1

I. INTRODUÇÃO

1. Família Trypanosomatidae

A Família Trypanosomatidae é de grande interesse médico e econômico,

sendo composta por protozoários uniflagelados parasitas, que podem ter seus

ciclos de vida estabelecidos em um único hospedeiro (parasitas monoxênicos),

ou em mais de um hospedeiro (parasitas heteroxênicos). Os gêneros

heteroxênicos estão divididos entre os que parasitam invertebrados (em

especial insetos) e vertebrados: Leishmania, Trypanosoma e Endotrypanum e

o constituído de parasitas de insetos e vegetais: Phytomonas (Hoare &

Wallace, 1966; Vickerman, 1994).

2. Leishmania

Parasitos do gênero Leishmania foram descritos em 1903 por James Wright.

As síndromes atribuídas a estes protozoários são chamadas de leishmanioses,

de grande importância médica, essas doenças variam de lesões que se curam

espontaneamente à formas viscerais fatais. (Vannier-Santos Martiny & De

Souza, 2002). As leishmanioses são as mais importantes doenças emergentes,

devido a sua incidência, alta mortalidade em indivíduos não tratados e crianças

desnutridas, e estão em segundo lugar no número de mortes, entre as doenças

parasitárias, logo depois da malária. Há cerca de 350 milhões de pessoas

vivendo em áreas endêmicas. A leishmaniose cutânea afeta a pele, causando

úlceras e a mucocutânea ulceração, seguida da destruição de membranas

mucosas e do tecido do nariz, da boca e da garganta. É uma doença que pode

levar à morte por infecção secundária das vias respiratórias. A Bolívia, o Brasil

e o Peru contabilizam 90% de todos os casos mundiais. A forma mais perigosa

da doença, no entanto, é a leishmaniose visceral (LV), que está entre as seis

doenças mais importantes causadas por protozoários no mundo, devido a sua

incidência, alta mortalidade em indivíduos não tratados e crianças desnutridas,

e emergência em indivíduos portadores da infecção por HIV. Tem ampla

distribuição geográfica, ocorrendo na Ásia, Europa, Oriente Médio, África e

2

Américas. Estima-se a ocorrência de 500 mil novos casos por ano, sendo que

90% deles em Bangladesh, Brasil, Índia e Sudão. Na América Latina, a doença

já foi descrita em 12 países (cerca de 90% dos casos no Brasil)

(http://www.who.int/en/).

A reprodução destes protozoários ocorre por divisão binária simples em

ambos os hospedeiros. Os hospedeiros vertebrados incluem uma grande

variedade de mamíferos. Como hospedeiro invertebrado são identificados,

exclusivamente, fêmeas de inseto hematófagos conhecidos como

flebotomíneos dos gêneros Lutzomyia (Novo Mundo) e Phlebotomus (Velho

Mundo) (Neves et al., 2005).

São reconhecidos dois estágios de desenvolvimento distintos durante o ciclo

de vida deste parasito (Fig. 1). As formas promastigotas (Fig. 1A) que estão

presentes dentro do flebotomíneo (hospedeiro invertebrado) são alongadas e

possuem flagelo longo e as formas amastigotas (Fig. 1B) que estão presentes

no hospedeiro vertebrado, são arredondadas, com flagelo curto e intracelulares

(Olivier, Gregory & Forget, 2005).

Figura 1: Formas evolutivas: A- Amastigota B- Promastigota

(adaptação de Brener & Andrade, 2002)

O ciclo biológico da Leishmania começa quando a fêmea pica um

hospedeiro vertebrado infectado (Figura 2), ingerindo o sangue com os

macrófagos e monócitos contaminados com as formas amastigotas do parasito,

que no interior do aparelho digestivo do inseto sofrem mudanças bioquímicas e

morfológicas e se diferenciam em promastigotas procíclicas (forma replicativa

no inseto). O hospedeiro vertebrado saudável é infectado quando as formas

B

3

promastígotas metaciclicas (infectante no hospedeiro vertebrado) são

inoculadas pelas fêmeas dos insetos vetores, durante o repasto sanguíneo.

(Neves et al., 2005).

Os macrófagos são as primeiras células a serem infectadas por estes

parasitos. Depois da ligação ao macrófago, as formas promastigotas são

internalizadas e começam a diferenciar para amastigotas que são resistentes

ao ambiente acídico e hidrolítico do fagolisossoma, por isso a maturação do

endossoma e a fusão endossoma-fagossoma são retardadas até que as

formas promastigotas possam diferenciar em amastigotas mais resistentes,

esse processo ainda não está bem entendido (Olivier, Gregory & Forget, 2005).

Para tentativa de controle da infecção, os macrófagos produzem um oxidante

chamado óxido nítrico (NO). O NO é gerado após ativação dos macrófagos, por

INF-γ e TNF-α, e é o mais importante no estabelecimento da morte de

amastigotas intracelulares. O NO foi descrito como atuante na eliminação de L.

major por macrófagos humanos, estimulados através do receptor de baixa

afinidade Fce, CD23 e o IFN-γ (Vouldoukis et al., 1995). Entretanto, os

mecanismos de subversão do sistema imune são extremamente eficientes e

estão relacionados com fatores de virulência destes protozoários, como LPG

(camada de lipofosfoglicana “protetora” presente nas espécies de Leishmania)

e a glicoproteína 63 (gp63), uma metalopeptidase, também conhecida como

leishmaniolisina, que é descrita como um importante fator de virulência, por

conferir resistência à lise mediada por complemento, clivando e convertendo

C3b para sua forma inativa iC3b. A gp63 ainda é descrita como um ligante de

proteínas de superfície do hospedeiro, como o receptor para fibronectina

(McKerrow et al., 2006). Dentro das células do sistema fagocítico e

mononuclear os parasitos se multiplicam e rompem as células, alcançando, via

vasos sanguíneos e linfáticos, muitos órgãos, especialmente baço, fígado,

medula óssea e tecidos linfóides, no caso da leishmaniose visceral (Vannier-

Santos, Martiny & De Souza, 2002).

