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i

JULIANA SILVEIRA RUAS

METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA

PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

U-87MG E T98G EM CULTURA

CAMPINAS

2015

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

JULIANA SILVEIRA RUAS

“METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOMA U-87MG E T98G EM

CULTURA”

Orientador/Supervisor: Prof. Dr. Roger Frigerio Castilho

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, para a obtenção do título de Mestre em Ciências.

Este exemplar corresponde à versão final da

tese defendida pela aluna Juliana Silveira Ruas

e orientada pelo Prof. Dr. Roger Frigerio

Castilho.

Assinatura do Orientador

CAMPINAS

2015

vii

RESUMO

A maioria das células tumorais depende da glicólise para a ressíntese de ATP

durante um processo de rápida proliferação, mesmo que haja disponibilidade de

oxigênio para a transdução de energia mitocondrial (Efeito Warburg). O objetivo do

presente estudo foi avaliar o papel do metabolismo oxidativo mitocondrial na

proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. Quando as células

foram cultivadas na presença de oligomicina (um inibidor da ATP sintase) ou

antimicina A (um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons),

observou-se apenas uma inibição parcial da proliferação das células. Notadamente,

a incubação dessas células com ambos os inibidores causou uma inibição quase

completa na proliferação celular. Resultados semelhantes foram observados em

cultura primária de astrócitos, havendo uma queda na proliferação celular somente

quando ambos os inibidores mitocondriais estavam presentes. Medidas de consumo

de oxigênio indicaram que células de glioblastoma utilizam parcialmente a

fosforilação oxidativa para a ressíntese de ATP e apresentam uma respiração bem

acoplada. Quando se inibiu, nestas células, a fosforilação oxidativa do ADP com

oligomicina ou antimicina A, houve um pequeno aumento no consumo de glicose e

na produção de lactato. No entanto, o tratamento com ambos os inibidores

mitocondriais promoveu um menor consumo de glicose e produção de lactato, em

comparação com os efeitos que a antimicina A promoveu. Isso indica que a cadeia

transportadora de elétrons quando inibida pela presença de antimicina A, promove

um funcionamento inverso da ATP sintase, promovendo a hidrólise de ATP para que

haja um bombeamento de prótons para o espaço intermembranar mitocodrial. De

acordo com os resultados acima descritos, uma queda quase completa do potencial

de membrana mitocondrial foi observada apenas quando as células de glioblastoma

foram incubadas na presença de ambos os inibidores mitocondriais, oligomicina e

antimicina A. Quando a análise do ciclo celular foi realizada, observou-se uma

diminuição da percentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-

M quando tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com

antimicina A e oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição

viii

significativa nas fases G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Em conclusão, estes

resultados indicam que a rápida proliferação de células de glioblastoma depende da

existência do potencial de membrana mitocondrial, mas não da fosforilação oxidativa

ou do transporte de elétrons na cadeia respiratória.

Palavras-Chave: efeito Warburg, fosforilação oxidativa, glicólise, glioblastoma,

inibidores mitocondriais, potencial de membrana mitocondrial.

ix

ABSTRACT

Most tumor cells rely on glycolysis for ATP resynthesis during rapid

proliferation, despite the availability saturating levels of oxygen for mitochondrial

energy transduction (Warburg effect). The aim of the present study was to evaluate

the role of mitochondrial oxidative metabolism on proliferation of human glioblastoma

cells U-87MG and T98G. When cells were cultured in the presence of oligomycin

(ATP synthase inhibitor) or antimycin A (inhibitor of complex III of the electron

transport chain), we observed only a partial inhibition of cell proliferation. Remarkably,

incubation of cells with both inhibitors caused an almost complete inhibition of cell

proliferation. Similar results were observed in primary culture of astrocytes, with a

decrease in cell proliferation only when both mitochondrial inhibitors were present.

Oxygen consumption measurements indicated that glioma cells partially rely on

oxidative phosphorylation for ATP turnover and exhibit a well-coupled respiration. In

fact, shutting down mitochondrial ADP phosphorylation in these glioma cells with

either oligomycin or antimycin inhibitors slightly increased glucose consumption and

lactate release. However, the treatment with both mitochondrial inhibitors promoted

lower glucose consumption and lactate release as compared with the effects of

antimycin alone, which indicates that ATP synthase is operating reversely and thus

hydrolyzing ATP and pumping H+ out when the respiratory chain is inhibited by

antimycin. In agreement, an almost complete collapse of mitochondrial membrane

potential was only observed when the glioma cells were incubated in the presence of

both antimycin and oligomycin, but not of only antimycin. When cell cycle analyses

were performed in oligomycin-treated cells, a decrease in the percentage of cells in

G0-G1 phase and an increase in S and G2-M phases were observed. When cells

were treated with antimycin A or oligomycin plus antimycin A, it was observed a

significant decrease in G0-G1 and G2-M cell phases and an increase in S phase.

Overall, our results suggest that the rapid proliferation of glioblastoma cells is

dependent on the mitochondrial membrane potential, but not on oxidative

phosphorylation or electron transport in the respiratory chain.

x

Key words: Warburg effect, oxidative phosphorylation, glycolysis, glioblastoma,

mitochondrial inhibitors, mitochondrial membrane potential.

xi

SUMÁRIO

RESUMO....................................................................................................................... vii

ABSTRACT ................................................................................................................... ix

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. . 1

1.1 Metabolismo Energético ................................................................................................. . 1

1.2 Células Tumorais e o efeito Warburg ................................................................... . 7

1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa ................................................................ 10

1.4 Gliomas Humanos ................................................................................................ 12

2. OBJETIVOS. ................................................................................................................. 15

2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 15

2.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 15

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 16

3.1 Linhagens de células e reagentes químicos ........................................................ 16

3.2 Cultura de Células ................................................................................................ 17

3.3 Cultura Primária de Astrócitos.............................................................................. 17

3.4 Microfotografias .................................................................................................... 18

3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT ............................................................... 19

3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan ............................................... 20

3.7 Medida do consumo de O2 em células U-87MG e T98G intactas ........................ 20

3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato ..................................... 21

3.9 Estimativa do Potencial de Membrana Mitocondrial de Células Intactas ............. 22

xii

3.10 Análise do Ciclo Celular em células U-87MG e T98G ........................................ 23

3.11 Análise Estatística .............................................................................................. 25

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 26

4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na

proliferação de células de glioblastoma humano......... ............................................... .... 26

4.2 Efeitos da oligomicina e antimicina A no metabolismo energético das células de

glioma ........................................................................................................................ 32

4.3 Estimativa do potencial de membrana mitocondrial em células de glioblastoma

humano: Efeito de oligomicina e/ou antimicina A ....................................................... 38

4.4 Análise do ciclo celular em células de glioblastoma humano, U-87MG e T98G .. 45

4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na

proliferação de astrócitos primários em cultura .......................................................... 50

5. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 52

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 54

7. ANEXO .......................................................................................................................... 60

xiii

AGRADECIMENTOS

À Deus, por sempre direcionar meus passos e atender às minhas preces, me

dar forças e me reerguer quando precisei.

Ao meu orientador e amigo, Professor Dr. Roger Frigério Castilho, por toda

dedicação e paciência que teve para me ensinar e orientar ao longo de toda esta

jornada. Agradeço pela oportunidade de trabalhar sob sua orientação e pela

confiança depositada em mim. Ao Professor Dr. Anibal Eugênio Vercesi e sua

esposa, Drª Helena, que me indicou para trabalhar neste laboratório.

Aos funcionários Edilene de Souza Siqueira Santos, Roberto C. Stahl, Drª.

Márcia M. Fagian Pansani, pelos ensinamentos, companheirismo, amizade e pela

ajuda. Aos alunos do Laboratório de Bioenergética e do Laboratório de

Neurodegeneração Experimental, Fábio Rogério, Cláudia Navarro, Erika Rodrigues

da Silva, Kézia Moura, Evellyne Figueiroa, Genoefa Amalia Dal'bó, Ana Carolina

Marques, Hanan Chweih, Tiago Figueira, Juliana Ronchi, Raffaela Ignarro, Gustavo

Facchini e Estela Busanello. Aos ex-alunos do laboratório, Guilherme Michelini,

Daniela Melo, Ivan Cappelli, Vinícius Vercesi, Audrey de Moraes, Mary Aranda,

Luciana Luz, Rute Costa, Carina Malagutti, Felipe Gustavo Ravagnini, Silvia Elaine

Ferreira Melo, Sônia Ap. Gurgueira, Franco Rossato, e aos demais colegas, pelo

companheirismo, pelas discussões científicas e aos momentos de descontração.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão de bolsa para o desenvolvimento dessa dissertação.

Aos meus pais, Aparecida P. Da Silveira Ruas e Luiz Roberto Ruas, por terem

me dado suporte emocional, me motivado e apoiado em todos os momentos. Sou

eternamente grata a vocês. Meu amor por vocês é incondicional.

Ao meu querido namorado Thomas Samara, obrigada por todo o incentivo,

por cada sabádo e domingo que esteve ao meu lado fazendo companhia no

xiv

laboratório, por todo amor e dedicação que tem por mim. À minha querida sogra,

Sônia Samara, pelas conversas, pelos sorrisos, por toda sabedoria que me

acrescentou na vida. Aos meus cunhados amados Cammys, Carol, Tatá, Teté e

Patrick. Ao Luiz Arthur, Rodrigo, Victor Hugo e Dani.

À minha amada irmã, Roberta Silveira Ruas, e a meu cunhado, Kaue Dias de

Souza, pelas risadas e conversas que me proporcionaram. Por sempre me

defenderem e me apoiarem emocionalmente.

À minha avó Lais. Aos meus tios, Maria Auxiliadora, Teresa Cristina, Sueli,

Sílvia, Emílo, Bernardo, Álvaro. Aos meus primos, Vivian, Kika, Carol, Samira,

Emilinho, Jorginho, Léo, Lucas, Mateus. Aos agregados Mateus Dias, Marcelo,

Ricardo, Juscelino, Julia, Grazi. Ao pessoal de São Paulo, tia Eneida, tio Fábio,

Mané, Zé, Adriana, Rafa e Léo. A toda minha família.

Aos meus amigos, Fabio Zatta, Thais Alves, Giovani Felizardo, Augusto

Sancesário, Juliana Camargo, Marindia Freitas, Ana Carolina Arruda, Carol

Magalhães, Fer Pereira, Alex Oliveira, Fernanda Bonato, Alexandre Calix, Marcelo

Castro Lígia Carneiro, Lucia Devito, Romualdo, Rafaela Mendonça, Mateus Vidigal,

pelos momentos de descontração, pela amizade sincera, pela disposição em ouvir e

por todo apoio e confiança.

Aos meus queridos avós Teresinha, Miguel e Fernando. À minha madrinha

Cibele e ao tio Geraldo. Sinto muita falta de vocês. E ao colega Paolo La Guardia (In

Memoriam).

E àqueles que me ajudaram e torceram por mim ao longo desses anos. Muito

obrigada!

xv

Lista de Figuras

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para

o piruvato Pág 03

Figura 2 Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação

oxidativa mitocondrial Pág 04

Figura 3 Esquema exemplificando o complexo III da cadeia

transportadora de elétrons Pág 06

Figura 4 Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial Pág 07

Figura 5 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A na proliferação

de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 27

Figura 6 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de

células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 28

Figura 7 Microfotografias de células U-87MG e T98G mantidas em

cultura durante 5 dias: efeito de oligomicina e/ou antimicina A Pág 30

Figura 8 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A no consumo de

oxigênio de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 34

Figura 9

Avaliação do consumo de glicose e produção de lactato por

células de glioblastoma humano U-87MG e T98G: Efeito de

oligomicina e antimicina A

Pág 36

Figura 10

Efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no

potencial de membrana mitocondrial estimado em

suspensões de células intactas de glioblastoma humano U-

87MG e T98G

Pág 39

Figura 11

Efeito da incubação por 24 horas com oligomicina e/ou

antimicina A no potencial de membrana mitocondrial de

células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G

Pág 42

Figura 12

Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por

um citômetro de fluxo quando se quer avaliar a intérfase do

ciclo celular.

