ITA02003_-_poligrafo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CINCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ITA02003 BIOENGENHARIA PARA ENGENHARIA QUMICA - POLGRAFO -

Profa Rosane Rech

ITA02003 Bioengenharia para Engenharia Qumica Semestre 2010/1

Profa. Rosane Rech 2

ndice

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3 4

5 6 7 8

Introduo Engenharia de Bioprocessos ................................................................................................................. 7 1.1 Definies ......................................................................................................................................................... 7 1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos .............................................................................................. 7 1.3 Produtos provenientes de processos biotecnolgicos....................................................................................... 9 1.3.1 Enzimas .................................................................................................................................................... 9 1.3.2 cidos Orgnicos ..................................................................................................................................... 9 1.3.3 Aminocidos............................................................................................................................................. 9 1.3.4 Vitaminas................................................................................................................................................ 10 1.3.5 Biopolmeros .......................................................................................................................................... 10 1.3.6 Solventes ................................................................................................................................................ 10 1.3.7 Bebidas Alcolicas ................................................................................................................................. 10 1.3.8 Alimentos ............................................................................................................................................... 10 1.3.9 Microrganismos...................................................................................................................................... 10 1.3.10 Antibiticos ............................................................................................................................................ 11 1.3.11 Protenas reguladoras do metabolismo ................................................................................................... 11 1.3.12 Transformao de esterides .................................................................................................................. 11 1.3.13 Vacinas ................................................................................................................................................... 11 1.3.14 Controle Biolgico de Pragas................................................................................................................. 11 1.3.15 Lixiviao Bacteriana de Minrios......................................................................................................... 12 1.4 A Biotecnologia no Brasil............................................................................................................................... 12 1.5 Tendncias ...................................................................................................................................................... 12 1.6 Processos fermentativos industriais ................................................................................................................ 14 Microbiologia........................................................................................................................................................... 16 2.1 Distribuio dos organismos vivos ................................................................................................................. 16 2.2 Morfologia e estrutura..................................................................................................................................... 17 2.2.1 Bactrias (procariotos) ........................................................................................................................... 17 2.2.2 Fungos .................................................................................................................................................... 18 2.3 Nutrio microbiana........................................................................................................................................ 19 2.3.1 Consideraes gerais .............................................................................................................................. 19 2.3.2 Requisitos Nutricionais .......................................................................................................................... 19 2.4 Fatores fsico-qumicos ................................................................................................................................... 21 2.4.1 Temperatura............................................................................................................................................ 21 2.4.2 pH ........................................................................................................................................................... 22 2.4.3 Presso Osmtica ................................................................................................................................... 22 2.5 Meios de Cultura ............................................................................................................................................. 22 2.6 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial ........................................................................ 23 Biorreatores e Processos Fermentativos .................................................................................................................. 24 3.1 Classificao dos biorreatores......................................................................................................................... 24 3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo: ....................................................................................... 25 Cultivo Descontnuo ................................................................................................................................................ 26 4.1 Inculo ............................................................................................................................................................ 26 4.2 Meio de cultura ............................................................................................................................................... 26 4.3 Cintica de um cultivo em batelada ................................................................................................................ 27 4.3.1 Cintica de crescimento celular.............................................................................................................. 28 4.3.2 Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento................................................. 28 4.3.3 Cintica de formao de produto............................................................................................................ 31 4.3.4 Cintica de consumo de substrato pela clula ........................................................................................ 31 Cultivo Contnuo...................................................................................................................................................... 33 5.1 Formas de operao do sistema contnuo........................................................................................................ 33 Cultivo Semi-contnuo ............................................................................................................................................. 35 6.1 Produtividade de um processo semi-contnuo................................................................................................. 35 Cultivo em Regime Batelada Alimentada................................................................................................................ 36 Reatores com clulas imobilizadas .......................................................................................................................... 39 8.1 Mtodos de imobilizao celular..................................................................................................................... 39 8.1.1 Imobilizao sobre a superfcie de um suporte slido............................................................................ 39



8.1.2 Envolvimento em uma matriz porosa:.................................................................................................... 40 8.1.3 Floculao celular (agregao)............................................................................................................... 41 8.1.4 Conteno mecnica atrs de uma barreira ............................................................................................ 41 8.2 Caractersticas e vantagens da imobilizao celular ....................................................................................... 41 8.3 Exemplos de usos de clulas imobilizadas...................................................................................................... 42 9 Biorreatores com membranas................................................................................................................................... 45 10 Cultivo Semi-Slido ............................................................................................................................................ 48 10.1 Microrganismos normalmente utilizados: ....................................................................................................... 48 10.2 Substratos: caractersticas e composio:........................................................................................................ 48 10.3 Biorreatores para CSS ..................................................................................................................................... 49 10.4 Controle de processo em CSS ......................................................................................................................... 50 10.4.1 Teor de umidade..................................................................................................................................... 50 10.4.2 Atividade de gua:.................................................................................................................................. 50 10.4.3 Temperatura............................................................................................................................................ 50 10.4.4 pH ........................................................................................................................................................... 51 10.4.5 Aerao: ................................................................................................................................................. 51 10.4.6 Agitao ................................................................................................................................................. 52 10.4.7 Estimativa de crescimento ...................................................................................................................... 52 10.4.8 Extrao dos produtos ............................................................................................................................ 52 11 Agitao e aerao em biorreatores..................................................................................................................... 53 11.1 Transferncia de oxignio da bolha de gs para a clula ................................................................................ 53 11.2 Mtodo dinmico para o clculo do kLa......................................................................................................... 54 11.3 Respirao microbiana .................................................................................................................................... 55 11.4 Anlise conjunta da transferncia e do consumo do oxignio ........................................................................ 56 11.5 Sistemas para a transferncia de oxignio....................................................................................................... 58 11.6 Transferncia de oxignio em meios agitados e aerados................................................................................. 58 11.6.1 Agitao de lquidos newtonianos.......................................................................................................... 58 11.6.2 Agitao de lquidos newtonianos submetidos aerao....................................................................... 61 11.6.3 Transferncia de oxignio ...................................................................................................................... 61 12 Escalonamento de biorreatores............................................................................................................................ 63 12.1 Critrios para ampliao de escala .................................................................................................................. 63 12.1.1 Constncia da potncia por unidade de volume do meio (P/V).............................................................. 63 12.1.2 Constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa)............................................ 64 12.1.3 Constncia da velocidade na extremidade do impelidor (vimp) ............................................................... 65 12.1.4 Constncia do tempo de mistura (tm) ...................................................................................................... 65 12.1.5 Constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V) .......................................................... 66 12.1.6 Constncia do Nmero de Reynolds ...................................................................................................... 66 12.1.7 Critrios ou regras de aerao ................................................................................................................ 67 12.2 Comparaes entre os critrios de ampliao de escala .................................................................................. 68 13 Esterilizao ........................................................................................................................................................ 69 13.1 Modos de atuao dos agentes esterilizantes .................................................................................................. 69 13.2 Esterilizao de equipamentos e meios de cultivo por calor mido................................................................ 71 13.2.1 Cintica de morte celular........................................................................................................................ 71 13.2.2 Esterilizao em batelada de meios de cultivo ....................................................................................... 71 13.2.3 Esterilizao contnua de meios de cultivo............................................................................................. 73 14 Referncias Bibliogrficas................................................................................................................................... 75 14.1 Livros .............................................................................................................................................................. 75 14.2 Artigos Cientficos .......................................................................................................................................... 75 14.3 Bibliografia complementar.............................................................................................................................. 76



