1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM RECURSOS NATURAIS ILZO COSTA PESSOAPERFIL DE RESISTNCIA A ANTIMICROBIANOS DE BACTRIASISOLADAS DE AMOSTRAS DE GUAS DAS ESCOLAS ESTADUAIS DE BOA VISTA - RRBoa Vista - RR2011

2. ILZO COSTA PESSOAPERFIL DE RESISTNCIA A ANTIMICROBIANOS DE BACTRIASISOLADAS DE AMOSTRAS DE GUAS DAS ESCOLAS ESTADUAIS DE BOA VISTA - RR Dissertao apresentada ao Programa de Ps- graduao em Recursos Naturais, Universidade Federal de Roraima, como parte dos requisitos para a obteno do ttulo de Mestre em Recursos Naturais na rea de Bioprospeco. Orientador: Prof. Dr. Marcos Jos Salgado Vital.Boa Vista - RR 2011 3. Dados Internacionais de Catalogao-na-publicao (CIP) Biblioteca Central da Universidade Federal de RoraimaP475p Pessoa, Ilzo Costa.Perfil de resistncia antimicrobianos de bactrias isoladas de amostrasde guas das Escolas Estaduais de Boa Vista-RR / Ilzo Costa Pessoa -Boa Vista, 2011.97 f. : il.Orientador: Prof. Dr. Marcos Jos Salgado Vital . Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Roraima,Programa de Ps-Graduao em Recursos Naturais.1 Qualidade da gua. 2 Bactrias heterotrficas. 3 Coliformes. 4 Resistncia. 5 Antimicrobianos. I Ttulo. II Vital, Marcos Jos Salgado. (orientador)CDU 556.115 4. In memoriamA minha me Francisca Costa Pessoa 5. AGRADECIMENTOSAo Programa de Ps-graduao em Recursos Naturais da Universidade Federal deRoraima, pela oportunidade.Ao Prof. Dr. Marcos Jos Salgado Vital por tudo o que fez por esse trabalho, pelaorientao crtica, pelo seu profissionalismo, sempre aconselhando-me para amelhor direo a ser seguida.Aos professores do Programa de Ps-graduao, pela generosidade ao dividiremsua experincia e conhecimentos.Aos integrantes das bancas de defesa, pelas contribuies para o aperfeioamentodeste trabalho.Aos colegas de turma pela amizade.A minha companheira Francilvana.Aos meus filhos Diego, Gabriel e Chico.Aos estagirios do Laboratrio de Microbiologia Jeffson Frana e Rodrigo Lopes.A mestranda Andria Alencar pelo apio.A Secretaria de Estado da Educao, Cultura e Desportos.Ao Centro de Geotecnologia, Cartografia e Planejamento Territorial.s biomdicas Mrcia Brazo Silva Brando, Ctia Alexandra Ribeiro Menezes e ofarmacutico bioqumico Gabriel Turmero Cidade, do Laboratrio Central LACEN-RR, pelo profissionalismo, amizade e auxlio na identificao das espcies debactrias e nas anlises dos antibiogramas.A todos que de uma forma ou de outra ajudaram, acreditaram e me incentivaram. 6. A importncia dos infinitamente pequenos infinitamente grande. (Louis Pasteur) 7. RESUMOAtualmente, uma das maiores preocupaes da humanidade com a disponibilidadee qualidade da gua. A explorao inadequada das fontes acarreta a contaminaodas guas superficiais e subterrneas que se tornam um risco para a sade pblica.Dentre as fontes biolgicas de contaminao da gua, incluem-se as bactrias, queso responsveis por inmeras doenas, sendo frequentemente tratadas comantimicrobianos. O amplo uso de antimicrobianos na medicina humana e naproduo animal tem resultado no aumento do nmero de bactrias comensais epatognicas resistentes a agentes antimicrobianos, fato que nos ltimos anos vemse tornando um dos principais problemas de sade pblica. O presente trabalhoresulta do interesse pelo estudo da qualidade da gua consumida pelos alunos de20 escolas estaduais da rede pblica de Boa Vista RR, bem como obter o perfil deresistncia a antimicrobianos de bactrias isoladas a partir de diferentes amostrasde guas, coletadas nessas escolas. No perodo de outubro de 2010 a abril de 2011,foram coletas 40 amostras de guas de torneiras das copas e 40 amostras de guasde bebedouros, as quais foram submetidas avaliao microbiolgica. Adeterminao dos coliformes totais e termotolerantes foi realizada por meio datcnica dos tubos mltiplos com 3 diluies e srie de 5 tubos. Para a deteco debactrias heterotrficas uso-se o mtodo pour plate, de acordo com as normaspreconizadas no Standard Methods for the Examination of Water and Wastwater. Oisolamento e a identificao dos isolados bacteriano foi realizada no LACEN-RRutilizando-se a srie bioqumica. Para a avaliao da resistncia aosantimicrobianos, utilizou-se a metodologia de difuso de disco, seguindo as normasestabelecidas pelo CLSI. Das amostras de guas que recebem tratamento completo,10% apresentaram resultados positivos para coliformes totais e nas amostras degua clorada, 20% apresentaram resultados positivos para coliformes totais e 2,5%resultado positivo para coliformes termotolerantes, o que as tornam imprpria para oconsumo humano. A contagem de bactrias heterotrficas variou de 1,4 x 10 a 3,6 x102 UFC/mL de gua, no ultrapassando o estabelecido pela Portaria 518/2004/MS.Foram identificadas as seguintes bactrias Gram-negativas (66,7%): Acinetobacterspp., C. violacea, Cocobacilos spp., E. aerogenes, E. coli, K. ozaenae, Leptothrixssp. e Bacilo Gram-negativo no fermentador de glicose, as bactrias Gram-positivas (33,3%), identificadas foram: B. subtilis, Micrococcus spp., S. aureus eStaphylococcus spp. Os resultados dos testes de sensibilidade aos antibiticosrevelaram que a maioria das bactrias isoladas foi resistente a ampicilina (68,2%),27,3% apresentaram resistncia a oxacilina e 22,7% foram resistentes a eritromicinae meropenem. As cepas de S. aureus isoladas das amostras de guasapresentaram maior ndice MAR (0,61) entre as bactrias Gram-positivas, enquantoque nas bactrias Gram-negativas, as cepas que apresentaram maior ndice MARforam as cepas de E. coli, com ndice 0,61. Os resultados comprovam a ocorrnciade instabilidade no padro de qualidade da gua fornecida a populao de Boa Vista RR seja no tratamento, na distribuio ou no armazenamento da gua. Alm deconstatar a presena de bactrias multirresistentes a antibiticos, o que representarisco populao.Palavras-chaves: Qualidadeda gua. Bactrias heterotrficas. Coliformes.Resistncia. Antimicrobianos. 8. ABSTRACTOne of the main concerns of humanity nowadays is water: its availability and itsquality. An inadequate exploitation of the sources results in the contamination of bothsuperficial and deep waters, which become a public health hazard. Bacteria are oneof these biological sources of water contamination, responsible for countlessdiseases which are treated with antimicrobials. The widely spread use ofantimicrobials in human medicine along with animal production had resulted in asteady increase in the number of pathogenic and commensal bacteria resistant toantimicrobial agents, which in recent years are becoming one of the main problemsof public health. This paper is a result of an interest in studying the quality of waterconsumed by the students of 20 state schools of the public school system of BoaVista RR, as well as trying to obtain a profile of antimicrobial resistance of thebacteria isolated in different water samples collected at these schools. BetweenOctober 2010 and April 2011, 40 water samples were collected from taps inlunchrooms, along with 40 samples from drinking wells, and all of them weresubmitted to microbiological examination. Using the multiple tubes technique, with 3dilutions and a series of 5 tubes, we determined the total number of coliforms andthermotolerant coliforms. In agreement with the rules of the Standard Methods forthe Examination of Water and Wastewater, the pour plate method was used at theCBio UFRR to detect heterotrophic bacteria. Isolation and identification ofmicroorganisms was done at LACEN RR, using the biochemical series. Inevaluating the resistance to antimicrobials, disk diffusion methods were used, inagreement with the established rules of the CLSI. In water samples that receive fulltreatment, 10% tested positive for total coliforms and, in chlorinated water samples,20% tested positive for total coliforms and 2,5% for thermo-tolerant coliforms, whichmakes them inadequate for human consume. The counting of heterotrophic bacteriawent from 1,4 x 10 to 3,6 x 10 CFU/mL of water, not surpassing what is establishedin the ordinance 518/2004/MS. The following Gram-negative bacteria (66,7%) wereidentified: Acinetobacter spp., C. violacea, Cocobacilos spp., E. aerogenes, E. coli,K. ozaenae, Leptothrix ssp. and Gram-negative glucose non fermenting bacillus.The Gram-positive bacteria identified were: B. subtilis, Micrococcus spp., S. aureusand Staphylococcus spp. The results of antibiotic sensibility tests revealed that mostof the isolated bacteria were resistant to ampicilin (68,2%), 22,3% showed resistanceto oxacilin and 22,7% were resistant to both eritromicin and meropenem. In Gram-positive bacteria, the growths of S. aureus isolated from water samples showed thegreatest MAR index (0,61), while E. coli growths were the ones who showed thegreatest MAR index in Gram-negative bacteria (also 6,1%). Results prove a greatinstability in the quality of water provided to the Boa Vista - RR population, being inits treatment, distribution or containment, as well as showing the presence of bacteriaresistant to multiple antibiotics, which is a health hazard to the public.Keywords: Waterquality. Heterotrophic bacteria. Coliforms. Resistance.Antimicrobials. 9. LISTA DE FIGURASFigura 1 Antibiticos e respectivos mecanismos de resistncia nosquais esto envolvidos ............................................................. 27Figura 2 Escolas, localizaes e pontos, onde as amostras de guaque recebem gua com tratamento completo foram coletadas 44Figura 3 Escolas, localizaes e pontos, onde as amostras de guaque recebem gua clorada foram coletadas ............................ 44Figura 4 Mapa com a localizao das escolas estaduais onde foramrealizadas as coletas das amostras de gua ........................... 46Figura 5 Procedimentos para coleta de amostra de gua em torneira ..47Figura 6 Teste presuntivo: caldo lactosado ............................................ 48Figura 7 Tcnica da fermentao em tubos mltiplos ............................ 49Figura 8 Teste confirmativo: caldo EC ................................................... 50Figura 9 Teste confirmativo: caldo V.B .................................................. 50Figura 10 Contagem das unidades formadoras de colnias (UFC) ......... 51Figura 11 gar MacConkey ...................................................................... 52Figura 12 gar sangue .............................................................................52Figura 13 Teste TSI .................................................................................. 53Figura 14 Teste da lisina .......................................................................... 55Figura 15 Teste do citrato Simmons ........................................................55Figura 16 Teste da motilidade .................................................................. 56Figura 17 Teste do indol ........................................................................... 56Figura 18 Prova da citocromo-oxidase ..................................................... 