INSTITUTO BIOMÉDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E ... · Dissertação apresentada ao curso de...

INSTITUTO BIOMÉDICO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

VIVIANE ALVES NASCIMENTO COSTA

“COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES METODOLOGIAS PARA

O DIAGNÓSTICO DE GIARDIA DUODENALIS EM AMOSTRAS

FECAIS DE CÃES E GATOS DOMÉSTICOS”

ORIENTADORA: PROFª DRa ADRIANA PITTELLA SUDRÉ

Niterói

2016


Comparação entre diferentes metodologias para o diagnóstico de Giardia

duodenalis em amostras fecais de cães e gatos domésticos

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação

Stricto Sensu em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas da Universidade Federal Fluminense,

como parte dos requisitos necessários para obtenção

do título de Mestre em Microbiologia e

Parasitologia

ORIENTADORA: PROFa DR

a ADRIANA PITTELLA SUDRÉ

Niterói

2016


Comparação entre diferentes metodologias para o diagnóstico de Giardia

duodenalis em amostras fecais de cães e gatos domésticos

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação

Stricto Sensu em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas da Universidade Federal Fluminense,

como parte dos requisitos necessários para obtenção

do título de Mestre em Microbiologia e

Parasitologia

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________

Profa. Dr

a. Teresa Cristina Bérgamo do Bomfim

UFRRJ

________________________________________________

Prof. Dr. Valmir Laurentino Silva

Fiocruz

________________________________________________

Profa. Dr

a. Beatriz Brener

UFF

Niterói

2016

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por sua amizade, pelas aptidões e pelo dons a mim designados

e pelo seu amor incondicional em todos os momentos da minha vida.

À minha orientadora Adriana Pittella, pela paciência, profissionalismo e

disponibilidade para me orientar e transmitir seus conhecimentos desde o início até o final do

Mestrado.

Às professoras, Daniela Leles e Beatriz Brener, por terem me auxiliado e partilhado

alguns de seus ensinamentos durante a execução do presente estudo.

Aos meus pais, Elizabeth e Jorge, que foram minha base de formação e valores e

grandes exemplos de conduta moral e cumplicidade.

Ao meu irmão, Vitor, pelo exemplo, de coragem e pelos seus princípios de vida

ensinados.

Às minhas avós, Mariana e Léa, por serem minhas fontes de sabedoria, força e doçura.

Ao meu avô, Amaro (in memoriam) que hoje descansa em Paz no Reino Celeste,

agradeço pelas lindas lembranças e sorrisos.

Às minhas amigas de longa data, Juliana, Nádia pelos mais de 10 anos de amizade,

apoio fraterno, mesmo que a distância.

Aos meus amigos, Caio, Bruna Ponciano que tornaram este percurso mais leve, com

tanto carinho, horas de risos, trilhas sonoras diárias, muitas xícaras de cafés e, porque não

puxões-de-orelha bem-humorados.

Aos amigos, Sabrina, Chynthia, Jilder, Janaiara, Rozeli, Ana Claudia, Jefferson e Beth

que chegaram aos poucos ou retornaram após muitos anos, mas que agregaram sentimentos

verdadeiros e me incentivaram nestes últimos meses.

Ao meu amigo, Thyago (in memoriam), grande incentivador, que me fez acreditar e

despertar novamente para o meio acadêmico e me mostrou, antes de partir, que todo dia é um

recomeço.

Às meninas da turma de mestrado de 2014, em especial, Kamilla, Dayana, Bruna,

Fabielle e Daniele, por toda aprendizagem trocada e parceria ao longo desses dois anos de

convivência.

E a todos aqueles que embora não mencionados, puderam contribuir direta e

indiretamente pela realização deste trabalho.

“Para tudo há um tempo, para cada coisa

há um momento debaixo do céu:

tempo de nascer e tempo de morrer;

tempo de plantar e tempo de arrancar o que se plantou.

Tempo de matar e tempo de curar;

tempo de demolir e tempo de construir.

Tempo de chorar e de rir;

tempo de gemer e tempo de dançar.

Tempo de atirar pedras e tempo de ajuntá-las;

tempo de abraçar e tempo de apartar-se.

Tempo de procurar e tempo de perder;

tempo de guardar e tempo de jogar fora.

Tempo de rasgar e tempo de costurar;

tempo de calar e tempo de falar.

Tempo de amar e tempo de odiar;

tempo de guerra e tempo de paz”

(Eclesiastes, 3, 1-8).

RESUMO

Giardia duodenalis é um enteroprotozoário cosmopolita e que acomete várias espécies de

mamíferos. Sua taxa de prevalência é variável segundo o hospedeiro, localização geográfica e

principalmente de acordo com a metodologia diagnóstica utilizada. Considerando a escassez

de estudos para amostras animais que envolvam as técnicas imunológicas e a falta de

padronização e de informações acerca de seu desempenho para estas amostras, este estudo

teve por objetivo comparar os seguintes métodos de detecção de Giardia duodenalis em

amostras fecais de cães e gatos: microscopia (EPF), imunocromatografia e ELISA. Além

disso, foi realizada uma adaptação da técnica imunocromatográfica para utilização em

sedimentos fecais previamente congelados e comparado o seu desempenho em relação ao

tempo de armazenamento por congelamento das amostras fecais. Todas as técnicas foram

realizadas em um total de 100 amostras, sendo 50 de cada hospedeiro, que foram submetidas

ao testes estatísticos de concordância. O EPF foi positivo para cistos de Giardia duodenalis

em 18% das amostras. A metodologia do ensaio imunocromatográfico foi adaptada e

realizada com sucesso nos sedimentos fecais de felinos e caninos estudados, e o tempo de

congelamento não interferiu significativamente nos parâmetros do teste imunocromatográfico

modificado. O teste imunocromatográfico foi positivo para antígenos de Giardia duodenalis

em 29/100 amostras (29%), sendo 12 amostras caninas (24%; 12/50) e 17 amostras felinas

(34%; 17/50). Já o teste de ELISA foi positivo em 26/100 (26%) amostras, sendo 18/50 (36%)

amostras felinas e 8/50 (16%) amostras caninas. As comparações dos resultados entre os

métodos diagnósticos revelou uma concordância substancial entre o teste de

imunocromatografia e o ELISA, e moderada entre a microscopia e o ELISA e entre a

microscopia e o teste imunocromatográfico. Foi observada uma menor sensibilidade e valor

de preditividade negativa da microscopia em relação às demais técnicas utilizadas. No

entanto, sua especificidade e valor preditivo positivo foram superiores às técnicas

imunológicas. Sendo assim, as técnicas imunológicas se mostraram como excelentes

ferramentas diagnósticas para amostras oriundas de animais de companhia, tendo em vista os

resultados por elas gerados, devendo ser utilizadas como ferramenta complementar ao

diagnóstico microscópico.

Palavras-chave: Giardia duodenalis, exame coproparasitológico, imunocromatografia,

ELISA, animais de companhia.

ABSTRACT

Giardia duodenalis is a worldwide enteric protozoa that can affect various species of

mammals. Its prevalence rate varies according to the host, geographical location and mainly

according to the diagnostic methodology used. Considering the scarcity of studies on animal

samples involving the immunological techniques and the lack of standardization and

information about their performance for these samples, this study aimed to compare the

following methods for Giardia duodenalis detection in fecal samples from dogs and cats:

microscopy (EPF), immunochromatography and ELISA. Moreover, the study aimed to adapt

the immunochromatographic technique to be performed on previously frozen fecal sediment

and compare its performance in relation to the freezing storage time of fecal samples. All the

techniques were performed in a total of 100 samples, 50 of each host, which were subjected to

statistical tests of agreement. The EPF was positive for Giardia duodenalis cysts in 18% of

the samples. The immunochromatography methodology was successfully adapted and

performed in all fecal sediments from dogs and cats, and the freezing storage time did not

interfered significantly with the studied parameters. The immunochromatography test was

positive for Giardia duodenalis antigens in 29/100 samples (29%), 12 samples from dogs

(24%; 12/50) and 17 samples from cats (34%; 17/50). The ELISA was positive in 26/100

(26%) samples, 18/50 (36%) feline samples and 8/50 (16%) canine samples. The results

comparison between the diagnostic methods showed a substantial agreement between

immunochromatography and ELISA, and a moderate agreement between microscopy and

ELISA, and between microscopy and immunochromatography. A smaller sensitivity and

negative predictive value were observed for microscopy when compared with immunological

methods. However, the specificity and positive predictive value were higher than

immunological methods. Thus, immunological techniques could be excellent diagnostic tools

for samples from companion animals, because of their results observed in the present study,

and should be used as complementary techniques to the microscopy diagnosis.

Keywords: Giardia duodenalis, coproparasitological examination, immunochromatography,

ELISA, companion animals.

SUMÁRIO

1. Introdução.............................................................................................................................19

2. Fundamentação teórica.........................................................................................................21

2.1. Histórico do gênero Giardia..............................................................................................21

2.2. Taxonomia.........................................................................................................................23

2.3. Giardia duodenalis............................................................................................................24

2.3.1. Genótipos de Giardia duodenalis...................................................................................26

2.3.2. Transmissão e ciclo biológico.........................................................................................28

2.3.3. Giardíase.........................................................................................................................30

2.3.4. Epidemiologia.................................................................................................................35

2.3.5. Prevenção e controle.......................................................................................................39

2.3.6. Diagnóstico....................................................................................................................40

2.3.6.1. Microscopia óptica.......................................................................................................41

2.3.6.2. Técnicas imunológicas.................................................................................................45

2.3.6.3. Métodos moleculares...................................................................................................49

3. Objetivos...............................................................................................................................52

3.1. Geral...................................................................................................................................52

3.2. Específicos........................................................................................................................52

4. Materiais e Métodos..............................................................................................................53

4.1. Amostras...........................................................................................................................53

4.2. Exame parasitológico de fezes e microscopia óptica.........................................................56

4.3. Adaptação do Teste Imunocromatográfico ALERE GIARDIA Ag TEST KIT................57

4.4. Ensaio imunoenzimático (ELISA).....................................................................................59

4.5. Análise Estatística..............................................................................................................60

4.6. Aspectos Éticos..................................................................................................................61

5. Resultados.............................................................................................................................62

5.1. Exame parasitológico de fezes...........................................................................................62

5.2. Métodos imunológicos.......................................................................................................64

5.2.1. Imunocromatografia........................................................................................................64

5.2.2. ELISA......................................................................................................... ....................64

5.3. Comparação de técnicas.....................................................................................................65

5.3.1. Exame parasitológico de fezes e imunocromatografia...................................................68

5.3.2. Exame parasitológico de fezes e ELISA.........................................................................69

5.3.3. Imunocromatografia e ELISA.........................................................................................69

5.4. Concordância entre as técnicas..........................................................................................70

5.4.1. Frequência de concordância e teste de McNemar...........................................................70

5.4.2. Coeficiente kappa............................................................................................................70

5.5. Cálculo dos parâmetros de sensibilidade, especificidade, acurácia ,valor preditivo positivo

e valor preditivo negativo para cada metodologia....................................................................74

5.5.1. Valores totais...................................................................................................................74

5.5.2. Hospedeiro canino...........................................................................................................76

5.5.3. Hospedeiro felino............................................................................................................78

5.6. Influência do tempo de congelamento das amostras sobre os resultados do teste

imunocromatográfico modificado.............................................................................................79

6. Discussão..............................................................................................................................82

6.1. Resultados do exame parasitológico de fezes....................................................................82

6.2. Adaptação do teste imunocromatográfico e seu desempenho nas amostras congeladas

segundo o tempo de congelamento das amostras......................................................................86

6.3. Comparação e concordância entre as técnicas...................................................................88

7. Conclusão.................................................................................................................... ..........99

8. Referências Bibliográficas..................................................................................................100

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas celulares das formas trofozoítica e cística (Ankarklev et al.,

2010).........................................................................................................................................25

Figura 2. Ciclo biológico da G. duodenalis no hospedeiro humano.........................................29

Figura 3. Resposta imune desenvolvida contra Giardia sp. ao longo do tempo de

infecção.....................................................................................................................................33

Figura 4. Cartuchos provenientes do kit da técnica imunocromatográfica para Giardia sp.

realizada em duplicata...............................................................................................................58

Figura 5. Placa de ELISA de kits comerciais – ELISA (IVD Research®) para diagnóstico de

Giardia sp. realizado em duplicata...........................................................................................60

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Tempos de armazenamento das amostras congeladas e utilizadas no estudo,

considerando o total de amostras (n= 100)...............................................................................59

Tabela 2. Número de amostras negativas e positivas para Giardia duodenalis, obtidas pelo

exame parasitológico de fezes para cada hospedeiro................................................................64

Tabela 3. Número de amostras negativas e positivas para antígeno de Giardia duodenalis pelo

teste imunocromatográfico, para cada hospedeiro....................................................................64

Tabela 4. Número de amostras negativas e positivas para antígenos de Giardia duodenalis

pela técnica de ELISA, para cada hospedeiro...........................................................................65

Tabela 5. Resultados do teste imunocromatográfico e exame parasitológico de fezes (EPF) nas

amostras caninas e felinas analisadas (n=100)..........................................................................68

Tabela 6 . Resultados do teste de ELISA e exame parasitológico de fezes (EPF) nas amostras

caninas e felinas analisadas (n=100).........................................................................................69

Tabela 7. Resultados do teste imunocromatográfico (IC) e da técnica de ELISA nas amostras

caninas e felinas analisadas (n=100).........................................................................................69

Tabela 8. Resultados da comparação entre o exame parasitológico de fezes (EPF) e a técnica

imunocromatográfica (IC) considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50)........................71

Tabela 9. Resultados da comparação entre o exame parasitológico de fezes (EPF) e o ELISA

considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50)...................................................................71

Tabela 10. Resultados da comparação entre a técnica imunocromatográfica (IC) e o ELISA

considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50)...................................................................72


imunocromatográfica (IC) considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50)..........................72

Tabela 12. Resultados da comparação entre o exame parasitológico de fezes (EPF) e o teste de

ELISA considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50)........................................................73

Tabela 13. Resultados da comparação entre a técnica imunocromatográfica (IC) e o teste de

ELISA considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50)........................................................73

Tabela 14. Resultados do exame parasitológico (EPF) em relação as amostras consideradas

como verdadeiramente positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando as

amostras totais analisadas (n=100)...........................................................................................74

Tabela 15. Resultados da técnica imunocromatográfica (IC) em relação as amostras

consideradas como verdadeiramente positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN),

utilizando as amostras totais analisadas (n=100)......................................................................75

Tabela 16. Resultados do ELISA em relação as amostras consideradas como verdadeiramente

positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando as amostras totais analisadas

(n=100)......................................................................................................................................75

Tabela 17. Cálculos dos parâmetros estatísticos para cada técnica empregada no diagnóstico

de giardíase considerando as amostras caninas e felinas totais (n=100)..................................76

Tabela 18. Resultados do exame parasitológico de fezes (EPF) em relação as amostras


utilizando somente as amostras caninas (n=50)........................................................................76



utilizando somente as amostras caninas (n=50)........................................................................76


positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando somente as amostras caninas

(n=50)........................................................................................................................................77


de giardíase considerando as amostras do hospedeiro canino (n=50) analisadas no presente

estudo.............................................................................................................................. ..........77



utilizando somente as amostras felinas (n=50).........................................................................78



utilizando somente as amostras felinas (n=50).........................................................................78


positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando somente as amostras felinas

(n=50)........................................................................................................................................78

Tabela 25. Cálculos dos parâmetros estatísticos para cada técnica para o diagnóstico de

giardíase, considerando as amostras do hospedeiro felino (n=50) analisadas no presente

estudo.............................................................................................................................. ..........79

Tabela 26. Resultados da técnica imunocromatográfica (IC) para o grupo 1 em relação as

amostras consideradas como verdadeiramente positivas (VP) e verdadeiramente negativas

(VN) agrupadas segundo o tempo de congelamento das amostras (n=100)...........................80







Tabela 29. Valores de sensibilidade, especificidade e acurácia das amostras agrupadas para o

teste imunocromatográfico em relação as amostras consideradas verdadeiramente positivas

(VP) e verdadeiramente negativas (VN)...................................................................................81

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Genótipos de Giardia duodenalis e seus respectivos hospedeiros..........................27

Quadro 2.Principais fatores de virulência de Giardia sp. e suas funções.................................32

Quadro 3. Informações sobre hospedeiro, origem, raça, sexo, faixa etária e data de

processamento do exame parasitológico de fezes e congelamento de sedimento fecal das

amostras de cães utilizadas no presente estudo.........................................................................54



amostras de gatos utilizadas no presente estudo.......................................................................55

Quadro 5. Classificação do coeficiente Kappa segundo Smith (1995).....................................61

Quadro 6 . Número e frequências relativas (%) de amostras fecais de cães e gatos coletadas no

presente estudo, positivas para Giardia duodenalis e demais espécies de parasitos

gastrointestinais pelo exame parasitológico de fezes................................................................63

Quadro 7. Números das amostras estudadas, origem, data de processamento do exame

parasitológico de fezes e congelamento do sedimento fecal e resultados obtidos pelas técnicas

de exame parasitológico de fezes para diagnóstico de Giardia duodenalis,

imunocromatografia (IC) e ELISA para as amostras de gatos utilizadas no presente

estudo.............................................................................................................................. ..........65



de exame parasitológico de fezes para diagnóstico de Giardia duodenalis,

imunocromatografia (IC) e ELISA para as amostras de cães utilizadas no presente

estudo.............................................................................................................................. ..........67

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Resultados dos exames parasitológicos de fezes das 69 amostras de cães e gatos

coletadas durante o período de estudo......................................................................................62

Gráfico 2. Valores obtidos nos cálculos do coeficiente kappa comparando-se os métodos de

microscopia convencional (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA para o diagnóstico de

Giardia duodenalis em todas as amostras analisadas (n=100).................................................71


microscopia convencional (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA, para o diagnóstico de

Giardia duodenalis utilizando as amostras referentes ao hospedeiro canino

(n=50)........................................................................................................................................72


microscopia convencional (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA, para o diagnóstico de

Giardia duodenalis utilizando as amostras referentes ao hospedeiro felino

(n=50)........................................................................................................................................73

Gráfico 5. Gráfico box plot representando o tempo de congelamento das amostras segundo a

concordância realizada entre a imunocromatografia e a microscopia......................................80

LISTA DE ABREVIATURAS

βg Gene codificante da β-giardina

CDC “Centers for Disease Control”

DNA Ácido desoxirribonucleico

ef-1 Gene codificante do fator de alongamento 1-α

EIA “ Enzyme Immunoassay”

ELISA “Enzyme Linked Immunosorbent Assay”

EPF Exame parasitológico de fezes

EUA Estados Unidos da América

gdh Gene codificante da glutamato desidrogenase

IFD Imunofluorescência direta

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IL-6 Interleucina 6

IFN-γ Interferon gama

κ Coeficiente kappa

kDa Kilodáltons

NaCl Cloreto de sódio

nm Nanômetro

NO Oxido nítrico

pb Pares de base

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PVA Álcool polivinílico

RFLP “Restriction Fragment Length Polymorphism”

RPM Rotação por minuto

ssurRNA Gene codificante da menor subunidade ribossômica

Se Sensibilidade

Sp Especificidade

tpi Gene codificante da triosefosfato isomerase

T CD4+

Células T auxiliares

T CD8+

Células T citotóxicas

µm Micrômetro

µl Microlitros

VPN Valor preditivo negativo

VPP Valor preditivo positivo

VPS Proteína variante de superfície

ZnSO4 Sulfato de zinco

WHO “World Health Organization”

1. INTRODUÇÃO

Giardia duodenalis é um parasito entérico flagelado cuja distribuição é cosmopolita,

podendo infectar humanos e uma variedade de outros membros do reino animal, incluindo

diversos mamíferos, tais como, os animais de companhia, de produção e silvestres. Assim

sendo, possui um ciclo de vida simples que compreende dois estádios evolutivos distintos: o

cisto, forma infectante, e o trofozoíto, o qual coloniza o lúmen intestinal de seus hospedeiros.

A espécie em questão é considerada de alta complexidade genética já que abrange oito

genótipos (A – H). Vale ressaltar que os genótipos C – H são considerados espécie-

específicos e os genótipos A e B já foram detectados tanto em humanos quanto em outros

animais, o que remete designá-los como potencialmente zoonóticos.

A giardíase em cães e gatos é apontada como uma das infecções parasitárias mais

comuns em todo mundo, estando associada a uma vasta gama de sinais clínicos. A

transmissão pode ocorrer de forma direta ou indireta, através da via fecal-oral, mediante a

ingestão de cistos, sendo que neste último caso, possui a água, alimentos e fômites

contaminados como importantes veículos para a difusão deste protozoário. Em virtude do seu

potencial papel como agente zoonótico, estando deste modo, entre as principais preocupações

atuais no que diz respeito à saúde coletiva, os estudos sobre esta espécie ganharam uma

proporção maior nestas últimas décadas, graças ao advento dos estudos imunológicos e

moleculares. Sendo assim, pesquisas epidemiológicas desse protozoário passaram a averiguar

a prevalência utilizando tanto o exame microscópico tradicional como as novas técnicas, a fim

de se confirmar o potencial zoonótico do mesmo.

No que se refere ao diagnóstico da giardíase, existem diferentes testes para avaliação

de G. duodenalis em cães e gatos. Porém, sabe-se que não existe um ensaio cuja sensibilidade

seja 100% para avaliação de amostras de fezes, por isso, recomenda-se a combinação de testes

para a elaboração mais fidedigna do diagnóstico.

20

Neste contexto, a primeira metodologia diagnóstica realizada em pacientes com

suspeita de giardíase é o exame microscópico das fezes para pesquisa de cistos e/ou

trofozoítos. Sendo esta, então, considerada a técnica padrão ouro para o diagnóstico de

giardíase, apesar do crescente avanço dos métodos imunológicos e moleculares.

Desta forma, cabe elucidar que a detecção de Giardia duodenalis foi melhorada (EIA)

e os testes imunocromatográficos. Dentre estas, a mais empregada é o ELISA (“Enzyme

Linked Immuno Sorbent Assay”), sendo este um teste diagnóstico altamente sensível e

específico para giardíase, além de ser facilmente executável e garantir o processamento

simultâneo de um grande número de amostras. Contudo, a maioria das técnicas

imunoenzimáticas para estudos de epidemiologia e principalmente para o diagnóstico foi

desenvolvida para uso em amostras clínicas humanas, logo, não se sabe ao certo sobre a

eficácia das mesmas quando empregadas em amostras animais.

Além disso, para o diagnóstico de Giardia sp. em cães e gatos, pode-se empregar os

testes imunocromatográficos, que são métodos específicos para ambos os hospedeiros,

baseados na utilização de kits comerciais, e que possuem como vantagens, a não necessidade

de equipamentos especiais e de um microscopista treinado. No entanto, nem estas técnicas e

nenhuma outra de cunho complementar, devem substituir o exame microscópico de fezes para

o diagnóstico de rotina, tendo em vista a sua incapacidade para detecção de outros parasitos

na amostra.

Com isso, pode-se dizer que a realização de um estudo comparativo entre

metodologias diversas para diagnóstico de Giardia duodenalis em amostras fecais de cães e

gatos, poderá contribuir tanto no que se refere à utilização destas na rotina clínica veterinária

como para que os estudos epidemiológicos em animais obtenham resultados mais fidedignos e

coerentes. Portanto, é fundamental que se estabeleça uma avaliação correta e consistente dos

parâmetros referentes às metodologias diagnósticas, sendo estes, a acurácia, a sensibilidade, a

especificidade e os valores preditivos, visando posteriormente à padronização destas para

utilização plena em amostras animais.

1DOBEL, C. The discovery of the intestinal protozoa of man. Proc. R. Soc. Med. v. 13, p. 1-

15, 1920. 2LAMBL, W. Mikroskopische untersuchungen der Darmexcrete. Vierteljahrsschr. Prakst.

Heikunde. v. 61, p. 1-58. 1859. 3DIESING, C.M. Systema Helminthium. Sumptibus Academiae Caesareae Scientiarum.

Vindobonae. Gerald’s Sohn, Vienna, 1850. 4BLANCHARD, R. Remarques sur le megastome intestinal. Bull. Soc. Zool. Fr. 13:18, 1888.

