INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE Pró-reitora de...

INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE

Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação

Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal

Dissertação

Uso de vacinação para redução da prevalência de Salmonella sp. em suínos de abate

Caroline Reichen

Concórdia, 2018

Caroline Reichen


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Produção e Sanidade Animal do

Instituto Federal Catarinense, como requisito parcial

à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de

concentração: Produção e Sanidade Animal).

Orientador: Jalusa Deon Kich

Coorientador (es): Diogenes Dezen

Arlei Coldebella

Augusto Heck

Concórdia, 2018

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,

através do Programa de Geração Automática do ICMC/USP, cedido ao IFC e adaptado pela CTI - Araquari e pelas bibliotecas do Campus de Araquari e Concórdia.

Reichen, Caroline

R351u Uso de vacinação para redução da prevalência de

Salmonella sp. em suínos de abate / Caroline Reichen;

orientadora Jalusa Deon Kich; coorientador Diogenes

Dezen; coorientador Arlei Coldebella; coorientador

Augusto Heck. -- Concórdia, 2018.

57 f.

Dissertação (mestrado) - Instituto Federal Catarinense,

campus Concórdia, Programa de Pós-graduação em Produção e

Sanidade Animal, Concórdia, 2018.

1. Estudo de campo. 2. Vacina de Subunidade. 3.

Soroprevalência. 4. Excretores. 5. Portadores. I. Kich, Jalusa

Deon, II. Dezen, Diogenes. III. Coldebella, Arlei. IV. Heck,

Augusto. V. Instituto Federal Catarinense. Programa de Pós-graduação em Produção e Sanidade Animal. VI. Título.

Dedico este trabalho aos meus pais Eucrides Antônio Reichen e Geni Moresco

Reichen, pela educação, suporte e oportunidades a mim dedicadas!

Agradecimentos

À minha família, pelo apoio e incentivo.

Ao meu marido Cicero Teófilo Berton, pela sapiência, apoio e compreensão em toda

essa jornada.

Ao IFC, pelo ensino público, gratuito e de qualidade, e todo o seu corpo de professores

e colaboradores. Em especial ao professor Dr. Ivan Bianchi.

À Embrapa, pela importante instituição que é, e pelo apoio na realização do

experimento, nas pessoas de Dra. Jalusa Deon Kich, Remidio Vizzotto, Luiza Letícia Biezus,

Mariana Meneguzzi e Luiz Carlos Ajala.

À minha orientadora, amiga e conselheira Dra. Jalusa Deon Kich. Uma profissional com

muito conhecimento e nobreza que engrandecem a pesquisa veterinária brasileira e mundial.

Aos co-orientadores, Dr. Diogenes Dezen, Augusto Heck e, em especial ao Dr. Arlei

Coldebella, pelo auxílio na parte estatítisca.

Aos colegas de mestrado, pelas amizades e discussões produtivas. Em especial a minha

querida Franciana Bellaver, pelas noites mal dormidas, risadas compartilhadas e regras de

ABNT.

À Vetanco pela parceria para realização do experimento. Em especial aos meus

queridos amigos Lucas Piroca e Gilmara Adada, sem vocês a caminhada não seria completa.

À BRF pelo espaço cedido para a coleta e processamento de dados da pesquisa.

Ao Cedisa pelo processamento das amostras, em especial as colegas Lauren Ventura e

Suzana Satomi Kuchiishi.

Aos profissionais médicos veterinários, engenheiros agrônomos e técnicos agrícolas,

amigos e companheiros desta labuta que é servir a suinocultura, em prol de uma melhoria

constante e incansável. Vocês fizeram parte deste sonho: Leonel Araújo Brehem, Francisco

Elias Vendruscolo, Juliano Parizoto, Sidmar Kaiber, Diego Treméa, Felipe Neis e Claudecir

Breitenbach.

Resumo

REICHEN, Caroline. Uso de vacinação para redução da prevalência de Salmonella sp. em suínos de abate .2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Concórdia, 2018.

Dentre as doenças zoonóticas transmitidas por alimentos, a salmonelose é a mais frequente, sendo alvo de controle nos produtos de origem animal. Embora programas de garantia da qualidade devam estar implantados no ambiente de abate e processamento da carne, medidas de controle na fase de criação colaboram com a redução da contaminação das carcaças. Neste sentido, a proposta deste estudo foi avaliar o uso de uma vacina de subunidade baseada em antígenos secundários, que ampliam o espectro em relação aos sorovares, na redução da soroprevalência e prevalência de suínos portadores de Salmonella sp. nos linfonodos mesentéricos e excretores nas fezes. A unidade experimental foi o lote de suínos terminados, sendo escolhidas aleatoriamente 10 granjas terminadoras para alojar os animais do grupo controle (GC) e 10 para o grupo vacinado (GV). Inicialmente, foram escolhidos 16 crechários para realizar a primeira vacinação e suprir as granjas de terminação, sendo oito para o GC e oito para o GV. A vacina foi fornecida via oral, 2 mL por animal, em quatro idades diferentes. A primeira dose foi administrada no segundo dia de alojamento na creche, a segunda dose 14 dias após a primeira, a terceira dose após 30 dias de alojamento na terminação e a quarta dose 21 dias antes do abate. Os animais permaneceram nas granjas terminadoras em média por 110 dias e foram abatidos com idade média de 175 dias de vida. Amostras de sangue foram coletadas nos crechários, após a segunda dose da vacina (n=32/grupo) e na primeira semana da terminação e ao abate (n= 30/lotes). Linfonodos mesentéricos (n=30/lote) e fezes (n= 20/lote) foram coletadas ao abate. O sangue foi processado por citometria de fluxo, o soro submetido a teste de ELISA e as amostras de linfonodos e fezes ao protocolo de isolamento de Salmonella (ISO 6579). Adicionalmente, foi realizada a quantificação de Salmonella nas fezes pela técnica de número mais provável. Não foi observada diferença estatística entre os grupos (p>0,05), tanto para soroprevalência (% de suínos positivos), quanto para intensidade da reação sorológica medida pela variabilidade da densidade ótica. A vacinação não reduziu a prevalência de portadores de Salmonella sp. nos linfonodos mesentéricos e excretores nas fezes, bem como a quantidade excretada.

Palavras-chave: estudo de campo; vacina de subunidade; soroprevalência; excretores; portadores.

Abstract

REICHEN, Caroline. Evaluation of the efficiency of vaccination use to reduce the prevalence of Salmonella sp. In pig slaughter. 2018. 57f. Dissertation (Master degree in Science) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Araquari, 2017.