Lista de Figuras

Figura 1.1: Multidisciplinaridade da Biotecnologia.......................................................................................................... 8 Figura 1.2: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997). ............................................... 14 Figura 1.3: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001) .................................................. 15 Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de R. H. Wittaker em 1969 (Fonte: Borzani et al., 2001). ....................................................................................................................................................................... 16 Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et al., 2001). ................................................................................................................................................................................. 16 Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997). ..................................................... 17 Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias. ........................................................................................................................ 18 Figura 2.5: Esquema de clula eucaritica animal (Fonte: http://people.eku.edu/ritchisong/cell1.gif em 01/08/08). .... 18 Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento. ................................... 21 Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula........................................................... 21 Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) recirculao de meio com leito fluidizado. ................................................................................................................................................................ 25 Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001)..................................... 27 Figura 4.2: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995). ................................................................. 28 Figura 4.3: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1 (Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B). ........................................................................................................................................ 29 Figura 4.4: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de Monod para mx = 0,14 h-1. ................................................................................................................................................. 30 Figura 5.1: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L....................................................................................................................................................... 33 Figura 5.2: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai diretamente do biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1. ............................................................................................................. 34 Figura 6.1: influncia de sobre a produtividade de um processo semi-contnuo (Fonte: Schmidell et al., 2001). ...... 35 Figura 7.1: Grficos da variao da vazo de alimentao, F, e da velocidade especfica de crescimento, , em cultivos em regime batelada-alimentada com vazo de alimentao constante, linear crescente e exponencial................... 37 Figura 7.2: Biomassa e produo de ergosterol para diferentes mtodos de controle de alimentao em cultivos batelada alimentada (Fonte: Gao & Tan, 2003)....................................................................................................... 37 Figura 7.3: Cultivo batelada-alimentada com alimentao exponencial combinada com pH-stat de Escherichia coli K12 com velocidade especfica de crescimento controladas em 0,1h-1 (esquerda) e 0,3h-1 (direita) (Fonte: Kim et al., 2004).................................................................................................................................................................. 38 Figura 8.1: Desenho esquemtico dos mtodos bsicos de imobilizao celular (Fonte: Kourkoutas et al., 2004). ..... 40 Figura 8.2: Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca++ e K+................................. 41 Figura 8.3: Produo de lipase com clulas imobilizadas e clulas livres (Fonte: Ellaiah et al., 2004). ........................ 42 Figura 8.4: Cintica de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ................................................................................................... 42 Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio (b) Produtividade de um cultivo contnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus coimobilizadas em alginato de sdio em biorreator PBR com 60mL de volume de trabalho (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ................................................................................................................................................ 43 Figura 8.6: Biomassa e atividade de bacteriocina em um biorreator contnuo com clulas livres (Fonte: Bhugaloo-Vial et al., 1997). ............................................................................................................................................................. 43 Figura 8.7: Produtividade de bacteriocina com a taxa de diluio (a) em um biorreator contnuo com clulas livres e (b) em biorreator contnuo PBR com clulas imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Bhugaloo-Vial et al., 1997). ....................................................................................................................................................................... 43 Figura 8.8: Produo de etanol, evoluo de CO2 e consumo de glicose por clulas de S. cerevisiae imobilizadas (smbolo cheio) e livres (smbolo aberto) (Fonte: Wendhausen et al., 2001).......................................................... 44 Figura 8.9: Produtividade (smbolo cheio) e concentrao de etanol (smbolo aberto) em clulas de S. cerevisiae imobilizadas em funo da taxa de diluio e em funo do tempo em um bioreator de leito empacotado alimentado com 33% de caldo de cana (180 g/L de sacarose) a 30oC (Fonte: Wendhausen et al., 2001)............... 44



Figura 9.1: Configuraes de MBRs: (a) membrana submersa, (b) circulao externa (Fonte: Melin et al., 2006)....... 45 Figura 10.1: Influncia do tamanho das partculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por Zymomonas mobilis para produo de etanol. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ....................................................... 49 Figura 10.2: Reatores para cultivo semi-slido industrial (a) tanques circulares; (b) esteira rolante; (c) reator tubular com agitao interna. (Fonte: Schmidell et al., 2001).............................................................................................. 49 Figura 10.3: Influncia do teor de umidade sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001)........... 50 Figura 10.4: Relao entre a atividade de gua e as reaes de deteriorao dos alimentos. ......................................... 51 Figura 10.5: Influncia da temperatura sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001).................. 51 Figura 11.1: Variao da concentrao de oxignio dissolvido em gua com a temperatura. ........................................ 53 Figura 11.2: Etapas da transferncia de oxignio da bolha de ar para a clula (Doran, 1995. p. 200). .......................... 54 Figura 11.3: Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de massa da fase lquida, kLa. ........................ 55 Figura 11.4: Representao esquemtica da variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido. (Fonte: Schmidell et al., 2001) .............................................................................................................................................................. 56 Figura 11.5: Curva de variao de concentrao de oxignio dissolvido para clculo de kLa e q O2 conforme o mtodo dinmico. Fonte: Ayub, 1991, p. 60. ....................................................................................................................... 57 Figura 11.6: Sistemas diversos de transferncia de oxignio em biorreatores. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............. 58 Figura 11.7: Esquema de um biorreator agitado com turbinas de ps planas. (Fonte: Schmidell et al., 2001)............... 59 Figura 11.8: nmero de potncia em funo do nmero de Reynolds para impelidor tipo hlice e Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............................................................................................................................................. 60 Figura 11.9: Pg/P em funo do nmero de aerao para um sistema de agitao com duas turbinas Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............................................................................................................................................. 61 Figura 12.1: Variao do fator tempo de mistura com o nmero de Reynolds. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............ 66 Figura 13.1:Perfil tpico de temperatura do meio de cultivo e evoluo da morte celular em uma esterilizao em batelada (Fonte: Doran, 1997). ................................................................................................................................ 72 Figura 13.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilizao em batelada................................................. 73 Figura 13.3: Equipamentos para esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor............................................................................................... 73 Figura 13.4: Curvas de aquecimento, manuteno da temperatura e resfriamento durante uma esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor........ 74 Figura 13.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). ................................................. 74 Figura 13.6: Trocador de calor tubular (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995)...................................................... 74



Lista de Tabelas

Tabela 1.1: Marcos Histricos no Desenvolvimento da Biotecnologia............................................................................. 8 Tabela 1.2: Principais Tipos de Enzimas e Suas Aplicaes............................................................................................. 9 Tabela 1.3: Principais tipos de vacinas produzidas por via fermentativa........................................................................ 11 Tabela 1.4: Aplicaes Comerciais Futuras da Nova Biotecnologia............................................................................... 13 Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores. ............................................................................................................ 24 Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos.............................................................................................. 30 Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico. ....................................... 31 Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono. .................... 32 Tabela 9.1: Comparao das caractersticas dos diferentes mdulos de membranas utilizados em MBRs..................... 46 Tabela 11.1: Valores de concentrao crtica de oxignio para alguns microrganismos ................................................ 56 Tabela 11.2: Coeficientes e da equao 11.23 conforme a escala de trabalho. ........................................................ 62 Tabela 12.1: Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala............................................................. 68 Tabela 12.2: Relao entre variveis em uma ampliao de escala (V1 = 60L; V2 = 7,5m3) ........................................... 68



1 1.1

Introduo Engenharia de Bioprocessos Definies

Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the links between biology and chemical engineering. (...) The heart of biochemical engineering lies on the scale up and management of cellular processes. Aiba, Humphrey, Millis Biochemical Engineering (1973). Processing of biological materials and processing using biological agents such cells, enzymes or antibodies are the central domain of biological engineering. Success in biochemical engineering requires integrated knowledge of governing biological properties and principles and of chemical engineering methodology and strategy. (...) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice. Bailey, Ollis Biochemical Engineering Fundamentals (1986). 1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos

O uso da Biotecnologia teve o seu incio com os processos fermentativos, cuja utilizao transcende, de muito, o incio da era Crist, confundindo-se com a prpria histria da humanidade. A produo de bebidas alcolicas pela fermentao de gros de cereais j era conhecida pelos sumrios e babilnios antes do ano 6.000 a.C. Mais tarde, por volta do ano 2.000 a. C., os egpcios, que j utilizavam o fermento para fabricar cerveja, passaram empreg-lo tambm na fabricao de po. Outras aplicaes como a produo de vinagre, iogurte e queijos so, de h muito, utilizadas pelo ser humano. Entretanto, no eram conhecidos os agentes causadores das fermentaes que ficaram ocultos por 6 milnios. Somente no sculo dezessete, o pesquisador Antom Van Leeuwenhock, atravs da visualizao em microscpio, descreveu a existncia de seres to minsculos que eram invisveis a olho nu. Foi somente 200 anos depois que Louis Pasteur, em 1876, provou que a causa das fermentaes era a ao desses seres minsculos, os microrganismos, caindo por terra a teoria, at ento vigente, que a fermentao era um processo puramente qumico. Foi ainda Pasteur que provou que cada tipo de fermentao era realizado por um microrganismo especfico e que estes podiam viver e se reproduzir na ausncia de ar. Posteriormente, em 1897, Eduard Buchner, demonstrou ser possvel a converso de acar em lcool, utilizando clulas de levedura maceradas, ou seja, na ausncia de organismos vivos. Foram as grandes guerras mundiais que motivaram a produo em escala industrial de produtos advindos de processos fermentativos. A partir da primeira guerra, a Alemanha, que necessitava de grandes quantidades de glicerol para a fabricao de explosivos, desenvolveu atravs de Neuberg, um processo microbiolgico de obteno desse lcool, tendo chegado a produzir 1.000 toneladas do produto por ms. Por outro lado, a Inglaterra produziu em grande quantidade a acetona para o fabrico de munies, tendo essa fermentao contribudo para o desenvolvimento dos fermentadores industriais e tcnicas de controle de infeces. Foi, todavia, a produo de antibiticos o grande marco de referncia na fermentao industrial. A partir de 1928, com a descoberta da penicilina por Alexander Fleming, muitos tipos de antibiticos foram desenvolvidos no mundo. Na dcada de 40, durante a segunda guerra mundial, os antibiticos passaram a integrar os processos industriais fermentativos, principalmente nos Estados Unidos, basendo-se inicialmente na sntese da penicilina e, posteriormente, da estreptomicina. Foi, todavia, a partir da dcada de 50 que a Biotecnologia, com a descoberta da sntese qumica do DNA, e com as tcnicas de manipulao gentica (DNA recombinante e fuso celular ou hibridoma), passou de fato a existir. A tcnica do DNA recombinante envolve a criao sinttica de novos organismos vivos, com caractersticas no encontradas na natureza, formadas pela hibridizao em nvel molecular do DNA. Essa tcnica permite, por exemplo, o enxerto de genes humanos que determinam a produo de insulina em um



