LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL - Unicamp€¦ · caryocar brasiliense obtido por co 2 supercrÍtico...
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i LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO EXTRATO DE Caryocar brasiliense OBTIDO POR CO2 SUPERCRÍTICO E SUA APLICAÇÃO COMO ATIVO PARA FORMULAÇÕES ANTISSÉPTICAS CAMPINAS 2014
Transcript of LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL - Unicamp€¦ · caryocar brasiliense obtido por co 2 supercrÍtico...
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LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO EXTRATO DE
Caryocar brasiliense OBTIDO POR CO2 SUPERCRÍTICO E SUA
APLICAÇÃO COMO ATIVO PARA FORMULAÇÕES
ANTISSÉPTICAS
CAMPINAS
2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LILIAN FERREIRA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO EXTRATO DE
Caryocar brasiliense OBTIDO POR CO2 SUPERCRÍTICO E SUA
APLICAÇÃO COMO ATIVO PARA FORMULAÇÕES
ANTISSÉPTICAS
Orientadora: Profa. Dra. Priscila Gava Mazzola
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Campinas para
obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas, área de concentração em
Ciências Biomédicas.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LILIAN FERREIRA
BARBOSA AMARAL E ORIENTADA PELA PROFA. DRA.
PRISCILA GAVA MAZZOLA.
---------------------------------
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2014
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v
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FOLHA DE APROVAÇÃO
vii
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DEDICATÓRIA
A Deus, que cuida de mim todo o tempo.
Aos meus pais, Zélia e Santiago, pelo amor incondicional.
Ao meu amado esposo, Helberth, pelo apoio em todos os momentos e por se
orgulhar das minhas conquistas, que na verdade, são nossas.
Ao meu príncipe Arthur, que embora pequenininho, já se alegra com a minha
alegria.
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xi
AGRADECIMENTOS
Eu agradeço a Deus, que nunca me deixa sozinha, que me abençoa além de
meus merecimentos.
Agradeço ainda à intercessora que tenho no céu, que me conduz a Deus.
Aos meus pais, que dignamente me formaram para a vida, apontando o
caminho da honestidade e persistência.
Ao meu marido por acreditar em mim, pelo amor tão sincero e por motivar o
meu crescimento. Agradeço em especial, pela nossa maior dádiva, nosso filho Arthur!
Aos meus irmãos Rany e Polly, que mesmo estando distante, amo
incondicionalmente.
Aos meus sogros Luzia e Antônio, pelo carinho e pela oração sempre constante.
À Profa. Dra. Priscila Gava Mazzola, orientadora deste trabalho, por
acreditar e confiar em mim, incentivado cada conquista. Sem você, talvez eu não tivesse
chegado até aqui!
À diretoria da empresa Chemyunion Química LTDA, pela oportunidade de
crescimento pessoal e profissional.
À Cecilia Nogueira, gerente de Pesquisa e Desenvolvimento da Chemyunion,
pelas palavras de motivação.
xii
À Ana Paula Vilar, coordenadora da Garantia da Qualidade da Chemyunion,
por compreender os meus anseios.
Aos colegas Marcos Rossan, Lilian Mussi e Wagner Magalhães pela
contribuição técnica.
À Ângela Jozzala que esteve presente em vários momentos deste trabalho,
sempre generosa em compartilhar seu conhecimento.
À Dra. Mary Ann pelo suporte nas análises fitoquímicas e na redação de um
dos artigos científicos.
À Aline Dutra e Sílvia Bueno, minhas “filhinhas”, que deixaram de ser colegas
de trabalho e se tornaram amigas.
À FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
À FCM - Faculdade de Ciências Médicas.
Aos colaboradores do programa de pós-graduação da Faculdade de Ciências
Médicas.
Ao departamento de Patologia Clínica pela oportunidade.
A todos que direta ou indiretamente possibilitaram a realização deste trabalho.
xiii
“Sê humilde para evitar o orgulho, mas voa alto para
alcançar a sabedoria."