Among the foodborne diseases, Salmonellosis is the most frequent, being controlled in the products of animal origin. Even though quality control programs should be implemented in the slaughter and meat processing, measures driven to the herds could contribute to decrease carcasses contamination. The purpose of this field trial was to evaluate the use of a subunit vaccine, based on secondary antigens, broad-spectrum among Salmonella serovars, in reduction of seroprevalence and prevalence of Salmonella carriers in mesenteric lymph nodes and shedders at slaughter. The experimental unit was a batch of fattening pigs, being chosen randomly 10 finishing farms to place the control group (GC) and 10 for the vaccinated group (GV). Initially, 16 nurseries were chosen to carry out the first vaccination and supply the finishing farms, being 8 for the GC and 8 for the GV. The vaccine was orally supplied, 02 mL by animal at four different ages. The first dose was on the second day of nursery, the second dose 14 days after the first, the third dose after 30 days of fattening and the fourth dose 21 days prior slaughter. The animals remained on the fattening for 110 days on average and slaughtered at 175 days old. Blood samples were collected after the second vaccine dose (n=32/group), and in the first week of fattening and at slaughter (n=30/batches). Mesenteric lymph nodes (n=30/batches) and feces (n=20/batches) were collected at slaughter. The blood was processed by flow cytometry, the serum submitted to ELISA test and lymph node and feces samples submitted to the isolation of Salmonella (ISO 6579). In addition, the quantification of Salmonella in feces was performed by the most probable number technique. There was no statistical difference between the groups (p> 0.05), both for seroprevalence (% of positive pigs) and for the intensity of the serological reaction measured by the variability in the value of optical density. Also, the vaccination did not reduce the prevalence of carriers in mesenteric lymph nodes and Salmonella shedders in feces, as well as their quantity shedding. Keywords: field trial; subunit vaccine; seroprevalence, shedders; carriers.

Lista de Figuras

Figura 1. Fluxograma do delineamento experimental. ............................................................ 28

Figura 2. Perfil da soroprevalência em função do grupo e do período de coleta, em diferentes

% de DO. ................................................................................................................................... 32

Figura 3. Perfil da densidade ótica em função do grupo e do período de coleta. ................... 33

Figura 4. Percentual de isolamento de Salmonella sp. nas fezes em função da soroprevalência.

.................................................................................................................................................. 35

Figura 5. Percentual de isolamento de Salmonella sp. nas fezes em função da densidade ótica

média. ....................................................................................................................................... 35

Figura 6: Atividade fagocítica dos monócitos e neutrófilos no grupo controle e vacinado. ... 36

file:///C:/Users/Usuário/Desktop/Caroline%20Documentos/Mestrado/Dissertação/Dissertação%20Vs/Dissertação%20VF-%20correções.docx%23_Toc522196805

Lista de Tabelas

Tabela 1. Comparação entre variáveis de desempenho zootécnico entre os grupos vacinados

para Salmonella sp. e controle. ................................................................................................ 31

Tabela 2. Percentagem de amostras de abate positivas para Salmonella sp. nas fezes e nos

LNM e respectivo teste de 2 , para o grupo controle e vacinado. ......................................... 33

Tabela 3. Número mais provável de unidades formadoras de colônias de Salmonella sp. em

amostras de fezes de suínos vacinados e controles. ................................................................ 34

SUMÁRIO

1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE ................................................. 15

2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 22

2.1 Geral ..................................................................................................................... 22

2.2 Específicos ............................................................................................................ 22

3 TÍTULO DO ARTIGO, PROCESSO OU NOTA TÉCNICA .......................................................... 23

3.1 Resumo ou Abstract ............................................................................................. 23

3.2 Introdução ........................................................................................................... 23

3.3 Material e Métodos ............................................................................................. 26

3.3.1 Desenho Experimental ...................................................................... 26

3.3.2 Vacinação .......................................................................................... 27

3.3.3 Coleta das amostras .......................................................................... 27

3.3.4 Sorologia ............................................................................................ 28

3.3.5 Bacteriologia ...................................................................................... 28

3.3.5.1 Quantificação de Salmonella sp. nas fezes ........................................... 29

3.3.6 Citometria de Fluxo ........................................................................... 29

3.3.7 Análise Estatística .............................................................................. 30

3.4 Resultados ............................................................................................................ 31

3.5 Discussão ............................................................................................................. 37

3.6 Conclusão ............................................................................................................. 42

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................................... 43

5 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 45

6 ANEXOS ............................................................................................................................... 54

15

1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE

Agentes patogênicos bacterianos, causas de doenças transmitidas por alimentos

(DTA) no ser humano, constituem um problema global. Frequentemente causam surtos

epidêmicos de doenças intestinais e são responsáveis por perdas econômicas elevadas

(Selke et al., 2007). Dentre as DTA, a salmonelose é uma das mais importantes (Mead et

al., 1999). Na produção animal, a infecção por salmonelas representa uma ameaça

multifacetada como doença clínica e segurança dos alimentos, o que gera preocupações

e risco para a saúde pública (Narrod et al., 2011).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (2010), aproximadamente 80 milhões

de pessoas no mundo foram vítimas de DTA causada por Salmonella sp. e, destas, 60 mil

vieram a óbito. Nos EUA, 6-9% delas estão associadas a produtos suinícolas (Frenzen et

al., 1999). Na Europa, 10% dos casos de salmonelose humana que ocorreram entre 2005

e 2006, estavam associadas ao consumo de carne suína (Pires et al., 2010). No Brasil,

segundo o Ministério da Saúde (2018), foram notificados 13 mil casos de DTA, onde 92,2

% envolveram bactérias e, deste total, 30% dos casos foram causados pela Salmonella

sp.

As infecções por salmonela em rebanhos de suínos são muitas vezes endêmicas

e predominantemente subclínicas (Kranker et al., 2003). Esta situação evidencia a

necessidade de ação para monitorar e reduzir o número de animais infectados

(Rostagno, 2011). A relação entre as condições sanitárias pré-abate e a segurança

alimentar justificam programas de controle do campo à mesa e que integrem as medidas

na cadeia de produção para melhorar a qualidade dos produtos (EFSA, 2010).

Embora a infecção por Salmonella sp. possa ocorrer em todas as fases da

produção de suínos (Arguello et al., 2013), a probabilidade que os suínos sejam

infectados em algum momento durante o período de terminação é cerca de 85%

(Berends et al., 1996; Kranker et al., 2003). No Brasil, a soroconversão na fase de

crescimento e terminação está bem documentada e a soroprevalência dos suínos no

16

alojamento na terminação é baixa, em torno de 5,5 % (Schwarz et al., 2009; Costa et al.,

2014), enquanto na idade de abate aumenta para índices que variam de 75 a 98% (Kich

et al., 2005; Silva et al., 2006; Schwarz et al. 2009; Kich et al., 2011; Costa et al., 2014).

Estudos brasileiros demonstraram que 50 a 70% dos suínos são portadores de

Salmonella sp. em linfonodos mesentéricos-LNM (Kich & Cardoso, 2012). Entre 5-30%

dos animais podem excretar o agente nas fezes no final do período de terminação, e

essa porcentagem pode dobrar durante o transporte e alojamento (Berends et al.,

1996). A transmissão e infecção ocorre de forma rápida durante o transporte (Hurd et

al., 2001; Letellier et al., 2009), nas pocilgas de espera pré-abate pode ocorrer em duas

horas após a exposição ao agente (Hurd et al., 2001; Rostagno et al., 2003). Esse

aumento na prevalência é atribuído aos efeitos do estresse no momento do

carregamento, transporte e jejum alimentar (Hurd et al., 2001).

Os suínos são um risco em potencial, por que muito tempo depois de terem sido

infectados eles seguem excretando intermitentemente a bactéria nas fezes. Sabe-se que

podem excretar entre 104 e 106 Unidade Formadora de Colônia (UFC) por grama de fezes

(Gopinath et al., 2012), e/ou abriga-lá no trato intestinal e gânglios linfáticos associados

(Bonardi et al., 2003; Griffith et al., 2006; Boyen et al., 2008). De acordo com Berends et

al. (1996), uma diminuição no número de animais portadores ao abate é considerada o

primeiro passo para alcançar produtos de carne suína livre de Salmonella sp.

