GME - Protocolos Laboratoriais - 2015-2016

Genética Molecular Experimental - Opção

4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 1

GENÉTICA MOLECULAR

EXPERIMENTAL

PROTOCOLOS LABORATORIAIS


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 2

EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO – SANGUE TOTAL

Citogene Blood Kit

Deitar 250 µL de sangue total para microtubo de 1,5 mL

Adicionar 750 µL de RBC Lysis Solution

Inverter para homogeneizar e incubar 10’ à temperatura ambiente

Centrifugar durante 5’ a 12.000xg

Remover o sobrenadante deixando o pellet e cerca de 100-200 µL de líquido residual

Agitar vigorosamente o tubo para ressuspender o pellet de células no líquido residual

Adicionar 250 µL de Cell Lysis Solution e homogeneizar por pipetagem

Adicionar 5 µL de Proteinase K (20 mg/mL)

Incubar durante 30’ a 65°C

Adicionar 5 µL de RNase A Solution, misturar por inversão 25x e incubar a 37°C durante

1 hora (passo opcional)

Adicionar 85 µL de Protein Precipitation Solution ao lisado celular

Agitar no vortex durante 20’’ para homogeneizar completamente

Centrifugar durante 5’ a 12.000xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se

acastanhado e consistente

Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 mL contendo 250 µL de Isopropanol

Misturar até que se forme o precipitado de DNA


Rejeitar o sobrenadante e adicionar 1 mL de Etanol 70%

Inverter várias vezes para lavar o pellet


Desprezar o sobrenadante e secar o pellet ao ar durante 10-15’

Adicionar 100 µL de DNA Hydration Solution

Incubar durante 1 hora a 65°C para dissolver completamente o DNA (passo opcional)

Conservar a amostra a 4°C


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 3

EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO – ESFREGAÇO BUCAL

Citogene Buccal Kit

Esfregar 10 vezes a mucosa bucal com 1 escova (5 escovas)

Mergulhar as escovas 10 vezes em 300 µL (650 µL) de Cell Lysis Solution num

microtubo de 1,5 mL

Ter o cuidado de escorrer bem a(s) escova(s) para não perder líquido

Incubar durante 15’ a 65°C

Arrefecer a amostra

Adicionar 100 µL (200 µL) de Protein Precipitation Solution ao lisado celular

Agitar no vortex durante 20’’ para homogeneizar completamente

Colocar a amostra em gelo durante 5’

Centrifugar durante 5’ a 12.000xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se

consistente

Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 mL e adicionar 450 µL (600 µL) de

Isopropanol e 0,5 µL (1 µL) de Glicogénio (opcional)

Misturar a amostra cuidadosamente 50 vezes e manter o tubo à temperatura ambiente

durante pelo menos 5’


Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado ao ar durante 10-15’

Adicionar 50 µL (100 µL) de DNA Hydration Solution


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 4

QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA

A partir da solução de DNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H2O.

Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H2O.

Calcular a concentração de DNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula:

Concentração de DNA (g / mL) A260 x FD x 50

Avaliar a qualidade da solução de DNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A260/A280

A280 Absorvência em 280 nm


FD Factor de diluição

50 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de DNA com a concentração de

50 g/mL

A260 / A280 1,8 – 2,0

Controlo da integridade do DNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 mL)

Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 mL

Adicionar 50 mL de TBE 1X

Fundir a agarose no micro-ondas

Deixar arrefecer até 60C

Adicionar brometo de etídio para concentração final de 0,5 g/mL

Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços

Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X

Aplicar a mistura da solução de DNA com tampão de deposição (10 L + 5 L,

respectivamente) em paralelo com um marcador de MM ( DNA x HindIII)

Migrar a 80 - 100V durante 1 h

Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 5

Reagentes

Agarose SeKeam LE e NuSieve GTG

Tampão TBE 10X

Tris-HCl 89 mM

Ácido bórico 89 mM

EDTA 2 mM

Solução de brometo de etídio 10 mg/mL

Solução de deposição das amostras

50% sacarose

0,1% Azul de bromofenol

0,1% Xileno cianol

50 mM EDTA pH 8,0

Marcadores de massas moleculares (0,5 g/L)