57Figura 19 Teste da urase .......................................................................58Figura 20 Antibiticos, local de ao de concentraes utilizadas paraos antibiogramas ......................................................................59 10. LISTA DE GRFICOSGrfico 1 Densidade de coliformes totais, expressa em Nmero MaisProvvel (NMP/100 mL) em amostras de gua tratada comclorao, coletadas nas escolas estaduais localizadas emBoa Vista RR .......................................................................... 62Grfico 2 Densidade de coliformes totais, expressa em Nmero MaisProvvel (NMP/100 mL) em amostras de gua comtratamento completo, coletadas nas escolasestaduaislocalizadas em Boa Vista RR ................................................. 64Grfico 3 Densidade de bactrias heterotrficas presentes em amostrasde gua tratada com clorao, coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................65Grfico 4 Densidade de bactrias heterotrficas presentes em amostrasde gua tratada com clorao, coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................66Grfico 5 Densidade de bactrias heterotrficas presentes em amostrasde gua com tratamento completo, coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................67Grfico 6 Densidade de bactrias heterotrficas presentes em amostrasde gua com tratamento completo, coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................68Grfico 7 Porcentagens de bactrias Gram-negativas e Gram-positivasisoladas a partir de amostras de guas coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ............................... 72Grfico 8 Incidncia das bactrias Gram-negativas, isoladas a partir deamostrasdegua,coletadasnas escolas estaduaislocalizadas em Boa Vista RR ................................................. 72Grfico 9 Incidncia das bactrias Gram-positivas, isoladas a partir deamostrasdegua,coletadasnas escolas estaduaislocalizadas em Boa Vista RR ................................................. 76 11. LISTA DE TABELASTabela 1 Resistncia das bactrias heterotrficas aos antibiticos testados ..................................................................................... 78Tabela 2 ndice MAR e porcentagem de padres de resistncia entre bactriasheterotrficas,Gram-positivas,isoladasnas amostrasdegua,coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................................. 80Tabela 3 ndice MAR e porcentagem de padres de resistncia entre bactriasheterotrficas, Gram-negativas, isoladasnas amostrasdegua,coletadas nas escolasestaduais localizadas em Boa Vista RR ................................................. 81 12. LISTA DE SIGLASAPHA American Public Health AssociationASM American Society MicrobilogyCAER Companhia de gua e Esgoto de RoraimaCBio Centro de Estudos da BiodiversidadeCIM Concentrao inibitria mnimaCETESB Companhia de Tecnologia e SaneamentoC.L Caldo lactosadoCLSI Clinical and Laboratory Standards InstituteC.T.I Centro de Tratamento IntensivoC.V.B. Caldo verde brilhanteDNA cido desoxirribonucleicoEAEC Escherichia coli enteroaderenteE. C. Caldo Escherichia coliEHEC Escherichia coli enterohemorrgicaEIEC Escherichia coli enteroinvasoraEMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuriaEPEC Escherichia coli enteropatognicaETEC Escherichia coli enterotoxignicaIBGE Instituto Brasileiro de Geografia e EstatsticaITAL Instituto de Tecnologia de alimentosITU Infeco do trato unirioLACEN-RR Laboratrio Central de RoraimaMRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina/oxacilinaMS Ministrio da SadeNMP Nmero Mais ProvvelOF Oxidao/fermentaoOMS Organizao Mundial da SadeOPAS Organizao Pan-Americana de SadePBP Protenas ligadora de PenicilinaPCA Plate Count AgarpH Pontencial HidrogeninicoRNA cido ribonuclico 13. SCN Staphylococcus coagulase negativasTSI Triple Sugar Iron AgarUFC Unidade Formadora de ColniaUFRR Universidade Federal de RoraimaUTI Unidade de terapia intensivaVISA Staphylococcus aureus com sensibilidade reduzida a vancomicinaVRE Enterococcus vancomicina resistenteWHO World Health Organization 14. SUMRIO1 INTRODUO ........................................................................... 141.1 Qualidade da gua .....................................................................141.2 Bactrias do grupo coliforme ...................................................... 201.3 Bactrias heterotrficas .............................................................. 211.4 Microbiota normal do corpo humano .......................................... 221.5 Bactrias patognicas de interesse mdico ............................... 221.5.1 Enterobacteriaceae ....................................................................231.5.2 Staphylococcus ..........................................................................241.6 Antimicrobianos e resistncia bacteriana ................................... 261.7 Mtodos e tcnicas disponveis para deteco de micro-organismos ................................................................................. 361.7.1 Tcnica de tubos mltiplos ......................................................... 371.7.2 Tcnica de presena e ausncia ................................................ 371.7.3 Plaqueamento em meio slido ...................................................371.7.3.1 Plaqueamento em superfcie (spread plate) ............................ 381.7.3.2 Plaqueamento em profundidade (pour plate) .......................... 381.7.4 Tcnica de membrana filtrante ................................................... 391.7.5 Mtodos rpidos de deteco e identificao de bactrias ......391.7.5.1 Tcnica de substrato cromognico ............................................401.7.6 Provas bioqumicas ....................................................................401.8 Determinao da susceptibilidade aos agentes antimicrobianos 402 OBJETIVOS ............................................................................... 432.1 Objetivo geral ............................................................................. 432.2 Objetivos especficos .................................................................433 MATERIAL E MTODOS ..........................................................443.1 rea de estudo ........................................................................... 443.2 Amostragem ............................................................................... 453.3 Anlises bacteriolgicas ............................................................. 473.3.1 Deteco de coliformes .............................................................. 483.3.1.1 Determinao de coliformes totais e termotolerantes ................ 493.3.2 Determinao da densidade de indicadores ou N.M.P. ............. 50 15. 3.3.3 Deteco de bactrias heterotrficas ......................................... 503.3.4 Isolamento das bactrias ...........................................................513.3.4.1 Teste do manitol ......................................................................... 523.3.4.2 Identificao das bactrias Gram-negativas .............................. 533.4 Avaliao da susceptibilidade aos antimicrobianos ..................583.5 Classificao dos isolados resistentes amltiplosantimicrobianos (MAR) ............................................................... 603.6 Tratamento e anlise estatstica dos dados ...............................604 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................. 614.1 Qualidade da gua submetida clorao .................................. 614.2 Qualidade da gua submetida ao tratamento completo ............. 634.3 Bactrias heterotrficas isoladas das amostras de gua .........654.4 Caracterizao dos isolados ......................................................714.5 Resistncia aos antimicrobianos ................................................ 784.5.1 Resistncia das bactrias Gram-positivas aos antimicrobianos794.5.2 Resistncia das bactrias Gram-negativas aos antimicrobianos 804.5.3 Bactrias multirresistentes aos antimicrobianos.........................815 CONCLUSES .......................................................................... 83REFERNCIAS .......................................................................... 84ANEXOS .................................................................................... 98 16. 141 INTRODUOA gua essencial para a vida e todos os esforos devem ser feitos paragarantir sua qualidade, do contrrio, a populao estar exposta ao risco dedoenas. Durante sculos, considerou-se que as fontes de gua eram inesgotveis,porm, o grande crescimento da populao mundial, o desenvolvimento industrial etecnolgico, a urbanizao e a expanso agrcola comprometem a capacidade deautodepurao das guas. As fontes de contaminao podem ser fsicas, qumicas ebiolgicas, tais como: esgotos sem tratamento que so lanados em rios e lagos;aterros sanitrios que afetam os lenis freticos, os defensivos agrcolas queescoam com a chuva sendo arrastados para os rios e lagos, os garimpos quelanam produtos qumicos, como o mercrio, em rios e crregos e as indstrias queutilizam os rios como carreadores de seus resduos txicos (EMBRAPA, 1994;GLEESON; GRAY, 1997; BOMFIM et al., 2007).Dentre as fontes biolgicas de contaminao da gua, destacam-se asbactrias, que podem causar inmeras doenas que so tratadas com antibiticos.O uso amplo e indiscriminado destes tem levado ao aumento de bactriasmultirresistentes, o que vem se tornando um dos principais problemas de sadepblica (SORUM; ABE-LUND, 2002; RIVERA-TAPIA, 2003). A presena de cepasbacterianas multirresistentes em guas para consumo humano pode representarriscos sade pblica. Desta maneira, a circulao de genes de resistncia nasguas pode representar um fator de risco para os consumidores. Neste contexto opresente trabalho tem como objetivo caracterizar microbiologicamente amostras degua e testar a sensibilidade das bactrias isoladas aos antibiticos. A importnciadesse estudo se d principalmente pelo aumento considervel dos perfis deresistncia bacteriana dos agentes causadores de doenas. Fato este constatadona presente pesquisa, desta forma, os resultados obtidos nessa investigao podersubsidiar as futuras discusses acerca das polticas publicas de sade do estado.1.1 Qualidade da guaA gua encontrada em cerca de 70% do planeta, sendo que 97,4% do totalso formadas por guas salgadas, 1,8% esto congeladas e 0,8% correspondem s 17. 