4

Figura 2: Ciclo biológico

(adaptado CDC, www.dpd.cdc.gov/dpdx)

5

2.1. Leishmania chagasi

Os protozoários do complexo Leishmania donovani são os causadores da

leishmaniose visceral na África, Ásia, Europa e nas Américas, e incluem três

espécies de Leishmania: L. donovani, L. infantum, L. chagasi. Nas Américas a

Leishmania chagasi é a espécie responsável pelas formas clínicas da

leishmaniose visceral e tem como vetor a espécie de flebotomíneo Lutzomyia

longipalpis (Neves et al., 2005). Outras espécies estão relacionadas com o

calazar ou leishmaniose visceral do Velho Mundo como, L. donovani na Índia e

L. infantum na região do Mar Mediterrâneo, Europa, África e China (Sundar &

Chatterjee, 2006). Estes protozoários apresentam um grande tropismo por

células do sistema fagocítico e mononuclear (Vouldoukis et al., 1995). O

primeiro relato de infecção por Leishmania chagasi no Brasil foi feito em 1934,

quando encontraram formas amastigotas de Leishmania em cortes histológicos

do fígado de pessoas que morreram com suspeita de febre amarela. Somente

20 anos depois é que se registrou o primeiro surto da doença em Sobral, no

Ceará (Gontijo e Melo, 2004).

Devido à gravidade desta doença, são registradas cerca de 59.000 mortes

por ano, com incidência de 500.000 novos casos. O índice de mortalidade da

leishmaniose visceral é de quase 100%, se não tratada (Dantas-Torres &

Brandão-Filho, 2006). No Brasil, são registrados cerca de 3.500 casos anuais,

cerca de 90% do total de casos de toda América Latina (Queiroz, Alves &

Correia, 2004). Grande parte dos casos acomete crianças menores de cinco

anos, moradoras de áreas rurais com baixa renda familiar (Jerônimo et al,

2004; Rey et al, 2005).

3. Tratamento

O arsenal terapêutico contra a leishmaniose viceral é delimitado. Os

antimoniais pentavalentes (Sb5+), antimoniato de N-metilglucamina

(Glucantime®) e o estibogliconato sódico (Pentostam®) são na maioria dos

países, a primeira opção terapêutica. No Brasil, a droga de escolha é a

Glucantime®, que é de distribuição gratuita na rede de saúde publica. Estas

6

drogas são tóxicas, nem sempre efetivas, e na LV são usadas em esquemas

prolongados (Gontijo e Melo, 2004).

No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, não existe documentações de

presença de cepas de L. chagasi resistentes aos antimoniais, in vitro. Apesar

de países do sudeste da África e Índia apresentarem índices preocupantes de

resistência aos antimoniais (Frezard et al., 2009).

Em caso de recidiva é recomendado um segundo tratamento com o

desoxicolato de sódio de anfotericina B e suas formulações lipossomais, além

de pentamidinas e imunomoduladores (Neves et al., 2005). As pentamidinas

(sulfato e mesilato) e os imunomoduladores (interferon gama e GM-CSF) ainda

se encontram em fase de investigação. A utilização destas drogas só deve ser

realizada em hospitais de referência (Gontijo e Melo, 2004).

O desenvolvimento de anfotericina B encapsulada em lipossomas

(AmBisome) tem mostrado bons resultados, com cura de 90-95% na Índia

(Gontijo e Melo, 2004). Em 2000 foi disponibilizada uma nova droga de uso

oral, o Miltefosine, um hexadecylphosphoscoline, originalmente desenvolvido

para o câncer. Este foi o mais significativo avanço no tratamento de

leishmaniose viceral desde 1940. Esse tipo de medicação é ainda de alto

custo, portanto o seu uso é restrito (Neves et al., 2005).

4. Fator de Ativação de Plaquetas (PAF)

Apesar de ainda serem pouco estudadas em tripanossomatídeos as vias de

sinalização celular são um potencial alvo para o desenvolvimento de novas

drogas, pois regulam virtualmente todos os aspectos do comportamento celular

(Cuatrecasas, 1986; Naula & Seebeck, 2000; Hammarton, 2007). A fosforilação

e a defosforilação de proteínas têm papel fundamental no controle de

fenômenos biológicos na maioria dos organismos (Hunter, 1995), incluindo

protozoários da família Trypanosomatidae (Parsons et al., 1993).

A ligação de muitos hormônios ou polipeptídios aos receptores na

membrana celular, transmitem seus sinais via (1) elevação de adenosina

monofosfato cíclica (AMPc) e transmissão, através de sinalização, via proteína

cinase dependente de AMP cíclico (PKA); (2) estimulando a hidrólise de

fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato e ativando uma combinação de mensageiros

7

secundários, incluindo o inositol trifosfato (IP3), íons Ca+2 e o diacilglicerol

(DAG), que por sua vez ativam a proteína cinase C (PKC); ou (3) estimulando

níveis intracelulares de GMPc e, consequentemente, ativando uma sinalização

via proteína cinase G (Derynck & Wagner, 1995; Robbins & Hollenberg, 1999;

Siegel et al., 1991).