Santo Agostinho
xiv
xv
Sumário
RESUMO ................................................................................................................... xxvii
ABSTRACT ................................................................................................................ xxix
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 31
1.1 Pequi (Caryocar brasiliense Cambess) .................................................................... 37
1.2 Extração por dióxido de carbono supercrítico .......................................................... 43
1.3 Produtos naturais e atividade antimicrobiana ........................................................... 50
1.4 Antioxidantes ............................................................................................................ 59
1.5 Testes de segurança in vitro...................................................................................... 64
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 73
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 73
2.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 73
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 77
3.1 Obtenção do material vegetal ................................................................................... 77
3.2 Obtenção dos extratos supercríticos .................................................................... 77
3.3 Avaliação do perfil fitoquímico ........................................................................... 78
3.4 Determinação da atividade antimicrobiana .......................................................... 78
3.4.1 Microrganismos utilizados ......................................................................... 78
3.4.2 Meios de cultura ........................................................................................ 79
3.4.3 Preparo dos meios de cultura ..................................................................... 79
3.4.4 Obtenção e conservação dos microrganismos ........................................... 80
3.4.5 Padronização dos inóculos ......................................................................... 80
3.4.6 Determinação da concentração inibitória mínima ..................................... 81
xvi
3.5 Preparo das formulações ...................................................................................... 82
3.6 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações .................................... 84
3.7 Avaliação da atividade antisséptica ..................................................................... 85
3.8 Avaliação da atividade antioxidante .................................................................... 85
3.8.1 Cultura de fibroblastos humanos ............................................................... 85
3.8.2 Incubação com o produto-teste .................................................................. 86
3.8.3 Determinação da atividade antioxidante .................................................... 86
3.9 Avaliação da irritação ocular - HET-CAM (Teste na membrana corioalantóide do
ovo de galinha) ........................................................................................................... 89
3.9.1 Preparação do produto-teste ...................................................................... 90
3.9.2 Preparação dos ovos .................................................................................. 90
3.9.3 Determinação do potencial irritante ........................................................... 90
3.10 Avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade .................................................... 93
3.10.1 Cultivo celular ......................................................................................... 93
3.10.2 Determinação da citotoxicidade pelo método do XTT ............................ 94
3.10.3 Avaliação da fototoxicidade pelo método do vermelho neutro (3T3 NRU)96
3.11 Avaliação da estabilidade das formulações ....................................................... 99
3.12 Análises estatísticas ......................................................................................... 100
4. RESULTADOS ........................................................................................................ 101
4.1 Obtenção dos extratos supercríticos .................................................................. 103
4.2 Screening do extrato bruto ................................................................................. 105
4.3 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) .................................. 105
4.4 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações .................................. 107
4.5 Avaliação da atividade antisséptica ................................................................... 108
xvii
4.6 Atividade antioxidante ....................................................................................... 109
4.7 Avaliação da irritação ocular ............................................................................. 110
4.8 Avaliação da citotoxicidade ............................................................................... 112
4.9 Avaliação do potencial fototóxico ..................................................................... 114
4.10 Avaliação da estabilidade das formulações ..................................................... 115
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 121
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 143
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 147
ANEXO I ...................................................................................................................... 183
ANEXO II .................................................................................................................... 183
ANEXO III ................................................................................................................... 185
xviii
xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS: (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).
AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome).
ANOVA: Análise de variância (Analysis of variance).
ATLA: Alternatives to Laboratory Animals.
ATP: Adenosina tri-fostato.
BHA: Butilhidroxianisol.
BHI: Caldo infusão de cérebro e coração.
BHT: Butilhidroxitolueno
CBSE: Extrato supercrítico de Caryocar brasiliense (Caryocar brasiliense supercritical
extract).
CCD: Cromatografia de camada delgada.
CIM: Concentração inibitória mínima.
CTFA: Cosmetic and toiletries fragance association.
DNA: Ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid).
DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila.
