tuberculina, contendo 0,1 mg de

tuberculoproteína. A avaliação do resultado (reação) deve ser feita entre 72 +/- 6 horas após

a inoculação da tuberculina, através de nova medição da dobra da pele e registro das

alterações perceptíveis. A interpretação da reação deve basear-se no seguinte esquema.

1-Teste ano caudal (teste de triagem em gado de corte)

Negativo (sem reação)

Reagente (qualquer reação)

Tabela 3 Teste cervical simples (PNCEBT, 2001)


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Quadro 1. Teste Cervical Comparativo (PNCEBT, 2001)

______________________________________________________________________________

Reação Diferença (mm) Resultado em relação à tuberculose

______________________________________________________________________________

Tb < Ta Negativo Negativo

Tb > Ta 0 - 1,9 Negativo

Tb > Ta 2,0 - 3,9 Suspeito

Tb > Ta 4,0 ou mais Positivo

_______________________________________________________________________________

Tb = tuberculina bovina Ta = tuberculina aviária


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A origem dos êrros nas tuberculinizações inclui

1-Má aplicação da tuberculina (subcutânea) e não intradérmica.

2-Sensibilização do animal às outras espécies de micobactérias.

3-Anergia.

4-Perda de resposta pela infecção recente.

5-Idade avançada.

6-Imunodepressão associada ao parto.

7-Dessensibilização associada com a tuberculose generalizada e avançada.

8-Administração recente de tuberculina, entre outras.

9-Dessensibilização criminosa

10-Êrro de leitura instrumental (paquímetro)

A falha na detecção da infecção, algumas vezes, resulta num dramático surto em

propriedades consideradas livres da doença.

No Brasil, onde a doença é endêmica, o Ministério da Agricultura recomenda o

método teste-e-abate (PNCEBT, 2001) em que todo animal considerado reagente as provas

de tuberculinização deve ser encaminhado ao abatedouro. Assim procura-se evitar que os

animais infectados desenvolvam a forma clinica de tuberculose e possam disseminá-la

neste ou em outro rebanho. Outra possibilidade seria proteger a população rural que maneja

diretamente com os animais e na proteção de quem ingere leite ou seus derivados lácteos

não pasteurizados. O controle da tuberculose bovina em regiões endêmicas ou mesmo em

regiões controladas necessita o rastreamento epidemiológico de fontes de infecção e

caracterização de amostras de maior patogenicidade, sendo epidemiologia molecular uma

ferramenta indispensável para esta avaliação.

VACINAÇÃO

O desenvolvimento de vacinas (BCG) contra o M. bovis foram realizadas no

passado. Entretanto a perda de eficácia dessas vacinas e o poder de confusão na


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interpretação dos testes de tuberculina impediram o uso de imunização artificial no controle

da tuberculose bovina.

Vacinação contra as doenças micobacterianas pode reduzir os sinais clínicos e

limitar a propagação do agente, mas não é suficiente para eliminar a infecção. Na

paratuberculose, vacinas vivas atenuadas ou inativadas têm sido utilizadas. Uma vez que a

vacinação interfere com testes de diagnóstico aplicado na paratuberculose e tuberculose

bovina, ela não deve ser utilizada em países que têm programas de controle da tuberculose

bovina. As vacinas contra a tuberculose bovina não são atualmente utilizadas pela mesma

razão. O uso de vacinas e testes diagnósticos sofisticados pode contornar esse problema no

futuro. A estratégia é usar diferentes antígenos em vacinas e nos testes diagnósticos, uma

estratégia denominada “DIVA” (“Differentiation between Infected and Vaccinated

Animals”). Isso já é viável para a tuberculose bovina com a vacina BCG tradicional. O M.

bovis BCG perdeu regiões genéticas quando comparadas ao M. bovis patogênico, incluindo

a proteína imunogênica ESAT-6. O teste que mede γ-IFN, após estimulação "in vitro" com

ESAT-6 pode ser utilizado para diferenciar infectados e vacinados com BCG. Entretanto o

até o teste de γ-IFN puder ser aprovado, o teste cutâneo deverá ser documentado quanto a

sua sensibilidade e especificidade. Até agora, este ensaio possui menor especificidade,

particularmente nos animais jovens, onde falso-positivos foram relatados como causadas

pela produção de γ-IFN a partir de células NK. Isto é preocupante, pois a vacina BCG

protege melhor quando administrado logo após o nascimento e seria importante testar esses

animais jovens. O teste de γ-IFN, utilizando antígenos especificos como o ESAT-6 também

pode diferenciar animais infectados pelo M. bovis e animais vacinados contra

paratuberculose em áreas com tuberculose bovina. O efeito protetor da vacina BCG em

bovinos, assim como no homem, é variável, interferindo com o teste cutâneo alérgico.

Apesar da redução das lesões, os animais são ainda susceptíveis e possíveis fontes de

propagação. Há um grande esforço e desafio para desenvolver uma segunda geração de

vacinas que dão um efeito superior a BCG. É provável que a imunidade protetora seja


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dependente de complexas interações entre as várias células do sistema imunológico com

uma variedade de mecanismos efetores anti-micobacterianos. Várias vacinas de DNA e

vacinas de subunidades de proteína foram testadas em bovinos, mas utilizadas

separadamente, mostraram menor eficácia do que a BCG. A alternativa mais promissora é a

BCG combinadas com vacinas de subunidades que produziria maior proteção em

comparação com BCG. Estes resultados mostram que uma estratégia vacinal parece ser

viável no futuro, mas precisa ser acompanhada com o desenvolvimento de testes de

diagnóstico apropriados.

TRATAMENTO

O tratamento da tuberculose bovina com ATMs não deve sequer ser pensado, pois

se trata de uma doença populacional. A indicação é o envio de animais reagentes para o

matadouro. O tratamento de tuberculose em primatas, especialmente aqueles pertencentes a

particulares deve ser desencorajado pelo risco à Saúde Pública. O clínico veterinário é

obrigado a recomendar cuidados médicos às pessoas expostas. O M. bovis é sensível à

isoniazida (INH), à estreptomicina, e à rifampicina. A eficiência do tratamento com INH

experimentalmente pode atingir 100 % (Leite e Lage, 1999), mas são citados resultados

clássicos onde a eficiência varia entre 50% e 96,4 %. Lamentavelmente, poucos

pesquisadores brasileiros insistem na utilização da isoniazida no tratamento da tuberculose

bovina e bubalina, entretanto o tratamento com ATMs deve ser completamente rejeitado

pelo risco de falha no controle da infecção nos animais; pelo perigo à Saúde Pública e

desenvolvimento de multirresistência.

Em casos muito especiais pode ser tentado o tratamento, tendo em mente que a

doença é infecciosa e dependente não somente do agente, mas também do hospedeiro e

ambiente. Quanto uma linhagem do M bovis é resistente aos ATMs se observa uma

crescente preocupação com o aumento de casos de tuberculose, tanto no homem como em

animais. Na Itália, foi detectada multirresistência em amostras do M. bovis isoladas em


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rebanhos na Sardenha, frente à rifampicina e isoniazida, envolvendo os genes rpoB para

rifampicina e inhA katG e oxyR-ahpC para isoniazida. A presença de linhagens do M.

bovis resistentes às drogas antituberculosas e o seu risco à Saúde Pública estão sendo

acompanhadas, desde 1974 na América latina.

No Brasil, em um estudo isolado com 200 amostras de micobactérias de tuberculose

humana, observou-se amostras de M. bovis (3,5 %), sendo 3 amostras multirresistentes às

drogas antimicobacterianas. Levantamentos quanto à resistência à INH, através de

amostragem aleatória, entre 1985 e 1990 foram realizadas pela OMS, na América Latina.

Verificaram que 63 amostras (6,64 %) de M. tuberculosis resistentes a INH, isoladas entre

948 pacientes tuberculosos. Mecanismos diversos de resistência do M. bovis a INH têm

sido detectados em função de casos de M bovis multirresistentes aos antimicrobianos em

pacientes humanos imunodeprimidos e imunocompetentes.