Nas três vias, é o receptor que transmite a informação para dentro da

célula, através da membrana plasmática, por intermédio das proteínas G, que

são ativadas quando se ligam a guanosina trifosfato (GTP) (Derynck & Wagner,

1995). Diferentemente dos receptores ligados às proteínas G, outros

receptores de superfície celular são diretamente ligados a enzimas

intracelulares, é a família dos receptores de proteínas tirosina cinase, que

fosforilam suas proteínas substratos em resíduos de tirosina. Esta família inclui

receptores para a maioria dos fatores de crescimento; por isso, a fosforilação

por tirosina cinase tem sido bem estudada, como um mecanismo sinalizador

envolvido no controle do crescimento e diferenciação celular animal, inclusive

de tripanossomatídeos (Hubbard et al., 1998; Chuenkova & Pereira-Perrin,

2004).

Em 1970, Henson descobriu um fosfolipídio que tinha a capacidade de

promover a agregação plaquetária em coelhos imunizados que ele chamou de

Fator de Ativação de Plaquetas (PAF). O PAF (1-O-alquil-2-acil-glicero-3-

fosfocolina) é um potente sinalizador molecular lipídico que apresenta uma

grande variedade de efeitos fisiológicos e fisiopatológicos em diversas células e

tecidos, incluindo a diferenciação celular, na inflamação e alergia (Rosa et al,

2001). Antes pensavam que as funções do PAF eram exclusivamente

estruturais ou de reserva energética, mas estudos comprovaram que este fator

solúvel liberado por leucócitos estimula a agregação de plaquetas e a liberação

de serotonina (Lenhinger, 2006 ).

8

Figura 3: Estrutura do PAF

Em mamíferos, o PAF é sintetizado e liberado por uma grande variedade de

células, incluindo plaquetas, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos e

células endoteliais, sendo mediador de diversos processos biológicos e

patofisiológicos, como a inflamação, alergia, bronquite asmática, doenças de

pele, infecção por Streptococcus e desordens do sistema nervoso central

(Benveniste, 1974; Bozza et al., 1994; Campbell & Halushka, 1996; Ishii,

Nagase, Shimizu, 2002). A presença de PAF também já foi observada em

outros organismos, como peixes (Turner & Lumb, 1989), vários invertebrados

(Sugiura et al., 1991, 1992), em Dictyostelium (Bussolino et al., 1991), plantas

(Mangold, Apte & Weber, 1991; Calligerou et al., 1996) e até mesmo em

microorganismos, como cianobactérias (Antonopoulou et al., 2002),

Tetrahymena (Tsoukatos Tselepis & Lekka, 1993) e Saccharomyces cerevisae

(Nakayama et al., 1994 a, b).

PAF age por meio da ativação de um receptor específico, presente na

superfície de suas células alvo. Este receptor, quando exposto ao seu

respectivo agonista, ativa uma proteína G, que por sua vez ativa e regula várias

respostas celulares (Hwang, Lam & Pong 1986; Zhu et al, 2006). Esta proteína

parece funcionar como um mediador, ligando o receptor do PAF a vários

sistemas celulares, como por exemplo as fosfolipases C e A2 (Chao & Olson,

1993). Além disso, através da ligação com seu receptor, o PAF também pode

estimular a reciclagem de fosfatidilinositol, fluxo de cálcio, ativação de proteína

cinase importantes como a proteína cinase C (PKC), produção de eicosanóides

e fosforilação de diversas proteínas (Gouill et al., 1997). Esses eventos levam à

ativação de diferentes fatores de transcrição, que controlam a expressão de

9

genes, que estão relacionados aos diferentes processos de ativação e

diferenciação celular (Bazan & Allan, 1996; Liu et al., 1997).

Figura 4: Estrutura do receptor de PAF

O WEB 2086 (3-[4-(2-clorofenil)-9-metil-6H-tieno-[3,2-f] [1,2,4]triazolo-[4,3,·]

[1,4] diazepina-2-·1-1-(4-morfolina-·1)-1-propanona), é um importante

antagonista do PAF, e que tem se mostrado uma poderosa ferramenta para o

estudo de receptores de membrana (Rodrigues et al., 1996; Lopes et al., 1997;

Dutra et al., 1998; Rodrigues et al., 1999)]. Em relação aos

tripanossomatídeos, em estudos anteriores, foi demonstrado que o PAF é

capaz de induzir um aumento de 40% na diferenciação celular dos

tripanossomatídeos T. cruzi (Rodrigues et al., 1996) e H. muscarum muscarum

(Lopes et al., 1997), além de modular uma atividade fosfatásica na superfície

destes protozoários (Dutra et al., 1998; Rodrigues et al., 1999; Dutra et al.,

2000). Também foi mostrado que o PAF é capaz de estimular a atividade da

enzima CK2 de H. m. muscarum, através de complexa via de transdução de

sinais, com participação de proteínas serina/treonina e tirosina fosfatases, PLC,

PKC e MAP cinases (Silva-Neto et al., 2002). Todos esses efeitos parecem

10

ocorrer via receptor de superfície, uma vez que foram revertidos na presença

do WEB 2086.

