Laboratório de Bioquímica para Licenciatura...
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Apostila da Disciplina de Laboratório de Bioquímica para Licenciatura (SLC0674) Prof. Dr. Andrei Leitão Técnico: Eduardo Marques Moreira
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Apostila da Disciplina de
Laboratório de Bioquímica para Licenciatura
(SLC0674)
Prof. Dr. Andrei Leitão
Técnico: Eduardo Marques Moreira
Sumário
Saponificação ................................................................................................................................ 1
I. Objetivos ................................................................................................................................ 1
II.1. Obtenção de um sabão ...................................................................................................... 1
II.2. Obtenção de um sabão insolúvel ....................................................................................... 2
II.3. Obtenção de ácidos graxos insolúveis ............................................................................... 2
II.4. Obtenção de emulsão ........................................................................................................ 3
III. Questões: ............................................................................................................................. 3
Determinação de pKa de um aminoácido e efeito tampão .......................................................... 4
I. Soluções ............................................................................................................................ 4
II. Procedimento .................................................................................................................... 4
III. Questões ....................................................................................................................... 5
Obtenção e quantificação de caseína ........................................................................................... 6
I. Objetivos ........................................................................................................................... 6
II. Materiais e métodos ......................................................................................................... 6
III. Questões ....................................................................................................................... 7
Determinação de Ks e Vmax para a hidrólise de caseína com tripsina ............................................ 8
I. Objetivos ........................................................................................................................... 8
II. Materiais ........................................................................................................................... 8
III. Procedimento ................................................................................................................ 9
IV. Questões ..................................................................................................................... 11
Extração e caracterização do amido ........................................................................................... 12
I. Objetivos ......................................................................................................................... 12
II. Materiais e métodos ....................................................................................................... 12
III. Questões ..................................................................................................................... 13
Extração e caracterização de DNA .............................................................................................. 14
I. Objetivos ......................................................................................................................... 14
II. Materiais ......................................................................................................................... 14
III. Procedimento ..................................................................................................................... 14
IV. Questões ............................................................................................................................ 16
INTRODUÇÃO
A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica
As aulas práticas de Bioquímica têm como objetivo criar condições para que os estudantes
sejam capazes, ao final do curso, de:
1. Manipular equipamentos frequentemente utilizados em laboratórios de bioquímica. 2. Conhecer, por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das
substâncias que compõem os organismos vivos. 3. Interpretar resultados experimentais.
B – Normas Gerais do Laboratório Didático de Bioquímica
1. Balanças, espectrofotômetros, centrífugas, microscópios ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão ser manuseados após instruções, a fim de evitar danos e acidentes.
2. Nos dias e horas destinados aos trabalhos práticos, os estudantes terão à sua disposição professores encarregados de orientá-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos.
3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixá-los abertos inutilmente, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente.
4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar corrosão. 5. Não lançar nas pias e calhas papel de filtro usado ou quaisquer substâncias sólidas que
possam obstruir os encanamentos. 6. Não lançar fósforos acesos nos locais destinados à coleta do lixo.
C – Material do Estudante
Todo estudante deverá trazer, para o trabalho prático, o material abaixo relacionado:
1. Avental (item obrigatório) - necessário para a sua proteção. Não será permitida a presença do aluno sem esse item.
2. Apostila de Aulas Práticas - sem a qual é impossível realizar qualquer trabalho no laboratório.
3. Caneta para retroprojetor - para marcar adequadamente a vidraria durante a execução dos trabalhos práticos.
4. Material para anotações. 5. Não serão permitidos alunos de bermudas, shorts ou saias e sandálias.
D – Apostila de Aulas Práticas de Bioquímica
Constituída de roteiros para a execução do trabalho prático, com exposição completa das
marchas das operações. O roteiro de cada trabalho prático deverá ser estudado previamente a
fim de possibilitar a sua execução no laboratório. As dúvidas serão resolvidas antes do início
dos trabalhos.
O roteiro consta dos seguintes itens:
1. Objetivos específicos - relação dos objetivos que deverão ser alcançados após o término de cada aula.
2. Material necessário - relação do material necessário à execução do trabalho. 3. Procedimento – etapas do trabalho a serem seguidas. 4. Questões sobre as reações, detalhes de técnicas ou cálculos empregados durante o
trabalho prático.