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Mycobacterium lepraemurium


Lepra murina

Lepra do gato

Systématique

La lèpre du rat a été décrite en 1902 lors d'une campagne de dératisation conduite en

Ukraine. Un an plus tard, la maladie a été identifiée au Royaume Uni puis dans la plupart

des pays. La maladie du rat présente des analogies clinique et anatomopathologique avec la

lèpre de l'homme si bien que, durant de nombreuses années, l'agent de la lèpre du rat a été

assimilé à Mycobacterium leprae. La présence de communautés antigéniques entre l'agent

de la lèpre du rat et Mycobacterium leprae ainsi que des similitudes dans les caractères

bactériologiques sont venus renforcer l'idée d'une identité entre les agents de la lèpre

humaine et de la lèpre du rat.

En se basant sur des arguments principalement morphologiques (contrairement à

Mycobacterium leprae, l'agent de la lèpre du rat n'est pas groupé en amas ou en palissades

au niveau des lésions) Marchoux et Sorel proposent l'appellation de Mycobacterium

lepraemurium pour l'agent de la lèpre du rat. Cette dénomination a été incluse dans les

Approved Lists of Bacterial Names et des analyses antigéniques ainsi que l'étude des sucres

de la paroi, l'analyse des acides mycoliques, la possibilité de cultiver cette bactérie in vitro,

l'étude des ADN et l'étude des séquences des ARNr 16S montrent que Mycobacterium

lepraemurium est une espèce distincte de Mycobacterium leprae.

Caractères bactériologiques

http://www.bacterio.cict.fr/alintro.html


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Mycobacterium lepraemurium est un bacille de 2 à 7 mm de longueur sur 0,3 à 0,4 µm de

diamètre, acido-alcoolo-résistant mais pouvant présenter une coloration irrégulière, sensible

au p-nitrobenzoate (500mg/L), sensible à l'hydroxylamine (125 mg/L), donnant une

réponse négative aux tests niacine, nitrate réductase, catalase thermostable, hydrolyse du

Tween 80, uréase, nicotinamidase, pyrazinamidase et phosphatase acide.

Cette bactérie est très difficile à cultiver in vitro et elle ne pousse pas sur les milieux

couramment utilisés pour les mycobactéries (Löwenstein-Jensen, milieux gélosés de

Middlebrook, milieu de Herrold, milieu de Dorset...). Toutefois, le milieu au jaune d’œuf

d’Ogawa, à condition d’être ensemencé de manière abondante et d'être incubé à 30 °C,

permet la croissance. Les colonies qui apparaissent en 4 à 8 semaines sont petites,

rugueuses, non pigmentées ou légèrement pigmentées en jaune clair.

Habitat et pouvoir pathogène

Mycobacterium lepraemurium est responsable d’une maladie endémique, chronique et

granulomateuse du rat mais cette bactérie est également responsable de la "lèpre du chat".

La preuve de l'identité entre l'agent de la "lèpre du chat " et Mycobacterium lepraemurium a

été apportée par la comparaison des séquences des ARNr 16S. Toutefois, d'autres

mycobactéries, proches de Mycobacterium malmoense, semblent également être

responsables de la "lèpre du chat".

Chez le chien, des mycobactéries non identifiées sont responsables d'une infection

comparable à la lèpre et qualifiée de "canine leproid granuloma syndrome".

La lèpre du chat, d’abord décrite en Nouvelle Zélande, semble avoir une répartition

mondiale (Australie, Amérique du Nord, Europe). L’infection du chat résulterait de

morsures de rats et la maladie se traduit par l’apparition de un ou de multiples nodules

cutanés, de 1 à 3 cm de diamètre, ulcérés ou non, présents sur toutes les parties du corps

mais avec une localisation préférentielle à la tête et aux membres. Les nodules sont non

douloureux, l’état général de l’animal est non affecté mais on observe fréquemment une

adénite des nœuds lymphatiques drainant la région. L’examen anatomopathologique révèle


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des granulomes inflammatoires présentant parfois des foyers de nécrose caséeuse, des

macrophages et des cellules géantes multinucléées. La coloration de Ziehl permet de

visualiser de nombreuses mycobactéries notamment dans les zones nécrosées et dans le

cytoplasme des macrophages ou des cellules géantes.

Expérimentalement, l’injection d’un broyat de granulomes reproduit chez le rat ou la souris

une infection tout à fait comparable à la lèpre du rat.

Le traitement fait généralement appel à une excision chirurgicale. La dapsone a été utilisée,

notamment en Australie, mais cette substance provoque des effets secondaires importants

chez le chat (anémie hémolytique, troubles nerveux).

Diagnostic bactériologique

Le diagnostic repose sur la mise en évidence dans les lésions de nombreuses bactéries

acido-alcoolo-résistantes, souvent présentes dans les macrophages, et ne cultivant pas sur

Löwenstein-Jensen (les autres mycobactéries telles que ¤ Mycobacterium fortuitum, ¤

Mycobacterium chelonae ou ¤ Mycobacterium smegmatis, capables de provoquer des

lésions cutanées chez le chat, sont cultivables in vitro sur les milieux couramment utilisés

pour les mycobactéries). La technique de PCR décrite par Hughes et al. peut être mise en

œuvre directement dans les prélèvements et, selon les auteurs, donnent un diagnostic de

certitude.

Orientation bibliographique

Site Web : Tuberculose. Techniques de diagnostic en mycobactériologie (Michel Fabre,

Frédéric Augu & Stéphane Lecaudey)

GREENE (C.E.) : Mycobacterial infections. In : C.E. GREENE (ed.) : Infectious diseases

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http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/mm/chelonae.html

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small animal practice. Volume VI., WB Saunders company, 1977, Philadelphie, 569-571.

Mycobacterium caprae


Tuberculose Caprina

SINONÍMIA: Mycobacterium bovis subsp caprae.


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INTRODUÇÃO

O gênero Mycobacterium é o único gênero da família das Mycobacteriaceae e,

dentro desse gênero estão incluídas as espécies M. africanum, M. bovis, M. canettii, M.

microti, M. pinnipedii e M. tuberculosis são responsáveis pela tuberculose no homem ou

nos animais.

Os estudos de hibridização de ADN-ADN; de polimorfismo eletroforético de

isoenzimas; a seqüência dos ARNr 16S e 23S; o sequenciamento das seqüência intergênicas

ADNr 16S - ADNr 23S; o sequenciamento dos genes que codificam a proteína do choque

térmico Hsp65; o sequenciamento dos genes rpoB, katG, rpsL, gyrA e dnaJ; eletroforese de

proteínas celulares e análise de fragmentos de restrição obtidos com EcoRI (técnica RFEL

naqueles fragmentos marcados com 32

P) mostraram que essas quatro espécies constituem

de fato uma única espécie genômica. Todas as demais deveriam ser consideradas como

subespécie (ou biovar) de uma única espécie que por razão das regras de prioridade deveria

ser chamada de M. tuberculosis.

Razões ligadas a sua importância veterinária e médica (poder patogênico e espectro

dos hospedeiros dessas espécies não são idênticas), nenhuma proposição formal foi feita e o

nome de M. africanum, M. bovis, M. microti, M. pinnipedii e M. tuberculosis conservam

seu “status” dentro da nomenclatura. Essas espécies são denominadas de micobactérias do

complexo M. tuberculosis.

Em 1999, num estudo com 119 amostras de caprinos foi isolada uma amostra de

carneiro e outra de suíno, permitindo que Aranaz e colaboradores descrevessem o M.

tuberculosis subsp caprae. A publicação valida dessa subespécie criou automaticamente

a subespécie M. tuberculosis subsp tuberculosis.

As linhagens do M. tuberculosis subsp caprae possuíam as seqüências do ADN

específicas dos bacilos (IS6110, IS1081 e MPB70), a seqüência do ARNr 16S e a

composição dos ácidos graxos característicos das espécies do complexo M. tuberculosis";

eles reagiram com a sonda Accuprobe (Gen-Probe) complementaria ao ARN ribossomal


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dos bacilos da tuberculose. Como essas cepas foram isoladas principalmente de caprinos,

elas foram etiquetadas como M. bovis. Por outro lado, a tipificação molecular baseada na

detecção das seqüências nucleotídicas repetitivas como a seqüência de inserção IS6110, as

seqüências polimorfas repetitivas ricas em guanina e citosinas (PGRS para Polymorphic

G+C-Rich Sequences) e as seqüências repetidas diretas (DR para Direct Repeat)

permitiram diferenciar essas cepas das outras representantes do complexo M. tuberculosis.

O mesmo se deu com a tipagem pelo spoligotyping.