EBSS: Solução salina balanceada de Earle (Earle's Balanced Salt Solution).
ECVAM: European committee for validation of alternative methods.
EGF: Fator de crescimento epidérmico (Epidermal growth factor).
xx
ERN: Espécie reativa de nitrogênio.
ERO: Espécie reativa de oxigênio.
FDA: Food and drug administration.
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz.
FRAME: Fund for replacement of animal medical experiments.
GRAS: Generally Recognized as Safe.
HET-CAM: Hen's Egg Test – Chorioallantoic Membrane.
IBAMA: Instituto brasileiro do meio ambiente e dos recursos naturais renováveis.
INCI: Nomenclatura cosmética Internacional (International nomenclature of cosmetic
ingredient).
IRAG: Interagency Regulatory Alternatives Group.
MH: Muller Hinton
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide).
NIEHS: National institute of environmental health sciences.
NRU: Ensaio de captação do corante vermelho neutro (Neutral red uptake).
OMS: Organização mundial da saúde.
P.A: Para análise.
PBS: Tampão fosfato-salino (Phosphate buffered saline).
PG: Propil galato.
xxi
PIF: Fator de fotoirritação (Photo-irritation factor)
REACH: Regulation on Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of
Chemicals.
RNA: Ácido ribonucleico (ribonucleic acid).
RPMI: Roswell park memorial institute.
SAB: Agar sabouraud dextrose.
SDS: Dodecil sulfato de sódio (Sodium dodecyl sulfate).
TAA: Atividade antioxidante total (Total antioxidant activity).
TBHQ: Terciobutilhidroquinona.
TSA: Ágar soja tripticaseína (Trypticase soy Agar).
TSB: Caldo soja tripticaseína (Trypticase soy broth).
UFC: Unidade formadora de colônia.
UV: Ultravioleta.
XTT: Sodium 3´-[1-(phenylaminocarbonyl) – 3,4–tetrazolium]–bis (4-methoxy-6-nitro)
benzene sulfonic acid hydrate).
xxii
xxiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Pequizeiro ............................................................................................................ 38
Figura 2. Diagrama pressão x temperatura para um componente puro. .............................. 45
Figura 3. Extrator CO2 supercrítico ..................................................................................... 47
Figura 4. Parede celular bacteriana. .................................................................................... 55
Figura 5. Área foto-exposta ................................................................................................. 59
Figura 6. Área não foto-exposta ......................................................................................... 59
Figura 7. Estrutura química dos principais antioxidantes sintéticos. .................................. 61
Figura 8. Dermatite fototóxica. ........................................................................................... 69
Figura 9. Membrana corioalantóide de ovo de galinha embrionado. .................................. 70
Figura 10. Etapas de execução do método ABTS ............................................................... 88
Figura 11. Esquema das etapas do método XTT. ................................................................ 94
Figura 12. Esquema da distribuição dos controles do teste em microplaca de 96 poços .... 95
Figura 13. (A) Curva global de extração de Caryocar brasiliense e (B) Curva de extração
referente à massa de extrato obtida versus tempo de extração ...................... 103
Figura 14. Concentração de antioxidantes em lisado celular tratado com extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico (CBSE). ......................... 109
Figura 15. Placa de 96 poços utilizada na determinação do potencial citotóxico do CBSE
em fibroblastos murinos (3T3) pelo método do XTT ...................................... 112
xxiv
Figura 16. Avaliação do potencial citotóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após
48 horas de incubação pelo método do XTT. ................................................ 113
Figura 17. Avaliação do potencial fototóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após
60 minutos de incubação pelo método do Vermelho Neutro (3T3 RNU) .... 114
Figura 18. Avaliação de pH da loção hidratante testada durante o estudo de estabilidade.
....................................................................................................................... 116
Figura 19. Avaliação de pH do sabonete líquido testado durante o estudo de estabilidade.