Fago digerido com HindIII

AVISO IMPORTANTE

MANUSEAMENTO DE BROMETO DE ETÍDIO

O brometo de etídio é um poderoso mutagéneo e é moderadamente tóxico. Como tal, deve

ser manipulado usando luvas

A solução de brometo de etídio será fornecida pelo professor

Os lixos (pontas de pipetas automáticas, gel) são colocados em recipiente apropriado

O brometo de etídio em tampões é destruído com excesso de lixívia ou adsorvido em carvão

activado


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 6

CÁLCULOS

A280 nm A260 nm A260 nm /A280 nm [ ] = ug/mL

Volume amostra inicial uL

Volume final

solução DNA uL

Massa DNA ug

Sangue

Total

Esfregaço

Bucal

Rendimentos teóricos - 16-50 ug DNA / mL sangue e 0,2-2 ug DNA / escova

CONCLUSÕES

Amostra Sangue Total Esfregaço Bucal

Rendimento

Qualidade

Integridade


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 7

ISOLAMENTO DE LINFÓCITOS

Material e Reagentes

10 mL sangue total colhido em tubos com anticoagulante (heparinato de lítio ou EDTA)

Tubos Greiner Leucosep com filtros estéreis de 15 mL

Tubos Nunc de 15 mL

Ficoll-Paque (Pharmacia nº 17-0840-03)

Solução de Hanks (Sigma H-2513)

Protocolo

Encher um tubo Greiner LeucoSep com Ficoll-Paque até ao filtro

Depositar sobre o filtro 2,5 mL de sangue total homogeneizado

Centrifugar a 2.700 rpm / 20’ / 25C (não usar travão nesta centrifugação)

Retirar o anel de linfócitos com auxílio de pipeta com ponta estéril para tubo Nunc de 15 mL

Centrifugar a 4.000 rpm / 10’ / 25C

Retirar o sobrenadante com auxílio de pipeta com ponta estéril

Ressuspender o precipitado de linfócitos em 500 µL de Solução de Hanks e transferir para

microtubo de 1,5 mL

Repetir esta operação

Centrifugar 20’’ a 12.000 rpm e retirar o sobrenadante

Após este passo manter o precipitado de linfócitos em gelo

Extracção de RNA total

Usar todo o precipitado de linfócitos


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 8

ISOLAMENTO DE LEUCÓCITOS

Material e Reagentes

10 mL sangue total colhido em tubos com anticoagulante (EDTA ou heparinato de lítio)

Tubos Nunc de 50 mL

RBC Lysis Solution (Citogene Blood kit)

Solução de Hanks (Sigma H-2513)

Protocolo

Deitar 2,5 mL de sangue total num tubo Nunc de 50 mL

Adicionar 15 mL de RBC Lysis Solution

Incubar durante 15’ à temperatura ambiente

Centrifugar 10’ a 4.000 rpm e retirar o sobrenadante

Ressuspender o precipitado de leucócitos em 1000 µL de Solução de Hanks e transferir para

microtubo de 1,5 mL

Centrifugar 2’ a 12.000 rpm e retirar o sobrenadante

Repetir esta operação

Após este passo manter o precipitado de leucócitos em gelo

Extracção de RNA total

Usar todo o precipitado de leucócitos


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 9

EXTRACÇÃO DE RNA A PARTIR DE CÉLULAS

Isolate RNA Mini Kit

BIOLINE

1. Lise das células

Adicionar 450 L de Lysis Buffer R ao precipitado de células e homogeneizar bem por

pipetagem até não serem visíveis agregados de células

Incubar durante 3´ à temperatura ambiente

2. Homogeneização a amostra

Pipetar o lisado para uma Spin Column R1 (azul) previamente colocada num tubo

colector de 2 mL

Centrifugar a 12.000 rpm durante 2’ para a completa homogeneização da amostra. As

membranas e núcleos ficam retidos na coluna. No tubo colector fica o citosol (RNA).

