Roteiro de Aulas Práticas de Bioquímica

7/23/2019 Roteiro de Aulas Práticas de Bioquímica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA

R OTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

Práticas de Bioquímica 1

ROTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS

Profa.Dra. Regina Célia de Assis






DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS AMINOÁCIDOS

As proteínas são substâncias orgânicas de alto peso molecular formadas por um grande número deaminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. As células de todos os organismos vivos contêm umavariedade de proteínas com funções diferentes. As membranas que circundam as células contêm proteínas, as

reações metabólicas que se dão no interior das células são catalisadas por enzimas que são proteínas. Areprodução das células e a transmissão das características hereditárias dependem das proteínas. Certoshormônios são proteínas, e os anticorpos que defendem o corpo são proteínas. Quando as proteínas sãohidrolisadas, elas são convertidas numa mistura de aminoácidos. São conhecidos cerca de 20 aminoácidosobtidos a partir de proteínas. O propósito das experiências descritas é a determinação qualitativa de aminoácidos

bem como a pesquisa da ligação peptídica. A molécula protéica é tão complexa que às vezes é difícil interpretaro seu comportamento químico. As proteínas de um modo geral refletirão as propriedades químicas de seusaminoácidos. Muitas reações coloridas das proteínas dependem da presença de um determinado aminoácido.

1 - R EAÇÃO DO BIURETO

As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham mais de duas ligações peptídicas são reagentes

positivos para a Reação do Biureto.O Biureto é formado da decomposição da uréia a uma temperatura de 180°C.

As soluções alcalinas com biureto apresentam uma coloração violeta na presença de sulfato de cobre(CuSO4). Isso ocorre pela formação de um complexo entre o íon Cu+2 e os átomos de nitrogênio da molécula do

biureto.

R

H

H

H

R

N

N

O

N

O

R

H

H

H

R

N

N

O

N

O

Cu2+

As ligações presentes na molécula do biureto são semelhantes às ligações peptídicas que unem osaminoácidos na formação dos peptídeos e proteínas.

R EAGENTE DE BIURETO

Dissolva 1,5g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e 6,0g de tartarato de sódio e potássio(KNaC4H4O6.4H2O) em 500 mL de água destilada. Adicione, sob agitação constante, 300 mL de solução de

hidróxido de sódio (NaOH) 10%. Complete o volume para 1L com água destilada e guarde o reagente em frascoâmbar. Conserve por tempo indefinido.






TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Reagente de biureto;

ii.

Solução de ovoalbumina 2%;iii. Solução de gelatina 1%;iv. Água destilada.b. Vidraria:i. 3 tubos de ensaio;

ii. 4 pipetas de 5 mL.2) Procedimento:a. Numere os tubos de ensaio;

b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. Tubo 1 com 2 mL de solução de ovoalbumina 2%;

ii. Tubo 2 com 2 mL de água destilada;

iii.

Tubo 3 com 2 mL de solução de gelatina 1%;c. Adicione 1 mL de reagente de biureto em cada tubo;d. Agite os tubos;e. Observe e anote os resultados.

2 - R EAÇÃO DE NINHIDRINA

Aminoácidos que possuem um grupo amino livre aquecidos em solução com excesso de ninhidrinaformam um composto chamado Púrpura de Rühemann. Essa reação pode ser utilizada para a detecção de

peptídeos e proteínas que apresentam essas características, aminas primárias e amônia. Nas condiçõesapropriadas, a intensidade da cor violeta produzida é relacionada à concentração das espécies presentes. A

prolina, que é um iminoácido, forma um composto amarelo.

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução aquosa de ninhidrina [C6H4COCO.C(OH)2] 0,1%;

ii. Solução de ovoalbumina 2%.

b.

Vidraria:i. 1 tubo de ensaio;

ii. 2 pipetas de 5 mL.






2) Procedimento:a. Preparar o tubo com as seguintes soluções:i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;

b. Adicione 10 gotas da solução de ninhidrina 1 %;

c.

Agite o tubo;d. Aqueça em banho maria durante 2 minutos;e. Observe e anote os resultados.

3 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS

Os cátions de metais como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas pela formação de sais insolúveis de metal com as proteínas negativamente carregadas, forma em que seencontram em meio alcalino. Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI)

porque nessa circunstância, a carga total sobre a proteína é negativa, o que favorece a interação com os cátionsmetálicos. Pode ocorrer a ressolubilização se o pH for corrigido.

O

R

NH3

+O

-2 + HgCl2

2NaOH

Hg

O

R

NH3

+O

O

R

NH3

+O

+ 2NaCl + 2H2O

Proteína Cloreto de Mercúrio Sal Insolúvel do metal Cloreto de sódio

O

R

NH3

+O

-2

2NaOH

Pb(II)

O

R

NH3

+O

O

R

NH3

+O

+ 2CH3COONa + 2H

2O

Proteína Acetato de Chumbo Sal Insolúvel do metal Acetato de sódio

Pb(II)

CH3

O

O

CH3

O

O

TÉCNICA

1) Material:

a.

Soluções e reagentes:i. Solução de cloreto de mercúrio (HgCl2) 5%;ii. Solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb.3H2O] 10%;

iii. Solução de ovoalbumina 2%.b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;


b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. 2 mL de solução de ovoalbumina 2%;

c. Adicione ao primeiro tubo 7 gotas de HgCl2 5%;

d. Adicione ao segundo tubo 5 gotas de (CH3COO)2Pb.3H2O 10%;e. Agite levemente;f. Observe e anote os resultados.