1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

1.1. HISTÓRICO DO GÊNERO Giardia

O gênero Giardia foi inicialmente descrito, em 1681, por Van Leeuwenhoek, quando

o mesmo examinou as próprias fezes diarreicas em seu microscópio rudimentar (DOBEL1,

1920 apud ADAM, 2001). Contudo, coube a Vilem Lambl, em 1859, a primeira descrição de

um protozoário (que hoje sabemos ser deste gênero) em fezes humanas, o qual ele denominou

de Cercomonas intestinalis (LAMBL, 18592 apud ADAM, 2001). Ele escolheu alocar este

protozoário no já existente gênero Cercomonas Dujardin, 1841, pois acreditava que o mesmo

fosse comensal, sendo adequado a este gênero o qual engloba protozoários de vida livre.

Entretanto, Diesing em 1850 havia proposto a passagem da espécie Bodo intestinalis

Ehrenberg, 1838 para o gênero Cercomonas, sendo então proposta a espécie Cercomonas

intestinalis (EHRENBERG, 1838) (DIESING, 18503 apud MONIS et al., 2009).

Desta forma, Lambl ao denominar o protozoário de Cercomonas intestinalis criou uma

homonímia tanto para o gênero quanto para a espécie. Neste caso, o nome proposto por

Diesing seria o homônimo sênior, sendo privilegiado e ficando de posse do nome, enquanto

que o nome proposto por Lambl seria o homônimo júnior, devendo receber um novo nome.

Porém, apenas em 1888, Blanchard reconheceu a colocação errônea e estabeleceu o gênero

Lamblia Blanchard 1888, com a espécie Lamblia intestinalis Blanchard 1888, para designar o

parasito descrito por Lambl (BLANCHARD, 18884 apud ADAM, 2001).

22

1DAVAINE, C. MONADIENS. In Dictionnaires encyclopedique des sciences medicales.

(Ser. 2, Vol. 9) (Asselin, P. and Masson, G., eds). Place de l’Ecole-de-Medecine, Paris, 1875. 2STILES, C.W. The type species of certain genera of parasitic flagellates, particularly

Grassi’s genera of 1879 an 1881. Zool. Anz. v. 25, p. 689.1902. 3HEGNER, R.W. The systematic relationship of Giardia lamblia, Stiles 1915 from man

and G. agilis Kunstler, 1882 from the tadpole. Am. J. Hyg. v. 2, p. 435-441. 1922. 4DESCHIENS, R. Giardia cati R. Deschiens, 1925, du chat domestique (Felis

domestica). Annales de Parasitologie, Paris. v . 4, p. 33-48. 1926. 5FILICE, F.P. Studies on the cytology and life history of a Giardia from the laboratory rat.

Univ. Calif. Publ. Zool. v. 57, p. 53-146, 1952.

6KULDA J.; NOHYNKOVA, E. Flagellates of the human intestine and of intestine of the

other species, p. 1-183. In J. P. Kreier (ed.). Parasitic Protozoa, vol II, Academic Press, Inc.,

New York, NY, 1978.

Em 1882 Kunstler descreveu pela primeira vez um organismo em girinos e o

denominou de Giardia agilis Kunstler, 1882, sendo esta, a primeira vez que o nome Giardia

foi utilizado (ADAM, 2001). Em 1875 Davaine encontrou protozoários no intestino de

coelhos, e os denominou de Hexamita duodenalis Davaine, 1875 (DAVAINE, 18751 apud

MONIS et al, 2009). Em 1902, Stile alterou para Giardia duodenalis (STILES, 19022 apud

ADAM, 2001).

Ao longo de algumas décadas, diversos investigadores descreveram diferentes

espécies de Giardia tendo como base os diferentes hospedeiros. Hegner em 1922 denominou

de Giardia canis, a forma parasitária de Giardia em cães e, em 1925, Giardia felis em gato,

para o qual Deschiens no mesmo ano, concedeu uma designação diferente, Giardia cati

(HEGNER, 19223; DESCHIENS, 1926

4 apud BOWMAN & LUCIO-FORSTER, 2010).

Este cenário foi modificado com a publicação de um trabalho de revisão realizado por

Filice em 1952, onde o pesquisador realizou uma avaliação abrangente das espécies descritas

e reconheceu a existência de variabilidade dentro do gênero, mas as ferramentas necessárias

para esta discriminação ainda não estavam disponíveis. Neste trabalho, Filice considerou

válida apenas 3 espécies, em função de suas diferenças morfológicas: G. agilis Kunstler,

1882; G. muris (GRASSI, 1879) e G. duodenalis (DAVAINE, 1875). Este autor considerou

também que G. intestinalis e G. lamblia seriam sinônimos de G. duodenalis (FILICE, 19525

apud ADAM, 2001). Todavia, a controvérsia sobre o número de espécies de Giardia

continuou após muitos anos, com alguns pesquisadores sugerindo a nomenclatura com base

na origem do hospedeiro e outros propondo a taxonomia baseando-se na morfologia do

parasito (KULDA & NOHYNKOVA, 19786 apud ADAM, 2001).

Cabe ressaltar que, assim como exposto por Filice (1952), Monis et al. (2009) em seu

estudo, consideram o táxon específico duodenalis como sinônimo sênior uma vez que este foi

o primeiro a ser designado para o protozoário (DAVAINE, 18751 apud MONIS et al, 2009),

23

pois o táxon intestinalis inicialmente utilizado correspondia a um homônimo júnior, sendo

corrigido por Blanchard apenas em 1888. Desta forma, obedecendo-se a lei da prioridade, o

sinônimo sênior é considerado válido enquanto que o sinônimo júnior deve ser descartado.

Assim, utilizaremos a denominação de Giardia duodenalis ao longo do presente trabalho.

Mais tarde foram admitidas outras duas espécies, assinaladas em aves, G. psitacci e

G. ardeae (THOMPSON et al., 2000). G. microti foi proposta com base na morfologia do

cisto e na análise da sequência do gene codificante da menor subunidade ribossômica,

constituindo assim, a sexta espécie reconhecida (MONIS et al., 1999).

1.2. TAXONOMIA

De acordo com a classificação sistemática antiga, o protozoário Giardia possui a

seguinte classificação (ADAM, 2001; IVANOV, 2010):

Reino: PROTISTA

Sub-reino: PROTOZOA

Filo: SARCOMASTIGOPHORA

Subfilo: MASTIGOPHORA

Classe: ZOOMASTIGOPHOREA

Ordem: DIPLOMONADIDA

Família: HEXAMITIDAE

Gênero: Giardia

Recentemente, há uma nova classificação taxonômica para o referido parasito, a qual

passa a ter um fundamento genético, estrutural e bioquímico. De acordo com esta nova

sistemática (CAVALIER-SMITH, 2003), Giardia pertence ao:

Filo: METAMONADA

Subfilo: TRICHOZOA

Superclasse: EOPHARYNGIA

Classe: TREPOMONADEA

Subclasse: DIPLOZOA

Ordem: GIARDIIDA

Família: GIARDIIDAE

Gênero: Giardia

24

Atualmente são reconhecidas seis espécies que compreendem o gênero Giardia, sendo

estas designadas de acordo com seus hospedeiros específicos e sua morfologia: G. duodenalis,

G. agilis, G. microti, G. muris, G. ardeae e G. psittaci (ADAM, 2001). G. duodenalis infecta

a maioria dos mamíferos, incluindo o homem. G. agilis, possui os anfíbios como hospedeiros;

G. microti e G. muris têm como hospedeiro os roedores; G. psittaci e G. ardeae são espécie

específicas de aves (THOMPSON et al., 2000).

A espécie mais estudada é indubitavelmente, Giardia duodenalis, devido aos seus

aspectos epidemiológicos e por ser a única que acomete diversos hospedeiros na classe dos

mamíferos, incluindo o homem. Deste modo, os estudos sobre esta espécie ganharam uma

proporção maior nestas últimas décadas e também graças ao advento dos ensaios moleculares.

Assim foi possível afirmar que somente a diferenciação de Giardia sp., baseada na origem do

hospedeiro, não era um critério propriamente válido e, também, estudar a variabilidade

existente na espécie G. duodenalis (SOGAYAR & GUIMARÃES, 2000). Desta forma, foram

estabelecidas as distinções genotípicas entre parasitos encontrados em diferentes hospedeiros,

agrupando-se estes parasitos em grupos ou genótipos, os quais variam de A a H

(THOMPSON, 2009).

2.3. Giardia duodenalis

Protozoários do gênero Giardia são parasitos flagelados que habitam o trato intestinal

de uma ampla gama de hospedeiros vertebrados (DUBEY, 1993; THOMPSON et al., 2000;

APPELBEE et al., 2005). A espécie Giardia duodenalis trata-se de um protozoário entérico

cosmopolita e que frequentemente pode acometer humanos, animais de companhia e de

produção e animais silvestres (KIRKPATRICK & GREEN, 1985; ADAM, 1991;

THOMPSON et al. 1993; OLSON et al., 1996; LANE & LLOYD, 2002; THOMPSON,

2004).

Este protozoário possui duas formas evolutivas: trofozoítica e cística. A sua forma

trofozoítica, forma móvel, apresenta corpo com formato piriforme com a porção anterior

dilatada e posterior afilada, com simetria bilateral, medindo aproximadamente de 12 a 20 µm

de comprimento e 6 a 10 µm de largura. Possui citoesqueleto, dois núcleos ovóides, com

grande cariossoma central ou excêntrico, localizados na porção anterior do parasito, um de

cada lado do grupo de axonemas, lisossomas e ribossomos. Em seu interior, não são

observadas mitocôndrias e nem retículo endoplasmático liso (RIVERA et al., 2002). Logo, é

25

um protozoário binucleado e multiflagelar que apresenta um complexo citoesqueleto

constituído por microtúbulos (CAMPANATI et al., 2003).

Os microtúbulos, por sua vez, são estruturas estáveis e essenciais para a manutenção

da forma e organização celular, sendo ainda importantes no transporte citoplasmático, na

motilidade e na divisão em células eucarióticas (WILSON & JORDAN, 1995). O

citoesqueleto do parasito em questão é representado, principalmente, pelos corpos basais e

axonemas de oito flagelos; pelos funis, microtúbulos que acompanham os axonemas caudais;

pelo corpo mediano, formado por um grupo irregular de microtúbulos e pelo disco adesivo

ventral, composto por microtúbulos que se dispõem paralelamente na forma de espiral (figura

1-A) (BENCHIMOL, 2004; ANKARKLEV et al., 2010).

O disco ventral é uma importante estrutura do gênero Giardia, ocupando a superfície

ventral anterior, sendo indispensável para a sobrevivência do parasito, devido ao fato de ser a

única que permite o estabelecimento da interação deste com o intestino do hospedeiro

(ADAM, 2001). A fixação mecânica ocorre mediante o desenvolvimento de uma pressão

negativa entre as superfícies parasitárias e as células do hospedeiro (WOLFE, 1992). Segundo

Peatiie et al. (1989), o disco ventral é constituído por um conjunto de microtúbulos que forma

a base de uma estrutura designada de microribbons, que por sua vez, são contituídos por

diversas proteínas, entre as quais se destacam as giardinas.

Figura 1. Estruturas celulares das formas trofozoítica (A) e cística (B). (Adaptado de:

Ankarklev et al., 2010).

O cisto (figura 1- B), por sua vez, é uma estrututa oval que apresenta membrana cística

evidente e que pode apresentar aspecto de duplo contorno limitante quando ocorre retração do

26

conteúdo, com formação de espaço entre o citoplasma e a parede. Possui de dois a quatro

núcleos e mede de 8 a 12 µm de comprimento e 7 a 10 µm de largura (LEVINE, 1985).

Encontra-se protegido por uma parede espessa e rígida, tendo como principal constituinte em

sua parte filamentosa, o glicídio N-acetil-D-galactosamina, sintetizado a partir das reservas

endógenas de glicose por enzimas no citosol (ANKARKLEV et al., 2010). Além da parede

externa (porção filamentosa), há ainda duas membranas internas, que consituem a porção

membranosa, as quais estão separadas por uma camada citoplasmática (DAVIDS et al., 2011).

As estruturas mais evidentes são os funis e os axonemas que dividem o cisto em duas metades

pelo eixo longitudional. Todas as demais estruturas que se observam no trofozoíto (flagelos,

vacúolos, ribossomos e fragmentos de disco ventral), encontram-se dispostas

desordenadamente dentro do cisto (RIVERA et al., 2002).

2.3.1. GENÓTIPOS DE G. duodenalis

Sabe-se que G. duodenalis é um protozoário ubíquo e seus isolados são oriundos de

diferentes hospedeiros, sendo estes isolados indistinguíveis morfologicamente. No entanto,

esta diferenciação é permitida mediante estudos moleculares, nos quais são empregados

diferentes genes-alvo. Os resultados destes apontam que este protozoário compreende uma

espécie de alta complexidade (MONIS et al., 1999).

Baseado em estudos recentes de biologia molecular, pode-se dizer que se trata de uma

espécie considerada de grande heterogeneidade genética, conforme ressaltaram Monis et al.

(2003) e Feng & Xiao (2011), por ser caracterizada como uma espécie que compreende 8

genótipos ou assemblages distintos. Para Cacciò et al. (2002), a realização de estudos onde se

compararam dados relativos a antígenos, isoenzimas, cariótipos e sequências de DNA de

isolados de origem animal e humana, foram fundamentais para a elucidação da diversidade no

grupo morfológico nomeado G. duodenalis.

Os genótipos deste grupo foram designados após a descoberta de substanciais

diferenças entre os genes glutamato desidrogenase (gdh), triosefosfato isomerase (tpi) e β-

giardina e subsequente análise filogenética, de maneira a descartar a possibilidade das

diferenças serem devido à heterogeneidade das cópias ou de variação intra-genotípica

(PLUTZER et al., 2010). Foi demonstrado, posteriormente, que G. duodenalis não é uma

espécie uniforme, mas sim um complexo de espécies com diversidade genética, mas

morfologicamente similares, exibindo uma adaptação a diferentes hospedeiros (THOMPSON,

27

2004). Assim, os genótipos mais próximos foram agrupados em genótipos (“assemblages”) e

subgenótipos (“subassemblages”) (PLUTZER et al. 2010).

Os genótipos A e B são os que apresentam uma maior variedade de hospedeiros, em

particular humanos e primatas não-humanos, além de animais domésticos e silvestres, o que

os destaca devido à importância de seu potencial zoonótico. Referente aos animais de

companhia, os genótipos C e D são encontrados em cães infectados e o genótipo F, em gatos,

sendo então considerados espécie-específicos (CACCIÒ & RYAN, 2008; BOWMAN &

LUCIO-FORSTER, 2010; TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010). Além dos genótipos

previamente descritos, têm sido propostos outros, tais como, o genótipo E encontrado em

animais de produção, o genótipo G, detectado em roedores e o genótipo H, identificado em

focas (quadro 1) (FENG & XIAO, 2011).

Quadro 1. Genótipos de Giardia duodenalis e seus respectivos hospedeiros.

Genótipos Hospedeiro

A* Humanos e outros primatas, cão, gato, animais de produção, roedores

e outros mamíferos domésticos, dentre outros

B* Humanos, e outros primatas, cães

C Cão, coiotes e lobos

D Cão, coiotes e lobos

E Animais de produção: bovino, ovino, caprino, alpaca, suíno

F Gato e outros felinos

G Roedores

H Focas

*Genótipos com potencial zoonótico.

Fonte: Adaptado de Adam, 2001; Feng & Xiao, 2011.

Além dos genótipos referidos, existem os subgenótipos já descritos pela literatura para

os genótipos A (AI, AII, AIII e AIV) e B (BI, BII, BIII, BIV), sendo que os isolados humanos

pertencem aos subgenótipos AI, AII, BIII e BIV, enquanto que os isolados animais pertencem

aos subgenótipos AI, AII, AIII, AIV, BI e BII (RYAN & CACCIÒ, 2013). Os genótipos com

um maior risco zoonótico são aqueles pertencentes ao genótipo A, particularmente os do

subgenótipo AI e com uma menor extensão o genótipo B (THOMPSON et al. 2000).

28

Cabe ressaltar que a descoberta de que genótipos similares estão dispersos em

diferentes hospedeiros não é, por si só, prova concludente de que se trata de uma real

transmissão zoonótica. Todavia, a caracterização genética é designada por alguns autores

como uma ferramenta potencial preditiva não somente por proporcionar evidências diretas de

transmissão zoonótica, mas também por determinar fontes de infecção em situações de surto

(THOMPSON et al. 2000).

2.3.2. TRANSMISSÃO E CICLO BIOLÓGICO

Trata-se de um parasito monoxeno, não invasivo, que vive e se multiplica no lúmen e

superfície do intestino de seus hospedeiros. Assim sendo, o ciclo de Giardia sp. é direto,

conforme pode ser observado na figura 2, e compreende dois estádios evolutivos distintos, os

quais são discriminados morfologicamente: o trofozoíto, o qual coloniza, sobretudo, o jejuno

e o íleo do hospedeiro; e o cisto, a forma infectante, estável e resistente no meio ambiente

(ADAM, 1991; ECKMANN & GILLIN, 2001; GARCIA et al., 2006). Tanto os cistos quanto

os trofozoítos podem ser liberados nas fezes, entretanto, os últimos raramente sobrevivem por

um período significativo fora do hospedeiro (ADAM, 2001; TANGTRONGSUP & SCORZA,

2010). Deste modo, os trofozoítos são liberados para o meio externo apenas em situações nas

quais a motilidade intestinal encontra-se extremamente aumentada e em presença de diarreia

com consistência muito líquida (BOWMAN, 2009).

29

Figura 2. Ciclo biológico de Giardia duodenalis no hospedeiro humano (Adaptado de:

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Giardiasis.htm. Acessado em: 07/10/2014).

Os hospedeiros adquirem a infecção por meio da ingestão de cistos, através da

transmissão fecal-oral, podendo ocorrer diretamente de indivíduos infectados ou

indiretamente, sendo esta a via mais comum, pela ingestão de cistos em águas, alimentos ou

fômites contaminados (LEIB & ZAJAZ, 1999). Logo, as rotas de transmissão ambiental

incluem todos os veículos que envolvam uma quantidade suficiente de cistos infecciosos que

possam culminar em infecção, principalmente água e alimento (SMITH et al., 2007).

Após a ingestão dos mesmos, dentro de poucas horas, se dá o desencistamento ou

abertura dos cistos, que ocorre inicialmente no estômago devido a ação do pH ácido sobre a

parede cística e termina na porção proximal do intestino delgado, em nível de duodeno, onde

dois novos trofozoítos são formados, liberados e colonizam a superfície dos enterócitos

(SOGAYAR & GUIMARÃES, 2000). De acordo com Castillo-Romero et al. (2009), o

trofozoíto sai por uma abertura da parede do cisto graças a sua motilidade flagelar. A

reprodução ocorre por fissão binária longitudinal, originando dois trofozoítos binucleados

(figura 2). Estes se aderem através do seu disco adesivo e se multiplicam neste habitat,

30

podendo assim iniciar a patogênese ou apenas colonizar o epitélio intestinal, onde realizam a

pinocitose de moléculas oriundas do bolo alimentar ingerido pelo hospedeiro. E se,

porventura, o fluxo intestinal estiver acelerado, este estádio pode ser observado nas fezes.

Para Cacciò & Sprong (2010), tradicionalmente, as espécies dentro do gênero

Giardia têm sido consideradas como eucariotos que mostram a ausência de uma reprodução

sexuada em seu ciclo de vida. Este fato tem sido alterado por alguns estudos que

demonstraram genes homólogos no genoma de G. duodenalis relacionados à meiose em

outros eucariotos, à troca de material genético em diferentes regiões cromossomiais entre

isolados humanos do parasito e à fusão entre núcleos dos cistos (cariogamia) e a transferência

de material genético (plasmídeos epissomais) entre eles (RAMESH et al., 2005; COOPER et

al., 2007; TEODOROVIC et al, 2007; POXLEITNER et al., 2008). Estes achados apontam

para uma possível existência de recombinação sexual. Entretanto, muitos detalhes do processo

permanecem desconhecidos e os dados experimentais ainda são escassos, logo mais estudos

neste sentido são necessários para o melhor esclarecimento da origem da meiose e

recombinação sexual nesses eucariotos (CACCIÒ & SPRONG, 2010).

Depois da multiplicação, o ciclo se completa, os trofozoítos atingem a porção terminal

do intestino delgado e formam novos cistos, processo este designado como encistamento, os

quais são excretados nas fezes. Acredita-se que este processo seja uma consequência de

estímulos ambientais, tais como, mudança de pH, concentração de sais biliares ou colesterol

no intestino. Os cistos são eliminados em quantidades variáveis e podem sobreviver

plenamente no ambiente, permitindo ao parasito alcançar outro hospedeiro susceptível e

causar nova infecção (ADAM, 1991; SULAIMAN & CAMA, 2006; CASTILLO-ROMERO

et al., 2009).

2.3.3. GIARDÍASE

De uma maneira geral, a giardíase pode ser apontada como uma protozoose com raras

complicações, porém com uma alta prevalência. Sua importância está relacionada ao impacto

para saúde coletiva e saúde animal, conforme apontam Schantz (1991) e Santana et al. (2014).

Cabe esclarecer que a infecção pode ser desencadeada após a ingestão de uma baixa dose

infectante, de 10 a 100 cistos de G. duodenalis (FAYER et al., 2004; BALLWEBER et al.,

2010).

31

A gravidade da sintomatologia varia consideravelmente com a idade, estresse, resposta

imunológica, estado nutricional, e também de acordo com as linhagens genéticas do parasito

(SAHAGUN et al., 2008). Logo, a infecção por este agente parasitário é multifatorial, já que

envolve elementos pertinentes ao parasito, ao hospedeiro e ao ambiente, conforme citaram

Geurden & Olson (2011). Para Ankarklev et al. (2010), os elementos referentes ao parasito

incluem seus diversos fatores de virulência, os quais apresentam funções específicas ao

entrarem em contato com as células dos seus hospedeiros (quadro 2).

A patogenia da giardíase ainda não está completamente esclarecida e a infecção pode

assumir um amplo espectro de quadros clínicos, que variam desde quadros assintomáticos até

manisfestações agudas com severa diarreia e ou formas crônicas (SPRONG et al., 2009).

Ortega-Pierres et al. (2009) acreditam que a patogenia seria resultante de produtos parasitários

que quebrariam a barreira epitelial determinando a produção de um uma resposta inflamatória.

Para estes autores, a disfunção do transporte hidroeletrolítico é responsável por uma

hipersecreção clorídrica que somada à má absorção da glicose, sódio e água, podem levar ao

acúmulo de líquidos no interior do lúmen intestinal.

Para Buret (2008), os mecanismos gerais da patogênese incluem: produção de toxinas,

alteração da microbiota normal, indução de doença inflamatória intestinal, interrupção da

função enzimática dos enterócitos, destruição das microvilosidades, indução de desordens de

motilidade e indução de apoptose das células epiteliais intestinais. Tudo isso, por conseguinte,

culminado com diarreia pela combinação da má-absorção intestinal e hipersecreção. Todavia,

a alteração da permeabilidade da membrana epitelial intestinal é certamente uma das

alterações mais importantes da infecção por Giardia, parecendo resultar dos efeitos

citopáticos diretos induzidos por substâncias produzidas pelo parasito (BURET et al., 2002).

Geurden et al. (2010) abordam que a referida alteração da mucosa pode ser decorrente da

apoptose dos enterócitos e ainda pelos produtos tóxicos dos trofozoítos, cujo aumento conduz

à elevação do número de linfócitos intra-epiteliais e à ativação dos linfócitos T.

32

Quadro 2. Principais fatores de virulência de Giardia sp. e suas funções.

Função Fatores de virulência

Ligação O disco ventral e as lectinas permitem a ligação e a

colonização do endotélio intestinal

Evasão dos fatores naturais do

lúmen intestinal

Motilidade (flagelos) permite a relocalização para

novo endotélio durante a colonização

Variação antigênica Alteração das PVS na superfície do trofozoíto evita a

ação das IgA

Alteração das defesas inatas do

hospedeiro

Liberação de produtos reguladores da diminuição da

produção de NO pelo epitélio

Modificações anti-inflamatórias Papel anti-inflamatório de produtos ainda

desconhecidos dos trofozoítos

Sobrevivência no ácido estomacal e

no ambiente externo

Diferenciação em cistos

PVS = Proteína Variante de Superfície; NO = óxido nítrico; IgA = imunoglobulina A.

Fonte: Adaptado de Ankarklev et al. (2010).

Segundo Tangtrongsup et al. (2010), os mecanismos patogênicos da giardíase

envolvem uma elevada taxa de apoptose em nível de enterócito, disfunção da barreira

intestinal, produção de toxinas, ativação de linfócitos, encurtamento da borda em escova das

microvilosidades com ou sem atrofia, má absorção intestinal, hipersecreção e aumento do

peristaltismo.

