IntroduoProcessos Bioqumicos So processos que utilizam reaes bioqumicas ou biomolculas no preparo de produtos de interesse econmico. Atualmente utilizado o conceito de biotecnologia, considerado mais amplo.Biotecnologia Segundo a Federao Europia de Biotecnologia a biotecnologia uma cincia interdisciplinar, que faz uso integrado da bioqumica, microbiologia e engenharia qumica para atingir a aplicao tecnolgica das capacidades

Essa definio interessante, porem no engloba outros aspectos da biotecnologia, como a agronomia, medicina e meio ambiente/ecologia. No curso ser discutido o uso da biotecnologia para a obteno de substncias qumicas, produtos farmacuticas e alimentos. Na tabela abaixo so mostrados alguns produtos obtidos por biotecnologia. Esses produtos podem ser metabolitos dos microorganismos/clulas ou produtos de biotransformao por -os.Nos produtos qumicos e farmacuticos pode haver uma concorrncia entre processos qumicos/biotecnologicos, como na produo de etanol.Na vitamina A era utilizado um processo biotecnologico, que foi substituido por processo qumico e atualmente h a tendencia a utilizar um novo processo biotecnologico.

Qumicos Farmacuticos Alimentos Solventes AntibiticosBebidas Alcolicascidos orgnicosVitaminasLaticniosPolmeros VacinaVinagresDetergentes HormniosInseticidas

Microorganismos(-os) de uso industrialTradicionalmente -os so utilizados pela industria de biotecnologia.Bactrias So -os procariontes, ou seja, entre outras caractersticas no apresentam uma membrana separando o ncleo do material citoplasmtico. Seu tamanho celular pequeno (mx. 10mm), levando a uma tima relao rea volume, facilitando as trocas com o meio e tornando seu metabolismo de um modo geral muito acelerado. Apresentam parede celular e membrana plasmtica. Bactrias se dividem por cissiparidade, no ocorrendo diviso sexual. Para compensar essa desvantagem, as bactrias podem trocar informao gentica umas com as outras utilizando plasmideos, que so fragmentos de DNA circular.

Morfologia Bacteriana(1) cocos, ou bactrias esfricas. Os cocos podem se organizar como (2) diplocos (5) sarcinas (6) estafilococos (7) estreptococos. Cocos que no apresentam um formato perfeitamente esfrico so (3) gonococos (4) Pneumococos (8) bacilos ou bactrias cilndricas (9) vibrios (10) e (11) espirilos.

Colorao de gramColorao de Gram uma tcnica de colorao para diferenciao de microorganismos atravs das cores, para serem observados em microscpio ptico. A tcnica recebeu este nome em homenagem ao mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram.Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactrias, aps serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas. Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A tcnica de Gram fundamental para a taxonomia e identificao das bactrias, sendo muito utilizada atualmente, como tcnica de rotina em laboratrios de bacteriologia.

Parede Celular

Principais doenas causadas por bactrias Tuberculose: causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis.Hansenase (lepra): transmitida pelo bacilo de Hansen (Mycobacterium lepra).Difteria: provocada pelo bacilo diftrico.Coqueluche: causada pela bactria Bordetella pertussis.Pneumonia bacteriana: provocada pela bactria Streptococcus pneumoniae.Escarlatina: provocada pelo Streptococcus pyogenes.Ttano: causado pelo bacilo do ttano (Clostridium tetani).Leptospirose: causada pela Leptospira interrogans.Tracoma: provocada pela Chlamydia trachomatis.Gonorria ou blenorragia: causada por uma bactria, o gonococo (Neisseria gonorrhoeae).Sfilis: provocada pela bactria Treponema pallidum.Meningite meningoccica: causada por uma bactria chamada de meningococo.Clera: doena causada pela bactria Vibrio cholerae , o vibrio colrico.Febre tifide: causada pela Salmonella typhi.

FungosFungos So microorganismos eucariontes (ncleo separado por membrana). Seu tamanho maior que as bactrias (min. 10mm), tendo um metabolismo mais lento devido a menor relao rea/volume. Apresentam parede celular e membrana citoplasmatica. No microscpio h uma grande diversidade de formas. Fungos: vegetais ou animais?Em 1969 passaram a ser classificados no Reino FungiEstima-se que existam mais de 1,5milhes de espciesImprtancia nas diversas reas

Classificao do ponto de vista macroscpico:Bolores Formam os chamados miclios, no crescendo em meio liquidoLeveduras So fungos que crescem bem em meio liquido, ou seja, submersos.Os fungos podem se reproduzir utilizando reproduo assexuada como as bactrias ou reproduo sexuada, passando por clulas com metade do material gentico original.Fungos e bactrias so de um modo geral bastante flexveis quanto aos seus aspectos nutricionais, podendo se adaptar a uma grande variedade de fontes de alimento. Porm no so autotrficos, ou seja, no conseguem aproveitar a energia da luz do sol como plantas e algas.