4 - PRECIPITAÇÃO PELOS ÁCIDOS FORTES

Estes ácidos desnaturam as proteínas transformando-as em metaproteínas insolúveis. Essa precipitaçãoé mais intensa quando o pH está abaixo do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, abaixo do pI, a carga líquida sobrea proteína é positiva, favorecendo a interação com os ânions provenientes dos ácidos fortes. Pode ocorrer a

ressolubilização se o pH for corrigido.

P R O T E Í N A + H N O 3 → M E T A P R O T E Í N A ↓

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução de ácido nítrico concentrado (HNO3);

ii. Solução de ovoalbumina 2%;iii. Água destilada.b. Vidraria:

i.

1 tubo de ensaio;ii. 3 pipetas de 5 mL.2) Procedimento:a. Prepare o tubo com a seguinte solução:i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;

b. Adicione 3 mL de água destilada;c. Incline o tubo e acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de ácido nítrico concentrado (HNO3), sem agitar;

d. Observe e anote os resultados.

5 - R EAÇÃO XANTOPROTEICA

O benzeno reage lentamente com o ácido nítrico (HNO3) concentrado formando o nitrobenzeno. Essa

reação pode ser acelerada por aquecimento tornando a coloração da reação amarela. Essa reação também ocorrecom aminoácidos que possuam em suas cadeias laterais anéis benzênicos, que ocorre com a tirosina e otriptofano, e em condições de nitração mais fortes, ocorre também para a fenilalanina. Se a reação for mantidaem meio básico, a coloração será vermelho alaranjada.

O

NH3

+

OH

O-

Tirosina (Tyr)

Nitroderivadoamarelo

O

NH3

+

OH

O-

N+

O-

O

+ HNO3

-H2O

NaOH

Nitroderivado

vermelho

alaranjado

Nitroderivadoamarelo intenso

+ HNO3

-H2O

NaOH

Nitroderivadovermelho

alaranjado intenso

O

NH3

+

NH

O-

Triptofano (Trp)

O

NH3

+

NH

O-

N+

O-

O






TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução de ácido nítrico concentrado (HNO3);

ii.

Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2N;iii. Solução de ovoalbumina 2%.b. Vidraria:i. 1 tubo de ensaio;

ii. 3 pipetas de 5 mL.2) Procedimento:a. Prepare o tubo com a seguinte solução:i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;

b. Acrescente 10 gotas de ácido nítrico concentrado (HNO3);c. Aqueça o tubo em banho maria;d. Adicione 4 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2N;

e.

Observe e anote os resultados.6 - R EAÇÃO DE MILLON

O grupamento hidroxifenil da tirosina sofre uma nitração pelo ácido nítrico presente na solução. Após anitração, esse produto reage com os íons mercúrio na solução, formando o fenolato de mercúrio que forma umasolução ou precipitado vermelho, resultados positivos. Como a tirosina é o único aminoácido a apresentar umgrupo fenólico, esse teste se torna específico para verificação da presença ou ausência desse aminoácido. Areação não deve ser feita em meio alcalino forte devido à precipitação do mercúrio sob a forma de óxido.

O

NH3

+

OH

O-

Tirosina (Tyr)

+Hg++ HNO3

HgO O

O

NH3

+

CH3 O

-

Alanina (Ala)

2 2

Fenolato de mercúrio R EATIVO DE MILLON

Adicione 40 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado frio em 20 g de mercúrio (Hg0), dissolvendo poraquecimento. Dilua com água destilada 2 vezes em volume. Deixe decantar por 24 horas e use o sobrenadante. Oreativo de Millon pode ser armazenado por longos períodos em geladeira.

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução do reagente de Millon;

ii. Solução de gelatina 1%;iii.

Solução de ovoalbumina 2%.b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;


b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;

ii. 1 mL de solução de gelatina 1%;c. Adicione aos dois tubos 5 gotas do reativo de Millon;d. Agite levemente;

e.

Observe e anote os resultados;f. Aqueça em banho maria o tubo com a solução de ovoalbumina com reativo de Millon;g. Observe e anote os resultados.






7 – REAÇÃO DO GRUPO SULFIDRILA

Dos aminoácidos que apresentam enxofre em sua constituição apenas a cisteína e a cistina são capazesde liberá-lo à quente e no meio alcalino. O enxofre liberado forma sulfeto de sódio que reage com o acetato dechumbo, formando o sulfeto de chumbo precipita na cor preta ou castanha. O enxofre da metionina não é

liberado em meio básico.

O

NH3

+SH O

-

Cisteína (Cys)

2NaOH

Na2S + H

2O +

O

NH3

+OH O

-

Serina (Ser)

Na2S +

Acetato de Chumbo

Pb(II)

CH3

O

O

CH3

O

O

PbS + 2Na

O

OCH3

Sulfeto de sódio Sulfeto de chumbo Acetato de sódio

Sulfeto de sódio

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Chumaço de cabelo;

ii. Solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%;iii. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 50%.b. Vidraria:i. 1 tubo de ensaio;

ii. 2 pipetas de 5 mL.2) Procedimento:a. Coloque o chumaço de cabelo no tubo de ensaio;

b. Adicione 5 gotas da solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%;c. Acrescente 2 mL da solução de hidróxido de sódio (NaOH) 50%;

d.