Niemann e colaboradores, em 2001, demonstraram que as características culturais,

bioquímicas e genéticas do M. tuberculosis subsp caprae eram mais próximas das

características do M. bovis do que as características do M. tuberculosis. Assim, os autores

propuseram transferir esta subespécie dentro da espécie M. bovis com a nomenclatura de M.

bovis subsp caprae. A validação do Mycobacterium bovis subsp caprae criou

automaticamente a subespécie M. bovis subsp bovis. M. bovis subsp caprae e o M. bovis

subsp bovis partilham características comuns, permitindo diferenciá-las do M. tuberculosis:

suas colônias são disgônicas; são microaerófilas; não reduzem nitratos; dão resposta

negativa ao teste da niacina; incapazes de crescer na presença de 1 ou de 2 µg/mL de

hidrazida do ácido tiofênico-2-carboxílico; apresentam mutação dos genes oxyR (posição

285) e gyrB (posição 756); desprovidos de espaçadores 39 a 43 e desprovidos da seqüência

genética mtp40. Contrariamente ao M. bovis subsp bovis, as cepas do M. bovis subsp

caprae são sensíveis à pirazinamida (codon 57 do gene pncA code para uma histidina);

desprovidos de espaçadores 1, 3-16 e 30-33, as bases 1311 e 1410 do gene gyrB são G e C

(T e T no M. bovis subsp bovis) e produzem uma fosfatase alcalina uma beta-glucosidase e

uma Tween 80 esterase.

Em 2003, Aranaz e colaboradores propuseram elevar o M. bovis subsp caprae ao

nível de espécie e em 13 de novembro de 2003, os autores validaram a nomenclatura de

Mycobacterium caprae.


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CARACTERÍSTICAS MORFOTINTORIAIS

O M. caprae apresenta todas as características do gênero Mycobacterium. As

linhagens dessa espécie são constituídas de bastonetes AAR; não esporulados; imóveis;

algumas vezes, agrupados em filamentos alongados e retorcidos (formação de “corda”).

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Resposta positiva aos testes de:

Teste da catalase (à temperatura ambiente), hidrólise do Tween 80 (reação fraca

obtida em 10 dias) e sintetiza (galeria API ZYM) uma fosfatase ácida; uma fosfatase

alcalina, uma beta-glucosidase e uma esterase.

Resposta negativa aos testes de:

Teste da catalase a 68° C; redução de nitratos; acúmulo de niacina e arilsulfatase.

CARACTERÍSTICAS CULTURAIS

O Crescimento é estimulado pelo piruvato de sódio; colônias tornam-se visíveis

após 4 a 6 semanas de incubação a 36° C. Após os subcultivos, o crescimento é mais rápido

(3 a 4 semanas a 36° C), mas elas não são observadas à temperatura de incubação a 25, a 30

ou a 43° C.

Em meios sólidos, as colônias são lisas e não pigmentadas.

No meio 7H10, o cultivo é inibido com 5% de NaCl; 1µg/mL de hidrazida do ácido

tiofênico-2-carboxílico, por 50 µg/mL de pirazinamida; por 0,2 % de ácido pícrico; por 500

µg/mL de hidroxilamina; por 500 µg/mL de p-nitrobenzoato e por 250 µg/mL de ácido

oléico.

HABITAT E PATOGENICIDADE


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As primeiras amostras do M. caprae foram isoladas, na Espanha, por Aranaz e

colaboradores, em 1999, de linfonodos e dos pulmões de cabras com tuberculose. Pouco

tempo depois o agente foi isolado e a infecção documentada em diferentes países e em

diversas espécies animais. Na Áustria, em 2002, Prodinger e colaboradores descreveram as

infecções do M. caprae em bovinos, homem e cervo vermelho (Cervus elaphus). Em 2002,

na República Checa, Pavlik e colaboradores registraram a patogenicidade do M. caprae em

bovinos e suínos domésticos. Em 2003, na Alemanha, Kubica e colaboradores confirmaram

em pacientes alemães e que 69% dos casos de tuberculose bovina eram causados pelo M.

bovis enquanto que 31% dos isolados foram identificados como M. caprae. Em 2004 e

2006, na Croácia, Erler e colaboradores e Cvetnik e colaboradores descreveram casos da

doença em bovinos e em bovinos e suínos respectivamente.

A especificidade para um hospedeiro, como acontece com outras espécies do

complexo M. tuberculosis não é total. As amostras do M. caprae foram isoladas de

suídeos, ovinos, bovinos e de cervídeos (Cervus elaphus). Varias linhagens (pelo menos 3

na Espanha e pelo menos 12 na Alemanha) foram isoladas do homem. As cepas humanas

isoladas na Espanha foram provenientes de um empregado de matadouro (magarefe), um

veterinário trabalhando com cabras e um habitante vivendo em uma região ou propriedade

caprina tecnificada. Esses fatos demonstram a possibilidade de transmissão ao homem a

partir de animais, especialmente pequenos ruminantes.

As cepas do M. bovis sensíveis à pirazinamida possuem um spoligotype original

(ausência dos espaçadores 3 a 16 e dos espaçadores 18 à 43) isolados por Niemann e

colaboradores poderiam pertencer a espécie M. caprae.

DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

As técnicas utilizadas por Aranaz e colaboradores, em 1999, para isolamento e

identificação desse agente foram os seguintes:


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1-Trituramento do tecido com água destilada e descontaminação, através da técnica

do lauril sulfato de sódio; através do método do cloreto de cetil-piridinio.

2-Centrifugação por 30 minutos a 1.068 X G, inoculação no meio de Coletsos e no

meio de Löwenstein-Jensen enriquecido com 0,2 % de piruvato de sódio e incubação a

36°C.

3-As colônias suspeitas foram cultivadas no meio de Coletsos a 36°C, durante 4

semanas e, posteriormente submetidas ao testes preconizados por Lévy-Frébault e Portaels

(1992).

O diagnóstico do gênero é fácil, mas o diagnóstico de espécie nem todos os

laboratórios realizam. A linhagem suspeita deverá ser enviada a um laboratório

especializado em micobactérias e mais particularmente no estudo dos bacilos tuberculosos.

É importante considerar o M. caprae como agente de uma zoonose e esta espécie

será provavelmente colocada na categoria de agentes que apresentam um nível de risco 3, o

que faz necessário o envio da amostra a um laboratório de referência.

TSA

A amostra ou linhagem típica é sensível a isoniazida (0,2 µg/mL); rifampicina (1

µg/mL); etambutol (5 µg/mL); estreptomicina (2 µg/mL); p-aminosalicilato (2µg/mL);

ofloxacina (2,5 µg/mL); a cicloserina (30 µg/mL) e 50 µg/mL de pirazinamida (1 % de

colônias resistentes).


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Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map)


Paratuberculoses

Doença de Johne

Doença de Crohn

TAXONOMIA ATUAL

Em 1990, Thorel e colaboradores, tendo como base a relação genética próxima entre

o Mycobacterium avium, M. paratuberculosis e do M. silvaticum, propuseram que estas

espécies fossem agrupadas juntas como Mycobacterium avium e separadas pelas

designações de subespécie. Desde então o agente da paratuberculose foi oficialmente

substituído pelo Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map)

IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

A compreensão dos eventos associados aos prejuízos econômicos é fundamental e

dá suporte na tomada de decisão quanto a abordagem da doença local e/ou global.

Os prejuízos econômicos na pecuária leiteira são bem maiores do que nos animais de corte

(Barkema et al 2010). O impacto econômico da paratuberculose pode inclui perdas antes da

eliminação e durante a eliminação, antes das medidas de controle e prevenção; as perdas

com o estabelecimeno das medidas de controle e prevenção e os custos do controle e

prevenção. Nos Estados Unidos, essas perdas foram estimadas em mais de 1,5 bilhões por

ano, segundo Jones (1989).

A maioria dos casos de paratuberculose é subclínica e com isso, as estimativas não

são muito precisas o que torna difícil avaliar as perdas econômicas (National Research

Council, 2003). Merkal e colaboradores, em 1975, reportaram que 22,6% dos animais

infectados pelo Map foram descartados por mastite quando comparadas com 3,6% das

vacas não infectadas. Wilson e colaboradores, em 1995, relataram uma associação inversa

entre mastite e os reagentes para a infecção pelo Map.


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Benedictus e colaboradores, em 1987, estimaram que no ano da eliminação de uma

vaca com DJ houve uma redução na produção de leite de 19,5% e na última lactação desse

mesmo animal houve uma perda estimada em 5%, pois não houve o consumo do

concentrado durante toda a lactação, mas a animal não utilizou eficientemente o alimento.

