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Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breve ヤクルト株の薬剤感受性

緒　言

　近年、小児科・小児外科、消化器外科および救命救急

医学の領域において、プロバイオティクスの代表的な菌

株であるL . casei シロタ株（LcS 株）およびB . breve ヤ

クルト株（BBG-01 株）を用いたプロ（シン）バイオティ

クス療法による感染症予防に関する報告が増加している1-5）。臨床機関における、シンバイオティクス療法によ

る感染症予防のアプローチは増々、発展していくものと

考えられる。

　一方で、臨床で用いられている抗菌薬に対する LcS

株および BBG-01 株の感受性について、医療機関から

の問い合わせが増加している。そこで LcS 株および

BBG-01 株の種々の抗菌薬に対する最小発育阻止濃度

（MIC）を Clinical and Laboratory Standards Institute

（CLSI：米国臨床検査標準化委員会）の定める broth

microdilution method6）にて測定し、それぞれの感受性

を判定した。

材料および方法

1．抗菌薬の調製

　各種抗菌薬 47 種 { アミノグリコシド系［Amikacin

sulfate salt（Sigma），Gentamycin salfate（Sigma），

Kanamycin monosalfate（Sigma），Streptomycin

sulfate salt（Sigma）］、ϐ−ラクタム系［Ampicillin（Sigma），

Carbenicillin disodium salt（Sigma），Oxacillin sodium

salt monohydrate（Sigma），Penicillin（Sigma）］、セフェ

ム系［Cefaclor（Sigma），Cefazolin sodium salt（Sigma），

Cefbuperazone sodium（Toyama Chemical），Cefdinir

（Sigma），Cefmetazole sodium（Daiichi Sankyo），

Cefotaxime（Sigma），Cefotiam dihydrochloride

（Takeda Pharmaceutical），Cefoxitin sodium salt

（Sigma），Cefpirome sulfate（Aventis Pharma），

Cefsulodin sodium salt（Sigma），Ceftazidime hydrate

（Sigma），Ceftizoxime sodium（Fujisawa Healthcare），

Ceftriaxone disadium salt hemi（hepatohydrate）

（Sigma），Cephalothin sodium salt（Sigma），Flomoxef

Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breve ヤクルト株の薬剤感受性

朝原 崇・結城 功勝・高橋 明・高橋 琢也・野本 康二

Takashi Asahara, Norikatsu Yuki, Akira Takahashi, Takuya Takahashi, Koji Nomoto

Yakult Central Institute for Microbiological Research,

1796 Yaho, Kunitachi, Tokyo 186-8650 Japan

AbstractThe minimum inhibitory concentrations (MIC) of probiotic strains, Lactobacillus casei strain Shirota (LcS)

and Bifidobacterium breve strain Yakult (BBG-01) to clinically used antibiotics were determined by the broth microdilution method proposed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) . Since the CLSI susceptibility evaluation table does not include Lactobacillus or Bifidobacterium, their susceptibility was evaluated using the evaluation tables for other bacteria . LcS and BBG-01 were slightly susceptible to many aminoglycoside, cephem, quinolone, peptide antibiotics, fosfomycin, sulfamethoxazole, trimethoprime, but were susceptible to tetracycline and macrolide antibiotics .

Susceptibility of Lactobacillus casei strain Shirota and Bifidobacterium breve strain Yakult to various antibiotics.

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ヤクルト研究所研究報告集　第 30号， 1–6（2012）