E – Material Recebido e sua Limpeza
1. Cada grupo de estudantes receberá o material necessário à execução do trabalho prático.
o aluno não deverá utilizar o material de seus colegas, a não ser com autorização prévia.
2. Será exigido dos estudantes o máximo cuidado com o seu lugar na bancada e com o respectivo material.
3. No caso de inutilização ou quebra de algum material recebido, o estudante deverá dar conhecimento aos professores responsáveis pela aula, a fim de se providenciar a sua substituição.
o aluno não deverá jogar no lixo o material inutilizado ou quebrado. Deposite-o em local apropriado. Neste caso, chamar o técnico responsável.
4. Terminado o trabalho, o estudante deverá realizar a limpeza de seu lugar, deixando-o em condições de ser utilizado novamente.
F - Reagentes
1. Para cada trabalho prático haverá à disposição dos estudantes uma provisão dos reagentes relacionados nos roteiros;
2. Imediatamente após o uso cada reagente deverá ser colocado em seu lugar adequado; 3. Deve-se tomar cuidado com os vidros de reagentes e as soluções neles contidas, a fim de
se evitar contaminações; 4. Não trocar as rolhas; 5. Não retornar ao frasco original as soluções retiradas em excesso; 6. Caso seja autorizado pipetar diretamente do vidro de reagentes, usar sempre uma pipeta
limpa.
G – Execução dos Trabalhos Práticos
1. Exige-se para todos os trabalhos práticos a mesma atenção, rigor técnico e disciplina. 2. A inobservância de quaisquer dos requisitos técnicos pode induzir erros que invalidam,
parcial ou totalmente, o trabalho realizado, não se levando em conta o desperdício de material, reagentes e tempo.
3. Para que o aluno alcance a eficiência desejada é necessário que o mesmo seja pontual, assíduo, ordeiro, asseado e tenha conhecimento prévio do trabalho prático a ser executado.
H – Regras Básicas para a Elaboração dos Relatórios das Aulas Práticas
1. Os relatórios deverão ser digitados ou feitos à mão, legíveis e bem organizados.
2. Deverão ser entregues, NO MÁXIMO, 2 semanas após o término da prática.
3. Os relatórios deverão constar de: 1) Introdução (envolvendo informações TEÓRICAS acerca da prática realizada), 2) Objetivos, 3) Metodologia (material e métodos utilizados), 4) Resultados e Discussão, 5) Conclusão, 6) Referências e 7) Respostas às questões apresentadas.
I – Prevenção de Acidentes
1. Trabalhar sempre protegido por avental, usando calças (jeans de preferência) e sapato fechado.
2. Usar óculos de proteção. 3. Ter o cuidado de não abrir a torneira de gás do bico de Bunsen antes de ter a mão um
palito de fósforo aceso. 4. Não utilizar substâncias inflamáveis (álcool, éter, acetona, etc.) nas proximidades de uma
chama. Usar banhos de água ou areia. 5. Os reagentes tóxicos e/ou que exalam vapores deverão ser manuseados na capela.
Obs.: NÃO SERÁ PERMITIDA A PRESENÇA DE ESTRANHOS À TURMA DURANTE AS AULAS.
1
Prática 1
Saponificação
I. Objetivos Verificar a formação de diferentes produtos reacionais a partir de triacilgliceróis.
Fundamentação:
Triacilgliceróis de origem animal ou vegetal podem ser hidrolisados por soluções fortemente
alcalinas, sendo então convertidos em três ácidos graxos e glicerol, conforme esquema abaixo:
II.1. Obtenção de um sabão
Material necessário
- Triglicerídeos (óleo de soja, manteiga, gordura animal, óleo utilizado em fritura, etc.);
- Solução alcoólica de KOH 10%;
- Tubos de ensaio;
- Bico de Bunsen.
2
Procedimento:
Colocar em um tubo de ensaio grande, 0,8 mL de triglicerídeo.
Adicionar 5 mL da solução alcoólica de KOH 10%.
AQUECER COM CUIDADO NA CHAMA, POIS O REAGENTE É INFLAMÁVEL, mantendo em
ebuliçao branda por 3 minutos.
Acrescentar em seguida 10 mL de água destilada e aquecer por mais 2 minutos.