Portanto, calculou-se que a perda líquida devido a perdas de produção foi de 209 libras /

caso de DJ. As estimativas das perdas na produção de leite são variáveis ou contraditórias.

Alguns estudos detectaram produção de leite equivalente ou mesmo superiores aos animais

não infectados pelo Map (McNab et al. 1991; Johnson et al, 2001). Outros evidenciaram

perdas na produção de leite nos animais reagentes de até 19,5% de 0 a 305 dias de produção

(Benedictus et al. 1987; Wilson et al. 1993; Sweeney et al. 1994; Kudahl et al, 2004).

Entretanto, quando foi utilizado um modelo simulatório, a média global de perda anual foi

35 dólares por vaca, aumentando para 72 dólares/vaca/ano, após 20 anos, em um rebanho

leiteiro, típico americano, com 100 animais em média (Groenendaal e Galligan, 2003). Stott

e colaboradores, em 2005, na Escócia, consideraram que a DJ justificava o ajuste da

política de abate, sob a constante pressupostos bioeconômica, reduziu a renda esperada da

produção de leite no âmbito da política de substituição ideal de cerca de 10 por cento (27

libras /vaca/ ano). Ott e colaboradores, em 1999, nos Estados Unidos, num estudo

envolvendo o serviço nacional de saúde animal estimaram que as perdas econômicas em

rebanhos positivos para paratuberculose bovina era cerca de 100 dólares / vaca quando

comparado com rebanhos negativos pela redução na produção e aumento dos custos de

reposição. Em rebanhos positivos houve pelo menos 10% de vacas eliminadas com a forma

clinica da doença com custos superiores a 200 dólares. Nos rebanhos com alta prevalência

houve uma redução de mais de 700 kg de leite / vaca; eliminação de mais vacas; menores

receitas com as vacas descartadas e aumento da mortalidade em vacas quando comparadas

aos rebanhos negativos. A média dos custos com a redução da produção da indústria de

laticínios americana com a DJ de todos os rebanhos varia de 22 a 27 dólares / vaca ou 200 a

250 milhões de dólares anuais. Lombard e colaboradores, em 2005, publicaram os


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resultados obtidos sobre o efeito da infecção pelo Map e a produção de leite individual de

7.879 vacas de 38 rebanhos leiteiros provenientes de 16 estados. Concluíram que vacas com

teste (Elisa) fortemente positivo produziram significativamente menos leite, tanto na

lactação equivalente quanto na lactação máxima (305 dias). Não houve diferenças

significativas observadas na lactação de 305 dias para o percentual de gordura, proteínas

idade, lactação e contagem celular somática entre vacas com forte resultado positivo ou

resultado negativo.

Merkal e colaboradores, em 1975, quantificaram a associação entre infertilidade e

descarte de vacas. Obtiveram que 68,8% das vacas infectadas foram eliminadas por

infertilidade quando comparados com as 60,2% das não infectadas.

Abbas e colaboradores, em 1983, na Califórnia compararam o intervalo entre partos

entre infectados e não infectados. O intervalo entrepartos foi de 15,2 meses nos animais

infectados pelo Map e 13,5 meses entre os não infectados. Essa associação não foi

verificada pelos estudos de McNab e colaboradores, em 1991, no Canadá.

Fallah e colaboradores, em 2010, no Iran, estudaram os efeitos da infecção pelo

Map sobre um rebanho leiteiro. Concluíram que há associação entre os casos clínicos e o

baixo desempenho reprodutivo, incluindo absorção fetal, abortos e redução da produção de

leite.

O valor da carcaça é reduzido em pelo menos 30% (em casos extremos a carcaça

perde valor). Entretanto o peso reduzido pode significar diminuição da ingesta de alimento,

gerando um fator de correção. Benedictus e colaboradores, em 1987, contabilizaram o

prejuizo com a redução de peso no matadouro em 129 libras.

Mais importante do que prejuízos diretos, a redução no preço do leite de rebanhos

infectados pode resultar em preocupação dos consumidores sobre o potencial zoonótico de

paratuberculose. O papel potencial do Map na patogênese da doença de Crohn no homem

ainda não foi resolvido (European Commission, 2000; Food Safety Authority of Ireland,

2000; Chacon et al, 2004). Se o Map estiver implicado, então o leite seria o veículo de


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transmissão possível do organismo para os seres humanos, pois o Map tem sido detectado

em leite cru e pode não ser eficazmente inativado pelos processos de tratamento térmico

(pasteurização) industrial (Sweeney et al.1992; Streeter et al, 1995; Grant et al. 1996; Grant

et al. 1999; Grant et al, 2002a,b).

Juste, em 1997, na Espanha, calculou os prejuizos econômicos com cada caso da

forma clinica da paratuberculose ovina. Estimou em 120 euros /caso clinico para os ovinos

leiteiros e 60 euros/ caso para os animais d ecorte.

Brett, em 1998, na Nova Zelândia avaliou os prejuízos de uma vaca leiteira com DJ

em 1.616 dólares; de ovinos da raça Merino em 48 dólares e ovinos de duplo propósito em

42 dólares, considerando o impacto econômico de 1 único animal com DJ / ano. Caldow e

Gunn, em 2000, na Inglaterra, estimaram os prejuízos econômicos em ovinos,

especialmente pelas mortes inesperadas causada pela paratuberculose. Eles estimaram um

valor entre 24 a 94 libras.

CARACTERÍSTICAS GERAIS DO AGENTE

O M. avium subsp paratuberculosis (Map) é um bastonete pequeno com 0,5 m de

largura e 1,5 m de comprimento. Gram positivo. Parasita intracelular obrigatório. Nas

fezes e tecidos, aparecem agrupados (apinhados) que é um forte indicativo de sua

identificação. É fortemente A.A.R.; É encontrado dentro dos macrófagos e células gigantes.

A principal característica dessa espécie é a sua dependência a micobactina exógena para

crescimento “in vitro”.

Micobactina é um agente quelante do ferro produzidos por todas as micobactérias e,

por razões desconhecidas o Map não a produz ou produz em quantidade insuficiente para

seu crescimento “in vitro” A dependência à micobactina pode ser resolvida pela adição de

ferro no meio de cultivo. As colônias características são pequenas, lisas-rugosas, firmes,

brilhosas, brancas de 1 a 5 mm de tamanho no meio; pode haver variação com a


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pigmentação colonial com cepas produtoras de pigmento amarelo ou laranja. As cepas com

pigmentação amarela ou laranja, primariamente são isoladas de ovinos.

CARACTERÍSTICAS CULTURAIS

O Map cresce muito lentamente com uma necessidade de micobactina P ou J

(agente quelante do ferro). Está muito mais relacionado com o M. avium.

Após 9-16 semanas, as colônias (1 a 2 mm) podem ser visualizadas. O meio de

Herrold ou Dubos-Smith com 0,4% de piruvato de sódio promove o seu crescimento. As

amostras de fezes e conteúdo intestinal destinada ao isolamento podem ser tratadas com

cloreto de hexadecilpiridínio (HPC), cloreto de benzalcônio e/ou 5% de ácido oxálico.

LEVANTAMENTOS EPIDEMIOLÓGICOS

Num levantamento realizado em 1983, ao nível de abatedouro, em Wisconsin

demonstrou que 11% das lesões eram compatíveis com paratuberculose. Outro

levantamento semelhante detectou 18% quando o exame histopatológico foi associado ao

cultivo bacteriológico.

Testes sorológicos de ELISA em bovinos no estado da Flórida indicaram amplo

contato dos animais com o agente sendo estimado em 8,6% de bovinos de corte positivos e

17,1% de bovinos leiteiros.

TRANSMISSÃO

→→-→-Há penetração do Map no epitélio do íleo e cólon→-→-→-fagocitado pelo

macrófago (sobrevive semanas) →-→-→-multiplicação na mucosa→-→-→--resposta

granulomatosa íleo-cecal→-→-→-lesão intestinal (espessamento) →-→-→-proliferação de

massas epiteliais na mucosa e submucosa→-→-→-diarréia intermitente→-→-→-caquexia


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(edema ventral, intermandibular) →-→-→-morte (não há tubérculo não há necrose).\ou →-

→-→-epitélio intacto (gânglios mesentéricos s/alter.).