Pág 48

Figura 13 Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das

células de glioblastomas U-87MG e T98G Pág 49

Figura 14 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de

astrócitos de ratos neonatos Pág 51

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela I Compostos que interferem na fosforilação oxidativa Pág 06

Tabela II Variação dos locis analisados pelo método de repetição de

arranjos curtos (STR) Pág 14

Tabela III

Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada

tratamento em células de glioblastoma humano U-87MG

relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular

Pág 47

Tabela IV

Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada

tratamento em células de glioblastoma humano T98G relativas

a cada fase da intérfase no ciclo celular

Pág 47

xix

LISTA DE ABREVIATURAS

AA Antimicina A

ADP Adenosina difosfato

ANOVA

atm

Análise de variância simples

Atmosfera, unidade de pressão

ATP Adenosina trifosfato

A.U. Unidades arbitrárias (Arbitrary units)

Acetil-CoA Acetil coenzima A

BSA

Ca2+

Albumina soro bovino

Íon cálcio

CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CDKN2C Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C

C6H12O6 Molécula de glicose

CO2 Dióxido de carbono

Cyt c Citocromo c

DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s médium)

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

DNAse Deoxiribonuclease I

DPI Cloreto difenileneiodonio

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGFR Receptor de fator de crescimento epidérmico

FADH2 Flavina adenina dinucleotídeo reduzido

FCCP Carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona

FH Fumarato hidrase

GOD Glicose oxidase

H+ Cátion hidrogênio (próton)

H2O Molécula de água

xx

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HCl Ácido clorídrico

HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2’-etanosulfônico

HIF1 Hypoxia-Inducible Factor 1

HIF1 α Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit α

HIF1 β Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit β

HKI Hexoquinase 1

HKII

IDH2

Hexoquinase 2

Isocitrato desidrogenase 2

KCl Cloreto de potássio

LDH-A Lactato desidrogenase

MCU Canal uniporter mitocondrial (Mitochondrial uniporter channel)

MTT Brometo de azul tiazoil tetrazólio

NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma oxidada

NADH

NADP

NADP+

Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma reduzida

Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato

Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma oxidada

NADPH

NNT

Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma reduzida

Transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida

O2 Oxigênio molecular

O2.- Radical ânion superóxido

Oligo Oligomicina

OXPHOS Fosforilação oxidativa

PBS Tampão fosfato salina

PDH Piruvato desidrogenase

Pi Fosfato inorgânico

PI Iodeto de propídeo

PKM2 Piruvato quinase, isoforma M2

PTEN Phosphatase and tensin homolog

xxi

RNA

RNAse

Ácido ribonucleico

Ribonuclease

rpm Rotações por minuto

SDH Succinato desidrogenase

SDS

SNC

SNP

Dodecil sulfato de sódio

Sistema nervoso central

Sistema nervoso periférico

SRC Coativador do receptor esteroide (Steroid receptor coactivator)

STR

TIM

Repetição de arranjos curtos (short tandem repeat)

Translocase de membrana mitocondrial interna

TMRM

TOM

Tetrametilrodamina metil éster

Translocase de membrana mitocondrial interna

TPB- Tetrafenilborato de sódio

UQ Coenzima Q

UQH2 Coenzima Q reduzida

Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

A homeostase bioquímica celular depende de processos que requerem alta

demanda energética, suprida pela disponibilidade de ATP. A contínua ressíntese de

ATP pode ser provida tanto pela glicólise como pela fosforilação oxidativa

(OXPHOS), processo dependente da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial

(NELSON, COX, 2012). Quando a célula está em hipóxia, a geração de ATP é

dependente da glicólise (NELSON, COX, 2012).

Nesta Introdução serão descritos os mecanismos de obtenção de ATP por

células normais e as alterações metabólicas mais comumente observadas em

células tumorais. As implicações destas alterações para processos de proliferação

celular e tumorigênese também serão apresentadas.

1.1 Metabolismo Energético

O metabolismo energético de uma célula depende de processos capazes de

promover a ressíntese de ATP. A forma como uma célula em normóxia obtém este

ATP, envolve os processos da glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa.

A glicólise é uma via central quase universal de catabolismo da glicose, sendo

a via com o maior fluxo de carbono na maioria das células. Na glicólise uma molécula

de glicose, contendo seis carbonos, é degradada por uma série de reações

catalisadas por enzimas formando duas moléculas de piruvato, contendo três

carbonos cada. Durante as reações sequenciais da glicólise, parte da energia livre

liberada a partir da glicose é conservada na forma de ATP e NADH. A glicólise ocorre

em dez reações, sendo as cinco primeiras consideradas a fase preparatória e as

outras cinco reações a fase de pagamento (LODISH et al., 2005; NELSON, COX,

2012).

A fase preparatória da glicólise é caracterizada pela fosforilação da glicose a

glicose-6-fosfato pela enzima hexoquinase e a conversão deste intermediário através

Introdução

2

de mais quatro reações à gliceraldeído-3-fosfato (aldose) mais dihidroxicetona

(cetose). Nas reações desta fase, duas fosforilações são realizadas com gasto de

ATP. Já na fase de pagamento, a célula recupera o gasto de ATP que ocorreu na

fase preparatória. A fase de pagamento consiste em uma sequência de cinco

reações com a conversão do gliceraldeído-3-fosfato em piruvato, produto final da

glicólise. Nestas reações ocorre a formação de ATP e NADH. Para cada molécula de

glicose metabolizada são consumidas duas de ATP na fase preparatória e quatro

moléculas de ATP são produzidas na fase de pagamento, tendo um resultado líquido

de duas moléculas de ATP para cada molécula de glicose convertida a piruvato

(NELSON, COX, 2012).

O piruvato formado pela glicólise pode ter dois destinos (Fig. 1). Na presença

de oxigênio, este piruvato é majoritariamente utilizado pelo ciclo do ácido cítrico, que

provê substratos para a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial. Quando em

situação de hipóxia, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase com a

oxidação de uma molécula de NADH à NAD+. O NAD+ é essencial para a

continuação da fase de pagamento da glicólise. Em hipóxia, o NADH não pode ser

reoxidado a NAD+ pelas mitocôndrias (NELSON, COX, 2012).

Quando na presença de oxigênio, o complexo da piruvato desidrogenase

(PDH), localizado na matriz mitocondrial, promove a reação de descarboxilação

oxidativa do piruvato, com a redução de uma molécula de NAD+. Essa reação

consiste na remoção do grupo carboxila do piruvato na forma de uma molécula de

CO2. Os dois carbonos remanescentes tornam-se o grupo acetil do acetil-CoA. O

acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico a medida que a enzima citrato sintase

catalisa sua condensação com o oxaloacetato para a formação de citrato. Em sete

reações em sequência, incluindo duas descarboxilações, o ciclo do ácido cítrico

converte o citrato em oxaloacetato e libera duas moléculas de CO2. A maior parte da

energia de oxidação é temporariamente retida nas coenzimas presentes na matriz

mitocondrial NADH e FADH2, formadas em quatro reações no ciclo do ácido cítrico.

O NADH e FADH2 são oxidados, respectivamente, nos complexos I e II da cadeia

respiratória e os elétrons são transferidos através dos complexos respiratórios para

Introdução

3

O2. O transporte de elétrons está acoplado ao transporte de prótons para o espaço

intermembranas nos complexos I, III e IV, gerando o gradiente eletroquímico de H+

(NICHOLLS, BUDD, 2000; NASSEH et al., 2001; NELSON, COX, 2012).

Glicose

2 Piruvato

2 ATP

2 ADP

4 ADP 2 NAD

+

4 ATP 2 NADH

Fase Preparatória

Fase Pagamento

2 Lactato 2 NAD+

2 FADH2 6 NADH

4 CO2

O2 Hipóxia

Glicólise 2 gliceraldeído

3-fosfato

2 Acetil-CoA 2 CO2

2 NADH

Ciclo do ácido cítrico

Fig. 1 – Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para o piruvato.

Na membrana mitocondrial interna estão presentes os complexos respiratórios

multienzimáticos (I, II, III e IV); além da ATP sintase (também conhecida como

complexo V) e dos transportadores de elétrons, coenzima Q (UQ) e citocromo c

Introdução

4

conforme apresentados na figura 2 (NICHOLLS, BUDD, 2000; FERREIRA et al.,

2008; NELSON, COX, 2012).

Fig. 2 – Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa mitocondrial (adaptado NELSON, COX, 2012).

Na cadeia transportadora de elétrons, o NADH transfere seus elétrons para a

coenzima Q através do complexo I e o complexo II promove a transferência de

elétrons a partir do FADH2 e succinato para a coenzima Q. Na sequência, o

complexo III transfere elétrons da coenzima Q reduzida (UQH2) para o citocromo c e

então, no complexo IV, os elétrons do citocromo c são transferidos para o oxigênio

molecular, formando água (H2O). É importante ressaltar que à medida que ocorre a

passagem dos elétrons pelos complexos I, III e IV, há o movimento unidirecional de

prótons da matriz para o espaço intermembranar mitocondrial. Portanto um gradiente

eletroquímico de prótons é criado através da membrana mitocondrial interna

(carregada negativamente) (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).

Por existir um potencial eletroquímico mais positivo no espaço intermembranar

quando comparado com a matriz mitocondrial, esta acaba por atrair prótons. Os

Introdução

5

prótons passam pela ATP sintase (Fig. 2) e quando isso ocorre esta muda sua

conformação unindo um ADP à um fosfato (Pi), produzindo ATP (NICHOLLS, BUDD,

2000).

Portanto, a fosforilação oxidativa é o processo final do metabolismo

envolvendo a produção de energia na forma de ATP, ocorrendo apenas na presença

de oxigênio molecular. Estudos recentes mostram uma produção de 30 a 32

moléculas de ATP a partir de uma de glicose, como apresentado abaixo na reação

final de obtenção de ATP pela fosforilação oxidativa a partir de uma molécula de

glicose. Qualquer disfunção da glicólise ou da cadeia transportadora de elétrons

mitocondrial influencia diretamente este processo (FERREIRA et al., 2008; MOTTA,

2011; NELSON, COX, 2012).

Inibidores mitocondriais são comumente utilizados para estudar a função

mitocondrial e o papel no metabolismo energético de cada complexo multienzimático

da cadeia transportadora de elétrons (NICHOLLS, BUDD, 2000). Na tabela 1 estão

representados alguns destes inibidores e o modo como atuam nestes complexos.

Dentre estes compostos, ressaltamos a antimicina A, oligomicina e o FCCP, que

foram utilizados para o presente trabalho.

A antimicina é um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de

elétrons, este complexo é um dímero com dois monômeros idênticos, como

apresentado na figura 3. Seus componentes citocromo c1 e a proteína ferro enxofre

de Rieske podem interagir com o citocromo c. Este complexo possui dois sítios de

ligação para a coenzima Q, QN e QP. A antimicina A liga-se ao sítio QN, impedindo o

fluxo de elétrons do heme bH para a coenzima Q (NELSON, COX, 2012).

C6H12O6 + 6 O2 + 30 ADP + 30 Pi 6 CO2 + 6 H2O + 30 ATP

Introdução

6

Fig. 3 – Esquema ilustrativo do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (NELSON, COX, 2012).

Tipo de Interferência

Composto Alvo / Modo de ação

Inibição da transferência de

elétrons

Rotenona Impedem a transferência de elétrons do centro Fe-S (complexo I) para a coenzima Q Piericidina A

Mixotiazol Impede o fluxo de elétrons de QH2 para a

proteína ferro enxofre de Rieske

Antimicina A Bloqueia a transferência de elétrons do

citocromo b (complexo III) para o citocromo c

Cianeto Inibe a citocromo c oxidase (complexo IV)

Inibição da ATP sintase

Aurovertina B Inibe a subunidade F1

Oligomicina Inibem as subunidades Fo e CFo

Venturicidina

Desacoplamento da transferência de elétrons com

a fosforilação

FCCP

Carreadores hidrofóbicos de prótons 2,4-Dinitrofenol

Inibição da troca

ATP-ADP Carboxiatractilosídeo

Inibe a translocador de nucleotídeos de

adenina

Tabela I – Compostos que interferem na fosforilação oxidativa (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).

Introdução

7

A ATP sintase (Fig. 4) possui um domínio periférico F1 e uma parte integral Fo,

acoplada a membrana interna mitocondrial. À medida que os prótons fluem do

espaço intermembranas para a matriz mitocondrial através de Fo, o cilindro e a haste

giram, e as subunidades β de F1 mudam de conformação à medida que as

subunidades ɤ se associam com cada uma delas (KAGAWA, RACKER, 1996). Com

isso, uma molécula de ADP é unida com uma de Pi, formando o ATP. Estima-se que

para cada três prótons transportados para a matriz mitocondrial pela ATP sintase,

uma molécula de ATP é formada. Notadamente, a ATP sintase também pode

funcionar de forma inversa, hidrolisando ATP e promovendo o transporte de prótons

da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas (NICHOLLS, BUDD, 2000).

Fig. 4 – Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial (NELSON, COX, 2012).

1.2 Células Tumorais e o Efeito Warburg

Células tumorais apresentam uma organização bioenergética distinta quando

comparadas a células normais. Diferentemente de células normais, onde a maior

parte do ATP obtido é proveniente da fosforilação oxidativa mitocondrial, em células

tumorais o ATP é proveniente majoritariamente da glicólise, mesmo na presença de

oxigênio molecular. Ou seja, células tumorais apresentam predominância da glicólise

e elevada produção de lactato no citosol quando comparadas com a baixa taxa

glicolítica e oxidação do piruvato que ocorre na maioria das células normais. Esse

fenômeno foi observado e caracterizado primeiramente por Otto Warburg há nove

Matriz Mitocondrial

Introdução

8

décadas, recebendo o nome de “efeito Warburg” (WARBURG, 1925; WARBURG et

al., 1927; WARBURG, 1956; HAO et al., 2010; KOPPENOL et al., 2011).

Nos primeiros estudos de Warburg, ele observou um rápido consumo de

oxigênio concomitantemente a uma rápida proliferação celular, levando-o a postular

que tecidos tumorais utilizavam mais oxigênio molecular quando comparados com

tecidos normais. Posteriormente, experimentos de consumo de oxigênio em fígados

de ratos comprometidos por células tumorais foram realizados e observou-se que

estes não consumiam mais oxigênio que tecidos normais, mas que na presença de

O2 o tecido tumoral produzia lactato, o que não se observava em tecidos normais.