Verificar se a saponificação foi completa, colocando uma alíquota do sabão em um tubo de
ensaio com água. Agite vigorosamente e observe a formação de espuma.
II.2. Obtenção de um sabão insolúvel
Material necessário
- Sabão recém-preparado;
- Soluções de cloreto de cálcio (CaCl2) 10%;
- Solução saturada de cloreto de sódio (NaCl) (fornecido);
- Tubos de ensaio.
Procedimento:
Adicionar em um tubo de ensaio, 40 gotas (2,0 mL) do sabão recém-preparado. Em
seguida, adicionar 2,0 mL de cloreto de cálcio. Agite e verifique o que acontece.
Em outro tubo de ensaio, adicione 40 gotas (2,0 mL) do sabão. Em seguida, adicione
2,0 mL da solução de cloreto de sódio. Agite e verifique o que acontece.
II.3. Obtenção de ácidos graxos insolúveis
Material necessário
- Sabão recém-preparado;
3
- Béquer de 25 mL;
- Conta gotas;
- HCl concentrado (fornecido)
Procedimento:
Colocar em um béquer pequeno, 3 mL do sabão. Na capela, adicionar ácido clorídrico,
gota a gota, com agitação constante.
Observe e descreva o que aconteceu.
II.4. Obtenção de emulsão Material necessário
- Triglicerídeos (óleo de soja, manteiga, gordura animal, óleo utilizado em fritura, etc.);
- Sabão recém-preparado;
- Tubos de ensaio.
Procedimento:
Colocar em um tubo de ensaio, 0,5 mL de triglicerídeo. Adicionar 1,5 mL do Sabão recém-
prepadado. Agitar a suspensão.
Observe e descreva o que aconteceu.
III. Questões: 1. Qual o mecanismo de reação química envolvido nesta prática? 2. O processo é endotérmico ou exotérmico?
4
Prática 2
Determinação de pKa de um aminoácido e efeito tampão
I. Soluções
1. Soluções preparadas
HCl 250 mL de uma solução a 0,05 mol/L;
NaOH: 250 ml de uma solução a 0,1 mol/L.
2. Soluções a serem preparadas
ácido oxálico: 25 mL de uma solução a 0,1 mol/L;
Ácido acético: 250 mL de uma solução a 0,1 mol/L;
NH4OH: 250 mL de uma solução a 0,1 mol/L.
3. Solução de glicina
Preparar 50 mL de uma solução de Glicina a 0,1 mol/L e ajustar o pH para 1,8, com HCl
(3,0 mol/L).
II. Procedimento
4. Titulações
a) Ácido oxálico (20,0 mL) versus NaOH, por meio de titulação potenciométrica;
b) HCl versus NaOH, por meio de titulação potenciométrica;
c) HCl versus NH4OH (20 mL) por meio de titulação potenciométrica;
d) NaOH versus Ácido acético (20 mL), por meio de titulação potenciométrica;
5
e) NaOH versus Glicina (20 mL), por meio de titulação potenciométrica.
Observações:
1. Calibre o PHmetro, ajustando primeiramente o pH 7,0 no botão “E” e depois o pH 4,0
no botão de sensibilidade.
2. As titulações potenciométricas devem ser realizadas de 0,2 em 0,2 mL na faixa próxima
ao ponto de viragem.
3. Colocar em gráfico todos os dados das titulações potenciométricas e determinar os
valores de pKa para cada caso (pelo método das paralelas ou derivada primeira).
4. Montar os gráficos de titulação potenciométrica e determinar os valores de pKa.
III. Questões
1. Faça o cálculo necessário de massa para preparar a solução de NaOH, HCl e ácido
oxálico utilizados no experimento (tópico I).
2. Quais as características química e bioquímica da glicina?
3. Onde ocorrem os efeitos tampões nos gráficos? Explique sua resposta.
4. Os valores encontrados estão de acordo com os dados da literatura? Justifique.
6
Prática 2
Obtenção e quantificação de caseína
I. Objetivos Obtenção e quantificação da caseína e determinação da sua massa molecular.
II. Materiais e métodos
1. Obtenção da caseína
Pese 10 g de elite em pó e transfira para um béquer de 250 mL, seguido da adição de
125 mL de água destilada. Adicione a seguir HCl (0,1 mol/L) com auxílio de uma bureta a uma
vazão de 5 mL por minuto sob constante agitação até que o pH seja igual a 4,60 medido no
pHmetro.
