Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética Departamento de...
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Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética Departamento de Genética e Evolução – IB UNICAMP http://cafe.cbmeg.unicamp.br/biotecmol/aula4_dna_rec.pdf Marcelo Menossi UNICAMP O DNA recombinante
Transcript of Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética Departamento de...
Laboratoacuterio de Genoma FuncionalCentro de Biologia Molecular e Engenharia Geneacutetica
Departamento de Geneacutetica e Evoluccedilatildeo ndash IBUNICAMP
httpcafecbmegunicampbrbiotecmolaula4_dna_recpdf
Marcelo Menossi
UNICAMP
O DNA recombinante
Problema
Como produzir hormocircnio de crescimento humano
em milho
DNA recombinante
Stanley CohenStanford University
Herbert W BoyerUSFC
Questotildees iniciais
1 Qual eacute o produtoPlanta transgecircnica de milho que produza hormocircnio de crescimento
2 Algueacutem jaacute fez issoBusca em revistas cientiacuteficas e banco de patentes
3 Viabilidade econocircmica custos de produccedilatildeo mercado etcEntenda a importacircncia do assunto e consulte especialistas
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
0 O laboratoacuterio tem Certificado de Qualidade em BiosseguranccedilaObedecer a legislaccedilatildeo brasileira
DNA
ceacutelulas nuacutecleo cromossomos DNAorganismo
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 4
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- Slide 6
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- Slide 8
- Slide 9
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- Slide 50
- Slide 51
-
Problema
Como produzir hormocircnio de crescimento humano
em milho
DNA recombinante
Stanley CohenStanford University
Herbert W BoyerUSFC
Questotildees iniciais
1 Qual eacute o produtoPlanta transgecircnica de milho que produza hormocircnio de crescimento
2 Algueacutem jaacute fez issoBusca em revistas cientiacuteficas e banco de patentes
3 Viabilidade econocircmica custos de produccedilatildeo mercado etcEntenda a importacircncia do assunto e consulte especialistas
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
0 O laboratoacuterio tem Certificado de Qualidade em BiosseguranccedilaObedecer a legislaccedilatildeo brasileira
DNA
ceacutelulas nuacutecleo cromossomos DNAorganismo
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
DNA recombinante
Stanley CohenStanford University
Herbert W BoyerUSFC
Questotildees iniciais
1 Qual eacute o produtoPlanta transgecircnica de milho que produza hormocircnio de crescimento
2 Algueacutem jaacute fez issoBusca em revistas cientiacuteficas e banco de patentes
3 Viabilidade econocircmica custos de produccedilatildeo mercado etcEntenda a importacircncia do assunto e consulte especialistas
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
0 O laboratoacuterio tem Certificado de Qualidade em BiosseguranccedilaObedecer a legislaccedilatildeo brasileira
DNA
ceacutelulas nuacutecleo cromossomos DNAorganismo
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
Questotildees iniciais
1 Qual eacute o produtoPlanta transgecircnica de milho que produza hormocircnio de crescimento
2 Algueacutem jaacute fez issoBusca em revistas cientiacuteficas e banco de patentes
3 Viabilidade econocircmica custos de produccedilatildeo mercado etcEntenda a importacircncia do assunto e consulte especialistas
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
0 O laboratoacuterio tem Certificado de Qualidade em BiosseguranccedilaObedecer a legislaccedilatildeo brasileira
DNA
ceacutelulas nuacutecleo cromossomos DNAorganismo
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
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Co-integrate
Gene
ccdB
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Km
attB1
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attL2
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attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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DNA
ceacutelulas nuacutecleo cromossomos DNAorganismo
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
Dogma central da biologia molecular
Animaccedilatildeo Carnegie Mellon
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
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- Slide 28
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- Slide 30
- Slide 31
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- Slide 34
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- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
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- Slide 44
- Slide 45
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- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
Dogma central da biologia molecular
DNA Armazena informaccedilatildeo
RNA intermediaacuterio da
informaccedilatildeo do DNA
ProteiacutenaRealiza as tarefas
das ceacutelulas
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
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- Slide 7
- Slide 8
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- Slide 11
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- Slide 22
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- Slide 24
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- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
O gene
promotor codificante terminadora
Onde folha raiz
Quando iniacutecio germinaccedilatildeo ataque inseto
Quanto muito pouco
O queproteiacutena bactericidaabsorccedilatildeo de Fesiacutentese accediluacutecar
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
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- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
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- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
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- Slide 37
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- Slide 40
- Slide 41
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- Slide 51
-
DNA recombinante ou transgene
Promotor hGH Terminador
4 Como montar o gene recombinante- como obter a regiatildeo codificante- em qual parte da planta seraacute expresso- sistema de purificaccedilatildeo- biosseguranccedila
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 7
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- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
Como obter a regiatildeo codificante
Alternativa menos complexa busque em banco de dados
NCBI milhotildees de sequumlecircncias de DNA e proteiacutenas
62
36 617
55
67
1711008 genomas
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
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- Slide 31
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- Slide 34