Recentemente, nosso grupo identificou uma molécula com característica

semelhante ao PAF em T. cruzi (Gomes et al., 2006). Além disso, a presença

de atividade de PAF acetil –hidrolase (enzimas capazes de hidrolisar a

molécula de PAF) em Rhodnius prolixus pode ser um indicativo da ação de

fosfolipídio no inseto vetor do T. cruzi (Figueiredo et al, 2008).

A cascata de eventos de transdução de sinais, disparada pela ligação do

PAF ao seu receptor, ativa diferentes fatores de transcrição, que controlam a

expressão de genes, que estão relacionados aos diferentes processos de

ativação e diferenciação celular. Estes estudos demostram como é complexa a

sinalização intracelular promovida por PAF (Rosa et al, 2001).

Uma droga promissora para o tratamento das leishmanioses, em especial a

leishmaniose visceral, é a Miltefosine. Curiosamente, a Miltefosine é uma

alquil-glicero-fosfocolina (um éter lipídio), que apresenta uma grande

semelhança estrutural com o PAF, além de se ligar ao receptor do PAF em

células de mamíferos (Croft & Engel, 2006).

Todos os estudos envolvendo as ações do PAF sobre L. chagasi, além dos

aspectos acadêmicos, tem o interesse de possibilitar a elucidação de vias de

sinalização celular, o que é de extrema importância para a descoberta de

novas drogas e estratégias quimioterápicas para a leishmaniose visceral.

11

II.OBJETIVOS

1. Objetivo Geral

Determinar o efeito que do Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) comercial

e extraído de L. chagasi na proliferação e interação de Leishmania chagasi

com células do hospedeiro vertebrado.

2. Objetivos específicos

2.1. Obter o lipídio com atividade semelhante a PAF em L. chagasi;

2.2. Verificar a influência do PAF de Leishmania e comercial na proliferação de

L. chagasi;

2.3. Verificar a influência do PAF de Leishmania e comercial na infecção de

macrófagos peritoneais de camundongos por L. chagasi;

2.4. Analisar as possíveis mudanças, no perfil de expressão de proteínas, após

o tratamento com PAF de Leishmania e comercial, em Leishmania chagasi;

12

III.METODOLOGIA

1- Microorganismos

O parasita foi obtido no Centro de Referência em Leishmaniose do Instituto

Oswaldo Cruz. Leishmania (Leishmania) chagasi (MHO/BR/1974/PP75).

Os promastigotas foram mantidos em meio Schneider contendo 20% de

soro fetal bovino a 26oC .

2- Extração e purificação do lipídio semelhante a PAF de Leishmania

chagasi

Protozoários da espécie L. chagasi foram crescidos por 5 dias. Estes

parasitos (109células/mL) foram, então, centrifugados, lavados duas vezes com

solução salina. A extração ocorreu com a adição de uma solução de ácido

acético (50mM) em metanol, também foi adicionado clorofórmio e acetato de

sódio 0.1M, vortexar e centrifugar por 5 minutos a 5000 rpm. Foram formadas 3

fases, a fase superior foi descartada, a fase inferior foi seca em nitrogênio, à

fase mediana foi adicionada a mesma proporção de ácido acético (50mM) em

metanol, clorofórmio e acetato de sódio, esse procedimento foi repetido por

três vezes (adaptado de Bligh & Dryer, 1959). A parte inferior corrrespondente

aos lipídeos totais dos parasitos, foi ressuspensa em etanol (50 L) e

posteriormente, separada por cromatografia de camada fina (HPTLC)

preparativa, em placas de sílica (Si 60 F254, Merk, Darmstadt, Alemanha),

usando sistema clorofórmio: metanol: água (65:35:6, v/v). As bandas foram

visualizadas por vapores de iodo, H2SO4. A banda correspondente ao autêntico

PAF (PAF comercial foi utilizado como padrão) e ao lipídio semelhante a PAF

de L. chagasi foram extraídas da sílica. A concentração do lipídio semelhante a

PAF de L. chagasi foi estimada, com base em resultados de experimentos de

agregação plaquetária (principal função do PAF) e ajustada para os

experimentos posteriores.

13

3- Avaliação da proliferação celular

Protozoários da espécie L. chagasi foram crescidos por 1-7 dias na

ausência ou na presença de PAF-like extraído de Leishmania (10–5 M) ou PAF

comercial (10–5 M). Cerca de 5 x 105 parasitos (de uma cultura de 5 dias) foram

inoculados em 5 ml de meio de cultura. A contagem das células foi

determinada diariamente através de Câmara de Neubauer (Santos & Oliveira,

1988).

4- Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c

Os camundongos BALB/c fêmeas foram anestesiados com éter etílico e

sacrificados por deslocamento da coluna cervical e, então, a cavidade

peritoneal foi lavada com 5 a 6 mL de PBS estéril. O volume final obtido,

retirado da cavidade abdominal, foi distribuído em placas (24 poços) para

fixação e manutenção dos macrófagos em meio RPMI, em atmosfera contendo

4 % de CO2, por 16 horas.

5- Interação dos parasitos com macrófagos peritoneais de camundongos

Os macrófagos peritoneais, tratados ou não com PAF-like isolado de

Leishmania chagasi (10–5 M) e PAF comercial (10–5 M), foram infectados com

Leishmania chagasi tratadas ou não tratadas com PAF-like de Leishmania

chagasi (10–5 M) e PAF comercial (10–5 M) que foram adicionadas às culturas,

na proporção de 10 parasitos para cada macrófago. Após a infecção, as placas

foram incubadas durante 4 horas a 37 ºC, em atmosfera contendo 4 % de CO2.