15guas doces (TANCREDI; CERQUEIRA; MARINS, 2002) desta parcela, cerca de97% se encontra em aquferos subterrneos e 3% em superfcie (NASCIMENTO etal., 2000). A gua um recurso natural escasso, indispensvel para a vida e o exerccioda maioria das atividades econmicas; insubstituvel, no amplivel por meravontade do homem, irregular em sua forma de apresentao no tempo e no espao,facilmente vulnervel e suscetvel de usos sucessivos. Desta forma, a gua constituirecurso unitrio, que se renova mediante o ciclo hidrogeolgico e que conserva, aefeitos prticos, uma magnitude quase constante dentro de cada uma das baciashidrogrficas (BRASIL, 1985). Sabe-se que a demanda de gua pelo homem cresce constantemente. Comocausa deste fenmeno, pode-se mencionar o aumento da populao mundial e, emespecial, a concentrao populacional nas cidades. Assim, a satisfao da demandade gua representa grave problema, pois alm do enorme volume consumido edesperdiado, o produto restitudo na maioria das vezes, ao meio natural, semqualquer tratamento prvio, sem iseno de risco sade e ao prprio ambiente(GERMANO; GERMANO, 2001). A explorao inadequada das fontes conduz contaminao das guassuperficiais e subterrneas, que se tornam, assim, um risco permanente para asade (CALAZANS et al., 2004). o que acontece com a poluio e a contaminaoprovocadas pelos efluentes domsticos, pblicos e industriais, lanados diretamentenos cursos de gua. A gua, portanto, um problema de segurana nacional ecomo tal merece a adoo de estratgias direcionadas para cada um de seusaspectos particulares, todos eles de relevncia para o desenvolvimento social eeconmico dos povos, a compreendida a sade publica (GERMANO; GERMANO,2001). A gua tem influncia direta sobre a sade, sobre a qualidade de vida e sobreo desenvolvimento do ser humano. Para a Organizao Mundial da Sade (OMS) eseus pases membros,todas as pessoas,em quaisquer estgios dedesenvolvimento e condies scio-econmicas tm o direito de ter acesso a umsuprimento adequado de gua potvel e seguro. Seguro, neste contexto, refere-sea uma oferta de gua que no represente risco significativo sade, que tenhaquantidade suficiente para atender a todas as necessidades domsticas, que sejadisponvel continuamente e que tenha um custo acessvel. Essas condies podem 18. 16ser resumidas em cinco palavras-chave: qualidade, quantidade, continuidade,cobertura e custo (OPAS, 2009). Segundo a OMS, no Brasil morrem 29 pessoas ao dia por doenasdecorrentes da qualidade da gua e do no tratamento de esgotos e estima-se quecerca de 70% dos leitos dos hospitais estejam ocupados por pessoas quecontraram doenas transmitidas pela gua (ARAJO JUNIOR, 2009). Os sistemasde saneamento bsico adequado e a gua tratada podem reduzir em 20% a 80% aincidncia de doenas infecciosas, inibindo a sua gerao e interrompendo a suatransmisso (UNESCO, 2001; OPAS, 2009). Em todo o Planeta, crescente o aumento dos nveis de contaminao dagua, provocada pela degradao dos recursos hdricos em razo dos seus usosmltiplos (abastecimento pblico, irrigao, uso industrial, navegao, recreao eagricultura), embora estas atividades variem de acordo com a organizaoeconmica e social de cada regio. No Brasil, o cenrio atual caracterizado pelaprogressiva contaminao das guas superficiais e subterrneas em decorrnciadas deficincias de infraestrutura dos servios de esgotamento sanitrio (MOTA,1997). O ambiente aqutico, independentemente de sua profundidade, pode servircomo habitat para muitos micro-organismos de vida livre e no parasitria queextraem da gua os elementos indispensveis sua sobrevivncia, e por micro-organismos parasitrios e/ou patognicos, que utilizam a gua como veculo paratransmisso de doenas, podendo contaminar a gua, por meio das excretas oudejetos intestinais do homem e outros animais de sangue quente, constituindo assimum perigo sanitrio potencial (MOTA, 1997; SOARES; MAIA, 1999; FREITAS;BRILHANTE; ALMEIDA, 2001; MACDO, 2001; CEAR, 2004). As doenas transmitidas ao homem atravs da gua decorrem de suacontaminao por excretas de animais, do prprio homem, ou mesmo da presenade substncias qumicas nocivas sade humana (NASCIMENTO et al., 2000).Essa contaminao vem ocorrendo ao longo dos anos, sendo causada pelocrescente desenvolvimento industrial, pelo crescimento demogrfico e pelaocupao do solo de forma intensa e acelerada, aumentando consideravelmente orisco de doenas de transmisso hdrica (GUILHERME; SILVA; OTTO, 2000). 19. 17A qualidade da gua que consumida pela populao depende de diversosfatores tais como: a seleo e proteo eficaz e permanente das origens da gua; otratamento adequado da gua; a correta concepo, construo e explorao dossistemas de distribuio; a manuteno das redes de tubagens e dos reservatriosde armazenamento; o diagnstico peridico e sistemtico da qualidade da gua que distribuda aos consumidores e a realizao de aes corretivas que o diagnsticoevidencie como necessrias (PETGNAT et al., 2006).Segundo Arcuri, 2000 o controle da qualidade da gua para consumo humanoconstitui uma preocupao dominante para muitas entidades gestoras de sistemasde abastecimento de gua de todo o mundo. Para que se atinja o objetivo decontrolar a qualidade da gua distribuda, necessrio utilizar procedimentos derastreio eficientes e economicamente viveis.De acordo com Chaves (2004), o modo mais eficiente de diagnosticar aqualidade pretendida da gua, medir sistematicamente as concentraes dos seusparmetros. Para isso deve-se proceder realizao de anlises fsicas, qumicas emicrobiolgicas da gua, com uma frequncia adequada, em todo o sistema deabastecimento, desde a origem at a distribuio, incluindo todas as etapas dotratamento. Esses parmetros so indicadores da qualidade da gua e constituemimpurezas quandoalcanamvalores superiores aos estabelecidos paradeterminados usos (MOTA, 1997).As bactrias patognicas encontradas na gua so principalmente aspertencentes aos gneros Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia, Campylobacter eEscherichia (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997).Algumas espcies comoEscherichia coli e outras relacionadas com os coliformes, como Enterococus eClostridium perfringens, so habitantes normais do intestino grosso do homem eanimais, estando presente na matria fecal (SOARES; MAIA, 1999).A avaliao da presena de organismos patognicos na gua determinadapela presena ou ausncia de um organismo indicador e sua respectiva populao.O isolamento e a identificao de cada tipo de micro-organismo exige umametodologia diferente e a ausncia ou presena de um patgeno no exclui apresena de outros (LEITO et al.,1988).De acordo com Franco e Landgraf (2004), indicadores microbianos sogrupos ou espcies de micro-organismos que, quando presentes em um alimento,podem fornecer informaes sobre a ocorrncia de contaminao, acerca da 20. 18possvel presena de patgenos ou a respeito da deteriorao potencial do alimento,alm de poderemindicar condies sanitrias inadequadasdurante oprocessamento, produo ou armazenamento. Os micro-organismos indicadores so mais comumente utilizados para avaliara segurana e a higiene alimentar do que a qualidade (FORSYTHE, 2002). SegundoForsythe (2002) e Franco e Landgraf (2004), para um indicador da qualidade dagua ser considerado ideal importante observar algumas caractersticas, taiscomo, ser aplicvel a todos os tipos de gua, ter uma populao mais numerosa noambiente que os patgenos, sobreviver melhor que os possveis patgenos e serdetectado por uma metodologia simples e barata. O indicador ideal de contaminaofecal deveria preencher, alm dos requisitos anteriormente citados, os seguintes: tercomo habitat natural apenas o trato intestinal humano ou de outros animaishomeotrmicos, no se multiplicando facilmente fora deste ambiente, ser detectvelde forma fcil e rpida, estar presente em gua poluda e ausente em gua potvel,estar presente na gua quando os micro-organismos patognicos tambm esto,sobreviver mais tempo na gua do que os patgenos, apresentar baixapatogenicidade e estar presente em maior nmero do que os patognicos. Os organismos do grupo coliforme so bons indicadores microbianos daqualidade da gua potvel em razo, principalmente, da facilidade de deteco econtagem (WENDPAP; DAMBROS; LOPES, 1999). A Portaria n 518/2004/MS,estabelece a determinao da presena de coliformes totais e termotolerantes (E.coli) e a contagem de bactrias heterotrficas em 20% das amostras mensais degua tratada, no sistema de distribuio, no devendo essa contagem exceder 500UFC/mL (BRASIL, 2004). Segundo van der Wende e Characklis, 1990, em guas para consumohumano os grupos de micro-organismos potencialmente patognicos encontram-sepresentes em pequenas quantidades. No entanto, podem surgir variaes sbitasdos seus valores em decorrncia de diversas causas: atravessamento, quando oaumento do nmero de bactrias na rede de distribuio resulta de bactrias viveisque conseguiram atravessar o processo de desinfeco e tratamento; crescimento,quando o aumento do nmero de bactrias no sistema se deve proliferao debactrias jusante do processo de desinfeco, que pode ocorrer tanto em biofilmes(crescimento nas superfcies) como na fase lquida; retrocontaminao, aumento da 21. 19quantidade de micro-organismos pela entrada destes em pontos de sada de gua eposterior progresso em sentido contrrio do movimento da gua circulante.A ocorrncia de episdios de contaminao da gua para consumo deve-secada vez menos ao atravessamento ou a retrocontaminao ou qualquer outra fontede contaminao externa, uma vez que os sistemas de tratamento e distribuio socada vez mais eficientes. Assim, o crescimento microbiano, principalmente ocrescimento sob a forma de biofilmes, assume um papel primordial nas alteraessbitas da qualidade da gua nos sistemas de distribuio de gua potvel,resultante da eroso e do desprendimento de pores do biofilme para a guacirculante, influenciando diretamente a qualidade da gua (PETGNAT et al., 2006).Segundo Chaves, 2004, a definio mais usual de biofilme a de uma matrizpolimrica de aspecto gelatinoso, aderida a uma superfcie slida, quase sempreimersa em meio lquido, constituda essencialmente por micro-organismos, pelassubstncias polimricas extracelulares que estes excretam e por gua. As clulasmicrobianas aderem firmemente a quase todas as superfcies imersas em soluoaquosa. Estas clulas aderidas crescem, reproduzem-se e produzem substnciaspolimricas extracelulares, que se estendem para alm da superfcie das clulas,formando um emaranhado polimrico que envolve toda a biomassa aderida,assumindo o conjunto a designao de biofilme (CHARACKLIS; WILDERER, 1989).Os biofilmes desempenham um papel importante na natureza e em processostecnolgicos. Do ponto de vista do interesse do Homem podem ser benficos ouprejudiciais, donde resulta a necessidade do seu estudo para poder desenvolverestratgias no sentido de melhorar as suas caractersticas, caso ele seja benfico,ou para elimin-lo ou inibir a sua formao, quando a sua ao prejudicial(CHAVES, 2004).Como exemplos de biofilmes benficos temos aqueles que se acumulam emambientes naturais nos depsitos dos rios, lagos ou ambientes marinhos, e que sedesenvolvem em associao com as razes de algumas plantas fornecendo-lhesalguns nutrientes. So tambm biofilmes benficos aqueles que so utilizados embiotecnologia ambiental com grande sucesso no tratamento de efluentes, removendopoluentes orgnicos e inorgnicos de guas contaminadas. Na indstria alimentar osbiofilmes apresentam inmeras vantagens, podendo ser utilizados na produo dealimentos fermentados, como por exemplo, a produo de vinagre (ARCURI, 2000). 22. 