Para cada 5 mL de HCl adicionado verifique o PH com papel indicador (intervalo de
leitura de 3,8 a 5,4) até que o valor lido esteja por volta de 4,8. Em seguida, ajuste até 4,60 no
PHmetro. Deixe a caseína sedimentar totalmente, descarte o sobrenadante e lave tantas vezes
quantas forem necessárias com água destilada, até que o teste para fosfato solúvel seja
negativo (veja item 1.1). Filtre o resíduo resultante em funil de Buchner.
1.1 Teste do fosfato
Retirar 2 ML do sobrenadante, transferindo-o para um tubo de ensaio, contendo 2 mL
de solução de molibdato de amônio [(NH4)6Mo7O24.4H2O)] a 9% e 2 ML de HNO3 a 6 mol/L. O
aparecimento de um precipitado amarelo indica a presença de fosfato.
As lavagens devem ser realizadas até que o teste forneça um resultado negativo.
Anote a massa e calcule o rendimento relativo à massa inicial de leite em pó.
2. Quantificação de uma solução de caseína
Pesar uma massa de caseína (a partir do obtido na etapa anterior) para obter 25 mL de
uma solução 1% (m/v). Dissolva-a a quente em 25 mL de tampão borato (pH 7,6) com agitação
7
magnética. Filtrar a solução se necessário a quente em um chumaço de algodão. Completar o
volume para 25 mL com água em balão volumétrico (Atenção: Não coloque diretamente o
filtrado quente no balão volumétrico).
A partir de uma solução estoque de caseína com concentração conhecida (fornecida)
construa uma curva de padronização como mostra a Tabela 1. Simultaneamente, proceda com
sua solução de caseína obtida anteriormente de acordo com os itens C e F da Tabela 1 abaixo.
Tabela 1. Volumes de reagentes adicionados para construção da curva de
padronização da caseína.
Tubos Volume da solução de
caseína padrão (mL)
Volume de
tampão borato (mL)
Volume de
biureto (mL)
mgproteína/mL A
(550 nm)a
A 1,0 0,0 4,0
B 0,8 0,2 4,0
C 0,6 0,4 4,0
D 0,5 0,5 4,0
E 0,4 0,6 4,0
F 0,2 0,8 4,0
G 0,0 1,0 4,0
a Filtro verde no fotocolorímetro (550 nm).
Após as adições do reagente de Biureto agitar os tubos e deixar repousar por 30
minutos à temperatura ambiente, seguido das leituras no fotocolorímetro ou
espectrofotômetro a 550 nm. Construir uma curva de padronização de absorbância versus mg
de proteína/mL. Extrapole o seu valor de absorbância para determinar a concentração da sua
solução de caseína.
III. Questões
1. Qual é a estrutura química da caseína e sua principal função metabólica?
2. O rendimento obtido está coerente com aquele descrito no rótulo?
3. Mostre a reação da proteína com o biureto. Como ele é preparado?
4. Este procedimento pode ser utilizado para obtenção de outras proteínas? Justifique.
8
Prática 3
Determinação de Ks e Vmax para a hidrólise de caseína com
tripsina
I. Objetivos Determinação da cinética da reação de hidrólise de caseína pela tripsina.
II. Materiais
1. Soluções a serem preparadas
1.1 Solução tampão de borato de sódio (0,2 mol/L) a pH 7,6, 100 mL
Dissolva a massa correspondente de borato de sódio a 0,2 mol/L em 75 mL de água
destilada (dissolver a quente). Esfriar a solução e ajustar o pH para 7,6 com HCl 3 mol/L
(fornecido). Completar o volume até 100 mL e checar novamente o pH. Se necessário, ajustá-lo
para 7,6.
1.2 Solução de CaCl2 (5x10-3 mol/L), 50 mL
Dissolva a massa de cloreto de cálcio correspondente a 5x10-3 mol/L em 50 mL de
tampão borato a pH 7,6 e, se necessário, ajuste o pH.