microrganismo, possibilitando a produo industrial de insulina humana, substituindo, com grande vantagens, a insulina bovina ou suna empregadas no tratamentos de diabticos. A tcnica de hibridoma possibilitou a manipulao gentica a nvel das clulas vivas onde duas ou mais clulas so fundidas para formar novos microrganismos. Na prtica, clulas animais que produzem anticorpos so incorporadas a outras malignas ou perniciosas resultando em uma nova que se torna eficiente produtora de anticorpos. A Tabela 1.1 mostra os principais marcos histricos no avano cientfico e tecnolgico da Biotecnologia. Tabela 1.1: Marcos Histricos no Desenvolvimento da Biotecnologia Perodo 6.000 a. C. 2.000 a.C. 1875 d. C. 1880-1910 1910-1940 1940-1950 1953 1973 1982 Acontecimento bebidas alcolicas (cerveja e vinho) so produzidas por sumrios e babilnios panificao e bebidas fermentadas so utilizadas por egpcios e gregos Pasteur mostra que a fermentao causada por microrganismos surgimento da fermentao industrial (cido lctico, etanol, vinagre) sntese de glicerol, acetona e cido ctrico antibiticos so produzidos em larga escala por processos fermentativos estabelecida a estrutura do DNA incio da engenharia gentica insulina humana produzida

Atualmente crescente o ritmo de desenvolvimento do setor, mantendo, inclusive, uma acentuada relao de interao com diversos outros setores da cincia e tecnologia tais como: biologia molecular, fisiologia, microbiologia, engenharia qumica, engenharia ambiental, etc. como mostrado na Figura 1.1.

Figura 1.1: Multidisciplinaridade da Biotecnologia



1.3

Produtos provenientes de processos biotecnolgicos

A Biotecnologia encontra muitas e diferentes aplicaes importantes em vrios segmentos de atividade, como a agricultura, a minerao, a pecuria, a sade e a indstria. Suas aplicaes na indstria constituem o objetivo principal da chamada Biotecnologia Industrial. A fermentao como processo industrial apresenta hoje uma importncia crescente em setores chaves da economia. Empresas por todo o mundo produzem e comercializam produtos obtidos atravs de processos fermentativos, tendo sido a produo em escala industrial de bens, atravs de processos microbiolgicos, iniciada a partir da primeira guerra mundial. Atualmente, existem mais de uma centena de produtos viveis de serem obtidos atravs da via fermentativa. 1.3.1 Enzimas

As enzimas so molculas de protenas que tm a funo de catalisar reaes. A principal fonte de obteno de enzimas so os microrganismos, embora muitas enzimas de aplicao industrial tenham sua origem nos tecidos animal ou vegetal: renina, obtida do estmago de bezerros e papana, obtida do mamo, por exemplo. Os principais tipos de enzimas comercializados atualmente so as proteases, as gluco- e -amilase e a glicose-isomerase. A Tabela 1.2 mostra os principais tipos de enzimas bem como o seus principais usos (para saber mais: http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes) Tabela 1.2: Principais Tipos de Enzimas e Suas Aplicaes enzima protease amilase e amiloglucosidase catalase glicose-isomerase invertase lactase lipase celulase glicose-oxidase aplicao quebra de molculas de protena sacarificao do amido eliminao da gua oxigenada no processamento de alimentos produo de frutose hidrlise da sacarose desdobramento da lactose desdobramento de leos e gorduras desdobramento da celulose remoo da glicose

1.3.2

cidos Orgnicos

Dentre os cidos orgnicos que podem ser produzidos por processos fermentativos destacam-se: o cido actico, o cido ctrico e o cido lctico, os trs de grande uso industrial, principalmente na rea de alimentos, com a funo de acidulantes. 1.3.3 Aminocidos

Os aminocidos constituem a unidade bsica das protenas. O ser humano necessita basicamente de 20 aminocidos para as suas necessidades de metabolismo e desenvolvimento orgnico. Destes, oito no so sintetizados pelo organismo necessitando, pois, serem ingeridos atravs de alimentos.



Entretanto, dois aminocidos revestem-se de especial importncia: a metionina e a lisina, dado ao fato de no se encontrarem presentes nos cereais. A metionina no obtida por processos fermentativos, porm 80% da lisina produzida obtida por via microbiolgica. Outros importantes aminocidos sintetizados por via fermentativa so o cido glutmico, o cido asprtico e o triptofano. 1.3.4 Vitaminas

Tradicionalmente utilizadas como suplemento alimentar para o ser humano e animais, as vitaminas so, em sua maioria, sintetizadas quimicamente. Entretanto, algumas delas como as do complexo B, notadamente a B2, so produzidas por biossntese microbiana. 1.3.5 Biopolmeros

Comercialmente entende-se por biopolmeros determinados polissacardeos excretados por microrganismos. Os principais biopolmeros encontrados no mercado so as gomas xantana e as dextranas. As primeiras representam a maior parte do mercado, sendo aplicadas como aditivos em alimentos: estabilizantes de suspenso lquidas e geleificantes. 1.3.6 Solventes

Trs so os principais solventes orgnicos produzidos por microrganismos: etanol, butanol e acetona. Destes, o etanol se reveste de especial importncia no contexto brasileiro pelo seu destaque no segmento da economia. 1.3.7 Bebidas Alcolicas

As bebidas alcolicas so to antigas quanto a humanidade e numerosas como suas etnias. Fencios, assrios, babilnios, hebreus, egpcios, chineses, germanos, gregos e romanos mencionaram-nas e cada povo tem praticamente as suas, a partir das fontes naturais prprias de acares e produtos amilceos como: frutas, cana-de-acar, milho, trigo, arroz, batata, centeio, aveia, cevada, e mesmo razes e folhas. Deve-se lembrar, alis, de que esses produtos de fermentao alcolica originavam-se na antigidade de processos espontneos de fermentao e que s em poca mais recente comearam a ser usados nas indstrias, para a sua fabricao, os modernos mtodos da Biotecnologia. As bebidas alcolicas podem ser classificadas em : - fermentadas: cerveja, vinho saqu, sidra, etc. - fermento - destiladas: aguardente, rum, usque, conhaque, vodca, gim, etc. 1.3.8 Alimentos

Inmeros so os produtos alimentcios modificados ou produzidos atravs de processos fermentativos. Alguns como queijos, iogurte e po so utilizados pela humanidade h mais de 2.000 anos. Picles, azeitonas e chucrute so outros alimentos que tem a participao de processos biolgicos em sua obteno. 1.3.9 Microrganismos

O primeiro processo industrial para a produo de microrganismos teis ao homem constituiu-se na produo de levedura para panificao. Hoje, alm da panificao, so produzidos microrganismos para serem utilizados como inculos para produo de bebidas alcolicas e iogurtes, e esporos para utilizao como bioinseticidas. Alm de inculos, o uso de protena unicelular - SCP (sigle cell protein) para a nutrio animal tem-se mostrado atraente. Para ingesto humana, a SCP provoca problemas de digestibilidade devido a grande quantidade de cidos nuclicos componentes da SCP. Todavia, muitas indstrias tm construdo fbricas para a produo de protenas unicelular nos ltimos anos, principalmente na Europa, Estados Unidos e Japo.