Descartar a coluna e GUARDAR O FILTRADO

3. Retenção do RNA na coluna

Adicionar ao filtrado igual volume de etanol 70% (450 L) e homogeneizar bem por

pipetagem. Nota: não agitar no vortex!

Aplicar o filtrado numa Spin Column R2 (rosa) previamente colocada num tubo colector

de 2 mL. Centrifugar a 12.000 rpm durante 2’ Desprezar o filtrado; o RNA vai ficar retido

na coluna

4. Lavagem da coluna

Pipetar 500 L de Wash Buffer AR para a coluna e centrifugar a 12.000 rpm durante 1’

para lavar o RNA

Transferir a coluna para um novo tubo colector, adicionar 700 L de Wash Buffer BR e

centrifugar a 12.000 rpm durante 1’ para lavar a membrana. Desprezar o filtrado

Transferir a coluna para novo tubo colector e centrifugar novamente a 12.000 rpm durante

mais 2’ para eliminar todos os vestígios de etanol

5. Extracção do RNA

Transferir a coluna para microtubo de 1,5 mL e adicionar 50 L de H2O RNase-free

directamente na membrana. Repousar durante 5 - 10 minutos. Centrifugar a 8.000 rpm

durante 1’ para eluir o RNA

Conservar a amostra a -20°C ou -80°C


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 10

EXTRACÇÃO DE RNA A PARTIR DE CÉLULAS

Trizol

Invitrogen

Adicionar ao precipitado de células 1 mL de TRIZOL

Lisar as células e homogeneizar por pipetagem

Adicionar 200 µL de clorofórmio

Agitar e centrifugar 2’ / 13.000 rpm / 4°C

Separar a fase aquosa (≈ 600 µL) para novo microtubo de 1,5 mL

Adicionar igual volume de isopropanol e agitar

Incubar 15’ / RT

Centrifugar 10’ / 13.000 rpm / 4°C

Retirar o sobrenadante e lavar o precipitado com etanol 75%

Centrifugar novamente e retirar o sobrenadante

Ressuspender o precipitado em 50 µL de H2O RNase-free e quantificar (±100-250ng/µL)


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 11

QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO RNA

A partir da solução de RNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H2O.

Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H2O.

Calcular a concentração de RNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula:

Concentração de RNA (g / mL) A260 x FD x 40

Avaliar a qualidade da solução de RNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A260/A280



FD Factor de diluição

40 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de RNA com a concentração de

40 g/mL

A260 / A280 1,9 – 2,1

Controlo da integridade do RNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 mL)

Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 mL


Fundir a agarose no micro-ondas. Deixar arrefecer até 60C




Aplicar a mistura da solução de RNA com tampão de deposição (10 L + 5 L,

respectivamente) em paralelo com um marcador de MM ( DNA x HindIII)

Migrar a 80 - 100V durante 1 h



4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 12

CÁLCULOS

A280 nm A260 nm A260 nm /A280 nm [ ] = ug/mL

Volume amostra inicial uL

Volume final

solução RNA uL

Massa RNA ug

Linfócitos

(coluna)

Linfócitos

(Trizol)

Rendimentos teóricos - ≈ 25x10

6 células / 5 mL, 10ug RNA / 10

6 células em cultura

0,5 ug / 106 linfócitos

CONCLUSÕES

Amostra Sangue Total

Rendimento

Qualidade

Integridade


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 13

AMPLIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO DNA POR PCR Polymerase Chain Reaction

A. Introdução

Esta técnica permite partir de quantidades mínimas de DNA (da ordem dos 0,2 - 1 g) e, por

amplificação enzimática in vitro, obter mais de 1 milhão de cópias de determinado fragmento

de DNA. Este é delimitado por um par de primers, cada um constituído por 20 nucleótidos e

complementar de cada uma das cadeias a amplificar.

Uma série de ciclos térmicos repetitivos permite a desnaturação do DNA, a ligação dos

primers às cadeias e a sua extensão pela enzima termo-estável Taq DNA polimerase,

originando-se uma acumulação exponencial do fragmento amplificado.