1.3 Solução de caseína 1% em tampão borato (0,2 mol/L) a pH 7,6
Dissolva (a quente) a massa obtida em 25 mL de tampão borato a pH 7,6, sem cloreto
de cálcio. Filtrar a solução, se necessário, e completar o volume com água para 25 mL, em
balão volumétrico. A concentração real de caseína será determinada com auxílio de um fator
de conversão determinado pelo “end point” da reação. Este fator (F) será fornecido,
convertendo unidades de densidade ótica em mg de proteína solubilizada. Se sua caseína
estiver em forma de placa, converse com o técnico ou professor responsável.
1.4 Solução de tripsina (fornecida)
Pese 4 mg de tripsina e dissolva em 25 mL de tampão borato com cloreto de cálcio.
1.5 Solução de ácido tricloroacético 5% (TCA) (fornecida)
9
Pese 5 g de TCA e dissolva em 100 mL de água destilada. Cuidado: altamente
corrosiva.
III. Procedimento
2. Cinética enzimática
Pipetar em tubos de ensaio as soluções de caseína e tampão Borato com CaCl2, como
mostrado na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1. Volumes da solução de caseína e de tampão com CaCl2 adicionado em cada
tubo.
Número do tubo Volume de
solução de caseína (mL)
Volume de tampão
com CaCl2 (mL)
1 0,2 0,8
2 0,4 0,6
3 0,5 0,5
4 0,6 0,4
5 0,8 0,2
6 0,9 0,1
7 1,0 0,0
8 1,0 0,0
9 1,0 0,0
Observação: Não continuar a prática sem ler previamente o texto com muita atenção.
Após o término da Tabela 1, adicione 1 mL de solução de tripsina no tubo 1. Coloque-o
em banho termostático a 36 oC e incube por 1 minuto. Adicione 1 mL de solução de tripsina no
tubo 2 e coloque-o em banho termostático 36 oC e incube por 1 minuto. Repita o
procedimento para todos os outros tubos. Após este procedimento, os tubos devem
permanecer em banho termostático a 36 oC até que o tubo 1 complete 60 minutos. Retire os
tubos do banho e adicione 3 mL de ácido tricloroacético 5% (TCA) após 1 minuto, repita o
procedimento do tubo 1 para o 2 e assim por diante até o tubo 7.
10
Tubo 8: Adicione 1 mL de tripsina e deixe hidrolisar durante 1 semana à temperatura
ambiente. Após est período adicione 3 mL de TCA 5% e proceda como nos demais tubos. Este
tubo nos dará o “end point” da reação.
Observação: o “end point” corresponde ao valor máximo de absorbância.
Tubo 9: Adicione 3 ML de TCA 5% e 1 mL de tripsina, nesta ordem (Branco). Atenção:
Após a leitura no espectrofotômetro, guarde o tubo 9 juntamente com o tubo 8.
Centrifugue todos os tubos, exceto o tubo 8, e observe a ordem de intensidade de
precipitado nos tubos. Remova cuidadosamente 3,0 mL de sobrenadante de cada um,
colocando-os em tubos numerados como anteriormente. Faça as leituras de absorbância (ou
densidade ótica, DO) do sobrenadante no espectrofotômetro em 270 nm.
Determinação da concentração de caseína solubilizada:
Absorbância (DO) x F = concentração de caseína solubilizada.
(F = 1,108 mg de proteína/mL)
Complete a tabela II.
11
Tabela 2. Valores de absorbância, concentração da caseína e velocidade de reação.
Número do
tubo
Absorbância mgproteína/mL mol/mL Velocidade
(mol/mL.min)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Observação: Massa molecular média da caseína = 23.600 Daltons (Da).
IV. Questões
1. Qual é a importância de calcular o Km e Vmax?
2. Por que utilizar a cubeta de quartzo e não a de vidro como na prática anterior?
12
Prática 4
Extração e caracterização do amido
I. Objetivos Obtenção e caracterização do amido de batata por hidrólise ácida e enzimática.
II. Materiais e métodos
1. Extração do amido da batata
Descascar e picotar a batata de tamanho médio, transferindo os pedaços com cerca de
1 cm x 1 cm x 1 cm para um béquer. Adicionar 100,0 mL de água destilada e homogeneizar
durante cerca de 30 s com o liquidificador com velocidade máxima. Filtrar em duas folhas de
gaze dobradas apenas uma vez, recolhendo o filtrado em um béquer de volume apropriado, e
espremer a gaze no final. Deixar o amido decantar no béquer, em seguida cuidadosamente
desprezar o líquido sobrenadante.