→-→-→-macrófagos para o fígado? o baço? o útero? o úbere? os órgãos reprodutores?

Pode ser transmitida pela ingestão de água e alimentos contaminados por fezes de

animais infectados os quais podem excretar o agente 15 a 18 meses antes de apresentar

sinais clínicos. O agente pode estar presente no sêmen e prepúcio de touros contaminados

podendo ocorrer infecção por esta via.

A taxa de infecção fetal pelo Map em vacas com sinais clínicos da doença varia

muito, mas ela está entre 37% e de 8,6% em vacas sem sinais clínicos. O microrganismo

pode ser cultivado do leite de vacas com sinais clínicos

INFECÇÃO

A infecção ocorre pela transmissão oral-fecal, principalmente da vaca para a usa

descendência, durante os primeiros dias de vida.

Outras formas de transmissão são registradas especialmente a intra-uterina, pelo

alimento, pela água e pelo sêmen. Grande parte dos animais infectados mostra sinais

clínicos após um período de 3-4 anos da infecção. Porem antes desse período pode estar

eliminando o agente, através das fezes (disseminadores) aos seus susceptíveis.

Os animais jovens são mais susceptíveis à infecção do que os adultos, entretanto

dose mais alta mesmo os animais adultos podem tornar-se infectados. A infecção ocorre

seguindo a ingestão do leite, água e alimento contaminado pelo agente. A infecção pode

ocorrer via intra-uterina particularmente, durante a última fase da infecção quando a

bactéria se dissemina e muitos órgãos são infectados. O terneiro ou terneira nascido de mãe

infectada que se alimenta regularmente de sua mãe tem uma grande chance de infectar-se

porque o agente é secretado pelo leite de animais infectados. No gado leiteiro, onde os

animais são individualmente, manejados com leite integral ou substituto do leite está

associado com rápida disseminação da infecção de um rebanho.


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SUSCETIBILIDADE

Bovinos jovens são mais sensíveis à infecção embora as manifestações clínicas

sejam tardias. Terneiros alimentados com leite de mãe com a doença possuem maior risco

de tornarem-se infectados. Machos são mais suscetíveis, pois a incidência é maior em

touros. A doença manifesta-se, geralmente entre animais de dois a três anos e raramente

com mais de cinco anos.

RESISTÊNCIA

O Map assim como outros membros do gênero possui parede celular rica em

lipídios; é resistente a influencias física, tais como mudanças de pH e temperatura,

(acessibilidade de àgua e nutrientes). Pode sobreviver em solos e fezes, durante 8 meses

mas provavelmente anos. Resiste aos ácidos e bases, permanecendo viáveis nas fezes por

15 semanas a -70ºC. É sensível a luz solar sua sobrevivência é reduzida por contato

constante com fezes e urina no ambiente. Em esterqueiras e pode sobreviver de 98 a 287

dias. Pode sobreviver nos solos e nas fezes por mais de um ano e mais tempo na água. É

destruído pelo aquecimento moderado, por 5% de formol e lisol.

ETIOPATOGENIA

A infecção ocorre pela ingestão do leite, água e alimento contaminado pelo agente.

A infecção pode ocorrer via intra-uterina particularmente, durante a última fase da doença

quando a bactéria se dissemina, atingindo múltiplos órgãos.

Bezerros nascidos de mães infectadas que se alimentam regularmente de sua mãe

têm uma grande chance de infectar-se porque o agente é secretado pelo leite de animais

infectados. No gado leiteiro, onde os animais são individualmente, manejados com leite

integral está associado com rápida difusão da infecção num rebanho.

A paratuberculose progride e se difunde lentamente, podendo levar anos até que o

rebanho seja reconhecido como infectado. A percentagem media de animais infectados é de

38-42% por rebanho. Rebanhos com boas práticas de manejo podem ter uma prevalência de


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infecção menor enquanto que aqueles com pior manejo têm uma taxa de infecção maior.

Ocasionalmente podem ser detectados rebanhos em que todos os animais estão infectados

pelo Map.

As perdas anuais com mortes dentro de um rebanho variam de 3-10% dos animais

adultos. O período de incubação pode variar de 6 meses a 15 anos. Entretanto a maioria dos

casos ocorre entre três a cinco anos de idade. A doença em animais jovens é rara, ocorrendo

em propriedades com alta taxa de infecção, associada ao manejo deficiente. A doença

clínica tem sido observada em animais, variando de 4 meses a 15 anos. A doença clínica é o

estágio terminal de uma infecção subclínica crônica, podendo ser precipitada por fatores

estressantes. O parto, a desnutrição, a grande produção leiteira, as infecções parasitárias, as

deficiências minerais e a permanência em ambientes baixos e úmidos têm sido

incriminados como fatores precipitantes.

O primeiro sinal clínico observado é a falha na terapêutica contra a diarréia crônica

e persistente. Há períodos de remissão que podem levar semana e meses. A diarréia,

geralmente ocorre durante a prenhez, retornando mais severa, após o parto. Associado à

diarréia, há uma fraqueza generalizada, pelo sem brilho, perda de peso. O pelo pode ficar

descolorido, especialmente em raças leiteiras inglesas ou animais de pelagem vermelha.

Essa mudança de coloração representa o esforço compensatório dos precursores da

vitamina A (carotenos) para outras necessidades metabólicas. Há febre intermitente, mas o

apetite permanece bom. No estágio terminal o apetite é suspenso, sendo observadas fezes

diarreicas contendo sangue franco. Há edema ventral, caquexia debilitação e morte.

O curso clínico pode variar de três a seis meses ou mais longo. Alguns animais

parecem recuperar-se, mas os sinais recidivam posteriormente.

Animais com os sinais clínicos tornam o seu reconhecimento mais simples pelo

dono ou tratador, especialmente se a enfermidade já havia sido diagnosticada neste rebanho

e, sinais sutis da enfermidade tais como tosse, pelo sem brilho e diminuição na produção

leiteira, possam ser observadas. Nenhuns dos sinais clínicos mencionados são únicos na DJ,


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havendo, portanto o risco de supervalorização dos sinais clínicos se aplicados de forma não

criteriosa.

Os fatores associados à mudança do estágio assintomático para o estágio

sintomático não são bem conhecidos, mas a idade e a época da infecção estão bem

conhecidas. A dose inicial é influenciada pelo manejo da propriedade; das condições

higiênicas; da prevalência da infecção no rebanho e da presença da forma clinica da

doença. Animais com os sinais clínicos de paratuberculose podem eliminar concentrações

acima de 108 bactérias / g de fezes.

Fatores estressantes, incluindo parto e alta produção leiteira pode resultar num

aumento de incidência da doença clinica logo após o parto, embora os resultados de

infecções experimentais não confirmem este ponto de vista. Há sugestões sobre a

concentração de ferro e vitamina D da dieta poderia modular o curso da doença, mas os

estudos experimentais são contraditórios. Estudo experimental comparativo entre a

vitamina D e o hormônio do crescimento e prolactina parece influenciar a ingestão pelos

macrofagos bovinos e subseqüentemente a destruição da bactéria mais pronunciadamente.

É comum nas regiões temperadas e climas úmidos, existindo evidências que

bovinos mantidos em solos alcalinos são menos suscetíveis a DJ.

A maioria dos animais com exposição moderada ao Map torna-se infectados, mas

com imunidade protetora e, poucos, desenvolvem a doença (1 de cada 20 infectados). A

resposta protetora está relacionada com a resposta imune mediada por células (imunidade

celular).

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

O diagnóstico diferencial inclui peritonite crônica, fasciolose, abscesso de fígado,

infecções parasitárias, disenteria de inverno, pielonefrite e salmonelose crônica. A DJ nos

outros ruminantes é mais conhecida pelo quadro de caquexia e cronicidade do que aqueles

acompanhados de diarréia e, por isso, o diagnóstico clinico sozinho é difícil.


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Nos caprinos e ovinos, geralmente não há diarréia ou ela é limitada a fezes

peletizadas amolecidas. Perda de peso crônica e enfraquecimento generalizado podem ser

os únicos sinais clínicos nesses animais. O curso da doença clínica pode progredir mais

rapidamente nos caprinos e ovinos. A paratuberculose de ovinos e caprinos deve

diferenciada de enfermidades que cursem com perda de estado corporal.