sodium（Shionogi），Latamoxef sodium（Shionogi）］、

マクロライド系［Clarithromycin（Sigma），Clindamycin

（Sigma），Erythromycin（Sigma），Oleandomycin

phosphate salt（Sigma）］、カルバペネム系［Imipenem/

Cilastatin（Banyu Pharmaceutical），Panipenem/

betamipron（Daiichi Sankyo）］、キノロン系［Ciprofloxacin

（Sigma），Enoxacin（Sigma），Levofloxacin HCl（LKT

Laboratories），Lomefloxacin hydrochroride（Santa Cruz

Biotechnology），Ofloxacin（Sigma）］、テトラサイクリン系

［Minocyclin hydrochloride（Sigma），Tetracyclin

hydrochloride（Sigma）］、ペプチド系［Colistin methanesulfate

（Sigma），Polymyxin B sulfate salt（Sigma），Vancomycin

hydrochloride（Sigma）］、および、その他［Chloramphenicol

（Sigma），Fosfomycin disodium salt（Sigma），

Lincomycin（Sigma），Neomycin sulfate（Sigma），

Sulfamethoxazole（Sigma），Trimethoprim lactate salt

（Sigma）］｝をそれぞれ 25 .6 mg/0 .5 ml になるよう滅菌蒸

留水に溶解し、これを 0 .45 µm のメンブランフィルター

（DISMIC-25cs，Toyo Roshi）を用いてろ過滅菌した。ろ

過滅菌済みの各種抗菌薬水溶液を基礎培地（LSM- シス

テイン添加液体培地 7））に添加して、512 µg/ml の各抗

菌薬添加液体培地を作製した。さらに 512 µg/ml の各

抗菌薬添加液体培地を基礎培地にて 2 倍段階希釈して、

256 ～ 0 .5 µg/ml の希釈系列を作製した。512 ～ 0 .5

µg/ml の濃度の各抗菌薬添加液体培地を 96 穴プレート

（丸底、滅菌済）のウェルに 50 µl ずつ分注した。陰性

対照として抗菌薬非添加液体培地を用いた。

2．菌液の調製

　LcS 株を 104 CFU/ml になるよう 10 ml の MRS 液体

培地（Becton Dickinson and Company［3］）に添加し

て、37℃、24 時間嫌気（100%CO2）培養した。BBG-

01 株については、104 CFU/ml になるよう 10 ml の

GAM 液 体 培 地（Nissui Pharmaceutical8））に 菌 を 添

加して同様に培養した。培養終了後の各培養液の 0 .1

ml を、 そ れ ぞ れ MRS 寒 天 培 地（Becton Dickinson

and Company、LcS 株用）、あるいは GAM 寒天培地

（Nissui Pharmaceutical、BBG-01 株用）に塗抹して、

37℃、48 時間嫌気（Anaero Pack-Anaero, Mitsubishi

Gas Chemical）培養した。培地上に発育したコロニー

10 ～ 20 個を釣菌して、これをそれぞれの液体培地に

懸濁（マクファーランド 0 .5-1 .0）させて、106 CFU/ml

になるよう調整した。調整済み菌液を 96 穴プレートに 50

µl ずつ分注した（抗菌薬最終濃度：0 .25 ～ 256 µg/ ml）。

3．培養および MIC 判定

　菌液入りの 96 穴プレートの蓋をして良く撹拌した後、

37℃、48 時間嫌気（Anaero Pack-Anaero 薬剤感受性

用 , Mitsubishi Gas Chemical）培養した。培養後、Well

中の培養液の発育を観察して、陰性対照に比べて目視に

て明確に増殖抑制の認められた各種抗菌薬の最低濃度を

最小発育阻止濃度（MIC）とした。なお本測定を 3 連に

て実施した。感染リスクのある細菌についての薬剤感受

性評価基準である CLSI M100-S189）を参考にして感受

性（S）、中間（I）、低感受性（R）を判定した。なお、CLSI

M100-S18 には、Bifidobacterium および Lactobacillus

の感受性判定表がないことから、単純比較はできないが、

本 論 文 で は 便 宜 上、Staphylococcus、Enterococcus、

Enterobacteriaceae、あるいは Non-Enterobacteriaceae

の判定基準を用いて、それぞれの感受性を判定した。

結　果

　47 種の抗菌薬に対する LcS 株および BBG-01 株の

MIC を Table 1 に示した。

1）LcS 株は、アミノグリコシド系、キノロン系およびペプ

チド系の多くの抗菌薬、ならびにβ - ラクタム系の

Ampicillin および Penicillin、セフェム系の Cefaclor、

Cefmetazole、Cefoxitin および Ceftazidime、カルバペ

ネム系のImipenem、FosfomycinおよびTrimethoprim

に低感受性であった。CLSI M100-S18 の感受性判定表

に掲載されていない Metronidazole、Neomycin およ

び Sulfamethoxazole に対する MIC が高値であり（32

～ 256< µg/ml）、これらの抗菌薬に対しても低感受性

であると考えられた。一方、セフェム系の Cefotaxime、

Ceftizoxime、Ceftriaxone および Cefalothin、マクロ

ライド系の多くの抗菌薬およびテトラサイクリン系の

Minocyclin および Tetracyclin には感 受 性 であり、

Chloramphenicol には中間であった。

2）BBG-01 株は、アミノグリコシド系、ϐ ラクタム系、セ

フェム系、およびキノロン系の多くの抗菌薬、ならび

3

Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breve ヤクルト株の薬剤感受性