Caso o amido obtido não esteja completamente branco, lave-o novamente com água
destilada, repetindo ou não a filtração em gaze, deixando o amido depositar para nova
decantação. Retirar o líquido sobrenadante e deixar secar no fundo do béquer em um
dessecador com secante durante 24 h ou uma semana. Pesar e calcular o rendimento.
2. Preparação da solução de amido a 1% (m/v), 100 mL
Manter inicialmente 75 mL de água destilada, fervendo em um béquer de 250 mL.
Enquanto isto, adicionar aproximadamente 25 mL de água destilada fria ao amido extraído
anteriormente (1 g em 100 mL) e agitar fortemente até deixar todo o amido em suspensão. A
seguir, adicionar lentamente esta suspensão à água em ebulição, sob agitação constante.
Continuar o aquecimento e agitação até que forme uma solução opalescente. Rotular como:
Solução de amido e o número do grupo.
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3. Hidrólise do amido
3.1 Hidrólise ácida do amido
Colocar o erlenmeyer contendo 25 mL da solução de amido (1 %) no banho maria. A
seguir adicione 1 mL de HCl ao erlenmeyer. Agitar, marcar o tempo (tempo zero) e
imediatamente retirar 2 mL da mistura, colocando 1 mL em cada um dos dois tubos de ensaio
numerados. Esfriar os dois tubos em água corrente. Adicionar a um dos tubos 2 mL de
reagente de Benedict e deixar em banho maria por exatos 5 minutos para testar a presença de
sacarídeos redutores. Adicionar 3 gotas de solução de iodo ao outro tubo e agitar a
temperatura ambiente. Anotar os resultados.
Repetir o mesmo procedimento para os tubos após 5, 10, 20 e 40 minutos, dividindo
cada amostra em dois tubos de ensaio numerados, esfriando-os em água corrente e repetindo
as etapas do reagente de Benedict e de iodo.
3.2 Hidrólise enzimática do amido
Coletar 2 mL de saliva em um tubo de ensaio. Colocar 15 mL de solução de amido em
um tubo de ensaio. Colocar a seguir os dois tubos em banho termostático a 37 oC por 10
minutos para equilibrar as temperaturas da enzima e do substrato. Adicionar 0,5 mL de saliva
ao tubo contendo amido, agitar, marcar o tempo e imediatamente retirar 2 mL da mistura
colocando 1 mL em cada um dos tubos de ensaio numerados. Sem demorar, adicionar 3 gotas
de solução de iodo em um dos dois tubos e agitar. Ao outro tubo adicionar 2 mL de reagente
de Benedict e deixar em banho maria por exatos 5 minutos para testar a presença de
sacarídeos. Anotar os resultados.
Retirar as amostras de 2 mL do tubo de reação após 5, 10, 20 e 40 minutos, dividindo
cada amostra em dois tubos de ensaio e repetindo as mesmas etapas dos dois tubos
anteriores.
III. Questões
1. Demonstre, com estruturas químicas, a reação de Benedict e do iodo com o amido
hidrolisado ou não.
2. Mostre outra reação que possa ser utilizada para determinar qualitativamente a presença
do açúcar redutor (com estruturas químicas).
3. Mostre as reações que ocorrem na hidrólise ácida e enzimática do amido com estruturas
químicas.
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Prática 5
Extração e caracterização de DNA
I. Objetivos
Conhecer as propriedades físico-químicas fundamentais do DNA através da extração
do material genético da cebola, a partir dos tecidos do bulbo e de suas propriedades óticas.
II. Materiais
Soluções a serem preparadas:
A ) Preparar 100,0 mL de uma Solução Extratora contendo:
- citrato de sódio 0,15 mol/L
- dodecil sulfato de sódio (SDS) 5% m/v
- NaCl 0,15 mol/L
- EDTA 0,001 mol/L partindo de uma solução estoque 0,05 mol/L (fornecida).
Completar o volume final com água
B) Preparar 50,0 mL de uma Solução de Solubilização Tris-HCl (pH 8) contendo:
- tris-HCl 0,01 mol/L partindo de uma solução estoque de 0,2 mol/L (fornecida)
- EDTA 0,001 mol/L partindo de uma solução estoque 0,05 mol/L (fornecida).