20Infelizmente, nem sempre as potencialidades dos biofilmes constituemvantagens para o Homem. Na maioria das situaes, a adeso de micro-organismosa superfcies slidas indesejvel, pois, de uma maneira geral, est associada deteriorao das superfcies e/ou ambiente circundante. Nas cincias mdicas, osbiofilmes apresentam-se geralmente com um carter nocivo uma vez que estoassociados a um grande nmero de problemas de sade, tais como infeces emtecidos, infeces do trato urinrio, infeces e consequente rejeio de prteses eimplantes e infeces da placa dentria (NEU; van der MEI; BUSSCHER, 1992;WILCOX, 1993).Nos sistemas de distribuio de gua potvel, a formao debiofilme, e principalmente o seu desprendimento, constitui um fator de diminuio daqualidade da gua (LECHEVALLIER; MCFETERS, 1985).1.2 Bactrias do grupo coliformeO grupo dos coliformes totais formado por diversas bactrias pertencentes famlia Enterobacteriaceae, incluindo os gneros Citrobacter, Enterobacter,Klebsiella e Escherichia (SILVA JR., 2002). Os quais, com exceo do gneroCitrobacter, constituem o grupo dos coliformes termotolerantes, importante grupoindicador de contaminao fecal na gua (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997).Os coliformes totais so bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbiosfacultativos, no formadores de esporos. Sua identificao se baseia na capacidadede fermentao de lactose, com formao de gs, aps incubao por 24 a 48horas, entre 35C e 37C (FRANCO; LANDGRAF, 1999; FORSYTHE, 2002; SILVAJR., 2002; BRASIL, 2004). A utilizao dos coliformes totais como indicadores decontaminao fecal no possvel, uma vez que bactrias dos gneros Citrobacter,Enterobacter e Klebsiella podem ser tambm encontradas no solo e em vegetais(FRANCO; LANDGRAF, 1999).Os coliformes termotolerantes, antes denominados coliformes fecais, formamum subgrupo dos coliformes totais, caracterizado pelas bactrias que mantm acapacidade de fermentar lactose, ainda com produo de gs, em temperatura entre44C e 45,5C (FRANCO; LANDGRAF, 1999; FORSYTHE, 2002).A espcie bacteriana E. coli tem como habitat primrio o trato intestinal dohomem e demais animais homeotrmicos, estando sempre presente nas fezes 23. 21desses seres, por esse motivo, tem sido utilizada como indicador de contaminaofecal. Existem vrias crticas e algumas desvantagens apontadas sobre o uso decoliformes como indicadores de poluio fecal, particularmente o fato de sua poucatolerncia toxidade da gua do mar e ao procedimento de clorao em relao aalguns patgenos mais resistentes. Nenhum indicador perfeito e aquelesdestinados a determinar a contaminao fecal certamente no funcionamadequadamente como indicadores de poluio de outras origens. Assim, a utilizaodos coliformes e de outros indicadores fecais devem ser complementada com autilizao de indicadores adicionais que compensem a ineficincia destes nomonitoramento de poluio diversificada. Desta forma, a legislao brasileirarecomenda que se utilizem as bactrias heterotrficas (mesfilas) e Pseudomonasaeruginosa (MACDO, 2001), como indicadores complementares.1.3 Bactrias heterotrficas O termo bactria heterotrfica engloba todas as bactrias que usamnutrientes orgnicos para crescimento. Essas bactrias esto universalmentepresentes em todos os tipos de gua, em alimentos, solo, vegetao e ar (ALLEN;REASONER, 2004). Para a contagem desses micro-organismos em gua, soutilizadas as tcnicas de contagem padro em placas e contagem total em placas(WHO, 2003). A presena de elevados nmeros de bactrias heterotrficas em guasenvasadas pode ser decorrente da microbiota natural da fonte. Estas bactriaspodem se multiplicar aps o envase, resultando em elevadas contagens. A ausnciade um desinfetante residual, como o cloro, e perodos longos de armazenamento temperatura ambiente, ou mais alta, podem resultar na elevao do nmero dessasbactrias at o consumo (LI; LACROIX; POWELL, 2001). Vrios gneros de bactrias heterotrficas tm sido encontrados em guaenvasada, incluindo Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas,Alcaligenes,Arthrobacter, Caulobacter, Corynebacterium, Flavobacterium e Pseudomonas(MANAIA et al., 1990). Algumas destas bactrias heterotrficas produzem fatores de 24. 22virulncia e podem agir como patgenos oportunistas (PAVLOV; GRABOW;EHLERS, 2004).Estudos com gua de torneira, filtrada e no filtrada, mostraram associaoentre contagens elevadas de bactrias heterotrficas e gastroenterites (PAYMENTet al., 1991). Os indivduos que so especialmente suscetveis a infeces porbactrias heterotrficas so aqueles de pouca idade, os imunologicamentedebilitados, os idosos, os transplantados, as gestantes, os portadores de doenasimunossupressoras, como a AIDS, alm de pessoas submetidas quimioterapia(EHLERS; PAVLOV; MLLER, 2004).1.4 Microbiota normal do corpo humanoPara Couto, Pedrosa e Nogueira (1999), toda a variedade de micro-organismos encontrados no corpo humano em qualquer stio anatmico denominada microbiota normal. Algumas bactrias so encontradas regularmenteem locais anatmicos particulares, outras esto presentes s ocasionalmente ousomente em alguns momentos da vida do hospedeiro.Embora vrios micro-organismos sejam constituintes da microbiota normal docorpo humano, alguns causam doenas ao homem e so os principais responsveispelas infeces nosocomiais, sendo considerados micro-organismos de interessemdico pela Comisso de Controle de Infeco Hospitalar. Souza (2003) concluiuque os estudos a respeito da microbiologia de agentes patognicos humanos emambientes naturais foram ampliados, porm mesmo assim, mais conhecido ocomportamento destes micro-organismos em seu ambiente especfico, ou seja, nocorpo humano.1.5 Bactrias patognicas de interesse mdicoDe acordo com Couto, Pedrosa e Nogueira (1999), os microbiologistasclassificam como micro-organismos patognicos aqueles que causam doenaspodendo ser patgenos primrios, secundrios ou oportunistas. Os patgenosprimrios so aqueles micro-organismos que, possuindo caractersticas peculiares,so capazes por si prprios, independentemente de fatores do hospedeiro, de 25. 23provocar doenas infecciosas. Geralmente, so causadoresde infecescomunitrias e raramente causam infeces hospitalares. Os patgenos secundriosdesenvolvem suas potencialidades patognicas quando h um desequilbrio narelao parasito-hospedeiro, principalmente em casos de imunoresistncia dohospedeiro.Segundo Silva (1999), as infeces podem ser causadas por bactrias,fungos, vrus ou parasitas, podendo ser endgenas ou exgenas. Nas infecesendgenas, o micro-organismo um componente da microbiota normal do paciente.As infeces endgenas podem ocorrer quando o micro-organismo aspirado dotrato respiratrio superior para o inferior ou quando ele penetra na pele ou mucosastraumatizadas ou aps processos cirrgicos. Por outro lado, nas infecesexgenas, o micro-organismo adquirido a partir do meio ambiente, como porexemplo, do solo, da gua, do ar, de objetos, de picada de insetos, etc., ou a partirde outra pessoa ou animal.1.5.1 EnterobacteriaceaeEnterobactrias so bastonetes gram-negativos, aerbios em sua maioria,que constituem os principais componentes da flora intestinal humana normal, sendorelativamente incomuns em outros locais do organismo humano (MURRAY et al,1992). As bactrias Gram-negativas possuem duas membranas uma membranaexterna e uma interna (citoplasmtica). A membrana externa das bactrias Gram-negativas evita que certos frmacos e antibiticos penetrem na clula, o que explicaparcialmente a razo por que so habitualmente mais resistentes aos antibiticos doque as bactrias Gram-positivas.A membrana externa das bactrias Gram-negativas rica numa molcula chamada lipopolissacardeo. Se uma bactria Gram-negativa entra na corrente sangunea, os lipopolissacardeos podem desencadearuma grande quantidade de sintomas, incluindo febre alta e uma descida acentuadada tenso arterial. Por essa razo os lipopolissacardeos so conhecidosfrequentemente pelo nome de endotoxinas (MERCK, 2010). As espcies deenterobactrias causadoras de infeces hospitalares incluem E. coli, Klebsiella sp.,Proteus sp., Enterobacter sp. e Serratia marcescens, representando 80% de todosos bastonetes Gram-negativos e 50% de todas as bacteremias clinicamente 26. 24significativas isoladas nos laboratrios de microbiologia. A espcie E. coli destaca-se como responsvel pela maioria das infeces produzidas por este grupo debactrias, principalmente infeces urinrias (MERCK, 2010).E. coli um bacilo Gram-negativo, anaerbio facultativo, possui exignciasnutricionais simples, fermenta a glicose e oxidase negativa. encontrada no solo,na gua e na microbiota de quase todos os animais de sangue quente, incluindo osseres humanos. Tem sido isolada de diversos stios do corpo humano, podendocausar patologias como pneumonias, meningites e infeces intestinais. Como parteda microbiota humana,esse micro-organismo tem papel importante nacontaminao fecal dos alimentos. Algumas cepas patognicas da E. coli podemproduzir uma potente endotoxina, a qual capaz de causar diarrias severas emtodos os grupos etrios. O tratamento destes pacientes infectados comantimicrobianos obrigatrio, pois caso contrrio, a infeco pode levar-los morte(MERCK, 2010).As cepas de E. coli que causam diarria so atualmente classificadas emcinco grupos: E. coli enteropatognica (EPEC), enterotoxignica (ETEC),enteroinvasora (EIEC), enterohemorrgica (EHEC) e enteroaderente (EAEC). Noh um teste bioqumico especfico que as diferencie das E. coli presentes emamostras fecais normais e devem, portanto, ser diferenciadas atravs de provassorolgicas, com a caracterizao dos antgenos somticos O e flagelar H dasmesmas (SILVA, 1999). Vale ressaltar que a presena de E. coli em amostras degua, solo, alimento e demais amostras ambientais indica poluio fecal (SILVA;JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997).1.5.2 StaphylococcusAs bactrias pertencentes ao gnero Staphylococcus so patgenoshumanos amplamente distribudos na natureza e fazem parte da microbiota normalda pele e mucosas de mamferos e aves. Atualmente, o gnero Staphylococcus composto por 27 espcies, sendo frequentemente associadas a uma variedade deinfeces de carter oportunista em seres humanos e animais. Entre elas,destacam-se, em patologia humana, as espcies S. aureus, S. epidermidis, S.saprophyticus e S. haemolyticus (MURRAY et al., 1992). 27. 25 Tradicionalmente, os estafilococos so divididos em duas categorias combase na sua habilidade de coagular o plasma (reao de coagulase) - estafilococoscoagulase positivos e coagulase negativos. Entre os coagulase positivos, o S.aureus representa a espcie geralmente envolvida em infeces humanas, tanto deorigem comunitria quanto hospitalar. As espcies coagulase negativas,denominadas como SCN, so hoje tambm consideradas como importantescausadoras de infeco, particularmente no ambiente hospitalar, em pacientes comas defesas orgnicas comprometidas ou portadores de corpos estranhos, tais comoprteses, cateteres e enxertos sintticos. Praticamente quase todas as pessoaspossuem estafilococos coagulase-negativa em sua superfcie cutnea (SILVA,1999). As bactrias Gram-positivas possuem parede celular composta por mltiplascamadas de peptidioglicano, cido teicicos, apresentam estrutura flagelar,produzem toxinas, principalmente exotoxinas, so resistentes ruptura fsica etambm ruptura da parede celular por lisozimas, so altamente sensveis penicilinae s sulfonamidas, apresentam sensibilidade a detergentes aninicos e resistncia azida sdica e ao ressecamento. Dentre as espcies de bactrias Gram-positivasmais importantes que podem causar danos patolgicos est S. aureus. Emboraencontrada com relativa frequncia como membro da microbiota normal do corpohumano, S. aureus uma das bactrias patognicas mais importantes, uma vez queatua como agente de uma ampla gama de infeces, variando desde aquelaslocalizadas, geralmente superficiais, at algumas disseminadas, com elevadagravidade. Em geral, as doenas causadas por essa bactria podem serclassificadas como somente superficiais invasivas ou txicas, ou ainda apresentarcaractersticas mistas, txicas e invasivas. Sua importncia clnica tem variado aolongo dos anos, tendo crescido particularmente devido ao aumento na ocorrncia deinfeces hospitalares graves causadas por amostras multirresistentes (TRABULSI;ALTERTHUM, 2008). S. aureus, coagulase-positivo, so cocos Gram-positivos que formam gruposde cocos em forma de cachos. So catalase positivos e so suscetveis elevadatemperatura, assim como a desinfetantes e solues anti-spticas. So encontradosna orofaringe, trato gastrointestinal e trato urogenital sendo transportados nasuperfcie cutnea e na nasofaringe (BROOKS et al., 2009). 