Em seguida, as lamínulas foram lavadas em PBS, fixadas e coradas com

reagente de Giemsa. Depois de secas, as lamínulas foram montadas sobre

lâminas de vidro (24x76mm), utilizando-se Permount.

6- Sobrevivência dos parasitos em macrófagos peritoneais de

camundongos

Os macrófagos peritoneais, tratados ou não com PAF-like isolado de

Leishmania chagasi (10–5 M) e PAF comercial (10–5 M), serão infectados com

Leishmania chagasi tratadas ou não tratadas com PAF-like isolado de

Leishmania chagasi (10–5 M) e PAF comercial (10–5 M). Os parasitos serão

adicionados às culturas, na proporção de 10 parasitos para cada macrófago.

14

Após a infecção, as placas foram incubadas durante 24 horas a 37 ºC, em

atmosfera contendo 4 % de CO2. Em seguida, as lamínulas serão lavadas em

PBS, fixadas e coradas com reagente de Giemsa. Depois de secas, as

lamínulas serão montadas sobre lâminas de vidro (24x76mm), utilizando-se

para isso o Permount.

7- Aprovação para experimentação utilizando células de animais

Os macrófagos peritoneais de camundongos foram obtidos de acordo

com as normas para experimentação animal, aprovadas pela Comissão de

Ética para Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

8 - Perfil de expressão de proteínas

L. chagasi foram tratadas e/ou não tratadas com PAF-like isolado de

Leishmania chagasi (10–5 M) e PAF comercial (10–5 M), as células foram então

centrifugadas, lavadas duas vezes com solução salina. O extrato celular foi

ressuspenso em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, NaCl 15 mM, ortovanadato

de sódio 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 10 mM, azida sódica 0,02 %;

pH 8,0). Os parasitos foram, então, congelados em nitrogênio líquido e

descongelados por 3 vezes. O material referente homogenato da célula foi

usado no gel. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, a 10%. A

eletroforese foi realizada a 150 volts e 60 mA. O gel foi corado com o corante

Coomassie Blue.

9. Análise estatística

Todos os experimentos foram feitos em triplicata. Os resultados foram

analisados estatisticamente pelo teste de Fisher e pelo teste de análise de

variância (ANOVA). Valores de P iguais ou menores que 0,05 foram

considerados significativos.

15

IV. RESULTADOS

1. Extração de lipídio com atividade semelhante a PAF em L. chagasi

De modo a verificar se o parasita Leishmania chagasi produz o lipídeo

com atividade semelhante ao PAF produzido pelos mamíferos foi feita a

extração total de lipídeos de uma cultura de L. chagasi. Estes lipídios foram

analisados por cromatografia em camada fina de alta resolução (HPTLC),

usando placas de sílica gel e, como sistema de separação, clorofórmio:

metanol: água (65: 35: 6, v/v). Lipídeos com fator de corrida semelhante ao

autêntico PAF foram observados (Figura 1). Neste ensaio foram isolados

lipídeos com atividade semelhante ao PAF comercial, que foram extraídos da

sílica pra serem utilizados nos experimentos seguintes.

Fig. 5. Cromatografia de camada fina de alta resolução (HPTLC) de lipídios

extraídos de Leishmania chagasi em sistema solvente composto por

clorofórmio:metanol:água (65:35:6, v/v/v). As placas foram secas e expostas a

vapor de iodo. Os lipídios foram identificados por comparação com PAF

comercial, usado como padrão.

PAF comercial PAF Leishmania chagasi

16

2. Efeito do PAF-like extraído de Leishmania chagasi e PAF comercial na

proliferação de L. chagasi

Também foi avaliado se o PAF-like extraído de Leishmania e PAF comercial

teria efeito na proliferação celular de L. chagasi. A figura 6 mostra a curva de

crescimento de parasitos crescidos na ausência (controle) e na presença das

seguintes drogas: PAF comercial (10-5M) e PAF-like isolado de L. chagasi (10-

5M). Podemos observar que nos sistemas onde os parasitos foram crescidos

na presença de PAF-like isolado de L. chagasi e PAF comercial houve uma

diminuição (30%) do número de células, em relação ao sistema controle. Este

resultado mostra que o PAF-like isolado de L. chagasi e o PAF comercial têm

efeito semelhante na modulação do crescimento de L. chagasi.

Fig. 6. Índice de proliferação de Leishmania chagasi. Parasitos tratados com

PAF comercial 10-5 M e PAF-like extraído de Leishmania chagasi 10-5 M (PAF

Lc).

24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h

x 1

06

ce

ls

0

2

4

6

8

10

Controle

PAF comercial

PAF Lc

17

3. Efeito do PAF-like extraído de Leishmania e do PAF comercial na

infecção de macrófagos peritoneais de camundongos por L. chagasi

De maneira a investigar o efeito do PAF na infecção de macrófagos

peritoneais de camundongos balb/c por L. chagasi foram feitas interações na

presença e ausência de PAF comercial (10-5M), PAF-like extraído de L. chagasi

(10-5M) e WEB 2086 (antagonista do receptor do PAF) (10-5M). Observamos

na figura 7 que quando tratamos somente os parasitas tanto com o PAF

comercial quanto com o PAF-like isolado de L. chagasi há um aumento de

100% do índice de associação comparado ao controle. Também observamos

que quando tratamos apenas os macrófagos tanto com o PAF comercial

quanto com o PAF-like extraído de L. chagasi o índice de associação diminui

em 50% em relação ao controle e quando tratamos os parasitos e os

macrófagos tanto com PAF comercial quanto com o PAF-like isolado de L.

chagasi o aumento da interação promovido pelo PAF comercial e pelo PAF

isolado de L. chagasi é revertido em 85%.