....................................................................................................................... 116
xxv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição da loção hidratante .......................................................................... 83
Tabela 2. Composição do sabonete líquido ......................................................................... 84
Tabela 3. Pontuação dos fenômenos ocorridos em função do tempo .................................. 92
Tabela 4. Classificação do potencial irritante de acordo com a pontuação atingida ........... 92
Tabela 5: Classificação da citotoxicidade em função da IC50. ............................................ 96
Tabela 6. Classificação da fototoxicidade em função do PIF. ............................................. 99
Tabela 7. Rendimento de extração de Caryocar brasiliense. ............................................ 104
Tabela 8. Valores da concentração inibitória mínima (CIM) do CBSE e da solução de
etanol .................................................................................................................. 106
Tabela 9. Avaliação da sensibilidade antimicrobiana........................................................ 107
Tabela 10. Atividade antisséptica do CBSE ..................................................................... 108
Tabela 11. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 100% . 110
Tabela 12. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 10% ... 111
Tabela 13. Estudo de estabilidade da loção hidratante ...................................................... 117
Tabela 14. Estudo de estabilidade do sabonete líquido ..................................................... 118
xxvi
xxvii
RESUMO
As indústrias cosméticas e farmacêuticas têm um crescente interesse na substituição dos
antimicrobianos sintéticos nos produtos dermatológicos, devido à resistência dos
microrganismos aos antimicrobianos convencionais. O pequi (Caryocar brasiliense) é uma
frutífera nativa do Cerrado brasileiro utilizada na medicina popular, na indústria cosmética
e na alimentação, com atividades leishmanicida e antimicrobiana descritas na literatura. O
objetivo principal deste trabalho foi avaliar a segurança e a eficácia do extrato de Caryocar
brasilense obtido por CO2 supercrítico visando sua aplicação cosmética. A concentração
inibitória mínima (CIM) frente às bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus foi determinada pelo método clássico de microdiluição em placas. O
potencial antioxidante do extrato foi determinado por um método baseado na oxidação do
2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS). Para avaliação da
citotoxicidade e fototoxicidade in vitro, foram utilizados métodos colorimétricos baseados
na conversão do corante tetrazólio (XTT) e o método do vermelho neutro (3T3 NRU),
respectivamente. Na avaliação do potencial de irritação ocular empregou-se o teste na
membrana corioalantóide do ovo de galinha (HET-CAM). O Perfil fitoquímico do extrato
foi analisado quanto à presença de alcalóides, saponinas, antraquinonas, esteróides, taninos,
flavonóides e compostos fenólicos, de acordo com métodos colorimétricos padronizados.
Os resultados obtidos indicam que o extrato de Caryocar brasilense obtido por CO2
supercrítico demonstra atividade antimicrobiana frente às bactérias testadas, além de
potencial antioxidante comparado ao padrão testado. Adicionalmente, o extrato de
Caryocar brasilense obtido por CO2 supercrítico não apresenta efeitos tóxicos, mostrando-
se um extrato seguro. Estes resultados fornecem perspectivas de desenvolvimento de
produtos para o cuidado pessoal, principalmente aqueles com atividade antisséptica e os
que minimizam os danos causados pelos radicais livres.
xxviii
xxix
ABSTRACT
The cosmetic and pharmaceutical industries have an increasing interest in replacing
synthetic antimicrobials in dermatological products due to increased microbial resistance to
conventional antimicrobial agents. Caryocar brasiliense (pequi) is a typical Brazilian
Cerrado fruit tree. Its fruit is used as a vitamin source for culinary purposes and as a source
of oil for the manufacture of cosmetics. Leishmanicidal and antimicrobial activities have
been reported previously. This study was designed to evaluate the safety and efficacy of C.
brasiliense extract obtained by supercritical CO2 extraction. The minimum inhibitory
concentrations (MICs) against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and
Staphylococcus aureus were determined by the classical microdilution method. Antiseptic
activity against these organisms was evaluated by the plate diffusion method. The
antioxidant potential of the extract was evaluated using a method based on the oxidation of
2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS). In vitro cytotoxicity and
phototoxicity of C. brasiliense supercritical CO2 extracts were assessed using a tetrazolium-
based colorimetric assay (XTT) and Neutral Red methods; eye irritation potential was
assessed using the Hen's Egg Test – Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) Test Method.