Para Cotton et al. (2011), a indução da apoptose dos enterócitos por Giardia sp.

representa um componente chave na patogênese da infecção. Sendo esta desencadeada e

controlada pela ativação sequencial, em cascata, de enzimas proteolíticas denominadas

caspases e que ocorre logo após a exposição dos hospedeiros aos trofozoítos.

Consequentemente, os pacientes com giardíase crônica apresentam uma área de superfície de

absorção reduzida. Processo esse mediado pela ativação dos linfócitos TCD8+. As células

TCD4+ são responsáveis pela produção de IFN-γ, importante na morte do parasito. O

encurtamento difuso da borda em escova causa deficiências de enzimas que auxiliam na

digestão, limita o acoplamento de nutrientes e absorção de eletrólitos, resultando em

hipersecreção, má-absorção e desencadeando diarreia (COTTON et al, 2011). Normalmente,

no decorrer da infecção, os trofozoítos não penetram no epitélio, não invadem os tecidos

33

adjacentes e nem entram na corrente sanguínea, mantendo-se a infecção restrita ao lúmen

intestinal do hospedeiro parasitado (FAUBERT, 2000).

Naturalmente, o organismo dos hospedeiros reúne uma série de barreiras que

dificultam o estabelecimento da infecção por Giardia sp., entre os quais, podem ser

destacados, o muco, o peristaltismo, as proteases e lipases, os sais biliares, a microbiota e

ainda, as células de Paneth (figura 3). Sobre imunidade desenvolvida durante a giardíase, Li et

al. (2004), mencionam que, no início da patogenia, os mastócitos assumem um papel

importante no controle da infecção, como fontes primordiais de IL-6 (interleucina 6), que

podem, por sua vez, influenciar o desenvolvimento da resposta celular e humoral. Porém,

Roxstrom-Lindquist et al. (2005), defendem a ideia de que mais estudos são necessários para

confirmar o papel dos mastócistos e da IL-6 durante a infecção por este protozoário, uma vez

que, em termos gerais pouco se conhece sobre a expressão de citocinas e quimiocinas no

epitélio intestinal do hospedeiro na giardíase. Os sinais clínicos da infecção são visíveis em

poucos dias, geralmente 6 a 10 dias após a infecção e, com apenas 10 a 100 cistos a infecção

pode ser desencadeada (THOMPSON & MONIS, 2004).

Figura 3. Resposta imune desenvolvida contra Giardia sp. ao longo do tempo de infecção.

Adaptado de: Roxstrom-Lindquist et al. (2005).

O período de incubação da giardíase é de uma a três semanas (9-15 dias) após a

ingestão do cisto pelo hospedeiro e o período pré-patente varia de 10 a 30 dias. No cão é de 5

a 16 dias (média de 10 dias) e os sintomas podem anteceder um a dois dias a eliminação dos

cistos (ZARJAC, 1992).

34

A infecção por G. duodenalis, usualmente, produz uma variedade de manifestações

clínicas tanto em animais quanto em humanos, podendo variar desde casos assintomáticos até

casos agudos e, além disso, há outra forma que deve ser contemplada, que é o quadro de

diarreia crônica (LEWIS & FREEDMAN, 1992; ECKMANN, 2003; OLSON et al. 2000;

JARVINEN, 2007; DOS ANJOS et al, 2013).

Sobre as manifestações clínicas, em casos sintomáticos, os sinais clínicos podem

incluir, desde leves desconfortos abdominais a cólicas abdominais. Quando ocorre diarreia,

esta pode se apresentar sob a forma pastosa ou líquida, pode conter frequentemente muco e

emitir um odor forte característico e, ainda, pode estar presente um sinal clínico conhecido

como esteatorreia (HUBER et al., 2005). A esteatorreia pode ser explicada pela diminuição da

atividade das lipases e também pelo aumento da produção de mucina (GEURDEN et al.,

2010). A giardíase, em geral, não configura ser uma causa frequente de óbitos humanos, mas

pode desencadear quadros de alergias, diarreias, anemias e ainda despesas com diagnóstico e

tratamento (SCHANTZ, 1991).

Mundim et al. (2003) afirmaram que a giardíase em cães, principalmente naqueles

mais jovens, pode causar diarreia intermitente com comprometimento da digestão e absorção

de alimentos, que pode deste modo culminar com desidratação, perda de peso e morte. Em

geral, a giardíase em cães não ocasiona febre, sendo que a diarreia quando ocorre é

normalmente auto-limitante em animais imunocompetentes (MUNDIM et al., 2003). Além

destas questões, a giardíase pode levar a perdas econômicas, especialmente as relacionadas à

redução da produtividade animal (SCHANTZ, 1991).

Em gatos é uma infecção que causa diarreia intermitente, de coloração clara, com odor

fétido, de consistência pastosa a aquosa, podendo em alguns casos, haver recidivas

(MENDES-DE-ALMEIDA et al., 2007). O quadro de má-absorção crônica é de possível

ocorrência em alguns animais domésticos e assim, pode ser observada perda de peso nos

mesmos. É importante dizer que as doenças imunossupressoras ou coinfecções podem, por

sua vez, potencializar o desenvolvimento dos sinais clínicos da doença (VASILOPULOS et

al., 2006; SCORZA & LAPPIN, 2007).

Animais de companhia considerados jovens, com menos de um ano de idade, possuem

uma maior sensibilidade quando comparados aos adultos, indicando o desenvolvimento de

certo grau de resistência com o aumento da idade (KIRKPATRICK, 1987; BECK et al., 2005;

FONTARRANOSA et al, 2006; LOPES et al., 2006; MEIRELES et al, 2008; NIKOLIC et al.,

2008; ITOH et al., 2009; SCORZA & LAPPIN, 2010). Contudo, de acordo com Gates &

Nolan (2009), mesmo havendo evidências de que os animais desenvolvam uma resposta

35

imune às infecções parasitárias, a proteção contra infecções posteriores não parecem ser

absolutas em alguns casos. Outro ponto que merece ser destacado é que em animais adultos a

infecção costuma ser assintomática, sendo raramente detectada. No entanto, em virtude destes

animais não apresentarem sintomatologia e de não serem diagnosticados e tratados, estes são

de extrema importância epidemiológica, uma vez que passam a assumir o papel principal de

disseminadores de cistos de Giardia sp. no ambiente (THOMPSON et al, 2000).

Os animais de companhia quando confinados em instalações com condições sanitárias

precárias, como canis e gatis, são mais vulneráveis, já que nestes locais a re-infecção é

facilitada pela presença do cisto em seus próprios pelos ou em outros animais. Além do mais,

fômites contendo cistos infectantes podem servir como fonte de infecção para os mesmos

(PAYNE & ARTZER, 2009).

Ocasionalmente, a infecção por este enteropatógeno, pode estar associada a sinais

clínicos menos frequentes, tais como, a prurido, urticária, uveíte e sinovite (ROBERTSON et

al., 2009). De acordo com estes autores, em animais, a infecção pode ser auto-limitante em

pacientes imunocompetentes, no entanto, o tratamento é preconizado devido à possibilidade

de cronicidade.

2.3.4. EPIDEMIOLOGIA

Giardia duodenalis é um protozoário de distribuição cosmopolita, ocorrendo tanto em

países em desenvolvimento como em países desenvolvidos (THOMPSON et al., 2000). Em

humanos, conforme os dados fornecidos pela “World Health Organization”, a estimativa era

de 200 milhões de casos de giardíase sintomática por ano (WHO, 1996). Já de acordo com

Lane & Lloyd (2002), a estimativa, por ano, é de aproximadamente 280 milhões de casos

sintomáticos em todo mundo. Sobre sua distribuição em animais de companhia, trata-se de

um parasito frequentemente relatado em todo o mundo (BALLWEBER et al., 2010;

CARMENA et al., 2012; DOS ANJOS et al., 2013).

Quanto a sua forma de transmissão, existem diversos mecanismos, sendo que a via

mais habitualmente citada é a ingestão indireta, na qual a infecção por este parasito ocorre

mediante a ingestão de água ou alimentos contaminados com cistos. No tocante as demais

vias, há a transmissão direta, com importância também considerável e que pode ocorrer por

meio do contato com cistos liberados nas fezes entre pessoas (pessoa-pessoa) ou entre animais

(animal-animal). E sob este aspecto ainda, considerando o contato próximo entre humanos e

36

animais, a forma de transmissão zoonótica não pode ser desprezada (GOMES et al., 2011).

Entre os animais, a transmissão direta ocorre principalmente onde há animais aglomerados,

como por exemplo, em criatórios de cães e gatos (BECK et al., 2005; PAYNE & ARTZER,

2009; GOMES et al, 2011). Logo, o modo de transmissão pode variar de um local para outro,

podendo ainda estar relacionado à heterogeneidade genética do parasito em questão

(NIKOLIC et al., 1993; MELONI et al, 1995).

Há diversos estudos epidemiológicos sobre a giardíase em animais, nos quais foram

empregadas diferentes técnicas de diagnóstico. Sendo assim, foi feita uma revisão para o

presente estudo enfatizando o ano, o local, as técnicas diagnósticas, os hospedeiros, as

frequências relativas e absolutas dos principais estudos epidemiológicos em cães e gatos

envolvendo Giardia duodenalis, conforme pode ser visto no anexo 1.

No Brasil e em todo mundo, a giardíase é uma protozoose usualmente relatada tanto

em humanos quanto em animais domésticos (JACOBS et al., 2001; LANE& LLOYD, 2002;

PAZ e SILVA et al., 2012). Entretanto, conforme pode ser observado no anexo 1, as taxas de

prevalência de G. duodenalis em cães e gatos apresentam variações, que por sua vez estão

associadas a alguns fatores, tais como, o desenho de estudo realizado, a localização

geográfica, o clima, a época do ano, o método utilizado para o diagnóstico, a população

estudada, o estado de saúde do indivíduo e as condições de manejo dos animais (DIXON et

al., 1997; ORTEGA & ADAM, 1997; HUBER et al., 2002; TORRICO et al., 2008;

BRINKER et al., 2009; GOMES et al., 2010; CAVALINI & ZAPPA, 2011; JAROS et al.,

2011). Além disso, em situações de estresse esta protozoose pode assumir uma proporção

maior, já que tais condições possivelmente acarretam uma queda do “status” imunológico do

hospedeiro (TORRICO et al., 2008).

Com relação à idade, a giardíase é mais frequentemente relatada em animais jovens já

que estes são mais susceptíveis a infecção, em razão de possuir um sistema imunológico em

desenvolvimento, hábitos comportamentais que favorecem sua infecção, sendo apontados,

então, como facilitadores dinâmicos da contaminação ambiental devido ao seu maior contato

com o solo e fômites, os quais podem estar contaminados com cistos de Giardia sp. (ROSEZ

et al., 2002; MUNDIM et al., 2003; ALVES et al., 2005; BECK et al., 2005; TORRICO et al.,

2008). No entanto, para outros pesquisadores, os animais mais velhos não podem ser

desconsiderados da epidemiologia das infecções parasitárias, conforme enfatizaram Gates &

Nolan (2009). Estes autores apontam que os exames fecais devem ser solicitados também para

animais adultos, já que a proteção imunológica frente aos enteroparasitos não parece ser

suprema.

37

De acordo com Beck et al. (2005), Giardia duodenalis acomete sobretudo os animais

que vivem em grupos. Os mesmos autores enfatizam que embora exista alta prevalência

nestes ambientes, nem todos os animais apresentam a forma clínica da doença. O fato é que

aglomerados populacionais com condições sanitárias deficientes e o maior contato entre os

hospedeiros são fatores predisponentes para que haja a disseminação deste enteropatógeno, e

ainda para a perpetuação do ciclo deste agente etiológico, conforme referido por Santana et al.

(2014). Neste cenário, Kirkpatric & Farrel (1984), reiteram que os animais errantes e os que

se encontram em abrigos são mais expostos aos fatores de risco, devido ao seu maior contato

com água, alimentos e fezes de animais ou pessoas infectadas, estando, deste modo, mais

vulneráveis.

A giardíase pode ser apontada ainda como uma protozoose de importância para a

saúde coletiva, onde os animais desempenham o papel de hospedeiros deste protozoário

gastrointestinal, favorecendo assim a contaminação ambiental e a possível disseminação deste

patógeno, através do contato direto ou pela via indireta que compreende a veiculação hídrica,

por alimentos e outros materiais contaminados com suas fezes (LANGONI, 2004; KEEPS et

al, 2006; SOTIRIADOU et al., 2013). Mesmo incipientes, já existem alguns relatos de

transmissão zoonótica entre humanos e seus animais de companhia, em particular cães e gatos

(LEIB & ZAJAC, 1999; TRAUB et al, 2004; BECK et al., 2005; VOLOTÃO et al. 2007;

KATAGIRI & OLIVEIRA-SIQUEIRA, 2008; BRINKER et al, 2009; DOS ANJOS et al,

2013). Segundo Keeps et al. (2006), em virtude do conhecimento acerca da contaminação

ambiental por agentes parasitários, é que vem sendo intensamente investigado o caráter

zoonótico de alguns destes nos últimos anos.

Embora haja a possibilidade de Giardia duodenalis ter caráter zoonótico, poucos

estudos têm comparado os seus isolados provenientes de humanos e de seus animais

coabitantes de forma a esclarecer esta questão (PAYNE & ARTZER, 2009). Por meio de

análises moleculares já foi demonstrado que um mesmo genótipo de G. duodenalis pode estar

presente em humanos e em outras espécies de mamíferos (THOMPSON et al., 2000). Feng &

Xiao (2011) também descreveram o potencial de transmissão de Giardia aos humanos pelos

animais, principalmente aos indivíduos imunocomprometidos, considerando cães e gatos

parasitados como origem de infecções humanas.

É importante destacar sobre o problema referente à subestimação dos resultados, uma

vez que a giardíase, em geral, se apresenta de forma assintomática, fator este que pode

contribuir para a geração de dados incompletos ou inconclusivos, e interpretações impróprias

dos dados publicados (SOTIRIADOU et al., 2013).

38

Sendo assim, para um entendimento mais preciso do potencial de transmissão de cães

e gatos para humanos, faz-se necessária a associação dos resultados de estudos biológicos,

moleculares e epidemiológicos. E embora os estudos moleculares sejam a chave para

complementar os outros dois dados, eles isoladamente não são capazes de fornecer respostas

conclusivas para elucidar o papel deste agente na transmissão zoonótica , uma vez que o estudo

ideal envolveria o emprego de diversos genes-alvo para a genotipagem e subgenotipagem de

isolados tanto de origem humana como de origem animal que coabitam em um mesmo local

(BALLWEBER et al. 2010).

Vale ressaltar também que os cistos são resistentes à maioria dos desinfetantes, sendo

capazes de sobreviver ao tratamento da água, podendo passar ainda através das barreiras

físicas, como os filtros com menor capacidade de retenção, ou ser resistentes à cloração,

sendo este último um importante método químico empregado para o tratamento da água

(CACCIÒ et al., 2005; SMITH et al., 2007). Tendo em vista a propriedade de resistência dos

cistos, Tseng et al. (2014) admitem que esta característica seja a grande responsável pela

contaminação das águas por este parasito, o que pode, por conseguinte, culminar com uma

infecção pandêmica.

Além das questões supramencionadas, há ainda o papel dos vetores mecânicos na

transmissão de Giardia sp. Santana et al. (2014), destacam que os cistos podem permanecer

viáveis no meio ambiente por até 60 dias, 24 horas no trato digestivo de moscas e por vários

dias no trato digestivo de baratas, sendo destruídos quando expostos a temperaturas superiores

a 64º C. Logo, estes vetores possuem algum papel na trasmissão deste protozoário.

Assim sendo, considerando a transmissibilidade e ubiquidade de Giardia sp., é

imprescindível que se conheça sua distribuição nas populações que compartilham o mesmo

ambiente, tais como, os animais de estimação e seus proprietários. Há de se considerar ainda o

fato do número crescente de animais de companhia, principalmente nos grandes centros

urbanos, o que leva ao estreitamento do contato entre estes hospedeiros, aumentando assim a

exposição humana a agentes potencialmente patogênicos e, por conseguinte, aos riscos

inerentes desta protozoose (GENNARI et al., 1999; KEULEN et al., 2002; APPELBEE et al.,

2005). Contudo, a infecção por si só não deve ser observada isoladamente, segundo Gomes et

al. (2011), deve-se estar atento aos problemas relacionados às condições sanitárias e

econômicas da população, os quais incluem hábitos higiênicos precários, má-nutrição e as

imunodeficiências em geral, que permitem o estabelecimento da infecção de forma mais

proeminente e também pelos muitos casos de giardíase sintomática.

39

2.3.5. PREVENÇÃO E CONTROLE

O caminho mais efetivo para prevenir a infecção e as reinfecções por Giardia sp. é

eliminar a disseminação ambiental dos cistos e evitar a ingestão dos mesmos (ROBERTSON

& THOMPSON, 2002; TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010).

Logo, alguns procedimentos devem ser preconizados de maneira a evitar infecção por

este patógeno, sendo estes, a fervura e a filtração de águas coletadas do ambiente para

consumo, uma vez que a cloração da água não é um meio completamente efetivo para efetuar

a prevenção desta protozoose. Entretanto, cabe ressaltar que a fervura não é um procedimento

aplicável na prática de coletividade, por ser considerado caro e ainda alterar o sabor da água.

Uma outra medida importante é o manejo do ambiente, como por exemplo a prática de

recolhimento de fezes dos animais de companhia em locais públicos, bem como o destino

adequado para os referidos dejetos (TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010).

Os banhos devem ser considerados, especialmente em animais nos quais se verifique a

presença de diarreia (TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010). Assim, de acordo com

Tangtrongsup & Scorza (2010) e Dos Anjos et al. (2013), para reduzir os riscos de giardíase

em animais, deve-se manter a limpeza da água e do ambiente de maneira a estabelecer o

controle das infecções recorrentes.

Portanto, algumas estratégias devem ser adotadas como tentativa de contornar o

problema supracitado, tais como, limpeza e descontaminação do ambiente com desinfetantes à

base de amônia quaternária deixando-a agir por quarenta minutos no local, prevenir a

reintrodução da infecção isolando os animais com diarreia, educação sanitária e higiene das

liteiras e fômites (BARR & BOWMAN, 1994; SCORZA & LAPPIN, 2010).

Segundo Scaramozzino et al. (2009), provavelmente existe uma correlação entre os

elevados níveis de prevalência e o contingente populacional animal, deste modo, os animais

que se encontram abrigados em canis e gatis, são então, considerados focos de dispersão de

patógenos. Por isso, os autores recomendam como medidas profiláticas relevantes isolar os

animais novos e a realização de exame parasitológico de fezes periodicamente, além do uso

da água fervida de maneira à inativar os cistos.

De acordo com Tangtrongsup & Scorza (2010), os vetores mecânicos devem ser

também controlados, pois estes podem contribuir para a dispersão dos cistos.

O tratamento da giardíase, na Medicina Veterinária, é geralmente empreendido e

existem diversos fármacos que podem ser utilizados para a terapêutica da giardíase. Mas o

40

fármaco de escolha tem sido basicamente o metronidazol e outros nitroimidazóis pela boa

eficácia e pelos menores efeitos colaterais por eles ocasionados (LALLO et al., 2003). Apesar

de a quimioterapia ser eficiente para eliminar a infecção, frequentemente podem ocorrer casos

de reinfecção decorrentes da contaminação ambiental, condições estas normalmente

associadas a condições de higiene inóspitas. Logo, a eliminação das fontes de infecção deve

ser estabelecida na tentativa de evitar a ocorrência de novas infecções (THOMPSON, 1998).

Além disso, acredita-se, que a adição de fibra na dieta pode auxiliar no controle dos sinais

clínicos em alguns animais, uma vez que auxilia no controle da microbiota, inibindo com isso

a adesão dos trofozoítos às microvilosidades intestinais. No entanto, a administração desses

prebióticos não diminui os índices de infecção (TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010).

Além das medidas preventivas acima citadas, há também uma vacina contra Giardia

sp., que foi proposta para animais de companhia e sua utilização assume duas vertentes,

inicialmente foi utilizada para fins preventivos e posteriormente foi assumindo um aspecto

mais terapêutico, particularmente em animais com infecção crônica (GRUFFYD-JONES et

al., 2013). Esta vacina (GiardiaVax® - Zoetis) foi produzida com base em trofozoítos

inativados de Giardia e inicialmente introduzida nos EUA com fins profiláticos e terapêuticos

para cães e gatos (OLSON et al., 2000). Possui aparentemente uma capacidade para diminuir

a duração da excreção dos cistos, e deste modo, pode constituir uma ferramenta útil para

diminuição das taxas de incidência da infecção e consequentemente a contaminação

ambiental, sendo de extrema importância em animais imunocomprometidos (ROBERTSON

& THOMPSON, 2002). Atualmente, observa-se uma descontinuidade no emprego da mesma,

já que sua eficácia não foi comprovada em alguns estudos (TANGTRONGSUP & SCORZA,

2010).

2.3.6. DIAGNÓSTICO

O diagnóstico clínico é considerado como presuntivo, já que as manifestações clínicas

observadas são inespecíficas e com isso, normalmente os exames laboratoriais são assim

solicitados de forma a garantir um diagnóstico definitivo de giardíase.

Existem inúmeros métodos diagnósticos para avaliação de Giardia duodenalis em cães

e gatos, sendo os mais comumente utilizados o exame parasitológico de fezes empregando-se

microscopia óptica, o ensaio imunoenzimático (ELISA) e a imunocromatografia. Porém não

existe um teste que seja 100% sensível para avaliação de amostras de fezes, por isso, a

41

combinação de testes para a confirmação do diagnóstico é frequentemente indicada, podendo

esta ser uma associação entre o exame parasitológico de fezes e técnicas imunológicas ou com

técnicas moleculares (TABOADA & MERCHANT, 1997; SCORZA & LAPPIN, 2007).

2.3.6.1. EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES

De uma forma geral, o exame coproparasitológico é o diagnóstico convencional e o

primeiro a ser requerido para giardíase, o qual se baseia no processamento das fezes por

diferentes técnicas, seguido de observação pela microscopia óptica para detecção de cistos

e/ou trofozoítos de G. duodenalis (GARCIA et al., 2006). Os métodos tradicionais para o

diagnóstico deste protozoário incluem o exame direto e as técnicas de concentração, as quais

podem ser baseadas na sedimentação ou na flutuação com soluções de densidades distintas

(como as soluções de sacarose, cloreto de sódio ou sulfato de zinco) (GARCIA, 2001;

CLETO, 2014).

O exame microscópico de fezes consiste em reconhecer as formas evolutivas típicas

dos parasitos, distinguido-as dos demais constituintes dos materiais fecais. Apresenta valor

preditivo igual a uma unidade (=1) (KATAGIRI & OLIVEIRA-SEQUEIRA, 2007).

O exame parasitológico de fezes pode ser realizado em fezes líquidas ou diarréicas,

neste caso, pode-se empregar o exame direto, no qual um fragmento da amostra fecal é

diluído em solução salina e posteriormente observado em microscópio óptico para detecção e

identificação de trofozoítos. Assim sendo, o exame direto de fezes ou exame a fresco é

preconizado primordialmente para detectar formas móveis de parasitos, tais como, trofozoítos

de protozoários e larvas de helmintos (KATAGIRI & OLIVEIRA-SEQUEIRA, 2010).

Conforme referido por Estevez & Levine (1985), trata-se de um método simples e rápido,

cujos resultados positivos são tão válidos como àqueles obtidos com os métodos de

concentração.

De acordo com Sloss et al. (1999), o exame direto pode ser empregado em situações

em que se deseja verificar as estruturas menos densas ou aquelas que podem ser distorcidas

mediante a adição de soluções específicas, como é o caso de trofozoítas de Giardia sp. O

exame direto tem como principais limitações o fato de avaliar uma quantidade muito ínfima

de fezes e a dificuldade de examinar amostras acondicionadas com conservantes, pois neste

último caso, os parasitos morrem e com isso perdem sua motilidade (BOWMAN et al. 2003).

Embora o exame direto possibilite a detecção de ovos e/ou larvas de helmintos, e cistos e/ou

42

oocistos de protozoários estes são mais comumente encontrados quando se utilizam as

técnicas de concentração, particularmente àquelas que empregam os princípios de flutuação.

Cabe lembrar que podem ser empregadas técnicas de coloração, como por exemplo,

hematoxilina férrica, para facilitar a observação das características morfológicas do parasito

(DE CARLI, 1994).