Neste contexto, o Codex Alimentarus (CAC-GL-87/6.1-2016), orienta o uso de

múltiplas intervenções ao longo de diferentes etapas de produção e processamento

como parte de uma estratégia de “múltiplos obstáculos”, que proporcionará uma

redução mais consistente de Salmonella sp. Medidas para controlar o agente na

suinocultura devem ser adotadas no campo, com o intuito de diminuir o número de

carreadores e excretores no abatedouro, para minimizar a contaminação e

contaminação cruzada de carcaças e produtos cárneos (OIE, 2016).

Programas nacionais de controle de Salmonella sp., voluntários ou mandatórios,

estão em curso em vários países. Em muitos casos, a sorologia com determinação da

17

prevalência do lote em idade de abate tem sido usada como indicador de risco de

contaminação da carcaça (Sørensen et al., 2004; Alban et al., 2012; Mainar-Jaime et al.,

2017).

Com o objetivo de reduzir a prevalência de Salmonella sp. em rebanhos suínos e

carcaças, em 1995, foi iniciado na Dinamarca a primeira versão do programa de controle

com base na sorologia (Mousing et al., 1997). Os rebanhos foram classificados em três

níveis de acordo com a soroprevalência (Alban et al., 2002). No início foi usado um ponto

de corte de 40 % de densidade ótica - DO (Mousing et al., 1997), o qual foi reduzido para

20 % de DO, amostrando lotes com mais de 200 animais terminados por ano (Nielsen et

al., 2001; Alban et al., 2002). Os lotes foram divididos em três níveis relacionados ao

risco de introdução de Salmonella sp. no ambiente de abate: Nível 1, definido como um

rebanho com um índice sorológico de Salmonella sp. variando de 1 < 40%; nível 2,

40

18

de conhecimento científico, em especial sobre novas tecnologias, incluindo vacinas e

outras alternativas para o controle de patógenos na produção animal.

Neste sentido, a estimulação do sistema imune por vacinas contra Salmonella sp.

visa prevenir a colonização intestinal e a excreção do agente nas fezes (Denagamage et

al., 2007; Arguello et al., 2012b), bem como o desenvolvimento do estado portador, o

qual é o grande reservatório do agente e representa uma ameaça importante para a

saúde humana (Haesebrouck et al., 2004; Boyen et al., 2008).

A imunidade inata, mediada por neutrófilos, os macrófagos (células que são a

ponte entre a imunidade inata e adaptativa) e a imunidade celular desempenham um

papel importante na proteção contra Salmonella sp. (Haesebrouck et al., 2004; Arguello

et al., 2012b). Neutrófilos e macrófagos são responsáveis pela fagocitose, a qual

permite a eliminação dos agentes invasores e a apresentação de antígenos estranhos ao

sistema imune (Janeway et al., 2001). No caso da Salmonella sp. a resposta imune

humoral é parcialmente evadida pelo fato da bactéria estar protegida pelas células que

infecta, como os macrófagos (Arguello et al., 2012b). Sendo assim, o estabelecimento

da imunidade de longa duração à infecção depende do desenvolvimento de células

especificas T e B (Mastroeni et al., 2001), da indução de produção de IgA na mucosa

(Haesebrouck et al., 2004; Roesler et al., 2006) e de respostas mediadas por CD4 e CD8

(Mastroeni et al., 2009).

Vacinas vivas atenuadas têm conferido uma melhor proteção contra a

Salmonella sp. devido à capacidade de induzir resposta imune celular (Haesebrouck et

al., 2004)., enquanto as vacinas mortas e de subunidades tem obtido resultados

variáveis (Xu et al., 1993; Davies & Breslin, 2003), provavelmente pela baixa capacidade

de gerar imunidade mediada por células.

Vacinas administradas via oral estimulam a produção de IgA e não há

necessidade de manuseio e injeção de animais individualmente, o que demanda mão-

de-obra e tende a ser questionado por produtores e/ou agroindústria que terceirizam

esse manejo. Evidências crescentes indicaram que a vacinação de mucosa pode induzir

19

imunidade sistêmica e local (Valosky et al., 2005), e uma forte resposta da IgA pode ser

um elemento significativo da proteção contra a colonização e a doença (Roesler et al.,

2006).

A literatura internacional tem registrado resultados variáveis do efeito da

vacinação contra Salmonella sp. na redução de suínos portadores e excretores da

bactéria.

Estudando a prevalência de suínos portadores de Salmonella sp. Arguello et al.

(2013) realizaram três avaliações. Não se comprovou efeito da vacinação (cepa de S.

Typhimurium DT104) em duas, das três avaliações realizadas na porcentagem de suínos

portadores do agente nos LNM (Grupo Vacinado-GV: 80 e GC:67,5%; GV: 97,5 e Grupo

Controle-GC: 95%). Já na terceira avaliação, a vacina demostrou efeito significativo com

prevalência de 30% de portadores em LNM contra 75% do grupo controle. Com relação

a porcentagem de excretores no conteúdo cecal, a vacina gerou uma redução de 13 para

3% e de 85% para 12,5% nos grupos de suínos vacinados.

Segundo Farzan & Friendship (2010) a vacina composta com S. Choleraesuis e S.

Typhimurium não reduziu a prevalência de suínos excretores de Salmonella sp. no

conteúdo fecal. Outros autores (De Ridder et al., 2013; De Ridder et al.,2014; Smith et

al., 2017; Steichen et al., 2017, relataram efeito positivo da vacinação com redução da

prevalência de suínos excretores de Salmonella sp. nas fezes, de até 69,6%.

A vacinação contra Salmonella sp. é sabidamente efetiva para a proteção da

doença clínica em suínos e pode auxiliar na melhoria da segurança dos alimentos.

Entretanto, com mais de 2.500 sorovares, as vacinas oferecem limitada proteção

cruzada contra sorovares heterólogos (Bearson et al., 2016). Neste sentido, Arguello et

al. (2013) concluíram que a vacina foi protetiva contra infecções do mesmo sorovar,

entretanto falhou ao conferir uma proteção entre sorovares distintos. No Brasil,

Schwarz et al. (2011) e Costa (2014) testaram a mesma vacina em diferentes sistemas

de produção. Schwarz et al. (2011) obtiveram uma redução de 79,7% para 44,6% na

soroprevalência e 59,5% para 31,1% na prevalência de portadores em linfonodos, porém

20

Costa (2014) não observou efeito positivo no uso da vacina na redução da

soroprevalência de suínos em idade de abate. Esta diferença nos resultados entre

sistemas de produção evidencia a dificuldade das vacinas em superar as especificidades

das granjas, as quais podem estar relacionadas com os sorovares de Salmonella sp.

presentes. Conforme (Roesler et al., 2006), a maioria das vacinas diminuem os sintomas,

mas não eliminam o estado de portador e excretor da Salmonella sp., especialmente

evidenciado no pré-abate (Leyman et al., 2012).

A maioria das vacinas usam antígenos baseados nos lipopolissacarídeos (LPS) de

membrana de Salmonella sp. A definição do sorovar é baseada em uma fórmula

antigênica de diferentes antígenos (Grimont & Weill, 2007). O LPS é parte dessa fórmula

e, embora possa ser compartilhado entre diferentes sorovares, a indução da proteção

parece não ser suficiente (Arguello et al., 2013). Para contornar essa barreira da

especificidade dos antígenos LPS, os produtos estão sendo continuamente melhorados.