The extract’s chemical profile was analyzed for the presence of alkaloids, saponins,
anthraquinones, steroids, tannins, flavonoids, and phenolic compounds according to
standard colorimetric methods. The C. brasiliense supercritical CO2 extract exhibits
antimicrobial activity against all bacteria tested. It also possesses antioxidant activity, when
compared to a vitamin E standard. We also found that the C. brasiliense (pequi) extract
obtained by supercritical CO2 extraction did not present cytotoxic and phototoxic hazards
This finding suggests that C. brasiliense supercritical may be useful for the development of
cosmetic and/or pharmaceutical products, primarily for antiseptic skin products that
inactivate, reduce, prevent, or arrest the growth of microorganisms with the inherent intent
to mitigate or prevent disease as well as products that minimize damage caused by free
radicals.
xxx
31
INTRODUÇÃO
32
33
1. INTRODUÇÃO
Desde a Antiguidade, o homem procurou conhecer as plantas e suas
propriedades medicinais. Muitas descobertas casuais são, atualmente, comprovadas pela
ciência, como por exemplo, a sua utilização para o desenvolvimento de medicamentos,
desenvolvimento de conservantes para alimentos e de produtos para o controle de
insetos (1).
A humanidade depende diretamente da biodiversidade para extrair ou produzir
alimentos, cosméticos e medicamentos. O uso de produtos naturais para fins terapêuticos é
tão antigo quanto a civilização humana. Por um longo tempo, produtos minerais, animais e
vegetais foram as principais fontes de ativos farmacológicos. O homem primitivo utilizava
as plantas na alimentação, na cura de doenças e também na agricultura. Atualmente, têm
um potencial de uso crescente pelas indústrias cosméticas e farmacêuticas na busca de
ativos naturais (2).
O número de plantas no planeta Terra é estimado entre 250.000 e 500.000
espécies (3). Desse total, cerca de 5% é utilizado como fonte de alimentos tanto para
humanos quanto para animais, e outros 5% têm propósito medicinal (4).
Dados literários sobre a utilização de espécies vegetais para a cura de doenças e
outros males são encontrados desde a antiguidade. Intuitivamente, o homem primitivo
buscava descobrir soluções para suas necessidades básicas como nutrição, reprodução e
proteção. Pelas suas experiências e observações, evoluiu biologicamente, descobrindo nas
plantas e ervas soluções para o tratamento de doenças. Além das plantas benéficas,
descobriu as plantas nocivas, capazes de matar e produzir alucinações (5).
34
No Brasil, o emprego de plantas medicinais está presente desde antes da
colonização. Os índios as utilizavam e, posteriormente, transferiram seus conhecimentos
para os colonizadores, tornando-as amplamente utilizadas na medicina caseira (6).
No início do desenvolvimento dos fármacos, os materiais vegetais eram
utilizados da maneira como eram encontrados no meio ambiente, depois, passaram a ser
concentrados para intensificar e uniformizar a atividade terapêutica. À medida que os
avanços da química surgiram, as substâncias ativas puderam ser identificadas, isoladas e
usadas como moléculas sinteticamente elaboradas, com uma eficácia ainda maior (7).
Extratos de plantas ou seus componentes vêm despertando interesse no uso
como antissépticos e agentes antimicrobianos em dermatologia principalmente devido ao
aumento da resistência dos microrganismos aos agentes antimicrobianos
convencionais (8, 9).
Esta alternativa foi baseada em princípios de convenções internacionais, com a
participação do Brasil na Conferência da Organização Mundial da Saúde (OMS) em Alma-
Ata em 1978, em Chiang-Mai em 1988 e na Conferência Mundial de Saúde de 1997. A
OMS recomenda que as tecnologias de saúde devam ser postas ao alcance de toda a
comunidade, com segurança científica, aceitabilidade social e sustentabilidade
econômica (10, 11, 12, 13).
