Lilian Castilho, PhD Sistema Rh Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008.
Transcript of Lilian Castilho, PhD Sistema Rh Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008.
Lilian Castilho, PhDLilian Castilho, PhD
Sistema RhSistema RhSistema RhSistema Rh
Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008
Sistema RhSistema Rh Sistema RhSistema Rh
Sistema complexo 49 antígenos muitos fenótipos no mínimo 200 alelos um fenótipo pode gerar vários genótipos
Principais antígenos D; C/c; E/e 8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2), cE(r”),
Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)
Sistema Rh:TerminologiaSistema Rh:Terminologia Sistema Rh:TerminologiaSistema Rh:Terminologia
Rh não Rhesus Sistema ISBT: 004 Símbolo ISBT: RH Fenótipo: D+C+E-c+e+
RH:1,2-3,4,5 Dce/ce ou Dce/dce=R1r Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5 ou R1r
Questões frequentemente realizadasQuestões frequentemente realizadas Questões frequentemente realizadasQuestões frequentemente realizadas
1. Por que RhD é tão imunogênico? Principal causa da DHFR 40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+
2. Por que o sistema Rh é tão complexo? - Número elevado de antígenos D, C/c, E/e (comuns) ~outros 40 Variantes - Diferenças na expressão de D D positivo ou D negativo? - D fraco - D parcial
3. Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD complicados? Anti-D em D+, D fraco
Locus RHLocus RHDuplicação de 2 GenesDuplicação de 2 Genes
Locus RHLocus RHDuplicação de 2 GenesDuplicação de 2 Genes
antígeno D antígenos CcEe
ce “Rh negativo” Deletado XEuropeus- 15-17%
X
“Rh positivo”RHD RHCE
ce, Ce, cE, or CE
Circulos- representam 32-35 diferentes amino acidos entre RhD e RhCE
RhCERhD
C/c E/e
1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos)
aa
2. Por que o sistema Rh é tão 2. Por que o sistema Rh é tão complexo ?complexo ?2. Por que o sistema Rh é tão 2. Por que o sistema Rh é tão complexo ?complexo ?
antígeno D antígenos CcEe
RHD5’ 3’
RHCE5’ 3’ ce, Ce, cE, or CE
- Localização no cromossomo- genes muito próximos - Orientação – final 3’ face a face um com outro
5’
RH
D5’
RH
CE
3’3 Durante a replicação cromossômica formação de hair-pinstrocas ocorrem
- um atua como template para a porção do outro
“Conversão gênica” Principal causa para a diversidade RH
Diferenças na expressão de RhDDiferenças na expressão de RhD Diferenças na expressão de RhDDiferenças na expressão de RhD
D-positivo – Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES
D-negativo - 15-17% Europeus- devido a deleção RHD 3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD
D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção trocas de único amino ácido (transmembrana)
diminuição na QUANTIDADE DE RhD 53 “tipos de D fracos” diferentes
Del - expressão muito fraca de D- não detectável por sorologia adsorve e elui anti-D
mais comum em populações Asiáticas
D Parcial –epítopos de D alterados tipam como D+ mas desenvolvem anti-D
Causas – Troca de único amino ácido na superfície da hemácia - Parte do gene RHD substituído pelo RHCE
1. Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicosDiscrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem
estimular anti-D em receptores D-
Exemplos: D Fraco tipo 2 D Fraco com RHCe em trans Del- nenhum reagente detecta
Problemas devido a D Fraco e DProblemas devido a D Fraco e DelelProblemas devido a D Fraco e DProblemas devido a D Fraco e Delel
RhDFraco
V270GTipo 1
2. Alguns pacientes desenvolvem anti-D Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D - altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície - Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar
Proteína D FracoProteína D FracoProteína D FracoProteína D Fraco RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias
D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o tipo de D fraco: 66 a 5.000 sítios/hemácia
300
500
1000
1500
2500 tipo 4tipo 4
tipo 3tipo 3
tipo 1tipo 1
tipo 2tipo 2
tipo 5tipo 5
Cut off sorológico= 500 ags/hemácias
D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo
Proteína Del
RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemáciasDel: densidade antigênica: < 50
sítios/hemácia
Cut off sorológico=500 ags/hemácias
Del: geralmente tipados como RhD-negativo
DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+
Hemácias D Parcial tipam como D+ e não são identificadas até que o paciente desenvolva anti-D
possuem epítopos de D alterados
Problemas com D ParcialProblemas com D Parcial Problemas com D ParcialProblemas com D Parcial
NH2
DMH- L54P DFW- H166P DHMi- T283I DII- A354DDVII- L110P DHR- R229K DNU-G353R DNB- G355S
- Devido a mutações localizadas na região extracelular
- Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas DIII DIV DV DVI DBT DAR DOL DAU etc.
Proteína D Parcial
RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemáciasD parcial: densidade antigênica: 500 a 25.000
sítios/hemácia
D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo
Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo? Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo?