Isso indica que em tecidos tumorais a produção de lactato predomina sobre a

entrada de piruvato no ciclo do ácido cítrico, o que daria início à fosforilação oxidativa

(KOPPENOL et al., 2011).

Tecidos normais tendem a consumir menos glicose na presença de O2 do que

o verificado em uma situação de hipóxia, isso porque o rendimento energético em

ATP de uma molécula de glicose é muito maior em meio aeróbico. Já os tecidos que

apresentam células tumorais mostram uma produção de lactato até 100 vezes maior

na presença de oxigênio molecular. Dessa forma, aproximadamente 60% da glicose

consumida pelos tecidos tumorais é convertida a lactato. Com todas essas

indicações, Otto Warburg propôs que o processo de respiração mitocondrial estaria

danificado em células tumorais (KOPPENOL et al., 2011; WU, ZHAO, 2013).

Contudo, estudos recentes têm sugerido que células tumorais apresentam

mitocôndrias funcionais e que a ocorrência do efeito Warburg provavelmente está

associada a uma condição que permite maior síntese de biomassa por estas células

(VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011; KOPPENOL et al.,

2011).

Hipóteses vêm sendo propostas para explicar a ocorrência do efeito Warburg

como mutações em proteínas responsáveis pela regulação da via glicolítica e

mutações genéticas que afetam o funcionamento de enzimas do ciclo do ácido cítrico

como a isocitrato desidrogenase 2 (IDH2), fumarato hidrase (FH) e a succinato

desidrogenase (SDH) (WU, ZHAO, 2013). Portanto, estas alterações enzimáticas

Introdução

9

levariam a uma desregulação no metabolismo oxidativo da glicose em células

tumorais.

Os fatores c-MYC e Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) também são críticos

para a tumorigênese em um grande número de tumores. O c-MYC leva à indução da

proliferação celular com consequente aumento em seu metabolismo. Já o HIF1 está

envolvido na adaptação de células quando estas se encontram em microambientes

em hipóxia, levando à ativação da glicólise (DANG, 2007). O HIF1 compreende um

heterodímero constituído pelas subunidades HIF1α e HIF1β, ativando genes

envolvidos na glicólise, contribuindo diretamente com o efeito Warburg.

Circunstâncias em que o c-MYC e o HIF1 são aumentados na presença de oxigênio

molecular, resultam em inibição do efeito Pasteur (menor consumo de glicose na

presença de O2) e indução do efeito Warburg em células tumorais (KIM et al., 2006;

SIMON, 2006). Portanto, estes fatores aumentam a expressão de enzimas que irão

favorecer a ocorrência da glicólise, como piruvato quinase M2 (PKM2), lactato

desidrogenase (LDH-A), e hexoquinase 2 (HKII) (DANG, 2007). Estudos recentes

indicaram evidências que ligam a ocorrência da glicólise aeróbica em células

tumorais pela capacidade do steroid receptor coactivator (SRC) em fosforilar enzimas

glicolíticas. O SRC ativa, posteriormente, o gene HIF1 que irá induzir a glicólise

(KOPPENOL et al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).

A piruvato quinase 2 (PKM2), enzima responsável pela conversão do

fosfoenolpiruvato a piruvato está aumentada em células tumorais (MAZUREK et al.,

2005). Sendo assim, ela permite uma maior captação e utilização da glicose e

produção de lactato. Além disso, ela aumenta a transcrição do HIF1, estimulando

ainda mais a glicólise (BAYLEY, DEVILEE, 2012; YANG et al., 2012). Já se sabe que

ativadores da transcrição da PKM2, como o receptor de fator de crescimento

epidérmico (EGFR), estão alterados em células tumorais, explicando o aumento

desregulado desta enzima (PARSONS et al., 2008; YANG et al., 2012).

A lactato desidrogenase (LDH-A) é ativada pelo HIF1 e é a enzima

responsável pela conversão do piruvato à lactato concomitante com a oxidação do

NADH a NAD+, restabelecendo o potencial redutor para a ocorrência da glicólise. É

Introdução

10

proposto a importância de um ambiente ácido, promovido pelo lactato, favorecendo a

invasão e proliferação de células tumorais para outros tecidos (SHIM et al., 1997;

KOPPENOL et al, 2011; WOLF et al., 2011).

A hexoquinase 2 (HKII) é uma enzima glicolítica chave e geralmente está

desregulada em células tumorais. Normalmente, encontra-se ligada à membrana

mitocondrial externa, tendo acesso a um maior suprimento de ATP, com

consequente favorecimento a sua maior atividade em células tumorais. Cérebros

normais ou gliomas de baixo grau expressam predominantemente a HKI; por outro

lado, gliomas de alto grau de malignidade hiperexpressam a HKII. Verificou-se que

quando ocorre a deleção da HKII, as células são capazes de recuperar seu

metabolismo glicolítico normal e aumentar a sensibilidade à morte celular, sendo

assim, a HKII é apontada como uma possível resistência para a apoptose nessas

células (GERSHON et al., 2013). Além disso, quando a HKII é inativada, ocorre a

inibição da glicólise aeróbica, ou seja, a inibição do metabolismo predominantemente

glicolítico característico de uma célula tumoral, favorecendo o metabolismo oxidativo

normal. Observa-se ainda um aumento de proteínas da cadeia transportadora de

elétrons e o aumento do consumo de oxigênio após a inativação da HKII (WOLF et

al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).

1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa

Em células normais uma proliferação descontrolada não ocorre, pois estas

células normalmente não utilizam todos os nutrientes presentes disponíveis em seus

microambientes; a não ser que sejam estimuladas por fatores de crescimento.

Células tumorais possuem mutações gênicas que alteram determinados receptores

que iniciam a via de sinalização para a duplicação celular. Algumas destas

sinalizações ativam a captação e o metabolismo de nutrientes, que promovem a

sobrevivência e a proliferação celular. Como descrito anteriormente, células tumorais

convertem piruvato à lactato mesmo na presença de oxigênio molecular, o que nos

indica que o metabolismo glicolítico pode providenciar energia suficiente para a

Introdução

11

proliferação celular (VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).

Ainda como característica das células que utilizam a glicólise aeróbica, estas

apresentam uma elevada razão de ATP/ADP e NADH/NAD+ (CHRISTOFK et al.,

2008; DEBERARDINIS et al., 2008).

Para que ocorra o processo mitótico de uma célula, é necessário que todo o

conteúdo celular seja replicado. Sendo assim, nucleotídeos, aminoácidos e lipídeos

são altamente necessários para esse processo. Apesar da hidrólise do ATP

proporcionar energia livre para reações bioquímicas responsáveis pela formação da

biomassa celular, este processo requer outros intermediários metabólicos. A saber, a

síntese do palmitato, um importante constituinte da membrana celular, requer 7

moléculas de ATP, 16 carbonos provenientes de 8 moléculas de acetil-CoA e 28

elétrons de 14 moléculas de NADPH. Da mesma forma, a síntese de aminoácidos e

nucleotídeos consome mais carbono e NADPH que o próprio ATP. Adicionalmente,

para a produção de uma cadeia de ácidos graxos contendo 16 carbonos, uma

molécula de glicose proporciona 5 vezes mais ATP que o necessário, enquanto é

necessário 7 moléculas de glicose para a produção necessária de NADPH (VANDER

HAIDEN et al., 2009, LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).

A glicose, por si só, é capaz de fornecer todo o carbono, nitrogênio e energia

livre necessária para suportar o crescimento e divisão celular. Direcionar toda glicose

para a fosforilação oxidativa mitocondrial para maximizar a produção de ATP vai

contra as necessidades do processo de proliferação celular. Parte da glicose deve

ser desviada para percursores macromoleculares, tais como acetil-CoA para a

produção de ácidos graxos, intermediários glicolíticos para a síntese de aminoácidos

não essenciais, e ribose para a produção de nucleotídeos. Isso pode explicar a

vantagem do efeito Warburg, onde até 90% do piruvato, proveniente da glicose, é

convertido a lactato (DEBERARDINIS et al., 2007; VANDER HAIDEN et al., 2009;

LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).

Introdução

12

1.4 Gliomas Humanos

Os gliomas são neoplasias tendo origem a partir de células gliais no sistema

nervoso. Os gliomas podem ser originados de astrócitos, oligodendrócitos ou células

ependimárias (SILVA et al., 2010). As células da glia são células não neuronais do

sistema nervoso que proporcionam suporte e nutrição aos neurônios. Os neurônios

são responsáveis pela propagação de impulsos nervosos, já as células da glia

desempenham inúmeras funções. As células da glia são um conjunto de vários tipos

celulares, dentre estes microgliócitos, células ependimárias, astrócitos,

oligodendrócitos, e células de Schwann (MACHADO, 2006).

Os microgliócitos são células que representam o sistema mononuclear

fagocitário no sistema nervoso central (SNC), ou seja, eles são os macrófagos do

tecido nervoso, participando assim do processo de inflamação e da reparação desse

tecido. Os microgliócitos também secretam diversas citocinas, as quais regulam o

processo imune e removem os restos celulares que surgem nas lesões do SNC. As

células ependimárias revestem os ventrículos cerebrais e o canal medular e são

responsáveis pela formação do líquido cefalorraquidiano. Os astrócitos estão

relacionados à homeostase metabólica e iônica do SNC, desempenhando papéis

como o funcionamento e formação das sinapses, nutrição dos neurônios, regulação

da concentração de diversas substâncias com potencial para interferir nas funções

neuronais, liberação de neurotransmissores e participação na barreira

hematoencefálica. Dentre estas funções, se destacam as de sustentação e nutrição

dos neurônios. As extremidades dos prolongamentos dos astrócitos circundam os

vasos sanguíneos e através deles, os nutrientes são levados até os neurônios. Os

oligodendrócitos são os responsáveis pela formação da mielina a partir de lipídeos e

proteínas. A mielina envolve os neurônios do sistema nervoso central fornecendo

uma proteção isolante aos neurônios. As células de Schwann possuem a mesma

função dos oligondendrócitos, diferenciando que as bainhas de mielina são

produzidas em volta dos axônios do sistema nervoso periférico (SNP) (LODISH et al.,

2005).

Introdução

13

Os gliomas são divididos em várias categorias de acordo com as células que

os originaram. Os mais frequentes são os astrocitomas, oligodendrogliomas e

ependimonas. De acordo com a morfologia e histologia, os astrocitomas são

subdivididos em quatro grupos de acordo com seu grau de malignidade. Os

astrocitomas pilocíticos, ou de grau I, apresentam um crescimento lento, limites

morfológicos bem definidos e geralmente estão restritos a uma determinada região

do SNC. Já o astrocitoma de baixo grau, ou grau II, é um tipo de astrocitoma de

crescimento relativamente lento, porém mais rápido do que o astrocitoma pilocítico.

Pode ou não invadir o tecido cerebral normal, no entanto tende a reaparecer após o

tratamento. Este reaparecimento pode ocorrer em um grau de malignidade maior. O

astrocitoma anaplásico, ou de grau III, cresce mais rapidamente do que o

astrocitoma de grau II, tendo uma tendência a invadir o tecido cerebral normal e

também de recidivar após o tratamento. O astrocitoma de grau IV, conhecido como

glioblastoma multiforme, é o tipo mais maligno e com o crescimento mais rápido de

todos os astrocitomas. Sob um microscópio, vários tipos de células diferentes podem

ser observados neste tumor, incluindo astrócitos e oligodendrócitos. Áreas de

necrose tumoral também são frequentemente observadas no centro do tumor. O

glioblastoma multiforme tende a crescer e se espalhar rapidamente, invadindo o

tecido normal do cérebro. A conduta no que diz respeito ao seu tratamento ainda é

bastante ineficaz apresentando um prognóstico, na maioria das vezes, bem ruim,

com uma expectativa média de vida de aproximadamente 14 meses a partir do

momento do diagnóstico (LOUIS et al., 2007; INSTITUTO ONCOGUIA, 2012).

Existem várias linhagens celulares imortalizadas de gliomas que são utilizadas

no estudo destas neoplasias malignas que acometem o sistema nervoso central. A

linhagem U-87MG é uma linhagem imortalizada de glioblastoma multiforme humano

que possui os genes mutantes CDKN2A, PTEN e CDKN2C. A segunda linhagem

celular utilizada neste estudo, T98G, também é derivada de um glioblastoma

multiforme humano. A diferença no cariótipo destas células encontra-se descrita a

seguir na tabela II e foi estabelecida pelo método de análise de repetição de arranjos

curtos (STR, short tandem repeat). A análise de repetição de arranjos curtos é uma

Introdução

14

técnica de análise para avaliar regiões específicas no DNA. Aproximadamente 99%

do DNA de um ser humano é idêntico ao DNA de qualquer outro ser humano. No

entanto, regiões polimórficas do DNA podem variar de pessoa para pessoa. Um tipo

de polimorfismo do DNA são as repetições de arranjos curtos. Portanto, a análise de

STR verifica a variação do número de repetições em cada região polimórfica, sendo

assim, a variação nas repetições distingue um perfil de DNA entre os seres humanos

(ATCC, 2014).

Loci dos

polimorfismos

Análise de Repetição de Arranjos Curtos - STR

U-87MG T98G

Amelogenin X X,Y

CSF1PO 10,11 10,12

D13S317 8,11 13

D7S820 8,9 9,10

D5S818 11,12 10,12

D16S539 12 13

vWA 15,17 17,20

THO1 9.3 7, 9.3

TPOX 8 8

Tabela II – Variação dos locis analisados pelo método de repetição de arranjos curtos (STR) (fonte ATCC.org, 2014).