SINAIS CLÍNICOS

A enfermidade é caracterizada por alterações intestinais graves, envolvendo o

intestino delgado (jejuno, íleo), o ceco, os vasos linfáticos (intestinais e mesentéricos) e

linfonodos (ilíacos e mesentéricos). O processo inflamatório causa uma enterite crônica e

granulomatosa que por sua vez provoca a síndroma de má absorção nos doentes e que e

traduzido clinicamente, pela perda de peso acentuada, enfraquecimento geral progressivo,

diarréia intermitente, desidratação e queda brusca na produção leiteira. O curso clinico da

paratuberculose tem poucos meses de duração, culminando com diarréia severa, debilidade

geral, edema ventral, caquexia e morte.

A paratuberculose é mais comum no gado leiteiro, em ovinos e caprinos. Tem sido

relatado em animais silvestres criados livremente, podendo tornar-se um problema

importante para a criação de animais silvestres ou para os animais de zoológicos,

particularmente quando diversas espécies são criadas no mesmo ambiente. A

paratuberculose pode ser um problema importante em fazendas de criação de veados e alces

assim como nos camelídeos tais como lhamas e alpacas. Infecções esporádicas em suínos,

eqüinos, preás, primatas e no homem.

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O cultivo do Map em amostras de tecido é o método mais seguro para a detecção de

animais com DJ. O procedimento é demorado, requerendo entre 8-16ª semanas de

incubação em meios especiais (Herrold egg yolk agar com e sem micobactina) para cultivo


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do agente. O uso de BACTEC 12B, contendo nutrientes diversos e, em especial um

radioisótopo ligado a uma fonte nutriente (14

CO2- palmitato) encurtou o resultado, quando

positivo, em 3-4 semanas.

O diagnóstico da doença de Johne é prejudicado pelo crescimento lento do Map e

pela resposta imune complexa que é montada pelo hospedeiro frente ao agente.

O hospedeiro monta uma resposta celular, durante o inicio da fase subclínica,

caracterizada por uma forte reação de hipersensibilidade retardada do tipo IV com

proliferação de linfócitos aos antígenos do agente e produção de linfocinas estimuladas por

linfócitos T sensibilizados. Com a progressão da enfermidade, há uma diminuição da

resposta imune celular, predominando uma resposta humoral forte. A presença de anticorpo

não protege o hospedeiro contra a doença. Durante o estágio final da doença, há perda de

resposta celular especifica, permitindo a rápida disseminação da infecção no hospedeiro.

A confirmação do diagnostico clinico da doença de Johne em bovinos é o

isolamento ou pode ser realizada através do teste imunoenzimático (ELISA), utilizando a

amostra absorvida. O teste é rápido, possui acurácia e é barato. Um teste positivo é

invariavelmente correto. Entretanto 15% dos bovinos com sinais clínicos da doença não são

positivos na prova.

O teste de imunodifusão (AGIDT) é menos sensível e o teste de fixação do

complemento (FC) menos específico.

O exame bacterioscópico com coloração de esfregaços de amostras pelo Ziehl-

Neelsen é outra técnica rápida para diagnostico confirmação do diagnóstico clinico. Esta

técnica requer um pouco mais de experiência sendo menos sensível e específica do que o

teste de ELISA.

A sonda de DNA para o agente está disponível comercialmente, mas mesmo mais

rápida e com especificidade semelhante ao cultivo fecal ela é menos sensível e de maior

custo.


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Bovinos com sinais clínicos de doença; de Johne possuem marcado espessamento

do íleo. O Exame histopatológico, utilizando a coloração AAR do íleo e linfonodos

mesentéricos é definitivo no diagnostico da doença de Johne. O diagnostico nos estágio

preclinico da infecção é um desafio por causa do período entre a infecção e a eliminação do

agente pelas fezes ou resposta sorológica.

O isolamento através do cultivo em amostras fecais é o mais amplamente utilizado,

mas tem suas desvantagens por ser caro e muito lento na sua resposta, pois pode necessitar

de até 16 semanas para finalizar o seu resultado.

A sorologia pela ELISA absorvido é mais rápido mais barato, mas menos sensível

que o cultivo fecal.

Detecção de rebanhos infectados assim com animais individualmente é a forma de

controle mais importante no controle de difusão da doença entre rebanhos. O teste de

ELISA absorvido possui sensibilidade melhor ao nível de rebanho.

O diagnóstico da paratuberculose subclínica apresenta muitos problemas,

especialmente no controle da enfermidade. Ensaios imunológicos tais como: ELISA,

AGIDT e FC, todos, detectando anticorpos sorológicos para o Map. Entretanto, a maioria

dos animais infectados não produz anticorpos mensuráveis até atingirem o estágio final da

doença; estes testes são ineficazes na detecção da infecção subclínica dos animais,

conforme Colgrove e colaboradores, em 1989.

O principal problema é a variedade de antígenos utilizados no desenvolvimento

desses testes, tornando a comparação entre laboratórios dificil subclinica especialmente em

conjunto com o cultivo fecal. A sensibilidade desses testes varia entre 15-57% para animais

subclinicamente infectados eliminado pequena carga organismos atraves das fezes; ela está

em torno de 88% para bovinos com a forma clinica da doenca e eliminando uma grande

quantidade de agente pelas fezes A especificidade desses kits comerciais está em torno de

99% ou mais.


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A preabsorção do soro com o M. phlei, aumenta a especificidade do ELISA. A

incorporação de antígenos mais específicos tem resultado no aumento de sensibilidade de

detecção e concomitantemente diminuição na especificidade. O CF é o teste mais utilizado

na importação e exportação de bovinos, entretanto possui baixa sensibilidade para a sua

utilização ou propósito. Sua especificidade é menor que o IDGA e ELISA.

Diversos testes de ELISA estão disponíveis comercialmente para diagnóstico desta

enfermidade. Esse teste detecta aproximadamente 60% dos animais que excretam o agente

através das fezes. A especificidade é de 99%. Comparado com outros testes para detecção

de animais infectados subclinicamente é o teste comercial mais confiável sendo melhor

que o padrão de fixação de complemento e o tempo necessário para se efetuar o teste é de 2

horas.

A resposta celular forte, na fase preclínica permitiu o desenvolvimento de um teste

que mede a liberação de interferon gama (IFN)- quando estimuladas por antígenos de

micobactérias. A vantagem do teste é poder detectar um número maior de animais

subclinicamente infectados no rebanho, permitindo a implantação rápida das medidas

sanitárias eficazes tais como manejo, segregação ou eliminação.

Outros métodos para detecção da infecção têm sido recentemente desenvolvidos

utilizando sondas de ácidos nucléicos combinados com a reação da polimerase em cadeias,

conhecida como PCR A primeira sonda de ADN para o M. a. paratuberculosis em fezes,

perdeu especificidade, pois também hibridizava com o M. avium. Posteriormente, outra

sonda mais especifica foram desenvolvidas, tendo como base a sequencia parcial de um

elemento de inserção do Map denominado IS900. Estudos comparativos com a sonda de

ADN e três diferentes procedimentos no isolamento do agente demonstraram que 60% dos

animais com cultivo positivo podiam ser detectados tambem pela sonda de ADN.

Entretanto o teste mesmo com especificidade alta foi incapaz de detectar bovinos infectados

eliminadores de pequeno número de organismos infecciosos. Outra sonda específica na

detecção do Map é o clone F57 que atualmente está sendo utilizado por muitos laboratórios.


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Uma recente modificação do PCR, incluindo duas reações de ampliação, utilizando nested

primers possibilitou o aumento da sensibilidade do teste, possibilitando detectar cerca de 50

organismos/g de fezes contra 104organismos/g fezes do kit comercial.

TRATAMENTO

Estudos “in vivo” e “in vitro” têm sido realizados nestes últimos 30 anos para

avaliar a eficácia de diferentes drogas administradas sozinhas ou combinadas para controle

da infecção causada pelo Map ou doença de Johne, nos ruminantes. A eficácia do

tratamento pela combinação da rifampicina, pirazinamida e estreptomicina no tratamento

da infecção pelo Map foi previamente avaliada em bezerros experimentalmente infectados.

Essa combinação tem sido aplicada com sucesso para tratamento da tuberculose no homem.

As diferentes ações, isto é, na ação intracelular (rifampicina e pirazinamida) e extracelular

(rifampicina e estreptomicina) resultou em sinergia. Entretanto esses fármacos não

mostraram efeito bloqueador na eliminação fecal das micobactérias noa animais com a

forma clínica natural. Durante a terapia e por um período de tempo posterior ao tratamento

não foram observados organismos alcool-acidos nas amostras coradas pelo ZN. Entretanto

as amostras cultivadas permaneceram positivas para o Map.

