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GenéticaProf.Doutor José Cabeda

Genética Molecular em Análises Clinicas

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOSDE ÁCIDOS NUCLEICOS

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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA

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PCR

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OPTIMIZAÇÃO DO PCR

[MgCl[MgCl22]]

ThTh [dNTP][dNTP] [primers][primers] [DNA][DNA] [inibidores][inibidores]

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Variações

RT-PCRRT-PCR Multiplex PCRMultiplex PCR Nested PCRNested PCR

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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA

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Principio de funcionamento do Real-Time PCR

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Detecção dos produtos de PCR

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Montar uma reacção

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Químicas Utilizáveis

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SYBR-Green I

5’3’

5’ 3’

SGExcitation

SG

SG

SG

SG

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SYBR-Green I

5’3’

5’ 3’

SG

SG

SG

SG

SG

Excitation Emission

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Detcção com SybGreen

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Sybr-Green Detection

Intercalates to dsDNAIntercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification Inhibits DNA amplification

so concentration is criticalso concentration is critical Detects specific and non-Detects specific and non-

specific targetsspecific targets Low starting background Low starting background

with large increase in with large increase in signalsignal

Can run a melt curve to Can run a melt curve to look at product specificitylook at product specificity

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Detecção com sondas

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Quimicas utilizáveis:sondas taqman

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R Q

Sequence specific probes: Dual labeled probes

5’3’5’ 3’

5’3’

5’ 3’

Excitation RQQR QR

Excitation

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Quimicas utilizáveis:molecular beacons

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Molecular Beacons I

10mer

25mer

FAM DabCyl

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Molecular Beacons II

R QExcitation

R

Q

QR Emission

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Molecular Beacons II

R QExcitation

R

Q

QR Emission

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Can be used to quantitation and Can be used to quantitation and mutation detectionmutation detection

Need beacons for the normal and Need beacons for the normal and mutation sequencemutation sequence

Design is difficult due to nature of Design is difficult due to nature of folding structurefolding structure

Expensive when compared to FRETExpensive when compared to FRET

Molecular Beacons III

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Quimicas utilizáveis:sondas FRET

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Hyb-ProbesTM

Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher

Excitation Emission

Transfer

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Quenched FRET analysis

Two labeled probes, FAM at the 5’ and Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’BH1 on the 3’

When the probes hybridize the FAM When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1energy is quenched by the BH1

After the product is amplified run a melt After the product is amplified run a melt curve to determine genotypecurve to determine genotype

Different melt points are seen for normal Different melt points are seen for normal and mutationand mutation

5’ 3’

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Quimicas utilizáveis:sondas Eclipse

F

Q

F F

MGB

Q

F

MGB

Q Q

F

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Aplicações

QuantificaçãoQuantificação

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End Point versus Real-Time

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Quantificação

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Aplicações

Detecção de Mutações / SNPDetecção de Mutações / SNP

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Detecção de mutações

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Aplicações

Multiplex DetectionMultiplex Detection

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Detecção simultânea de vários produtos

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Os equipamentos

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Light Cycler

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Smartcycler

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Rotorgene

The samples spin continually during The samples spin continually during a run at 500 rpma run at 500 rpm

The samples are heated and cooled The samples are heated and cooled in a low mass air ovenin a low mass air oven

Tubes are illuminated as they pass Tubes are illuminated as they pass the detectorthe detector

On data acquisition energy is On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each samplethe fluorescence of each sample

Four ChannelsFour Channels• Ch1: ex 470nm, det 510nm• Ch2: ex 530nm, det 550nm• Ch3: ex 585nm, det 610nm• Ch4: ex 625nm, det 660nm

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O Futuro próximo

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Detecção com sondas

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Detcção com SybGreen

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Quantificação

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Detecção de mutações

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Detecção simultânea de dois produtos

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Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

PCRPCR Real Time PCRReal Time PCR NASBA/TMANASBA/TMA

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NASBA/NUCLISENS

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Amplification: schematic diagram

Primer 1

Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 2

Reverse Transcriptase

T7 RNA polymerasePrimer 2

Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase

RNase HPrimer 1

• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA

Legend:

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Técnicas de amplificação de Sinal

bDNA (Quantiplex)bDNA (Quantiplex)

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bDNA (I)

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bDNA (II)

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bDNA (III)

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bDNA (IV)

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bDNA (V)


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