O WEB 2086 é um antagonista sintético do PAF, que tem sido utilizado como

ferramenta de estudo de ligações do PAF com o seu receptor para averiguar se

o PAF age via receptor na superfície da celular. A figura 8 mostra a interação

de macrófagos peritoneais de camundongos com L. chagasi utilizando o PAF

comercial, o PAF-like extraído de L. chagasi e o WEB 2086, para verificarmos

se a ação do PAF acontece via receptor. Observamos que quando o parasito é

tratado com o WEB + PAF (comercial e isolado de Leishmania), há a

diminuição do índice de associação quando comparamos com os parasitos

apenas tratados com o PAF (comercial e isolado de Leishmania) , indicando a

participação do receptor no efeito do PAF no parasito. Além disso, quando

tratamos os macrófagos com WEB + PAF (comercial e isolado de Leishmania)

também há a reversão do efeito promovido pelo PAF indicando também a

participação do receptor na sinalização promovida pelo PAF nos macrófagos.

Fizemos também a avaliação da sobrevivência de L. chagasi nos

macrófagos de camundongos por 24 horas. Podemos observar na figura 9, que

da mesma maneira que acontece na interação (4 horas), quando tratamos os

parasitos tanto com PAF comercial, quanto com PAF-like isolado de

Leishmania chagasi há um aumento na infecção, em relação ao controle.

18

Também observamos que da mesma forma quando apenas os macrófagos

foram tratados com PAF comercial e PAF-like isolado de Leishmania o índice

de infecção diminuiu em relação ao controle, igualmente como ocorre na

interação, e quando tratamos os macrófagos e os parasitos com PAF comercial

e com PAF-like isolado de Leishmania o aumento do índice de infecção

promovido tanto pelo PAF comercial quanto pelo PAF-like isolado de

Leishmania é revertido, também corroborando com os resultados da interação.

Estes resultados demonstram similaridade nos efeitos do PAF comercial e

do PAF-like extraído de L. chagasi em relação à infectividade de L. chagasi.

19

Fig. 7. Índice de associação de Leishmania chagasi com macrófagos de

camundongos. Parasitos e/ou macrófagos tratados com PAF comercial 10-5 M

e PAF-like extraído de Leishmania chagasi 10-5 M.

MCPC – macrófagos controle/ parasitos controle

MCPPc – macrófagos controle/ parasitos PAF comercial 10-5M

MPcPC – macrófagos PAF comercial 10-5M/ parasitos controle

MPcPPc- macrófagos PAF comercial 10 -5M/ parasitos PAF comercial 10-5M

MCPPl – macrófagos controle/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

MPlPC – macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos controle

MPlPPl- macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

Interação de Leishmania chagasi x macrófagos

(PAF comercial 10-5

M e PAF de Leishmania 10-5

M)

MCPC MCPPc MPcPC MPcPPc MCPPl MPlPC MPlPPl

Índ

ice

de

As

so

cia

çã

o

0

20

40

60

80

100

120

140

20

Fig. 8. Índice de infecção na sobrevivência por 24 horas de Leishmania chagasi

com macrófagos de camundongos. Parasitos e/ou macrófagos tratados com

PAF comercial 10-5 M e PAF-like extraído de Leishmania chagasi 10-5 M.

MCPC – macrófagos controle/ parasitos controle

MCPPc – macrófagos controle/ parasitos PAF comercial 10-5M

MPcPC – macrófagos PAF comercial 10-5M/ parasitos controle

MPcPPc- macrófagos PAF comercial 10 -5M/ parasitos PAF comercial 10-5M

MCPPl – macrófagos controle/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

MPlPC – macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos controle

MPlPPl- macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

Sobrevivência de Leishmania chagasi x macrófagos

(PAF comercial 10-5

M e PAF de Leishmania 10-5

M)

MCPC MCPPc MPcPC MPcPPc MCPPl MPlPC MPlPPl

Índ

ice d

e I

nfe

cção

0

20

40

60

80

100

120

140

160

21

Fig. 9. Índice de associação de Leishmania chagasi com macrófagos de

camundongos. Parasitos e/ou macrófagos tratados com PAF comercial 10-5 M

e PAF-like extraído de Leishmania chagasi 10-5M e WEB 2086 10-5 M.