Neste sentido, Bearson et al. (2016); Layton & Jabif (2017) utilizaram vacinas

geneticamentes modificada com o objetivo de resolver as limitações das vacinas atuais

com relação a proteção entre os sorovares. A experiência de Bearson et al. (2016)

mostraram que a vacina foi efetiva contra dois sorovares Choleraesuis e Typhimurium.

A vacina de subunidade, desenvolvida por Layton & Jabif (2017), obteve uma

redução de 40% na excreção de Salmonella com 14 dias pós infecção, em um modelo de

inoculação experimental da cepa Salmonella Enteritidis INTA 86 (10 7 UFC /ml) em

frangos de corte. Resultado semelhante foi obtido na inoculação experimental do

sorovar Typhimurium (108 UFC /ml), onde a administração da vacina reduziu

significativamente a colonização de Salmonella sp. nos órgãos (fígado, baço, ceco e

tonsilas). Em teste de campo, avaliou-se a mesma vacina, agora em aves poedeiras,

obtendo um aumento significativo da imunidade local específica (aumento prolongado

de IgA). Porém, essa tecnologia ainda não foi validada em suínos.

Neste cenário, o desafio de reduzir a prevalência de suínos portadores e

excretores de Salmonella sp. continua atual. Como contribuição para a solução deste

21

problema, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito desta vacina de subunidade,

baseada em antígenos secundários, administrada via oral, contra infecção natural por

Salmonella sp. em granjas de terminação de suínos.

22

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Testar a eficiência do uso de vacina, via oral, na redução da Salmonella sp. em

suínos de abate.

2.2 Específicos

2.2.1 Comparar a soroprevalência para Salmonella sp. por meio de ELISA, em

suínos vacinados e controle.

2.2.2 Comparar a quantidade de IgG por meio da do obtida no ELISA em suínos

vacinados e controle.

2.2.3 Comparar a prevalência de suínos portadores de LNM positivos para

Salmonella sp. em suínos vacinados e controle.

2.2.4 Comparar a prevalência de suínos excretores de Salmonella sp. em suínos

vacinados e controle

2.2.5 Comparar a quantidade de Salmonella sp. excretada em suínos vacinados

e controle através do mNMP.

2.2.6 Avaliar a atividade fagocítica da vacina de subunidade Bio Tech Vaccine

23

3 TÍTULO DO ARTIGO, PROCESSO OU NOTA TÉCNICA


Comparative immunology, microbiology & infectious diseases. (https://www.journals.elsevier.com/comparative-immunology-microbiology-and-

infectious-diseases)

Autores

Reichen, Caroline; Coldebella, Arlei; Dezen, Diogenes; Heck, Augusto; Kich, Jalusa Deon

3.1 Resumo ou Abstract

The purpose of this field trial was to evaluate the use of a subunit vaccine, based on secondary antigens, broad-spectrum among Salmonella serovars, in reduction of seroprevalence and prevalence of Salmonella carriers in mesenteric lymph nodes and shedders at slaughter The experimental unit was a batch of fattening pigs, being chosen randomly 10 finishing farms to place the control group (GC) and 10 for the vaccinated group (GV). Blood samples were collected after second vaccine dose (n=32/group), in the first week of fattening and at slaughter (n=30/batches). Mesenteric lymph nodes (n=30/batches) and feces (n=20/batches) were collected at slaughter. The serum was submitted to ELISA test and lymph node and feces samples submitted to the isolation of Salmonella (ISO 6579). In addition, the quantification of Salmonella in feces was performed by the most probable number technique. There was no statistical difference between the groups (p> 0.05), both for seroprevalence (% of positive pigs). Keywords: field trial; subunit vaccine; fattening; seroprevalence, excretors; carriers

3.2 Introdução

A Salmonella sp. é um dos principais agentes causadores de doenças

transmitidas por alimentos (DTA) em humanos. Em 2016, 94.530 casos de salmonelose

foram confirmados na União Europeia (EU), ovos e carne de frango continuam sendo a

fonte mais comum, seguidos pela carne suína (EFSA 2017). Em 2011, aproximadamente

56,8% dos casos de salmonelose relatados em humanos foram associados a carne suína

e seus derivados (EFSA, 2013). Estima-se que, anualmente, cerca de 80 milhões de

24

pessoas no mundo tiveram uma doença transmitida por alimento contaminado com

Salmonella sp. e destas, 60 mil vieram a óbito (Majowicz et al., 2010; Organização

Mundial da Saúde, 2010).

Suínos portadores são reservatório de Salmonella sp. e responsáveis pela

manutenção da bactéria em toda a cadeia de produção suinícola (Griffith et al., 2006;

Boyen et al., 2008). Estudos brasileiros demonstraram que 50 a 70% dos suínos são

portadores de Salmonella sp. em linfonodos mesentéricos-LNM (Kich & Cardoso, 2012).

Na EU, os números oscilam de zero, no caso da Finlândia, a 30% na Espanha, de suínos

com a presença de Salmonella sp. nos linfonodos (EFSA, 2008). Uma diminuição no

número de animais portadores e excretores de Salmonella sp. ao abate é considerado o

primeiro passo para alcançar produtos de carne suína livre de Salmonella sp. (Berends

et al., 1996).

Programas nacionais de controle de Salmonella sp., voluntários ou mandatórios,

estão em curso em vários países como Dinamarca, Alemanha e Irlanda (Mousing et al.,

1997; Alban et al., 2002; Rowe et al., 2003). Esses programas utilizam a sorologia para

determinar a prevalência do lote, em idade de abate, como indicador de risco de

contaminação da carcaça (Sørensen et al., 2004; Alban et al., 2012; Mainar-Jaime et al.,

2017).

A disseminação da infecção por Salmonella sp. se intensifica na fase de

crescimento/terminação. Vários estudos epidemiológicos demostraram que a

soroprevalência do momento do alojamento nas granjas de crescimento e terminação

é baixa, aproximadamente 5%, em comparação com o abate, onde alcança 70 a 100%

(Kich et al., 2005; Silva et al., 2006; Schwarz et al., 2009; Kich et al., 2011; Costa et al.,

2014).

O controle de Salmonella sp. na suinocultura passa por uma visão sistêmica do

problema e um programa integrado voltado para as principais etapas da produção,

desde a fábrica de ração, granjas, abate e processamento (Kich et al., 2015). As ações

dentro do frigorífico são imprescindíveis para a proteção do consumidor. Contudo,

25

medidas de controle na fase de produção animal primária também são necessárias para

que ocorra uma redução no número de animais portadores e excretores que chegam ao

abate. Entre as várias ferramentas disponíveis, a vacinação é um conceito tradicional e

consolidado na medicina veterinária preventiva.

A vacinação contra a infecção por Salmonella sp. em suínos previne a doença

clínica, diminui a colonização e translocação do patógeno para órgãos internos (Bearson

et al., 2016). Porém, para contribuir com a mitigação do risco de contaminação do

ambiente de abate é necessário a redução da proporção de suínos portadores e

excretores da bactéria, bem como da quantidade eliminada pelas fezes por ocasião do

pré-abate e abate. Nestes aspectos a vacinação contra Salmonella sp. tem produzido

resultados variáveis com falta de repetibilidade inclusive para o mesmo produto

(Schwarz et al.,2011; Costa, 2014). Entre os motivos levantados pelos autores,

destacam-se a variabilidade de sorovares presente nas granjas e a forma de

administração da vacina.