にマクロライド系の Clarithromycin、ペプチド系の

Polymyxin B や Fosfomycin および Trimethoprim に

低感受性であった。また、CLSI M100-S18 の感受性判

定表に記載されていない Metronidazole、Neomycin

および Sulfamethoxazole に対する MIC が高値であ

り（32 ～ 256< µg/ml）、これらの抗菌薬に対しても

低感受性であると考えられた。一方、カルバペネム系

の Imipenem には中間値を示し、マクロライド系の

Clindamycin および Erythromycin、ならびにテトラ

サイクリン系の Minocyclin および Tetracyclin、ペプ

チド系の Vancomycin、および Chloramphenicol に

は感受性であった。

考　察

　周術期の患者では、感染症の予防、治療を目的として

抗菌薬が使用されることが多い。したがって抗菌薬投与

下の患者に用いられるプロバイオティクスの生菌として

の有効性を考慮すると、その抗菌薬に対して低感受性で

あることが必要である。

　一方、臨床で用いられる抗菌薬に対するLactobacillus

や Bifidobacterium の感受性について、種々の乳酸

菌やビフィズス菌で報告 8,10）が認められるが、残念な

がらこれまで LcS 株については臨床で使用される頻

度の低い抗菌薬についての報告のみであり 11）、また

BBG-01 株については薬剤感受性の報告は認められな

い。周術期の感染症予防のため、術前に Kanamycin や

Metronidazole が、術後に Cefazorin や Cefotiam 等の

セフェム系の抗菌薬、Vancomycin、等が使用されるこ

とが多い 12,13）。今回の MIC 測定結果より、LcS 株およ

び BBG-01 株は、臨床で用いられるアミノグリコシド

系、セフェム系、キノロン系、ペプチド系の多くの抗菌

薬、ならびに Fosfomycin や Metronidazole に低感受

性であることが明らかになった。また LcS 株について

はカルバペネム系抗菌薬や Vancomycin にも低感受性

であった。以上のことから患者における当該抗菌薬と

LcS 株および BBG-01 株の併用による予防・治療効果

の可能性が強く示唆された。

　病原菌による抗菌薬耐性獲得についての問題が提起

され、伝達性の抗菌薬耐性遺伝子の有無はプロバイオ

ティクにおいても安全性評価の主要な基準の一つと

なっている 11,14）。院内感染菌である Vancomycin 耐

性腸球菌（VRE）の Vancomycin 耐性遺伝子（vanA と

vanB 遺伝子）は薬剤耐性プラスミドなどにより接合伝

達で菌体間を伝播する。LcS 株も Vancomycin に対し

て低感受性であったが、木脇ら 11）は、LcS 株が既知の

Vancomycin 耐性遺伝子を持たないことを PCR 法に

より明らかにしている。近年、メチシリン耐性黄色ブ

ドウ球菌（MRSA）、多剤耐性アシネトバクタバウマニ

（MDRAb）、VRE、等の耐性菌の出現が社会問題となっ

ていることから、臨床で用いられるプロバイオティクス

は、耐性遺伝子伝播についての安全性が調べられた菌株

でなければならないと考えられた。

　木脇らは、17 種の抗菌薬に対する LcS 株を含むL .

casei 43 菌株およびB . breve 26 菌株の薬剤感受性を

測定したところ、供した菌株は概ね菌種固有の MIC 値

を示したと報告している 11,15）。本研究で用いた臨床で

利用される抗菌薬に対しても、供試菌株を増やして、菌

種固有の自然耐性か獲得耐性かの判断 16）、既知の抗生

物質耐性遺伝子の有無の確認等により、伝達性抗生物質

耐性遺伝子を持つか否かを明らかにしていくことが今後

の課題であると考えられた。

要　約

　臨床で用いられている抗菌薬に対する プロバイオティ

クスの代表的な菌株であるLactobacillus casei シロタ株

（LcS株）およびBifidobacterium breve ヤクルト株（BBG-

01 株）の最小発育阻止濃度（MIC）について、Clinical

and Laboratory Standards Institute（CLSI）の 定 め る

broth microdilution method にて測定した。CLSI の感

受性判定表には、Bifidobacterium およびLactobacillus

の判定表がないことから、他の細菌の判定表を参照して、

それぞれの感受性を判定した。

　LcS 株および BBG-01 株は、臨床で用いられるアミノグ

リコシド系、セフェム系、キノロン系およびペプチド系の多

くの抗菌薬、ならびに Fosfomycin、Sulfamethoxazole お

よび Trimethoprime に低感受性であり、テトラサイクリン

系やマクロライド系の抗菌薬には感受性であった。

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ヤクルト研究所研究報告集　第 30号， 1–6（2012）

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（2009） .5） Usami M, Miyoshi M, Kanbara Y, Aoyama M, Sakaki

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11） Kiwaki M, Kushiro A： Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacillus casei by the Broth Microdilution Method and a Survey of Vancomycin-Resistance

謝　辞

　本研究の遂行に当たり、ご助言を頂きました株式会社

ヤクルト本社中央研究所 木脇真祐美 副主席研究員に謹

んで感謝の意を表します。

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Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breve ヤクルト株の薬剤感受性