28. 26S. aureus pode causar doenas devido produo de toxinas, pela invasodireta ou por destruio do tecido. o agente mais comum de infeces piognicasque podem se localizar na superfcie da pele formando pus ou em regies maisprofundas. As infeces da pele recebem diferentes designaes, tais como:foliculite, furnculos, carbnculos, conjuntivites, impetigo, sndrome da peleescaldada, de acordo com a localizao e outras caractersticas. As infecesprofundas so de carter mais grave e ocorrem particularmente em indivduosdebilitados devido a doenas crnicas, ferimentos traumticos, queimaduras ouimunocomprometidos. Estas infeces incluem pneumonias, abcessos profundos,osteomielites, endocardites, flebites, mastites, meningite e artrite bacteriana. Causatambm, intoxicao alimentar devido ingesto de alimento contaminado pelastoxinas estafiloccicas A, B, C, D, E, sendo a enterotoxina A mais associada intoxicao alimentar (MARTINS, 2001).A transferncia de S. aureus para um indivduo suscetvel pode ocorreratravs de contato direto, atravs de fmites a exemplo de objetos como maanetade portas, que podem por sua vez, tornar-se uma fonte de infeco ou atravs daingesto de alimentos contaminados. Desta forma, por ser comumente encontradona flora humana e ser o agente principal das infeces estafiloccicas, uma dasformas de evitar sua transferncia para os alimentos, paciente ou entre os pacientes,e preveno da infeco a adoo do simples hbito de lavar adequadamente asmos antes de manipular os alimentos e antes e aps o atendimento aos pacientes(HARVEY, CHAMPE; FISHER, 2008).1.6 Antimicrobianos e resistncia bacterianaSegundo Martins (2001), embora o uso de substncias qumicas notratamento de doenas infecciosas seja to antigo quanto a humanidade, somente apartir do sculo XVI, com o desenvolvimento da alquimia, as drogas medicinaispassaram a ser obtidas atravs de laboratrios.O desenvolvimento dos antimicrobianos foi um dos maiores feitos da cincianos ltimos 70 anos. A partir de 1935 com a identificao das atividadesantibacteriana das sulfas e, em 1940 com as penicilinas, os antimicrobianos vm 29. 27sendo utilizados para o tratamento de infeces contribuindo significativamente paraa reduo da morbidade e mortalidade (CRAIG, 2004; FUCHS, 2004). De acordo com Funchs (2004), os antimicrobianos so substncias queprovocam morte ou inibio do crescimento microbiano. Classificam-se emantibacterianos, antifngicos, antiprotozorios, anti-helmnticos e antivirais. Quanto origem, so divididos em antibiticos, produzidos por micro-organismos (bactrias efungos) e quimioterpicos sintetizados em laboratrios (parcial ou totalmente). Adenominao antibitico prevalece na prtica clnica, independentemente da origemnatural ou sinttica. Os antimicrobianos podem atuar de diversas maneiras, interferindo emprocessos metablicos ou em estruturas do micro-organismo. O mecanismo de ao exercido essencialmente por interferncia na sntese da protena celular,alteraes na permeabilidade da membrana citoplasmtica, interferncia nareplicao do cromossomo e interferncia na sntese protica (TENOVER, 2006). Na figura 1, esto relacionados os antibiticos e respectivos mecanismos deresistncia nos quais esto envolvidos.Figura 1: Antibiticos e mecanismos de resistncias envolvidos.Antibiticos Mecanismo de resistncia envolvido Betalactmicos: penicilinas, cefalosporinas, carbapnicos Inativao enzimtica Aminoglicosdeos Cloranfenicol Betalactmicos (protenas ligadoras de penicilinas) Aminoglicosdeos (protenas ribossmicas) Quinolonas (DNA girase) Alterao do stio de ao Macroldeos (RNA ribossmico) AminoglicosdeosDiminuio da Quinolonas Betalactmicos permeabilidade Cloranfenicol Quinolonas Promoo de efluxo Tetraciclinas Fonte: Adaptado de Martins (2001). 30. 28 A parede celular responsvel pela forma e rigidez clula bacteriana. Elaserve como uma barreira osmtica permite que as bactrias retenham nutrientes,protenas essenciais e cidos nuclicos no seu interior e mantenham certasmolculas em seu exterior. A membrana externa tem constituio diferente conformea bactria seja Gram-negativa ou Gram-positiva. Entretanto, todas tm uma camadaem comum, o peptideoglicano (KOCH, 2003). Nas bactrias Gram-positivas, essemucopeptideo compreende 60% da parede celular, sendo o restante constitudo decidos teicos, ribonucleato de magnsio e carboidratos. J nas Gram-negativas, eleconstitui 10% da parede, formando, ento, uma camada basal sobre a qual se situauma camada externa composta por lipopolissacardeos, fosfolipdeos e protenas(OPAL; COHEN,1999). Segundo Fourgeaud; Mainardi; Morel (2002), a sntese do peptideoglicanoocorre em trs etapas: a primeira ocorre no citoplasma bacteriano e resulta naformao de um derivado do cido N-acetilmurmico, o cido uridinodifosfato-N-acetilmurmico. Na segunda etapa da sntese da parede celular ocorre a formaode um composto derivado do cido N-acetilmurmico com um pentapeptdeo, queser transportado por um fosfolipideo para fora da membrana citoplasmtica,juntamente com molculas de N-acetilglicosamina. No meio externo ocorrer aterceira etapa com as reaes de transglicosilao e transpeptidao. Protenas ligadoras de penicilina ou PBPs (Penicillin-Binding Proteins) soprotenas situadas na face externa da membrana citoplasmtica, que tm atividadeenzimtica detransglicosidases,transpeptidases,carboxipeptidases eendopeptidases, e participam na terceira etapa da biossntese das novas molculasde peptideoglicano (MAZZEI; PERITI, 1999). Estas PBPs so os principais alvos dosantibiticos beta-lactmicos (penicilinas, cefalosforinas, carbapenmicosemonobactmicos), os quais inibem sua ao e, consequentemente, a formao dopeptideoglicano havendo lise osmtica (SINGH, 2004). A membrana citoplasmtica ou membrana interna, como tambm chamada,se localiza abaixo da parede celular, envolvendo o citoplasma onde se encontram asorganelas essenciais para as funes vitais do micro-organismo. Sua constituio a mesma para bactrias Gram-positivas e negativas. Cerca de 66% de suaconstituio so protenas e 33% so lipdeos, principalmente fosfolipdeos. Elapossui permeabilidade seletiva que controla a passagem de solues para dentro efora da clula e tambm apresenta um sistema enzimtico de transporte ativo. 31. 29onde ocorre a sntese de ATP por oxidao fosforilativa e onde esto as enzimasenvolvidas na sntese do peptideoglicano (YAO; MOELLERING, 2007).Alteraes fsico-qumicas da membrana citoplasmtica levam mortebacteriana, pois a permeabilidade seletiva rompida, havendo a sada de elementosvitais clula, como fosfato, ons, purinas e cidos nuclicos, ou entrada desubstncias nocivas ao metabolismo bacteriano. Alm disso, a morte celular podeocorrer por alteraes do sistema respiratrio da clula. Existem antibiticos que seligam aos constituintes normais da membrana provocando desordem funcional.Estes so os mecanismos de ao das polimixinas e tirotricina (YAO;MOELLERING, 2007).Quando as duas fitas da dupla hlice de DNA (cido desoxirribonuclico) soseparadas, cada uma pode servir como um molde para sntese de uma nova fitacomplementar, produzindo duas novas fitas idnticas com orientao antipararela.Este processo chamado replicao e feito por polimerases. Na replicao,ocorrem dois fenmenos fsicos: a desnaturao e a renaturao da dupla fita, ouseja, fuso da dupla fita realizada principalmente pela topoisomerase, ereanelamento formando uma nova fita (STILLMAN; WAGA, 1998). Antibiticos quetm como mecanismo de ao interferir na replicao do DNA atuam, na grandemaioria das vezes, ligando-se topoisomerase, como no caso das quinolonas e docido nalidxico (COZZARELLI; HARDY, 2003).Segundo Hentze; Sachs; Sarnow (1997), a sntese protica um processometablico, feito a partir de genes cromossomais que envolve trs fases: a iniciao,a extenso e a terminao (NOLLER, 1984). A iniciao envolve a reao queprecede a ligao entre o primeiro e o segundo aminocido que iro formar aprotena. Ocorre ento, a ligao do ribossomo sequncia que precede a regiocodificadora do cido ribonuclico mensageiro (mRNA) formando um complexo quecontem o primeiro aminoacil RNA transportador (tRNA). A molcula de mRNA possuicdons, que so sequncias especficas formadas por trs bases. O tRNA possuianticdons que se ligam aos cdons do mRNA. Os cdons especificam a inserona cadeia peptdica em formao do aminocido transportador pelo tRNA.A extenso envolve todas as reaes com adio de aminocidos extremidade carboxila da cadeia polipeptdica em formao. Durante esta etapa, osribossomos movem-se do 5terminal ao 3terminal do mRNA que est sendotraduzido. Este processo chama-se translocao. A formao das ligaes 32. 30peptdicas catalizada pela peptidiltransferase. A terminao feita por um cdonde terminao e seguida respectivamente pela liberao da protena sintetizada epela dissociao do ribossomo e do mRNA (HENTZE; SACHS; SARNOW, 1997). De acordo com Moellering; Yao (2007), a sntese protica pode sofrerinterferncia em vrias fases, como na formao dos RNA (RNA mensageiro, RNAribossomal e RNA de transporte), na fixao do mRNA ou do tRNA ao ribossomo. Ainterferncia na sntese dos RNA observada com as rifampicinas, que se ligam demaneira irreversvel RNA polimerase. J o cloranfenicol atua ligandos-e frao30S do ribossomo, impedindo a ligao do tRNA, inibindo a ao dapeptiltransferase. As lincosaminas (clindamicina e lincomicina) atuam da mesmamaneira que o cloranfenicol e o tiafenicol, porm ligam-se poro 50S. Astetraciclinas ligam-se frao 30S impedindo a ligao do tRNA econsequentemente o aporte de aminocidos. Os macroldeos ligam-se tambm aporo 50S inibindo a translocao do tRNA e bloqueando a unio dos aminocidosna formao da cadeia peptdica. Com a descoberta das penicilinas e sua utilizao no tratamento dasinfeces acreditou-se que as doenas infecciosas deixariam de ser um problema naprtica mdica. Pouco tempo aps o incio da sua utilizao, em 1946, cerca de 5%dos Staphylococcus aureus isolados de pacientes ou portadores eram resistentes penicilina. Em 1949, esta resistncia podia ser notada em 29% dos estafilococosisolados em hospitais, em 1950, atingia 50% e, em 1959, era cerca de 80% emhospitais americanos (BAUER; KIRBY, 1960). Outros antibiticos foram sendo sintetizados, mas sempre surgiam bactriasque apresentavam resistncia aos novos medicamentos. Atravs de mecanismos detroca gentica, muitas bactrias tornam-se resistentes a vrias classes deantimicrobianos. E emergncia de cepas de bactrias multirresistentes consequncia natural da presso seletiva resultante do uso dos antimicrobianos,sendo um problema cada vez mais preocupante (WHITE et al., 2000; FRIDKIN et al.,2002; PATRICK et al., 2004; RUTTIMANN et al., 2004). Uma bactria considerada resistente a um determinado antimicrobianoquando a concentrao inibitria mnima definida in vitro no pode ser obtida noplasma do paciente (TAVARES, 2002; FUCHS, 2004). J o conceito de bactriamultirresistente no unnime. Segundo as diretrizes do CDC (Centers for DiseaseControl and Prevention), a definio de multirresistncia arbitrria, dependendo 33. 