1.3.10 Antibiticos Os antibiticos so empregados no combate a infeces causadas por microrganismos, notadamente bactrias, tanto no organismo humano como no animal e vegetal. So usados tambm no controle de contaminaes em determinados processos fermentativos. Atualmente existem mais de 5.000 tipos diferentes de antibiticos conhecidos, tendo sido a sua produo grandemente impactada pelo melhoramento gentico dos microrganismos utilizados. Dentre os produtos industrializados a maior contribuio comercial provm das penicilinas e cefalosporinas. 1.3.11 Protenas reguladoras do metabolismo A produo dessas macromolculas por microrganismos, teve grande impulso com as pesquisas do DNA recombinante. Os principais produtos so: insulina humana, interferon, hormnio de crescimento humano, peptdios neuroativos, etc. Desses frmacos, o que se encontra em estgio tecnolgico mais avanado a insulina, fundamental na regulao do teor de glicose no sangue, sendo usada na terapia de pacientes com diabetes. 1.3.12 Transformao de esterides A cortisona, descoberta no incio da dcada de 30, e suas propriedades no combate artrite reumtica, levou pesquisa do desenvolvimento de muitos compostos similares, hoje industrializados e comercializados. Inicialmente, a sntese da cortisona era feita por via qumica. Posteriormente, algumas das etapas principais da sntese passaram a ser realizadas por microrganismos o que proporcionou substancial barateamento no custo final. Outros produtos como hidrocortisona, testosterona, albumina humana, gama globulina, e fator antihemoflico esto sendo produzidos e comercializados. 1.3.13 Vacinas As vacinas representam um importante instrumento no controle de doenas infecciosas. Muitas doenas podem ser evitadas pela imunidade induzida como a poliomielite, a varola e o sarampo. As vacinas podem ser de origem viral, bacteriana, protozoria e mesozoria. A Biotecnologia, atravs da tcnica do DNA recombinante, tem envidado esforos no desenvolvimento de novos agentes imunizantes para influenza tipos A e B, herpes, pliomelite e hepatite A e B. Vacinas de origem bacteriana, para diversos tipos de meningite, tem sido produzidas por meio de fermentao, bem como o componente pertussis da vacina trplice.

Tabela 1.3: Principais tipos de vacinas produzidas por via fermentativa Vacinas Difteria Ttano Coqueluche Poliomielite Rubola Hepatite B Fonte Corynebacterium diphtheriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Vrus atenuados em clulas renais diplides humanas ou de macacos Vrus atenuados em clulas renais de hamsters recm-nascidos Anticorpo de superfcie expressado em leveduras recombinantes

1.3.14 Controle Biolgico de Pragas So inegveis os danos que os insetos/pragas causam agricultura. A monocultura e o uso indiscriminado de produtos qumicos - defensivos agrcolas - eliminam os inimigos naturais que existem em



culturas diversificadas, provocando o desequilbrio ecolgico nas reas de plantio, gerando condies propcias para o aparecimento de pragas alm de aumentar a sua resistncia. Os microrganismos patognicos aos insetos/pragas so adequados reduo especficas, enquanto que os predadores naturais e insetos benficos so preservados ou podem se desenvolver, estabelecendo o equilbrio natural. Portanto, os inseticidas microbiolgicos so considerados como uma forma alternativa de controle de pragas. 1.3.15 Lixiviao Bacteriana de Minrios O estudo e aperfeioamento dos processos de concentrao de metais em geral tem contribudo significativamente para o aproveitamento de minrios. No campo da metalurgia extrativa, mais especificamente da hidrometalurgia, a lixiviao bacteriana de minrios vem merecendo crescente ateno como alternativa para os processos convencionais. Analogamente a lixiviao convencional, baseia-se na solubilidade dos metais em solues adequadas por meio de reaes qumicas e tambm de reaes bioqumicas. Cobre, urnio e zinco so exemplos de minerais que podem ser recuperados atravs de lixiviao bacteriana. 1.4 A Biotecnologia no Brasil

A aplicao de cincias biolgicas no Brasil remonta a meados do sculo passado. Notadamente tcnicas laboratoriais e de campo em microbiologia - uma disciplina precursora da moderna Biotecnologia foram aplicadas por pesquisadores como Piraj da Silva e Pedro Severiano de Magalhes. No decurso da segunda metade do sculo XIX, trabalhos pioneiros foram desenvolvidos em vrias modalidades da microbiologia dentre os quais merecem destaque a bacteriologia, micologia, protozoologia, fitopatologia e virologia. Na primeira metade do sculo XX registrou-se atuao marcante de pesquisadores tais como: Carlos Chagas, Vital Brasil, Oswaldo Cruz, Adolfo Lutz, Emlio Ribas, Rangel Pestana, dentre outros no campo do combate e profilaxia de graves molstias que atingiam a populao brasileira. Atualmente, a continuidade desse esprito cientfico est presente nas equipes de pesquisas dos Institutos Oswaldo Cruz, Biofsica e Microbiologia no Rio de Janeiro, Biolgico, Agronmico de Campinas, Adolfo Lutz, Butant e Pasteur em So Paulo. Na dcada de 40, a Biotecnologia clssica atraiu o esprito empreendedor de cientistas da Universidade de Viosa, Minas Gerais, que fundaram uma empresa pioneira, a Sementes Agroceres, objetivando produzir sementes de milho hbrido a partir de material gentico selecionado no Pas. A Brasil Sul Agropecuria, na dcada de 60, voltou-se produo e seleo de sementes forrageiras e pesquisa gentica para a obteno de hbridos de sorgos granferos forrageiros e de milho doce para o consumo humano. A Agroflora Reflorestamento e Agropecuria, dedicou-se pesquisa e produo de sementes melhoradas e seleo de variedades de plantas adaptadas a diferentes condies sazonais. Atualmente existem no Pas cerca de meia centena de instituies de pesquisa e empresas comerciais atuando em Biotecnologia. 1.5 Tendncias

As novas tcnicas de engenharia gentica esto promovendo uma reavaliao de quase todos os processos industriais que empregam tcnicas ou produtos biolgicos. A engenharia gentica aplicada Biotecnologia, alm de substituir processos e produtos tradicionais, apresenta grandes perspectivas de melhorar o bem estar da populao por meio de melhores solues para problemas de sade, alimentao, energia, materiais e meio ambiente.



A Tabela 1.3, a seguir, fornece uma indicao parcial da aplicao comercial da nova Biotecnologia s necessidades da sociedade. Tabela 1.4: Aplicaes Comerciais Futuras da Nova Biotecnologia rea aplicao potencial - remdios e vacinas mais eficazes com maior grau de pureza e a um custo menor - diagnstico, preveno e tratamento de doenas genticas - novos produtos e processos alimentcios mais eficientes - melhor rendimento e qualidade na produo agropecuria - maior eficincia na converso de biomassa em combustveis Energia - menor consumo energtico em processos industriais - aumento na recuperao de petrleo - menor custo na produo de produtos qumicos com matrias-primas de biomassa - extrao econmica de minerais de baixo teor - alternativas biolgicas herbicidas e pesticidas - tratamento de detritos txicos

Sade

Alimentos

Materiais

Meio Ambiente

A Tabela 1.3 demonstra a amplitude e a profundidade de mudanas que devero advir com o uso da nova Biotecnologia. Na rea da sade, o desenvolvimento de produtos teraputicos para o tratamento de herpes, cncer, hepatite, artrite e outras doenas vislumbra solues novas. Em outras aplicaes da Biotecnologia sade, essas tcnicas novas permitem meios baratos e mais sensveis para diagnosticar gravidez, doenas venrias e outras condies que atualmente requerem testes de laboratrio complexos e caros. Adicionalmente, essas tcnicas possibilitam a dosagem especfica de produtos farmacuticos para determinados rgos do corpo. Na rea de materiais, produtos de qumica fina para medicina e alimentao podem ser produzidos por microrganismos novos, que tornam possveis transformaes complexas em uma nica etapa. A nova Biotecnologia um instrumento poderoso, podendo substituir vasto nmero de processos industriais atualmente empregados e criando com isso novas e melhores solues para uma grande gama de problemas. O papel do engenheiro qumico na engenharia de bioprocessos reside no: desenho e operao de biorreatores, esterilizadores e equipamentos para recuperao de produtos; desenvolvimento de sistemas para automao e controle de processos; projeto de indstrias de fermentao seguras e eficientes.

A Figura 1.2 mostra os passos no desenvolvimento de um novo bioprocesso.



Figura 1.2: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997).

1.6

Processos fermentativos industriais

O objetivo primordial da biotecnologia a obteno de produtos metablicos teis atravs do processamento biolgico. Entende-se por processo biolgico, todo sistema reacional envolvendo seres vivos. Dentre estes seres, destacam-se microrganismos tais como fungos, bactrias, algas, etc. Denominam-se processos fermentativos os processos biolgicos que tm aplicao industrial. Em geral, um processo fermentativo compreende seis etapas, conforme ilustra a Figura 1.3. Estas etapas so: Formulao do meio de cultura: define-se a composio qualitativa e quantitativa do meio de cultura, o pH e a temperatura ideal de cultivo; Esterilizao do meio de cultura e dos equipamentos: promove-se a assepsia de todo material que entrar em contato direto com os microrganismos. Desenvolvimento do inculo: Produo de cultura pura em quantidade suficiente para inocular o biorreator. Para operacionalizar o cultivo de microrganismos em escala industrial necessrio promover o cultivo destes microrganismos em uma srie de vasos ou reatores em escala reduzida (pr-reatores), de modo a garantir o crescimento acelerado e a eliminao da fase de adaptao (lag). Alm disto, necessrio garantir a qualidade do inculo em todas as etapas de forma a garantir resultados consistentes. Promoo do crescimento da populao de clulas no biorreator sob condies propcias para a formao do produto: Nesta etapa aplicam-se todos os conhecimentos adquiridos no estudo da fisiologia do microrganismo de maneira a propiciar as condies mais favorveis para o crescimento celular e a produo do metablito desejado.