Ferva durante 5 minutos;e. Observe e anote os resultados.

R EAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS

Os carboidratos podem ser definidos como: poli-hidroxialdeídos ou poli-hidroxicetonas(monossacarídeos), seus polímeros (oligossacarídeos polissacarídeos), seus produtos de redução, oxidação e seus

produtos de substituição. A função mais importante dos carboidratos no organismo é servir como combustível,fornecendo a fonte principal de energia, graças a sua oxidação a CO2 e H2O, através de uma via complexa, deimportância fundamental no metabolismo de todos os componentes da célula animal. São as biomoléculas maisabundantes da natureza.

Para um completo entendimento de muitas reações que se processam com os carboidratos nos seresvivos, é indispensável o conhecimento de suas estruturas, suas reações e de que maneira eles são identificados nolaboratório. As reações a seguir são clássicas, geralmente reações coloridas que apesar do advento da técnica decromatografia ainda são muito utilizadas para identificação dos diversos tipos de carboidratos.






I – IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS

1 – TESTE DE MOLISCH

Os ácidos concentrados como o ácido sulfúrico (H2SO4) causam a desidratação de um monossacarídeo.

Se um oligossacarídeo ou polissacarídeo estiver presente, eles são primeiro hidrolisados aos seusmonossacarídeos constituintes os quais então são desidratados. Pela desidratação originam-se o furfural ou seusderivados. As pentoses formam o furfural e as hexoses o hidroximetilfurfural. Vários compostos fenólicos comoo timol ou o α-naftol condensam com o furfural ou seus derivados e formam compostos coloridos de estruturascomplexas.

O teste de Molisch é considerado uma reação geral para carboidratos livres ou combinados, mas não éespecífica, porque pode ocorrer com outras substâncias. Por isso, quando positiva não indica necessariamente

presença de um carboidrato, mas sendo não reagente, indica seguramente sua ausência.

O

OOH

D-Glucose

H2SO4

5 hidroximetilfurfural

+ 3 H2O Naftol

(Composto de cor violeta)

O

OHOHOH

OH

OH

OH

O

O

D-Arabinose

H2SO

4

Furfural

+ 3 H2O

O

OHOH

OH

OH

OH

OH

O

OH

2

Naftol

(Composto de cor violeta)

OH

OH

OH

O

2

4,4'-(furano-2-ilmetanedil)dinaftaleno-1-ol

4,4'-{[5-(hidroximetil)furano-2-il]metanedil}dinaftaleno-1-ol

R EAGENTE DE MOLISCH

Dissolva 20g de α-naftol em 100 mL de etanol 94°GL.

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i.

Reagente de Molisch;ii. Solução de Ácido Sulfúrico (H2SO4) concentrado;

iii. Solução de glicose 1%;iv. Solução de sacarose 1%;v. Solução de amido 1%

vi. Água destilada.b. Vidraria:i. 4 tubos de ensaio;


b.

Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. Tubo 1 com 1 mL de solução de glicose 1%;

ii. Tubo 2 com 1 mL de solução de sacarose 1%;






iii. Tubo 3 com 1 mL de solução de amido 1%;iv. Tubo 4 com 1 mL de água destilada.c. Adicione duas gotas do reagente de Molisch em cada tubo;d. Agite os tubos;

e.

Adicione cuidadosamente e sem agitação 1 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, inclinando o tubo edeixando escorrer lentamente pelas paredes;f. Deixe o tubo em repouso na estante por 5 minutos;g. Observe e anote os resultados.

2 – TESTE DO LUGOL

O amido, polissacarídeo importante, é constituído por dois outros polissacarídeos estruturalmentediferentes que são a amilose e a amilopectina. A ligação glicosídica da amilose é Gli α(1:4)Gli, não apresentando

portanto, ramificações e, no espaço, assume a conformação helicoidal. Já a amilopectina, além das ligações Gliα(1:4)Gli, a cada 20 a 25 moléculas de glicose apresenta uma ligação Gli α(1:6)Gli, formando então

ramificações, não formando uma estrutura helicoidal.

RR

O

O

HH

H

O

OH

H OH

H

OH

O

OH

HH

OH

H OH

H

OH

n

Amilose

O iodo presente no lugol reage com a amilose formando um complexo de cor azul escuro ou intenso pela oclusão ou aprisionamento do iodo nas cadeias lineares da amilose. A reação com o glicogênio ou com asdextrinas formam um complexo de cor marrom avermelhado porque a interação com o iodo é menor e a

coloração então, menos intensa. Outros carboidratos poliméricos como a celulose ou mono e dissacarídeos nãoformam esse complexo com o iodo por não apresentarem uma conformação que interaja com o iodo.

RR

O

O

HH

H

O

OH

H OH

H

OH

O

O

HH

H

O

OH

H OH

H

OH

R

O

O

HH

H

OOH

H OH

H

OH

O

HH

H

OOH

H OH

H

OH

O

HH

H

OH

H OH

H

Amilopectina






SOLUÇÃO DE LUGOL

Dissolva 100 g de KI e 50 g de I2 em 100 mL de água destilada e complete o volume para 1 L.