31das necessidades e perfil de sensibilidade de cada instituio (SHLAES et al., 1997).Um critrio comumente utilizado a resistncia a dois ou mais frmacos de classesdistintas, para os quais as bactrias so originalmente sensveis (COUTO, 2003). A resistncia das bactrias aos antimicrobianos de primeira escolha temaumentado consideravelmente. So exemplos de bactrias multirresistentes aKlebsiella spp e Escherichia coli produtora de beta-lactamase de espectro estendidoou que apresentamresistncia s cefalosporinas de terceira gerao,Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA), Enterococcus spp resistentes vancomicina, Acinetobacter spp sensvel carbapenmicos (SEGAL-MAURER;URBAN; RAHAL, 1996; HARBARTH et al, 2001). Pseudomonas spp resistentes aminoglicosdeos, carbapenmicos e/ou cefalosporinas (HARBARTH et al, 2001) eEnterobacter spp resistentes beta-lactamases de espectro estendido (CONLY,2002). Muitos mecanismos de resistncia bacteriana tm sido descritos na literatura(MUTO et al, 2003). Algumas espcies bacterianas so consideradas naturalmenteresistentes a uma ou mais classes de agentes antimicrobianos, normalmente porqueelas no possuem o alvo molecular para ao do frmaco ou ento soimpermeveis a ele, resistncia primria (TENOVER, 2006; LIM; WEBB, 2005) esomente concentraes excessivamente altas exerceriam efeito sobre elas. Nessescasos, a tendncia que todas as espcies sejam resistentes a todos osantimicrobianos daquela classe (TENOVER, 2006). A resistncia fisiolgica ocorreem condies especiais de crescimento bacteriano, como os biofilmes, pela adesodas bactrias nas superfcies, dificultando a penetrao dos antimicrobianos eoriginando ambiente para as trocas genticas entre as bactrias (FUCHS, 2004). Poroutro lado, a resistncia adquirida ocorre atravs de mutao ou atravs daaquisio de novo material gentico transportado por elementos mveis tais comoplasmdeos e transposons (LIM; WEBB, 2005). A resistncia adquirida (secundria)pode resultar do uso continuado de antimicrobianos, onde as bactrias queinicialmente eram sensveis a um determinado antimicrobiano tornam-se resistentesatravs de mutao ou transferncia horizontal de material gentico (SHLAES et al,1997; FUCHS, 2004; TENOVER, 2006). Os mecanismos de resistncia adquirida so variados e incluem alterao nosreceptores dos frmacos, reduo da permeabilidade da membrana celular,eliminao do frmaco por bomba de efluxo e inativao de frmacos (CRAIG, 2004; 34. 32LIM; WEBB, 2005). Estes mecanismos geralmente agem sinergicamente paraproduzir um fentipo resistente quando somente um mecanismo simples no seriasuficiente. Alm disso, presso seletiva pode resultar no agrupamento de diversosgenes resistentes em um nico pacote de material gentico permutvel. Isso especialmente comum em organismos Gram-negativos resistentes (LIM; WEBB,2005). Segundo, Lim; Webb (2005), a resistncia aos antimicrobianos por alteraesno seu receptor geralmente adquirida por mutao cromossmica, sendo poucofrequente a participao de plasmdeos, tanto entre bactrias Gram-positivas quantonas Gram-negativas. Este mecanismo inclui qualquer modificao do alvo doantimicrobiano causando afinidade reduzida para o frmaco, ou a troca de alvo poroutro caminho. A resistncia aos antibiticos beta-lactmicos observada em cepas deEnterococcus spp e Streptococcus spp pode ser devida diminuio da afinidadedestes antibiticos pelas protenas ligadoras de penicilinas (PBPs), sitio natural deao dos beta-lactmicos (JACOBY, 1999). Tambm pode haver produo de umaPBP adicional com pequena afinidade de ligao aos antibiticos, como observado,por exemplo, em cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistente eStaphylococcus coagulase negativa nos quais ocorre o surgimento de uma novaPBP-2, a PBP-2 ou PBP-2a, que substitui a ao das PBPs-1, 2 e 3 (ARCHER;CLIMO, 1994; HIRAMATSU, 2001). A resistncia s fluoroquinolonas resulta de mutao em genescromossmicos, no sendo conhecida resistncia mediada por plasmdeos. Emconsequncia, formam-se DNA girase modificadas, seja em sua subunidade A ou nasubunidade B, ou alteraes nas subunidades ParC e ParE das topoisomerases IV,s quais no mais se ligam aos antimicrobianos ativos (CHAMBERS, 1997). A substituio dos receptores alvos do antimicrobiano por um caminhoalternativo melhor ilustrada pelo ERV, onde um novo substrato para a sntese daparede celular (D-alanina e D-lactato) usado, no sendo afetado pela vancomicina(CETINKAYA; FALK; MAYHALL, 2000). A reduo da permeabilidade da membrana celular geralmente acontecesinergicamente com outros mecanismos, como a inativao de frmacos, paraproduzir resistncia clnica quando nenhum dos dois individualmente poderia faz-lo(LIM; WEBB, 2005). O mecanismo que influencia a penetrao dos antibiticos do 35. 33meio externo para o meio intracelular relaciona-se existncia de porinas nasmembranas, ao tamanho das molculas do antibitico e sua hidrofilia, de talmaneira que seja possvel a passagem do frmaco atravs dos poros (NIKAIDO,1989). A hidrofobia dos antimicrobianos explica a resistncia intrnseca observadaem muitas bactrias Gram-negativas, tais como Stenotrophomonas maltophilia ePseudomonas aeruginosa (LIM; WEBB, 2005).A resistncia por alteraes na permeabilidade aos antimicrobianos pode seradquirida mediada por genes de localizao cromossmica ou plasmidial, sendoque, mutao no cromossomo bacteriano tem pequena expresso clnica. Suaocorrncia tem sido descrita no Mycobacterium tuberculosis resistente isoniazida,nas Pseudomonas aeruginosa e enterobactrias resistentes s quinolonas e emalgumas cepas de Neisseria gonorrhoeae resistente s penicilinas e eritromicina.Tambm foram descritas cepas de Escherichia coli e de Pseudomonas aeruginosaresistente ampicilina e carbenicilina respectivamente, cuja resistncia resultou demutaes que provocaram alteraes nas porinas, impedindo a difuso dosantimicrobianos para o espao periplasmtico. Tambm j foi relatada a resistnciadevida ausncia de porinas (TAVARES, 2002).A resistncia por alterao na permeabilidade adquirida por mutao passoua ter, nos dias atuais, importncia maior ao se descrever cepas de Staphylococcusaureus resistentes aos glicopeptdeos. Estas bactrias mostram-se resistentes aosglicopeptdeos provavelmente por apresentarem espessamento da parede celular,resultante do aumento de sua sntese provocada por um maior nmero de protenasligadoras de penicilina. possvel, tambm que a resistncia dos estafilococos aosglicopeptdeos seja decorrente do aprisionamento destes antibiticos por resduosde mucopeptdeo produzido em excesso, com isso reduzindo a quantidade doantibitico que chega ao seu local de ao na membrana citoplasmtica (HANAKI etal., 1998; HIRAMATSU; HANAKI, 1998).A resistncia devida alterao na permeabilidade promovida por genesplasmidiais pouco frequente. Sua ocorrncia descrita em Pseudomonasaeruginosa resistente beta-lactmicos e ao cloranfenicol e em cepas deEscherichia coli e de Haemophylus influenzae resistente ao cloranfenicol. tambmvista em raras cepas de pneumococos que apresentam resistncia mltipla(BENVENISTE; DAVIES, 1973; SHAW, 1984). 36. 34A resistncia s sulfonamidas, observada em alguns bacilos Gram-negativos,e a resistncia da Pseudomonas aeruginosa aos aminoglicosdeos tambmatribuda diminuio da permeabilidade mediada por fatores R (plasmdeo deresistncia). Neste ltimo caso, no est claro se a reduzida penetrao doantibitico se deve a uma impermeabilidade prpria das membranas ou a alteraesno sistema de transporte destes antibiticos (RICE; BONOMO, 2007).O mecanismo da impermeabilidade aos frmacos pode ser um dos fatoresresponsveis pela resistncia de Staphylococcus aureus a meticilina, das bactriasanaerbias aos beta-lactmicos e dos bacilos Gram-negativos s quinolonas.Resulta de alteraes nas porinas das membranas externas, com isso havendo obloqueio da penetrao dos frmacos em seu local de ao (LEUNG; WILLIAMS,1978; NORD et al., 1985).O efluxo de frmacos a remoo ativa do frmaco antes que ele se ligue aoreceptor alvo (LIM; WEBB, 2005). As bombas de efluxo pode ser substrato-especficas como sistemas de efluxo de tetraciclina e de macroleos. Outras atuamcom antibiticos de classes diferentes, como o sistema MexABOprM que podeexportar uma larga gama de substratos, produzindo resistncia cruzada a umagrande nmero de agentes estruturalmente no relacionados (POOLE, 2000;POOLE, 2000). Este sistema foi identificado na Pseudomonas aeruginosa, onde aprotena MexB uma bomba citoplasmtica de amplo espectro, a protena OprMforma um poro que fornece um portal atravs da membrana externa e a protenaMexA liga fisicamente estes componentes(LIM; WEBB, 2005).Segundo Livermore (2001), o sistema confere resistncia a penicilina,cefalosporinas, fluoroquinolonas, tetraciclina e cloranfenicol. A combinao dooperon MexABOprM com perda de OprD produz resistncia ao meropenem alm doimipenem, apesar de no ser o mecanismo de efluxo o nico responsvel pelaresistncia de carbapenmicos em Pseudomonas aeruginosa.Mecanismos de efluxo de multi-frmacos tm sido identificados em outrosorganismos incluindo as Enterobacteriaceae. A mutao do loco cromossmiconomeada MAR (resistncia a mltiplos antibiticos), que regula a susceptibilidade aantimicrobianos no relacionados, resulta em uma combinao de efluxo ativo ebaixa-regulao do canal dos poros OmpF (LIM; WEBB, 2005).A inativao de frmacos intimicrobianos por enzimas produzidas pelasbactrias provavelmente o principal mecanismo molecular de resistncia 37. 35microbiana. Foi inicialmente descrita por Abraham e Chain, em 1940, aodemonstrarem em extratos de Escherichia coli uma enzima capaz de inativar a aoda penicilina, qual denominaram penicilinase. Esta enzima atua sobre o anel beta-lactmico da penicilina, provocando a abertura do anel por hidrlise e transformandoo antibitico em um produto inativo. Com a introduo das cefalosporina, na dcadade 60, o termo cefalosporinase passou a ser empregado para designar as enzimasque hidrolisavam este novo grupo de antibiticos beta-lactmicos. Subsequentemente verificou-se que as bactrias podiam produzir enzimashidrolticas tanto contra as penicilinas como contra as cefelosporinas, passando-se aempregar o termo beta-lactamase para nomear as enzimas contra antibiticos beta-lactmicos (TAVARES, 2002; LIM; WEBB, 2005). Mais recentemente, verificou-se que a resistncia associada produo debeta-lactamases podia ocorrer sem haver a destruio das penicilinas ecefalosporinas. Neste tipo de resistncia, a interao entre a enzima e o substratoresulta em bloqueio da ao do frmaco, sem haver sua hidrlise. Por isso, estemecanismo de ao enzimtica denominado barreira no-hidroltica (TAVARES,2002). Um terceiro tipo de resistncia por inativao enzimtica consiste namodificao de antibiticos das famlias dos aminoglicosdeos, do cloranfenicol e dafosfomicina por enzimas produzidas pela bactria resistente. Desta maneira, osfrmacos modificados tornam-se incapazes ou tm dificuldade em penetrar na clulabacteriana ou, ento, perdem sua afinidade pelo seu receptor (BENVENISTE;DAVIES, 1973). A primeira beta-lactamase foi descoberta no Staphylococcus aureus. Hoje,essas enzimas produzem mais comumente resistncia em patgenos Gram-negativos. As bactrias Gram-negativas naturalmente produzem uma grandevariedade de beta-lactamases, algumas so cromossomicamente codificadas eoutras residem nos plasmdeos. A primeira beta-lactamase mediada por plasmdeo,TEM-1, foi originalmente isolada em Escherichia coli nos anos 60 e em poucos anosdisseminou-se em vrias espcies de Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp(BRADFORD, 2001). Esta beta-lactamase ativa contra todas as penicilinas, masno contra cefalosporina (WATERER; WUNDERINK, 2001). Atravs da substituiode aminocidos, o espectro de atividade enzimtica aumentou de forma a incluircefalosporinas de terceira gerao de amplo espectro. Estas enzimas so 38. 