IMUNIZAÇÃO/VACINAÇÃO

A vacinação contra a doença de Johne foi primeiramente descrita por Vallee e

Ringjard, na França, em 1926, após observações de que a inoculação subcutânea de

amostras vivas e não atenuadas do Map não resultaram em infecção.

Desde então, um número significativo de vacinas e bacterinas, utilizando cepas

tanto atenuadas e não atenuadas tem sido utilizadas mortas pelo calor e de cepas rompidas a

fragmentos foram avaliadas.

A imunidade da paratuberculose ocorre em algum estagio após a hipersensibilidade

e, aparece desenvolver de maneira semelhante a outras infecções por micobactérias. As


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vacinas que provocam uma apreciável hipersensibilidade tanto com organismos mortos ou

vivos e resíduos extraídos pelo metanol são efetivas agentes imunizantes enquanto que os

resíduos extraídos pelo álcool e frações protoplasmáticas causam pouco ou nenhuma

hipersensibilidade e não funcionam como vacinas efetivas.

A vacinação, geralmente reduz o número de animais com a enfermidade clinica,

diminuindo o número de animais eliminadores, atraves das fezes e reduzindo o número de

animais com infecções intestinais detectáveis. A vacinação não confere imunidade absoluta.

Os animais vacinados podem desenvolver a doença e/ou eliminar o agente. A vacina pode

proteger o animal da doença clinica ou apenas retardar o seu aparecimento. Esse atraso no

aparecimento pode ser vantajoso, postergando a doença para alem do período produtivo.

Animais vacinados respondem positivamente aos testes diagnósticos e, desse modo, só

podem ser detectados, através do cultivo das fezes. Os vacinados não devem ser

considerados como livres de paratuberculose. O manejo e medidas de controle são

indispensáveis para a obtenção de benefícios máximos.

A desvantagem da vacinação é o desenvolvimento no local de inoculação de um

processo inflamatório e desenvolvimento posterior de nódulo fibrocaseoso, geralmente com

32 a 42 mm de diâmetro. Esses nódulos podem tornar-se muito grandes (250 X 127 mm)

particularmente com a revacinação.

A vacinação com agente vivo provoca a recuperação de microrganismos viáveis no

nódulo de inoculação mesmo após 6 anos de inoculação. Há o desenvolvimento seguido da

imunização de uma forte e persistente sensibilidade a tuberculina aviária e mamífera,

segundo imuneros autores. As vacinas contra paratuberculose aumentaram em cerca de 8

vezes a sensibilidade à tuberculina. Essa sensibilização cruzada interfere com os programas

de erradicação à tuberculose. Animais tuberculosos podem ser diferenciados dos vacinados

pelo teste cervical comparativo.

A vacinação com cepa viva do Map tem sido utilizada na Europa enquanto que nos

EU ela é fundamentalmente uma bacterina preparada com a cepa 18 (conhecida agora como


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M. avium) morta pelo calor e suspensa em óleo mineral. Embora ambas sejam capazes de

estimular a imunidade celular e humoral, segundo os ensaios diagnósticos, elas não são

capazes de produzir niveis bons de proteção.

A vacina é indicada para controlar a doença em rebanhos endemicamente infectados

e não está indicada como medida profilática em rebanhos livres da doença. Distribuição e

uso estão limitados aos veterinários, especialmente treinados pelos perigos e possíveis

efeitos irreversíveis da inoculação acidental no homem. A vacina deve ser inoculada

subcutaneamente na região do peito e, administrada entre 1-35 dias de idade, onde há

formação posterior de um nódulo. A imunidade dura aproximadamente 18 meses. A

revacinação não é recomendada. Vários estudos têm demonstrado uma queda na resistência

após a revacinação. Estudos efetuados com a bacterina e conduzidos em alguns desses

rebanhos demostraram que houve redução em 90% dos casos clinicos e redução em 50% no

número de animais infectados. Entretanto, esses resultados devem ser interpretados com o

conhecimento das necessidades da propriedade necessário para qualificar a vacinação.

As propriedades devem instituir praticas de manejo consistente com aquelas

recomendadas para controle e erradicação dessa doença como parte no programa de

vacinação. Essa pratica de manejo se propriamente instituídas podem efetivamente

controlar a doença. A bacterina, em essência é usada como incentivo para donos de

rebanhos para instituir programas de manejo. Ela é portando difícil de determinar se efeito

benéfico da vacinação com o resultado da bacterina ou as práticas de manejo visto que o

manejo sozinho pode produzir resultados semelhantes.

CONTROLE E PREVENÇÃO

Atualmente, não há qualquer sinalização dos órgãos federais na criação de um

Programa Nacional de Controle da Paratuberculose. A cada ano acumulam-se casos

clínicos bem documentados em bovinos e bubalinos leiteiros, alguns deles, com isolamento

do agente, caracterização molecular e exames anatomopatológicos sólidos. Precisamos com


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urgência de laboratórios com experiência e pessoal nessa área e os raros conhecidos estão

em Minas Gerais, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. Há uma grande carência de

laboratórios próximos as bacias leiteiras (novas ou em expansão) como Amazonas, Pará,

Pernambuco, Bahia, Goiás, São Paulo, Paraná etc. Infelizmente, não vislumbramos

mudanças num curto, médio e no longo prazo.

A paratuberculose possui difícil controle, especialmente pelo longo período de

incubação, ausência de sinais clínicos nos estágios iniciais da enfermidade, durante o qual

os animais podem ser disseminadores, através das fezes sem apresentar sinais clínicos;

testes diagnósticos com baixa sensibilidade (ELISA adsorvido e cultivo em HEY);

tratamento da amostra com HPC (fezes, tecido, leite); uso de micobactina como fator de

crescimento e uma variedade de metodologias.

É fundamental conhecer e estimar a prevalência da doença tanto do rebanho quanto

individual, especialmente na tomada de decisão se uma doença infecciosa é importante ou

não e quais as medidas aplicáveis. Assim podemos pensar e aplicar medidas de erradicação

em áreas de baixa prevalência; medidas de controle em áreas de alta prevalência e

monitoramento em áreas onde não há histórico da enfermidade.

As estimativas de prevalência são necessárias quando modelam e simulam a difusão

da doença. Entretanto as estimativas obtidas são influenciadas pela acurácia dos testes

diagnósticos aplicados e pela comparação entre estudos que precisam ser ajustados para

melhor estimar a prevalência verdadeira.

No estudo epidemiológico da paratuberculose no Brasil há passos que poderíamos

economizar muito trabalho, muito tempo e muitos recursos econômicos. O esquema é

simplificado, mas importante:

1-Detectar os rebanhos-leiteiro alvo (>3anos) suspeito (bovino, bubalino, ovino,

caprino, silvestres etc) com um teste de Elisa adsorvido como teste de triagem

(probabilidades)


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2-Associar a pesquisa dos sinais clínicos, histórico do rebanho compatível com a DJ

não excluindo doenças concomitantes (fasciolose, salmonelose, perotonite, tuberculose etc)

3-Isolar, identificar, caracterizar, e guardar o Map (tecidos, fezes, leite, lácteos) de

animais reagentes na triagem.

4-Aplicar medidas higiênicas no rebanho positivo (parto, instalações, ordenha)

5- Mudar manejo dos rebanhos positivos (mãe-filho, colostro, alimento, água)

6- Medidas de qualificação da produção do leite.

7-Teste-abate nos rebanhos (identificar / classificar positivos, abater os mais

infectados; classificação de rebanhos como negativos e positivos)

8-Programa de ressarcimento pelos animais doentes ou sorologicamente positivos

9-Registrar dados e monitorar o rebanho (Elisa) todos os anos

10-Prepara-se para o futuro (γ-ITF, vacinas)

Precisaríamos que os casos suspeitos fossem comunicados às autoridades sanitárias oficiais

que imediatamente isolaria o animal suspeito e se confirmado, seria eliminado à custa do

recurso público. Os animais importados deveriam ser provenientes de rebanho livres de

Map com controle emitido pelo governo federal do país que exporta, evitando assim a

entrada de animais infectados/doentes e protegendo nossas populações animais.

O agente persiste sem multiplicação nas pastagens por longos períodos e estas

pastagens são infectantes por mais de um ano.