TÉCNICA

1)

Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução de Lugol;

ii. Solução de glicose 1%;iii. Solução de sacarose 1%;iv. Solução de amido 1%v. Água destilada.b. Vidraria:i. 4 tubos de ensaio;

ii. 5 pipetas de 2 mL.2) Procedimento:

a.

Numere os tubos de ensaio; b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:

i. Tubo 1 com 1 mL de solução de glicose 1%;ii. Tubo 2 com 1 mL de solução de sacarose 1%;

iii. Tubo 3 com 1 mL de solução de amido 1%;iv. Tubo 4 com 1 mL de água destilada.c. Adicione duas gotas do reagente de Lugol em cada tubo;d. Agite os tubos;e. Aqueça um pouco no banho maria o tubo 3 até a mudança de coloração;f. Resfrie em água corrente e observe;g. Observe e anote os resultados de todos os tubos.

II – IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS R EDUTORES

1 – R EAÇÃO DE BENEDICT

Os monossacarídeos possuem na sua estrutura um grupamento aldeído livre ou em potencial o qual poderá reduzir certos íons metálicos. Reagentes alcalinos de sais de cobre são muito usados para pesquisas deaçucares redutores. Sob a ação de um agente redutor, o hidróxido cúprico é reduzido a hidróxido cuproso que poraquecimento forma óxido cuproso.

O

OHOHOH

OH

OH

-D-Glicose

+ 2Cu(OH)2

- H2O O

OHOHOH

OH

O-

OH

Ácido -D-Glicônico

+ 2CuOH- H

2O

Cu2

O

Precipitado

vermelho-tijolo

R EAGENTE DE BENEDICT

Dissolva 173 g de citrato de sódio (C6H5O7 Na3.5H2O) e 100 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3)em 800 mL de água a quente. Filtre se necessário e complete o volume para 850 mL. Dissolva 17,3 g de sulfatode cobre (CuSO4) em 100 mL de água e adicione na primeira solução aos poucos, agitando continuamente.Complete então o volume para 1 L. A solução final pode ser conservada por muito tempo.






TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Reagente de Benedict;

ii.

Solução de glicose 1%;iii. Solução de sacarose 1%;iv. Solução de frutose 1%;v. Solução de amido 1%

vi. Água destilada.b. Vidraria:i. 5 tubos de ensaio;


b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:

i.

Tubo 1 com 1 mL de solução de glicose 1%;ii. Tubo 2 com 1 mL de solução de sacarose 1%;

iii. Tubo 3 com 1 mL de solução de frutose 1%;iv. Tubo 4 com 1 mL de solução de amido 1%;v. Tubo 5 com 1 mL de água destilada.c. Adicione 1 mL do reagente de Benedict em cada tubo;d. Aqueça em banho maria por 3 minutos;e. Observe e anote os resultados.

III – DIFERENCIAÇÃO ENTRE ALDOSES E CETOSES

1 – R EAÇÃO DE SELIWANOFF

O mecanismo da reação de Seliwanoff é semelhante à reação de Molisch. As cetohexoses formam maisderivados do 5-hidroximetilfurfural de que as aldohexoses pela ação de ácidos concentrados. O resorcinol secondensa com as altas concentrações formadas de 5 hidroximetilfurfural originados das cetohexoses, formando

produtos de coloração vermelha, mas não reage com a quantidade baixa formada a partir das aldohexoses.

O

OOH

-D-Frutose

HCl

5 hidroximetilfurfural

+ 3 H2O

Composto de cor avermelhado

O

OH

OH

OH

OH OH

OOH

O

OH

OOHOH

Resorcinol

6-hidroxi-9-[5-(hidroximetil)furano-2-il]-3 H -xanten-3-ona

2

R EAGENTE DE SELIWANOFF

Dissolva 0,05 g de resorcina (resorcinol) [C6H4(OH)2] em 100 mL de HCL.

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Reagente de Seliwanoff;

ii. Solução de glicose 1%;

iii.

Solução de sacarose 1%;iv. Solução de frutose 1%;v. Água destilada.






b. Vidraria:i. 4 tubos de ensaio;

ii. 5 pipetas de 2 mL.2) Procedimento:

a.

Numere os tubos de ensaio; b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. Tubo 1 com 1 mL de solução de glicose 1%;

ii. Tubo 2 com 1 mL de solução de sacarose 1%;iii. Tubo 3 com 1 mL de solução de frutose 1%;iv. Tubo 5 com 1 mL de água destilada.c. Adicione 2 mL do reagente de Seliwanoff em cada tubo;d. Aqueça em banho maria por 12 minutos, observando de 3 em 3 minutos a reação;e. Observe e anote os resultados.

IV – HIDRÓLISE DE DI E POLISSACARÍDEOS

A sacarose é um dissacarídeo encontrado nas plantas (açúcar comum) e é formada por uma unidade deD-glicose e uma de D-frutose com uma ligação do tipo Gli α(1:2)β Fru. Como a ligação glicosídica da

sacarose ocorre entre os carbonos anoméricos, então a sacarose não é um açúcar redutor.

O amido é o material de reserva celular dos vegetais. Contêm dois tipos de polímeros daglicose, a amilose e a amilopectina. A amilose é formada por cadeias longas, não ramificadas, deunidades de D- glicose com ligações do tipo Gli α(1:4) Gli. A amilopectina é muito ramificada e

formada por ligações glicosídicas tanto do tipo Gli α(1:4) Gli quanto Gli α(1:6) Gli.