Por outro lado, em fezes formadas, nas quais se espera a observação das estruturas

císticas, utilizam-se os métodos de concentração para a detecção das mesmas (SOUZA et al.,

2003). Assim sendo, as técnicas coproparasitológicas que empregam procedimentos de

concentração acabaram substituindo o exame direto de fezes na rotina diagnóstica.

Tangtrongsup & Scorza (2010) citam que tais técnicas são de grande utilidade na rotina

clínica, uma vez que são consideradas como não invasivas, de fácil execução e pouco

dispendiosas, podendo as amostras serem armazenadas a 4° C por vários dias.

Os métodos de flutuação, que podem ser gravitacionais ou por centrifugação, se

baseiam na diferenciação de densidade específica (D.E) entre as formas evolutivas dos

parasitos e os detritos fecais, em uma solução empregada para flutuação (DRYDEN et al.,

2005). A técnica de flutuação com solução de sulfato de zinco (ZnSO4) a 33% (D.E. = 1,18),

parece ser a ideal, principalmente pelo fato de não induzir alterações morfológicas nos cistos,

facilitando a sua indentificação, diferentemente do que ocorre com as soluções de açúcar

(D.E. = 1,27) que parecem provocar distorções em nível citoplasmático ou influenciar no

processo de flutuação em fezes esteatorreicas. Já quando se utiliza soluções de cloreto de

sódio (NaCl) verifica-se um rápido processo de cristalização a temperatura ambiente, o que

também dificulta a observação do parasito (TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010).

Para Katagiri & Oliveira-Sequeira (2010), estes métodos baseados na flutuação de

estruturas parasitárias possuem a limitação de exigir o pronto exame das lâminas

confeccionadas após emprego das soluções saturadas, em virtude da possibilidade de

alterações na morfologia do parasito.

As técnicas que utilizam a sedimentação para a concentração de formas evolutivas

parasitárias são especialmente recomendadas para detectar infecções por helmintos que

liberam ovos pesados, no entanto, permitem a recuperação de cistos ou oocistos de

protozoários, caso seja empregado um maior tempo de sedimentação (GARCIA, 2001). Tais

técnicas podem ser realizadas de várias formas, sendo estas, natural (gravitacional), por

centrifugação ou por meios químicos (TRUANT et al., 1981). A sedimentação por força

gravitacional possui como vantagens sua simplicidade, e o fator de não alterar a viabilidade

das estruturas parasitárias. As suas limitações incluem: a produção de uma preparação

43

contendo uma grande quantidade de detritos que dificulta a indentificação dos parasitos e o

longo tempo requerido para que a sedimentação espontênea ocorra. A sedimentação por

centrifugação elimina apenas o último impasse, o fator tempo (KATAGIRI & OLIVEIRA-

SEQUEIRA, 2007).

Na literatura, os diferentes achados sobre ocorrência e recorrência de parasitos,

sobretudo em animais de companhia são em sua maioria geradas pela realização das técnicas

que empregam a concentração da amostra fecal, dada as suas vantagens em relação ao exame

direto das fezes (TAPARÓ et al., 2006). Contudo, considerando a baixa sensibilidade do

exame coproparasitológico quando se emprega uma única amostra coletada, Zajac et al.

(2002) propuseram que a condução seriada dos exames parasitológicos de fezes seria

fundamental para melhorar a sensibilidade da técnica. Segundo Anderson et al. (2004), a

sensibilidade desta técnica quando se analisa uma única amostra fecal é de aproximadamente

70%, mas considerando a questão de intermitência na liberação dos cistos, o ideal é que se

realize a coleta de três amostras com intervalos de 2 a 3 dias, neste caso, observa-se uma

elevação da sensibilidade para 96%.

Além de todos estes pontos relacionados a sensibilidade intrínseca, há de se considerar

ainda os fatores extrínsecos que podem influenciar na eficiência de um determinado método

diagnóstico e nos seus resultados, a saber: o volume da amostra examinada, o tempo de

coleta, o uso de líquidos conservantes e as condições de envio ao laboratório. Há de se

considerar ainda que as amostras velhas ou precariamente preservadas são causas comuns de

erros diagnósticos (ASH & ORIEHL, 1987).

Dentre todas estas ferramentas diagnósticas supracitadas, o método de flutuação

utilizando a solução de sulfato de zinco (técnica de Faust et al., 1939) é considerado o

método diagnóstico de escolha na giardíase (SHERDING & JOHNSON ,1998; MUNDIM et

al., 2003; BARTMANN & ARAUJO, 2004; DA SILVA et al. 2007). Para Payner & Artzer

(2009), esta técnica é, de fato, designada como padrão ouro para o diagnóstico desta

protozoose. Da Silva et al. (2007), em seu estudo comparativo, demonstraram uma maior

porcentagem de amostras positivas pela técnica de flutuação quando comparado com os

resultados da técnica de sedimentação. Segundo Barr et al. (1992), mesmo a técnica de Faust

et al. (1939) sendo eficaz para detecção de cistos de Giardia sp., o sucesso do diagnóstico

nem sempre é atingido, sendo assim necessária a utilização de métodos mais sensíveis e

específicos, considerando, sobretudo, a intermitência do ciclo deste parasito.

Além da irregularidade de excreção dos cistos que pode culminar frequentemente com

os resultados falso-negativos, há ainda, os animais considerados como “baixos excretores”

44

que podem passar um período de até 21 dias sem eliminar cistos (ADAM, 1991; TABOADA

& MERCHANT, 1997; BRINKER et al., 2009). Além do mais, deve-se ter em mente

algumas limitações relacionadas ao exame parasitológico de fezes, já que é um método que

requer um tempo considerável para sua execução, sendo necessários procedimentos

apropriados de preparação e também necessita de um treinamento adequado do profissional

para que este possa diferenciar corretamente os cistos de Giardia sp. dos demais cistos de

protozoários, estruturas parasitárias e detritos fecais (WILSON & HANKENSON, 2010).

Na Medicina Veterinária, o método de escolha para o diagnóstico de cistos de Giardia

sp. é também o de flutuação com sulfato de zinco, apresentando uma especificidade de 100%,

conforme relataram Tangtrongsup & Scorza (2010). estes autores e Papini et al. (2013),

propõem a coleta de pelo menos três amostras fecais para serem submetidas aos exames

microscópicos de fezes, de forma a elevar a sensibilidade da técnica para 95%, dada a

intermitência natural na liberação de cistos, que leva ao declínio da sensibilidade da mesma

para 70%.

Em suma, as limitações do procedimento de diagnóstico microscópico incluem o baixo

número de cistos nas fezes, eliminação intermitente, pequeno tamanho dos cistos o que pode

levar a possíveis erros de identificação, principalmente de técnicos inexperientes, e a baixa

sensibilidade. Para Geurden et al. (2008), há ainda, os casos de esteatorreia, algumas vezes

presente no quadro clínico, que podem interferir na flutuação em algumas soluções, como, por

exemplo, na solução de sacarose. Estes autores mencionam também que a falta de um

treinamento adequado ou o cansaço do microscopista pode gerar resultados falso-negativos,

havendo então, a necessidade de métodos mais sensíveis e específicos para o diagnóstico de

G. duodenalis. É importante ressaltar que na rotina de clínica veterinária, alguns fatores como

disponibilidade de tempo do proprietário e até o custo, podem inviabilizar a realização de

duas ou três amostras como é o indicado (BARTMANN & ARAÚJO, 2004).

Segundo Geurden et al. (2008), mesmo que os testes parasitológicos clássicos sejam

apontados como referência para o diagnóstico desta protozoose, estudos recentes revelaram

que a sensibilidade destes pode ser relativamente baixa se comparada ao novo arsenal de

técnicas diagnósticas disponíveis. Com isso, nas últimas décadas, as técnicas imunológicas

foram emergindo neste cenário como tentativa de melhorar a sensibilidade das metodologias e

contornar as limitações relativas às técnicas parasitológicas de fezes até então utilizadas para

o diagnóstico de giardíase (DIXON et al., 1997; OLSON et al. 2010; DOS ANJOS et al,

2013).

45

Desta maneira, os testes complementares, embora mais onerosos, podem ser usados

para a detecção deste enteroparasito, para uma melhor confiabilidade dos resultados. Contudo,

os exames parasitológicos de fezes não devem ser substituídos sob nenhuma hipótese nos

exames laboratoriais de rotina, já que é a única técnica capaz de detectar outros parasitos

gastrointestinais na amostra (DRYDEN et al., 2006; DOS ANJOS et al., 2013).

2.3.6.2. TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

Nas últimas décadas, o diagnóstico de giardíase sofreu grandes tranformações diante

do advento das técnicas imunológicas. A baixa sensibilidade da técnica de microscopia, por

exemplo, pôde ser aumentada graças ao emprego de anticorpos fluorescentes utilizados na

imunofluorescência e também pelos métodos destinados a detecção de antígenos proteicos de

Giardia sp. em amostras fecais (DRYDEN et al., 2006). Assim, as técnicas imunológicas para

o diagnóstico da giardíase compreendem os seguintes métodos: imunofluorescência; ensaios

imunoenzimáticos, tendo como técnica principal o ELISA; o teste imunocromatográfico; e as

técnicas indiretas para detecção de anticorpos anti-Giardia no soro. Todavia, há uma fraca

correlação entre os títulos de anticorpos anti-Giardia e a presença de infecção aguda

(ROSOFF et al., 1989). E com isso, a detecção de anticorpos do parasito foi caindo em

desuso.

Para Santana et al. (2014), a sensibilidade dos testes imunológicos pode variar de 85 a

100%. Estes autores citam que o emprego dos mesmos pode contribuir para o diagnóstico de

giardíase uma vez que resolveria o problema dos resultados falso-negativos, resultados estes

frequentemente evidenciados pelo exame parasitológico de fezes com posterior análise pela

micrscopia óptica. Por outo lado, os resultados falso-positivos pelas técnicas imunológicas

também devem ser considerados conforme suscitaram Strand et al. (2008), sendo estes

decorrentes da presença de antígenos solúveis nas amostras fecais, mesmo após a eliminação

do parasito. Entretanto, para Olson et al. (2010), a presença destes antígenos nas amostras

fecais já são por si só, indicativo de que o hospedeiro contêm Giardia sp. e assim pode liberar

cistos em suas fezes contaminando o ambiente.

As técnicas imunológicas para detecção de antígeno utilizam anticorpos monoclonais

que se ligam especificamente a proteínas da parede do cisto e/ou do trofozoíto (GEURDEN et

al., 2008). Enquanto a técnica de imunofluorescência tem a capacidade de detectar estruturas

parasitárias intactas, os testes imunoenzimáticos e imunocromatográficos possuem a

46

propriedade de detectar antígenos solúveis nas fezes (GARCIA et al., 1993; GARCIA &

SHIMIZU, 2000).

A técnica de imunofluorescência direta (IFD) é realizada utilizando-se um anticorpo

monoclonal marcado com fluoresceína, com sensibilidade e especificidade de

aproximadamente 100% e 99,8%, respectivamente. É importante reiterar que a IFD

complementa a leitura de uma técnica parasitológica de fezes e os seus parâmetros de

qualidade também podem variar em função desta. Há de se considerar ainda que baseado em

sua maior sensibilidade e especificidade, alguns pesquisadores consideram esta metodologia

como padrão de referência para detecção de Giardia sp. em fezes caninas e felinas

(RISHNIW et al., 2010). Além disso, são consideradas como desvantagem desta, a

necessidade de se possuir um microscópio de fluorescência, o tempo de execução e mão-de-

obra especializada e, como vantagens, a impossibilidade de gerar resultados falso-positivos,

além de possibilitar a observação morfológica do organismo (RISHNIW et al., 2010;

TANGTRONGSUP & SCORZA, 2010). Já Corripio et al. (2010) apontam como vantagens

desta técnica: ser uma metodologia rápida, de fácil interpretação, e com isso podem ser

utilizadas com um bom desempenho para estudos de cunho epidemiológico.

Sobre os enzaios imumoenzimáticos para Giardia, de acordo com Garcia & Shimizu

(1997) e Rimhanen-Finne et al. (2007), as metodologias que envolvem tais ensaios possuem

uma alta sensibilidade e especificidade (> 90%), e com isso, podem ser utilizados com uma

relativa relevância na rotina clínica, pois fornecem resultados de forma rápida e não requer

um profissional treinado, especialmente em situações de surtos e riscos a saúde coletiva, visto

que são técnicas extremamente úteis em situações nas quais a carga parasitária é baixa.

Ungar et al. (1984) mostraram que as técnicas imunoenzimáticas possuem uma

sensibilidade de 92% e especificidade de 98%, porém, os mesmos atentam para o

inconveniente relativo a necessidade de serem empregados em amostras fecais frescas. No

entanto, tais técnicas foram sofrendo adaptações e tiveram uma melhoria em sua sensibilidade

e especificidade para 99% e 100%, respectivamente, a partir da aplicação de antígenos

específicos de Giardia sp., tais como GSA65 (65-KDa), proteína esta produzida

abundantemente pelos trofozoítos quando estes se multiplicam dentro do trato intestinal do

hospedeiro (GREEN et al., 1985; BIANCIARDI et al., 2004). Posterior a este evento, os kits

comerciais passaram a empregar estes antígenos, o que permitiu ampliar o uso dos ensaios

imunoenzimáticos, uma vez que a sensibilidade e especificidade aumentaram, sendo possível,

então, a sua utilização em amostras não-frescas, isto é, em amostras congeladas por um tempo

indeterminado (VIDAL & CATAPANI, 2005).

47

Dentre os ensaios imunoenzimáticos, o mais utilizado é o ELISA, o qual pode detectar

coproantígenos proteicos de G. duodenalis (UNGAR et al., 1984). A técnica de ELISA é de

fácil execução, menos demorada e permite o processamento simultâneo de um número

considerável de amostras sendo ainda uma técnica específica e com uma sensibilidade

relevante (ROCHA et al., 1999; VIDAL & CATAPANI, 2005; GEURDEN et al., 2008;

PAPINI et al., 2013). A sensibilidade e especificidade da técnica de ELISA são,

respectivamente, de 95% e 99% em comparação com o exame parasitológico de fezes

(MEKARU et al., 2007).

Conforme apontado por Knisley et al. (1989), as técnicas que procuram antígenos de

Giardia sp., como por exemplo, o ELISA, têm sido caracterizadas como indefinidamente

estáveis, posto que podem ser empregadas em amostras refrigeradas por uma semana e

congeladas. Segundo estes autores os diversos episódios de descongelamento e congelamento

parecem não afetar os resultados obtidos pelo ELISA. Porém, Ungar et al. (1984) suscitaram a

ideia de que é possível que a intensidade colorimétrica dos resultados da reação possa ser

reduzida por múltiplos (dois ou mais) eventos de descongelamento/congelamento,

principalmente quando as amostras contiverem baixos níveis antigênicos.

O estudo de Papini et al. (2013) confirmou a eficiência do ELISA para o diagnóstico

de giardíase canina e, além disso, forneceu evidências de que é possível aplicá-lo em fezes

caninas oriundas do ambiente/solos contaminados. E com isso, esta técnica pode ser

razoavelmente incluída, como uma alternativa válida e ainda como um recurso complementar

a outras técnicas em estudos epidemiológicos para identificação de áreas expostas ao risco de

contaminação ambiental.

Em relação aos testes imunocromatográficos, são procedimentos nos quais

normalmente utilizam-se kits comerciais, e estes, por sua vez, permitem que o diagnóstico de

Giardia sp. em cães e gatos seja realizado sem auxílio de equipamentos especiais e sem as

dificuldades intrínsecas das técnicas parasitológicas de fezes (OLSON et al, 2010). Nestes

testes empregam-se anticorpos e antígenos específicos no intuito de que o parasito seja assim

isolado e imobilizado no substrato (membrana do kit). Possui como vantagens ser um método

muito eficiente, de rápida execução, menos laborioso, de fácil interpretação, sendo que alguns

autores o consideram de baixo custo, já que os custos com reagentes são ínfimos (GARCIA et

al., 2003; PITÃES et al., 2015). Os mesmos autores salientam que se trata de uma técnica

extremamente útil quando não se tem um microscopista treinado, o que leva a redução dos

erros diagnósticos. Pillai & Kain (1999) enfatizam outras vantagems em relação à técnica, que

são: a estocagem dos seus kits, já que esta pode ser realizada em temperatura ambiente; e a

48

presença dos controles positivos e negativos já contidos na tira do teste. Em contrapartida,

citam como desvantagens, a necessidade deste recurso diagnóstico ser utilizado em amostras

fecais frescas ou recentemente congeladas, sem conservantes.

Segundo Behr et al. (1996) e Garcia et al. (2003), as técnicas imunológicas para

detecção de antígenos possuem como vantagens sua alta sensibilidade e especificidade, além

da sua acurácia e simplicidade, tendo em vista a sua capacidade de detectar quantidades

mínimas de antígeno em situações nas quais a densidade parasitária é mínima, enquanto que a

questão do custo empreendido para sua execução parece ser a principal desvantagem.

Convém salientar, que todos os métodos de detecção de antígenos geram bons

resultados no que diz respeito à sensibilidade e especificidade. Não obstante, apresentam

como maiores desvantagens o fato de serem dispendiosos (DOGRUMAN AL et al., 2006).

Todavia, apenas a IFD, permite a quantificação de cistos por grama de fezes. Neste sentido, a

imunofluorescência direta, é uma técnica bem utilizada para detecção e quantificação de

cistos e oocistos em águas, na qual, o micro-organismo de interesse é observado ao

microscópio de epifluorescência e, através de suas características morfológicas, é detectado e

quantificado, conforme referido por Greinert (2002).

As vantagens dos ensaios imunoenzimáticos sobre a imunofluorescência, são, em

primeiro lugar, que um número considerável de amostras pode ser analisado simultaneamente

e, secundariamente, há de se considerar a possibilidade de uma leitura mais objetiva por meio

de um espectofotômetro contra a subjetividade da microscopia por fluorescência (GARCIA &

SHIMIZU, 1997). A imunocromatografia, por sua vez, possui vantagens em relação às demais

técnicas imunológicas, que são, a possibilidade desta ser realizada a campo, não havendo

necessidade de ser executada em laboratórios, e a sua rapidez para fornecer os resultados e

facilidade de leitura (GEURDEN et al., 2008).

Contudo, um estudo comparativo realizado por Geurden et al. (2008) em cães, revelou

que o método de IFD foi o que demonstrou maior sensibilidade, seguido da

imunocromatografia, sendo o exame parasitológico menos sensível. No entanto, para Behr et

al. (1997) a utilidade das técnicas de detecção de antígenos torna-se limitada mediante casos

em que o paciente ainda manifesta sintomatologia, uma vez que estas técnicas detectam

coproantígenos e não os cistos e/ou trofozoítos deste protozoário e demais estruturas

parasitárias que podem estar presentes nas amostras fecais, assim, não permitem predizer a

intensidade da infecção e nem diagnosticar a infecção por outros parasitos gastrointestinais.

Nestas situações, recomenda-se o exame microscópico, para diagnóstico de outras estruturas

parasitárias condizentes com outros parasitos gastrointestinais.

49

Considerando que a maioria dos métodos imunológicos foi elaborada para utilização

em amostras humanas e que não há padronização destes para amostras de origem animal,

pode-se inferir que os estudos de prevalência e de comparação utilizando diferentes

metodologias disponíveis para o diagnóstico de giardíase são de suma importância, uma vez

que auxiliam na análise dos parâmetros inerentes aos métodos diagnósticos. E além disso,

conforme referido por alguns autores, os mesmos podem auxiliar na padronização destas

técnicas para sua utilização nos diversos hospedeiros infectados e, consequentemente,

contribuindo para uma obtenção mais fidedigna dos resultados (VIDAL & CATAPANI,

2005; DE VASCONCELOS et al., 2006; RIMHANEN-FINNE et al. 2007).

Entretanto, apesar da importância dos métodos para o diagnóstico da giardíase, sua

padronização para plena utilização em amostras animais é substancialmente limitada, já que

geralmente se empregam os exames parasitológicos de fezes nestes espécimes clínicos,

principalmente em função do seu menor custo, sendo que estes apresentam baixa

sensibilidade. Com isso, é comum haver falhas diagnósticas e assim o tratamento correto não

é empreendido, possibilitando as reinfecções de algumas ou novas fontes ambientais,

conforme observaram Gates & Nolan (2009).

2.3.6.3. MÉTODOS MOLECULARES

Técnicas moleculares, como a PCR, também podem ser realizadas para diagnóstico de

Giardia duodenalis. Estas são utilizadas para amplificar o DNA do parasito em amostras

fecais, podendo determinar os genótipos pela avaliação das sequências nucleotídicas obtidas o

que é importante para estudos de cunho epidemiológico (SCORZA & LAPPIN, 2007). As

maiores vantagens das técnicas moleculares são a sua elevada sensibilidade, já que a liberação

dos cistos de Giardia geralmente é baixa, não podendo ser detectável facilmente em outros

métodos de diagnóstico e a possibilidade da determinação do genótipo causador da infecção

(IVANOV, 2010). As técnicas moleculares baseadas na PCR apresentam maior sensibilidade,

sendo necessário apenas um cisto para gerar um resultado positivo, e também uma maior

especificidade, se comparadas às demais técnicas (GRUFFYDD-JONES et al., 2013).

Possui como desvantagem o custo elevado. Entretanto, durante os últimos anos, o

custo destes diminuiu ligeiramente, enquanto que a sua qualidade melhorou, tornando este um

método altamente importante de classificação e até mesmo de detecção (SULAIMAN &

CAMA, 2006). Além disso, considerando que as fezes são quimicamente complexas, a

50

extração de DNA a partir de amostras fecais torna-se difícil. Produtos de degradação da

hemoglobina, ácidos biliares e os íons de minerais, que estão presentes nas amostras de fezes,

podem inibir a amplificação do DNA e ocasionar resultados falsos negativos em ensaios

moleculares (NANTAVISAI et al., 2007). Com isso, as condições de armazenamento das

fezes são muito importantes para o diagnóstico de parasitoses intestinais e outros

microrganismos por meio de abordagens moleculares (KUK et al., 2012). Existem diversos

genes-alvo que podem ser empregados nestas técnicas de cunho molecular, tais como, os

genes de cópia única (β-giardina) e os de loci comuns (SSUrRNA, fator de elongação 1α,

gdh) (BALLWEBER et al., 2010). Outra limitação das técnicas moleculares que pode ser

levantada é a escolha de genes alvos adequados e que sejam facilmente amplificados

(SULAIMAN & CAMA, 2006).

Partindo da premissa de que a PCR e outras técnicas moleculares têm a melhor

sensibilidade e especificidade para a detecção de Giardia duodenalis, estas, quando

combinadas, fornecem informações mais abrangentes sobre a genotipagem deste protozoário

(CACCIÒ et al., 2002; MCGLADE et al., 2003). Assim, o uso de ferramentas moleculares

não só confirma a validade de uma espécie, mas pode identificar subpopulações específicas,

também descritas como genótipos (assemblages) ou subgenótipos (MONIS et al., 1999).

Vários estudos filogenéticos vêm sendo empreendidos com base na caracterização de

sequências nucleotídicas de genes-alvo diversos, tais como, o gene codificador da enzima

glutamato desidrogenase (gdh), o fator de elongação 1α (EF1α), o gene codificante da menor

subunidade ribossômica (SSU rRNA), e o gene codificante da enzima triosefosfato isomerase

(tpi) (MONIS et al., 1999; SULAIMAN et al., 2003). Além destes alvos, há o gene

codificador da proteína β-giardina, um gene de cópia única e que vem sendo utilizado também

para estudos de subgenotipagem, sendo então, capaz de definir pelo menos 8 subgenótipos

dentro do genótipo A e pelo menos 6 subgenótipos dentro do genótipo B, conforme referido

por Lalle et al. (2005).

Portanto, os métodos moleculares têm sido uma ferramenta válida para esclarecer a

complexidade referida a Giardia duodenalis e seus resultados a caracterizam como uma

espécie heterogênea. Todavia, novos recursos são necessários para fornecer a classificação

genotípica e subgenotípica, especificamente no que tange os genótipos A e B. Tais

ferramentas podem basear-se em loci únicos ou múltiplos e em microssatélites, e devem ser

desenvolvidas e avaliadas de forma a elucidar o status taxonômico desta espécie e esclarecer a

sua potencialidade no que diz respeito à transmissão zoonótica (BALLWEBER et al., 2010).