De acordo com o Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, foi aprovada a
Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos que tem o papel de garantir à
população, o acesso seguro e o uso correto de plantas medicinais e de remédios
fitoterápicos. A medida também busca promover a utilização sustentável da biodiversidade
brasileira e o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria do setor (14).
35
A descoberta de agentes farmacologicamente ativos de origem natural tem
contribuído para o tratamento de doenças humanas (15). A utilização de plantas contra
infecções é uma prática antiga e os resultados alcançados compreendem desde um alívio de
sintomas até a cura completa de doenças (16). Estima-se que 60% das drogas anti-tumorais e
anti-infecciosas inseridas no mercado mundial ou que se encontram na fase de triagem
clínica sejam de origem natural (17).
Embora o desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos
biotecnológicos esteja disponível às indústrias cosméticas e farmacêuticas, 25% dos
medicamentos utilizados nos países industrializados são provenientes de plantas.
Aproximadamente 120 compostos de origem natural, obtidos a partir de cerca de 90
espécies de plantas, são utilizados na terapêutica moderna. Os produtos naturais estão
envolvidos no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas (18).
O mercado de produtos cosméticos e farmacêuticos com componentes de
origem vegetal ou mineral tem crescido muito nos últimos anos. De acordo com Farnsworth
et al. (19), a correlação entre o uso de uma planta na medicina tradicional e a presença de
princípios farmacologicamente ativos com alguma ação terapêutica é altamente positiva.
Estima-se que 74% dos medicamentos convencionais da atualidade tenham sido
descobertos com base no seu uso tradicional. Por este motivo, a procura por compostos
bioativos em produtos naturais tem causado grande repercussão internacional (20).
Na prática, os produtos de origem sintética são raramente associados a sérios
danos à saúde. Entretanto, isto não significa que estes produtos sejam sempre seguros,
especialmente quando são considerados os efeitos a longo prazo. Partindo do pressuposto
de que estes produtos podem ser usados extensivamente durante um amplo período de
36
nossa vida, é extremamente necessário garantir a segurança e a eficácia dos mesmos,
através do controle da toxicidade do produto final e dos seus ingredientes (21).
As reações ou sensibilizações provocadas pelos produtos sintéticos, bem como
o excesso de efeitos colaterais, o uso abusivo, a prescrição indiscriminada e o emprego
incorreto destes produtos, têm estimulado diversos pesquisadores na busca por substâncias
de origem natural para substituição dos ativos sintéticos. Outro motivo que tem favorecido o
crescimento da fitoterapia é a falta de acesso de parte da população mundial à medicina
convencional, devido à situação econômica ou às condições oferecidas pelo sistema político
econômico mundial ou ainda, pela política adotada pelas grandes indústrias
farmacêuticas (22).
Muitas empresas estão conscientes das tendências de consumo e buscam novos
ingredientes para incorporar aos produtos já existentes e aos que poderão ser
desenvolvidos. Uma tendência que está se destacando é o aumento da procura, por parte da
população, de produtos funcionais e seguros baseados em ativos naturais (23).
Normalmente, todas as partes da planta possuem substâncias ativas importantes,
que são sintetizadas a partir do metabolismo primário, resultando em componentes
bioquímicos de ação terapêutica. Por isso, o crescente o interesse dos consumidores em
utilizar produtos menos agressivos e de origem natural, remetendo-se à pesquisa de
produtos fitoterápicos e produtos naturais com valor conhecido, comprovado ou não, que
são disponibilizados às indústrias cosméticas e farmacêuticas.
Assim, a seleção de ativos de origem vegetal para incorporação em produtos
cosméticos ou farmacêuticos é uma tarefa bastante difícil, devendo ser feita à luz do
conhecimento técnico específico disponível sobre sua estrutura química, aspectos
microbiológicos, toxicológicos e legais, buscando substâncias naturais que sejam eficazes,
37
não apresentem efeitos tóxicos ou irritantes e atendam aos aspectos regulatórios dos países
onde são fabricados ou comercializados.