Extrao e purificao do(s) produto(s): Aps a converso biolgica, o produto ou produtos precisam ser separados do meio de cultura e purificados em seguida. Muitos dos produtos do processamento biolgico so quimicamente frgeis, devendo-se controlar cuidadosamente a temperatura e o pH da mistura e aplicar tcnicas de separao que preservem a atividade biolgica dos produtos. Tratamento dos efluentes: recomendvel o tratamento dos efluentes do processo biolgico antes deles serem descartados. Muitas vezes, os efluentes constituem-se em produtos teis, podendo-se aumentar a margem de lucro do processo atravs da utilizao eficiente desses efluentes.

Figura 1.3: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001) Em muitos processos uma ou mais destas etapas so desnecessrias ou diferentes. Por exemplo, a produo de etanol por Saccharomyces cerevisae no Brasil feita sem a esterilizao do meio e dos equipamentos. J a produo de SCP (single cell protein) d-se pela ao de uma mistura de microrganismos, sendo o preparo do inculo diferente do mencionado acima e as prprias clulas so produto desejado. A eficincia do processo fermentativo pode ser aumentada atravs de programas de pesquisa e desenvolvimento atuando principalmente em trs das etapas citadas acima: modificando o microrganismo atravs de tcnicas de mutao e de engenharia gentica, e selecionando variaes de clulas mais produtivas, otimizando as condies do meio durante a reao e desenvolvendo estratgias de separao e purificao do produto.



2 2.1

Microbiologia Distribuio dos organismos vivos

Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de R. H. Wittaker em 1969 (Fonte: Borzani et al., 2001).

Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et al., 2001).



A nomenclatura dos organismos vivos binomial, sendo que o nome cientfico dado pela combinao do nome genrico (gnero) seguido da espcie. O nome do gnero iniciado com letra maiscula mas o da espcie no. Ambos devem ser escritos em itlico ou grifado. Exemplo:

Saccharomyces cerevisiae gnero espcie2.2 2.2.1 Morfologia e estrutura Bactrias (procariotos)

As clulas bacterianas podem ter forma esfrica (cocos), cilndrica (bacilos) ou espiralada. Os cocos podem estar isolados (micrococos), em duplas (diplococos), formar correntes (estreptococos) ou formaes aleatrias tipo cachos (estafilococos). Os bacilos podem apresenta-se isolados ou formar correntes (estreptobacilos). As bactrias espiraladas podem ter a forma de espiral (espirilos) ou de uma vrgula (vibries). Seu tamanho varia entre 0,5 e 4,0 m para os cocos e em torno de 19,0 m para os bacilos. As principais estruturas bacterianas, mostradas na Figura 2.3, so: Membrana citoplasmtica: de composio lipoprotica, regula as trocas com o meio externo e executa processos respiratrios, fotossntese, sustentao de ribossomos, orientao da diviso celular e biossntese de estruturas de superfcie. Parede celular: garante a forma celular e protege contra a diferena de presso osmtica entre o interior da clula e o ambiente externo.

Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997). Citoplasma: solubiliza sais minerais, aminocidos, pequenas molculas, protenas e acares, e possui partculas em suspenso: ribossomos e grnulos de material de reserva (amido, glicognio, lipdeos, fosfatos). Nucleide: filamento duplo de DNA (cromossomo) no associado a protenas e preso a uma invaginao da membrana plasmtica (mesossomo). Flagelos: mobilidade celular. Fmbrias ou pili: fixao celular (formao de biofilmes). A Figura 2.4 mostra fotos de microscopia de diferentes tipos de bactrias. Algumas bactrias possuem a capacidade de formar esporos. Os esporos se constituem em uma clula em tamanho menor, com material nuclear e citoplasma condensado, baixo teor de gua, maior quantidade de clcio e presena do



cido dipicolnico. Alm da membrana citoplasmtica, o esporo possui vrias camadas de invlucro, possuindo um revestimento bastante espesso e com considervel resistncia agentes externos, sobretudo temperatura. A reproduo das bactrias se d por diviso binria simples, gerando duas clulas filhas iguais.

Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae

Lactobacillus acidophilus

Propionibacterium acne

Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias.

2.2.2

Fungos

So organismos eucariticos, heterotrficos. Podem ser divididos em leveduras (unicelulares) e bolores ou mofos. As leveduras possuem forma esfrica, elptica ou filamentosa, com 1 a 5 m de dimetro a 5-30 m de comprimento. Bolores so constitudos por clulas multinucleadas que formas tubos denominados hifas. Um conjunto de hifas denominado de miclio. A clula fngica possui parede celular, membrana citoplasmtica, e membrana nuclear, dentro da qual existem diversos cromossomos, nuclolo e histonas. O citoplasma possui vacolos, mitocndrias, retculo endoplasmtico, ribossomos e material de reserva. A Figura 2.5 apresenta o desenho esquemtico de uma clula eucaritica animal. A reproduo das leveduras pode ser assexuada, por brotamento ou diviso celular, ou sexuada, via formao de esporos.

Figura 2.5: Esquema de clula eucaritica animal (Fonte: http://people.eku.edu/ritchisong/cell1.gif em 01/08/08).



2.3 2.3.1

Nutrio microbiana Consideraes gerais Quanto nutrio: Plantas: Fotossintticas: obtm energia da luz solar Auxotrficas: nutrem-se basicamente de substncias inorgnicas Animais, fungos: Quimiotrficos: obtm energia atravs de reaes qumicas. Heterotrficos: exigem fontes orgnicas de carbono.

2.3.2

Requisitos Nutricionais

Os microrganismos retiram do meio ambiente todas as substncias necessrias para a sntese de material celular e de obteno de energia. As necessidades nutricionais dos microrganismos variam muito. Organismos autotrficos podem sintetizar todos os metablitos necessrios pela clula a partir de compostos inorgnicos; os heterotrficos requerem um ou mais nutrientes orgnicos. Essas diferenas nutricionais refletem diferenas na habilidade de sntese dos microrganismos. A habilidade em usar diferentes compostos como fonte de energia e de sintetizar protenas e compostos do citoplasma a partir de compostos inorgnicos depende da presena de uma srie de enzimas, sem as quais as clulas tornam-se mais exigentes nutricionalmente. A formao dessas enzimas diretamente controlada pela gentica da clula. A falta ou a represso de um ou mais genes que codificam a formao de uma destas enzimas reflete-se diretamente nas necessidades nutricionais da clula. Geralmente o cultivo de microrganismos para aplicao em biotecnologia feito em ambiente controlado. A formulao do meio de cultura essencial para a produo do metablito desejado. O meio de cultura deve conter todas as substncias que constituem o material celular. As principais substncias so descritas seguir. 2.3.2.1 Fontes de material plstico

O Carbono representa de 45 a 50% do peso seco celular. o componente bsico para a biossntese, fazendo parte de todos os compostos sintetizados pela clula. Geralmente a mesma fonte de carbono serve como fonte de energia. As fontes de carbono mais comuns so os acares e os glicdios (pentoses, hexoses, polissacardeos). Outras fontes de carbono menos comuns abrangem uma ampla faixa de compostos, indo desde os mais simples como metano e metanol s mais complexas como celulose e hemicelulose. No entanto, a eficincia de assimilao destes compostos, do ponto de vista biotecnolgico, muito menor do que as fontes tradicionais e poucos microrganismos selvagens so capazes de assimilar tais compostos. O Nitrognio consiste de 10 a 15% do peso seco das clulas. o componente bsico na formao de aminocidos. assimilado sob forma amoniacal. Fontes de nitrognio em outras forma que no a amoniacal so primeiro transformadas em ons amnio sendo ento utilizadas normalmente no metabolismo celular. Muitas substncias servem como fonte de nitrognio: i) Fontes inorgnicas de nitrognio: NH4Cl, (NH4)2SO4 , NH4NO3, N2, etc. ii) Fontes orgnicas de nitrognio: aminocidos e hidrolisados de protenas naturais, peptdeos, uria, purinas e pirimidinas. Os ons inorgnicos dividem-se em macronutrientes e micronutrientes. Entre os primeiros esto o fsforo e o enxofre. O fsforo assimilado somente na forma de di-hidrognio fosfato (ortofosfato) H2PO4-. importante na regulao do metabolismo celular e no fornecimento de fosfatos para a gerao de energia. A concentrao intracelular de PO43- regula a sntese de lipdeos e carboidratos. O enxofre representa 1 a 2% do peso seco celular e entra na constituio dos aminocidos sulfurados metionina e cistena. As fontes inorgnicas de enxofre so tipicamente K2SO4 ou mais comumente (NH4)2SO4. A formao de pontes de