36coletivamente conhecidas como beta-lactamases de espectro estendido. Mas de 150beta-lactamases de espectro estendido foram identificadas no mundo inteiro emmuitas espcies diferentes (BRADFORD, 2001). Algumas delassocefalosporinases especficas sendo que algumas tm uma atividade maior, enquantoque outras so resistentes aos inibidores de beta-lactamases, (isto , cidoclavulnicos e tazobactam). Apesar de a maioria das beta-lactamases de espectroestendido permanecer susceptvel aos inibidores das beta-lactamase, foramidentificadas cepas com alta resistncia s cefalosporinas de terceira gerao queno so afetadas por inibidores de beta-lactamase (NORDMANN, 1998). Andreotti, 2003 afirma que a presena de linhagens multirresistentes poderepresentar risco sade pblica se atingirem o sistema de abastecimento de gua.Desta forma, a circulao de genes de resistncia nas guas representa um fator derisco para os usurios e para os consumidores destas guas, uma vez que genesdas linhagens multirresistentes podem atingir o homem por via direta ou indireta. Assim, a possibilidade de disseminao de bactrias resistentes entrediferentes pases, as relaes entre resistncia e virulncia e os respectivos efeitossobre a evoluo bacteriana, aliados a dificuldade da indstria em desenvolvernovos antimicrobianos na velocidade em que a resistncia se estabelece, soconstataes que fazem do controle da resistncia um enorme desafio (VIEIRA,2003). O uso excessivo de antimicrobianos favoreceu a seleo de organismosresistentes, que vm se disseminando rapidamente, em diversos ambientes. Assimsendo, a disseminao e o crescente aumento da resistncia bacteriana tornou-seuma questo emergente de sade pblica, justificando-se a necessidade deconhecer a susceptibilidade dos micro-organismos comumente causadores deinfeces hospitalares (P. aeruginosa e S. aureus) isolados de amostras de guapara consumo humano (MACHADO, 2004).1.7 Mtodos e tcnicas para deteco de micro-organismos Sero descritos os mtodos diretos mais comumente utilizados para adeteco dos micro-organismos a partir de amostras de guas, de alimentos eamostras clnicas, os quais baseiam-se na capacidade de multiplicao dos micro- 39. 37organismos quando transferidos para um meio de cultura que pode ser lquido ouslido.1.7.1 Tcnica de tubos mltiplos um mtodo de anlise qualitativa e quantitativa que permite determinar onmero mais provvel (NMP) dos micro-organismos de interesse, pela estimativa dadensidade de bactrias em uma amostra, calculada a partir dos resultados positivosobtidos por diluies sucessivas da amostra e distribuio de alquotas em umasrie de tubos contendo meios de cultura seletivos e diferenciais. Neste mtodo, acultura diluda at um ponto em que as amostras da diluio, quando semeadasem meio apropriado, no apresentem crescimento (CETESB,1998). O mtodo sebaseia em testes presuntivos e confirmativos e os resultados so obtidos por meiode tabelas do Standard Methods (APHA, 2005), correspondente s diluiesutilizadas.1.7.2 Tcnica de presena e ausnciaO teste de presena/ausncia no objetiva quantificar os micro-organismosnas amostras, mas sim verificar sua presena num determinado volume. Suaprincipal aplicao na anlise de guas destinadas ao consumo humano, para asquais a legislao brasileira atravs da Portaria n 518/2004 do Ministrio da Sade,estabelece como padro a ausncia de coliformes totais e termotolerantes em 100mL da amostra (BRASIL, 2004). mais simples, rpida e econmica do que atcnica de tubos mltiplos. Pode ser realizada com meios de cultura diferenciais epresuntivos ou com meios que incorporam substrato cromognicos e fluorognicos,como o colilert, dentre outros (ITAL, 2000).1.7.3 Plaqueamento em meio slidoSegundo Trabulsi e Alterthum (2008), neste mtodo, alquotas de diluiesseriadas da amostra so semeadas em meios de cultura slidos adequados eincubadas de maneira a permitir o desenvolvimento de colnias (unidades 40. 38formadores de colnias UFC) isoladas. Estas so contadas e, aps considerada adiluio, obtm-se o nmero de bactrias viveis por mililitro na suspenso originalou, como mais adequadamente se designa, o nmero de unidades formadoras decolnias (UFC/mL). Conforme consta no manual do ITAL (2000), o plaqueamentoem meio slido pode ser em superfcie ou em profundidade.1.7.3.1 Plaqueamento em superfcie (spread plate)Tcnica que quantifica os micro-organismos a partir da inoculao dasamostras sobre a superfcie de um meio slido (gar). Limita o volume inoculado a0,1 mL da amostra ou suas diluies, mas permite uma melhor visualizao dascaractersticas das colnias na superfcie, alm de facilitar sua transferncia paraoutros meios de cultura.1.7.3.2 Plaqueamento em profundidade (pour plate)Permite a inoculao da amostra ou suas diluies e indicado para a anlisede amostras com contagens acima de 102/mL. uma tcnica geral de enumerao de micro-organismos que pode serutilizada tanto para bactrias heterotrficas como para a contagem de outros grupos,gneros ou espcies de micro-organismos. Essa versatilidade decorrente doprincpio do mtodo que se baseia na premissa de que cada clula microbianapresente em uma amostra, quando fixada em um meio de cultura slido adequado,ir formar uma colnia visvel e isolada. tambm conhecida como contagem padro em placas e muito utilizada paraestimar o nmero de bactrias heterotrficas na gua, particularmente como umaferramenta para acompanhar as variaes nas condies de processo ou aeficincia das diversas etapas de tratamento, permitindo ainda verificar as condieshiginicas em diferentes pontos da rede de distribuio. 41. 391.7.4 Tcnica de membrana filtrante uma metodologia de concentrao de micro-organismos indicada paraamostras nas quais se espera ausncia ou contagens muito baixas dos micro-organismos em estudo, fora do limite de deteco das tcnicas de plaqueamentoconvencionais e de outros mtodos. Por este motivo, sua principal aplicao aanlise de gua destinada ao consumo humano, embora possa ser utilizada paraoutros tipos de gua selecionando-se volumes adequados concentrao dosmicro-organismos presentes (ITAL, 2000). um mtodo de anlise quantitativo que permite determinar o nmero deunidades formadoras de colnias (UFC) dos micro-organismos alvos na amostra,baseado na filtrao de um volume adequado da amostra atravs de um filtromembrana. utilizada para a anlise de coliformes, P. aeruginosa, Enterococcus eC. perfringens.Esta tcnica baseia-se na filtrao de volumes adequados da amostra degua, atravs de membrana filtrante com porosidade adequada. As bactrias aserem detectadas apresentam dimenses maiores e ficaro retidas na superfcie damembrana a qual ento transferida para uma placa de Petri contendo o meio decultura seletivo e diferencial. Por capilaridade, o meio difunde-se para a membrana,entrando em contato com as bactrias e, aps o perodo determinado de incubao,desenvolvem-se colnias com caractersticas tpicas, que podero ser observadascom o auxlio de um microscpio. A partir da contagem destas colnias, calcula-se adensidade de coliformes presentes na amostra (CETESB, 1993).1.7.5 Mtodos rpidos de deteco e identificao de bactriasContrastando com os procedimentos convencionais, dependentes decrescimento para identificao de bactrias, o uso de provas com substratoscromognicos de enzimas, permite ao laboratrio identificar numerosas espcies demicro-organismos de modo rpido. Substratos cromognicos de enzimas detectamenzimas pr-formadas nas bactrias e permitem a identificao rpida de micro-organismos especficos em comparao com os mtodos clssicos de identificao,que incluem o crescimento em meios seletivos e diferenciais, as caractersticas das 42. 40colnias e a morfologia celular em esfregaos corados por Gram (SCHAECHTER etal., 2002). As principais tcnicas rpidas de deteco e identificao de bactriasso:1.7.5.1 Tcnica de substratos cromognicos Tcnica de identificao rpida de espcies bacterianas pela deteco decaractersticas fenotpicas. Baseia-se na sntese de compostos incolores queoriginam produtos de hidrlise coloridos diretamente ou aps adio de umreagente. Os substratos enzimticos comumente utilizados para identificao debactrias so as enzimas glicosidase e aminopeptidase.1.7.6 Provas bioqumicas As provas bioqumicas so amplamente utilizadas para diferenciar e identificarbactrias por meio de suas atividades enzimticas. Algumas das principais provasbioqumicas normalmente utilizadas para identificao dos micro-organismos deinteresse mdico e indicadores ambientais so: meio de Rugai modificado, indol,degradao da uria, motilidade, sulfeto de hidrognio, citrocromo oxidase,coagulase, prova de oxidao/fermentao (O/F) e fermentao do manitol. Alm dessas provas, outra prova rotineiramente utilizada antes de qualquerprova bioqumica para identificao dos micro-organismos a colorao de Gram,que se caracteriza pela colorao diferencial dos mesmos, atravs da qual asbactrias so classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas, dependendo dareteno ou no do corante cristal-violeta em sua estrutura (ANVISA, 2004).1.8 Determinao da susceptibilidade aos agentes antimicrobianos A determinao da susceptibilidade aos agentes antimicrobianos pode serdeterminada direta ou indiretamente. A determinao direta feita pelos chamadosmtodos de diluio e a indireta pelo mtodo de difuso em placa (TRABULSI;ALTERTHUM, 2008). 43. 