A maioria das vacinas usam antígenos baseados em lipopolissacarídeos (LPS) de

membrana, essas moléculas, tendem a ser específico a um determinado sorovar e/ou

sorogrupo. Entretanto, com a variabilidade de sorovares presentes nas granjas (Kich et

al. 2011) e as vacinas oferecendo limitada proteção contra sorovares heterólogos

(Bearson et al., 2016), investimentos em produtos inovadores têm sido propostos. Para

contornar a barreira da especificidade, Bearson et al. (2016) produziram vacina viva

atenuada contendo mutação genética para reduzir a produção de LPS e Layton & Jabif

(2017) propuseram vacina de subunidade com antígenos secundários.

Formulações com administração via mucosa, oral ou instilação nasal, estimulam

a produção de IgA e imunidade celular, importantes no controle do referido patógeno.

Especificamente, a administração oral torna o produto mais competitivo porque reduz

consideravelmente a mão-de-obra se comparado a necessidade de injetar nos animais

individualmente.

26

Neste contexto, o desafio atual é reduzir os sorovares de Salmonella sp. que

causam DTA. Desta forma, as vacinas devem ser aplicadas em animais não infectados

atuando como profilaxia para reduzir a disseminação e amplificação da infecção, bem

como a prevalência de animais portadores e excretores.

Para contribuir com a solução deste problema, o objetivo desta pesquisa foi

avaliar uma vacina de subunidade baseada em antígenos secundários, administrada via

oral contra infecção natural em granjas de terminação de suínos.

3.3 Material e Métodos

Este estudo foi realizado em uma unidade de produção de uma agroindústria

brasileira, localizada no meio-oeste de Santa Catarina que adota sistema de integração

em sítios.

O experimento foi conduzido seguindo os Princípios Éticos na Experimentação

Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e

aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA / IFC) (Protocolo nº

02/2017), conforme Anexo I. Todos os procedimentos experimentais foram realizados

em estrita conformidade com as diretrizes e regulamentos aprovados pelo Comitê

Institucional de Ética em Animais.

3.3.1 Desenho Experimental

O experimento foi realizado em 20 granjas de crescimento e terminação de suínos

pertencentes ao mesmo sistema de integração agroindustrial. A unidade experimental

foi o lote de suínos, sendo 10 vacinados (grupo vacinado - GV) e 10 controles (grupo

controle - GC).

Os leitões oriundos do sistema produtor de desmamados foram alojados

aleatoriamente em 16 crechários, 8 deles para o GV e 8 para o GC, 15.655 animais

receberam a vacina via água de bebida. Com idade média de 65 dias e peso médio de

25,07 Kg, os suínos foram transportados para as granjas terminadoras, onde 6.000

animais receberam a vacina via água de bebida. Os animais permaneceram nas granjas

27

terminadoras em média por 110 dias e foram carregados para o abate com idade média

de 175 dias de vida, e peso médio de 125,3 Kg.

3.3.2 Vacinação

Administrou-se via água de bebida 2 mL da vacina Bio Tech Vaccine por animal,

em quatro idades. A primeira dose foi no segundo dia de alojamento do animal na

creche (em média 28 dias de idade), a segunda dose 15 dias após a primeira, a terceira

dose após 30 dias de alojamento na terminação e a quarta dose 21 dias pré-abate.

As vacinas foram conservadas em geladeira com temperatura entre 2 a 8 °C.

Realizou-se restrição hídrica de duas horas para os animais ficarem com sede. A vacina

foi diluída nas caixas d´águas juntamente com um corante azul, sequestrante de cloro,

de nome comercial Proteclor C®. A diluição da vacina seguiu a orientação do fornecedor,

variando conforme o peso dos animais, conforme Anexo II. O fornecimento da vacina

iniciou às 10 h da manhã com consumo médio de 9 horas.

3.3.3 Coleta das amostras

Os animais foram escolhidos de acordo com o programa de alojamento da

agroindústria, não havendo interferência na rotina da logística empresarial em

decorrência do experimento. No terceiro dia após a segunda dose da vacina coletou-se

sangue com anticoagulante (heparina) de 4 animais por crechário e no dia do

alojamento nas terminações realizou-se a coleta de sangue de 30 animais por granja. No

dia do abate os animais foram transportados até o abatedouro por caminhões que

prestavam serviço para a empresa. O lote saiu da propriedade acompanhado de uma

ficha de identificação do experimento. O fluxograma de abate seguiu a seguinte

orientação, nas segundas-feiras foram abatidos dois ou três lotes do GV e nas terças-

feiras foram abatidos dois ou três lotes do GC, sempre no início do abate diário.

No momento da sangria foram coletados sangue de 30 animais por lote. Na linha

de inspeção, as vísceras brancas correspondentes aos animais coletados na sangria,

28

foram identificadas e separadas em um carrinho. Sequencialmente, foram coletados

LNM e porções do colón ascendente de 30 e 20 suínos, respectivamente. A Figura 1

ilustra o fluxograma do delineamento experimental.

3.3.4 Sorologia

Para as análises sorológicas foi usado o kit Herd Check Swine Salmonella Ensaio

de Imunoabsorção Enzimática - ELISA, (IDEXX Laboratories, ME, USA), para a detecção

de IgG anti-Salmonella suina, de acordo com as instruções do fabricante. Os antígenos

de revestimento neste ELISA incluíram o LPS dos sorogrupos B, C1 e D (antígenos O 1, 4,

5, 6, 7 e 12). Os pontos de cortes foram fixados em DO de 10%, 20% e 40%, de acordo

com as recomendações do fabricante e programas de vigilância sorológica (Mousing et

al., 1997; Alban et al., 2002, Kich et al., 2016).

3.3.5 Bacteriologia

Os LNM e fezes foram submetidos ao protocolo de isolamento de Salmonella sp.

seguindo a método qualitativo descrito na ISO 6579: 2002. Os LNM foram previamente

debridados e fragmentados, 25 g da amostra (LNM ou fezes) foi pesado e acrescentado

Figura 1. Fluxograma do delineamento experimental.

29

225 mL APT a 1% e incubados a 37°C por 18 a 24 h. A partir da água peptonada, 0,1 mL

foi transferido para 10 mL do Caldo Rappaport Vassiliadis (RV) e incubado a 42°C e 1 mL

para 9 mL de caldo Tetrationato e incubado a 37 °C, ambos por 24h. Após a incubação,

foi transferida uma alçada de todos os tubos para os meios sólidos ágar Verde Brilhante

e ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) e incubados por 24 a 48 h a 37°C. As colônias com

características de Salmonella sp., foram submetidas a uma triagem bioquímica com os

testes: Ágar Ferro Lisina, Ágar Ferro Tríplice Açúcar e Uréia e aglutinação rápida em

lâmina utilizando soros polivalentes.