As linhagens celulares U-87MG e T98G foram utilizadas nos protocolos

experimentais no presente trabalho. Astrócitos de ratos neonatos mantidos em

cultura primária foram utilizados em um protocolo experimental com o objetivo de se

estabelecer uma comparação com uma célula proliferativa, mas não tumoral.

Objetivos

15

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

As células tumorais utilizam quase que exclusivamente a via glicolítica para a

obtenção de ATP, ao contrário da maioria das células não tumorais que utilizam a

fosforilação oxidativa, uma via muito mais eficiente para a obtenção de ATP. Este

trabalho objetivou uma melhor compreensão da bioenergética mitocondrial no

processo de proliferação de células tumorais.

2.2 Objetivos específicos

a) Avaliar a importância da ATP sintase e da cadeia transportadora de

elétrons na proliferação de células de glioblastoma e astrocíticas, conduzindo

experimentos na ausência e presença de inibidores destes sistemas.

b) Correlacionar o efeito na proliferação celular de inibidores da ATP

sintase e da cadeia transportadora de elétrons com alterações no metabolismo

energético celular e do potencial de membrana mitocondrial.

Materiais e Métodos

16

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Linhagens de células e reagentes químicos

A maioria dos compostos químicos, incluindo ácido N-2-hidroxietilpiperazina-

N’-2’-etanosulfônico (HEPES), antimicina A, azul de tripan, brometo de azul tiazoil

tetrazólio (MTT), carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP), cloreto

difenileneiodonio (DPI), dimetilsulfóxido (DMSO), oligomicina, tetrafenilborato de

sódio (TPB-) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Iodeto de

propídeo (PI) e tetrametilrodamina metil éster (TMRM) foram obtidos da Invitrogen

(Carlsbad, CA, USA). Os meios de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium

(DMEM) contendo 2 g/L e 4,5 g/L de glicose, solução de tripsina/EDTA 250 mg %,

tampão fosfato salina (PBS), soro fetal bovino e soro equino foram obtidos da

Vitrocell (Campinas, SP, Brasil).

As soluções de antimicina A, oligomicina, TMRM foram preparadas em DMSO.

As soluções de oligomicina e antimicina A foram preparadas em uma concentração

de 4 mg/mL e 4 mM respectivamente, filtradas e utilizadas como soluções estoques.

Para possibilitar a adição simultânea destes dois inibidores mitocondriais mantendo-

se a mesma quantidade de DMSO, uma solução estoque foi preparada com ambos

inibidores nas concentrações mencionadas acima.

As células utilizadas foram de linhagens derivadas de glioblastoma multiforme

humano (grau IV), U-87MG e T98G. As linhagens U-87MG e T98G foram adquiridas

da ATCC (Manassas, EUA). A linhagem T98G também nos foi cedida pela Profa Dra

Suely Kazue Nagahashi Marie (USP, São Paulo). As células foram armazenadas em

nitrogênio líquido na sala de cultura do laboratório de Bioenergética da FCM, prédio

FCM 15, UNICAMP.


17

3.2 Cultura de Células

As células U-87MG e T98G foram continuamente mantidas a 37°C em

atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar, em frascos de cultura de 150

cm2 de superfície e em meio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (2 g/L de

glicose), suplementado com soro fetal bovino 10% e antibiótico (100 U/mL de

penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A manutenção das células foi realizada a

cada dois ou três dias por meio da passagem das células (aproximadamente 50.000

células/cm2) para novas garrafas. As células aderidas foram previamente lavadas

com tampão fosfato salina (PBS) e em seguida foi utilizada uma solução de

tripsina/EDTA (250 mg %) a 37°C para dissociar as células da superfície. A ação da

tripsina foi inativada pela adição de meio DMEM suplementado. A passagem das

células para novas garrafas foi realizada após a centrifugação da suspensão a 2.800

g por 5 min e ressuspensão do sedimento resultante em 6 mL de DMEM 2 g/L

glicose suplementado. Os experimentos foram realizados quando as células estavam

entre a 4ª e a 20ª passagem.

3.3 Cultura Primária de Astrócitos

Cultura primária de astrócitos foi obtida a partir de 10 a 12 ratos Wistar com

idade de 2 dias, utilizando o método de MECHA et al. (2011), com modificações.

Primeiramente os neonatos foram higienizados com etanol 70% e em seguida

decapitados dentro de uma cabine de fluxo laminar horizontal. Utilizando materiais

esterilizados, os cérebros foram dissecados em meio DMEM 4,5 g/L de glicose, sem

vermelho de fenol, suplementado com antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100

μg/mL de estreptomicina). O cerebelo, tronco encefálico e bulbos foram descartados,

assim como as meninges, com auxílio de uma lupa. Em seguida, o tecido foi

picotado, tratado com tripsina 30 μM e incubado a 37ºC em atmosfera umidificada

com 5% de CO2 e 95% de ar para dissociação. Após 20 min, DMEM 4,5 g/L de

glicose, suplementado com 10% de soro eqüino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico

(100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) foi adicionado para


18

inativação da tripsina na presença de DNAse 1 mg/mL. O tecido foi então dissociado

mecanicamente com pipeta sorológica previamente revestida com soro fetal bovino,

e o homogenato celular resultante foi filtrado em malha de nylon de 100 μm (BD

Falcon Cell Strainer) para retirada de resíduos celulares. Na sequência, a suspensão

foi centrifugada a 1.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e a

suspensão celular foi novamente centrifugada em solução de BSA 4% para impedir

contaminação por bactérias. O pellet foi ressuspendido em DMEM 4,5 g/L de glicose,

suplementado com 10% de soro equino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico (100

U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A seguir, o pellet foi disposto e

mantido em 2 ou 3 garrafas com superfície de 75 cm2 próprias para a aderência de

culturas celulares primárias. Após três dias, as garrafas foram mantidas sob agitação

constante de 240 rpm, durante 6 horas para descolamento de oligodendrócitos e

outros tipos celulares. Em seguida, as garrafas foram lavadas de 3 a 5 vezes com

PBS e os astrócitos que permaneceram aderidos foram tripsinizados e passaram

pelo procedimento usual de manutenção das culturas celulares, permanecendo

viáveis por até 5 passagens.

3.4 Microfotografias

As microfotografias das células U-87MG e T98G foram capturadas através de

microscópio Leica DMLB operando com sistema digital de imagem Leica DC 300F

acoplado ao software de aquisição “Image Manager 50 1.2” (Leica Microsystems,

Bannockburn, IL), localizado no Instituto de Biologia, UNICAMP. Para captura das

fotos foi empregado o modo de contraste de fase óptico invertido, utilizando objetiva

com aumento de 20x.

Estas células foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma

confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de

fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2. As culturas de células

foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após

24 h do plaqueamento (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025%,

oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4


19

dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. As microfotografias

foram realizadas 24 horas após o plaqueamento (D0) e após 5 dias de tratamento

(D5) com os inibidores mitocondriais.

3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT

O método de viabilidade celular por MTT é um teste colorimétrico que utiliza o

sal brometo de azul tiazoil tetrazólio como substrato de uma reação enzimática. O

método tem como princípio testar a viabilidade celular pela atividade enzimática de

desidrogenases intracelulares (LIU et al., 1997), que convertem o sal em cristais de

formazan. Os cristais de formazam são solubilizados pela adição de uma solução

ácida de dodecil sulfato de sódio (SDS 10% em HCl 10 mM) e após 24 horas a

densidade óptica das amostras é determinada pela subtração das absorbâncias nos

comprimentos de onda 570 e 650 nm, através de um leitor de placas (BIOTEK,

Power Wave XS2) (CHAPDELAINE, 2011). Este teste foi aplicado para se estimar a

proliferação das células de glioblastomas em cultura, U-87MG e T98G, como

também a proliferação de astrócitos em cultura primária.

A solução de MTT 1 mg/mL foi preparada em meio DMEM 2 g/L de glicose e

sem vermelho de fenol e mantida por até uma semana a 4ºC. Em cada amostra,

após a remoção do meio de incubação foi adicionado 2 mL da solução de MTT,

seguindo-se uma incubação por 90 min a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de

CO2 e 95% de ar. Em seguida foi adicionada a solução ácida de SDS e após 24 h, as

amostras foram lidas conforme descrito anteriormente.

Previamente à adição da solução de MTT, as células foram plaqueadas em

placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma confluência de 15.000 células/cm² em 4

mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, suplementado como

descrito no item 3.2. As placas foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada

com 5% de CO2 e 95% de ar durante 24 h após o plaqueamento para aderirem à

superfície dos poços. Logo após, as células foram tratadas com DMSO 0,025%

(controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A.


20

Este experimento transcorreu durante 7 dias corridos, D0 – D7, onde “D” representa

os dias. D0 é o tempo em que as células começaram a ser tratadas (após 24 horas

do plaqueamento). D0, D2, D4 e D6 foram os dias em que o teste do MTT foi iniciado

e as respectivas leituras foram feitas em D1, D3, D5 e D7. As células tiveram o meio

renovado com as respectivas drogas em D2 e D4.

3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan

Primeiramente foi realizado o plaqueamento das células U-87MG e T98G

(5.000 células/cm2) em placas de 6 poços (9,6 cm2) e estas foram mantidas em 4 mL

de meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado como descrito no item

3.2, mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após

transcorridas 24 h (D0) para aderência das células na superfície dos poços, o meio

foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL,

antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o

meio foi renovado com as respectivas drogas e as células permaneceram incubadas

nas mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, as células foram

ressuspendidas e a estimativa da viabilidade celular foi realizada por meio da

contagem das células em câmara de Neubauer após a diluição da suspensão celular

em azul de tripan 0,1% em PBS. Os valores absolutos obtidos são de células viáveis

por poço encontrados no quinto dia após a adição dos compostos mencionados

acima (D5).

3.7 Medida do consumo de O2 por células U-87MG e T98G intactas

Para as medidas do consumo de oxigênio molecular (O2) por células intactas

em suspensão foi utilizado um oxígrafo constituído por uma cubeta de 1,4 mL com

temperatura controlada a 37ºC, agitação constante e um eletrodo sensível ao

oxigênio, eletrodo de Clark (Yellow Spring Instruments, EUA). Este eletrodo é envolto

por uma membrana de poliestireno e por uma solução saturada de cloreto de

potássio (KCl), localizada entre o eletrodo e a membrana, sendo possível a


21

passagem de corrente elétrica. Considerou-se a solubilidade do oxigênio molecular

(O2) em água como sendo de 200 μmol/L, a 37°C e 1 atm (ROBINSON, COOPER;

1970).

As células U-87MG e T98G foram tripsinizadas, contadas em câmara de

Neubauer e adicionadas a uma concentração de 4.000.000 células/mL na cubeta do

oxígrafo em meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado com HEPES 20

mM (pH 7,2). Após o registro da respiração basal, foi adicionada oligomicina 1 µg/mL

e/ou antimicina A 1 µM, seguida pela adição de FCCP 1 µM, para se obter o máximo

consumo de oxigênio.

3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato

As medidas do consumo de glicose e da produção de lactato por células U-

87MG e T98G em cultura foram realizadas através de kits colorimétricos

comercializados pela empresa Bioclin (Belo Horizonte, MG, Brasil), cuja referência

dos produtos é K082 e K084, respectivamente.

O kit de glicose é constituído por elemento tamponante (pH 7,0) 36 mmol/L,

fenol 10 mmol/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L, azida sódica 7,7 mmol/L, glicose

oxidase >10.000 U/L e peroxidase >700 U/L. O teste consiste na oxidação da glicose

pela enzima glicose oxidase (GOD), de acordo com a seguinte reação:

Na presença da peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado, reage com a 4-

aminoantipirina e fenol, originando um produto de coloração avermelhada, cuja cor é

proporcional à concentração de glicose no meio. Como padrão foi utilizado uma

amostra contendo 100 mg/dL de glicose. A absorbância das amostras foi lida em um

comprimento de onda de 505 nm.

O kit de lactato é constituído por tampão borato (pH 10,0), lactato

desidrogenase (LDH) >24 kU/L, azida sódica 15,38 mmol/L, NAD+ >4 mmol/L e

Glicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2 GOD


22

tampão citrato (pH 3,0) 200 mmol/L. O teste consiste na reação catalisada pela LDH

entre lactato e NAD+, com a produção de piruvato e NADH.

Como padrão foi utilizado uma amostra contendo 10 mg/dL de lactato. A absorbância

do NADH foi determinada em um comprimento de onda de 340 nm.

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma

confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de

fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2, mantidas a 37°C em

atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h o meio foi renovado e

depois de 48 h as células foram tratadas com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina

1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A em meio DMEM 2 g/L

de glicose, suplementado e sem vermelho de fenol. Após 20 h do tratamento, foi

retirado 1 mL de meio de cada poço para a realização das dosagens de glicose e

lactato, em placas de 96 poços. Os valores obtidos foram descontados do valor do

branco (reagentes dos kits de determinação mais meio de cultura).