* até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagem
Anti-D#1Anti-D#1
(IgM)(IgM)
Anti-D#2 Anti-D#2
(IgM)(IgM)
ResultadoResultado TransfusãoTransfusão
POSPOS POSPOS RhD+RhD+ RhD+RhD+
NEGNEG NEGNEG RhD-RhD- RhD-RhD-
POSPOS NEGNEG DF/DP?DF/DP? RhD-*RhD-*
NEGNEG POSPOS DF?DP?DF?DP? RhD-*RhD-*
Pacientes
Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo? Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo?
* genotipagem?** até resolver a discrepância: genotipagem
Anti-D#1Anti-D#1
(IgG/AGH)(IgG/AGH)
ResultadoResultado Transfundir Transfundir para para
pacientespacientes
POSPOS RhD+RhD+ RhD+RhD+
NEGNEG RhD-RhD- RhD-*RhD-*
POS FracoPOS Fraco DF/DP?DF/DP? RhD-**RhD-**
Doadores
Voce sabe qual é sua unidade
RhD-negativo?
D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?
Identificação em gelIdentificação em gel
Painel com 12 soros monoclonais Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT,
DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)
D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?
D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?
D FracoD FracoD FracoD Fraco
D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?
–
D conf.
D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?
–
D Fraco tipo 38
D-neg, D Fraco ou DD-neg, D Fraco ou Delel ? ?D-neg, D Fraco ou DD-neg, D Fraco ou Delel ? ?
DEL RHD(M295I)
D FracoD FracoD FracoD Fraco
IgG IgM
PAP
DF1
DF4
DV
I
Problemas nos testes sorológicos
Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial com fraca expressão
Testes sorológicos não detectam alguns D fracos, Del e D parcial
Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de
variantes do antígeno D
Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de
variantes do antígeno D
D Fraco e D parcial
Imunizam receptores D-negativos
Desenvolvem anti-D
Casos enviados ao nosso laboratório para Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007)genotipagem RHD (2007)
Casos enviados ao nosso laboratório para Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007)genotipagem RHD (2007)
TuboTubo GelGel
Variações de DVariações de D IgMIgM PoliPoli DVI+DVI+ DVI-DVI- Dconf.Dconf.
DF1DF1 0/(+)0/(+) 0/1+0/1+ 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ 1+/3+1+/3+
DF2DF2 00 00 0/2+0/2+ 00 2+/3+2+/3+
DF3DF3 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ 2+2+ 2+2+ 4+4+
DF4DF4 0/2+0/2+ 0/2+0/2+ (+)/3+(+)/3+ 1+/3+1+/3+ 4+4+
DVIDVI 0/1+0/1+ 0/1+0/1+ 0/2+0/2+ 00 1+/4+1+/4+
DF1+DF2DF1+DF2 0/3+0/3+ 02+02+ (+)/2+(+)/2+ (+)/2+(+)/2+ 3+3+
DF1+DF4DF1+DF4 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ (+)/4+(+)/4+ (+)/4+(+)/4+ 4+4+
DF1+DF2+DF3DF1+DF2+DF3 3+3+ 2+2+ 2+2+ 3+3+
Amostras Tipos de D fraco e D parcial
Graus de aglutinação Densidades antigênicas
Anti- D mono (gel)
Anti-D conf(gel)
9 DF1 2+ 3+ 1273
4 DF2 0 1+ 462
1 DF3 1+ 3+ 1936
13 DF4 2+ 4+ 2184
2 DAR 0 1+ 988
1 DHMi 0 1+ 1112
3 DVI (+) 1+ 1050
2 DF1/DHMi (+) 2+ 1577
1 DF4/DAR (+) 2+ 1432
ReagentesReagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcialanti-D na detecção de D fraco e D parcialReagentesReagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcialanti-D na detecção de D fraco e D parcial
Genotipagem RHD em doadores de sangueGenotipagem RHD em doadores de sangue Genotipagem RHD em doadores de sangueGenotipagem RHD em doadores de sangue
Indicações:Indicações: Discriminar D neg de DEL e D posDiscriminar D neg de DEL e D pos Discriminar D parcial e D FracoDiscriminar D parcial e D Fraco LimitaçõesLimitações CustoCusto TempoTempo Imunogenicidade de DEL?Imunogenicidade de DEL? Quem deveria ser testado?Quem deveria ser testado? Doadores de primeira vezDoadores de primeira vez Doadores de repetição (discrepâncias) Doadores de repetição (discrepâncias)
Esta unidade é RH
compatível?