BoloresSo fungos multicelulares, filamentosos, constitudos por hifas (miclio) Hifas cenocticas ou septadas, com espessura varivel (2 a 15 m) Hifa vegetativa e hifa reprodutiva Hifas hialinas e hifas escuras Hifa em raquete, nodular ou em espiral

Hifas - Bolores

LevedurasSo fungos unicelulares, arredondados ou ovais, com dimetro entre 3 e 10 m

As leveduras se apresentam como clulas isoladas e algumas podem formar pseudo-hifas A prpria clula desempenha as funes vegetativas e reprodutivas

CogumelosPodem ser:ComestveisTxicosMedicinaisAlucingenosnome comum dado s frutificaes de alguns fungos,pertencentes ao Reino Fungi. Possuem corpo frutfero composto por uma base.

Importncia dos Fungos

Outros microrganismosClulas de mamferos Fora os fungos e bactrias, podem ser utilizadas em processos industrias. So utilizadas linhagens de clulas que conseguem viver e se reproduzir bem fora do seu organismo original. So muito maiores (atingem at 100mm) e mais exigentes que os m-os do ponto de vista nutricional, apresentando um metabolismo mais lento. So utilizadas na produo de vrus e na produo de protenas que no podem ser produzidas por outros meios.

Vrus So as formas vivas mais simples. Como sua bioqumica muito limitada sempre tem que se reproduzir utilizando uma clula hospedeira. Tem muita importncia em medicina, veterinria e agronomia. Industrialmente so produzidos para a preparao de vacinas e kits para diagnstico clinico.

Algas e protozorios So utilizados em processos muito especficos.

Seleo de microrganismosOs microrganismos so selecionados tradicionalmente a partir de fontes naturais. Nessa fonte (solo, por exemplo), o m-o de interesse se encontra contaminado com outras espcies. Para isola-lo so necessrios procedimentos especficos.Mtodo de diluies : nesse mtodo a mistura de m-os diluda de forma seqencial, diminuindo a concentrao de m-os presentes. Essas diluies so inoculadas em meio slido. Cada nova colnia formada em meio slido tende a se apresentar como uma espcie isolada. Meios de cultura Como ser visto mais a frente, os m-os apresentam exigncias nutricionais diferentes. Utilizando-se meios de crescimento seletivos, pode-se enriquecer o material no microorganismo de interesse.Uso de inibidores Como ser discutido mais adiante, determinadas substncias qumicas podem inibir seletivamente o crescimento de microorganismos, diminuindo a contaminao por inibir algumas espcies presentes no meio.

Melhoramento de -osComo j foi dito, os primeiros m-os foram isolados de fontes naturais. Os rendimentos de produtos obtidos, porm era baixo. Logo foi determinado que um dos fatores que limitava o rendimento era o prprio m-o . Por isso foram desenvolvidas tcnicas para preparar linhagens mais produtivas do m-o.Como j foi dito, fungos podem se reproduzir de forma sexuada. Uma forma de obter linhagens mais produtivas foi cruzar linhagens que apresentavam caractersticas desejadas, para obter uma nova linhagem que englobasse as duas caractersticas. Por exemplo, cruzar uma linhagem que cresce rpido, mais com baixo rendimento, com uma de crescimento mais lento, mais com bom rendimento de produto.A principal tcnica para produzir m-os mais produtivos foi a induo de mutaes. As mutaes na verdade so mudanas na estrutura do DNA induzida por agentes fsicos e qumicos. Seguem a lgica mostrada na prxima folha.

A mutao um processo que ocorre naturalmente. Em processos de seleo foram utilizados agentes que apenas induziram que essas mutaes ocorressem de forma mais rpida. Esses agentes provocam leses na estrutura qumica do DNA. As clulas tem enzimas que so especializadas em reparar essas leses, s que no processo de reparo podem ocorrer erros nas seqncias de bases nitrogenadas, levando a produo de protenas mutantes

Exemplos de algumas leses qumicas que podem ser utilizadas para induzir mutaes. A deaminao conseguida utilizando-se nitritos, que em meio fisiolgico esto em equilbrio com o cido nitroso. Vrios reagentes eletrofilicos podem ser utilizados, como o iodometano e as mostardas nitrogenadas. As radiaes so Ultra violetas e raio X.A mutao foi utilizada com xito para desenvolver cepas altamente produtivas de antibiticos e vitaminas, entre outros. Apesar desses sucessos, o processo apresenta vrios inconvenientes. No h controle sobre as mutaes, sendo que a maioria dos mutantes no vivel. Por esse motivo, o custo elevado, o tempo longo e a principio no h uma garantia de sucesso.