3.9 Estimativa do Potencial de Membrana Mitocondrial de Células Intactas

Dois protocolos experimentais foram utilizados para a avaliação dos efeitos

dos inibidores mitocondriais no potencial de membrana mitocondrial em células

intactas, U-87MG e T98G. No primeiro protocolo, avaliou-se o efeito imediato no

potencial de membrana dos inibidores mitocondriais. Em um segundo protocolo,

avaliou-se o impacto da incubação durante 24 horas com os inibidores mitocondriais

(oligomicina e/ou antimicina A) no potencial de membrana. Em ambos os protocolos,

o potencial de membrana das suspensões celulares foi avaliado sob proteção da luz

em um fluorímetro (Shimadzu RF-5301PC, Kyoto, Japão) equipado com agitação

magnética constante e operando em comprimentos de onda de 553 e 576 nm para

excitação e emissão respectivamente, slits de 3 nm e uma resposta de 2 segundos.

As suspensões celulares foram tripsinizadas e ressuspensas em meio de leitura

Lactato + NAD+ Piruvato + NADH LDH


23

DMEM 2 g/L de glicose, sem vermelho de fenol e suplementado com HEPES 20 mM

(pH 7,2). Ambos protocolos foram estabelecidos pela metodologia de PERRY et al.

(2011).

Para a avaliação do efeito imediato dos inibidores mitocondriais no potencial

de membrana, o meio foi acrescido do marcador fluorescente catiônico, TMRM 500

nM, que é rapidamente sequestrado pelas mitocôndrias ativas, na presença de TPB-

1 µM. Após 3-4 minutos adicionou-se as células (2.000.000 células/mL) ao meio de

leitura e durante os 7-8 minutos seguintes observou-se a captação, pelas células, do

marcador TMRM. A seguir, os inibidores mitocondriais foram adicionados conforme

mostrado nas figuras correspondentes. Ao final de cada medida adicionou-se o

desacoplador mitocondrial FCCP 250 nM, um protonóforo que desfaz o gradiente

eletroquímico de prótons transmembrana.

No segundo protocolo para avaliação do potencial de membrana mitocondrial,

15.000 células/cm2 foram mantidas em placas de 6 poços de 9,6 cm2 e incubadas em

meio DMEM 2 g/L de glicose suplementado como descrito no item 3.2 e mantidas a

37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. O meio foi renovado

após 24 h e as culturas de células foram mantidas por mais 48 h a 37°C em

atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. A seguir, as células foram

incubadas durante 24 h na presença dos inibidores mitocondriais. Posteriormente, as

células foram ressuspensas em 2 mL no meio de leitura acrescido de seus

respectivos inibidores mitocondriais e TPB- 1 µM. Após os 3 primeiros minutos,

adicionou-se TMRM 500 nM e a fluorescência foi acompanhada por 9-10 min. Ao

final de cada traçado adicionou-se FCCP 250 nM. Para cada condição experimental,

a diferença entre a fluorescência antes (F) e após a adição de FCCP (FFCCP) foi

utilizada como um parâmetro na estimativa do potencial de membrana mitocondrial.

3.10 Análise do Ciclo Celular em Células U-87MG e T98G

O protocolo experimental para a avaliação do ciclo celular nas células U-87MG

e T98G foi adaptado de POZAROWSKI, DARZYNKIEWICZ (2004) e CARVALHO et


24

al. (2008) utilizando-se iodeto de propídeo (PI) mediante a presença dos tratamentos

com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou

oligomicina mais antimicina A. O experimento transcorreu durante 6 dias.

Primeiramente, as células foram plaqueadas em garrafas de 25 cm² (7.000

células/cm²) em 6 mL de meio DMEM 2 g/L de glicose com vermelho de fenol,

suplementado conforme descrito no item 3.2 e mantidas a 37°C em atmosfera

umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, essas

células sofreram o processo de carenciamento, que consiste na troca por um meio

DMEM 2 g/L de glicose suplementado apenas com antibiótico (100 U/mL de

penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Nesta etapa, o soro fetal bovino, que é um

fator de crescimento celular, foi retirado possibilitando que todas as células partissem

da mesma fase do ciclo celular. Após 24 horas do carenciamento (D0), as primeiras

amostras foram retiradas e mantidas à -20ºC, para avaliar a sincronização das fases

do ciclo celular, e as outras amostras receberam seus tratamentos específicos. Após

48 horas (D2), o meio foi renovado com seus respectivos tratamentos e então, após

mais 48 horas (D4) as amostras foram tripsinizadas, centrifugadas a 4°C durante 5

minutos à 500 g. As suspensões celulares foram ressuspendidas em 1 mL de etanol

70% e mantidas a -20ºC. As células permaneceram nesta temperatura por pelo

menos 24 horas para que ocorresse a lise da membrana plasmática e nuclear,

liberando o DNA.

As amostras retiradas do freezer foram centrifugadas à 4°C, durante 10

minutos, à 500 g. O sobrenadante foi aspirado delicadamente com uma pipeta

automática e descartado. Ao pellet de células, foi adicionado 4 µL de RNAse 1

mg/mL, e 40 µL de uma solução com o marcador fluorescente iodeto de propídeo

(1% citrato de sódio, 1% triton X-100 e 500 µg/mL de iodeto de propídeo) e 356 µL

de PBS, totalizando um volume final de 400 µL. As amostras foram incubadas à

37ºC, durante 30 min, protegidas da luz e em seguida foram incubadas à 4ºC,

durante 2 h, protegidas da luz. A análise do ciclo celular foi realizada por um

citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson), equipado com laser de argônio,

por meio da leitura da fluorescência do iodeto de propídeo (PI) captado no canal FL-


25

2, coletando-se 10.000 eventos de cada amostra. Os dados resultantes foram

analisados utilizando-se o software ModFit LT versão 2.0.

3.11 Análise Estatística

Os dados experimentais foram analisados utilizando-se o software GraphPad

Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Os valores foram submetidos à análise

de variância de medidas repetidas (ANOVA de uma ou duas vias), seguida por teste

Bonferroni. Os dados estão representados como a média ± erro padrão da média (±

SEM) de pelo menos quatro experimentos independentes onde P < 0,05 (*, #) e P <

0,01 (**, ##) foram considerados significativos.

Resultados e Discussão

26

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Células tumorais utilizam preferencialmente a glicólise como fonte de

obtenção de ATP, ao contrário de células diferenciadas e não tumorais que utilizam

sobretudo a fosforilação oxidativa para a produção do mesmo. Na glicólise são

produzidos somente 2 ATPs por molécula de glicose, enquanto que na fosforilação

oxidativa são obtidos aproximadamente 30 ATPs. Sendo assim, as células tumorais

utilizam pouco a mitocôndria para a obtenção de energia. Os experimentos descritos

a seguir foram realizados tentando elucidar qual o papel da bioenergética

mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano.

4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de

elétrons na proliferação de células de glioblastoma humano

Para verificar a taxa de proliferação das células de glioblastoma humano, U-

87MG e T98G, três metodologias distintas foram utilizadas: teste de redução do MTT

com a produção de cristais de formazan (Fig. 5), contagem de células viáveis pelo

método de exclusão com azul de Tripan (Fig. 6) e aquisição de microfotografias por

um microscópio de contraste de fases invertido (Fig. 7).

Em células U-87MG mantidas em cultura durante 6 dias, observou-se que em

situação controle ocorre um aumento de aproximadamente 14 vezes na atividade

metabólica de redução do MTT, o que pode ser evidenciado pelos valores de

absorbância que passaram de 0,1 para 1,4 neste período. Quando estas células

foram tratadas com oligomicina, um inibidor da ATP sintase, observou-se uma

inibição de 21,1% na proliferação desta linhagem. Uma vez que o tratamento

transcorreu com antimicina A, um inibidor do complexo III da cadeia transportadora

de elétrons, a inibição da proliferação celular foi de 49,8%. Quando ambas as drogas

estavam presentes, i.e. oligomicina mais antimicina A, as células mostraram um

pequeno aumento na proliferação durante os 4 primeiros dias, seguido por uma

tendência à diminuição da atividade metabólica da redução do MTT até o final do


27

sexto dia. Ao final do sexto dia observou-se uma inibição de 81,2% na proliferação

desta linhagem na presença de oligomicina mais antimicina A.

Quando se avaliou as células T98G após 6 dias em cultura, a situação

controle apresentou um aumento de aproximadamente 6 vezes na atividade de

redução do MTT em relação ao primeiro dia de leitura das absorbâncias das

amostras, sendo obtidos os valores de absorbância de 0,2 no início do tratamento e

1,4 ao final dos 6 dias. Durante o tratamento com oligomicina, observou-se uma

inibição na taxa de proliferação celular de 25%. Quando se avaliou a taxa de inibição

da proliferação celular pela antimicina A, esta foi de 33,5%. Uma vez que estiveram

presentes oligomicina mais antimicina A, foi constatado um pequeno aumento na

proliferação das células até o segundo dia, seguido por um declínio durante os

próximos 4 dias em cultura. Ao final do sexto dia, na presença de oligomicina mais

antimicina A, observou-se uma inibição de 83,3% na proliferação desta linhagem.

Fig. 5 - Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. A figura apresenta os resultados de proliferação celular estimados pela redução de MTT com a produção de azul de formazan. Os dados representam a média ± S.E.M de pelo menos 4 experimentos independentes realizados em duplicata. *P<0,05, **P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.

U-87MG

0 2 4 60.0

0.5

1.0

1.5 Control

Oligo

AA

Oligo + AA **##

**####

*#

Days of Treatment

Op

tica

l d

en

sity

of

form

aza

n a

bso

rba

nce

T98G

0 2 4 60.0

0.5

1.0

1.5 Control

Oligo

AA

Oligo + AA **##

**##

**##

**##

Days of Treatment

Op

tica

l d

en

sity

of

form

aza

n a

bso

rba

nce


28

Quando foi avaliada a proliferação celular pela contagem de células viáveis

por exclusão de azul de Tripan (Fig. 6), um padrão semelhante de proliferação

àquele observado pelo método do MTT foi verificada. As células U-87MG

apresentaram uma maior taxa proliferativa em relação às células T98G.

U-87MG

0 2 4 60

1.0106

2.0106

3.0106

Control

Oligo

AA

Oligo + AA

**##

**##

Time (days)

Ce

ll N

um

be

r

T98G

0 2 4 60

1.0106

2.0106

Control

Oligo

AA

Oligo + AA

**##

**##

Time (days)

Ce

ll N

um

be

r

Fig. 6 - Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (5.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. Na figura são mostrados os valores absolutos de células viáveis por poço encontrados no sexto dia após o plaqueamento nas situações descritas acima. As células viáveis foram contadas em câmara de Neubauer com azul de tripan a 0,1% em PBS. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M de pelo menos 6 experimentos independentes. **P<0,01 vs Control. ##P<0,01 vs Oligo+AA.

No início do tratamento haviam sido plaqueadas 48.000 células U-87MG por

poço e ao final do sexto dia, na situação controle havia uma média de 2.517.691

células por poço, ou seja, um aumento de aproximadamente 52,5 vezes. No

tratamento com oligomicina, havia 1.254.000 células, indicando um aumento


29

proliferativo de 26,1 vezes. Quando as células foram tratadas com antimicina A, o

número de células caiu para 321.142, mostrando que neste tratamento o aumento foi

de 6,7 vezes no número de células. Notadamente, quando as células foram tratadas

com a associação de oligomicina mais antimicina A, o número final de células

(49.750) manteve-se praticamente igual ao número inicial de células plaqueadas.

Também foram plaqueadas 48.000 células T98G por poço. Após transcorridos

6 dias com seus respectivos tratamentos, pode-se observar que em uma situação

controle, as células apresentaram uma taxa de crescimento de 35,1 vezes,

totalizando em média 1.682.142 células por poço. Quando as células foram tratadas

com oligomicina, o aumento na proliferação celular foi de 21,5 vezes, havendo

1.030.714 células. Já quando tratadas com antimicina A, o número de células caiu

para 302.857, indicando que a taxa proliferativa foi de 6,3 vezes. Na última condição

de tratamento, onde as drogas oligomicina e antimicina foram adicionadas

simultaneamente, o número de células caiu para 23.930, indicando um decréscimo

de 0,5 vez em relação ao número de células inicialmente plaqueadas.

A aquisição de microfotografias foi a última metodologia utilizada para avaliar

a taxa de proliferação de ambas as linhagens celulares de glioblastoma, U-87MG e

T98G. As fotos apresentadas na Fig. 7 representam o crescimento destas células ao

longo de 5 dias em cultura. Em condições controle (DMSO), as células atingiram uma

alta confluência em D5 e até mesmo algumas células começaram a crescer uma

sobre as outras. Na presença de qualquer uma das drogas, oligomicina ou antimicina

A, uma moderada diminuição na confluência celular foi observada, sendo a

confluência celular com antimicina A menor quando comparada com a da

oligomicina. Nenhuma evidência clara de morte celular foi observada sob essas

condições. Notadamente, quando as células foram incubadas na presença de ambas

as drogas, oligomicina mais antimicina A, uma inibição quase total da proliferação

das células foi observada. Pode-se notar, nesta mesma condição, uma mistura de

células normais e outras com morfologia menor e arredondada sugerindo morte

celular por apoptose.


30

-

Co

ntr

ol

(D5

)


31

Fig. 7 - Microfotografias de células U-87MG e T98G mantidas em cultura: efeito de oligomicina e/ou antimicina A.

Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm²) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. As microfotografias foram realizadas utilizando-se contraste de fase óptico nos tempos 0 (D0) e após 5 dias de tratamento (D5) com os inibidores mitocondriais. As imagens originais foram igualmente ajustadas aumentando-se o contraste. Barra de escala: 50 µm.

As três metodologias de avaliação de proliferação celular, acima descritas,

indicam que a inibição da ATP sintase pela oligomicina, e a inibição do complexo III

da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial pela antimicina A, prejudicaram

parcialmente a proliferação de células de glioblastoma humano. No entanto, quando

se promoveu uma inibição simultânea da ATP sintase e da cadeia respiratória houve

um prejuízo significativo na proliferação celular, ou seja, uma inibição quase total

desta proliferação.

Quando a ATP sintase está inibida pela oligomicina, a cadeia transportadora

de elétrons ainda continua funcional e as mitocôndrias mantém um potencial de

prótons transmembrana. Nesta condição, espera-se que o potencial de prótons

transmembrana aumente ligeiramente, pois a ATP sintase não estará funcional e não

ocorrerá a fosforilação do ADP em ATP, não utilizando este gradiente de prótons

(NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).

Quando a cadeia transportadora de elétrons está inibida pela antimicina A, a

fosforilação oxidativa não ocorre, pois o bombeamento de prótons para o espaço

intermembranas pelos complexos respiratórios I, III e IV não ocorre. No entanto, na

presença de antimicina A, espera-se que a ATP sintase possa funcionar de maneira

inversa promovendo a hidrólise de ATP da matriz mitocondrial com o bombeamento

de prótons para o espaço intermembranas, o que gera um potencial de prótons

transmembrana (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).


32

Quando os dois inibidores estão presentes, espera-se que não se forme um

significativo potencial de prótons transmembrana, uma vez que estará inibido o

bombeamento de prótons tanto pelos complexos respiratórios I, III e IV, como pelo

funcionamento inverso da ATP sintase. Assim, podemos interpretar que a potente

inibição da proliferação celular pela associação da oligomicina mais antimicina A

deve estar relacionada com incapacidade das mitocôndrias em manterem um

potencial de prótons transmembrana nesta condição, como abordado adiante.

4.2 Efeitos da oligomicina e antimicina A no metabolismo energético das

células de glioma

A fim de caracterizar o efeito da inibição da ATP sintase mitocondrial e/ou da

cadeia transportadora de elétrons no metabolismo energético de células de

glioblastoma humano, foram realizados experimentos para a determinação da

respiração celular e do consumo de glicose e produção de lactato.

Primeiramente, o efeito dos inibidores oligomicina e antimicina A foi testado

sobre o consumo de oxigênio por células intactas (Fig. 8). Além dos tratamentos

padrões, verificamos a capacidade máxima respiratória pela utilização de um

protonóforo, FCCP, que promove o transporte de prótons do espaço intermembranas

para a matriz mitocondrial, desfazendo o gradiente eletroquímico de prótons e

estimulando a respiração. Isso ocorre porque o FCCP fica constantemente carreando

prótons para a matriz mitocondrial, mantendo um baixo gradiente de prótons

transmembrana (NELSON, COX, 2012); sendo assim, os prótons são transportados

novamente para o espaço intermembranas pelos complexos I, III e IV da cadeia

transportadora de elétrons, gerando um ciclo fútil e estimulando ao máximo a

respiração. E ainda, para verificarmos a participação da NADPH oxidase no consumo

de oxigênio insensível à antimicina A, utilizamos um inibidor da NADPH oxidase, o

cloreto de difenileneiodônio (DPI). A NADPH oxidase, localizada na membrana

plasmática de algumas células de origem astrocítica (GAO et al., 2012; BRANDES et

al, 2014), consome oxigênio molecular produzindo o radical ânion superóxido (O2.-).

O superóxido formado, em uma reação de dismutação com outro superóxido formará


33

uma molécula de H2O2 e outra de O2. O H2O2 será degradado a H2O através da ação

da glutationa peroxidase ou peroxiredoxina, ou também pode ser degradado em H2O

e O2 pela ação da catalase (AUGUSTO, 2006).

Na linhagem celular U-87MG observamos a capacidade respiratória celular

máxima pela utilização do FCCP que, em valores numéricos, correspondeu a 36,7

pmol O2.mL-1/s/106 células (Fig. 8, painel B). Em condição controle, esta linhagem

utilizou cerca de 50% de sua capacidade respiratória total, consumindo 18,1 pmol

O2.mL-1/s/106 células. Após cinco minutos de incubação em condição controle, foram

adicionados os respectivos tratamentos. Quando a oligomicina foi adicionada, as

células passaram a consumir 9,1 pmol O2.mL-1/s/106 células, indicando uma inibição

de 49,5% na respiração das mesmas em relação ao controle. Já após a adição de

antimicina A, a respiração foi inibida em 68,5% em relação ao controle, passando a

consumir 5,7 pmol O2.mL-1/s/106 células. Quando ambas as drogas foram

adicionadas simultaneamente, a respiração manteve-se em 5,9 pmol O2.mL-1/s/106

células. Uma vez que o DPI foi adicionado após a antimicina A, observou-se uma

inibição adicional da respiração de aproximadamente 27,6% em relação à antimicina

A.

Nas células T98G (Fig. 8, painel C), foi observado que a capacidade

respiratória máxima foi de 65,0 pmol O2.mL-1/s/106 células e que em condição

controle estas utilizam apenas 52,3% (34,0 pmol O2.mL-1/s/106 células) de sua

capacidade máxima respiratória. Passados também cinco minutos, os tratamentos

foram adicionados e uma inibição de 56,8%, passando a consumir 14,7 pmol O2.mL-

1/s/106 células, ocorreu na presença de oligomicina. Após a adição de antimicina A,

as células passaram a consumir 7,6 pmol O2.mL-1/s/106 células, o que corresponde a

uma inibição de 77,5% da respiração em relação ao controle. Quando ambos os

tratamentos foram associados, a inibição foi de 75,9%, passando a consumir 8,3

pmol O2.mL-1/s/106 células. Na presença de antimicina A e DPI, as células respiraram

5,3 pmol O2.mL-1/s/106 células, ou seja, a inibição foi de 31,3% em relação à

antimicina A. O painel A mostra traçados representativos obtidos com as células

T98G.


34

Fig. 8 - Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A no consumo de oxigênio de

células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (4×106/mL) foram tripsinizadas e ressuspensas em meio DMEM 2

g/L de glicose suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Após 4-5 min de incubação,

foram adicionados oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA), oligomicina mais

antimicina A (Oligo + AA), antimicina A mais DPI 10 µM (AA + DPI) ou FCCP 1 µM.

Painel A: Traçados representativos de medidas do consumo de oxigênio pelas células de

glioblastoma T98G. Antimicina A (AA) ou FCCP foram adicionados onde indicados pela seta

(*).

Painéis B e C: Valores absolutos do consumo de oxigênio por células U-87MG e T98G

observados nas diferentes condições experimentais. Dados representam a média ± S.E.M.

de 5 e 10 experimentos independentes para as células U-87MG e T98G, respectivamente.

**P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.


35

Em ambas linhagens celulares, a inibição da ATP sintase por oligomicina

resultou em uma diminuição significativa no consumo de oxigênio, indicando que em

condições basais grande parte do consumo de oxigênio mitocondrial é devida a

fosforilação oxidativa do ADP a ATP. O alto potencial de prótons transmembrana, na

presença de oligomicina, não permite que haja o bombeamento de prótons para este

espaço. Sendo assim, o transporte de elétrons por essa cadeia é bastante inibido e

consequentemente a respiração diminui. Como o efeito inibitório da oligomicina no

consumo de oxigênio foi próximo ao obtido pela antimicina A, pode-se deduzir que

células de glioblastoma humano têm uma respiração bem acoplada. Esta observação

está de acordo com um processo eficiente de fosforilação oxidativa em células

tumorais (HAO et al., 2010; KOPPENOL et al, 2011).

Em seguida, foi quantificado o consumo de glicose e produção de lactato

pelas células U-87MG e T98G (Fig. 9), assim como o efeito dos inibidores

mitocondriais nestes parâmetros. Ambas as linhagens apresentaram um consumo de

glicose semelhante à produção de lactato na situação controle, o que pode ser um

indicativo do elevado metabolismo glicolítico das células de glioblastoma. O consumo

de glicose em 20 horas na situação controle, foi cerca de 50 mg/mL e a produção de

lactato de aproximadamente 40 mg/mL. Uma vez que a ATP sintase foi inibida por

oligomicina, observou-se um aumento no consumo de glicose de 35,6% e 31,4%, e

na produção de lactato de 65,2% e 34% nas células U-87MG e T98G,

respectivamente. Um efeito similar foi obtido quando a cadeia respiratória foi inibida

pela antimicina A, onde o consumo de glicose aumentou em 43% e 32,8% e a

produção de lactato em 67,2% e 47% nas células U-87MG e T98G, respectivamente.

Curiosamente, quando ambos inibidores foram adicionados, ocorreu uma diminuição

significativa no consumo de glicose e na produção de lactato quando comparados ao

tratamento somente com antimicina A. Na presença de oligomicina mais antimicina

A, houve uma diminuição de 17,8% e 16,2% no consumo de glicose e uma

diminuição de 18,4% e 18,1% na produção de lactato nas células U-87MG e T98G,

respectivamente, quando comparados com o tratamento somente com a antimicina

A.


36

Fig. 9 - Avaliação do consumo de glicose e produção de lactato por células de

glioblastoma humano U-87MG e T98G: Efeito de oligomicina e antimicina A.

Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h do plaqueamento o meio foi renovado. Após 48 h, o meio foi trocado para DMEM 2 g/L de glicose sem vermelho de fenol, na presença das drogas DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). As células foram incubadas nestas condições experimentais durante 20 horas e amostras do meio foram retiradas para quantificação da concentração de glicose e lactato por kits enzimáticos. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M. de 9 experimentos independentes realizados em duplicata. **P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.

Estes resultados indicam que na presença de oligomicina ou antimicina A,

ocorre um aumento do metabolismo glicolitico nas células de glioblastoma. Assim

como foi observado por PAUWELS et al (1985) para células de neuroblastoma em

cultura, estes resultados indicaram que as células de glioblastoma humano resistem

a uma inibição da respiração, desde que haja glicose suficiente disponível. Quando

as células estão inibidas somente pela oligomicina, a ATP sintase não está funcional

e não há a fosforilação oxidativa do ADP à ATP, portanto o potencial de prótons

mitocondrial não é utilizado para a síntese de ATP, que nesta condição deverá ser

suprido pela glicólise. No entanto, na presença de oligomicina, a cadeia

U-87MG

Con

trol

Olig

oAA

Olig

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A

Con

trol

Olig

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Olig

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)


37

transportadora de elétrons está funcional e até determinado ponto continua

transferindo H+ para o espaço intermembranas, e parte do piruvato é convertido a

acetil-CoA para atender às necessidades de substratos para o ciclo do ácido cítrico.

Quando o potencial de membrana já está elevado a um ponto em que os prótons não

podem ser mais transferidos para o espaço intermembranas, o piruvato é convertido

a lactato (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012). Logo o aumento da

produção de lactato na presença de oligomicina se deve tanto a uma maior demanda

da via glicolítica para a produção de ATP, como a uma menor demanda de

substratos respiratórios (intermediários do ciclo do ácido cítrico).

Quando o complexo III da cadeira transportadora de elétrons está inibido pela

antimicina A, não haverá o transporte de elétrons pelos complexos I, III e IV, assim

como o transporte de prótons por esses complexos respiratórios para o espaço

intermembranas. Nesta condição, espera-se que a ATP sintase mitocondrial passe a

funcionar de maneira inversa, hidrolisando ATP e promovendo o efluxo de prótons

para o espaço intermembranas (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).

Assim, na presença de antimicina A, a glicólise deverá suprir uma maior demanda de

ATP, uma vez que não está havendo a fosforilação oxidativa do ADP a ATP e a

mitocôndria está consumindo ATP. Nesta condição, acaba havendo um acúmulo dos

intermediários no ciclo do ácido cítrico pela ausência de respiração mitocondrial,

impedindo que o piruvato se converta em acetil-CoA. Este piruvato é então

convertido à lactato, em uma reação catalisada pela lactato desidrogenase, com a

oxidação de uma molécula de NADH à NAD+. O NAD+ é essencial para a

continuação da glicólise (NELSON, COX, 2012).

Já na presença de oligomicina mais antimicina A, observa-se uma menor

demanda no metabolismo glicolítico quando comparado às condições na presença

dos inibidores isoladamente. Isso porque na presença dos dois inibidores, apesar da

mitocôndria não promover a síntese de ATP, não haverá gasto dos intermediários do

ciclo do ácido cítrico para manter a respiração pela cadeia transportadora de

elétrons, nem a hidrólise de ATP pela ATP sintase. Nesta condição, as mitocôndrias


38

estarão “desligadas” pelo fato de não estarem promovendo a fosforilação oxidativa e

nem apresentarem o potencial de prótons transmembrana.