3.3.5.1 Quantificação de Salmonella sp. nas fezes

Das amostras positivas no método qualitativo, foi realizada a quantificação de

Salmonella sp. pelo método do número mais provável miniaturizado (mNMP) seguindo

a ISO/TS 6579-2:2012. Foi retirado 1 g de fezes e diluído em 9 mL de APT. Transferiu-se

2,5 mL da solução para o primeiro poço da primeira coluna da microplaca de 12 poços

em triplicata. Em seguida realizaram-se três séries de diluições, passando 500 µL de APT

até o último poço. Incubou-se a 37°C por 24 h. Desta cultura pré-enriquecida transferiu-

se 20 µL para outra placa contendo 2 mL de RV. Após a incubação em estufa a 42°C por

24 h, foram semeados 10 µL do enriquecimento seletivo em placas de ágar XLT4, cada

orifício da placa correspondeu a uma diluição. Após a incubação de 24- 48 h, a 37°C,

colônias compatíveis com Salmonella sp. foram submetidas a triagem bioquímica e

sorológica descrita anteriormente. As interpretações dos resultados foram feitas com

auxílio de tabelas encontradas na literatura (Jarvis et al., 2010).

3.3.6 Citometria de Fluxo

A capacidade fagocítica foi avaliada após a extração das células mononucleares do

sangue periférico (PBMC), procedimento realizado através da separação das células do

sangue em Histopaque (sigma). O sangue total foi diluído 1:1 de água peptonada

tamponada (APT) e adicionado sobre o mesmo volume de Histopaque. Centrifugado a

400 × g por 30 min. A camada de PBMC foi coletada e as células foram contadas. Para

30

106 leucócitos, 1 µl de pHrodo (Invitrogen) foi adicionado. Este conjunto foi incubado a

37o C por 30 min. A quantidade de células que fagocitaram, o reagente e a intensidade

de fagocitose foram medidos em comprimento de onda de 488 nm em citômetro FACS

Calibur (BD) com excitação da fluorescência por laser de argônio.

3.3.7 Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software comercial

Statistical Analysis Sytem© (SAS 9.3: 2012).

Dados de desempenho zootécnico, como idade e peso de abate e alojamento,

foram analisados utilizando o teste F (análise da variância), com comparação de médias

em função dos grupos (vacinado e controle). Esses dados serviram como um controle de

qualidade do experimento.

Os dados médios da densidade ótica (DO) por lote foram analisados por meio da

análise de medidas repetidas. Considerou-se os efeitos dos grupos, período de coleta, a

interação entre os grupos e os três tipos de estruturas de matriz de variâncias e

covariâncias (PROC MIXED). A estrutura usada na análise foi escolhida com base no

menor valor do Critério de Informação de Akaike (AIC). O método de estimação usado

foi o de máxima verossimilhança restrita.

Para a soroprevalência, a distribuição de probabilidades foi considerada binomial

e a análise dos mesmos foi realizada por meio das Equações de Estimação Generalizadas

(GEE). Foram testados os efeitos fixos de grupo, período de coleta e a interação através

dos dois fatores (GENMOD).

O efeito do tratamento sobre o isolamento de Salmonella sp. nas fezes e nos

linfonodos, bem como sua categorização em positivo e negativo, entre os animais

vacinados e controles, foram analisados por teste Qui-quadrado (χ2). Os dados do

mNMP foram transformados em log (y+1). Após o cálculo das médias por lote, os dados

foram analisados por meio da análise da variância.

31

Avaliou-se a associação entre o isolamento de Salmonella sp. nas fezes com a

soroprevalência e com a intensidade da reação sorológica medida pela variabilidade da

densidade ótica (%DO), através de regressão logística.

Para citometria de fluxo foram feitos testes t ou de Mann-Whitney entre os

grupos, e para análise dos gráficos, em todas as amostras apresentadas em conjunto,

usou-se o teste de ANOVA de duas vias

3.4 Resultados

Para harmonizar os grupos de animais utilizados no experimento, comparou-se

peso e idade de alojamento e abate. Não foram observadas diferenças estatísticas para

as variáveis analisadas (p>0,05), conforme Tabela 1, e partindo deste princípio os lotes

do GC foram comparados ao do GV para as demais variáveis.

Tabela 1. Comparação entre das de desempenho zootécnico entre os grupos vacinados

para Salmonella sp. e controle.

Variáveis Grupo Pr>F

Grupo Controle Grupo Vacinado

Idade abate 175,10 ± 0,89 174,90 ± 0,98 0,8816

Idade alojamento 64,70 ± 0,30 65,00 ± 0,00 0,3306

Peso abate 124,02 ± 2,33 126,55 ± 1,76 0,3984

Peso alojamento 24,08 ± 0,89 26,07 ± 1,01 0,1551

Considerando o ponto de corte de 20% de DO (Figura 2), a soroprevalência no

momento do alojamento variou de 15 para 22%, e subiu para 75 até 80% em todos os

lotes. A Figura 2 ilustra a soroconversão em diferentes pontos de corte e para a

densidade ótica média. Entretanto, o efeito de grupo não se mostrou significativo

(p>0,05) em qualquer período de coleta para as duas variáveis.

32

(a) 10% de DO

(b) 20% de DO

(c) 40% de DO

Figura 2. Perfil da soroprevalência em função do grupo e do período de coleta, em diferentes % de DO.

33

Figura 3. Perfil da densidade ótica em função do grupo e do período de coleta.

Os animais pertencentes ao GV apresentaram maior percentual de isolamento nas

duas variáveis avaliadas, excreção do agente nas fezes, e o isolamento do agente nos

LNM no momento do abate.

Na Tabela 2 observa-se que houve efeito significativo de grupo sobre o

isolamento de Salmonella sp.

Tabela 2. Percentagem de amostras de abate positivas para Salmonella sp. nas fezes e

nos LNM e respectivo teste de 2 , para o grupo controle e vacinado.

Variáveis Grupo Pr>2


Isolamento nas fezes 23,62 (47/199) 33,00 (66/200) 0,0367

Isolamento nos LNM 30,00 (90/300) 38,33 (115/300) 0,0314

O método quantitativo, mNMP foi usado para estimar a quantidade de

Salmonella sp. nas amostras positivas no isolamento das fezes. Na Tabela 3 é possível

visualizar os resultados, sendo que houve diferença estatística entre os grupos, e o GV

apresentou um maior percentual de isolamento. O mNMP para Salmonella sp. no GV

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Alojamento Abate

Den

sid

ad

e Ó

tica (

%)

Período de Coleta

GC

GV

34

variou de >0,07 a 0,04 log mNMP/gr, enquanto o GC variou de >0,16 a 0,06 log

mNMP/gr. O teste F da análise da variância detectou efeito significativo (pF


mNMP fezes (Log) 0,07 ± 0,04 0,16 ± 0,06 0,1720

O isolamento de Salmonella sp. nas fezes dos suínos em função da soroprevalência

e da densidade ótica em % mostrou-se positiva e significativa (p≤0,05). Nas Figuras 4 e

5 são apresentados os valores observados do percentual de isolamento de Salmonella

sp. nas fezes dos suínos em função da soroprevalência (% de suínos positivos), e da

intensidade da reação sorológica medida pela variabilidade da densidade ótica (%DO),

respectivamente. Para cada 10 unidades de aumento na soroprevalência (utilizando um

ponto de corte de 40% de DO), espera-se incremento de 30,3% no percentual de

isolamento de Salmonella sp. nas fezes. No caso da densidade ótica média, para cada 10

unidades de aumento estimam-se 15,6% de incremento no percentual de isolamento de

Salmonella sp. nas fezes.