1 – HIDRÓLISE DA SACAROSE

O

OHHH

H

OHOH

H OH

H

OH

O OH

H

OH

OH

HH

OH

OH

O

O

HHH

OHOH

H OH

H

OH

O

H

OH

OH

HH

OH

OH

Sacarose: Gli (1:4) Fru

+ H2O H2SO4 D Glicopiranose

D Frutofuranose

TÉCNICA

1) Material:

a.

Soluções e reagentes:i. Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado;ii. Reagente de Benedict;

iii. Solução de sacarose 1%;iv. Água destilada.b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;


b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:i. Tubo 1 com 2 mL de solução de sacarose 1%;

ii.

Tubo 2 com 2 mL de solução de sacarose 1%.c. Adicione 3 gotas da solução de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado no tubo 1;d. Adicione 3 gotas de água destilada no tubo 2;






e. Aqueça em banho maria por 3minutos;f. Observe e anote os resultados;g. Acrescente 2 mL do reagente de Benedict em cada tubo;h. Agite os tubos;

i.

Aqueça em banho por mais 3 minutos; j. Observe e anote os resultados.

2 – HIDRÓLISE DO AMIDO

Quando o amido é tratado por um ácido a quente sofre uma sucessão de hidrólises formando dextrinas(amilo, eritro e acrodextrinas), maltose e glicose como produto final. As dextrinas são classificadas pelacoloração que fornecem quando reagem com a solução de Lugol. A maltose e a glicose possuem propriedadesredutores que podem ser reconhecidas pela reação de Benedict.

Carboidrato Lugol Benedict Cor

Amido + - Azul

Amilodextrina + - RoxaEritrodextrina + - Vermelha

Acrodextrina - - Incolor

Maltose - + Vermelha

Glicose - + Vermelha

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:

i.

Solução de ácido clorídrico (HCl) 2N;ii. Reagente de Benedict;

iii. Solução de Lugol;iv. Solução de amido 1%.b. Vidraria:i. 7 tubos de ensaio;

ii. 2 pipetas de 10 mL;iii. 1 pipeta de 5 mL;iv. 1 pipeta de 2 mL;v. 1 erlenmeyer de 100 mL.2) Procedimento:

a.

Coloque 30 mL da solução de amido 1 % no erlenmeyer; b. Acrescente 6 mL da solução de ácido clorídrico (HCl) 2N;c. Numere os tubos de ensaio;d. Coloque 3 mL da mistura do erlenmeyer em cada tubo;e. No tubo 1 acrescente uma gota da solução de Lugol;f. Observe e anote os resultados;g. Coloque os tubos de 2 a 7 no banho maria;h. A cada 5 minutos, retire um tubo do aquecimento e resfrie em água corrente;i. Acrescente uma gota da solução de Lugol;

j. Observe e anote os resultados;k. Ao retirar o último tubo (Tubo 7), resfrie em água corrente;l. Adicione 2 mL do Reagente de Benedict;m.

Retorne ao banho maria por mais 3 minutos;n. Observe e anote os resultados;o. Preencha a tabela.






Tubo Tempo de reação (min) Cor (Solução de Lugol) Produto

1 0

2 5

3 104 15

5 20

6 25

Cor (Reagente de Benedict)

7 30

R EAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS LIPÍDEOS

Os lipídeos constituem uma classe de compostos de grande interesse bioquímico que se caracterizamfisicamente porque são pouco solúveis na água e solúveis nos chamados solventes orgânicos (éter, benzeno,clorofórmio, acetona, etc.), e quimicamente porque na maioria são ésteres de ácidos graxos. A função principaldos lipídeos no organismo é a de reserva energética atuando também como isolante térmico, mecânico e comoveículo de vitaminas.

Como lipídeos, há os óleos e gorduras (triglicerídeos, ceras, fosfolipídeos e cerebrosídeos) e assubstâncias derivadas dos lipídeos (esteróides e compostos isoprenóides). Quase todos estes compostos temácidos graxos nas suas estruturas como o ácido butírico, ácido capróico e todos os outros ácidos graxossaturados. Entre os insaturados há os ácidos palmitoléico, oléico, linoléico, linolênico. As reações a seguiranalisam algumas propriedades físicas e químicas dos ácidos graxos e triacilgliceróis.

PROPRIEDADES GERAIS DOS ÓLEOS E GORDURAS 1 - HIDRÓLISE ALCALINA DE TRIGLICERÍDIOS (Saponificação)

OH

OH

OH

CH3O

O

O

O CH3

O

CH3

O

+ 3 KOH

CH3

O

O-

K++ 3

Triacilglicerol Glicerol Sais de ácidos graxos (sabões)

n

n

n

n

TÉCNICA

3) Material:a. Soluções e reagentes:i. Margarina;

ii. Solução alcoólica de hidróxido de potássio (KOH) 5%.

b.

Vidraria:i. 1 tubo de ensaio grande (Grosso calibre);

ii. Pipeta de 10 mL.






4) Procedimento:a. Adicione 10 g de margarina no tubo de ensaio;

b. Acrescente 10 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio (KOH) 5%;c. Aqueça em banho maria fervente por 30 minutos.

d.