4.3 Estimativa do potencial de membrana mitocondrial em células de

glioblastoma humano: Efeito de oligomicina e/ou antimicina A

Para avaliar o potencial de membrana mitocondrial em células U-87MG e

T98G intactas em suspensão dois protocolos distintos utilizando o marcador TMRM

foram empregados. Primeiramente avaliou-se o efeito imediato da adição dos

inibidores mitocondriais oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana

mitocondrial (Fig. 10). No segundo protocolo, o efeito de inibidores mitocondriais no

potencial de membrana foi avaliado após a incubação com as células por 24 h (Fig.

11).

Para verificarmos o efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no

potencial de membrana em células de glioblastoma humano, conduzimos

experimentos em um período de 30 minutos, monitorando a fluorescência emitida

pelo TMRM à medida que as drogas foram adicionadas (Fig. 10). Em ambas as

linhagens, obtivemos um padrão de fluorescência semelhante para cada droga

adicionada. No início da leitura do experimento, juntamente com o meio de cultura

celular sem vermelho de fenol, foi adicionado o marcador fluorescente catiônico,

TMRM, capaz de detectar o potencial de membrana mitocondrial, e um reagente que

permite o acúmulo do TMRM mais facilmente para o interior celular, o TPB-.

Estes traçados devem ser entendidos de forma que quanto menor a

fluorescência emitida pela suspenção celular, maior é o potencial de membrana

mitocondrial das células e quanto maior a fluorescência, menor é o seu potencial de

membrana mitocondrial. Isso se deve ao fenômeno de quenching de fluorescência.

Quanto maior o potencial de membrana das mitocôndrias, mais marcador

fluorescente será captado e acumulado por estas. No entanto, esse marcador vai

para o interior celular e ficará restrito a um pequeno volume de matriz mitocondrial,

então a fluorescência da maior parte das moléculas de TMRM deixa de ser


39

detectada, pois a alta concentração de moléculas acaba por limitar a detecção da

intensidade de fluorescência emitida por todas as moléculas (quenching). Em adição,

a diminuição da concentração do marcador fluorescente no meio reacional, devida a

sua captação pelas mitocôndrias polarizadas, irá diminuir a detecção de sua

fluorescência emitida (FIGUEIRA et al., 2013).

Fig. 10 - Efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial estimado em suspensões de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (2×106/mL) foram tripsinizadas e ressuspensas em meio DMEM 2 g/L de glicose, sem vermelho de fenol e suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Para a estimativa do potencial de membrana, o meio foi acrescido do marcador fluorescente TMRM 500 nM, na presença de TPB- 1 µM. Após 3-4 minutos adicionou-se as células de glioblastoma U-87MG ou T98G e durante os 7-8 minutos seguintes observou-se a captação, pelas células, do marcador TMRM. A seguir, adicionou-se oligomicina 1 µg/mL (Oligo) e/ou antimicina A 1 µM (AA). Ao final de cada medida adicionou-se o desacoplador mitocondrial FCCP 250 nM. Os traçados correspondem a resultados representativos de 4 experimentos independentes.

D C

B A

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T98G

AA

FCCP

Oligo


40

Após 2-3 minutos observou-se uma estabilização do sinal de fluorescência do

meio reacional contendo TMRM. Após este período as células foram adicionadas e

verificou-se a captação do marcador fluorescente pelas mesmas. Após 7 a 8

minutos, adicionaram-se as drogas oligomicina ou antimicina A e foi observada a

mudança no potencial de membrana mitocondrial. Quando a leitura de fluorescência

do potencial de membrana apresentou uma estabilização, foram adicionadas

novamente as drogas. Quando primeiramente adicionamos oligomicina, em seguida

adicionou-se antimicina A e vice-versa. No momento da segunda adição, vale

lembrar que temos uma situação de tratamento oligomicina mais antimicina A. Após

ocorrer novamente a estabilização da medida do potencial de membrana, adicionou-

se o protonóforo FCCP, que promove o transporte de prótons do espaço

intermembranas para a matriz mitocondrial, desfazendo o potencial de membrana

mitocondrial.

Quando a oligomicina foi adicionada primeiramente, observou-se uma

hiperpolarização do potencial de membrana mitocondrial das células U-87MG e

T98G. Isso ocorre devida a inibição da ATP sintase, com a inibição da síntese de

ATP, ou seja, a ATP sintase não utiliza os prótons do espaço intermembrana para

que ocorra a fosforilação do ADP em ATP. No entanto, a cadeia transportadora de

elétrons mitocondrial está funcional, transportando prótons da matriz mitocondrial

para o espaço intermembranar. Pelo fato da ATP sintase não utilizar esses prótons,

quando inibida pela oligomicina, o potencial de membrana mitocondrial aumenta

ligeiramente (NICHOLLS, BUDD, 2000).

Uma vez que a antimicina A foi inicialmente adicionada, observa-se uma

diminuição no potencial de membrana mitocondrial. A antimicina A, por ser um

inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons, acaba por não permitir

que os complexos mitocondriais I, III e IV transportem prótons da matriz mitocondrial

para o espaço intermembranas. Na tentativa de restabelecer esse potencial, a ATP

sintase atua de forma inversa, hidrolisando ATP em ADP para promover o efluxo dos

prótons para o espaço intermembranas. Contudo, o desempenho da ATP sintase em


41

manter um potencial de membrana mitocondrial não é tão eficiente quando

comparado com a cadeia transportadora de elétrons (NICHOLLS, BUDD, 2000).

Quando a adição da segunda droga foi realizada e, portanto, tivemos uma

situação com a presença de oligomicina mais antimicina A, o potencial de membrana

mitocondrial caiu drasticamente. Tanto a ATP sintase como a cadeia transportadora

de elétrons estavam inibidas. Sendo assim, as mitocôndrias não têm como enviar

prótons para o espaço intermembranas, ficando apenas um potencial de membrana

residual. Quando foi adicionado o FCCP, as mitocôndrias perderam quase que

totalmente seu potencial de membrana. Como dito anteriormente, o FCCP fica

constantemente carreando prótons para a matriz mitocondrial, mantendo um baixo

gradiente de prótons transmembrana, desfazendo o potencial de membrana

mitocondrial.

A seguir, foi verificado o efeito da incubação das células com os inibidores

mitocondriais durante 24 horas no potencial de membrana mitocondrial (Fig. 11), de

acordo com a metodologia descrita no segundo protocolo do item 3.9. O valor

numérico da fluorescência de cada suspenção celular foi calculado pela diferença

entre os valores de fluorescência do potencial de membrana mitocondrial entre as

condições descritas na figura (Control, Oligo, AA e O+AA) e aquele obtido após a

adição do FCCP.

A linhagem de glioblastoma humano U-87MG apresentou na condição controle

um valor de 2,56 F, onde F indica a diferença (em módulo) de fluorescência descrita

acima. Quando as células foram tratadas com a oligomicina, obteve-se 3,61 F,

indicando que houve uma hiperpolarização mitocondrial em relação ao controle. Já

na presença do inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons,

antimicina A, observou-se uma queda, em relação ao controle, do potencial de

membrana mitocondrial, resultando em 1,07 F. As células tratadas com ambos os

inibidores, oligomicina mais antimicina A, apresentaram 0,1 F, o que representa uma

queda drástica no potencial de membrana mitocondrial em relação ao controle.


42

Fig. 11 - Efeito da incubação por 24 horas com oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (15.000/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. O meio foi renovado após 24 h e as culturas de células foram mantidas por mais 48 h a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. A seguir, as células foram incubadas durante 24 h na presença das drogas DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Posteriormente, as células foram tripsinizadas e ressuspensas em 2 mL de meio DMEM 2 g/L de glicose sem vermelho de fenol contendo os respectivos tratamentos, tampão HEPES 20 mM e TPB- 1 µM. As suspensões celulares foram avaliadas por um fluorímetro. Após os 3

primeiros minutos, adicionou-se TMRM 500 nM, a fluorescência foi acompanhada por 9-10 min e no final de cada traçado adicionou-se FCCP 250 nM. Para cada condição experimental, a diferença entre a fluorescência antes (F) e após a adição de FCCP (FFCCP) foi utilizada como um parâmetro na estimativa do potencial de membrana mitocondrial. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M de 5 experimentos independentes. *P<0,05, **P<0,01 vs Control. ##P<0,01 vs Oligo+AA.

A linhagem T98G apresentou na condição controle um valor de 4,62 F.

Quando foi adicionado um inibidor da ATP sintase, oligomicina, ocorreu uma

hiperpolarização mitocondrial em relação ao controle, obtendo-se um valor de F de

5,81. A antimicina A causou uma queda no potencial de membrana mitocondrial,

quando comparada ao controle, apresentando 2,43 F. O tratamento com as duas

drogas simultaneamente, oligomicina mais antimicina A, também fez com que as

U-87MG

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F -

FF

CC

P)

**


43

células T98G perdessem de forma drástica o potencial de membrana mitocondrial,

com um F de apenas 0,1, em comparação com o controle.

Sendo assim podemos dizer que em células incubadas por até 20 horas na

presença de oligomicina ou antimicina A, as mitocôndrias ainda mantiveram seu

potencial de membrana. Na condição com oligomicina, as células podem ter seu

potencial aumentado pelo fato da ATP sintase estar inibida e dessa forma não estar

utilizando o gradiente de prótons transmembrana para a produção de ATP, e ainda

pelo fato da cadeia transportadora de elétrons estar funcional e bombeando prótons

para o espaço intermembranas. Já as células quando incubadas com antimicina A,

apresentam uma queda em seu potencial de membrana mitocondrial, que é

parcialmente mantido pela atividade inversa da ATP sintase que hidrolisa ATP e

transporta prótons para o espaço intermembranas. Já quando houve a incubação

simultânea das drogas, as células não conseguiram manter seu potencial de

membrana mitocondrial, pois ambos os mecanismos presentes capazes de formar

um gradiente de prótons transmembrana, cadeia transportadora de elétrons e

atividade reversa da ATP sintase, estavam inibidos.

O potencial de membrana mitocondrial pode ser necessário para diversas

funções celulares fundamentais para o metabolismo e proliferação celular. A seguir

serão discutidas três funções mitocondriais relacionadas ao metabolismo celular e

que são dependentes do potencial de membrana mitocondrial, a saber, a captação e

acúmulo mitocondrial de Ca2+, o transporte mitocondrial de proteínas e o

funcionamento da transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida (NNT).

A captação de Ca2+ por mitocôndrias é mediada por um canal de Ca2+ (MCU)

presente na membrana mitocondrial interna e é dependente do potencial elétrico

transmembrana (RIZZUTO et al., 2012; FIGUEIRA et al., 2013). Uma vez que deixa

de ocorrer o transporte de Ca2+ para a matriz mitocondrial pelo MCU devido à

ausência de potencial transmembrana, pode ocorrer um acúmulo deste segundo

mensageiro no citosol celular. O aumento de Ca2+ citosólico pode interferir em

funções celulares, como a recaptação de neurotransmissores da fenda sináptica, e

até mesmo desencadear um processo de morte celular (SZYDLOWSKA,


44

TYMIANSKI, 2010). Elevações na concentração citosólica de cálcio podem ativar

algumas quinases e fosfatases que transmitem seus sinais para o núcleo, alterando

a taxa de transcrição de genes (SZYDLOWSKA, TYMIANSKI, 2010). Já a falta de

Ca2+ na matriz mitocondrial influencia diretamente a taxa de respiração mitocondrial

(KAVANAUGH et al., 2000), isto se deve ao fato de algumas das desidrogenases

presentes na matriz mitocondrial serem ativadas por Ca2+, como a piruvato, isocitrato

e α-cetoglutarato desidrogenase (MCCORMACK, DENTON, 1994; HUANG et al.,

2013).

Um segundo processo dependente do potencial de membrana mitocondrial é o

transporte de proteínas e precursores codificados pelo DNA celular (LODISH et al.,

2005). Para que ocorra o transporte mitocondrial de proteínas, estas precisam ter

sequências que serão reconhecidas por receptores mitocondriais. A transferência de

proteínas mitocondriais é pós-traducional e ocorre pela ação de translocadores.

Existem dois grupos de translocadores, os complexos TOM (translocase de

membrana mitocondrial externa) e TIM (translocase de membrana mitocondrial

interna). Eles podem funcionar separadamente, somente o TOM para as proteínas

de membrana externa e espaço intermembranar e, TOM e TIM para proteínas de

membrana interna e matriz. As proteínas são orientadas para as mitocôndrias por

uma pré-sequência amino terminal contendo aminoácidos carregados positivamente.

Desta forma, o potencial elétrico transmembrana mitocondrial (mais negativo

internamente), facilita o transporte destas proteínas. Uma vez que estas proteínas

são reconhecidas pelos receptores mitocondriais, elas são transportadas pelo

translocador TOM e em sequência, transferidas para o translocador TIM da

membrana interna. As proteínas destinadas às membranas mitocondriais contêm

sequências hidrofóbicas de parada de transferência que interrompem sua

transposição através dos componentes TOM e TIM, levando a sua incorporação,

respectivamente nas membranas externa e interna (LILL, NEUPERT, 1996;

PFANNER, MEIJER, 1997; REHLING et al., 2001).