Completar o volume final com água
Observação: As soluções de Tris-HCl e EDTA serão fornecidas separadamente.
III. Procedimento
Extração do DNA da Cebola
1. Aquecer 100 mL da solução extratora, em um béquer de 250 mL, a 60 oC em um banho
térmico;
2. Adicionar aproximadamente 50,0g de cebola picotada e agitar suavemente por 2 min.;
3. Deixar descansar por 15 min. nesta temperatura (60°C), a qual não deverá ser
ultrapassada;
15
4. Colocar imediatamente o béquer em banho de gelo até atingir a temperatura entre 15 e
20 C, sempre com agitação suave para permitir o esfriamento homogêneo. O tempo de
resfriamento não pode ultrapassar 6 minutos;
5. Agitar por 45 s em baixa velocidade com o auxílio de um agitador magnético, e em
seguida, por 15 s em alta velocidade com auxílio de um Mixer;
Observação: Lembrar-se de retirar a barra magnética (“pulguinha”) antes de usar o Mixer.
6. Colocar o homogeneizado em um béquer de 500 mL e deixar em repouso por mais 20 min.
no banho de gelo;
7. Filtrar a mistura utilizando um filtro formado por 4 camadas de gaze para um béquer de
plástico de 250 mL, tomando cuidado para não deixar passar a espuma;
8. Colocar o béquer de plástico em banho de gelo até atingir a temperatura entre 10 e 15C.
9. Resfriar em banho de gelo um volume de etanol 95%. Esse volume de etanol deverá ser o
mesmo que o obtido na filtração da etapa anterior;
10. Adicionar ao filtrado o etanol previamente resfriado. Esta adição deve ser lenta com o
etanol escorrendo pela parede do béquer, sem agitação;
Observação: Não mexer vigorosamente o tubo de ensaio ou frasco de plástico após a
adição do etanol!
11. Quando a solução estiver viscosa, utilizar um bastão de vidro para coletar o DNA em
suspensão. Para isso, tocar rapidamente a superfície da fase líquida com a ponta do bastão
e girar o bastão somente em um sentido. A substância aderida ao bastão é o DNA
existente nas células da cebola;
12. Colocar o bastão com o DNA dentro de uma proveta de 25,0 mL contendo 5,0 mL da
solução de solubilização para dissolver o material.
Determinação da concentração do DNA
1. Diluir em um tubo de ensaio 0,5 mL da solução estoque de DNA preparada anteriormente
para 10 mL em solução de solubilização;
2. Agitar suavemente o tubo;
3. Fazer a leitura da absorbância em 260 nm. Um valor de absorbância de 0,5 corresponde a
25 μg da dupla hélice do DNA/mL. Se a leitura de absorbância for maior que 0,7 ou menor
que 0,1 conversar com os responsáveis.
16
Determinação da estabilidade térmica e da pureza do DNA
1. Dissolver toda a amostra do DNA obtida no item 12 com a solução de solubilização para
dar origem a uma solução de DNA de 25 μg/mL. Se persistir a presença de material
insolúvel, filtrar a solução utilizando um chumaço de algodão;
2. Transferir para 3 tubos de ensaio alíquotas de 10 mL cada um, sendo que dois tubos serão
aquecidos em banho-Maria (água em ebulição) por 15 min, e o terceiro tubo deixado sem
aquecer;
3. Após este período, um dos tubos aquecidos deve ser esfriado rapidamente em banho de
gelo por 15 min e o outro tubo deve ser esfriado lentamente em temperatura ambiente;
4. Em temperatura ambiente, fazer uma curva de absorção entre 245 e 320 nm (1 medida a
cada 5 nm) dos 3 tubos, usando como branco o tampão de solubilização;
5. Outra informação importante obtida do espectro de UV é referente à pureza da
preparação do DNA. Soluções de alta pureza apresentam uma razão de absorbâncias
A260/A280 1,8.
IV. Questões
1. Por que a presença do SDS, EDTA e NaCl nesta prática?
2. Explique o efeito observado pelo aquecimento da solução aquosa do DNA.
3. A quantidade de DNA encontrada na cebola é condizente com a literatura?
4. Quais as impurezas que podem existir e em qual comprimento que absorve no UV o DNA e
as impurezas?