dissulfeto e importante para a atividade de protenas. O enxofre encontrado em certas vitaminas tais como biotina e tiamina. Os micronutrientes so necessrios em concentraes da ordem de miligramas por litro de cultura. Esses compostos, s vezes, esto presentes como impurezas de outros ingredientes do meio de cultura. O Potssio regulador da presso osmtica (para cada on metlico bivalente absorvido, o dobro da quantidade de K+ excretada), estimula fermentao e respirao em pH reduzido, e co-fator de vrias enzimas. O Magnsio co-fator de vrias enzimas. Participa na ativao das enzimas glicolticas, estimula a sntese de cidos graxos essenciais, regula os nveis inicos celulares, a ativao de ATPase na membrana e a absoro de fosfato juntamente com K+. A concentrao de Mg++ afeta a associao de ribossomos. O Clcio estimula o crescimento celular pela incorporao na parede celular e membrana plasmtica. O Ferro necessrio para a sntese dos citocromos e de certos pigmentos. Outros ons como Cl-, Na+, Ba2+, Zn2+, Mn2+, Co+2 so encontrados na composio elementar de muitos microrganismos e esto envolvidos em importantes etapas do metabolismo. O Fator de Crescimento um metablito essencial que o microrganismo incapaz de sintetizar, devendo encontrar pr-formado no meio. A bactria Zymomonas mobilis, por exemplo auxotrfica em relao a pantotenato, um precursor da coenzima A. Em geral, os fatores de crescimento podem ser: i) aminocidos - indispensveis para a sntese de protenas; ii) bases pricas e pirimdicas - necessrias para a sntese dos cidos nuclicos; iii) vitaminas - so co-enzimas ou precursores de co-enzimas.

2.3.2.2

gua

Representa 75% de peso celular. essencial para a absoro dos nutrientes e a remoo de produtos indesejveis.

2.3.2.3

Oxignio

O oxignio o receptor final de eltrons na respirao celular. Tambm altera o potencial de oxidao-reduo das clulas. Muitos sistemas enzimticos de clulas requerem condies extremamente reduzidas, isto , um baixo potencial de oxidao-reduo, para funcionar. Outros requerem condies oxidadas, um potencial de oxidao-reduo elevado. Os microrganismos podem ser classificados quanto ao requerimento de oxignio em: i) aerbios - necessitam do oxignio para a sua sobrevivncia. O oxignio participa do metabolismo desses microrganismos como receptor final de eltrons. Bacillus, Pseudomonas e Streptomyces pertencem a esta classe. ii) anaerbios - no sobrevivem na presena de oxignio, que txico para esta classe de microrganismos. As espcie do gnero Clostridium incluem-se nesta classe. iii) anaerbios facultativos - sobrevivem na ausncia ou na presena de oxignio. Tais organismos podem ser subdivididos em dois grupos, dependendo se o oxignio ativamente metabolizado ou meramente tolerado. As bactrias acticas (Streptococcus, Leuconostoc e Lactobacillus) pertencem ao grupo que obtm energia exclusivamente de fermentao, embora no sejam prejudicadas pelo oxignio. Por outro lado, bactrias coliformes, tal como Escherichia coli, podem obter energia de fermentao ou respirao. O desenvolvimento timo destes microrganismos geralmente acontece em uma das duas condies. Zymomonas mobilis por exemplo, se desenvolve na presena de oxignio, porm no o utiliza no seu metabolismo e a taxa de crescimento inferior que na sua ausncia. iv) microaerfilos - precisam de oxignio para sobreviver, mas a concentraes muito baixas. v) aerotolerantes - so bactrias anaerbias que crescem em presses de oxignio inferiores a da atmosfera terrestre.



2.4 2.4.1

Fatores fsico-qumicos Temperatura

A temperatura ideal para o crescimento do organismo varia de espcie para espcie. Os microrganismos podem ser classificados de acordo com a temperatura em que o seu crescimento pleno em (Figura 2.6): i) psicrfilos- se desenvolvem em temperaturas baixas entre -4C e 15C. Estes microrganismos, por sua vez, apresentam taxas metablicas bastante reduzidas. ii) mesfilos - se desenvolvem em temperaturas mdias entre 20C e 40C iii) termfilos - se desenvolvem em temperaturas entre 45C e 100C. A principal vantagem destes microrganismos sobre os outros que crescem em temperaturas inferiores o metabolismo mais rpido.

Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento.

Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula. A influncia da temperatura no crescimento , em ltima anlise, o reflexo do efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula. Na Figura 2.7 mostra-se que com a reduo da temperatura, a atividade enzimtica, e portanto a taxa de crescimento celular, diminui. No ponto de congelamento a atividade metablica pra, no somente devido diminuio da atividade enzimtica como tambm porque a clula desprovida de gua. Um aumento da temperatura acima da temperatura tima de crescimento, aumenta a atividade metablica, porm ao mesmo tempo a taxa de degradao das enzimas e das protenas tambm aumenta, resultando eventualmente em dano aos componentes celulares e conseqentemente na morte da clula.



Note-se, que a faixa de temperatura em que um microrganismo se desenvolve otimamente muito mais estreita que a representada pela classificao acima. A temperatura tima para o crescimento de uma espcie de microrganismo est diretamente relacionada com a temperatura do seu habitat natural.

2.4.2

pH

Existe uma faixa tima de concentrao de ons hidrognio para o desenvolvimento de microrganismos, embora a faixa de pH em que eles se desenvolvam seja relativamente ampla. As bactrias preferem os meios neutros (pH 7-7,5), sendo a maioria tolerantes a pH entre 6 e 9. As leveduras e os mofos preferem meios relativamente cidos de pH 3 a 6. Os microrganismos geralmente crescem melhor no pH do seu habitat natural. Em muitos casos, o prprio microrganismo, como resultado do seu metabolismo, exerce papel preponderante na definio do pH ideal para o seu crescimento. Bactrias produtoras de cido, mofos e leveduras aumentam a concentrao de ons hidrognio no ambiente e tendem a crescer melhor em valores de pH moderadamente baixos. Outras bactrias, especialmente as putrefativas que decompem protenas em aminocidos e amnia, aumentam o pH do ambiente e vivem bem em condies alcalinas.

2.4.3

Presso Osmtica

A presso osmtica de microrganismos independente da presso osmtica do meio de cultura em que eles esto suspensos. Quando uma clula colocada em um meio, uma presso osmtica exercida atravs de sua membrana semi-permevel. Um microrganismo normalmente cresce melhor em meios que tenham concentraes osmticas levemente inferiores sua prpria. Isto causa o fluxo de gua para o interior clula, condio essencial para a difuso de nutrientes e manuteno de uma presso exercida de dentro para fora da clula (turgor). Quando a concentrao do meio consideravelmente menor que a da clula (meio hipotnico), a gua difunde em excesso para interior da clula, aumentando a presso de turgor e causando muitas vezes, o rompimento da membrana celular (plasmlise) em clulas que no so protegidas por uma parede celular rgida. Se a concentrao osmtica do meio maior que a da clula (meio hipertnico), a gua deixa a clula, e a membrana citoplasmtica encolhe se afastando da parede celular. Organismos que crescem em altas presses osmticas ou em altas concentraes salinas so ditas osmoflicos e haloflicos, respectivamente.

2.5

Meios de Cultura

So meios lquidos ou slidos (semi-slido) contendo substncias capazes de proporcionar o crescimento de microrganismos. Os meios de cultura so classificados de acordo com as fontes de nutrientes em complexo e sinttico. Meio Complexo - um meio emprico consistindo de extratos de tecidos animal ou vegetal. Estes meios geralmente contm todos os ingredientes necessrios para o crescimento dos microrganismos, mas eles esto em formas cruas, isto , nem todos os componentes do meio nem as quantidades exatas deles so conhecidas. Muitos componentes de meio complexo so produtos da digesto cida ou enzimtica de tecidos de plantas, carnes, casena e clulas de levedura que so fontes ricas em polipeptdeos, aminocidos, vitaminas e sais minerais. Exemplos de meios complexos so os extratos de levedura e as peptonas (hidrolisados de protena). Estes extratos, geralmente contm carboidratos, no entanto os meios complexos so suplementados com acar. Meio Sinttico (Quimicamente Definido) - so os meios de cultura em que todos os nutrientes necessrios para o crescimento do microrganismo so fornecidos na forma de produtos qumicos relativamente puros e suas quantidades so conhecidos. Diz-se que o meio mnimo quando todos os compostos, exceto fatores de crescimento, so provenientes de fontes inorgnicas.