41 Mtodo de diluio: mtodo quantitativo que consiste no preparo de diluiessucessivas do antimicrobiano a serem testadas em tubos contendo caldos decultura, onde ser ento inoculada a suspenso bacteriana padronizada do micro-organismo em estudo. Aps a incubao, deve-se verificar a menor concentrao doantimicrobiano que inibiu o crescimento bacteriano. Esta concentrao denominada concentrao inibitria mnima CIM (TAVARES et al., 2001). Mtodo de difuso em placa: mtodo qualitativo consiste na deposio de umdisco de papel impregnado com o antimicrobiano no meio de cultura slido e emplaca previamente semeada com suspenso da bactria em estudo. A drogaaplicada difunde-se no meio de cultura e o crescimento bacteriano poder serinibido, formando-se ento um halo de inibio em torno do disco (zona onde no hcrescimento bacteriano), cujo dimetro varia de acordo com a velocidade de difusodo antimicrobiano. Os halos so medidos e os resultados so reportados comosensvel, intermedirio (moderadamente resistente) ou resistente (TAVARES et al.,2001). O mtodo de difuso em placa pode ter numerosas variveis, de acordo coma tecnologia empregada. Para que os resultados obtidos entre os diferenteslaboratrios sejam comparados, foi padronizada internacionalmente, a tcnicadescrita por Bauer e Kirby. Nesta tcnica so estabelecidas normas para asconcentraes a serem utilizadas nos discos de cada antimicrobiano, padronizaodo inculo bacteriano testado e tipo de meio de cultura a ser utilizado (SILVA, 1999). Para o isolamento e a identificao dos micro-organismos indicadores decontaminao e patognicos nas amostras de gua, deve-se analisar qual destastcnicas a mais adequada. A cidade de Boa Vista, capital do estado de Roraima, possua em 2010,sessenta e uma escolas (61) na zona urbana, que atendia a 49.981 alunos, sendo32.327 do ensino fundamental, 9.777 do ensino mdio, 413 da educao especial e7.464 da educao de jovens e adultos, distribudas em 33 bairros. Das 61 escolasda capital, 63,9%, so abastecidas com gua apenas clorada e 36,1%, soabastecidas com gua que recebem tratamento completo. (RORAIMA, 2011). O abastecimento de gua, esgoto domiciliar e coleta de lixo so importantesindicadores de condies ambientais e de qualidade de vida da populao de umaregio. O fornecimento de gua potvel na cidade de Boa Vista, capital do Estado deRoraima, constitudo por dois sistemas de abastecimento: captao superficial das 44. 42guas do Rio Branco, localizado no bairro So Pedro, que atravs de duas adutoras,encaminham a gua bruta para as duas estaes de tratamento de guas (ETA) ecaptao subterrnea realizadas em diversos bairros da cidade: Buritis, Caran,Pintolndia, Tancredo Neves e Jardim Equatorial, atravs de 68 poos tubularesinstalados. As guas bombeadas destes poos recebem clorao antes de seremencaminhadas para abastecimento.De acordo com dados fornecidos pela CAER/RR no municpio de Boa Vista,em 2009, 67 mil domiclios encontravam-se ligados a rede geral de abastecimentode gua, beneficiando 259 mil pessoas (98% da populao da capital), com umvolume de 36 milhes de m3/ano de gua tratada.Na verdade, no se sabe a qualidade de gua nos reservatrios domiciliares,de onde o produto realmente consumido pela populao. A qualidade da guatambm pode decair no sistema de distribuio pela intermitncia do servio, baixacobertura de distribuio de gua, manuteno deficiente, entre outros. Nosdomiclios os nveis de contaminao podem se elevar pela precariedade dasinstalaes hidrulico-sanitrias, pela falta de manuteno das caixas-dgua e pelomunuseio inadequado da gua (DAGUILA et al., 2000).O tratamento da gua apesar de reduzir a carga microbiana, no eliminaalgumas bactrias, principalmente as resistentes a antibiticos e nveis elevados debactrias heterotrficas, especialmente as resistentes a mltiplos antibiticos compossveis infeces oportunistas, podem representar riscos para a sade dosindivduos com pouca idade, os imunologicamente debilitados, os idosos, ostransplantados, as gestantes, os portadores de doenas imunossupressoras, almde pessoas submetidas quimioterapia (BRASIL, 2006).Boa parte da populao do Estado de Roraima conta com sistema deabastecimento de gua tratada. Mesmo assim, o consumo de gua engarrafada temcrescido muito, pelo fato da populao desconfiar que o tratamento da gua, apesarde reduzir a carga microbiana, no elimina as bactrias resistentes a antibiticos, oque pode contribuir para a disseminao destes organismos e /ou dos seus genes.No nosso estado e em particular em Boa Vista RR, so poucos aspesquisas sobre o perfil de resistncia a antimicrobianos de bactrias isoladas emamostras de guas, nesse sentido acreditamos que esta pesquisa ir fornecer umasrie de informaes que podero contribuir para um melhor redirecionamento daspolticas pblicas de sade do estado de Roraima. 45. 43OBJETIVOS2.1 Objetivo geralAvaliar microbiologicamente e determinar os riscos da presena de bactriasheterotrficas em amostras de guas consumidas nas escolas estaduais de BoaVista Roraima.2.2 Objetivos especficosDetectar e quantificar micro-organismos indicadores de qualidade de guanas amostras de guas coletadas nas escolas estaduais localizadas em Boa Vista RR.Isolar as bactrias heterotrficas;Testar a sensibilidade das bactrias isoladas aos antibiticos;Classificar as bactrias quanto resistncia a mltiplos antibiticos;Enquadrar as amostras de gua na legislao pertinente. 46. 443 MATERIAL E MTODOS3.1 rea de estudoForam visitadas 20 escolas pblicas localizadas em Boa Vista, as quaisatendiam um total de 21.917 alunos. As escolas foram divididas em 2 grupos: as querecebem gua com tratamento completo e as que recebem gua clorada. Asescolas, as localizaes e os pontos onde as amostras de guas foram coletadasencontram-se nas figuras 2 e 3.Figura 2 Escolas, localizaes e pontos, onde as amostras de gua que recebemgua com tratamento completo foram coletadas.EscolaBairro PontosGonalves DiasCanarinho 1e2Penha BrasilAparecida 3e4Hildebrando F. Bittencourt dos Estados5e6Ana Libria Mecejana7e8Ayrton SennaCentro 13 e 14Monteiro Lobato Centro 35 e 36Oswaldo CruzCentro 37 e 38Euclides da Cunha Centro 39 e 40Fonte: Roraima, 2010Figura 3 Escolas, localizaes e pontos, onde as amostras de gua que recebemgua clorada foram coletadas.EscolaBairro PontosTancredo Neves Tancredo Neves9 e 10Jesus Nazareno Caran11 e 12Maria das Dores Brasil 13 de setembro15 e 16Amrica SarmentoSlvio Botelho 17 e 18Severino Cavalcante Slvio Botelho 19 e 20Jaceguai Cunha Asa Branca21 e 22Major AlcidesAsa Branca23 e 24Wanda D. AguiarRaiar do Sol25 e 26Luiz R. Lucena Nova Cidade 27 e 28Elza BrevesConjunto cidado29 e 30Luiz R. de Lima Equatorial 31 e 32Hlio Campos Slvio Leite33 e 34Fonte: Roraima (2010). 47. 453.2 AmostragemEste trabalho foi desenvolvido durante o perodo de outubro de 2010 a abrilde 2011, no Laboratrio de Microbiologia do Centro de Estudos da Biodiversidade CBio da Universidade Federal de Roraima e no Laboratrio Central LACEN, deRoraimaAs amostras foram coletadas em vinte (20) escolas estaduais localizadas emBoa Vista RR, sendo selecionadas aquelas com os maiores contingentes dealunos, localizao e tipo de tratamento que a gua recebe. Foram escolhidas 12escolas que recebem gua com tratamento completo (coagulao, floculao,decantao, filtrao, correo de pH, clorao e fluoretao) e 8 que recebem guaclorada e localizao, visando obter-se maior abrangncia na distribuiogeogrficas das escolas. O intervalo entre a primeira e a segunda coleta teve adurao de trs meses.A primeira coleta ocorreu entre 18/10/2010 a 20/12/2010, quando foramrealizadas coletas em um bebedouro central, o mais utilizado pelos alunos e outrana torneira da copa de cada escola, perfazendo um total de 40 amostras de gua. Asegunda coleta foi realizada no perodo de 17/01/2011 a 11/04/2011, quando foramrealizadas novas coletas nos bebedouros e nas torneiras da copa das mesmasescolas da primeira campanha, obtendo-se mais 40 amostras de gua, totalizando80 amostras, sendo 40 da gua dos bebedouros e 40 da gua das torneiras dascopas.As amostras foram coletadas no perodo da manh, acondicionadas emfrascos de polietileno, com capacidade para 125 mL, previamente esterilizadoscontendo 0,01 mL (2 gotas) de tiossulfato de sdio (Na2S2O3) a 10% para neutralizaro cloro residual da gua dos bebedouros e das torneiras das copas.O mapa com a localizao das escolas estaduais onde foram realizadas ascoletas das amostras de gua pode ser visto na figura 4. 48. 46Figura 4 Mapa com a localizao das escolas estaduais onde foram realizadas ascoletas das amostras de gua.Fonte: Roraima (2011).Antes de coletar as amostras de gua, as torneiras foram limpas com algodoembebido em lcool 70% sendo que permitiu-se o escoamento de gua por 2 a 3minutos. Os frascos foram preenchidos com aproximadamente 100 mL de gua eposteriormente realizou-se a identificao dos mesmos. Os frascos foram marcados 49. 47com os nmeros das amostras, correspondente aos pontos das coletas e finalmenteforam preenchidas as fichas de identificao das amostras de guas. Na figura 5est representado o procedimento para coleta de amostra de gua em torneiraFigura 5 Procedimentos para coleta de amostra de gua em torneiraFonte: OMS (1998).Aps o procedimento de coleta, os frascos foram acondicionados em caixaisotrmica contendo gelo e transportados imediatamente ao laboratrio deMicrobiologia do Centro de Estudos da Biodiversidade CBio da UniversidadeFederal de Roraima - UFRR, onde foram processadas. Todas as amostras foramanalisadas quanto presena de coliformes totais, coliformes termotolerantes ebactrias heterotrficas.3.3 Anlises bacteriolgicasAs tcnicas adotadas, para quantificar os coliformes totais e termotolerantes ebactrias heterotrficas nas amostras de gua, so as preconizadas no StandardMethods for the Examination of Water and Wastwater (APHA, 2005), conformedescritas a seguir. 50. 483.3.1 Deteco de coliformesPara a determinao dos coliformes foi utilizada a tcnica dos tubos mltiplos,com trs diluies (10, 101, 10-1) e sries de cinco tubos de acordo com asrecomendaes para as anlises de gua utilizada para consumo humano. Oesquema 2 mostra como realizada a tcnica da fermentao em tubos mltiplos.A gua de diluio foi preparada da seguinte forma: em um tubo de ensaio contendo9 0,2 mL de soluo salina a 0,85% foi adicionado 1 mL da amostra de gua a serexaminada, em seguida foi retirado da diluio com auxlio de uma pipetaesterilizada, 1 mL e inoculado nos tubos contendo caldo lactosado de concentraosimples, diluio 1:100).Para a realizao do teste foram utilizados 15 tubos de ensaio, distribudos de5 em 5, nos primeiros 5 tubos, que contem caldo lactosado de concentrao dupla,foram inoculados com auxlio de uma pipeta esterilizada, 10 mL da amostra de gua,em cada tubo, figura 6. Nos 10 tubos restantes, os que contm caldo lactosado deconcentrao simples, foram inoculados nos 5 primeiros, 1 mL da amostra de gua(diluio 1:10) e nos 5 ltimos tubos, foram inoculados 1 mL da diluio 1:100descrita acima.Figura 6 Teste presuntivo: tubos com caldo lactosado para coliformes totais.O esquema da realizao da tcnica da fermentao em tubos mltiplos associadaao Nmero Mais Provvel se encontra na figura 7. 51. 49Figura 7 Tcnica da fermentao em tubos mltiplos. Amostra de guaPresuntivo1.Caldo lactosado35C/24-48h Confirmativo2. Caldo verde brilhante eBile 2% - coliformes totais35C/24-48h3. Caldo E.C. - coliformestermotolerantes44,5C-24hgua: trs sries de cinco tubosFonte: Disponvel em: http://www.dms.ufsc.br/mip7013/arquivos/Microbiologiagua.pdf3.3.1.1 Determinao de coliformes totais e termotolerantes Inicialmente, realizou-se o teste presuntivo com inoculao das amostras emCaldo Lactosado C.L. (MERCK) duplo e simples que foram incubadas em estufabacteriolgicas a 35,0 0,5C por 24-48h. Esse meio de cultivo rico em nutrientes(lactose e peptona) facilitadores do crescimento dos micro-organismos, oferecendo-lhes como fonte de carbono a lactose, a qual fermentada pelos coliformesproduzindo cido e gs, sendo que o gs apreendido no tubo de Durhan. Quando o resultado apresentou-se positivo no teste presuntivo, ou seja,quando houve produo de gs com aprisionamento do mesmo no tubo de Durhan,realizou-se o teste confirmativo para a presena de coliformes totais, figuras 8 e 9.As amostras positivas foram inoculadas em Caldo Verde Brilhante C.