Manipulao gentica de -os O uso de tcnicas de mutao no desenvolvimento de m-os mais produtivos comeou em torno de 1940. No final da dcada de 1960 o conhecimento acumulado de gentica microbiano foi ajudado pela descoberta de enzimas que podiam manipular de forma controlada o DNA, iniciando a era da engenharia gentica.O fundamento dessa tcnica o uso dos plamideos, fragmentos de DNA circular que as bactrias podem trocar umas com as outras. Esses fragmentos podem ser abertos com enzimas seletivamente, e novos fragmentos de DNA contendo genes para a preparao de protenas de interesse. O esquema abaixo mostra de forma resumida como feito o processo.

O plasmideo codifica vrios genes, como o gene A. Utilizando-se enzimas o plamideo pode ser aberto, um novo gene B introduzido e o plasmideo pode ser fechado e inserido na bactria. A bactria ir produzir a protena codificada em B, que pode ser o produto de interesse. Outra possibilidade que a protena seja uma enzima que ir produzir um metabolito que o produto de interesse. Plasmdeos so molculas de DNA extra cromossomais que podem ser passados de bactria bactria, carregando consigo informaes genticas (e at mesmo novos genes). Essas molculas extra cromossmicas podem ter um baixo ou alto peso molecular, fator este que ir determinar o nmero total de cpias que podem ser feitas a partir de um nico plasmdeo. Esta relao inversamente proporcional, ou seja, quanto maior o peso molecular menor o nmero de cpias a serem feitas. Existem alguns tipos de plasmdeos: Plasmdeos

A caracterizao de um microorganismo purificado e selecionado importante para demonstrar que no ocorreu uma contaminao do microorganismo por outra espcie e o m-o selecionado manteve sua caractersticas. Pode ser feita de vrias maneiras.Provas bioqumicas : Utilizando-se alguns testes que so sensveis ao metabolismo do m-o, pode-se verificar se a cepa escolhida ou no. O inconveniente destes mtodos o tempo demorado para a obteno de resposta. Morfologia/cor das colnias em meio slidoTestes Imunoqumicos : Quando inoculados em animais, m-os estimulam a produo de protenas especificas pelo sistema imunolgico. Essas protenas so chamadas de anticorpos e reconhecem seletivamente o m-o que foi inoculado. Desta forma existem anticorpos comerciais que reconhecem determinados m-os, e produzem reao colorida na presena deles. Laboratrios tambm podem preparar seus prprios anticorpos, precisando ter animais disponveis. Esses mtodos so rpidos, sensveis e seletivos. O grande inconveniente que os reagentes so caros.Anlise de Protenas totais : Uma das caractersticas de uma cepa de m-o o perfil eletrofortico de protenas celulares totais. Se a cepa permaneceu estvel, esse perfil no varia. A estabilidade pode ser determinada comparando o perfil da cepa em anlise com uma cepa de referncia.Anlise de isoenzimas: Teste semelhante a analise de protenas totais, s que na eletroforese se utiliza um reagente que desenvolve cor somente na presena de determinada enzima. O perfil eletrofortico de uma cepa dessa forma um marcador de sua identidade. Tem uma sensibilidade maior que o anterior. Anlise gentica: O DNA do microorganismo pode ser analisado por eletroforese aps extrao e fragmentao com enzimas. O perfil eletrofortico deve ser o mesmo de uma cepa de referncia.Caracterizao de -os

Armazenagem de -osOs m-os podem ser mantidos de duas formas principaisRepiques sucessivos : Por esse mtodo o m-o transferido de um meio de crescimento para outro, aps um intervalo de tempo. Esse mtodo antigo e tem vrias desvantagens. Durante a manipulao h sempre o risco de contaminao. O m-o pode sofrer mutaes ao longo do tempo.Liofilizao : Nesse mtodo uma amostra de m-o congelada a gua presente removida por vcuo molecular. desta forma uma secagem frio. A remoo do excesso de gua e a reduo de temperatura contribuem para estabilizar o m-o, podendo esse ser guardado por longo tempo em meio refrigerado, como freezer e nitrognio lquido.

Fornecimento de -os de referenciaATCC American Type Culture CollectionMaior coleo de m-os do mundo. Fornece cepas de referencia.Fora a ATCC as empresas multinacionais mantm suas prprias colees, com cepas geneticamente manipuladas de alta produtividade. O acesso a essas cepas restrito por razes de segurana industrial. INCQS FiocruzFornece cepas de referncia no Brasil.