Alguns autores chamam de meio semi-definido ou completo, o meio complexo complementado por quantidades conhecidas de sais minerais. Os meios de cultura so usualmente esterilizados com calor em autoclave a 121oC e 15 libras de presso de vapor durante 15 a 30 minutos.

2.6

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Os microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes formas: isolamento a partir de recursos naturais compra de colees de cultura obteno de mutantes naturais obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de biologia molecular.

Caractersticas desejveis em microrganismos industriais: Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto; permitir o acmulo de produto no meio de cultura, de forma a se obter elevada concentrao deste no caldo fermentado; no produzir substncias incompatveis com o produto; apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico; no ser patognico; no exigir condies de processo muito complexas; no exigir meios de cultura dispendiosos.

Caractersticas desejveis nos meios de cultivos: Ser o mais barato possvel; atender as necessidades nutricionais dos microrganismos; auxiliar no controle do processo, como o caso de meios ligeiramente tamponados, que evitam variaes drsticas de pH, ou evitar formao excessiva de espuma; no provocar problemas na recuperao do produto; os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo; ter composio razoavelmente fixa; no causar dificuldades no tratamento final dos efluentes.



3

Biorreatores e Processos Fermentativos

Denominam-se biorreatores, reatores bioqumicos ou reatores biolgicos os reatores qumicos onde ocorrem uma sries de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores. Estes biocatalisadores podem ser enzimas ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais). Assim, os biorreatores podem ser classificados em dois grandes grupos: 1. biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou seja, so reatores enzimticos; 2. biorreatores onde as reaes se processam na presena de clulas vivas 3.1 Classificao dos biorreatores Os biorreatores podem receber diversos tipos de classificao, como por exemplo: quanto ao tipo de biocatalisador (clulas ou enzimas); quanto configurao de biocatalisador (cel/enz livres ou imobilizadas); quanto a forma de se agitar o lquido no biorreator.

Considerando as vrias propostas uma classificao mista e abrangente apresentada na Tabela 3.1, seguir. A Figura 3.1 mostra alguns tipos de configuraes de biorreatores. Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores. CLASSIFICAO DOS BIORREATORES 1. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa): 1.1. Clulas ou enzimas livres: - reatores agitados mecanicamente (STR: stirred tank reactors) Figura 3.1 (a) - reatores agitados pneumaticamente: o coluna de bolhas (bubble column) Figura 3.1 (b) o reatores air-lift Figura 3.1 (c) - reatores de fluxo empistonado (plug-flow) 1.2. clulas ou enzimas imobilizadas em suportes: - reatores agitados pneumaticamente com leito fixo ou fluidizado: o coluna de bolhas (bubble column) o reatores air-lift - reatores agitados devido recirculao do meio com leito fluidizado Figura 3.1 (d) - reatores de fluxo empistonado (plug-flow) 1.3. clulas confinadas em membranas: - reatores com membranas planas - reatores de fibra oca 2. Reatores de fase no aquosa (fermentao em estado slido) - reatores estticos (bandejas) - reatores com agitao (tambor rotativo) - reatores com leito fixo - reatores com leito fluidizado gs-slido. Fonte: Adaptado de Schmidell et al., 2001



Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) recirculao de meio com leito fluidizado. 3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo: a) descontnuo: - com um inculo por tanque; - com recirculao de clulas; b) semicontnuo: - sem recirculao de clulas; - com recirculao de clulas; c) descontnuo alimentado: - sem recirculao de clulas; - com recirculao de clulas; d) contnuo: - executado em um biorreator (com ou sem recirculao de clulas); - executado em vrios biorreatores (com ou sem recirculao de clulas).



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Cultivo Descontnuo

Os cultivos descontnuos clssicos vm sendo utilizados pelo homem desde a Antigidade e, ainda hoje so os mais utilizados para a obteno de diversos produtos. So tambm conhecidos como fermentaes descontnuas, fermentaes por batelada ou processo descontnuo de fermentao. Forma de operao: No primeiro instante, o meio de cultura esterilizado adicionado ao biorreator. Aps adicionada o inculo e inicia-se o cultivo. Ao longo do cultivo podem ser adicionados ar, no caso de cultivos aerbios, soluo cida e/ou alcalina, quando se deseja manter o pH constante, e antiespumante. Terminado o tempo de cultivo, esvazia-se o biorreator e o meio fermentado segue para a etapa de extrao e purificao dos produtos. O biorreator ento lavado, esterilizado e recarregado novamente com meio de cultivo. Caractersticas dos cultivos descontnuos: - volume de meio de cultura praticamente constante ao longo do cultivo; - pode ter baixos rendimentos e/ou produtividades devido a efeitos de inibio pelo substrato ou pelo produto e dos tempos mortos de carga, descarga, lavagem e esterilizao do biorreator; - baixo risco de contaminao; - grande flexibilidade de operao. 4.1 Inculo

Denomina-se de inculo, p-de-cuba ou p-de-fermentao um volume de suspenso de microrganismo de concentrao adequada capaz de garantir, em condies econmicas, o cultivo de um dado volume de meio de cultura. O armazenamento dos microrganismos possui o objetivo de conservar a cepa vivel e com capacidade produtiva, portanto, como o mnimo possvel de divises celulares, evitando desta forma o aparecimento de mutaes. O principais mtodos de armazenamento das cepas so em gar inclinado ou secas. A manuteno da cepa to importante que algumas empresas possuem centros especializados para manuteno e distribuio das cepas. O volume de inculo introduzido em um fermentador normalmente em torno de 10% de sua capacidade til, podendo variar, no entanto entre 0,5% e 50% de sua capacidade conforme o processo. A Figura 4.1 apresentas as diversas fases de preparao do inculo. Nos processos industriais, as bateladas podem ser classificadas conforme seu inculo em trs tipos: - cada biorreator recebe um inculo; - processo com recirculao de microrganismos; - processo por meio de cortes. 4.2 Meio de cultura

Tambm denominado de mosto, o meio de cultura deve possuir os nutrientes necessrios para o crescimento celular: a) b) c) d) elementos principais: C, H, O e N; elementos secundrios: P, K, S, Mg; vitaminas e hormnios; elementos traos: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, etc.

Na hora de escolher um meio de cultivo para utilizao industrial, a quantidade de cada um dos elementos no meio de cultivo deve levar em conta a necessidade de nutrientes do microrganismo e favorecer a formao do produto final. Outro fatores importantes so: - o custo; - a quantidade de carbono disponvel;



-

a disponibilidade e o armazenamento; dificuldade de esterilizao; a fermentescibilidade; o comportamento do meio durante e aps o cultivo (ex: formao de espuma);

Exemplos de substratos disponveis para utilizao como meio de cultura industrial: acares, melaos, soro de queijo, celulose, amido, e resduos como gua de macerao de milho, metanol, etanol, alcanos, leos e gorduras, etc.

Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001)

4.3

Cintica de um cultivo em batelada

O estudo cintico de um processo fermentativo consiste, inicialmente, na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema. Por componentes do sistema entende-se: - Microrganismo (biomassa) X - Substratos do meio de cultura S - Produto ou metablito P Parmetros de um processo biolgico: Velocidades instantneas de transformao, r: tambm denominadas velocidades volumtricas de transformao, com unidades (massa) (comprimento)-3 (tempo)-1. Velocidades especficas de transformao, : tambm denominada velocidade especfica de crescimento em (tempo)-1. Tempo de duplicao, td : O crescimento celular muitas vezes expresso em termos de tempo de duplicao. Fatores de converso e coeficientes especficos de manuteno, Y e m.



4.3.1

Cintica de crescimento celular

Em um cultivo descontnuo so observadas diferentes fases na curva de crescimento celular. Estas fases so bem visveis quando se desenha o grfico semilogartmico da concentrao de clulas viveis contra o tempo, como mostrado na Figura 4.2.

Figura 4.2: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995). Fase lag ou de latncia: durante a fase lag, a taxa de crescimento nula (X = X0 = cte), pois as clulas esto se adaptando ao novo meio de cultura, sintetizando novas enzimas ou componentes estruturais. A durao da fase lag varia com a concentrao do inculo, com a idade do microrganismo e com seu estado fisiolgico. Conforme a composio e a durao do pr-inculo possvel que a fase lag nem exista. Fase de acelerao: a fase de transio em que se observa o incio da reproduo microbiana. Ocorre um aumento gradual na velocidade de reproduo e, conseqentemente, na velocidade especfica de crescimento. Fase exponencial de crescimento: a velocidade especfica de crescimento constante e mxima ( = mx). Desta forma, pode-se concluir, atravs da equao (4.1), que a velocidade de crescimento diretamente proporcional concentrao celular X:

dX = mx X dt

(4.1)

Fase de declnio ou desacelerao: medida que os nutrientes do meio de cultura vo se esgotando, ou que so formados produtos inibitrios, a taxa de crescimento cai e a curva de crescimento celular entra na fase de declnio. Fase estacionria: nesta fase foi atingida a concentrao mxima de clulas no meio de cultivo e esta concentrao constante (X = Xmx) durante a fase estacionria. H um balano entre a velocidade de reproduo e a velocidade de morte dos microrganismos, ocorrendo tambm modificaes na estrutura bioqumica da clula. Fase de morte: o valor da concentrao celular diminui porque as clulas perdem viabilidade ou so destrudas por lise.