B. Protocolo experimental

Meio de reacção

Num microtubo de 500 L adicionar os seguintes reagentes:

Reagentes (concentração inicial) Volumes Reagentes (concentração final)

Tampão PCR (10x) (MgCl2 2mM) 5 uL

dNTPs (2 mM) 5 uL

Primer A (5 mM) 5 uL

Primer B (5 mM) 5 uL

Taq DNA polimerase (5 U/ml) 0,2 uL

DNA amostra 5 uL

H2O x uL

Volume total 50 uL

Cobrir com 30 L de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador)

Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de amplificação

Reacção de PCR

Ciclos Condições

95oC / 5 min

58oC / 1 min

72oC / 2 min

95oC / 40 seg

58oC / 40 seg

72oC / 90 seg

1 72oC / 5 min

1

30

No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de

agarose 2% (5 L de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pBR322

xMspI ou 100 bp ladder).


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 14

ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE DNA POR SSCP

Single Strand Conformation Polymorphism

Gel de poliacrilamida 8% (2 geis – 15 mL) Conc. Final

Acrilamida / bisacrilamida (37,5:1) 3,0 mL

TBE 10X 1,5 mL 1X

EDTA 0,5M pH8,0 60 µL 2 mM

Glicerol 750 µL 5%

Água Milli Q 9,0 mL

Persulfato amónio 10% 100 µL

TEMED 10 µL

Preparação da amostra

5 µL produto PCR + 7 µL mix EDTA/SDS/LB Bleu

Homogeneizar

Desnaturar a 95°C durante 5 min

Colocar em gelo durante 5 min

Aplicar 12 µL no gel

LB Bleu

Formamida 19 mL

Azul bromofenol 10 mg

Xileno cianol 10 mg

EDTA 0,5M pH8,0 800 µL

EDTA/SDS 10X

SDS 20% 500 µL

EDTA 0,5M pH8,0 2 mL

LB Bleu /EDTA/SDS

20 µL LB Bleu + 2 µL EDTA/SDS 10X

Electroforese

Migração a 12,5 mA / gel até saída de xileno cianol do gel


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 15

Coloração com nitrato de prata (DNA Silver Staining kit – GE Healthcare)

Colocar o gel em tina e cobrir com solução de fixação 1X durante 10’. Retirar

Adicionar solução de coloração 1X e deixar 15’ em contacto ao abrigo da luz, agitando

de vez em quando. Retirar

Lavar com água Milli Q durante 1’. Retirar

Adicionar solução revelação 1X. Agitar suavemente até aparecimento das bandas

Parar a reacção por adição de solução de paragem e preservação 1X e deixar actuar

durante 15’

Colocar o gel entre folhas de papel celofane e secar no secador de géis

Solução de fixação 5X

Ácido benzeno-sulfónico 3,0% (p/v) em etanol 24% (v/v)

Solução de coloração 5X

Nitrato prata 1,0% (p/v)

Ácido benzeno-sulfónico 0,35% (p/v)

Solução de carbonato sódio 5X

Carbonato sódio 12,5% (p/v)

Formaldeído 37%

Formaldeído 37% (p/v) em água

Tiossulfato de sódio 2%

Tiossulfato sódio 2% (p/v) em água

Solução de revelação 1X

Carbonato sódio 5X 25 mL

Tiossulfato sódio 2% 125 µL

Formaldeído 37% 125 µL

Água 100 mL

Solução de paragem e preservação 5X

Ácido acético 5% (v/v)

Acetato sódio 25% (p/v)

Glicerol 50% (v/v)


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 16

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES POR ENSAIOS DE RESTRIÇÃO

PCR / RFLP

A. Introdução

Determinadas mutações podem abolir ou introduzir sítios de restrição nas moléculas de DNA;

por outro lado, a ausência desses sítios de restrição naturais pode ser ultrapassada pela sua

criação artificial por PCR (ACRS - amplification created restriction site).