35

Figura 4. Percentual de isolamento de Salmonella sp. nas fezes em função da soroprevalência.

Figura 5. Percentual de isolamento de Salmonella sp. nas fezes em função da densidade ótica média.

36

Através dos resultados da citometria de fluxo foi possível evidenciar que a

atividade dos monócitos fagocíticos foi aumentada pela vacinação nas granjas 1 – 4 (p =

0,012). Embora as granjas 5 – 8 e 9 – 12 tenham apresentado a mesma tendência, isto

não foi estatisticamente relevante. (Figura 6).

Figura 6: Atividade fagocítica dos monócitos e neutrófilos no grupo controle e vacinado.

A intensidade da fagocitose dos monócitos fagocíticos foi alterada pela vacinação. As figuras superiores indicam a quantidade relativa de monócitos e a sua atividade. As figuras inferiores indicam a quantidade relativa de neutrófilos e a sua atividade. Análise conjunta de todas as granjas feita por ANOVA de duas vias. Diferença relevante está indicada por descrição ao lado do gráfico.

37

3.5 Discussão

No presente estudo a vacinação foi realizada no período de creche e

terminação, com uma das doses ministrada aos 21 dias pré-abate. A pesquisa teve como

objetivo o uso de uma vacina que oferecesse uma ação sanitária contra a infecção

natural, reduzindo o número de suínos portadores e excretores de Salmonella sp. que

chegam ao frigorífico e que podem alcançar o consumidor final.

A proposta foi testar uma vacina que se mostrasse efetiva no controle contra

qualquer sorovar de Salmonella enterica (amplo espectro) presente em granjas de

terminação de suínos. O resultado esperado era transpor a dificuldade posta pela

variabilidade de sorovares em decorrência da especificidade antigênica do agente

(Schwarz et al., 2011; Costa., 2014).

A Salmonella sp possui na sua superfície grandes moléculas antigênicas

(moléculas imunedominantes), os LPS de membrana, que são facilmente reconhecidos

pelo sistema imune, e são alvo da maioria das vacinas de linhas. Essas moléculas tendem

a ser específicas de um determinado sorovar e/ou sorogrupo (Arguello et al., 2012b).

Porém todos os patógenos possuem moléculas de superfície secundárias, que podem

ser apresentadas ao sistema imune de tal forma que ele consiga responder, tornando-

as imunoprotetoras (Layton & Jabif, 2017). Sendo assim, uma sequência genética

comum para todas as salmonelas foi clonada em um plasmídeo de expressão, e este

inserido em Bacillus subtilis, o qual produziu subunidades (peptídeos) que foram

incorporadas por micropartículas, compondo a vacina de mucosa.

No presente estudo, a vacina de subunidade foi administrada via oral, com o

intuito de gerar uma resposta imune de mucosa com produção de IgA (Haesebrouck et

al., 2004; Roesler et al., 2006) e estímulo de tecido linfóide associado ao intestino–GALT

(Ogra et al., 2001). Após a administração do produto, foi determinado a porcentagem

de soropositivos, portadores e excretores de salmonelas nos LNM e fezes como

respostas à vacinação. O suíno portador da Salmonella sp. no linfonodo tem uma grande

importância epidemiológica, porque a partir deste status a excreção da bactéria pode

38

recrudescer após situações de estresse na granja e pré-abate. Ele é a fonte primária do

agente no abatedouro, contaminando o ambiente, equipamentos e carcaças (EFSA,

2008). Desta forma, em lotes de suínos positivos, os animais são quatro vezes mais

susceptíveis a (re) infecção com Salmonella sp. a partir de outros indivíduos do rebanho

do que a partir de outros rebanhos (Berends et al., 1997).

Na mesma linha, Kich et al. (2011) demonstraram que linfonodos mais profundos

estavam albergando os mesmos subtipos de Salmonella sp. presentes nas granjas,

denotando a importância do status suíno portador. Já as carcaças apresentaram

subtipos relacionados com aqueles encontrados na baia de espera, afirmando a

importância do suíno excretor de Salmonella sp. imediatamente antes do abate.

Inúmeros trabalhos já mostraram que existe uma forte correlação entre os

animais excretores de Salmonella sp. nas fezes e carcaças positivas, reflexo de uma

combinação de fatores. A Salmonella sp. que entra no abatedouro é transferida para

carcaça do animal de origem (extravasamento do conteúdo intestinal/evisceração) e

promove a contaminação cruzada entre as carcaças por contato direto e indireto

(Berends et al., 1997). Corroborando com isso, Coldebella et al. (2017), em pesquisa

adstrita ao Ministério da Agricultura, baseados em um banco de dados de três anos de

suínos inspecionados pelo SIF (Serviço de Inspeção Federal), em 114 plantas frigoríficas

(94,262,328 suínos abatidos), mostraram que a segunda maior causa de condenações

de carcaças no Brasil é por contaminação no momento da evisceração. (1,797%). Diante

disto, além de mitigar o risco de contaminação durante o abate, intervenções nas

granjas são fortemente estimuladas para diminuir o número de animais portadores e

excretores de Salmonella sp. que chegam ao frigorifico (Letellier et al., 2009).

Nesta pesquisa, o GV apresentou mais frequência de detecção de Salmonella sp.

do que o GC, com diferença de 8,33% de portadores de Salmonella sp. nos LNM, 9,38%

de suínos excretores e 0,09 log no mNMP de unidade formadoras de colônia nas fezes,

no momento do abate.

39

Além do efeito da vacinação sobre portadores e excretores de Salmonella sp. o

presente estudo realizou a avaliação imunológica dos suínos frente a vacina Bio Tech

Vaccine. É sabido que a destruição dos microrganismos fagocitados por macrófagos se

deve à produção de óxido nítrico (NO) e outros intermediários, os quais são produzidos

devido à ativação via clássica (Th1) dos macrófagos através de IFN-γ ou LPS (Classen,

Lloberas, & Celada, 2009). Entretanto, para bactérias intracelulares, como a Salmonella

sp., a ingestão destas por macrófagos pode fornecer um refúgio seguro, protegendo as

bactérias da morte extracelular mediada pelo complemento. Eze et al. (2000)

demonstraram que a cepa virulenta 16M de Brucella Melitensis foi eficientemente

fagocitada por macrófagos peritoniais de camundongos na presença de soro hiperimune

anti-LPS de B. Melintenis. Contudo, uma vez internalizada, a bactéria se multiplicou

eficientemente em macrófagos não-ativados, sendo que sua eliminação só ocorreu

quando foi induzida a ativação dos macrófagos por IFN-γ.

Neste estudo, ao se avaliar todas as granjas conjuntamente, foi encontrado

aumento na atividade fagocítica de monócitos periféricos em animais vacinados. Porém,

os dados não permitem inferir se este aumento da atividade fagocítica resultou na

eliminação efetiva das cepas de campo pelos macrófagos, ou se estas células

potencializaram a multiplicação do patógeno servindo como sítio de replicação. Os

resultados de isolamento nas fezes, isolamento nos LNM e nNMP apontam para a

segunda hipótese, uma vez que o percentual de detecção de Salmonella sp. foi maior no

grupo vacinado que no controle.