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- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
Sequumlecircncia codificante (CDS)
1 aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cactagcggc 61 aatggctgca ggctcccgga cgtccctgct cctggctttt ggcctgctct gcctgtcctg 121 gcttcaagag ggcagtgcct tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat 181 gctccgcgcc cgtcgcctgt accagctggc atatgacacc tatcaggagt ttgaagaagc 241 ctatatcctg aaggagcaga agtattcatt cctgcagaac ccccagacct ccctctgctt 301 ctcagagtct attccaacac cttccaacag ggtgaaaacg cagcagaaat ctaacctaga 361 gctgctccgc atctccctgc tgctcatcca gtcatggctg gagcccgtgc agctcctcag 421 gagcgtcttc gccaacagcc tggtgtatgg cgcctcggac agcaacgtct atcgccacct 481 gaaggaccta gaggaaggca tccaaacgct gatgtggagg ctggaagatg gcagcccccg 541 gactgggcag atcttcaatc agtcctacag caagtttgac acaaaatcgc acaacgatga 601 cgcactgctc aagaactacg ggctgctcta ctgcttcagg aaggacatgg acaaggtcga 661 gacattcctg cgcatcgtgc agtgccgctc tgtggagggc agctgtggct tctagctgcc 721 cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gtcgtggaag gtgctactcc 781 agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc
Hormocircnio crescimento humano
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
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- Slide 5
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- Slide 10
- Slide 11
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- Slide 14
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- Slide 20
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- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
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- Slide 40
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-
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
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- Slide 51
-
PromotorRegiatildeo
codificadoraRegiatildeo
terminadora
Exon Intron
RNA pol IIFatores de transcriccedilatildeo
Transcrito primaacuterio
Em alguns tecidos ocorre ligaccedilatildeo de fatores de transcriccedilatildeo que ativam a RNA pol II
Na transcriccedilatildeo a RNA pol II produz o transcrito primaacuterio do RNA
RNA mensageiro
No processamento o transcrito primaacuterio eacute modificado por enzimas que removem os introns adicionam o cap na extremidade 5rsquo e a cauda poli-A na extremidade 3rsquo
Na traduccedilatildeo o mRNA eacute ldquolidordquo pelos ribossomos iniciando a produccedilatildeo da proteiacutena no AUG e terminando em um coacutedon de parada (STOP)
AAAAAAA(n)
AUG STOP
Liacuteder (transcrito natildeo taduzido)
Transcriccedilatildeo
Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
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Gene
attL2
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
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Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
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Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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attL2
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Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Transcriccedilatildeo
mRNA
Projeto Genoma EST obtenccedilatildeo de cDNA
Diversos tipos celularesFlor raiz colmo
1- ExtraccedilatildeoRNA
2- Produccedilatildeo de cDNA
cDNA
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 51
-
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
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ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
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Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
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Co-integrate
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ccdB
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attP1
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attB1
Gene
attL2
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ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Plasmiacutedeos
Pequenos cromossomos circulares de bacteacuterias
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
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- Slide 7
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- Slide 50
- Slide 51
-
G
ene
de
in
tere
sse
bull Cromossomos circulares fita dupla de DNA que replicam de forma independente do ciclo celular
bull Tamanho varia de poucos kb a ~100 kb bull Insertos de ateacute 10 kb bull Tecircm origem de replicaccedilatildeo gene de resistecircncia a antibioacutetico e siacutetio muacuteltiplo de clonagem
(vaacuterios siacutetios de enzimas de restriccedilatildeo)bull Vaacuterias coacutepias por ceacutelulabull Bacteacuteria contendo um plasmiacutedeo pode ser armazenada indefinidademente a -70oC em
soluccedilatildeo com 15 glicerolbull DNA plasmidial eacute facilmente isolado de culturas celulares
Vetores plasmidiais
Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
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ccdB
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Km
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attL2
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ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Siacutetio muacuteltiplo de clonagem
Gene de interesseEnzima 1
Enzima 2
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
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Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
-
A ligaccedilatildeo pode ocorrer entre DNA distintos
Extremidades coesivas
Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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attL2
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Co-integrate
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ccdB
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ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
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By-Product
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Gene
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Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Extremidades abruptas (blunt ends)
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
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morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
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+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
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+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
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Vetores plasmidiais
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pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
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Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