51

Estudos publicados vêm indicando a similaridade genética entre os genótipos

presentes em humanos e em muitas espécies de animais, o que suscita a hipótese da

transmissibilidade deste parasito entre diferentes espécies de hospedeiros, o que leva a

caracterizá-lo, de certa forma, como zoonótico. Assim sendo, G. duodenalis continua a ser um

patógeno emergente em vários cenários epidemiológicos, com isso, as ferramentas

moleculares, principalmente baseadas na PCR, são valiosas na identificação das rotas e da

dinâmica de transmissão deste ao fornecer dados mais robustos para estudos epidemiológicos

ou biológicos. Todavia, somente estes dados não são capazes de fornecer ao certo respostas

conclusivas com relação a essas questões (SCHANTZ, 1991; SULAIMAN et al, 2003;

BALLWEBER et al., 2010).

De acordo com Ballweber et al. (2010), as ferramentas moleculares embora

promissoras, ainda se apresentam de forma escassa e com isso não são capazes de traçar um

perfil de trasmissão completo do parasito em questão. Para estes autores, o estudo ideal para

elucidar estas incertezas seriam os longitudinais empregando vários genes-alvo para a

genotipagem e subgenotipagem de amostras positivas oriundas de animais de companhia e

humanos que compartilham o mesmo local.

3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

Comparar diferentes metodologias parasitológicas e imunológicas para diagnóstico de

G. duodenalis em amostras fecais caninas e felinas.

3.2. ESPECÍFICOS

Realizar exame parasitológico de fezes (EPF) nas amostras fecais de cães e gatos

através de técnicas de flutuação e sedimentação com posterior visualização por

microscopia óptica.

Adaptar a metodologia do ensaio imunocromatográfico para utilização em sedimentos

de amostras fecais e comparar o seu desempenho em relação ao tempo de

congelamento das amostras.

Empregar o método imunocromatográfico para detecção de antígenos de Giardia

duodenalis nos sedimentos fecais de felinos e caninos.

Executar o método imunoenzimático (ELISA) para detecção de coproantígenos de G.

duodenalis nos sedimentos fecais de felinos e caninos.

Comparar os resultados da microscopia óptica, do teste imunocromatográfico e do

ensaio imunoenzimático (ELISA).

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. AMOSTRAS

Para a realização do presente estudo foram selecionadas amostras fecais de cães e

gatos pertencentes a dois bancos de amostras distintos, sendo estes, os dos laboratórios de

Parasitologia (n=7, todas de gatos) e de Virologia (n=24, todas de cães), localizados no

Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense - UFF. Todas as amostras fecais

provenientes destes bancos já haviam sido previamente analisadas pelo exame microscópico e

possuíam um tempo de armazenamento que variava de 1 a 13 anos em temperatura de – 20ºC

sem conservação química.

Para compor o quantitativo de amostras necessárias para realização dos ensaios de

comparação de técnicas diagnósticas, também foram coletadas amostras fecais de ambos os

hospedeiros (cão n=26; gato n=43). Após a coleta, as amostras foram acondicionadas em

potes plásticos sem líquido conservante e, assim, foram devidamente identificadas e

conservadas em geladeira por no máximo 24 horas até o seu processamento para realização do

exame parasitológico de fezes, o qual foi realizado no Laboratório de Diagnóstico

Coproparasitológico, localizado no Instituto Biomédico da UFF.

Sendo assim, utilizou-se um total de 100 amostras, sendo 50 amostras caninas e 50

amostras felinas. Com relação à origem, estas foram provenientes de animais domiciliados,

54

errantes e de abrigos coletivos, de diferentes locais do estado do Rio de Janeiro e com sexos,

raças e idades variadas. É importante salientar que foi utilizada apenas uma amostra fecal de

cada animal no presente estudo, em virtude do bancos de amostras supracitados possuírem

apenas um exemplar de sedimento fecal de cada animal. As informações sobre as amostras

utilizadas no presente estudo podem ser observadas nos quadros 3 e 4.



amostras de gatos utilizadas no presente estudo.[a1]

Amostras obtidas da coleção do Laboratório de Parasitologia da UFF

Amostra Origem Faixa

etária

Sexo Raça Data processamento EPF e congelamento

do sedimento

1 ND ND F ND 03/05/2012

2 ND ND ND ND 17/05/2012

3 ND ND M SRD 21/05/2012

4 errante ND ND ND 01/06/2013

5 errante ND ND SRD 01/06/2013



Amostras coletadas para o presente estudo


etária


do sedimento

8 domiciliado adulto* F SRD 30/10/2013

9 domiciliado jovem F SRD 30/10/2013

10 domiciliado jovem M SRD 06/11/2013
















26 gatil/abrigo adulto * ND SRD 27/06/2014












*Idade não conhecida. ND= informação não disponível.

55

Quadro 3 (continuação). Informações sobre hospedeiro, origem, raça, sexo, faixa etária e data

de processamento do exame parasitológico de fezes e congelamento de sedimento fecal das

amostras de gatos utilizadas no presente estudo.[a2]



etária


do sedimento



40 gatil/abrigo jovem * ND SRD 01/07/2014














amostras de cães utilizadas no presente estudo.


Registro

Amostra

Origem Faixa

etária


do sedimento

51 domiciliado ND M Waimaraner 23/05/2014

52 domiciliado adulto F SRD 30/08/2013


54 canil jovem* ND SRD 30/08/2013


56 domiciliado adulto M Rottweiler 30/08/2013




60 canil adulto* M SRD 30/08/2013




64 domiciliado adulto M SRD 02/10/2013

65 canil adulto* F Labrador 08/10/2013

66 canil jovem* ND SRD 08/10/2013

67 canil adulto* M SRD 08/10/2013

68 domiciliado adulto* M SRD 09/10/2013





73 domiciliado jovem* F SRD 13/11/2013



56

Quadro 4 (continuação). Informações sobre hospedeiro, origem, raça, sexo, faixa etária e data

de processamento do exame parasitológico de fezes e congelamento de sedimento fecal das

amostras de cães utilizadas no presente estudo.


Registro

Amostra

Origem Faixa

etária


do sedimento


76 domiciliado adulto* ND SRD 13/11/2013

Amostras obtidas da coleção do Laboratório de Virologia da UFF

Amostra Origem Faixa etária Sexo Raça Data processamento EPF e congelamento

do sedimento

77 domiciliado jovem ND Cocker Spaniel 02/12/2002

78 domiciliado jovem F Cocker Spaniel 25/01/2003


80 errante jovem F Cocker Spaniel 18/02/2003

81 domiciliado jovem M Cocker Spaniel 06/03/2003

82 domiciliado jovem F Cocker Spaniel 01/03/2003

83 domiciliado jovem M Rottweiler 28/04/2003


85 domiciliado jovem ND Pastor Alemão 12/09/2003

86 domiciliado jovem ND Pastor Alemao 12/09/2003






92 domiciliado jovem M Poodle 12/09/2003





97 domiciliado jovem M Yorkshire 05/07/2004

98 ND jovem M SRD 09/07/2004




4.2. EXAME PARASITOLÓGICO E MICROSCOPIA ÓPTICA

Todas as amostras coletadas para este estudo foram submetidas ao exame

parasitológico de fezes com posterior visualização pela microscopia óptica. Dentre as técnicas

coproparasitológicas de fezes empregadas, foram realizadas: o método de sedimentação

espontânea (Hoffman et al., 1934) e o método de centrífugo-flutuação em solução de sulfato

de zinco (Faust et al., 1939). Para cada técnica foi confeccionada uma lâmina para exame por

microscopia.

Assim, as amostras fecais foram homogeneizadas com água destilada e, logo em

seguida, filtradas em tamises de plástico contendo uma gaze sobre estes e acoplados em

57

cálices de sedimentação. Após esta etapa de filtragem, uma parte do material filtrado foi

depositado em tubos do tipo Falcon de 15 mL para serem processadas pela técnica de Faust et

al. (1939), a outra parte foi mantida no cálice supracitado, o qual foi completado com água

destilada para a realização da técnica de sedimentação espontânea (Hoffman et al, 1934). É

importante ressaltar que as leituras das lâminas pela técnica de sedimentação foram realizadas

24 horas após o processamento das fezes.

Referente à técnica de Faust et al. (1939), colocou-se aproximadamente 8 mL do

material filtrado e completou-se com água destilada até atingir o volume final do tubo. Em

seguida, procedeu-se a primeira centrifugação a 1.500 rpm durante aproximadamente 1

minuto. Após esta primeira centrifugação, o sobrenadante foi descartado e, em seguida, no

tubo foi colocado aproximadamente 8 mL de solução de sulfato de zinco (ZnSO4) a 33%

(densidade específica = 1,18). Depois da adição da solução de sulfato de zinco e

homogeinização, seguiu-se para etapa da segunda centrifugação a 1.500 rpm por 1 minuto. E

por fim, com auxílio de alça de platina foi retirado uma parte do sobrenadante, sendo este

depositado em lâmina para posterior leitura em microscopia óptica. Convém mencionar, que

no caso da técnica de Faust a leitura das lâminas foi feita logo em seguida a realização da

técnica e confecção das mesmas. Foi utilizado iodeto de Lugol como solução de contraste

para as lâminas confeccionadas por ambas as técnicas.

O sedimento restante da técnica de Hoffman et al. (1934), após coleta para confecção

das lâminas, foi dividido em alíquotas para serem subsequentemente empregadas nas demais

técnicas imunológicas, estas foram então, acondicionadas em tubos plásticos de fundo cônico

de 2mL e congeladas a uma temperatura de – 20º C até o seu uso posterior.

4.3. ADAPTAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO ALERE GIARDIA Ag

TEST KIT®

Em virtude do teste imunocromatográfico ter sido desenvolvido para utilização em

fezes frescas ou congeladas, por meio de coleta de fragmento fecal com um swab; e não em

sedimento fecal, foi necessária a adaptação da metodologia do kit para possibilitar sua

utilização neste estudo.

Desta forma, ao invés de utilizar o swab fornecido pelo fabricante, foram colocados 50

µL do sedimento da alíquota fecal e 50 µL do reagente proveniente do kit e essa mistura foi

homogeneizada por aproximadamente 10 segundos. Em seguida, foi retirada uma parte do

58

sobrenadante com auxílio da pipeta fornecida pelo fabricante, sendo então instiladas 4 gotas

deste no poço do kit. Por fim, foram feitas duas leituras, realizadas com os tempos de 5 e 10

minutos. Cada amostra foi testada em duplicata (cartucho 1/R1 e, cartucho 2/R2) (figura 4).

Baseado nas intruções do fabricante ALERE GIARDIA Ag TEST KIT®,

este kit possui

uma letra T (como linha do teste) e uma C (como linha de controle) na sua superfície. Ambas

as linhas não são visíveis na janela de resultado antes da aplicação da amostra. A linha de

controle deve aparecer sempre que o procedimento do teste estiver correto e se os reagentes

da linha de controle estiverem funcionando. Uma linha roxa será visível na janela do resultado

se houver a presença de antígenos de Giardia duodenalis na amostra testada (Figura 4).

Figura 4. Cartuchos provenientes do kit da técnica imunocromatográfica para Giardia sp.

realizada em duplicata. Em A - cartucho 1 gerando o primeiro resultado (R1); em B - cartucho

2 gerando o segundo resultado (R2). Neste caso como houve o aparecimento de uma banda

rosada em ambas as janelas dos dois cartuchos do kit, os resultados foram considerados

positivos. Linha controle do teste (C) circulada em vermelho e linha de resultado (T) circulada

em azul.

Para permitir a avaliação da influência do tempo de congelamento na eficiência da

técnica de imunocromatografia, os sedimentos fecais foram agrupados de acordo com os

tempos de armazenamento sob congelamento, os quais podem ser observados na tabela 1.

59

Tabela 1. Tempos de armazenamento das amostras congeladas e utilizadas no estudo,

considerando o total de amostras (n= 100).

Tempo de

armazenamento

Total de amostras

≤ 1 ano 37

> 1 ano e ≤ 3 anos 39

> 10 anos (10 a 13 anos) 24

TOTAL 100

4.4. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)

Foram usados neste ensaio 50μL de sedimento proveniente das alíquotas. O

diagnóstico foi efetuado pelo emprego de kits comerciais - ELISA (IVD Research®) para

detecção qualitativa de antígenos de Giardia duodenalis. A metodologia utilizada seguiu

conforme as orientações do fabricante. Todas as amostras foram avaliadas em duplicata.

Deste modo, 50 μl da amostra foi homogeneizado com 50 μL de diluente e em seguida

colocado em um poço da placa do kit (figura 5). Após este procedimento, 100 μL dos

controles foram dispostos em duplicata na mesma. Em seguida foi feita uma homogeneização

da placa com posterior incubação de 60 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação,

a placa foi lavada com tampão por 5 vezes para adição subsequente de 2 gotas de conjugado

em cada poço. Posteriormente a adição do conjugado, a placa foi incubada pela segunda vez,

por 30 minutos, e lavada logo após por mais 5 vezes. Logo após a segunda lavagem, foram

colocadas 2 gotas de cromógeno e após 10 minutos desta adição foram colocadas 2 gotas de

solução de bloqueio em cada poço, deixando-o agir por 5 minutos. Por fim, as leituras dos

resultados foram feitas em um espectrofotômetro pela verificação da cor gerada pela reação

enzimática, e o resultado foi considerado positivo quando a leitura de absorbância foi igual ou

maior que 0,08 nm.

Não foi realizada a avaliação da influência do tempo de congelamento das amostras na

eficiência do resultado do teste de ELISA pois, como houve atraso na chegada de um dos kits

diagnósticos, os ensaios foram realizados com um ano de intervalo entre eles, não permitindo

a divisão dos grupos amostrais de forma homogênea impossibilitando assim a comparação

destes parâmetros.

60

Figura 5. Placa de ELISA de kits comerciais - ELISA (IVD Research®) para diagnóstico de

Giardia sp., realizado em duplicata. Nos quatro primeiros poços à esquerda, foram dispostos

os controles negativos (A1 e A2 – circundado em vermelho) e positivos (B1 e B2 –

circundado em azul), disponibilizados pelo kit.

4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

A sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e a acurácia dos

testes foram determinados segundo Coggon et al. (1993).

Geralmente o EPF é o teste considerado padrão ouro e referência para estudos de

comparação de metodologias diagnósticas. Entretanto, esta técnica pode apresentar resultados

falso-negativos devido a intermitência de eliminação e a baixa carga de parasitos em

infecções crônicas e assintomáticas. Em virtude das amostras do presente estudo serem de

uma única coleta e em grande parte provenientes de animais assintomáticos, para tentar

superar as limitações acima citadas, optamos por seguir o preconizado por Weitzel et al.

(2006) e utilizar um padrão de referência para comparação entre as metodologias diagnósticas

que não fosse baseado apenas nos resultados da análise por microscopia. Assim, foram

estabelecidos critérios para definição das amostras verdadeiramente positivas para Giardia

duodenalis, sendo estes: (1) amostra positiva pelo exame parasitológico de fezes; (2) amostra

negativa no EPF, mas positiva em ambos os ensaios imunológicos (imunocromatografia e

ELISA).

A concordância entre os testes foi calculada estimando-se a frequência de resultados

concordantes entre duas técnicas e também mensurada através do coeficiente Kappa segundo

Smith (1995), sendo classificada de acordo com o quadro 5. Também foram utilizados os

61

testes não paramétricos de Qui-quadrado, McNemar e Mann-Whitney a um nível de

significância de 5% para comparar os resultados das técnicas diagnósticas.

Quadro 5. Classificação do coeficiente Kappa segundo Smith (1995).

Valores de Kappa Concordância

0,0 Rara probabilidade de concordância

0,0 – 0,20 Fraca

0,21 – 0,40 Regular

0,41 – 0,60 Moderada

0,61 -0,80 Substancial/boa

0,81 - 0,99 Concordância quase perfeita entre os testes

1,0 Concordância perfeita

4.6. ASPECTOS ÉTICOS

Este estudo faz parte do projeto intitulado “Epidemiologia da giardíase no Brasil” de

número 239, o qual foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade

Federal Fluminense em 09 de Agosto de 2012.

5. RESULTADOS

5.1. EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES

Em virtude das amostras obtidas das coleções de sedimentos fecais já terem sido

analisadas anteriormente pela microscopia óptica, tais resultados não serão descritos no

presente estudo por já terem sido utilizados anteriormente (DE CASTRO et al. 2007). Para

estas amostras, somente será considerado no presente estudo o resultado referente à presença

ou ausência de cistos de Giardia duodenalis.

Das 69 amostras coletadas para compor o número amostral do presente estudo, foi

possível diagnosticar diversos parasitos gastrointestinais, sendo estes: Giardia duodenalis,

ancilostomídeos, Toxocara sp., oocistos de coccídeos e Dipylidium caninum (gráfico 1 e

quadro 6). Infecções mistas também foram evidenciadas, todas em amostras felinas, sendo

estas: ancilostomídeos + oocisto de coccídeo; Giardia duodenalis + oocisto de coccídeo;

Dipylidium caninum + oocisto de coccídeo.

Gráfico 1. Resultados dos exames parasitológicos de fezes das 69 amostras de cães e

gatos coletadas durante o período de estudo.

63

Relativo à diversidade parasitária nos hospedeiros, um maior número de espécies foi

observado para o hospedeiro felino. Em cães foram evidenciadas somente duas espécies de

parasitos gastrointestinais, sendo estas os ancilostomídeos e Giardia duodenalis, e nenhuma

infecção mista pôde ser vista para o hospedeiro em questão. Em gatos, foram detectados os

protozoários, Giardia duodenalis e oocistos de coccídeos e, ainda, os helmintos

ancilostomídeos, Toxocara sp. e Dipylidium caninum (quadro 6).

Quadro 6 . Número e frequências relativas (%) de amostras fecais de cães e gatos coletadas no

presente estudo, positivas para Giardia duodenalis e demais espécies de parasitos

gastrointestinais pelo exame parasitológico de fezes.

Hospedeiro Parasitos encontrados Número de

amostras positivas

Frequência

relativa (%)

Cães (n = 26)

Ancilostomídeos 7 26,9%

G. duodenalis 4 15,4%

Gatos (n = 43)

Ancilostomídeos 8 18,6%

G. duodenalis 3 7,0%

Oocisto de coccídeo 1 2,3%

Toxocara sp. 3 7,0%

Dipylidium caninum 2 4,7%

Ancilostomídeo + oocisto de

coccídeo

1 2,3%

Giardia duodenalis + oocisto de

coccídeo

2 4,7%

Dipylidium caninum + oocisto de

coccídeo

1 2,3%

Dos 31 sedimentos fecais obtidos dos bancos de amostras, 9 possuíam resultado

positivo de EPF para cistos de Giardia duodenalis (7 de gato e 2 de cão). Desta forma,

considerando-se as 100 amostras utilizadas para os ensaios do presente estudo, 18% foram

positivas para Giardia duodenalis no EPF. Considerando-se a frequência de positividade

separadamente para cada hospedeiro, esta foi de 24% nos gatos (12/50) e 12% nos cães (6/50)

(tabela 2).

64

Tabela 2. Número de amostras positivas e negativas para Giardia duodenalis, obtidas pelo

exame parasitológico de fezes para cada hospedeiro.

Hospedeiro

Pesquisa de Giardia duodenalis por EPF

Total Positivo Negativo

Gato 12 (24%) 38 (76%) 50

Cão 6 (12%) 44 (88%) 50

Total 18 82 100

5.2. MÉTODOS IMUNOLÓGICOS

5.2.1 IMUNOCROMATOGRAFIA

O teste imunocromatográfico foi positivo para antígenos de Giardia duodenalis em

29/100 amostras (29%), sendo 12 amostras caninas (24%; 12/50) e 17 amostras felinas (34%;

17/50) (Tabela 3). Não foi observada diferença nos resultados das leituras nos tempo de 5 e 10

minutos. Não houve discordância nos resultados da mesma amostra quando testada em

duplicata pela imunocromatografia.

Tabela 3. Número de amostras positivas e negativas para antígeno de Giardia duodenalis pelo

teste imunocromatográfico, para cada hospedeiro.

Hospedeiro

Teste Imunocromatográfico


Gato 17 (34%) 33 (66%) 50

Cão 12 (24%) 38 (76%) 50

Total 29 71 100

5.2.2. ELISA

O teste de ELISA foi positivo em 26/100 (26%) amostras, sendo 18/50 (36%)

amostras felinas e 8/50 (16%) amostras caninas (tabela 4).

65

Tabela 4. Número de amostras positivas e negativas para antígenos de Giardia duodenalis

pela técnica de ELISA, para cada hospedeiro

Hospedeiro

Técnica de ELISA


Gato 18 (36%) 32 (64%) 50

Cão 8 (16%) 42 (84%) 50

Total 26 74 100

5.3. COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS

Os quadros 7 e 8 apresentam as informações referentes à positividade em cada uma

das técnicas empregadas para as 100 amostras utilizadas no presente estudo.



de exame parasitológico de fezes, imunocromatografia (IC) e ELISA para diagnóstico de

Giardia duodenalis, nas amostras de gatos utilizadas no presente estudo.

Amostras obtidas da coleção do Laboratório de Parasitologia da UFF

Amostra Data processamento EPF e congelamento do

sedimento

EPF IC ELISA

1 03/05/2012 + + +

2 17/05/2012 + + +

3 21/05/2012 + + +

4 01/06/2013 + + +

5 01/06/2013 + - -

6 01/06/2013 + - -

7 01/06/2013 + - -



sedimento

EPF IC ELISA

8 30/10/2013 - - -

9 30/10/2013 - - -

10 06/11/2013 - + +

11 06/11/2013 - - -

12 06/11/2013 - - -

13 09/12/2013 - - -

14 09/12/2013 - - -

15 11/06/2014 + - +

16 11/06/2014 - - -

17 11/06/2014 + + +

(*) Banda fraca.

EPF = exame parasitológico de fezes; IC = teste imunocromatográfico.

66

Quadro 7(continuação). Números das amostras estudadas, origem, data de processamento do

exame parasitológico de fezes e congelamento do sedimento fecal e resultados obtidos pelas

técnicas de exame parasitológico de fezes, imunocromatografia (IC) e ELISA para

diagnóstico de Giardia duodenalis, nas amostras de gatos utilizadas no presente estudo.



sedimento

EPF IC ELISA

18 11/06/2014 - - +

19 11/06/2014 - - -

20 11/06/2014 + - -

21 11/06/2014 - - -

22 11/06/2014 - - +

23 11/06/2014 - - -

24 11/06/2014 - - -

25 11/06/2014 - + +

26 27/06/2014 - - -

27 27/06/2014 + + +

28 27/06/2014 - - -

29 27/06/2014 - - -

30 27/06/2014 - - -

31 27/06/2014 - - -

32 27/06/2014 - - -

33 27/06/2014 - - -

34 27/06/2014 + - +

35 27/06/2014 - - -

36 27/06/2014 - - -

37 27/06/2014 - + +

38 27/06/2014 - - -

39 27/06/2014 - - -

40 01/07/2014 - + +

41 01/07/2014 - + (*) -

42 01/07/2014 - + +

43 01/07/2014 - + (*) -

44 01/07/2014 - + (*) -

45 01/07/2014 - + +

46 01/07/2014 - + +

47 01/07/2014 - - -

48 01/07/2014 - + +

49 01/07/2014 - - -

50 01/07/2014 - - -

(*) Banda fraca.

EPF = exame parasitológico de fezes; IC = teste imunocromatográfico.

67



de exame parasitológico de fezes, imunocromatografia (IC) e ELISA para diagnóstico de

Giardia duodenalis, nas amostras de cães utilizadas no presente estudo.



sedimento

EPF IC ELISA

51 23/05/2014 + + +

52 30/08/2013 - - -

53 30/08/2013 - + +

54 30/08/2013 - - -

55 30/08/2013 - - -

56 30/08/2013 - + (*) +

57 30/08/2013 - - -

58 30/08/2013 - - -

59 30/08/2013 - - -

60 30/08/2013 - + +

61 26/09/2013 - - -

62 26/09/2013 - - -

63 26/09/2013 - - -

64 02/10/2013 - - -

65 08/10/2013 - - -

66 08/10/2013 + + +

67 08/10/2013 + + -

68 09/10/2013 - - -

69 09/10/2013 - - -

70 30/10/2013 - - -

71 30/10/2013 - - -

72 13/11/2013 - - -

73 13/11/2013 + + +

74 13/11/2013 - - -

75 13/11/2013 - - -

76 13/11/2013 - - -



sedimento

EPF IC ELISA

77 02/12/2002 - - -

78 25/01/2003 - - -

79 03/02/2003 - - -

80 18/02/2003 - + (*) -

81 06/03/2003 - - -

82 01/03/2003 + - -

83 28/04/2003 - - -

84 05/05/2003 - - -

85 12/09/2003 - - -

86 12/09/2003 - - -

87 12/09/2003 - - -

88 12/09/2003 - - -

89 12/09/2003 - - -

.(*) Banda fraca.