A pesquisa de anticorpos, realizadas por meio do teste de ELISA, foi usado como

indicador de uma exposição prévia a Salmonella sp. Considerando 20% de DO como

ponto de corte, no alojamento a soroprevalência foi baixa, variando de 15 a 22%, e no

momento do abate subiu para 75 e 80%, o que confirma que nesta fase da produção

ocorre a disseminação da bactéria entre os animais e, consequentemente, a

amplificação da infecção. Estudos anteriores constataram a mesma situação, de que os

suínos são infectados em algum momento durante o período de terminação (Berends

40

et al., 1996; Beloeil et al., 2003; Kranker et al., 2003). Segundo Nielsen et al. (1995) a

soroconversão para Salmonella sp. pode ocorrer de 7 a 14 dias após a infecção e o pico

em aproximadamente 30 dias, quando em condições experimentais. No caso de

infecção natural um período maior pode ser esperado (Kranker et al., 2003). Como o

período de crescimento e terminação dura em média 110 dias, os animais têm

oportunidade de se infectarem e soroconverterem elevando a soroprevelência na fase

final de produção.

Por ser um indicador da disseminação da bactéria no rebanho, a sorologia tem

sido utilizada como indicador de risco em o lote de animais introduzir a bactéria no

ambiente de abate. Ela possibilita a discriminação entre os rebanhos de forma concisa,

rápida e barata. Desta forma, muitos países adotaram-na como uma ferramenta útil

para discriminar lotes suínos infectados por Salmonella sp. Porém o uso da sorologia

para classificação de risco de um rebanho tem sido discutido (Rostagno & Callaway.,

2012) no intuito de se estabelecer ferramentas exequíveis de predição de risco de

contaminação ao abate. Devido possibilidade de alguns animais eliminarem a infecção

e permanecerem soropositivos, ou mesmo, serem infectarem no pré-abate e negativos

na sorologia, ela é limitada para determinar o estado de infecção do indivíduo, mas é

útil para determinar o nível de infecção no rebanho (Vico et al., 2011).

Países como, Alemanha e Dinamarca iniciaram seu programa nacional de

controle da Salmonella sp. utilizando 40% de DO (Mousing et al., 1997; Blaha., 2004), a

qual é adotado pelos kits comerciais de ELISA para a interpretação qualitativa dos

resultados. A associação entre a condição do suíno, quanto ao status sorológico,

portador e excretor de Salmonella sp. já demonstrou uma forte associação com risco de

isolamento do agente no momento do abate (Nielsen et al., 1995., Alban et al., 2002),

no passado, alguns estudos demonstraram que a melhor associação seria em um ponto

de corte em torno de 11% de DO (Nielsen et al., 1995). Contudo, Alban et al. (2002) e

Kich et al. (2016) demostraram que 20% é o melhor modelo para predizer a frequência

de isolamento de Salmonella sp. em lotes de suínos. Soresen et al. (2004)

41

demonstraram forte associação entre sorologia do rebanho e a prevalência de

Salmonella encontrada no conteúdo cecal. A chance para isolamento positivo aumentou

1,3 vezes para cada 10% de aumento da soroprevalência.

Mainar-Jaime et al. (2017), associaram valores de intensidade da reação

sorológica medida pela variabilidade da densidade ótica, a %DO com a % de excretores

de Salmonella sp., em diferentes idades na terminação. Suínos com 90 dias possuem

66% de chance de excretaram Salmonella sp. quando chegam ao abate, com uma %

DO=40. Quando se analisa os dados deste experimento, para cada 10% de aumento na

% de DO estimam-se 15,6% de incremento no percentual de isolamento de Salmonella

sp. nas fezes em animais no momento do abate (110 dias de terminação).

Na Dinamarca, granjas de terminação com ≤ 200 suínos de abate por ano,

utilizando 20% de DO, foram classificadas em três categorias: nível 1, definido como um

rebanho com um índice sorológico de Salmonella sp. variando de 1 < 40%; nível 2,

40

42

Este fato foi demostrado neste trabalho, onde um incremento de 10% na

soroprevalência aumentou em 30% a possibilidade de excreção de Salmonella sp. nas

fezes.

3.6 Conclusão

Concluiu-se que o programa de vacinação na creche e terminação com a vacina

de subunidade oral não conferiu redução na disseminação e amplificação da infecção

nas granjas que impactasse na prevalência de suínos portadores e excretores de

Salmonella sp. no abate. Esses resultados nos permitem afirmar que a forma de

apresentação do antígeno na vacina, ainda não foi suficiente para estimular imunidade

que pudesse segurar o desafio de campo.

43

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O Brasil está discutindo e finalizando um programa de autocontrole com

verificação oficial de salmonela em carcaças suínas a ser estabelecido nos abates que

possuem inspeção federal. Esta proposta foi recentemente apresentada ao setor e vai

estimular as agroindústrias a desenvolverem estratégias sistêmicas de controle de

salmonela, que em algum momento também devem ser orientadas para a fase de

criação dos animais nas granjas. Atualmente, se houvesse uma classificação de rebanho

usando a soroprevalência (Alban et al., 2002), os lotes de suínos terminados no Brasil

estariam em média no Nível 3, ≥ 65% de prevalência com OD de 20% (EFSA 2009), o que

representa risco alto de introduzir a contaminação no ambiente de abate. Neste

experimento, houve um incremento de aproximadamente 60% nos resultados de

soroprevalência do alojamento ao abate, considerando 20% de DO como ponto de

corte, ficaram entre 75 e 80%, o que confirma na fase de terminação ocorre a

disseminação da bactéria entre os animais e, consequentemente, a amplificação da

infecção, a exemplo de outras pesquisas já realizadas no Brasil (Kich et al., 2005; Silva et

al., 2006; Schwarz et al., 2009; Kich et al., 2011; Costa et al., 2014).

Apesar do GV apresentar um aumento de 8,33% de suínos portadores de

Salmonella sp. nos LNM, 9,38% de suínos excretores e 0,09 log no mNMP de unidade

formadoras de colônia nas fezes, no momento do abate, é preciso investir em potenciais

práticas de biotecnologias que superem os limites dos produtos oferecidos pelo

mercado e surjam como alternativa para controle de patógenos transmitidos por

alimentos.

A vacinação, do ponto de vista de segurança dos alimentos, pode e deve ser

usada na fase primária de produção. Entretanto, para isso, é preciso garantir robustez

nos resultados, a qual está intimamente atrelada a especificidade antigênica e via de

administração do produto. Quando houver esse progresso nas tecnologias ofertadas,

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será de grande valia a implementação da vacinação como uma ferramenta de redução

do patógeno e proteção ao consumidor.

Para dar sequência ao trabalho, sugere-se medir o título vacinal (IgA) através da

secreção lacrimal dos suínos pertencentes aos grupos vacinado e controle e a

sorotipificação das cepas isoladas. É comum a presença de vários sorovares em uma

mesma planta frigorifica e, também, há uma grande variação entre eles em diferentes

plantas (Botteldoorn et al., 2003; EFSA, 2008).

Além disso, pode-se realizar coleta de amostras nas granjas, ração, caminhões,

baias de esperas, bem como nas carcaças no abatedouro, para que se determinem os

sorovares mais prevalentes e se realize estudos de epidemiologia molecular

correlacionando os isolados. Estes resultados ajudam a agroindústria definir estratégias

de controle direcionadas as diferentes etapas da produção e, se possível, corrigir falhas

de processo reveladas com estes estudos.

45

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6 ANEXOS

6.1 Anexo I

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6.2 Anexo II

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