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Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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- Slide 51
-
DNA ligases reparam DNA quebrado
Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
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By-Product
attP1 attP2
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Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Como ligar extremidades natildeo compatiacuteveis
Klenow fragment atividade DNA polymerase 5rsquo -gt 3rsquo e exonuclease 3 -gt 5
Preenchimento extremidades 5 de DNA
Digestatildeo de extremidades 3 de DNA
T4 DNA polimerase eacute 200 x mais ativa
para este fim
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
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-
Como separar os cDNAs dos distintos genes
Soluccedilatildeo aquosa contendo os cDNAs em um tubo de 15 ml
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
GT ACGT
morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
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attL2
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ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
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Gene
ccdB
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Km
attB1
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ccdB
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Km
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attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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-
Clonagem do GOI no vetor de expressatildeo
Plasmiacutedeo de
Ecoli
Gene de interesse
DNA ligase
Plasmiacutedeo hiacutebrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA TGCA
AC
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morpheusfmrpuspbrtdfilesapostilaTD_2003doc
Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
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DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
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ccdB
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
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attP1 attP2
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Co-integrate
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attL2
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Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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Plasmiacutedeobacteriano aberto
cDNA (ESTs)
+
Enzima T4 DNA ligase
Coleccedilatildeo de cDNAsclonados
Clonagem dos cDNAs
gene resistecircncia antibioacutetico
ampR
+
BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
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Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
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Km
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attL2
attR2
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Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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ampR
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BacteacuteriaEletroporaccedilatildeo
Biblioteca de cDNA
Transformaccedilatildeo de bacteacuterias
Este e o proacuteximo slide foram inseridos para detalhar a transformaccedilatildeo de bacteacuterias com os plasmiacutedeos contendo os ESTs natildeo mostrados em aula
Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
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DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
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Gene
attL2
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Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Plaqueamento emmeio com agenteseletivo
Incubaccedilatildeo a 37ordmC para a siacutentesede b-lactamasepelo gene ampR
Formaccedilatildeo de colocircniascontendo plasmiacutedeos
Bibliotecade cDNA
Seleccedilatildeo das bacteacuterias com plasmiacutedeos
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
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Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
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- Slide 51
-
Plaqueamento de uma biblioteca de cDNA
Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
gtSCCCLR1076G12gCCCATTTGTCTCGTCTCGCTCTCACGCTCGCGTCACCGGAGCTCTCCAGAAGCGAGCCCCAACTGCCCAAGGGCGAGCGATCCGATCCCCTTCGCGGCCTCGTCAACGACGCCGAGAACACTTTGAGGAATGGCTGAAGAGGATGTCCAGCCCCTTGTGTGTGACAATGGCACTGGAATGGTCAAGGCGGGTTTCGCTGGTGACGATGCACCGAGAGCTGTCTTTCCTAGCATTGTAGGCAGGCCACGCCACACTGGTGTGATGGTGGGCATGGGTCAAAAGGATGCATATGTGGGCGATGAAGCTCAGTCCAAAAGAGGTATTCTGACACTGAAGTACCCAATCGAGCACGGCATTGTCGGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTTCGTGTGGCACCTGAGGAGCACCCTATACTGCTGACCGAGGCTCCTCTGAACCCCAAGGCAAACAGGGAGAAGATGACCCAGATTATGTTCGAGACGTTCAACTGCCCGGCAATGTATGTGGCCATCCAGGCCGTTCTTTCCCTGTACGCCAGTGGTCGAACAACTGGTATTGTGCTCGACTCTGGTGATGGTGTGAGCCACACTGTCCCCATCTACGAAGGGTACACGCTTCCTCATGCTATTCTTCGATTGGACCTTGCTGGTCGTGACCTTACCGACAACCTGATGAAGATCCTTACTGAGAGGGGTTACTCCTTCACCACAACTGCCGAGCGAGAAATTGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTTGCCTACGTTGCCCTTGATTATGAACAGGAGCTGGAGACTGCCAGGACCAGCTCCACCATTGAGAAGAGCTACGAGCTACCCGATGGCCAGGTTATCACAATCGGTGCAGAAAGGTTTAGG
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
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DestinationVector
LR Clonase
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Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
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ccdB
Km
By-Product
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Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Km
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Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Algoritmo Blastx
Inferecircncia da funccedilatildeo da proteiacutena
Traduccedilatildeo das 6 possiacuteveis framese
comparaccedilatildeo com proteiacutenasdepositadas em bancos de dados
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Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
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5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
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TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
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Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
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Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
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AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
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attL2
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Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