EPF = exame parasitológico de fezes; IC = teste imunocromatográfico

68

Quadro 8 (continuação). Números das amostras estudadas, origem, data de processamento do

exame parasitológico de fezes e congelamento do sedimento fecal e resultados obtidos pelas

técnicas de exame parasitológico de fezes, imunocromatografia (IC) e ELISA para

diagnóstico de Giardia duodenalis, nas amostras de cães utilizadas no presente estudo.



sedimento

EPF IC ELISA

90 12/09/2003 - - -

91 24/09/2003 - - -

92 12/09/2003 - - -

93 01/09/2003 - - -

94 06/04/2004 - - -

95 12/04/2004 - + -

96 21/05/2004 - - -

97 05/07/2004 - + -

98 09/07/2004 - - -

99 01/05/2004 - + +

100 01/08/2003 + + +

(*) Banda fraca.

EPF = exame parasitológico de fezes; IC = teste imunocromatográfico

5.3.1. EPF E IMUNOCROMATOGRAFIA

As frequências de positividade para Giardia duodenalis obtidas nas técnicas de

microscopia (EPF) e imunocromatografia para as 100 amostras analisadas podem ser

observadas na tabela 5. Vale ressaltar que houve algumas discrepâncias quando se comparou

a frequência de positividade entre as duas técnicas, onde 7 amostras nas quais encontrou-se

cistos de Giardia duodenalis pelo exame parasitológico de fezes (EPF), não houve detecção

de coproantígenos deste protozoário pela técnica imunocromatográfica. Por outro lado, em 18

amostras houve a detecção de antígenos parasitários pela imunocromatografia, porém não

foram encontrados cistos pelo EPF.

Tabela 5. Resultados do teste imunocromatográfico e exame parasitológico de fezes (EPF) nas

amostras caninas e felinas analisadas (n=100).

Imunocromatográfico Total

Positivo Negativo

EPF Positivo 11 7 18

Negativo 18 64 82

Total 29 71 100

69

5.3.2. EPF E ELISA

As frequências de resultados do exame parasitológico de fezes e aqueles obtidos pela

técnica de ELISA podem ser observados na tabela 6. Da mesma forma como observado na

comparação entre o EPF e a imunocromatografia, foram percebidas algumas divergências,

sendo 6 amostras positivas para cistos de Giardia duodenalis pelo EPF e negativas para

coproantígenos pelo ELISA. Além disso, em 14 amostras houve a detecção de antígenos

parasitários pelo ELISA, porém não foram encontrados cistos pelo parasitológico de fezes.

Tabela 6 . Resultados do teste de ELISA e exame parasitológico de fezes (EPF) nas amostras

caninas e felinas analisadas (n=100).

ELISA Total

Positivo Negativo

Imunocro-

matografia

Positivo 22 7 29

Negativo 4 67 71

Total 26 74 100

5.3.3. IMUNOCROMATOGRAFIA E ELISA

As frequências de resultados do teste imunocromatográfico e aqueles obtidos pela

técnica de ELISA podem ser observados na tabela 7. Da mesma forma como observado nas

comparações anteriores, foram notadas algumas disparidades entre os resultados, sendo 6

amostras positivas pelo teste imunocromatográfico e negativas para coproantígenos pelo

ELISA; e, ainda, 4 amostras tiveram detecção de antígenos parasitários pelo ELISA, porém

não houve detecção de coproantígenos pela imunocromatografia.

Tabela 7. Resultados do teste imunocromatográfico (IC) e da técnica de ELISA nas amostras

caninas e felinas analisadas (n=100).

ELISA Total

Positivo Negativo

IC Positivo 12 6 18

Negativo 14 68 82

Total 26 74 100

70

5.4. CONCORDÂNCIA ENTRE AS TÉCNICAS

5.4.1. FREQUÊNCIA DE CONCORDÂNCIA E TESTE DE MCNEMAR

Na comparação efetuada entre a imunocromatografia e o EPF, evidenciou-se uma

frequência de concordância de 75%. Aplicando-se o teste de McNemar foi observado um p-

valor de 0,043 (p<0,05), portanto, houve diferença estatisticamente significativa entre as

concordâncias das duas técnicas avaliadas.

Já na comparação efetuada entre o teste de ELISA e a microscopia, evidenciou-se uma

concordância de 80%. Através do teste McNemar foi observado um p-valor de 0,115 (p>0,05)

e, portanto, não houve diferença significativa nos resultados de concordâncias entre as duas

técnicas.

Pela comparação realizada entre o teste imunocromatográfico e o ELISA, identificou-

se uma concordância de 89%. E, através do teste de McNemar, foi observado um p-valor de

0,549, logo, para esta comparação também não houve diferença estatisticamente significativa

quanto a concordância entre as técnicas.

5.4.2 COEFICIENTE KAPPA

A realização do cálculo do coeficiente kappa para todas as amostras (n=100) sem

considerar o hospedeiro, demonstrou concordância substancial (κ = 0,75) para o teste de

imunocromatografia quando comparado ao ELISA, moderadas entre o exame parasitológico

de fezes em relação às técnicas de ELISA (κ=0,52) e imunocromatografia (κ=0,45) (Gráfico

2).

71

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

EPF x ELISA EPF x IC IC x ELISA

Co

efi

cie

nte

ka

pp

a

Métodos empregados

0,52

0,45

0,75

Mo

de

rad

a

Mo

de

rad

a Sub

stan

cial

Gráfico 2. Valores obtidos nos cálculos do coeficiente kappa comparando-se o exame

parasitológico de fezes (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA para todas as amostras

analisadas (n=100).

A comparação entre os resultados das técnicas para o hospedeiro canino pode ser

observada nas tabelas 8, 9 e 10. Os níveis de concordância entre os testes foram: moderadas

para a comparação efetuada entre o EPF e o ELISA (κ= 0,56) e também entre o EPF e a

imunocromatografia (κ= 0,51). Além disso, verificou-se uma substancial concordância entre o

teste imunocromatográfico e o ELISA (κ=0,75) (gráfico 3).


imunocromatográfica (IC) considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50).

Imunocromatografia Total

Positivo Negativo

EPF Positivo 4 2 6

Negativo 4 40 44

Total 8 42 50


considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50).

ELISA Total

Positivo Negativo

EPF Positivo 4 2 6

Negativo 4 40 44

Total 8 42 50

72


considerando apenas o hospedeiro canino (n= 50).

ELISA Total

Positivo Negativo

IC Positivo 8 4 12

Negativo 0 38 38

Total 8 42 50

Gráfico 3. Valores obtidos nos cálculos do coeficiente kappa comparando-se o exame

parsasitológico de fezes (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA utilizando as amostras

referente ao hospedeiro canino (n=50).

No que diz respeito o hospedeiro felino, a comparação entre os resultados das técnicas

pode ser observada nas tabelas 11, 12 e 13. Os resultados da análise de concordância entre os

testes foram: moderadas, para a comparação efetuada entre o EPF e o ELISA (κ= 0,49) e entre

o EPF e a imunocromatografia (κ= 0,44); e substancial entre o teste imunocromatográfico e o

ELISA (κ= 0,73) (gráfico 4).


imunocromatográfica (IC) considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50).


Positivo Negativo

EPF Positivo 6 6 12

Negativo 11 27 38

Total 17 33 50

73


considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50).

ELISA Total

Positivo Negativo

EPF Positivo 8 4 12

Negativo 10 28 38

Total 18 32 50


considerando apenas o hospedeiro felino (n= 50).

ELISA Total

Positivo Negativo

IC Positivo 14 3 17

Negativo 4 29 33

Total 18 32 50

Gráfico 4. Valores obtidos dos cálculos do coeficiente kappa comparando-se o exame

parasitológico de fezes (EPF), Imunocromatografia (IC) e ELISA utilizando as amostras

referente ao hospedeiro felino (n=50).

74

5.5. CÁLCULO DOS PARÂMETROS DE SENSIBILIDADE, ESPECIFICIDADE,

ACURÁCIA, VALOR PREDITIVO POSITIVO E VALOR PREDITIVO NEGATIVO

PARA CADA METODOLOGIA

Das 100 amostras analisadas, 30 preencheram os critérios estabelecidos para definição

das amostras verdadeiramente positivas, sendo 18 correspondentes ao critério 1 e 12 ao

critério 2. Desta forma, foram considerados para cálculo dos parâmetros acima descritos 30

amostras verdadeiramente positivas e 70 amostras verdadeiramente negativas. Deve-se

ressaltar, que os valores de predição podem variar em função da prevalência.

5.5.1. VALORES TOTAIS

As tabelas 14, 15 e 16 descrevem os resultados dos testes diagnósticos estudados em

relação às amostras consideradas como verdadeiramente positivas e verdadeiramente

negativas. Os valores calculados de sensibilidade, especificidade, acurácia, valor preditivo

positivo e negativo para as técnicas de exame parasitológico de fezes (EPF),

imunocromatografia e ELISA, sem considerar o hospedeiro, encontram-se descritos na tabela

17.

Tabela 14. Resultados do exame parasitológico (EPF) em relação as amostras consideradas

como verdadeiramente positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando as

amostras totais analisadas (n=100).

EPF Total

Positivo Negativo

Amostras VP 18 12 30

VN 0 70 70

Total 18 82 100

75



utilizando as amostras totais analisadas (n=100).


Positivo Negativo

Amostras VP 23 7 30

VN 6 64 70

Total 29 71 100


positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando as amostras totais analisadas

(n=100).

ELISA Total

Positivo Negativo

Amostras VP 24 6 30

VN 2 68 70

Total 26 74 100

Sobre a eficiência das técnicas empregadas, pode-se dizer que foi observada uma

menor sensibilidade (60%) e valor de preditividade negativa (85,4%) do EPF em relação às

demais técnicas utilizadas. No entanto, sua especificidade (100%) e valor preditivo positivo

(100%) foram superiores às técnicas imunológicas. A acurácia, por sua vez, foi de 88%,

próxima a obtida pelo teste imunocromatográfico, que apresentou uma acurácia de 87%.

A imunocromatografia apresentou uma sensibilidade de 76,7%, valor este bem

próximo ao do ELISA, que por sua vez, foi a técnica mais sensível (80%). Os parâmetros de

especificidade e valor preditivo positivo para o teste imunocromatográfico foram menores do

que as outras metodologias estudadas, com 91,4% e 79,3%, respectivamente. Contudo, por

este teste, encontrou-se um valor de 90,1% de preditividade negativa, sendo este um valor

muito próximo ao obtido pelo ELISA, que foi 91,9%.

Pelo ELISA, notaram-se as maiores porcentagens de sensibilidade, conforme

mencionado anteriormente, e também de acurácia (92%). Porém, em seus valores de

preditividade positiva e de especificidade obsevou-se uma porcentagem de 92,3% e 97,1%,

respectivamente. Sendo estas, então, um pouco abaixo das obtidas pelo EPF. Notou-se ainda

um valor de preditividade negativa de 91,9% pelo ELISA, valor este similar ao encontrado

pela imunocromatografia.

76


de giardíase considerando as amostras caninas e felinas totais (n=100).

Técnica Se

(%)

Sp

(%)

Acurácia

(%)

VPP

(%)

VPN

(%)

EPF 60 100 88 100 85,4

Imunocromatografia 76,7 91,4 87 79,3 90,1

ELISA 80 97,1 92 92,3 91,9

Onde: Se= sensibilidade; Sp=especificidade; VPP= valor preditivo positivo; VPN= valor

preditivo negativo.

5.5.2. HOSPEDEIRO CANINO

Os cálculos dos parâmetros considerando-se apenas as amostras do hospedeiro canino

foram realizados mediante a utilização dos dados contidos nas tabelas 18, 19 e 20 e podem ser

observados na tabela 21.



utilizando somente as amostras caninas (n=50).

EPF Total

Positivo Negativo

Amostras VP 6 4 10

VN 0 40 40

Total 6 44 50



utilizando somente as amostras caninas (n=50).


Positivo Negativo

Amostras VP 9 1 10

VN 3 37 40

Total 12 38 50

77


positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando somente as amostras caninas

(n=50).

ELISA Total

Positivo Negativo

Amostras VP 8 2 10

VN 0 40 40

Total 8 42 50

Pelos resultados observados neste hospedeiro, a imunocromatografia foi certamente a

técnica que apresentou maior sensibilidade (90%), seguidas posteriormente pelo ELISA

(80%) e microscopia (60%) (tabela 21).

A maior especificidade foi obtida pela microscopia e pelo ELISA (100%) e a menor

pela imunocromatografia (92,5%). Foi ainda encontrado pelo exame microscópico e também

pelo ELISA o maior valor preditivo positivo (100%) e em contrapartida, um menor valor

preditivo negativo foi notado pelo imunocromatográfico, já que a porcentagem deste por esta

técnica foi de 75%.

Cabe ressaltar que para acurácia, os valores encontrados foram os mesmos (92%) pela

microscopia e pelo teste imunocromatográfico. Entretanto, pelo ELISA foi o maior valor

evidenciado, sendo este de 96%.

O maior valor preditivo negativo foi observado pela técnica de imunocromatografia

(97,4%), seguida pelo ELISA (95,2%) e por fim, pela microscopia (90,9%).


de giardíase considerando as amostras do hospedeiro canino (n=50) analisadas no presente

estudo.

Técnica Se

(%)

Sp

(%)

Acurácia

(%)

VPP

(%)

VPN

(%)

Microscopia 60 100 92 100 90,9

Imunocromatografia 90 92,5 92 75 97,4

ELISA 80 100 96 100 95,2


preditivo negativo.

78

5.5.3. HOSPEDEIRO FELINO

Com base nos resultados das tabelas 22, 23 e 24 e considerando apenas as amostras

felinas, os resultados calculados dos parâmetros para este hospedeiro, podem ser evidenciados

na tabela 25.



utilizando somente as amostras felinas (n=50).

EPF Total

Positivo Negativo

Amostras VP 12 8 20

VN 0 30 30

Total 12 38 50



utilizando somente as amostras felinas (n=50).


Positivo Negativo

Amostras VP 14 6 20

VN 3 27 30

Total 17 33 50


positivas (VP) e verdadeiramente negativas (VN), utilizando somente as amostras felinas

(n=50).

ELISA Total

Positivo Negativo

Amostras VP 16 4 20

VN 2 28 30

Total 18 32 50

Para o parâmetro sensibilidade, a técnica que obteve um maior valor foi o ELISA

(80%), seguida pela imunocromatografia (70 %) e por fim, pela microscopia (60%).

Relativo aos parâmetros especificidade e valores preditivos positivos, os valores

máximos foram observados pela microscopia (100%), sendo que os valores de especificidade

79

obtidos pelas técnicas imunológicas foram bem próximos entre si (90% e 93,3%

respectivamente para imunocromatografia e ELISA), porém menores do que os obtidos pelo

EPF. Já, os valores de preditividade positiva pelas técnicas imunológicas foi de 82,4% para a

técnica imunocromatográfica e de 88,9% para o ELISA e, assim também foram inferiores ao

EPF.

Pelo ELISA também foram identificados os maiores valores de acurácia (88%) e de

preditividade negativa (87,5%). Pela imunocromatografia e pelo EPF encontraram-se valores

de acurácia de 82% e 84%, respectivamente. E referente aos valores de preditividade negativa

notou-se frequências de 78,9% pelo EPF e de 81,9% pelo teste imunocromatográfico.

Tabela 25. Cálculos dos parâmetros estatísticos para cada técnica para o diagnóstico de

giardíase, considerando as amostras do hospedeiro felino (n=50) analisadas no presente

estudo.

Técnica Se

(%)

Sp

(%)

Acurácia

(%)

VPP

(%)

VPN

(%)

EPF 60 100 84 100 78,9

Imunocromatografia 70 90 82 82,4 81,9

ELISA 80 93,3 88 88,9 87,5


preditivo negativo.

5.6. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS SOBRE O

SRESULTADO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO MODIFICADO

O gráfico 5 representa a distribuição dos valores concordantes e discordantes entre o

teste imunocromatográfico e o EPF, em relação ao tempo de congelamento. Por meio dele,

pode-se dizer que os resultados concordantes estão distribuídos ao longo do tempo, enquanto

que os resultados discordantes estão localizados mais próximos das amostras com os menores

tempos de congelamento. Logo, o tempo de congelamento não influenciou nos resultados

obtidos pela imunocromatografia.

80

Gráfico 5. Gráfico boxplot representando o tempo de congelamento das amostras segundo a

concordância realizada entre a imunocromatografia e a microscopia.

Os parâmetros de sensibilidade, especificidade e acurácia para cada um dos grupos de

congelamento foram calculados baseando-se nas tabelas 26, 27 e 28. Os resultados obtidos

podem ser observados na tabela 29.



(VN) agrupadas segundo o tempo de congelamento das amostras (n=100).


Positivo Negativo

Grupo 1 VP 10 3 13

VN 3 21 24

Total 13 24 37





Positivo Negativo

Grupo 2 VP 11 3 14

VN 0 25 25

Total 11 28 39

81





Positivo Negativo

Grupo 3 VP 2 1 3

VN 3 18 31

Total 5 19 24

Os resultados, descritos na tabela 29, demonstram que o grupo 3, cujo tempo de

congelamento ultrapassou o período de 10 anos, apresentou um menor valor de sensibilidade

(66,7%) se comparado ao grupo 1 (Se = 76,9%) e ao grupo 2 (Se = 78,6%), grupo estes com

amostras mais recentes. No entanto, os valores de acurácia e especificidade observados tanto

para o grupo 1 (acurácia = 83,8,% ; Sp = 87,5) como para grupo 3 (acurácia = 83,3% ; Sp =

87,5%) foram bem próximos entre si. O grupo 2 foi o que apresentou os maiores valores para

os parâmetros sensibilidade (78,6%), especificidade (100%) e acurácia (92,3%).

Tabela 29. Valores de sensibilidade, especificidade e acurácia das amostras agrupadas para o

teste imunocromatográfico em relação as amostras consideradas verdadeiramente positivas

(VP) e verdadeiramente negativas (VN).

Tempo de

congelamento

Se

(%)

Sp

(%)

Acurácia

(%)

Grupo 1 (n=37) 76,9 87,5 83,8

Grupo 2 (n=39) 78,6 100 92,3

Grupo 3 (n=24) 66,7 85,7 83,3

6. DISCUSSÃO

6.1. RESULTADOS DO EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES

No presente estudo, foram diagnosticados diversos parasitos gastrointestinais, além da

espécie Giardia duodenalis, incluindo algumas associações parasitárias, as quais foram

evidenciadas apenas nos felinos. Meraku et al. (2007) e Pivoto et al. (2013) também

observaram uma grande diversidade parasitária em amostras de felinos, incluindo o

protozoário Giardia sp., bem como infecções mistas.

Em cães a diversidade parasitária foi bem menor, sendo evidenciadas somente duas

espécies de parasitos gastrointestinais, os ancilostomídeos e Giardia duodenalis, e nenhuma

infecção mista foi detectada. Estes dados são divergentes de diversos estudos publicados (DE

VASCONCELOS et al., 2006; DA SILVA et al., 2007;), BARNABE et al., 2015), os quais

encontraram uma maior diversidade parasitária em amostras caninas. Os dois últimos estudos

foram realizados em cidades diferentes, logo, a localização geográfica pode ter influenciado

nas taxas de prevalência dos parasitos encontrados. Sobre o estudo realizado por De

Vasconcelos et al. (2006), também realizado no estado do Rio de Janeiro, a explicação para as

diferenças encontradas pode ser devido a população escolhida, já que os autores utilizaram

amostras provenientes de canis municipais, enquanto que as amostras do presente estudo eram

constituídas majoritariamente de cães domiciliados.

Nos cães e nos gatos deste estudo, os ancilostomídeos foram um dos parasitos mais

detectados, sendo o único helminto encontrado no hospedeiro canino, corroborando com os

dados de diversos estudos brasileiros (DA SILVA et al., 2007; DE VASCONCELOS et al.,

2006; GENNARI et al., 1999; MAESTRI et al., 2012; PIVOTO et al., 2013; TORRICO et

al., 2008). Este achado já era esperado, pois foram coletadas amostras de animais com

diferentes faixas etárias e segundo Urqhart et al. (1991) este parasito pode estar presente em

83

animais independentemente de suas idades, e com isso, podem parasitar os referidos

hospedeiros por toda a vida.

Giardia duodenalis foi o protozoário diagnosticado com maior frequência (18%) no

presente estudo, assim como observado por Maestri et al. (2012). Similarmente, em seu

estudo sobre as parasitoses gastrointestinais realizado em cães e gatos, na cidade de São

Paulo, Tavares et al. (2005) utilizando o exame parasitológico de fezes, observou uma

prevalência de 19,55% (26/133) de infecção por Giardia sp. Diferentemente, Gennari et al

(1999) e Torrico et al. (2008) encontraram Cystoisospora sp. como protozoário mais

prevalente em suas amostras.

A literatura mundial apresenta uma grande variabilidade nas frequências de positividade

para Giardia duodenalis tanto para o hospedeiro canino como para o hospedeiro felino. Nos

cães, podem ser observadas frequências que variam de 5 a 70% (GENNARI et al., 1999;

GREZANA & MARQUES, 2003; MUNDIM et al., 2003; ZÁRATE et al., 2003; BECK et al.,

2005; BRENER et al. 2005; LABRUNA et al., 2006; LÓPEZ et al., 2006; DA SILVA et al.,

2007; TORRICO et al., 2008; BRINKER et al., 2009; KATAGIRI & OLIVEIRA-

SEQUEIRA, 2010; MAESTRI et al., 2012; MARQUES & BORGES, 2014; MOTA et al.,

2014; PIPIA et al., 2014; TSENG et al., 2014).

Já nos gatos, esta faixa varia de 0,9% a 35% (GENNARI et al., 1999; ARBABI &

HOOSHYAR, 2000; HUBER et al., 2002; SERRA et al., 2003; TAVARES, 2005;

TESSEROLLI et al., 2005; LÓPEZ et al., 2006; PALMER et al., 2008; TORRICO et al.,

2008; BRINKER et al. , 2009; GATES & NOLAN, 2009; DALL´AGNOL et al., 2010;

KINGSBURY et al., 2010; JAROS et al., 2011; KHALAFALLA et al., 2011; MCDOWALL

et al., 2011; DADO et al., 2012; PIVOTO et al., 2013). Portanto, as taxas de positividade

observadas no presente estudo de, respectivamente, 12% e 24% para cães e gatos, estão dentro

da faixa observada na literatura.

Outros estudos também conduzidos no estado do Rio de Janeiro utilizando o exame

parasitológico de fezes encontraram frequências de positividade para Giardia duodenalis em

amostras fecais caninas e felinas semelhantes as obtidas no presente estudo (HUBER et al.,

2002; SERRA et al., 2003; BRENER et al., 2005). Contudo, no estudo realizado por De

Vasconcelos et al. (2006), no Rio de Janeiro, foi observado uma frequência inferior, de 1,5%,

para as amostras de cães avaliadas, embora estes cães fossem oriundos de abrigos municipais.

Alguns fatores podem explicar as divergências encontradas na literatura no que diz

respeito as taxas de prevalência deste protozoário. Uma delas seria a população escolhida, a

84

qual é bastante heterogênea entre os estudos, tanto em relação à faixa etária quanto às

questões de criação dos animais (errantes, domiciliados, canis ou gatis). Cabe ressaltar

também que a maioria das amostras do presente estudo foi coletada de caninos e felinos que

não possuíam evidências de sinais clínicos (animais assintomáticos). Conforme exposto por

Sotiriadou et al. (2013), a ausência de sintomas pode levar a subestimação na detecção deste

protozoário, em função de uma baixa eliminação de cistos nas fezes, o que por sua vez,

culmina com dados incompletos e interpretação imprópria dos resultados publicados.

O fato dos gatos apresentarem uma maior diversidade parasitária e uma maior frequência

de positividade para Giardia duodenalis pode ser explicado parcialmente pela escolha da

população amostral, uma vez que a maioria das amostras de gatos do presente estudo foi

obtida de gatis e abrigos, enquanto que a maioria dos cães eram domiciliados. Segundo Beck

et al. (2005), Giardia duodenalis pode acometer principalmente os animais que vivem em

grupos. Para Kirkpatric & Farrel (1984) os animais errantes e aqueles que se encontram em

abrigos são mais expostos aos fatores de risco, devido ao seu maior contato com água,

alimentos e fezes de animais ou pessoas infectadas, estando, deste modo, mais vulneráveis.