Verifique se a hidrólise foi completa observando a solubilidade de uma amostra do produto em água;e. Conserve o tubo em banho maria;f. Observe e anote os resultados;

2 - SEPARAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

CH3

O

O-

K+

Sais de ácidos graxos

+ HCl

n

CH3

O

OH

n

+ KCl

Ácidos graxos livres

TÉCNICA1) Material:

a.

Soluções e reagentes:i. Tubo da experiência anterior;

ii. Solução de ácido clorídrico (HCl) concentrado.b. Vidraria:i. 1 tubo de ensaio grande (Grosso calibre);

ii. Pipeta de 2 mL:iii. Béquer.2) Procedimento:a. Retire o tubo do banho maria;

b. Adicione 1 mL da solução de ácido clorídrico (HCl) concentrado gota a gota, agitando o tubo;c. Recoloque no banho maria até a separação de uma camada oleosa na superfície;

d.

Resfrie o tubo em água corrente e a seguir em gelo em um béquer;e. Descarte o líquido do tubo cuidadosamente;f. Reserve os produtos para as experiências seguintes;g. Observe e anote os resultados.

3 - SOLUBILIDADE NOS SOLVENTES TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Tubo da experiência 2;

ii. Éter;iii. Solução de álcool etílico;iv.

Água destilada.b. Vidraria:i. 3 tubos de ensaio;

ii. 1 tubo de ensaio grande (Grosso calibre);iii. 3 pipetas de 2 mL;iv. Bastão de vidro.2) Procedimento:a. Numere os 3 tubos de ensaio;

b. Retire com o bastão de vidro uma pequena quantidade dos ácidos graxos obtidos na experiência 2 e distribua nos3 tubos de ensaio;

c. Acrescente 1 mL de éter no tubo 1 e agite;

d.

Acrescente 1 mL de água destilada no tubo 2 e agite;e. Acrescente 1 mL da solução de álcool etílico no tubo 3 e agite;f. Observe e anote os resultados.






4 - FORMAÇÃO DE SABÕES POR R EDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

CH3

O

OH

n

Ácidos graxos

+ KOH

CH3

O

O-

K+

Sais de ácidos graxos (sabões)

n

+ H2O

TÉCNICA


ii. Solução alcoólica de hidróxido de potássio (KOH) 5%;iii. Água destilada.

b.

Vidraria:i. 1 tubo de ensaio grande (Grosso calibre);ii. 2 pipetas de 10 mL;

iii. Bastão de vidro.2) Procedimento:a. Adicione 10 mL de água destilada ao tubo da experiência 2;

b. Acrescente 6 mL da solução alcoólica de hidróxido de potássio (KOH) 5%c. Aqueça em banho maria por 5 minutos e agite;d. Guarde o tubo para a próxima experiência;e. Observe e anote os resultados.

5 - SEPARAÇÃO DOS SABÕES POR SALIFICAÇÃO

TÉCNICA


ii. Cloreto de sódio (NaCl);iii. Água destilada.b. Vidraria:i. 1 tubo de ensaio grande (Grosso calibre);

ii. Proveta de 50 mL;iii. Bastão de vidro.

2)

Procedimento:a. Coloque em uma proveta 3 mL da experiência 4; b. Acrescente água destilada até 20 mL;c. Adicione cloreto de sódio (NaCl) misturando até saturar, ou seja, quando o sal não mais se dissolver;d. Observe e anote os resultados.

6 - FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS

CH3

O

O-

K+

n

+ CaCl22

n n

CaCH3

O

O

CH3

O

O

+ 2KCl

Sabões de potássio solúveis Sabões de cálcio insolúveis






CH3

O

O-

K+

n

2n n

Pb(II)

CH3

O

O

CH3

O

O

+ 2

Acetato de chumbo

Pb

(II)

CH3

O

O

CH3

O

O

Sabões de potássio solúveis Sabões de chumbo insolúveis

CH3

O

O-K

+

Acetato de potássio

TÉCNICA


ii.

Solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 5%;iii. Solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;

ii. 3 pipetas de 2 mL.2) Procedimento:a. Numere os 2 tubos de ensaio;

b. Pipete 2 mL da solução do tubo da experiência 4 em cada tubo de ensaio;c. Adicione 3 gotas da solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 5% no tubo 1;d. Adicione 3 gotas da solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5% no tubo 2;e. Observe e anote os resultados.

R EAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO QUALITATIVA DOS COMPONENTES QUÍMICOS DO LEITE

O leite é utilizado como alimento humano desde o nascimento até a morte. Por isso, o estudo daquímica do leite é importante para a garantia de qualidade desse produto e contribui decisivamente nodesenvolvimento de novos produtos em laticínios.

O leite bovino é um fluido complexo que contém água, lipídeos, proteínas, carboidratos e sais minerais.O conhecimento dessa composição química é determinante na definição da qualidade nutricional e adequação

para processamento e consumo humano.

Obs: essa composição pode variar em função da raça, alimentação e outros fatores.

ÁGUA

É o constituinte quantitativamente mais importante. Isso faz com que o leite apresente propriedadesfísicas semelhantes às da água, sendo que essas são modificadas pela concentração de solutos e pelo estado de






dispersão dos outros componentes. A água pode ser encontrada livre ou ligada quimicamente a outroscomponentes como proteínas, lactose e substâncias minerais.