Um terceiro mecanismo dependente de potencial de membrana mitocondrial é

a manutenção de um alto poder redutor na matriz mitocondrial, representado por


45

NADPH e glutationa. A NNT promove a transferência de um hidreto de NADH para o

NADP+ na matriz mitocondrial, em um processo acoplado à translocação de prótons

para o interior da organela (HOEK, RYDSTRÖM, 1988). Assim, na ausência de

potencial de membrana mitocondrial, o NADP, se encontrará em um estado mais

oxidado (RONCHI et al., 2013), diminuindo a eficácia de sistemas antioxidantes

dependentes de glutationa e tioredoxina (KOWALTOWSKI et al., 2009).

Notadamente, trabalhos com células derivadas de tumores de cólon de

humanos indicaram que células que apresentam maiores valores de potencial de

membrana mitocondrial têm uma maior capacidade de invasão e resistência à

apoptose (HEERDT et al., 2005; HEERDT et al., 2006).

4.4 Análise do ciclo celular em células de glioblastoma humano, U-87MG e

T98G

O ciclo de vida das células depende da divisão celular, tendo início assim que

uma célula é dividida e o término quando esta célula se divide ou morre por apoptose

ou necrose. O processo de divisão celular consiste na intérfase e na fase mitótica. A

intérfase é determinada por uma organização celular em atividade constante,

produzindo diversas substâncias, realizando processos físicos e químicos, é a fase

em que ocorre a duplicação do material genético. As células permanecem no estágio

da intérfase a maior parte de suas vidas (LODISH et al., 2005).

A intérfase é subdividida em três fases: G0-G1, S e G2-M. Durante a fase G0,

a célula não recebe nenhum tipo de estímulo para a divisão celular, realizando

exclusivamente a sua atividade celular. Quando há um estímulo para a divisão

celular, a célula entra em G1, onde ocorre a síntese de muitas proteínas, entre elas,

enzimas e RNA. Consequentemente, a célula aumenta seu tamanho nesta fase. A

fase S apresenta, como característica, a replicação das moléculas de DNA para cada

cromossomo existente. É nesta fase que cada cromossomo passa a ter duas

cromátides ligadas por um centrômero. Durante fase G2-M, ocorre a síntese de tudo


46

que é necessário para a formação de duas novas células, portanto, nesta etapa,

devem ter duplicadas todas as organelas celulares (LODISH et al., 2005).

O ciclo celular é regulado por diversos fatores, sendo assim, este pode ser

interrompido até determinada fase e só ter continuidade quando as condições ideais

se mostrarem presentes, como uma quantidade ideal de nutrientes ou quando a

célula atinge as dimensões apropriadas para a divisão. As células neuronais, em

condições normais, param de se dividir quando o animal atinge o estado adulto e

permanecem em G0 pelo resto da vida do animal.

No entanto, existem três momentos em que os mecanismos de regulação

atuam. No final da fase G1, células que não têm as condições apropriadas para dar

continuidade ao seu ciclo celular param e permanecem em G0. Além disso, caso

sejam detectados erros no DNA que são impossíveis de se reparar, as células

entram em apoptose. No final da fase G2-M, é verificado se a replicação do DNA

ocorreu corretamente, caso contrário, o ciclo é interrompido e as células voltam para

a fase S (LODISH et al., 2005).

A fim de se verificar a influência dos tratamentos com oligomicina e/ou

antimicina A nas fases do ciclo celular em células U-87MG e T98G, analisamos por

citometria de fluxo as fases da intérfase após um tratamento de 4 dias na presença

dos inibidores mitocondriais citados acima. Os resultados em valores percentuais

estão descritos nas tabelas III e IV, totalizando 100% das células em cada

tratamento. Estes resultados também estão mostrados na figura 13, painéis B e C.

Na linhagem celular U-87MG, quando foi adicionado um inibidor da ATP

sintase, oligomicina, ocorreu uma diminuição da porcentagem das células em G0-G1,

um aumento de 2,09 vezes na fase S, e um aumento de 1,1 vezes na fase G2-M.

Quando os tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foram

realizados, percebeu-se uma diminuição significativa celular na fase G0-G1 e um

aumento de 3,12 e 3,01 vezes na fase S quando as células foram tratadas com

antimicina A e oligomicina mais antimicina A, respectivamente. Esse grande aumento

percentual de células na fase S pode ser explicado por uma dificuldade em completar


47

os processos da divisão celular na presença destes inibidores mitocondriais, parando

em S, ou voltando da fase G2-M para a fase S. No entanto, quando observamos a

porcentagem de células na fase G2-M nestes tratamentos, percebemos uma

diminuição de 1,3 e 1,89 vezes no tratamento com antimicina A e oligomicina mais

antimicina A, respectivamente. Essa queda pode ter ocorrido devido à diminuição do

potencial de membrana mitocondrial, que é necessário para diversos mecanismos

intracelulares, não favorecendo a proliferação celular, conforme discutido no item 4.3.

U-87MG

Tratamento G0-G1 (%) S (%) G2-M (%)

Controle 79,93 13,5 6,57

Oligomicina 64,48 28,26 7,26

Antimicina A 52,82 42,16 5,02

O + AA 55,89 40,64 3,47

Tabela III – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano U-87MG relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular.

T98G

Tratamentos G0-G1 (%) S (%) G2-M (%)

Controle 71,33 21,45 7,22

Oligomicina 70,30 22,44 7,26

Antimicina A 57,05 42,59 0,36

O + AA 66,64 30,72 2,64

Tabela IV – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano T98G relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular.


48

O mesmo padrão percentual das fases da intérfase na presença dos

tratamentos oligomicina e/ou antimicina A ocorreu com a linhagem T98G. Observou-

se uma diminuição percentual em G0-G1, com consequente aumento na fase S e um

pequeno aumento na fase G2-M quando tratadas com oligomicina. Já com os

tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A, houve uma maior

queda no percentual de células em G0-G1 quando comparado com o controle,

aumentando consequentemente a porcentagem de células na fase S e uma

significativa diminuição de células na fase G2-M. Os resultados devem ser

interpretados da mesma forma como os das células U-87MG.

A figura 13, painel A, apresenta os histogramas obtidos em análises por um

citômetro de fluxo em ambas as linhagens celulares estudadas, U-87MG e T98G. O

primeiro pico representa a fase da intérfase G0-G1, o segundo pico representa as

células que se encontram em G2-M e entre os dois picos estão as células na fase S,

como mostrado na figura ilustrativa 12.

Fig. 12 – Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por um citômetro de fluxo quando se avalia a intérfase do ciclo celular. O eixo X é representado pela quantidade de DNA por célula, e o eixo Y pela quantidade de células que apresentam os valores de DNA estabelecidos no eixo X. O eixo X é avaliado por unidades arbitrárias de

fluorescência e o eixo Y pela quantidade de eventos que o citômetro identificou (RESINO, 2014).


49

A


50

Fig. 13 - Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das células de glioblastomas U-87MG e T98G.

Células U-87MG e T98G (7.000 células/cm2) foram plaqueadas em garrafas de 25 cm2 com 6 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, o meio foi renovado com a privação do soro fetal bovino. Após 24 horas, o meio foi renovado novamente, com a presença de soro fetal bovino, e as culturas celulares receberam os tratamentos específicos: DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. Após 4 dias de tratamento com os inibidores mitocondriais, as células foram fixadas em etanol 70% e mantidas a -20°C por pelo menos 24 horas. Após processamento das amostras, as fases do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± S.E.M de 8 experimentos independentes.

Painel A: Histogramas representativos da análise do ciclo celular por citometria de fluxo.

Painéis B e C: Porcentagens relativas das fases do ciclo celular após tratamentos nas condições indicadas. *P<0,05, **P<0,01 vs DMSO. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.

4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de

elétrons na proliferação de astrócitos primários em cultura

Para verificar a taxa de proliferação de astrócitos provenientes de ratos

neonatos foi utilizado o teste de redução do MTT com a produção de cristais de

formazan (Fig. 14). Estas células foram escolhidas devido à origem astrocítica das

células de glioblastoma humano utilizadas neste trabalho.

As células de astrócitos foram mantidas em cultura durante 6 dias, após este

período pôde-se observar um aumento de 2,82 vezes na atividade metabólica de

redução do MTT na situação controle, passando de um valor de absorbância de

0,084 no início do tratamento para 0,238 ao final dos 6 dias. Quando estas células

foram tratadas com oligomicina ou antimicina A observou-se, ao final de 6 dias, uma

proliferação celular semelhante às obtidas na condição controle, apresentando

absorbâncias de 0,243 e de 0,226, respectivamente. Quando ambas as drogas

estavam presentes, oligomicina mais antimicina A, as células acompanharam o

crescimento observado nos demais tratamentos até o segundo dia, seguido por uma

diminuição da atividade metabólica da redução do MTT ao final do sexto dia de

aproximadamente 20,5% quando comparadas ao controle, indicando que a

proliferação celular diminuiu significativamente.


51

Conclui-se que os astrócitos tratados com as drogas oligomicina ou antimicina

A conseguiram se proliferar em uma taxa similar aos de uma situação controle.

Contudo, quando as drogas foram adicionadas simultaneamente, houve uma queda

significativa em sua proliferação. Estes resultados indicam que há um prejuízo na

proliferação de astrócitos quando estes não mantem um potencial de membrana

mitocondrial.

A sobrevivência e proliferação de astrócitos na presença de inibidores

mitocondriais, oligomicina ou antimicina A, pode ser explicada pelo comportamento

glicolítico dos mesmos, assim como observado para as células de glioblastomas. Isto

é, a maior parte da glicose captada por astrócitos é convertida à lactato que é

utilizado por neurônios (MAGISTRETTI, 2006; RODRIGUES et al., 2013).

Fig. 14 - Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de astrócitos de ratos neonatos.

Astrócitos (15.000 células/cm2) provenientes de ratos neonatos (2 dias) foram dispostos em discos de 9,2 cm2 com 2 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h, o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. A figura apresenta os resultados de proliferação celular estimados pela redução de MTT com a produção de azul de formazan. Os dados representam a média ± S.E.M de pelo menos 6 experimentos independentes realizados em duplicata. **P<0,01 vs Control or Oligo.

Astrocyte

0 2 4 60.0

0.1

0.2

0.3Control

Oligo

AA

Oligo + AA

**

Days of Treatment

Op

tical d

ensity

of

form

aza

n a

bso

rbance

(a.u

.)

Conclusões

52

5. CONCLUSÕES

Concluímos que a rápida proliferação de células de glioma humano é altamente

dependente do funcionamento mitocondrial. Diferentemente do que se poderia

esperar, esta dependência não se deve à fosforilação oxidativa, mas a outros

processos dependentes do potencial de prótons transmembrana mitocondrial.

Relacionamos abaixo as principais conclusões dos experimentos, que nos

permitiram chegar à afirmação apresentada acima:

5.1 A inibição da ATP sintase pela oligomicina e a inibição do complexo III da

cadeia transportadora de elétrons mitocondrial pela antimicina A inibiram

parcialmente a proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. No

entanto, quando se promoveu uma inibição simultânea da ATP sintase e da cadeia

transportadora de elétrons houve uma quase total inibição da proliferação celular.

Resultados semelhantes foram obtidos em culturas de astrócitos de ratos neonatos.

5.2 Medidas de potencial de membrana mitocondrial em células intactas,

incubadas na presença de oligomicina, mostraram uma hiperpolarização

mitocondrial. Na presença de antimicina A uma redução parcial do potencial

transmembrana mitocondrial foi observada. Já a associação de oligomicina mais

antimicina A resultou em uma quase completa redução no potencial de membrana

mitocondrial, restando apenas um potencial de membrana residual. Podemos

interpretar que a potente inibição da proliferação celular pela associação da

oligomicina mais antimicina A está associada à incapacidade das mitocôndrias em

manterem um potencial de prótons transmembrana nesta condição.

5.3 Notadamente, o consumo de oxigênio pelas células U-87MG e T98G em

suspensão foi em grande parte inibido na presença de oligomicina, indicando que em

condições basais grande parte do consumo de oxigênio mitocondrial se deve à

Conclusões

53

5.4 fosforilação oxidativa do ADP a ATP. O efeito inibitório da antimicina A no

consumo de oxigênio foi próximo ao obtido pela oligomicina, o que indica que células

de glioblastoma humano têm uma respiração mitocondrial bem acoplada ao processo

de fosforilação oxidativa.

5.5 Os experimentos de medida do consumo de glicose e produção de lactato

pelas células de glioblastoma indicaram que estas células utilizam majoritariamente a

glicólise como fonte produtora de ATP (efeito Warburg).

5.6 Quando a análise do ciclo celular foi realizada observou-se uma diminuição da

porcentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-M quando

tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com antimicina A ou

oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição significativa nas fases

G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Esse grande aumento percentual de

células na fase S pode ser explicado por uma dificuldade em completar os processos

da divisão celular na presença destes inibidores mitocondriais, parando em S, ou

voltando da fase G2-M para a fase S. A diminuição na porcentagem de células na

fase G2-M pode ter ocorrido devido à diminuição do potencial de membrana

mitocondrial, que é necessário para diversos mecanismos intracelulares, não

favorecendo a proliferação celular.

A caracterização dos processos dependentes do potencial de membrana

mitocondrial necessários à proliferação de células de glioblastoma poderá trazer

conhecimentos para a melhor compreensão da fisiopatologia de glioblastomas, assim

como para o aprimoramento de seu tratamento quimioterápico.

Referências Bibliográficas

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Anexo

60

7. ANEXO

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