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ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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-
Biblioteca de cDNA
bullDelimitar os tecidos que cujos transcritomas seratildeo amostradosSangue ceacuterebro fiacutegado etc
bullExtrair RNAbullGerar DNA complementar (cDNA) com transcritase reversabullClonar em plasmiacutedeosbullTransferir para bacteacuteria (normalmente E coli)bullAmplificar o DNA plasmidialbullSequumlenciarbullAvaliar similaridade da proteiacutena deduzida com bancos de dadosbullOrganizar informaccedilotildees do genoma em banco de dados
5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
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Gene
attL2
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ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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5rsquo GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT 3rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA3rsquo TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGC GTC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGGCGCAG 5rsquo
TCGACCCACGCGTCCGGGGTGCGCAGGC
AAAAAAAAAAAAAAAGGGC TTTTTTTTTTTTTTTCCCGCCGG
Primer para siacutentese de cDNA (Not I adapter)
mRNA
Siacutentese primeria fita de DNA comtranscritase reversa
mRNA
cDNA
Siacutentese segunda fita de DNA comRNAse H DNA polimerase e Ligase
Ligaccedilatildeo do Adaptador Sal I
Digestatildeo com Not I
AUG STOP
ATG STOP AAAA
TAC STOP TTTT
5rsquo TCGA
CCGG3rsquo 5rsquo
3rsquo
Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
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DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
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attL2
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
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By-Product
attP1 attP2
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Gene
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attB1
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Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
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RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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Vetores plasmidiais
Gene de interesse
pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
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AmpR
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LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
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Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
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attL2
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Gene
Gene
2-Hybrid
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T7- E coli
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ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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pSC101 primeiro plasmiacutedeo
Stanley Cohen Herbert Boyer
Construction of biologically functional bacterial plasmids in-vitro (1973) COHEN SN CHANG ACY BOYER HW HELLING RB Proc Natl Acad Sci USA 703240-3244
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
Km
By-Product
attP1 attP2
attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
attP1
attL2
attR2
attP1
attB1
Gene
attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
- Slide 2
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- Slide 51
-
Problema produccedilatildeo de hormocircnio de crescimento humano em milho
Identificar o gene de humanos que codifica o hormocircnio de crescimento
Montar um cassete de expressatildeo que seja ativo em milho
Produzir grandes quantidades do DNA
Obter uma planta transgecircnica
Purificar a proteiacutena
Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
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Co-integrate
Gene
ccdB
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
Amp
ExpressionClone
attB1 attB2
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Km
By-Product
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attL2 x attR2
Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
Gene
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attL2
attR2
ccdB
Cointegrado
Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
- Slide 1
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Plasmiacutedeo com o gene do hGH em matildeos
gene resistecircncia antibioacutetico
hGH
CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
AmpR
DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
ccdB
Amp
Km
attB1
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Co-integrate
Gene
ccdB
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ccdB
Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
Gene
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ExpressionClone
attB1 attB2
ccdB
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By-Product
attP1 attP2
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Gene
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Gene
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2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
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RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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CDS homocircnio crescimento humano
1 AGGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACTAGCGGCA 1 M A A G S R T S L L L A F G L L C L S W 61 ATGGCTGCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGTCCTGG 21 L Q E G S A F P T I P L S R L F D N A M 121 CTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATG 41 L R A R R L Y Q L A Y D T Y Q E F E E A 181 CTCCGCGCCCGTCGCCTGTACCAGCTGGCATATGACACCTATCAGGAGTTTGAAGAAGCC 61 Y I L K E Q K Y S F L Q N P Q T S L C F 241 TATATCCTGAAGGAGCAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGCTTC 81 S E S I P T P S N R V K T Q Q K S N L E 301 TCAGAGTCTATTCCAACACCTTCCAACAGGGTGAAAACGCAGCAGAAATCTAACCTAGAG 101 L L R I S L L L I Q S W L E P V Q L L R 361 CTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCATGGCTGGAGCCCGTGCAGCTCCTCAGG 121 S V F A N S L V Y G A S D S N V Y R H L 421 AGCGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTATGGCGCCTCGGACAGCAACGTCTATCGCCACCTG 141 K D L E E G I Q T L M W R L E D G S P R 481 AAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGTGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGG 161 T G Q I F N Q S Y S K F D T K S H N D D 541 ACTGGGCAGATCTTCAATCAGTCCTACAGCAAGTTTGACACAAAATCGCACAACGATGAC 181 A L L K N Y G L L Y C F R K D M D K V E 601 GCACTGCTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAG 201 T F L R I V Q C R S V E G S C G F - 661 ACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCC 721 GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGTCGTGGAAGGTGCTACTCCA 781 GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATC
O ATG iniciador e o TAG de parada estatildeo indicados em vermelho Eles delimitam a CDS
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
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Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
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ccdB
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attL1 x attR1Co-integrate
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T7- E coli
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ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
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IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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-
Em qual parte do milho o gene humano deve ser ativo
A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
W
M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
wwwacaclonecom
Sistema Gateway (Invitrogen)
Sistema Gateway (Invitrogen)
attL1
Gene
attL2
KmR
EntryClone
ccdB
attR1 attR2
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DestinationVector
LR Clonase
attL1 x attR1Co-integrate
Gene
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Amp
Km
attB1
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Cointegrado
Sistema Gateway (Invitrogen)
LR Clonase
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attB1 attB2
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By-Product
attP1 attP2
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Gene
Gene
2-Hybrid
Gene
T7- E coli
Gene
ViraPowertrade
Gene
Your Vector
Gene
BaculovirusGene
CMV-Neo
Gene
RNAiGene
IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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A Semente de MilhoA Semente de Milho
Fonte Adilson Leite
No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
Bibliotecas genocircmicas
Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
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DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
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de milho
Gene humano
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Software para construccedilotildees de DNA recombinante
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Sistema Gateway (Invitrogen)
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T7- E coli
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IVTT
Vetores para as mais diversas finalidades
CAT gene
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No milho as sementesNo milho as sementesrepresentam cerca derepresentam cerca de
40 da massa da planta40 da massa da planta
Composiccedilatildeo das sementesComposiccedilatildeo das sementes10 de proteiacutena10 de proteiacutena60-80 de amido60-80 de amido
4de oacuteleo4de oacuteleoFonte Adilson Leite
Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
ATCGTGATATACTAGACGATGCATGACCACCCAACTGAACTGTAACTTTAAC
Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
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DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
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DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
G
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BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
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Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
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de milho
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T7- E coli
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Construccedilatildeo do gene quimeacuterico
promotor codificante terminadora
Onde endosperma
Quando desenvolvimento da semente
Quanto muito
O quehGH
Final do gene
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Como clonar o promotor
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1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
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DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
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de milho
Gene humano
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Como clonar o promotor
A Buscar em publicaccedilotildees promotores com padratildeo desejado
Ou
B Clonar um novo promotor
1 Identificar RNA (transcrito) que se acumula no tecido desejado
2 Clonar o promotorBusca em banco de dadosGenome walkingScreening de bibliotecas genocircmicas
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DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
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DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
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BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
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Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
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Vetores especiais Cosmiacutedeos 30-46 kb de insertoCromossomos artificais de bacteacuteria (BACs) ateacute 300 kb
DNA do BAC Aligado na membrana de naacuteilon
TCAGT
32P
DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
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M
BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
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DNA do BAC Bligado na membrana de naacuteilon
Gene eacute marcado com radioatividade
Detecccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos ndash Southern blot
A
D
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BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
Estrateacutegia alternativa genomewalker
Cassete de expressatildeo em sementes
hGHhGHPPkafkaf
Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
3rsquo
Promotor de sorgo ativo em sementes
de milho
Gene humano
Terminadora de bacteacuteria
Software para construccedilotildees de DNA recombinante
pDraw32
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Sistema Gateway (Invitrogen)
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BACs que acendem tem o gene de interesse
Sequenciamento do BAC e identificaccedilatildeo do promotorEnsaio funcional do possiacutevel promotor (proacuteximas aulas)
Detecccedilatildeo do sinal radioativo
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Leite A Arruda P El-Dorry H Kemper E da Silva MJ Desenvolvimento de um cassete de expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas especificamente em sementes de plantas transgecircnicas Pedido de Patente ndash INPI PI9805166-0
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de milho
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