MCPC – macrófagos controle/ parasitos controle

MCPPc – macrófagos controle/ parasitos PAF comercial 10-5M

MPcPC – macrófagos PAF comercial 10-5M/ parasitos controle

MPcPPc- macrófagos PAF comercial 10 -5M/ parasitos PAF comercial 10-5M

MPcWPC - macrófagos PAF comercial 10 -5M + WEB 2086/ parasitos controle

MCPPcW - macrófagos controle/ parasitos PAF comercial 10-5M + WEB 2086

MCPPl – macrófagos controle/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

MPlPC – macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos controle

MPlPPl- macrófagos PAF de Leishmania 10-5M/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M

MPlWPC - macrófagos PAF de Leishmania 10-5M + WEB 2086/ parasitos controle

MCPPlW - macrófagos controle/ parasitos PAF de Leishmania 10-5M + WEB 2086

Interação Leishmania chagasi x macrófagos

(PAF comercial 10-5

M e PAF de Leishmania 10-5

M x WEB 2086 10-5

M)

MCPC MCPPc MPcPC MPcPPc MPcWPC MCPPcW MCPPl MPlPC MPlPPl MPlWPC MCPPlW

Índ

ice d

e a

sso

cia

ção

0

20

40

60

80

100

120

140

22

4. Efeito do PAF no perfil de expressão de proteínas de L. chagasi

Foi determinado também o perfil de expressão de proteínas com o PAF

comercial 10-5 M e PAF-like extraído de Leishmania chagasi 10-5 M para

verificar o efeito do PAF nas vias de sinalização celular deste protozoário. A

figura 10 mostra o perfil de expressão de proteínas de L. chagasi crescidos na

ausência ou na presença de PAF comercial ou PAF-like extraído de

Leishmania chagasi. O perfil de expressão apresenta mudanças nas proteínas

expressas principalmente entre o sistema controle e os sistemas PAF

comercial ou PAF-like extraído de Leishmania chagasi (setas).

Fig. 10. Perfil de expressão de proteínas de L. chagasi tratadas ou não com PAF comercial 10-5M (PAFc) e/ou PAF- like extraído de L. chagasi 10-5M (PAFLc). Cont- controle.

PPM Cont PAFc PAFLc

40 kDa -

25 kDa -

15 kDa -

23

V. DISCUSSÃO

Os tripanossomatídeos são excelentes modelos para estudos sobre vários

aspectos de biologia celular, incluindo ultraestrutura e morfologia,

posicionamento de organelas, tráfego de vesículas e de macromoléculas,

divisão e diferenciação celular. A organização da estrutura celular dos

tripanossomatídeos é fundamental para seu ciclo celular. Assim, compreender

a biologia celular do desenvolvimento dos tripanossomatídeos significa dar

subsídios à elucidação tanto de processos fundamentalmente conservados,

como de outros totalmente diferentes, em relação aos aspectos organizacionais

e fisiológicos da célula eucariótica (Matthews, 2005). Os tripanossomatídeos

assemelham-se aos eucariontes superiores em vários aspectos, incluindo o

fato de suas funções celulares serem mediadas por vias de sinalização,

envolvendo receptores de superfície, proteínas cinases e fosfatases, e

mensageiros secundários. Embora alguns gêneros de tripanossomatídeos

sejam patogênicos para humanos, animais ou plantas, as vias de transdução

de sinais destes parasitos ainda são pouco conhecidas (Parsons & Ruben,

2000).

O fator de ativação de plaquetas (PAF) é um potente fosfolipídio mediador

de diversas funções celulares em vários processos biológicos e patofisiológicos

de mamíferos, como diferenciação celular, inflamação e alergia. Considerando

as vias de sinalização celular, o fator de ativação de plaquetas (PAF) tem

recentemente assumido um papel cada vez mais importante como um segundo

mensageiro lipídico. Uma variedade de bioatividades de PAF têm sido

elucidadas, incluindo embriogênese, diferenciação celular, choque e respostas

imunes (Deo et al., 2004). Vários tipos de células e tecidos, quando

estimulados, são capazes de sintetizar e liberar PAF, além de apresentar

diversas respostas biológicas a este composto (Chao & Olson, 1993).

PAF é tão potente que pode elicitar respostas biológicas importantes em

concentrações nanomolares, tanto in vivo, quanto in vitro. As atividades

mediadas por PAF ocorrem através de uma proteína G ligada ao receptor, que

é expressa na superfície de muitas células (Le Gouill et al, 1997; Prescott et al,

2000; Ishii, Nagase & Shimizu, 2002).

24

Apesar de PAF estar bem estabelecido como mediador de vias de

sinalização em sistemas de mamíferos, pouco é conhecido sobre suas funções

em tripanossomatídeos (Izumi & Shimizu, 1995; Kulikov & Muzya, 1997;

Rodrigues et al., 1999, Silva-Neto et al., 2002). Já foi demonstrado que PAF

promove um aumento de 40% na diferenciação celular de Herpetomonas

muscarum muscarum e T. cruzi. Além disso, este lipídeo também tem

capacidade de modular a atividade ecto-fosfostásica e a interação de

Leishmania com células de mamíferos (Rodrigues et al., 1996, 1999; Lopes et

al., 1997; Dutra et al., 1998, 2000; Rosa et al., 2001).

Em 2006, um estudo publicado por Gomes e colaboradores identificou uma

molécula com características semelhantes ao PAF em T. cruzi, com efeitos

biológicos importantes como diferenciação celular (Gomes et al., 2006). De

modo a verificar se a Leishmania chagasi também produz o lipídeo com perfil

semelhante ao PAF foi feita uma extração de lipídeos seguida por comparação

com o PAF comercial (utilizado como padrão). Na figura 5 podemos observar

que a L. chagasi produz lipídeos com perfil análogo ao PAF comercial.