Além do mais, deve ser pontuado um outro fator, que seria o hábito de individualismo e

independência inerentes ao hospedeiro felino, conforme descreveram Huber et al. (2002), já

que esses animais normalmente não ficam limitados a uma área específica e, assim, percorrem

o território no qual estão inseridos, facilitando, por conseguinte, a dispersão de doenças

parasitárias.

Neste contexto, algumas hipóteses devem ser acrescentadas. Há de se considerar ainda

que as amostras do hospedeiro canino, em sua grande parte foram oriundas de coleções de

espécimes fecais, e portanto, o exame parasitológico foi realizado em diferentes momentos ao

longo de 13 anos e por um número maior de microscopistas, o que pode ter contribuído para a

maior quantidade de amostras negativas encontradas pela análise microscópica. Para Dixon et

al. (1997) e Vidal & Catapani (2005), a experiência e o nível de fadiga do microscopista, além

da quantidade de debris presentes na lâmina, podem influenciar no resultado da análise por

microscopia óptica.

Outro aspecto que deve ser considerado é o número de amostras analisadas de cada

hospedeiro. Mundim et al. (2003), utilizaram em seu estudo três amostras de cada hospedeiro,

coletadas ao longo de sete dias, e obtiveram uma positividade de aproximadamente 68% para

Giardia duodenalis. Taboada & Merchant (1997) ressaltam que o número de coletas é de

suma importância para obtenção de resultados satisfatórios pelo exame parasitológicos com

85

visualização por microscopia óptica, uma vez que quanto maior o número de amostras

coletadas, maior a chance de obtenção de positividade. Estes autores recomedam a realização

do exame em 3 amostras coletadas em dias alternados, visto que os cistos são excretados de

forma intermitente, evitando assim os resultados falso-negativos. Além disso, segundo

Brinker et al. (2009), deve-se atentar para os animais considerados “baixos excretores”, os

quais podem passar por um período de até 21 dias sem eliminar cistos. Portanto, a utilização

de uma única amostra de fezes no presente estudo pode ter influenciado no número de animais

positivos encontrados, contribuindo para a obtenção de frequências inferiores à algumas das

relatadas na literatura. A utilização de uma única amostra fecal de cada animal ocorreu em

virtude da dificuldade na coleta de amostras seriadas, especialmente dos animais errantes e

provenientes de abrigos (canis e gatis). Tal dificuldade também já foi relatada por Bartmann

& Araújo (2004). Além disso, todas as amostras provenientes das coleções não haviam sido

coletadas de forma seriada.

Assim, apesar de entendermos que a utilização de uma única amostra de fezes de cada

animal pode ter influenciado nos níveis menores de positividade no EPF, acreditamos que isto

não acarreta em uma depreciação da importância do presente estudo, uma vez que este não

possui um caráter epidemiológico, e sim o de comparação de metodologias diagnósticas.

Conforme mencionado por Mundim et al. (2003), as disparidades nos resultados

encontrados na literatura podem ser atribuídas ainda às diferenças nas técnicas de diagnóstico

empregadas. Para Bartmann & Araújo (2004), as técnicas parasitológicas de fezes trazem

consigo algumas limitações, sendo estas, o baixo número de cistos encontrados nas fezes,

eliminação intermitente destes, pequeno tamanho dos cistos o que pode culminar com os

possíveis erros de identificação, principalmente de técnicos inexperientes e, portanto, trata-se

de um método de baixa sensibilidade. Além disso, há de se considerar alguns pontos que

ocorrem corriqueiramente na rotina da clínica veterinária, tais como a disponibilidade de

tempo do proprietário, o que pode inviabilizar a realização do exame em duas ou três

amostras como é o indicado (BARTMANN & ARAÚJO, 2004).

86

6.2. ADAPTAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO E SEU DESEMPENHO

NAS AMOSTRAS AGRUPADAS SEGUNDO O TEMPO DE CONGELAMENTO

Segundo Ungar et al. (1984) as técnicas imunológicas apresentam uma alta

sensibilidade e especificidade, porém, possuem como limitação a necessidade de só poderem

ser utilizadas em amostras frescas para que não haja diminuição de sua sensibilidade. Pillai &

Kain (1999), também citam que a técnica imunocromatográfica deve ser utilizada em

amostras frescas e amostras frescas congeladas. Assim, acreditamos que as adaptações

realizadas na metodologia do teste imunocromatográfico podem contribuir neste sentido,

permitindo sua utilização em sedimentos fecais congelados, expandindo assim o espectro de

utilização deste teste.

Vale ressaltar que a técnica imunocromatográfica modificada foi a que obteve a maior

frequência de positividade em relação às demais metodologias estudadas. Os resultados das

frequências encontradas coincidem com os achados de outros autores que empregaram a

técnica imunocromatográfica em diferentes hospedeiros (GARCIA & GARCIA, 2006;

IGNATIUS et al., 2014). As frequências aqui identificadas para as amostras caninas (24%;

12/50) e felinas (34%; 17/50) foram superiores as encontradas por outros autores, como por

exemplo, Huamancayo & Chavés (2015), que encontraram uma prevalência menor (17,9%)

em um estudo com amostras de cães em Lima (Peru). Enquanto que Pitães et al. (2015), em

seu estudo em Portugal, utilizando um grupo amostral composto por 51 cães obtiveram uma

frequência de positividade de 21,6% (11/51), bem próxima a encontrada no presente estudo.

Uma questão que deve ser observada é a de que os parasitos não se distribuem de

forma homogênea na amostra fecal, e portanto a utilização de um swab para coleta de uma

porção de fezes sólidas ou semisólidas para utilização no kit imunocromatográfico poderia

levar a resultados falso-negativos, especialmente em baixas cargas parasitárias (CURRENT &

GARCIA, 1991). Assim, acreditamos que a utilização do sedimento fecal, em detrimento da

amostra fecal total, pode ter favorecido o diagnóstico de amostras com baixa quantidade de

cistos, em virtude da concentração da amostra necessária para obtenção do sedimento fecal.

A diferença entre os índices de positividade observados para a técnica

imunocromatográfica nas amostras de cães e de gatos pode ter ocorrido em virtude da maior

parte das amostras felinas ter sido considerada como positiva pelas demais técnicas, enquanto

que grande parte das amostras de cães foi identificada como negativa pelos outros métodos,

não havendo correlação com o tempo de congelamento. Contudo, de acordo com Ash & Ariel

(1987) e Verhoeven (2015), amostras mais antigas costumam culminar com possíveis erros no

87

diagnóstico, pois o tempo de congelamento das amostras pode interferir na observação de

Giardia, já que este pode influenciar na concentração dos cistos nas amostras, tornando sua

detecção mais difícil.

Entretanto, Knisley et al. (1989) afirmam que as técnicas imunológicas para detecção

de antígenos de Giardia são estáveis, mesmo quando os antígenos são submetidos ao

congelamento a – 20ºC ou refrigerados a 2 -7ºC. No entanto, estes autores cogitaram a idéia

de que a intensidade colorimétrica dos resultados pode ser reduzida por múltiplos episódios de

congelamento/descongelamento (> 2 eventos), sobretudo nas amostras cujas cargas

parasitárias são baixas, gerando, por conseguinte, os chamados resultados fracamente

positivos ou falsos negativos. Já para Ungar et al. (1984), a realização do processo de

descongelamento de amostras (até 15 vezes) não interfere na característica de antigenicidade

do protozoário. Tal afirmativa é corroborada pelo próprio processo de preparo dos antígenos

utilizados em técnicas sorológicas, o qual envolve o congelamento e descongelamento dos

parasitos.

Mediante a análise dos resultados apresentados e considerando a similaridade

evidenciada nos parâmetros estatísticos, pode-se afirmar que o tempo de congelamento não

interferiu significativamente nos parâmetros de sensibilidade, especificidade e acurácia do

teste imunocromatográfico modificado, corroborando assim com as observações de Knisley

et al. (1989) e Ungar et al. (1984).

Sendo assim, mediante os resultados obtidos, pode-se afirmar que o teste

Imunocromatográfico ALERE GIARDIA Ag TEST KIT® adaptado apresentou, de uma

maneira geral, um bom desempenho independentemente do tempo de armazenamento da

amostra. Deve-se destacar a importância destes resultados, que permitem o emprego desta

metodologia para um escopo ainda maior de análises, especialmente para triagem de

sedimentos fecais congelados em bancos de amostras, permitindo análises epidemiológicas e

comparativas ao longo de diferentes décadas. Tais estudos são dificultados quando se

emprega o exame parasitológico de fezes com posterior visualização por microscopia

convencional, visto que o congelamento destrói os cistos e torna sua detecção muito difícil.

Além disso, a utilização de métodos moleculares nestas amostras pode não trazer resultados

satisfatórios em virtude do armazenamento não ter sido realizado a uma temperatura de –

70°C, considerada ideal para preservação do material genético. Portanto, de acordo com os

resultados aqui apresentados, esta adaptação metodológica pode ser um recurso válido para

amostras mais antigas e que foram armazenadas em temperatura de congelamento usual (-20°

88

C), como as aqui estudadas, uma vez que foi possível detectar positividade em amostras com

mais de 10 anos de congelamento.

De acordo com Garcia & Shimizu (2000), Garcia et al. (2003), Regnath et al. (2006) e

Weitzel et al. (2006), a detecção de antígeno pela imunocromatografia pode ser uma

ferramenta diagnóstica alternativa, considerando a sua facilidade e a sua rapidez de execução,

podendo ser aplicada tanto para amostras frescas como para amostras conservadas, além de

não dependerem de equipamento mais sofisticado para sua realização.

6.3. COMPARAÇÃO E CONCORDÂNCIA ENTRE AS TÉCNICAS

É importante salientar que são poucos os estudos que comparam diferentes

metodologias para diagnóstico de Giardia duodenalis em amostras de cães e gatos, sobretudo

referentes aos níveis de concordância entre as ferramentas diagnósticas. Sendo que para o

hospedeiro felino, os estudos são mais raros ainda, dadas as dificuldades inerentes a coleta das

amostras destes hospedeiros em particular. Assim sendo, pode-se dizer que o presente estudo

foi um dos primeiros que utilizou diferentes metodologias e que procurou estudar os

parâmetros e os níveis de concordância das técnicas empregadas para amostras oriundas de

ambos os hospedeiros. Contribuindo assim com dados valiosos para comparação em estudos

futuros.

Outro ponto que merece ser abordado é a definição do padrão de referência (padrão-

ouro) para os estudos de comparação, já que a escolha de um teste de referência pode

interferir nos resultados obtidos pelas técnicas estudadas. Segundo Weitzel et al. (2006), a

utilização do exame parasitológico de fezes como padrão-ouro, por exemplo, pode

comprometer a comparação, em virtude dos resultados gerados pela referida técnica poderem

ser falso-negativos em casos cuja densidade parasitária é baixa ou quando os parasitos

intactos encontram-se ausentes na amostra. Além disso, este é um método mais subjetivo do

que os ensaios imunológicos, pois dependem das habilidades individuais dos microscopistas

envolvidos, visto que os cistos são diminutos e similares a outros micro-organismos, tais

como as leveduras (DRYDEN et al., 2006). Assim, estes pesquisadores consideram não haver

uma técnica padrão-ouro confiável para os estudos de comparação, e propõem a classificação

das amostras em verdadeiramente positivas e negativas baseado em critérios envolvendo mais

de uma técnica diagnóstica. De fato, a utilização desta metodologia no presente estudo

89

permitiu traçar comparações mais adequadas, especialmente pelo fato das amostras serem em

grande parte de baixa carga parasitária, o que é sabido resultar em falso-negativos no EPF.

Os resultados do estudo de Rimhanen-Finne et al. (2007), também apontam que outros

métodos podem ser empregados como padrões de referência. Estes pesquisadores realizaram

um estudo comparativo entre as técnicas de microscopia por imunofluorescência (utilizada

como padrão de referência) e o ELISA, empregando 150 amostras caninas, e observaram uma

sensibilidade de 100% e especifidade de 96% em relação ao padrão de referência, e uma boa

concordância entre as técnicas (κ=0,71).

A literatura mundial apresenta uma grande variabilidade nas frequências de

positividade para Giardia duodenalis em testes imunológicos tanto para o hospedeiro canino

como para o hospedeiro felino. Neste sentido, Olson et al. (2010), no Canadá, evidenciaram

em seu estudo frequências positivas inferiores, 13% das amostras caninas (241/1871) e 4,1%

das amostras felinas (16/389); e Carlin et al. (2006), nos EUA, obtiveram taxas de

positividade de 10,28% para amostras felinas (513/4.978) e de 15,6% paras as amostras

caninas (2.506/16.114). Zanzani et al. (2004), também encontraram em seu estudo conduzido

na Itália, uma frequência inferior de 11,06 % (51/463) nos cães examinados, enquanto que

Papini et al. (2013), no mesmo país, utilizando a mesma metodologia observou uma taxa de

positividade maior, de 55,2% (101/183) em cães de diferentes abrigos. Itoh et al. (2006),

estudando a prevalência de G. duodenalis em gatos de um distrito do Japão, encontraram uma

prevalência de 40% (n=600) nos felinos pelo ELISA. Entretanto, há de se considerar que uma

frequência menor ou maior de observação de parasitos pode não refletir a capacidade do

método diagnóstico empregado, e sim a variação da prevalência local e a presença de outros

condicionantes, como por exemplo, fatores climáticos.

No estado do Rio de Janeiro, destaca-se o estudo realizado por Mendes-de-Almeida et

al. (2007), que também utilizaram o método de ELISA, no qual foi evidenciado uma taxa de

positividade de 28,4% (n=208) em felinos. E a pesquisa de Labarthe et al. (2008), que

utilizaram tanto amostras caninas como felinas, nas quais foram observadas frequências de

positividade de 9,7% e 15,6%, respectivamente. Tais resultados foram bem próximos aos

encontrados no presente estudo.

Na comparação efetuada entre as frequências de positividade obtidas pelo exame

parasitológico de fezes (18%), pela técnica imunocromatográfica (29%) e pelo ELISA (26%)

no presente estudo, foi observada uma diferença importante entre as frequências dos métodos

imunológicos quando comparados ao EPF. Deve-se destacar que os resultados das técnicas

90

imunológicas foram bem próximas, já que estas utilizam princípios semelhantes. A ligeira

diferença encontrada pode estar relacionada a especificidade dos métodos empregados, uma

vez que o material fornecido pelos dois laboratórios não informa quais são as proteínas

utilizadas como alvo dos anticorpos presentes no kit.

Olson et al. (2010) estudaram a prevalência e diagnóstico de infecção por Giardia sp.

em cães e gatos, notando os seguintes resultados: 18,5% (241/1.871) dos cães foram positivos

para o protozoário em questão pela técnica imunocromatográfica e dessas 241 amostras, em

31,8% (61/241) foi possível a detecção de cistos pelo exame parasitológico de fezes; nas

amostras felinas, foi detectado coproantígeno de Giardia sp. em 10,8% (16/389) pelo teste

imunocromatográfico e dessas amostras positivas, em 26,7% (4/16) foi possível observar

cistos deste parasito.

Cleto (2014) em estudo de prevalência realizado com gatos para detecção de

Giardia spp., coletou amostras de 34 animais e as submeteram as técnicas microscópicas e

imunocromatográficas, obtendo baixas taxas de positividade: 4 amostras (11,8%) foram

positivas e 30 amostras (88,2%) foram negativas por ambas as técnicas.

Quadros et al. (2015), em seu estudo realizado em Santa Catarina, utilizando 108

amostras de cães domiciliados e 357 amostras de cães de abrigos, obtiveram índices de

positividade de 14,58% pela técnica de centrifugo-flutuação e 11,24% pela técnica de

sedimentação. Além disso, estes autores analisaram amostras de 56 cães domiciliados e 159

de cães de abrigo pela técnica ELISA, encontrando uma positividade de 33,68% (37/215).

Cirak & Bauer (2004), na Alemanha, também compararam as metodologias

convencionais e técnicas comerciais ELISA para detecção de antígenos de Giardia sp. em 270

cães e 100 gatos. Neste estudo, foram encontrados pela técnica parasitológica de fezes, 9,5%

e 0% de positividade nas amostras de cães e gatos, respectivamente e, já pela técnica ELISA

foi possível notar positividade em 29,5% das amostras caninas e em 22,4 % das amostras

felinas.

As diferenças encontradas nos diversos dados da literatura podem ser resultantes de

uma falta de padronização dos métodos utilizados, uma vez que a sensibilidade varia

conforme o método diagnóstico empregado. Além disso, outros fatores também podem

contribuir para esta variabilidade, sendo os principais a variação geográfica, diferenças no

número amostras, características da população estudada (p.ex., idade, raça, imunidade), e até

mesmo as diferenças nas condições de manejo dos animais, que reflete assim na taxa de

91

exposição dos mesmos aos fatores de risco (BIANCIARDI et al., 2004; BECK et al., 2005;

WEITZEL et al., 2006).

A frequência de concordância entre a imunocromatografia e o EPF foi de 75% e o

coeficiente kappa calculado revelou nível de concordância moderado para as amostras totais

(κ = 0,45), para as amostras caninas (κ = 0,51) e felinas (κ = 0,44). Ademais, o resultado do

teste de Mcnemar revelou diferença estatisticamente significativa entre os testes. Já a

comparação entre EPF e ELISA obteve frequência de concordância de 80% e foram

encontrados valores de kappa moderados tanto para as amostras gerais (κ = 0,52) como para

as amostras caninas (κ = 0,56) e felinas (κ = 0,49).

Estas diferenças observadas se devem a discrepâncias nos resultados de positividade

em 28 amostras. Em 8 amostras nas quais encontrou-se cistos de Giardia pela microscopia,

não houve detecção de coproantígenos deste protozoário em 5 amostras. Nas outras três

amostras, foi possível detectar coproantígenos, em uma pela técnica imunocromatográfica e,

em duas pela técnica ELISA. Estes resultados discordantes também foram observados por

Garcia & Garcia (2006).

Em contrapartida, em 20 amostras houve a detecção de antígenos parasitários, porém

não foram encontrados cistos pela microscopia convencional. Destas, 12 amostras foram

consideradas verdadeiramente positivas em razão de apresentarem positividade em ambos os

ensaios imunológicos (imunocromatografia e ELISA). Das oito amostras restantes, seis foram

positivas apenas na imunocromatografia e duas apenas no ELISA.

Das seis amostras positivas apenas na imunocromatografia, 4 apresentaram linhas

muito fracas na leitura do teste imunocromatográfico, o que pode indicar baixa carga

parasitária ou possivelmente resultados falso–positivos. Entretanto, o aparecimento da linha

tênue no resultado de teste imunocromatográfico também ocorreu em uma amostra que foi

positiva também pelo ensaio de ELISA, o que indica que estes resultados possivelmente se

tratam de um resultado falso-negativo obtido pela microscopia em função de uma baixa carga

parasitária. É importante destacar que tanto a imunocromatografia como o ELISA foram

realizados utilizando-se o sedimento fecal, o que pode ter contribuído para uma concentração

do coproantígeno e facilitado sua detecção nas amostras contendo baixa quantidade de

parasitos.

Vale ressaltar que devido ao alto número de divergências encontrado, os resultados de

concordância entre a microscopia e a imunocromatografia apresentaram diferenças estatísticas

92

significativas, o que não foi observada nas demais comparações, visto que para estas os

números de divergências foram proporcionalmente menores.

Para a comparação feita entre as técnicas imunológicas foi evidenciado um maior nível

de concordância tanto pelo Teste McNemar (89%) como pelo coeficiente kappa (κ > 0,73). A

similaridade em relação às duas metodologias imunológicas, em virtude de ambas as técnicas

utilizarem como alvo proteínas da superfície de cistos e trofozoítos do parasito, proporcionou

menores divergências de resultados. Entretanto, o número pequeno de divergências

observadas pode ter ocorrido em razão de diferenças no reconhecimento antigênico destas

proteínas a partir de um mesmo substrato (sedimento fecal).

Huamancayo & Chavés (2015) em seu estudo comparativo entre a

imunocromatografia e as técnicas parasitológicas utilizando amostras caninas encontraram

uma concordância moderada (κ=0,58) entre a técnica imunocromatográfica e a de

sedimentação e uma concordância substancial (κ=0,78) entre a imunocromatografia e a

técnica de flutuação.

Entretanto, outros autores puderam contemplar melhores resultados de concordância

em seus estudos. Eduardo (2008), em seu estudo de detecção de Giardia sp. em Portugal tanto

em amostras de origem humana (n= 29 crianças) como de origem canina (n= 61),

empregando o mesmo kit (Simple Giardia®, Operon, S.A.), encontrou pela técnica

imunocromatográfica uma positividade de 13,8% e 49,2%, respectivamente. É importante

destacar que o kit empregado pelo referido autor foi diferente do que foi utilizado no presente

estudo. Das 29 amostras humanas, em 6,9% foi possível detectar cistos nas fezes e das 64

amostras caninas foi possível identificar em 49,2% cistos deste protozoário. Na comparação

efetuada entre as técnicas foi verificado um grau de concordância excelente para as amostras

caninas, já que em ambos os resultados os valores das frequências foram os mesmos.

Segundo Eduardo (2008), as discrepâncias entre os resultados podem ser

multifatoriais, tendo como principais fatores a intermitência de liberação dos cistos,

problemas na hora da coleta bem como no armazenamento e transporte das amostras, ou

mesmo devido a erros inerentes à realização das técnicas laboratoriais, em especial a

microscopia. Uma outra questão importante que pode influenciar os resultados de detecção

deste protozoário está relacionado à diversidade genética entre os isolados do parasito na

população ou grupo estudado (Ignatus et al., 2014).

De acordo com Rishniw et al. (2010), os resultados negativos obtidos em ensaios

imunológicos podem ser em parte explicados por concentrações antigênicas baixas nas

93

amostras analisadas, estando abaixo dos limites de detecção do teste, produzindo, por

conseguinte, resultados falso-negativos. Cabe ressaltar também que os limiares de detecção

são diferentes entre os métodos imunológicos, o que pode gerar divergências de resultados

quando se emprega testes com metodologias diferentes em amostras com baixa carga

parasitária. Chan et al. (2000), sugeriram ainda que o nível antigênico pode ficar

temporariamente abaixo do limiar de detecção, explicando as discrepâncias que podem haver

nas técnicas que se baseiam na detecção de antígenos.

Além disso, Strand et al. (2008) e Rishniw et al. (2010) chamam a atenção para a

possibilidade de excreção persistente de antígenos solúveis nas amostras fecais, por várias

semanas ou meses, mesmo após a eliminação do parasito, o que poderia contribuir para

resultados falso-positivos.

Em relação aos resultados fracamente positivos, como por exemplo os observados na

imunocromatografia no presente estudo, Meraku et al. (2007) levantaram a hipótese de estes

poderem ocorrer nas amostras diarréicas, devido a diluição da concentração dos cistos, tendo

em vista a maior quantidade de líquido presente nestas amostras. Referente esta questão, não

foi possível avaliar uma possível correlação entre os resultados fracamente positivos obtidos

no presente estudo e a presença de diarréia no animal, uma vez que a informação acerca da

consistência fecal não estava disponível para todas as amostras analisadas.

Sobre os resultados falso-negativos encontrados no exame parasitológico de fezes,

Weitzel et al. (2006) e Mahdy et al. (2008), reiteram que podem ocorrer em casos em que a

carga parasitária é baixa ou pela ausência das formas parasitárias intactas ou completas. Cabe

aqui destacar que, conforme mencionado anteriormente, a grande maioria das amostras

utilizadas no presente estudo foi obtida de animais assintomáticos, e que portanto

provavelmente estavam eliminando baixas concentrações de cistos.

Além destas questões cogitadas anteriormente, devem ser considerados ainda os

fatores extrínsecos que podem assim influenciar na eficiência de um método diagnóstico em

particular, assim sendo, o volume da amostra examinada, o tempo de coleta, o uso de líquidos

conservantes e as condições de envio ao laboratório também podem provocar alterações nos

resultados dos exames (ASH & ORIEHL, 1987).

Com relação ao nível de concordância pelo coeficiente kappa, há poucos dados na

literatura para amostras animais. Desta forma, para o hospedeiro canino, o nível de

concordância e os valores de kappa encontrados na comparação da microscopia e do ELISA

94

foram menores dos que os obtidos no estudo comparativo realizado por Uchôa (2009), que

obteve em seus resultados uma concordância quase perfeita (κ = 0,83).

Sobre o hospedeiro felino, não há dados na literatura acerca do nível de concordância

empregando o coeficiente kappa entre as técnicas imunológicas e a microscopia convencional

e, com isso, não foi possível discutir esta variável para este hospedeiro. Assim, os dados

obtidos no presente estudo poderão contribuir de forma a subsidiar outras pesquisas futuras de

cunho comparativo.