Esta característica pode ser aproveitada para o rastreio de mutações.

B. Ensaios de restrição

Para microtubo de 1,5 mL pipetar a seguinte mistura reaccional:

Reagente Concentração Inicial Concentração Final Volume a pipetar

Tampão 10X 1X

DNA (produto de PCR) 15 L

Enzima HinfI 10 U/L 4U

H2O qbp 25L

Incubar durante a 37C (ou outra temperatura adequada) durante 60’

Parar a reacção por adição de 5 L de solução de deposição (Nota: contém EDTA)

C. Electroforese em gel de SeaKem LE agarose 2%

Pesar 1 g de agarose para matraz de 100 mL


Fundir a agarose no micro-ondas

Deixar arrefecer até 60C




Aplicar 20 L do produto de digestão e em paralelo um marcador de MM (pBR322xMspI)

Migrar a 80-100V durante 1 h



4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 17

Detecção da mutação p.R261Q (CGA→CAA) no gene PAH

Sequência normal do exão 7

tat gtg act act cca cta cca aag gtc tcc tag tgc ctc tga ctg agt ggt gat gag ctt tga gtt ttc

ttt ctt ctt ttc atc cca gCT TGC ACT GGT TTC CGC CTC CGA CCT GTG GCT GGC CTG

CTT TCC TCT CGG GAT TTC TTG GGT GGC CTG GCC TTC CGA GTC TTC CAC

TGC ACA CAG TAC ATC AGA CAT GGA TCC AAG CCC ATG TAT ACC CCC GAA

CCg tga gta ctg tcc tcc agc tac cag ttg cca ggc aca atg agc gcc atc ttt tcc tgc tgc aag

aat gag gtt tgg gtt cag ttg ctg gct ggt cca cag

Sequência mutada do exão 7

tat gtg act act cca cta cca aag gtc tcc tag tgc ctc tga ctg agt ggt gat gag ctt tga gtt ttc

ttt ctt ctt ttc atc cca gCT TGC ACT GGT TTC CGC CTC CGA CCT GTG GCT GGC CTG

CTT TCC TCT CGG GAT TTC TTG GGT GGC CTG GCC TTC CAA GTC TTC CAC

TGC ACA CAG TAC ATC AGA CAT GGA TCC AAG CCC ATG TAT ACC CCC GAA

CCg tga gta ctg tcc tcc agc tac cag ttg cca ggc aca atg agc gcc atc ttt tcc tgc tgc aag

aat gag gtt tgg gtt cag ttg ctg gct ggt cca cag

Primers utilizados

7A: 5’ - CTCCTAGTGCCTCTGACTGA - 3’

7B: 5’ - ACCAGCCAGCAACTGAACCC - 3’

Enzima utilizada

HinfI Sequência de reconhecimento: 5’ - GANTC - 3’

CÁLCULOS

Tamanho dos produtos de PCR (pb) Tamanho dos produtos de restrição (pb)


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 18

RT-PCR

Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction

Access RT-PCR System Kit

Promega

A. Introdução

O RT-PCR semi-quantitativo é uma metodologia sensível e versátil que permite determinar a

presença ou ausência de transcritos específicos, assim como avaliar os seus níveis de

expressão. Inicia-se com a síntese de um molde de cDNA em cadeia dupla a partir do RNA

mensageiro, seguindo-se a respectiva amplificação em cadeia. Esta última reacção é

terminada na fase exponencial, de forma a avaliar a quantidade relativa de mRNA inicialmente

presente, prevenindo o fenómeno de plateau. O cDNA correspondente ao mensageiro da β-

actina é frequentemente utilizado como padrão interno, dado o gene que codifica paraβ-actina

ser constitutivo.

O sistema usado utiliza a transcritase reversa do vírus do mieloblastoma aviário (AMV-RT)

para a síntese da primeira cadeia de cDNA a partir do mRNA e a DNA polimerase de Thermus

flavus (Tfl DNA polimerase) para a síntese da cadeia complementar do cDNA e para a sua

amplificação.