Medidas de controle da doença no rebanho podem ser tomadas para reduzir ou

eliminar a exposição de terneiros que são os mais sensíveis ao agente. Animais suspeitos

devem ser isolados e o diagnóstico feito através de exames bacteriológicos das fezes. Casos

confirmados precisam ser abatidos imediatamente. Quando possível, os terneiros devem ser

separados imediatamente das mães após o nascimento e postos em áreas livres de

paratuberculose. Colostro e leite devem ser de origem conhecida e de preferencia usar

substitutivos de leite sempre que possível. Alimentação e água devem ser higiênicas livres


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de contaminações fecais. As pastagens destes animais devem ser diferentes das dos animais

adultos.

ÉTICA

Proprietários de rebanhos infectados, assim como clínicos veterinários e autoridades

oficiais devem estar atentos ao processo de responsabilidade na venda de um rebanho ou

animal infectado. As vendas de animais são disciplinadas pelas mesmas leis de garantia

legal que regem outros bens no comércio e, desse modo, a responsabilidade civil tem base

na lei de fraude, negligência ou no contrato de garantia. Fazendeiros podem ser

responsabilizados não somente pelo valor particular de um animal, mas também por todas

as avarias que tiveram conseqüências ao comprador e subsequente compradores.

A venda de um animal conhecido como infectado pelo Map constitui a falsa

interpretação de um produto e o vendedor responsável por danos, tendo como base a lei de

fraude. O proprietário que vende um animal aparentemente saudável de um rebanho

conhecido como infectado pelo Map pode ser responsabilizado tendo como base a

negligência. Os animais de uma propriedade infectada foram todos expostos à doença e

como tal, podem estar infectado. Se um animal aparentemente saudável, mas não exposto é

encontrado infectado depois, a responsabilidade pelos danos podem advir na falha do

vendedor em cuidar na prevenção de alterações a outro, isto é negligencia. Mesmo a venda

de um animal infectado de um rebanho na qual não se conheça paratuberculose pode

sujeitar o fazendeiro ao direito baseado na implicação de garantia.

Produtos podem ser vendidos sobre uma cobertura do código comercial que

estabelece que produtos sejam indicados para os seus propósitos. Uma vez que a

paratuberculose subclínica e portadores assintomáticos do Map não podem ser detectados, a

venda de um animal, após a inspeção por outro não limita a responsabilidade do vendedor.

Assim, mesmo um fazendeiro, sem saber, vende um animal infectado, pode ser

responsabilizado por lesão baseada na garantia expandida.


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PERSPECTIVAS

Há pouca dúvida que a paratuberculose seja um problema importante no Brasil

assim como em outros países. Muito esforço é travado na tentativa de deter a doença e

progressos têm sido alcançados.

No Brasil, não há um programa de controle oficial. Rara propriedade tem mostrado

algum interesse o controle, mas ele é absolutamente voluntário e limitado a um pequeno

número de rebanho; que na sua abrangência é essencialmente ineficaz no controle desta

enfermidade. Temos uma tendência a pensar que a doença de Johne é uma doença de

bovinos, ignorando outras categorias animais.

Doença de Johne não é uma doença limitada a bovinos; ela causa problemas em

bubalinos, ovinos, caprinos, animais silvestre, exóticos e ainda risco a Saúde Pública. A

pecuária é o principal foco de atenção porque ela é a principal atividade pecuária e, além

disso, a maioria do conhecimento está baseada nesta espécie, por que o manejo é de fácil

controle e modificação ou porque a industria tem interesse.

Existe uma imensa carência com relação aos estudos nacionais sobre a

paratuberculose, envolvendo o ambiente, o agente e os diferentes hospedeiros. A

paratuberculose bovina nos bovinos leiteiros é mais outro desafio sanitário brasileiro.

Atualmente, no Brasil, não há nenhum estudo sólido sobre essa enfermidade em outros

ruminantes domésticos (ovinos e caprinos) ou silvestres, alem de muitas outras espécies

susceptíveis à infecção causada pelo Map. Existe uma gama de novas e grandes

oportunidades, abrangendo o ensino a pesquisa e a extensão sobre doença de Johne, no

Brasil.

SAÚDE PÚBLICA / ZOONOSE

Há um ponto de interrogação sobre uma possível ligação entre o Map e a doença de

Crohn no homem. A literatura disponível sobre o papel do Map na etiologia da Doença de


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Crohn (DC) é rica, numerosa e contraditória. DC é uma íleo-colite granulomatosa crônica

do homem sugerindo que o Map estivesse incriminado como etiologia e o agente foi

isolado em alguns casos.

Em 1901, Thomas K. Dalziel, um cirurgião escocês trabalhando em Glasgow

operou um colega com inflamação crônica do intestino. Ele estava familiarizado com a

recente descrição de doença de Johne e, da subsequente pesquisa pelo agente bacteriano

envolvido. Ele reuniu outros casos e publicou suas observações com o nome de “Enterite

Intersticial Crônica, no British Medical Journal, em 1913. Ele descreveu que o aspecto

histológico da DC era tão semelhante à Doença de Johne que justificou a proposição que a

doença poderia ser a mesma. O dilema de Dalziel fora que não foi possível a visualização

de micobactérias AAR no intestino de pessoas com a doença (citado em Hermon-Taylor et

al., 1998). Desde lá, o Map tem sido relacionado com a DC, tendo como base, as

semelhanças entre essas duas enfermidades.

O Map tem sido implicado como envolvido na patogenia da DC e, alguns

pesquisadores consideram a paratuberculose como uma zoonose potencial.

Os alimentos como leite, lácteos e possivelmente a carne podem tornar-se fontes de

infecção e, desse modo, a doença tem ganhado atenção sob o ponto de vista de segurança

alimentar. A Food Standards Agency reviu as evidências ligando Map à doença de Crohn

(Rubery 2001). O Comitê Científico da União Européia também examinou as evidências,

ligando o Map e a doença de Crohn, publicando o seu parecer em Março de 2000. Esses 2

estudos concluíram que nenhuma ligação conclusiva foi ainda estabelecida. O recente

resultado da pesquisa publicada por pesquisadores do “St George's Hospital Medical

School” (Bull et al. 2003), investigou a incidência do Map, em 37 pacientes com

diagnóstico de doença de Crohn e 34 pacientes diagnosticados como não portadores de

doença inflamatória intestinal. Eles concluíram que a taxa de detecção do Map em

indivíduos com doença de Crohn é bastante significativo o que implica esse agente

intestinal patogênico à causa da doença. O potencial de risco tem que ser considerado, em


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particular à luz da nova atitude para com as zoonoses causadas pelos alimentos na era pós-

BSE. Os relatórios da “Food Standards Agency” e o da União Européia indicaram a

necessidade de realizar a vigilância para o Map. A FSA estabeleceu um programa de

vigilância com o propósito de determinar os níveis de Map no leite cru e também para

determinar se o Mapa sobrevive aos tratamentos térmicos atualmente empregados em

fábricas de laticínios de pasteurização de leite líquido. Este trabalho concluiu que é viável o

Map ser isolado ocasionalmente no leite de vaca pasteurizado e comercializado no RU. Há

um número de opções possíveis para o controle de Map quando pasteurização. Uma opção

é alterar o tempo / temperatura utilizada na pasteurização, incluindo o ponto de inativação

da peroxidase. Isto resultaria na destruição de algumas propriedades funcionais do leite. A

separação dos grumos formados pelos Map antes do processo de pasteurização pode ser

uma opção importante já que a o processo de aderência uns aos outros confere proteção

térmica. No entanto, a força de cisalhamento e a velocidade de reagregação, se houver, são

desconhecidas.

A literatura sobre o envolvimento do Map na etiologia da DC é contraditória. O uso

de sondas genéticas e a técnica da PCR aplicadas em vários estudos têm indicado a

presença de micobactérias e, entre elas, a presença do Map. Entretanto outros estudos não

foram capazes de confirmarem esses resultados. Dados conflitantes têm sido publicados,

utilizando técnicas sorológicas. O isolamento do Map em amostras de tecidos lesionados de

pacientes com DC provou ser extremamente difícil, especialmente pela baixa freqüência ou

pela presença de formas bacterianas alteradas ou esferoblastos. O envolvimento etiológico

do Map na DC tem sido extensivamente revisado por vários autores nas ultimas décadas e,

essas revisões refletem que uma resposta definitiva ainda não há.


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