Aplicações clínicasAplicações clínicasGenotipagem RHGenotipagem RH
Aplicações clínicasAplicações clínicasGenotipagem RHGenotipagem RH
Pacientes com fenótipos D fracoPacientes com fenótipos D fraco D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com
hemácias RhD pos hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas)preservadas)
Doadores de sangueDoadores de sangue Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente
D neg D neg (prevenção da aloimunização)(prevenção da aloimunização)
Fenótipo D fraco Transfusão
D fraco tipo 1 RhD-positivo
D fraco tipo 2 RhD-positivo
D fraco tipo 3 RhD-positivo
D fraco tipo 4.0 RhD-positivo
D fraco tipo 4.1 RhD-positivo
D fraco tipo 4.2 RhD-negativo
D fraco tipo 5 RhD-negativo
D fraco tipo 11 RhD-negativo
D fraco tipo 15 RhD-negativo
Outros tipos RhD-negativo
Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco
Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginalcom sangramento vaginal
Solicitado 2 unidades de sangueSolicitado 2 unidades de sangue2 gestações2 gestaçõesTipada como O Tipada como O RhD+RhD+Anti-DAnti-D fraco detectado no soro fraco detectado no soroSem história de profilaxia Rh (óbvio!)Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)
Anti-D DIII DIV DV DVI DVII DAR DFR Paciente
1 + + +/- - + + + 3+
2 + - + + + + + 3+
3 + +/- +/- - + - - 3+
4 + + + - + + + 3+
5 + - +/- - + - + 3+
6 + - + + + + + 3+
Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Suspeitas:Suspeitas: D Normal – mas por que o anticorpo?D Normal – mas por que o anticorpo? DDIIIIII? ? DDVIIVII?? Outro D parcial?Outro D parcial?
Análise Molecular – screening rotina mostou Análise Molecular – screening rotina mostou RHD RHD normalnormal
Nenhum gene híbrido presenteNenhum gene híbrido presente
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Análise do DNAAnálise do DNAAnálise do DNAAnálise do DNA
PCR-SSP para DVII: negativoPCR-SSP para DVII: negativoPCR-RFLP para DIIIa: positivoPCR-RFLP para DIIIa: positivoDIIIa!DIIIa!Paciente possuía o fenótipo D parcialPaciente possuía o fenótipo D parcialAnti-D era um aloanticorpoAnti-D era um aloanticorpoPaciente ficou muito brava porque seu tipo de Paciente ficou muito brava porque seu tipo de
sangue estava errado!sangue estava errado!
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI de AHAI
PAI positiva, Auto e TDA positivosPAI positiva, Auto e TDA positivosAnti-D detectado no soro e eluatoAnti-D detectado no soro e eluatoPaciente tipado como D+ Paciente tipado como D+ Anti-D: Anti-D: auto ou alo?auto ou alo?Genotipagem!!!!Genotipagem!!!!
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Análise molecular de rotina demonstrou um Análise molecular de rotina demonstrou um gene gene RHDRHD normal normal
Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVIInem DVII
Sequenciamento do gene Sequenciamento do gene RHDRHD: : normalnormalConclusão: Conclusão: auto-anti-Dauto-anti-D
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Doador com 9 doações préviasDoador com 9 doações préviasFenotipado como O RhD-neg em todas as doaçõesFenotipado como O RhD-neg em todas as doaçõesNa 10Na 1000 doação: Suspeita de doação: Suspeita de D Fraco ou DelD Fraco ou Del??Genotipagem!!!!Genotipagem!!!!
Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico
Análise molecular demonstrou um gene Análise molecular demonstrou um gene RHDRHD deletadodeletado
Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectadoNenhum D fraco, DEL e D parcial detectadoConclusão: Doador Conclusão: Doador RhD-negativoRhD-negativo
Muitas regiões do gene devem ser analisadas Muitas regiões do gene devem ser analisadas Geralmente requer sequenciamento do gene inteiroGeralmente requer sequenciamento do gene inteiroNecessidade de genotipagem por microarrayNecessidade de genotipagem por microarrayConhecimento das mudanças no gene que alteram Conhecimento das mudanças no gene que alteram
os epítopos da proteína = clinicamente significantesos epítopos da proteína = clinicamente significantes
Problemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHD
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos com um gene híbrido D-CE-D específico
Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes aproximadamente 22% Africanos
15 %
Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e
L245Vces
W16C
D/Ce/D híbrido: D-negativo C-positivo
RHD RHCE
Variante ce
Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno C
Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno C
Frequentes em pacientes falciformes
G336CL245Vces
W16C
V223F
ceMOW16C
M238V L245V R263G M267K I306V ceAR
W16C
M238V A273V L378V ceBI
W16C
ceEKM238V R263G M267K W16C
ce “convencional”
Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e
Fenótipo e-positivo Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce
Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos
Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno e
Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno e
Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT, cloroquina
Antígenos do Sistema RhAntígenos do Sistema Rh Antígenos do Sistema RhAntígenos do Sistema Rh
Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos
anti-D, -E, -c, -C, -e
IgM ou IgG
reativos a 37oC, AGH, enzimas
clinicamente significantes
Auto-anticorpos
frequentes (anti-e)
Alo-anticorpos
anti-D, -E, -c, -C, -e
IgM ou IgG
reativos a 37oC, AGH, enzimas
clinicamente significantes
Auto-anticorpos
frequentes (anti-e)
Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh
Alo-anticorposanti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-eanti-E associado a anti-canti-e detectado em hemácias e-positivas
Alo-anticorposanti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-eanti-E associado a anti-canti-e detectado em hemácias e-positivas
PerspectivasPerspectivasPerspectivasPerspectivasGenótipoGenótipo FenótipoFenótipo
aglutinação DNA
+
Tipagem RhD: positivo ou negativoTipagem RhD: positivo ou negativo?? Tipagem RhD: positivo ou negativoTipagem RhD: positivo ou negativo??
Obrigado pela atenção!