B. Protocolo experimental

Meio de reacção

Num microtubo de 500 L adicionar os seguintes reagentes:

Reagentes (concentração inicial) Volumes Reagentes (concentração final)

Tampão Reacção AMV/Tfl (5X) 10 uL

dNTPs (10 mM) 1 uL

Primer Forward (5 mM) 2 uL

Primer Reverse (5 mM) 2 uL

MgSO4 (25 mM) 2 uL

Misturar por pipetagem e adicionar:

Transcritase Reversa AMV (5 U/uL) 1 uL

DNA polimerase Tfl (5 U/uL) 1 uL

Agitar suavemente e adicionar RNA:

Molde de RNA y uL 1 ug (103 - 10

6 cópias)

H2O DEPC x ul

Volume total 50 ul

Cobrir com 30 L de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador)

Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de síntese de cDNA e amplificação


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 19

Reacção de RT-PCR

Ciclos Condições Função

1 48oC / 45 min Transcrição reversa

1 94oC / 2 min Inactivação de AMV-RT e desnatu-

ração de RNA / cDNA / primer

94oC / 30 seg Desnaturação

60oC / 1 min Hibridação

68oC / 90 seg Elongação

1 68oC / 2 min Elongação final (opcional)

25

No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de

agarose 2% (5 L de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pBR322

xMspI ou 100 bp ladder)


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 20

SÍNTESE DE cDNA

Reverse Transcription System A3500

Promega

1. Preparação de RNA

4 L solução de RNA total

Incubar a 70C / 10’ gelo (mínimo 5’)

2. Preparação da mistura de RT

Misturar: Nuclease Free Water 5,75 L

10X Reaction Buffer 4,0 L

MgCl2 25 mM 2,0 L (3mM)

Mix dNTP 10 mM 2,0 L (0,5 mM)

Primer 1,0 L

RNase Inhibitor 0,5 L

AMV Reverse Transcriptase 0,75 L

Volume total 16,0 L

Agitar

Adicionar 16 L da mistura de RT a cada amostra de RNA total (4 L) → 20 L

3. Reacção de RT

Oligo (dT) 15 Primer - 42C / 15’; 95C / 5’

Random Primers – RT / 10’; 42C / 15’; 95C / 5’

Colocar em gelo ou a -20C até utilização posterior em PCR

Nota: A realização deste protocolo permite a obtenção de 20 μL de cDNA. Normalmente é

efectuada uma diluição de 1/3 deste cDNA antes da realização do PCR.


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 21

WESTERN BLOTTING

Isolamento de linfócitos a partir de sangue total em gradiente de Ficoll

Doseamento de proteínas pelo método de Bradford

Preparação da amostra para conservar a -20ºC: diluição ½ em tampão de amostra

DIA 1

Preparação da amostra para o processo electroforético: descongelar as amostras e diluí-

las em tampão de amostra para perfazer a concentração ideal (8 – 16 μg) num volume de

aplicação de 20 μL

Montagem do sistema

Nota: desengordurar placas com etanol

Preparação do gel de resolução a 10%:

Enchimento das placas com ajuda de uma seringa até 1cm abaixo dos pentes

Cobrir o gel com H2O

Polimerização ± 20 min

Colocação do sistema no frigorífico tapado com papel de alumínio até ao dia seguinte.

DIA 2

Preparação do gel de concentração 4%:

1 GEL 2 GEÍS

Acrilamida (37,5:1) 40% 490 μL 980 μL

Tris 0,5 M pH 6,8 1,25 mL 2,50 mL

SDS 10% 50 μL 100 μL

H2O 3,2 mL 6,4 mL

TEMED 10 μL 20 μL

PSA 10% 25 μL 50 μL

Remoção da H2O da superfície do gel absorvendo com papel de filtro

Aplicação do gel de concentração, colocação dos pentes e polimerização

1 GEL 2 GEÍS

Acrilamida (37,5:1) 40% 3,10 mL 6,20 mL

Tris 1,5 M pH 8,8 3,15 mL 6,30 mL

SDS 10% 125 μL 250 μL

H2O 6,05 mL 12,10 mL

TEMED 10 μL 20 μL

PSA 10% 62,5 μL 125 μL


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 22

Preparação das amostras: descongelar as amostras diluídas e submetê-las a fervura

durante 5 min (não esquecer de colocar tampas!) e colocá-las no gelo até aplicação