Table 1 Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breveヤクルト株 (BBG-01株)の薬剤感受性

判定a 判定a

アミノグリコシド系Amikacin RR Enterobacteriaceae : 感受性≦16、中間32、低感受性64≦Gentamycin RR Enterobacteriaceae : 感受性≦4、中間8、低感受性16≦Kanamycin RR Enterobacteriaceae : 感受性≦16、中間32、低感受性64≦Streptomycin -b -b 記載なし

β-ラクタム系Ampicillin RR Staphylococcus : 感受性≦0.25、低感受性0.5≦Carbenicillin SS Enterobacteriaceae : 感受性≦16、中間32、低感受性64≦Oxacillin RS Staphylococcus :感受性≦2、低感受性4≦Penicillin RR Staphylococcus : 感受性≦0.12、低感受性0.25≦

セフェム系Cefaclor RR Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Cefazolin RI Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Cefbuperazone -- 記載なしCefdinir RI Staphylococcus : 感受性≦1、中間2、低感受性4≦Cefmetazole SR Staphylococcus : 感受性≦16、中間32、低感受性64≦Cefotaxime RS Staphylococcus : 感受性≦8、中間16-32、低感受性64≦Cefotiam -- 記載なしCefoxitin RR Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Cefpirome -- 記載なしCefsulodin -- 記載なしCeftazidime RR Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Ceftizoxime RS Staphylococcus : 感受性≦8、中間16-32、低感受性64≦Ceftriaxone SS Staphylococcus : 感受性≦8、中間16-32、低感受性64≦Cephalothin IS Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Flomoxef -- 記載なしLatamoxef -- 記載なし

マクロライド系Clarithromycin RS Staphylococcus : 感受性≦2、中間4、低感受性8≦Clindamycin SS Staphylococcus : 感受性≦0.5、中間1-2、低感受性4≦Erythromycin SS Staphylococcus : 感受性≦0.5、中間1-4、低感受性8≦Oleandomycin -- 記載なし

カルバペネム系Imipenem IR Staphylococcus : 感受性≦4、中間8、低感受性16≦Panipenem -- 記載なし

キノロン系Ciprofloxacin RR Staphylococcus : 感受性≦1、中間2、低感受性4≦Enoxacin RR Staphylococcus : 感受性≦2、中間4、低感受性8≦Levofloxacin RR Staphylococcus : 感受性≦1、中間2、低感受性4≦Lomefloxacin RR Staphylococcus : 感受性≦2、中間4、低感受性8≦Ofloxacin RR Staphylococcus : 感受性≦1、中間2、低感受性4≦

テトラサイクリン系Minocyclin SS Staphylococcus : 感受性≦4、中間8、低感受性16≦Tetracyclin SS Staphylococcus : 感受性≦4、中間8、低感受性16≦

ペプチド系Colistin -- 記載なしPolymyxin B RR Non-Enterobacteriaceae : 感受性≦2、低感受性4≦Vancomycin SR Staphylococcus : 感受性≦4、中間8-16、低感受性32≦

その他Chloramphenicol SI Staphylococcus : 感受性≦8、中間16、低感受性32≦Fosfomycin RR Enterococcus : 感受性≦64、中間128、低感受性256≦Lincomycin -- 記載なしMetronidazole -- 記載なしNeomycin -- 記載なしSulfamethoxazole -- 記載なしTrimethoprim RR Staphylococcus : 感受性≦8、低感受性16≦

測定法: broth microdilution method (CLSI M11-A76))

MIC: µg/mla CLSI M100-S18あるいはNon-Enterobacteriaceaeの判定基準を用いて感受性を判定した（S: 感受性、I: 中間、R: 低感受性）。

9)には、BifidobacteriumおよびLactobacillusの感受性判定表がないことから、Staphylococcus、Enterococcus、Enterobacteriaceae

b CLSI M100-S189)の判定表に記載されていないため、「-」とした。

　　　抗菌薬

256<12816256

MICMIC

B. breve ヤクルト株(BBG-01株)L. casei シロタ株

256256 256<128

20.5

8881

32

82

256<32256<

64

41

256128

64

0.25<0.2522

128256<

168

641632256<162

64<0.2516256<

25664 256<

8

640.582

32<0.250.5<0.25

64256

0.25<0.2588

64

32

2 256<

1<0.25

256<

25616

256<4

CLSI M100-S18の判定基準

168

256< 256<

32 256<32

256< 256< 256< 256<

8256<8256<

1616

16

12816

256<

Table 1. Lactobacillus casei シロタ株およびBifidobacterium breve ヤクルト株（BBG-01 株）の薬剤感受性