LIPÍDEOS

O leite é um disperso natural de gordura em uma fase aquosa. A gordura está presente no leite na forma

de gotículas ou glóbulos contendo, principalmente, triglicerídeos. Esses glóbulos encontram-se revestidos poruma película que contém fosfolipídeos (principalmente lecitina e cefalina), proteínas e vitamina A.

PROTEÍNAS

O leite bovino contém vários compostos que possuem nitrogênio em sua composição, dos quais 95%ocorrem como proteínas. As proteínas quantitativamente principais estão agrupadas em duas grandes classes:caseínas (80%) e proteínas do soro como albuminas (16%) e globulinas (4%). Enquanto as albuminas eglobulinas são solúveis em água (denominadas proteínas do soro), as caseínas são insolúveis e apresentam-se emsuspensão, formando uma fase coloidal. As enzimas também são importantes constituintes do leite. Fazem parteas lipases, proteinases, óxido-redutases, fosfatase, catalase e peroxidase.

CARBOIDRATOS O principal carboidrato presente no leite é a lactose. Além dela, existem alguns oligossacarídeos, mas

que não são quantitativamente representativos.

SAIS MINERAIS

O leite contém quantidades significativas de cloro, fósforo, potássio, sódio, cálcio e magnésio. Alémdisso, possui pequenas quantidades de ferro, alumínio, bromo, zinco e manganês. Esses elementos encontram-sena forma de sais orgânicos e inorgânicos, podendo estar totalmente solúveis ou formando uma suspensãocoloidal. Os minerais também podem ser encontrados em associação com proteínas, fator que contribui para amanutenção da estabilidade de algumas proteínas, como a caseína.

VITAMINAS

O leite bovino contém praticamente todas as vitaminas conhecidas, mas em quantidades extremamentereduzidas. Por isso o leite não é considerado fonte de vitaminas. Essa situação é agravada pelo tratamentotérmico ao qual o leite é submetido, que interfere, principalmente, nas quantidades de vitamina B1, B12 e C.

PIGMENTOS

O principal pigmento presente no leite é o caroteno, que pode chegar a conferir coloração amarelada aoleite.

TÉCNICA

5) Material:a. Soluções e reagentes:

i.

Leite;ii. Água destilada;iii. Ácido acético (C2H4O2) 10%;iv. Álcool (C2H5OH);v. Éter (C4H10O);

vi. Reagente de biureto;vii. Reagente de Benedict;

viii. Reagente de Sulkowitch;ix. Solução de ácido nítrico (HNO3) concentrado;x. Solução de nitrato de prata (AgNO3) 5%;b. Vidraria:i. 4 tubos de ensaio;

ii.

8 pipetas de 5 mL.iii. Bastão de vidro;iv. Béquer de 100 mL;






v. Béquer de 250 mLvi. Erlenmeyer de 125 mL

vii. Funil;viii. Papel de filtro;

ix.

Placa de Petri;I EXTRAÇÕES

1) Procedimento:a. Adicione 50 mL de água destilada morna a 50 mL de leite em um béquer de 250 mL;

b. Acrescente solução de ácido acético (C2H4O2) 10% gota a gota, agitando até que o leite se coagule;c. Deixe em repouso durante 5 minutos;d. Prepare o aparato de filtrar com o papel de filtro encaixado sobre o filtro e sobre o erlenmeyer de 125 mL;e. Decante o líquido sobrenadante sobre o papel de filtro, recolhendo o filtrado no erlenmeyer de 125 mL;f. Guarde o precipitado para uso posterior;g. Transfira o filtrado para o béquer de 250 mL;h. Aqueça o béquer de 250 mL diretamente na chama até a ebulição, diminua a chama e mantenha em ebulição

para reduzir o volume até aproximadamente 40 mL;i. Se houver a formação de espuma, sopre na superfície;

j. Filtre e deixe esfriar;

k. Guarde a solução para uso posterior;

II R ECONHECIMENTO DA PORÇÃO LIPÍDICA DO LEITE

2) Procedimento:a. Coloque o precipitado do item “f ” em um béquer de 100 mL;

b. Adicione 10 mL de álcool (C2H5OH) e amasse com o bastão de vidro;c. Decante e despreze o sobrenadante;d. Adicione novamente 10 mL de álcool (C2H5OH) e repita a operação anterior;

e.

Adicione 5 mL de éter (C4H10O) e faça a extração com ouso do bastão de vidro;f. Passe o líquido sobrenadante para uma placa de Petri;g. Deixe evaporar o éter à temperatura ambiente;h. Recolha o precipitado lavado pelo éter em papel de filtro e deixe evaporar o éter restante à temperatura

ambiente;i. Observe e anote os resultados.

III R ECONHECIMENTO DA PORÇÃO PROTÉICA DO LEITE – TESTE DO BIURETO

3) Procedimento:a. Coloque uma pequena porção do precipitado reservado no procedimento “2-f ” em um tubo de ensaio;

b. Adicione 3 mL do reagente de biureto;

c.

Agite;d. Observe e anote os resultados.

IV PESQUISA DE AÇÚCARES R EDUTORES – TESTE DE BENEDICT

Procedimento:

a. Coloque 1 mL da solução reservada no procedimento “2-k ” em um tubo de ensaio; b. Adicione 2 mL do reagente de Benedict;c. Aqueça em banho maria por 3 minutos;d. Observe e anote os resultados.