Um fato que deve ser contemplado é que o ELISA foi elaborado para ser utilizado em

amostras humanas. Logo, o esperado é que mais estudos com este hospedeiro sejam

encontrados e, geralmente, os dados obtidos relativos a performance das técnicas

imunológicas sejam melhores do que aqueles observados para as amostras de origem animal.

Por exemplo, Rodrigues-Ulloa & Riviera-Jacinto (2011), em seu estudo comparativo entre

ELISA e a técnica de sedimentação espontânea observaram uma taxa de positividade de

28,3% (49/174) em amostras humanas pela técnica de sedimentação e uma taxa de 29,3%

pelo ELISA (51/174). Sendo que em 118 amostras, foi notada a detecção do parasito pelas

duas técnicas, e 7 amostras que foram negativas pela sedimentação foram positivas pelo

ELISA.

Os cálculos dos parâmetros estatísticos apresentaram valores bem próximos para as

técnicas imunológicas. E comparando estes com o exame parasitológico, foi observada uma

maior sensibilidade dos métodos imunológicos em relação ao exame parasitológico, o que já

era esperado. Entretanto, a acurácia e o valor preditivo negativo do exame parasitológico

foram bem próximos aos dos métodos imunológicos.

Os dados da literatura sobre estes parâmetros são vastos para amostras de origem

humana, tendo em vista que a maioria das técnicas e kits imunológicos foram desenvolvidos

para uso nestes espécimes. Dentre os estudos, realizados tanto pela técnica de ELISA como

pelo método imunocromatográfico em amostras humanas, em que foi encontrada uma alta

sensibilidade e especificidade, destacam–se o de Behr et al. (1997), Rocha et al. (1999),

Hanson & Cartwright (2001), Garcia et al. (2003), Meraku et al. (2007).

No entanto, alguns estudos encontraram valores menores, como por exemplo, Rishniw

et al. (2010), que compararam 4 técnicas, duas de detecção de cistos (microscopia

convencional e IFD) e duas para detecção de coproantígenos (ELISA e imunocromatografia).

Estes autores mencionaram alguns pontos que podem explicar a grande quantidade de

resultados negativos gerados, sendo os principais a intermitência na liberação dos cistos e as

95

baixas concentrações antigênicas excretadas em animais infectados subclinicamente ou

cronicamente, podendo estas, estarem abaixo dos limites de detecção, produzindo, por

conseguinte, resultados falso-negativos.

Pelos resultados observados para as amostras caninas, a imunocromatografia foi

certamente a técnica que apresentou a maior sensibilidade e maior valor de preditividade

positiva. O valor de acurácia desta foi bem próximo das demais técnicas comparadas.

Entretanto, seu valor de especificidade e de preditividade negativa foram os menores. Estes

achados foram similares aos relatados por Sadaka et al. (2015) em seu estudo com amostras

humanas, no qual foi comparado as técnicas de imunocromatografia e de ELISA com a

microscopia. Estes autores observaram valores próximos para os parâmetros estatísticos

calculados para as técnicas imunológicas e ainda notaram um desempenho superior das

técnicas imunológicas em relação ao exame parasitológico de fezes.

Para Sadaka et al. (2015), os menores valores obtidos para especificidade pelas

técnicas imunológicas podem ser explicados pela detecção de amostras positivas por ambas as

técnicas, mas que foram negativas pelo EPF, sendo estas amostras consideradas por estes

autores como falso-positivas.

A alta sensibilidade encontrada pela técnica de ELISA para amostras caninas vai de

encontro com alguns dados encontrados na literatura sobre a alta sensibilidade desta técnica

imunológica. Zanzani et al. (2014), em estudo de prevalência realizado na Itália, evidenciaram

uma sensibilidade de 99,6% e uma especificidade de 100% (n=463). Papini et al. (2013),

utilizando uma amostragem de 143 amostras fecais caninas, encontraram pela técnica de

ELISA, uma sensibilidade de 88,9% e especificidade de 95,8%. Ambos os estudos foram

realizados com amostras caninas coletadas de solos oriundos de diversas cidades da Itália.

Decock et al. (2003), compararam a microscopia e o ELISA e encontraram uma alta

sensibilidade, maior que 90%. É importante salientar que estes autores trabalharam com

amostras de cães da raça Beagle, de ambos o sexos, todos filhotes, assintomáticos e

clinicamente sem alterações aparentes e realizaram o sistema de coleta seriado composto por

três amostras coletadas em dias alternados, o que pode explicar a alta sensibilidade observada

pelos mesmos.

Entretanto, Mircean et al. (2012), em seu estudo conduzido em amostras caninas na

Romênia encontraram um valor baixo de sensibilidade (19,44%) e especificidade para a

técnica de ELISA, e com isso o valor de concordância calculado foi baixo (κ = 0,19) em

relação ao EPF. Cabe ressaltar que os referidos autores utilizaram em seu estudo, amostras de

96

cães de diferentes origens (domiciliados, de canis, errantes, de pastoreio), com idade entre 1 a

16 anos, e realizaram coleta de somente uma amostra por animal. Estes fatores podem, então,

ter influenciado no baixo valor de sensibilidade encontrado.

Para as amostras felinas, o teste de ELISA foi o que apresentou melhor performance,

já que apresentou os maiores valores de sensibilidade, acurácia e valor preditivo negativo. A

técnica imunocromatográfica por sua vez, apresentou valores similares, porém, ligeiramente

mais baixos. Olson et al. (2010), em contrapartida, encontraram para o teste de ELISA uma

sensibilidade bem inferior (26,7%) e especificidade similar (96,5%). Neste caso, algumas

hipóteses podem ser cogitadas, sendos estas, a escolha do padrão de referência ou o número

de resultados falso-negativos e falso-positivos encontrados em seu estudo, uma vez que essas

condições possuem relação com os parâmetros de sensibilidade e especifidade.

Behr et al. (1997) mencionaram que o diagnóstico utilizando a detecção de

coproantígenos é altamente acurado e parece ser uma ferramenta útil para o diagnóstico deste

parasito, particularmente em situações nas quais não se têm profissionais experientes para

determinar os resultados pela microscopia. Porém, os mesmos salientam que tais técnicas não

possuem a habilidade de predizer a intensidade da infecção, uma vez que estas detectam a

presença de antígenos solúveis e não de cistos. Segundo Anderson et al. (2004), a

sensibilidade desta técnica ao analisar uma única amostra fecal é de aproximadamente 70% e

quando a coleta é realizada em 3 amostras com intervalos de 2 a 3 dias, a sensibilidade

aumenta para 96%.

A alta especificidade das técnicas de detecção de antígenos pode ser explicada pelo

fato de que estas empregam normalmente anticorpos monoclonais que agem diretamente

contra antígenos específicos de Giardia duodenalis e com isso ocorre uma redução na

possibilidade de haver reações cruzadas com outros micro-organismos (ROSOFF et al. 1989).

Conforme observado anteriormente, as técnicas que se baseiam na detecção de

antígenos de Giardia sp. apresentam uma sensibilidade acima de 90% e especificidade que

pode atingir o valor de 100%. Para Hopkins et al. (1993), além da alta sensibilidade e

especificidade, este método pode ser utilizado com uma relativa relevância na rotina clínica,

pois fornece resultados de forma rápida, particularmente em situações de riscos, como são os

casos dos surtos de veiculação hídrica. Bianciardi et al. (2004), citaram também outras

vantagens destas técnicas, tais como, a sua habilidade para detectar antígenos de Giardia em

amostras frescas e congeladas em aproximadamente 15 minutos, o que amplia a sua utilidade,

97

uma vez que também podem ser utilizadas na prática veterinária, sendo assim, um diagnóstico

alternativo para infecções deste parasito em cães e gatos.

Sobre as vantagens da imunocromatografia em relação ao ELISA e as demais técnicas,

Chan et al. (2000) pontuam que as primeiras são menos laboriosas e mais rápidas, já que em

sua metodologia não há etapas de incubação, lavagens e não envolve tantos reagentes como é

o caso dos ensaios imunoenzimáticos. Pillai & Kain (1999) citam como uma vantagem

adicional desta técnica imunocromatográfica as condições de armazenamento dos kits

comerciais que empregam tal metodologia, já que estes podem ser estocados em temperatura

ambiente. De acordo com Hopkins et al. (1993), as técnicas imunocromatográficas podem ser

realizadas tanto a campo como em laboratórios, já que os valores encontrados, em seu

estudo, para a sensibilidade e especificidade nestes dois ambientes foram bem próximos.

Entretanto, pode-se inferir que a técnica parasitológica de fezes permanece ainda como

um método de grande utilidade para detecção de Giardia sp., já que é a única capaz de

identificar outros parasitos na amostra, possuindo elevada especificidade para detecção tanto

de helmintos como de protozoários (Dryden et al., 2006; Katagiri & Oliveira-Sequeira, 2007;

Meraku et al. ,2007; Dos Anjos et al., 2013). É importante ressaltar também que cinco

amostras foram positivas apenas pelo EPF, não sendo detectado antígeno pelas técnicas

imunológicas. Para Paulino (2005), mesmo com o advento das ténicas imunológicas e

moleculares, é possível a ocorrência de resultados falso negativos em todas as técnicas devido

ao caráter intermintente da eliminação dos cistos.

De acordo com Thompson (1999), em muitos casos não se justifica a substituição das

técnicas coproparasitológicas convencionais pelas demais, tendo em vista ser o recurso

diagnóstico de eleição devido a sua simplicidade, a sua sensiliblidade e o seu baixo custo.

Logo, Chalmers (2009) acredita que estas novas metodologias devem ser empregadas

como complementares e não devem substituir o exame microscópico de fezes. Pois apesar dos

avanços nas técnicas imunológicas e moleculares para o diagnóstico deste parasito, o exame

parasitológico de fezes permanece como a técnica padrão-ouro para o diagnóstico de

giardíase.

Portanto, tendo em vista as questões discutidas e mediante os resultados obtidos,

pode-se dizer que o diagnóstico de Giardia duodenalis na Medicina Veterinária possui

inúmeras limitações e dificuldades, sendo estas, a menor quantidade de ferramentas

diagnósticas disponíveis nesta área, a escassez de estudos baseados nas técnicas imunológicas,

a falta de concordância entre os testes, e os problemas referentes à coleta das amostras fecais

98

de cães e gatos. Sendo assim, pesquisas voltadas para o desenvolvimento, adaptação de

metodologias diagnósticas e ainda estudos do tipo comparativo na área veterinária tornam-se

imprescindíveis para que estas possam ser empregadas com sucesso tanto na rotina clínica

como nas pesquisas de cunho epidemiológico.

Neste sentido, considerando todas as análises e resultados, pode-se inferir que a

técnica imunocromatográfica em relação as outras técnicas utilizadas no presente estudo,

mostrou-se eficaz para as amostras oriundas de animais de companhia, sobretudo, para as

amostras caninas, considerando suas diversas vantagens, podendo ser empregada em amostras

frescas e também em amostras armazenadas por vários anos. Portanto, trata-se de uma

alternativa complementar válida que pode ser empregada tanto para a rotina clínica veterinária

como para estudos de cunho epidemiológico, uma vez que permite gerar resultados com

elevada acurácia.

7. CONCLUSÕES

O exame parasitológico de fezes mediante a realição das técnicas de sedimentação

espontânea e centrífugo-flutuação com posterior visualização pela microscopia óptica

mostrou-se de suma importância já que permitiu a detecção de outros parasitos

gastrointestinais, além de Giardia duodenalis, nas amostras analisadas.

A metodologia do ensaio imunocromatográfico adaptada foi realizada com sucesso

nos sedimentos fecais de felinos e caninos estudados, podendo ser empregada tanto na clínica

médica veterinária como em estudos de cunho epidemiológico em sedimentos fecais

congelados.

O tempo de congelamento não interferiu significativamente nos parâmetros de

sensibilidade, especificidade e acurácia do teste imunocromatográfico modificado.

O ELISA foi o teste que apresentou maior sensibilidade para detectar coproantígenos

de Giardia duodenalis.

As comparações dos resultados entres os métodos diagnósticos revelou uma

concordância substancial entre o teste de imunocromatografia e o ELISA e, moderada entre o

EPF e o testes de imunocromatografia e o ELISA.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ZÁRATE, D.V.; CHÁVES, A.V.; CASAS, E.A.; FÁLCON, N.P. Prevalência de Giardia sp.

em canes de los distritos del cono Sur de Lima Metropolitana. Rev. Int. Vet. Perú. v. 14, n. 2,

p. 134-139. 2003.

119

ANEXO 1

Dados epidemiológicos da giardíase em diferentes anos, localidades, hospedeiros e

empregando técnicas diversas.

Autores Ano Local Técnicas Hospedeiros Frequência

(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Gennari et

al.

1999 Brasil

(SP)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães

Gatos

7,65%

16,04%

353

187

Arbabi &

Hooshyar

2000 Irã EPF (exame

direto e

sedimentação)

Gatos 0,9% (1) 113

Huber et al. 2002 Brasil

(RJ)

EPF (flutuação) Gatos 31,25% (15) 48

Serra et al. 2003 Brasil

(RJ)

EPF (flutuação) Gatos 12,1% (8)

amostras + =

cães errantes

131 amostras =

domiciliados e

errantes

Mundim et

al.

2003 Brasil

(MG)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães 68, 04% (68) 100 (3

amostras

coletadas)

Grezzana &

Marques

2003 Brasil

(SC)

EPF (flutuação) Cães 40% (24/60) 60

Zárate et al. 2003 Peru (Lima)

EPF (exame direto)

sedimentação

espontânea

Cães 8,8% - (Exame

direto)

15,7%

(sedimenta-

ção)

204

Decock et

al.

2003 França EPF (flutuação)

ELISA

Cães 3 exames –

flutuação:

100%;

1 exame de

flutuação com

1 ELISA: 93%

2 Exames de

ELISA– 97%

1 exame

flutuação:

72%

30

Bianciardi

et al.

2004 Itália ELISA Cães

Gatos

19,04%

(20/105)

4,16% (2/48)

105

48

Cirak &

Bauer

2004 Alemanha

Central

ELISA e EPF

(flutuação)

Cães

Gatos

EPF: 9,5%

ELISA: 29,5%

EPF: 0%

ELISA: 22,4%

270

100

Araújo et

al.

2004 Peru EPF

(sedimentação)

Cães 9,4% (36/385) 385

120


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Tesserolli

et al.

2005 Brasil

(PR)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães

Gatos

19,28% (54)

13,33% (4)

280

30

Beck et al. 2005 Brasil

(RS)

EPF (flutuação) Cães 34,04% (113) 332

Alves et al. 2005 Brasil (GO)

EPF (flutuação) Cães 18 %- técnica de Sheater

7,33% - Faust

434

Tavares et

al.

2005 Brasil

(SP)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães e gatos 16,55% (26) 133

Brener et

al.

2005 Brasil

(RJ)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães

Gatos

5% (4)

0% (0)

212

40

López et al. 2006 Chile EPF

(sedimentação)

Cães

Gatos

21,7% (211)

19,1% (44)

972

230

De

vasconcelos

et al.

2006 Brasil

(RJ)


Itoh et al. 2006 Japão ELISA Gatos 40% 240 amostras

Carlin et al. 2006 EUA EPF (flutuação)

e Imunocromato-grafia

Cães

Gatos

15,6% (2506)

10,8% (513)

16114

4978

Mekaru et al.

2007 EUA EPF (flutuação), IFD,Imuno-

ensaios (EIA E

NEIA)

Gatos 9,9% 344

Volotão et

al.

2007 Brasil

(RJ)

EPF (triagem)

Moleculares

(Gene: β-

giardina)

Humanos

Cães e Gatos

60% (223)-

EPF;

31% (62):

60- genótipo

AI;

2- genótipo

AII

8 amplificadas genótipo AI (7

cães e 1 de

gato)

366

62

29 amostras cães e 1 gato

Souza et al. 2007 Brasil

(SP)

EPF (triagem)

Molecular

Gene-alvo: gdh

Humanos

Cães

Gatos

Bovinos

29 - genótipo

AII; 8

genótipo B

7 genótipo C e

20 genótipo D

11- genótipo

F; 8 genótipo

AI

4- genótipo E;

1- genótipo

AI.

37

27

19

5

121


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Da Silva et

al.

2007 Brasil

(RS)

EPF (exame

direto e

flutuação)

Cães 12,08 % (29) 248

Rimhanen-

Finne et al.

2007 Finlândia IFD

ELISA

Cães IFD - 5,33%

(8)

150

Mendes-de-Almeida et

al.

2007 Brasil (RJ)

ELISA Gatos 28,4% (59) 208

Palmer et

al.

2008 Austrália EPF

(sedimentação e

flutuação)

Cães

Gatos

9,3%

2%

1400

1063

Torrico et

al.

2008 Brasil

(SP)

EPF (flutuação) Cães

Gatos

17,91% (67);

20,96% (13)

872

140

Eduardo 2008 Portugal Imunocromato-

grafia

EPF (método de concentração

comercial e

flutuação)

Humanos

Cães

Humanos Cães

13,8% (4)

49,32% (30)

6,9% (2) 33,8% (34)

29

61

29 61

Labarthe et

al.

2008 Brasil

(RJ)

EIA Cães

Gatos

9,7%

15,6%

1837

462

Brinker et

al.

2009 Brasil

(RS)

EPF (flutuação) Cães

Gatos

5,2% (4)

13% (3)

77

23

Gates &

Nolan

2009 EUA

(Filadél-

fia)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães

Gatos

3.3% (216);

2,3% (36)

6555;

1566

Coelho et

al.

2009 Brasil

(SP)

EPF (flutuação)

ELISA

Gatos 5,9% (3/51)

13,7% (7/51)

51

Uchôa 2009 Brasil

(RJ)

EPF (flutuação)

ELISA

Cães 19,1% (18/94)

14,9% (14/84)

94

Claerebout

et al.

2009 Bélgica EPF (flutuação)

Molecular

(gene alvo:β-

giardina)

Cães 9,3%

43,9% 18,1%

AII- 3;

AII- 36;

A-2

B-4;

C- 26;

D1- 16;

D2- 25;

D- 8

Domiciliados

(451); Canis

(357); Clínicas sintomáticos

(351)

63

Ferreira et

al.

2009 Brasil

(SE)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães 1,9% 150

122


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Olson et al. 2010 Canadá Imunocromato-

grafia (IC) e EPF

(exame direto e

flutuação)

Cães

Gatos

18,5% (241) –

IC;

Desses 241 -

31,8% (61) -

EPF

10,8%(16) –

IC;

Desses 16 –

26,7% (4) - EPF

1871

389

Katagiri e Oliveira-

Sequeira

2010 Brasil (SP)

EPF (flutuação, sedimentação e

teste de

concentração

comercial)

Cães 16,9% 254

Da Silva 2010 Brasil

(RS)


Dall´Agnol

et al

2010 Brasil

(RS)

EPF (exame

direto e

flutuação)

Gatos 34,5% 116

Kingsbury

et al.

2010 Nova

Zelândia

EPF (flutuação)

ELISA

Gatos 22,7% (5)

27,3% (6)

22

Upjohn et

al.

2010 Inglaterra ELISA

Molecular (gene

alvo:β-giardina e ssurRNA )

Cães 9,9% (87)

41

amplificaram

genótipos C e

D

878

51

De Almeida

et al.

2010 Brasil

(SC)

EPF (flutuação) Humanos

Cães

20% (21)

18% (19)

105

105

Soriano et

al.

2010 Argenti-

na

EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães 1,29% 1944

Volotão et

al.

2011 Brasil

(SP)

Moleculares,

para triagem

ensaios imuno-

enzimáticos e

EPF

Cães

Humanos

subgenótipos:

A1-3; A2-2

38

subgenótipos

A1; 6

subgenótipos

A2

5

44

Jaros et al. 2011 Polônia IFD

Moleculares

(gene-alvo: gdh)

Gatos 3,75% (6); 2

genótipo A; 2

genótipo B e 2

genótipo D

160

McDowall

et al

2011 Canadá

(Ontário)

EPF (flutuação),

ELISA – triagem

Moleculares

(genes-alvos:

gdh, tpi, β-

giardina,

ssurRNA)

Cães

Gatos

31% 37/118)-

33 genótipo D e 3 genótipo C

27% (4) -

genótipo F

118

15

123


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Khalafalla

et al

2011 Egito EPF (flutuação) Gatos 2% (2) 113

Dado et al. 2012 Espanha EPF

(sedimentação)

Molecular (gene: gdh)

Cães

Gatos

Cães

Gatos

16,4% (99)

4,2% (6)

15,9%

genótipo A;

73% genótipo B; 19%

genótipo C;

34,9%

genótipo D;

9,5% genótipo

E.

Genótipo AI e

F

604

144

63

1

Pivoto et al. 2013 Brasil

(RS)

EPF (flutuação e

sedimentação)

Gatos 4,2% (08) 191

Sotiriadou et al.

2013 Alemanha Moleculares Gene-alvo: gdh

Gatos

Cães

10,5% (2)

6,2% (5)

7 - genótipo A

19

81

Papini et al. 2013 Itália ELISA

Molecular (PCR

em tempo-real)

Cães 28% (40) ;

30,8% (44)

143

Marques &

Borges

2014 Brasil

(MT)


Pipia et al. 2014 Itália EPF (flutuação)

Moleculares:

(gene-alvo:β-

giardina e ssurRNA )

Cães 26,3% (172)

17 genótipos

C; 23

genótipos D;

2 genótipos A

655

47 amostras

(42

amplificadas)

Zanzani et

al.

2014 Itália ELISA Cães 11,06% (50) 463

Tseng et al. 2014 China

(Taiwan)

EPF (exame

direto)

Moleculares

Gene-alvo: β-giardina

Cães 9,3% (11)

7- genótipo C;

4 genótipo D

118

Cleto 2014 Portugal EPF (flutuação)

Imunocroma-

tografia

Cães 11,8% (4)

11,8% (4)

34

Mota et al. 2014 Brasil

(MG)


Ahmed 2014 Egito EPF (flutuação e

sedimentação)

Cães 12% (21) 180

124


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Pitães et al. 2015 Portugal IC

EPF (flutuação)

Cães 21,6% (11)

19,67% (10)

51

Quadros et

al.

2015 Brasil

(SC)

EPF (flutuação e

sedimentação)

ELISA

Humanos

Cães

12,08%

(11/91) EPF;

17,54%

(10/57)

ELISA

5,29%

(28/529) EPF;

22,15% (35/1580)

ELISA

9,25%

(10/108)EPF;

16,07%

(9/56)ELISA

8,1% (29/357)

17,61%

(28/159)

grupoI

(amostras

coletadas

escola)

Grupo II

(amostras

enviadas ao laboratório)

grupo III- cães

domiciliados

Grupo IV -

cães CCZ

Pitães et al. 2015 Portugal IC

EPF (Flutuação)

Cães 21,6% (11)

19,67% (10)

51

Huaman-

cayo & Chavés

2015 Peru EPF (flutuação e

sedimentação)

Imunocro-

matografia

Cães Flutuação:

17,9%;

Sedimen-

tação:12,1%

25,0%

140

Verhoeven 2015 Bélgica EPF (flutuação)

x

IFD (padrão-

ouro)

PCR em tempo

real (gene-alvo: ssurRNA) x

IFD (padrão-

ouro)

Cães 41%

(145/354)

10% (35/354)

4 %

6%

354

comparadas

14

(comparadas)

Shin et al. 2015 Coreia Molecular

(gene alvo:β-

giardina)

Cães 25,7%

(39/152)

56% (28/50)

Genótipos A e

C

152 =

Gyeongbuk

50= Daejeon

202 total

125


(n. de

amostras

positivas)

N. total de

amostras

Colli et al. 2015 Brasil

(PR)

Molecular

(genes-alvos:

gdh e β-giardina)

Humanos

Cães

EPF (34);

76,5% (26/34

amplificaram)

19 amostras

subgenótipo

BIV

EPF( 2)

3 amostras genotipadas :

2 + pelo EPF(

Genótipos

BIV, C); e 1 –

pelo EPF(

genótipo D)

Nenhuma

amostra

positiva foi encontrada

2 amostras-

genótipo BIV

380 amostras

humanas

34 amostras animais

44 amostras de

água

11 amostras de

vegetais

* NEIA: Ensaio não-imunoenzimático; IC: Imunocromatografia; EPF: exame parasitológico de Fezes;

EIA: Ensaio imunoenzimático; IFD: Imunofluorescência direta.

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