Estudos anteriores demostraram que o PAF não tem efeito significativo na

proliferação celular de Herpetomonas muscarum muscarum (Lopes et al.,

1997). Curiosamente, na figura 6 mostramos que houve uma diminuição de

30% na proliferação das células crescidas na presença tanto de PAF comercial

quanto de PAF extraído de L. chagasi em relação ao sistema controle. Isto

sugere que de maneira diferente do que acontece com o tripanossomatídeo H.

m. muscarum há uma sinalização para a diminuição do crescimento celular, o

que poderia indicar uma indução da diferenciação celular quando os parasitos

entram em contato com o PAF (Alberts et al, 2004).

Em 2001, Rosa e colaboradores demonstraram que o PAF comercial é

capaz de modular a infecção de macrófagos peritoneais de camundongos por

Leishmania amazonensis, onde a infecção foi inibida quando os macrófagos ou

ambos macrófagos e parasitos foram tratados com PAF comercial, porém

estimulada quando somente os parasitos foram tratados com PAF comercial.

Estes resultados estão de acordo com os desse estudo como podemos

observar na figura 7 onde quando tratamos L. chagasi tanto com o PAF

comercial quanto com o PAF-like isolado de L. chagasi há um aumento de

100% de infecção em relação ao controle. Podemos observar também que

25

quando tratamos os macrófagos tanto com o PAF comercial quanto com o

PAF-like isolado de L. chagasi o índice de infecção diminui em relação ao

controle, e quando tratamos os macrófagos e os parasitos tanto com o PAF

comercial quanto com o PAF-like isolado de L. chagasi o índice de infecção

promovido é reduzido, tanto com o PAF comercial quanto com o PAF isolado

de L. chagasi, em comparação com o sistema controle. Também analisamos a

sobrevivência (Figura 8) onde observamos um perfil semelhante de infecção,

mostrando que esses efeitos podem ser duradouros possivelmente

influenciando também em uma infecção mais longa.

O WEB 2086, antagonista do receptor do PAF, têm sido utilizado como

ferramenta em estudos de ligação do PAF com seu receptor. O estudo

publicado por nosso grupo onde foi isolada e identificada uma molécula com

características semelhantes ao PAF em T. cruzi também mostrou que os

efeitos promovidos pelo PAF parecem ocorrer via receptor do PAF, já que

foram revertidos na presença do WEB 2086 (Gomes et al., 2006). Além disso,

outros estudos também demontraram que o WEB 2086 reverte efeitos

promovidos pelo PAF em tripanossomatídeos, como diferenciação celular

(Lopes et al., 1997; Rodrigues et al., 2001). A figura 9 demonstra que quando

tratamos os parasitos com o WEB 2086 mais o PAF comercial ou o PAF-like

isolado de L. chagasi, há uma diminuição do índice de infecção, quando

comparamos com os parasitos tratados apenas com PAF comercial ou o PAF-

like isolado de L. chagasi, indicando a participação do receptor na ação do PAF

sobre o parasito. E quando tratamos os macrófagos com o PAF comercial ou o

PAF-like isolado de L. chagasi e mais o WEB 2086, há a reversão de todo o

efeito promovido pelo PAF comercial ou o PAF-like isolado de L. chagasi,

indicando também uma participação do receptor na sinalização promovida pelo

PAF nos macrófagos.

A fosforilação e a defosforilação de proteínas têm papel fundamental no

controle de fenômenos biológicos na maioria dos organismos (Hunter, 1995),

incluindo protozoários da família Trypanosomatidae (Parsons et al., 1993).

Nas vias de sinalização é o receptor que transmite a informação para dentro

da célula, através da membrana plasmática, por intermédio das proteínas G,

que são ativadas quando se ligam a guanosina trifosfato (GTP) (Derynck &

Wagner, 1995). É intrigante o fato de que o sequenciamento dos genomas de

26

T.brucei, T.cruzi e L. major demonstrou ate o momento a ausência de qualquer

isótopo da proteína G. Apesar de não podermos explicar ainda como temos a

ação do PAF em tripassomatideos, na ausência da proteina G, sugerimos a

expressão de diferentes proteínas para atuar junto ao estimulo do PAF. Como

podemos observar na figura 10, o perfil de expressão de proteínas apresenta

mudanças nas proteínas expressas principalmente entre o sistema controle e

os sistemas tratados com PAF comercial ou com PAF-like extraído de L.

chagasi.

VI. CONCLUSÃO

O papel fisiológico de PAF e lipídios semelhantes à PAF precisa ser melhor

compreendido. De acordo com nossos resultados até agora, podemos

hipotetizar que a molécula lipídica produzida por L. chagasi, como o PAF

comercial, de funcionar como reguladora da infectividade de L. chagasi na

célula hospedeira, efeito que parece ocorrer via receptor, além disso, este

lipídeo isolado de Leishmania também age como modulador da proliferação

celular deste parasita e potencial modulador de vias de sinalização.

Obviamente esta molécula não é a única responsável por estes eventos,

contudo, o envolvimento de um composto intrínseco com efeitos importantes na

infectividade desses parasitas é de grande contribuição para o conhecimento

da biologia celular deste parasito.

O estudo dos efeitos do PAF produzido por Leishmania chagasi em

processos como proliferação, interação com células de mamífero e sinalização

celular pode ser bastante interessante para um maior entendimento do ciclo de

vida destes parasito. Além disso, o estudo das vias de sinalização induzidas

por PAF, assim como o mapeamento das proteínas envolvidas, parecem ser

bastante promissores como potencial alvo para drogas contra leishmaniose

visceral.

27

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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