Preparação do Tampão de Corrida:

200 mL Running Buffer 5X pH 8.3

Perfazer 1000 mL com H2O

Nota: Reutilizável (conservar a 4ºC)

Colocação do tampão de eléctrodo, retirar os pentes e fazer as aplicações das amostras e

do marcador MM (previamente aquecido a 40ºC/1 min – 8 μL)

Migração:

Gel de concentração – 30 mA/ ± 40 min

Gel de resolução – 60 mA/ até saída corante

Preparação da membrana e papéis de filtro (2 por membrana) para a transferência

Preparação do Tampão de Transferência (Tampão Towbin):

25 mM Tris – 6,08g

192 mM Glicina – 28,8 g

20% Metanol – 400 mL

Perfazer 2000 mL com H2O, não acertando o pH (≈ 8,3)

Nota: Reutilizável (conservar a 4ºC)

Desmontagem do sistema e colocação em tampão de transferência: 30 min o gel e 10 min

a membrana

Electrotransferência: 45 min / ± 240 mA de modo a não ultrapassar os 25 V


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 23

ESQUEMA DE MONTAGEM DA ELECTROTRANSFERÊNCIA

Lavagem da membrana com PBS 1X:

10 mL PBS 10X


Nota: Guardar a 4ºC para lavagem subsequente.

Blocagem com PBSM 5% durante 2 horas a 4ºC com agitação

20 mL PBS 10X

10 g leite em pó


Nota: Guardar a 4ºC para incubações dos Ac.


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 24

Incubação com os anticorpos primários durante a noite a 4ºC com agitação.

DIA 3

Lavagem da membrana com PBST: 1x e rejeitar + 3x 10min

100 mL PBS 10X

1 mL Tween 20


Nota: Guardar a 4ºC para lavagens subsequentes

Incubação com o anticorpo secundário (1:1600) durante 2 horas RT com agitação

Anticorpo secundário – Blotting Grade Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Human Absorbed)

Horseradish Peroxidase Conjugate – BioRad nº 170-6515

30 mL PBSM 5% + 10 μL Ac secundário

Lavagem da membrana: 2x 10 min com PBST + 1x 10 min com PBS 1X

Revelação: Kit Pico Pierce

500 μL solução A + 500 μL solução B

Incubação durante 5 min

6 mL PBSM 5% +

- 6 μL Ac E1

- 18 μL Ac E2

- 5 μL Ac E3

- 3 μL Ac BP


4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 25

SOLUÇÕES STOCK:

Tampão de amostra

200 mM Tris-HCl, pH 6,8

2% (p/v) SDS

40% (v/v) Glicerol

0,04% (p/v) Azul Coomassie G-250

2% (v/v) β-mercaptoetanol

Tampão Tris 1,5 M pH 8,8

Tris-Base – 54,45g

H2O – 150 mL

Ajustar pH 8,8 com HCl 1N, completar 300 mL com H2O e autoclavar

Tampão Tris 0,5 M pH 6,8

Tris-Base – 6 g

H2O – 60 mL

Ajustar pH 6,8 com HCl 1N, completar 100 mL com H2O e autoclavar

PSA 10%

Persulfato de amónio – 1 g

H2O – 10 mL

Dividir em alíquotas de 250 µL e congelar a -20ºC

SDS 10%

SDS – 10 g

H2O – 100 mL

Dissolver a 68ºC e ajustar a pH 7,2

Running Buffer 5X pH 8,3

Tris-Base – 15 g

Glicina – 72 g

SDS – 5 g


PBS 10X

1370 mM NaCl – 80 g

27 mM KCl – 20 g

100 mM Na2HPO4 – 14,2 g

18 mM KH2PO4 – 2,45 g


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