4.3.2

Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento

A equao emprica abaixo, proposta por Monod, tem sido normalmente utilizada para explicar a relao entre a concentrao de substrato limitante no meio de cultivo, S, e a velocidade especfica de reproduo do microrganismo, :



=

mx SKS + S

(4.2)

onde mx representa a velocidade especfica mxima de crescimento do microrganismo e KS a constante de saturao. Na equao (4.2), fazendo-se S = KS, tem-se que = mx , ou seja, KS a concentrao de substrato quando a metade de mx. A equao (4.2) est representada na Figura 4.3 para dois valores diferentes de KS. Quanto menor for o valor de KS, maior ser a durao da fase exponencial de crescimento. A Tabela 4.1 apresenta valores de KS para diversos microrganismos.

0,16 0,14 0,12 0,10-1 (h )

B A

0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 S (mg/L)

Figura 4.3: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1 (Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B). A equao de Monod no leva em conta o efeito inibidor tanto do substrato como do produto formado, contudo no o nico modelo que tenta explicar a relao entre o substrato limitante e a velocidade de crescimento microbiano nesta condio de cultivo. Outras equaes foram propostas e merecem ser citadas: Equao de Teissier:

= mx 1 e Equao de Moser:

S

KS

(4.3)

= mx

Sn KS + S n S KS X + S S KS + KD + S

(4.4)

Equao de Contois e Fujimoto:

= mxEquao de Powell

(4.5)

= mx

(4.6)

A ausncia de inibio , na verdade, uma situao pouco comum na prtica, principalmente em cultivos descontnuos, onde h um crescente acmulo de metablitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolismo e crescimento microbianos.



Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos. Microrganismo (gnero) Saccharomyces Escherichia Substrato limitante Glicose Glicose Lactose Fosfato Glicose Glicerol Oxignio Metanol Metano Dixido de carbono Magnsio Potssio Sulfato Metanol Ribose Tiamina KS (mg.L-1) 25 4,0 20 1,6 5,0 4,5 0,042-0,45 0,7 0,4 0,4 0,56 0,39 2,7 120,0 3,0 1,4 10-7

Aspergillus Candida Pseudomonas Klebsiella

Hansenula Cryptococcus Fonte: Doran, 1997

de mx, provoca o efeito contrrio, conforme mostrado na Figura 4.4:0,14 B

O efeito da inibio pelo substrato ocorre quando um alto valor inicial de S, ao invs de aproximar

-1 (h )

A 0,07

0,00 0,0S K 5,0 10,0 15,0 K 20,0 I,S 25,0 S (mg/L)

Figura 4.4: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de Monod para mx = 0,14 h-1. Com o objetivo de explicar esta reduo na velocidade especfica de crescimento, foi proposta uma modificao na equao de Monod:

= mx

K I ,S S K S + S K I ,S + S

(4.7)



Nesta nova expresso, KS continua sendo a constante de saturao da equao de Monod, e KI,S a constante de inibio pelo substrato, que se refere a um valor de S para qual X = mx , porm para um valor de S de cause inibio, sendo assim superior ao valor de S da equao de Monod. Se KI,S muito maior que S, a ltima parte da equao 4.7 fica igual unidade e no h inibio pelo substrato. Quando ocorre inibio pelo produto, uma equao semelhante foi proposta:

= mx

K I ,P S K S + S K I ,P + P

(4.8)

onde KI,P a constante de inibio pelo produto, com significado semelhante KI,S da equao 3.20. 4.3.3 Cintica de formao de produto

Os produtos de fermentao podem ser classificados conforme a relao entre a cintica de formao do produto e a gerao de energia pela clula. Conforme a Tabela 4.2 podemos classificar a cintica de formao de produtos durante a fermentao em trs tipos: - produtos diretamente associados formao de energia na clula (crescimento celular); - produtos indiretamente associados ao crescimento celular; - produtos no associados ao metabolismo energtico. Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico. Classe de produto Exemplos

Etanol, cido actico, cido glucnico, produtos diretamente associados formao de energia na clula acetona, butanol, cido ltico e outros produtos de fermentao anaerbica. produtos indiretamente associados formao de energia na clula produtos no associados ao metabolismo energtico Fonte: Doran, 1997. Aminocidos e derivados, cido ctrico, nucleotdeos. Penicilina, estreptomicina, vitaminas

4.3.4

Cintica de consumo de substrato pela clula

As clulas consomem substrato do meio externo e os canalizam para diferentes vias metablicas. Parte direcionada a crescimento e sntese de produtos, outra frao utilizada para gerar energia para a manuteno da atividade celular. A necessidade de substrato para manuteno depende do microrganismo e das condies de cultura. A velocidade especifica de consumo de substrato para manuteno da atividade celular conhecida como coeficiente de manuteno, mS, com dimenso (tempo)-1, geralmente expresso em (kg de substrato) (kg de biomassa)-1 (s)-1. Alguns exemplos de coeficiente de manuteno so mostrados na Tabela 4.3. A fora inica do meio de cultivo possui grande influncia no coeficiente de manuteno celular, pois so necessrias grandes quantidades de energia para manter os gradientes de concentrao atravs da membrana celular.



Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono. Microrganismo Saccharomyces cerevisiae Azotobacter vinelandii Klebsiella aerogenes Lactobacillus casei Aerobacter clocae Penicilium crysogenum Fonte: Doran, 1997 Condio de cultivo mS (kg glicose) (kg clulas)-1 (s)-1 anaerbia 0.036 anaerbia, 1,0M NaCl 0,360 1,5 fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,2 atm 0,15 fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,02 atm 2,88 anaerbica, limitao de triptofano, 2g.L-1 NH4Cl 3,69 anaerbica, limitao de triptofano, 4g.L-1 NH4Cl 0,135 anaerbia, limitao de glicose 0,094 aerbia 0,022



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Cultivo Contnuo

O cultivo contnuo caracteriza-se por possuir uma vazo de alimentao contnua e constante de meio de cultura dentro do biorreator, sendo que o volume de meio de cultura mantido constante dentro do biorreator atravs da retirada contnua de meio cultivado. Nesta operao o biorreator atinge a condio de estado-estacionrio ou regime permanente, no qual as variveis de processo permanecem constantes ao longo do tempo. Vantagens do processo contnuo em relao ao descontnuo: - aumento da produtividade do processo devido da reduo dos tempos mortos e no produtivos; - o meio de sada do biorreator uniforme, facilitando os processos de extrao e recuperao de produto; - manuteno das clulas num mesmo estado fisiolgico; - possibilidade de associao com outras operaes contnuas da linha de produo; - menor necessidade de mo-de-obra. Desvantagens do processo contnuo: - maior investimento inicial na planta; - possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas; - maior possibilidade de ocorrncia de contaminaes; - dificuldade de operao do estado estacionrio. 5.1 Formas de operao do sistema contnuo

O cultivo contnuo normalmente tm incio num cultivo em batelada. Aps o final de um processo batelada tpico, inicia-se a entrada e retirada de meio de cultivo, dando-se incio operao contnua propriamente dita. Uma vez iniciado o processo, ele ir convergir para o estado estacionrio com maior ou menor rapidez, dependendo das condies do processo.. O sistema contnuo extremamente verstil quanto as vrias possibilidades de operao: - contnuo em um nico estgio (um nico reator) com ou sem reciclo de clulas. - contnuo em mltiplos estgios (n reatores em srie): i. com uma nica alimentao (com ou sem reciclo de clulas); ii. com mltiplas alimentaes (com ou sem reciclo de clulas).

20 18 16 14 X, S (g/L) 12 10 8 6 4 2 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 diluio (1/h)

12 10 X Qx 6 4 2 0 Qx (g/(L.h) S 8

Figura 5.1: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L.



70 60 50 X, S (g/L) 40 X 30 20 10 0 0,0 0,5 1,0 1,5 diluio (1/h) 2,0 2,5 3,0 X Qx S S Qx

40 35 30 Qx (g/(Lh)) 25 20 15 10 5 0

Figura 5.2: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai diretamente do biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1.

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