V PESQUISA DE CÁLCIO – TESTE DE SULKOWITCH

(NH4)2C2O4 + CaCl2 → 2NH4Cl + CaC2O4↓ oxalato de amônio cloreto de cálcio cloreto de amônio oxalato de cálcio

R EATIVO DE SULKOWITCH






Dissolva 2,5 g de ácido oxálico em 100 mL de água destilada. Acrescente 2,5 g de oxalato de amônio, 5mL de ácido acético glacial e complete o volume com água destilada para 150 mL.

TÉCNICA

4) Procedimento:

a.

Coloque 2 mL da solução reservada no procedimento “2-k ” em um tubo de ensaio; b. Adicione o reativo de Sulkowitch gota a gota até o aparecimento de uma turvação ou formação de um

precipitado branco;c. Observe e anote os resultados.

VI PESQUISA DE CLORETOS

2AgNO3 + CaCl2 → 2AgCl↓ + Ca(NO3)2

nitrato de prata cloreto de cálcio cloreto de prata nitrato de cálcio

5) Procedimento:a. Coloque 2 mL da solução reservada no procedimento “2-k ” em um tubo de ensaio;

b.

Adicione 2 a 3 gotas de ácido nítrico (HNO3) concentrado;c. Acrescente gotas de nitrato de prata (AgNO3) 5% até o aparecimento de turvação ou formação de precipitado.d. Observe e anote os resultados.

PROPRIEDADES DA UREASE

A uréase é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico.

NH2

O

NH2

+ 2H2O + H+

Urease2NH

4+ + HCO

3-

Foi a primeira enzima cristalizada (1926). É encontrada principalmente em sementes de plantas,microorganismos e invertebrados. Em plantas, é um hexâmero de cadeias idênticas e em bactérias, ocorre com

duas ou três unidades. É uma enzima com alta especificidade para a uréia.

I – R EAÇÃO DA UREASE COM O BIURETO

TÉCNICA

1) Material:c. Soluções e reagentes:i. Reagente de biureto;

ii. Solução de urease;iii. Água destilada.d. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;

ii.

3 pipetas de 2 mL:2) Procedimento:a. Numere os tubos de ensaio;

b. Coloque nos tubos 1 mL do reagente de biureto;c. Acrescente ao primeiro tubo 3 gotas da solução de urease;d. Acrescente ao segundo tubo 3 gotas de água destilada;e. Observe e anote os resultados.

II – TESTE DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

TÉCNICA

1) Material:

a.

Soluções e reagentes:i. Solução de uréia [(NH2)2CO] 0,4M, pH 7,0 com o indicador vermelho de fenol;

ii. Solução de urease;






iii. Água destilada.b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;

ii. 3 pipetas de 2 mL.2) Procedimento:a.

Numere os tubos de ensaio; b. Coloque nos tubos 1 mL da solução de uréia 0,4M;c. Acrescente ao primeiro tubo 3 gotas da solução de urease;d. Acrescente ao segundo tubo 3 gotas de água destilada;e. Agite levemente;f. Aguarde 2 minutos;g. Observe e anote os resultados;h. Guarde o tubo 1 para comparação com outro experimento.

III – TESTE DA ESPECIFICIDADE

TÉCNICA

1)

Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução de tiouréia [(NH2)2CS] 0,4M, pH 7,0 com o indicador vermelho de fenol;

ii. Solução de urease.b. Vidraria:i. 1 tubo de ensaio;

ii. 2 pipetas de 2 mL.2) Procedimento:a. Coloque no tubo 1 mL da solução de tiouréia, 0,4M;

b. Acrescente 3 gotas da solução de urease;c. Agite levemente;

d.

Aguarde 2 minutos;e. Compare com o tubo 1 da experiência II;f. Observe e anote os resultados.

IV – TESTE DA DESNATURAÇÃO PELO CALOR

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i. Solução de uréia [(NH2)2CO] 0,4M, pH 7,0 com o indicador vermelho de fenol;

ii. Solução de urease;iii. Água destilada.

b.

Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;


b. Coloque no primeiro tubo 1 mL de água destilada;c. Acrescente 3 gotas da solução de urease;d. Coloque em banho maria por 5 minutos;e. Coloque no segundo tubo 1 mL da solução de uréia 0,4M;f. Acrescente 0,5 mL da solução de urease fervida;g. Agite levemente;

h.

Aguarde 2 minutos;i. Compare com o tubo 1 da experiência II; j. Observe e anote os resultados.





V – INIBIÇÃO POR SAIS DE MERCÚRIO

TÉCNICA

1) Material:a. Soluções e reagentes:i.

Solução de cloreto de mercúrio (HgCl2) 5%;ii. Solução de uréia [(NH2)2CO] 0,4M, pH 7,0 com o indicador vermelho de fenol;

iii. Solução de urease;iv. Água destilada.b. Vidraria:i. 2 tubos de ensaio;


b. Coloque nos dois tubos 1 mL de água destilada;c. Acrescente 3 gotas da solução de urease nos dois tubos;

d.

Adicione 5 gotas da solução de cloreto de mercúrio (HgCl2) 5% no segundo tubo;e. Agite levemente;k. Adicione 1 mL de solução de uréia [(NH2)2CO] 0,4M nos 2 tubos;f. Observe e anote os resultados.

Roteiro de Aulas Práticas de Bioquímica

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