1.1 Pequi (Caryocar brasiliense Cambess)
Estima-se que dois terços da diversidade biológica mundial estejam nas zonas
tropicais, distribuídas principalmente nos países em desenvolvimento. Cerca de 40% dessa
diversidade encontra-se na América tropical, que contém cerca de 90 mil espécies de
fanerógamas, representadas no Brasil por aproximadamente 60 mil espécies. O bioma
cerrado possui uma flora estimada em sete mil espécies, sendo o segundo bioma brasileiro
de maior diversidade vegetal com árvores frutíferas (24, 25).
Caryocar brasiliense Cambess é uma frutífera nativa do cerrado brasileiro (26,
27). É popularmente conhecida como “ouro do cerrado”, devido ao interesse econômico,
principalmente pelo uso de seus frutos na culinária, como fonte de vitaminas e na extração
de óleos para a fabricação de cosméticos (28). Etimologicamente, a palavra pequi ou piqui,
vem do tupi-guarani e significa “fruto de pele espinhenta”, fazendo, dessa forma, uma
alusão aos vários espinhos formadores de uma pele protetora sobre a semente (29).
Taxonomicamente, o Caryocar brasiliense pertence à classe Dicotiledonae,
ordem Parietales e família Caryocaraceae, cuja distribuição cobre a América Central e a
América do Sul, estendendo-se desde a Costa Rica até o Paraguai. Das 26 espécies da
família, dezesseis pertencem ao gênero Caryocar L. e as restantes, ao Anthodiscus G.F.W.
Meyer (30). No Brasil, podem ser encontradas as espécies C. nuciferum (Amazonas e Goiás),
C. Glabrum (Amazonas e Pará), C. edule (Estados do Norte até Rio de Janeiro), C.
brasiliense Cambess (Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro,
38
Maranhão, Piauí e Ceará), C. crenatum (Piauí e Ceará) e C. coriaceum Wittm
(Nordeste) (31).
É uma planta semidecídua, heliófita e seletiva xerófita, de formações primárias e
secundárias. A árvore de Caryocar brasiliense (Figura 1A) mede de 12 a 15 metros de
altura, possui tronco com até 2 metros de circunferência, casca escura e gretada, galhos
grossos, compridos e inclinados, copa longa e aprazível. Tem folhas (Figura 1B) opostas,
ovais, verde-luzentes de aspecto coreáceo, flores branco-amareladas (Figura 1C) e estames
vermelhos e grandes (32).
As folhas do pequizeiro são pilosas e opostas, formadas por três folíolos com as
bordas recortadas. As flores são grandes e amarelas, com múltiplos estames e quatro
estiletes (33).
Figura 1. Pequizeiro: A) Árvore34 B) Folhas35 C) Flores36 D) Fruto37.
A B
C D
39
O fruto (Figura 1D) é do tipo drupa, globoso, com casca verde-amarelada e
mesocarpo oleaginoso e brancacento, contendo de uma a quatro sementes volumosas,
protegidas por endocarpo lenhoso, acompanhado de espinhos delgados e agudos, sob a qual
está a amêndoa grande, carnosa e também oleaginosa (32). Contêm vitamina A, B1, B2, C,
E, fósforo, cobre e ferro (38), apresenta também proteínas, carboidratos, sais minerais e um
gama de metabólitos secundários (39).
A principal exploração do pequi é o uso de seus frutos na culinária e na
indústria agrícola para extração de óleos e produção de licores. Entretanto, são inúmeras as
aplicações do fruto, da casca, do óleo, do caule, da flor e das folhas desta planta na
medicina popular, na indústria cosmética e na alimentação (31, 38).
Popularmente, o óleo de pequi é utilizado no tratamento da rouquidão, dor de
garganta, bronquite, tosse, fortificante, uso tópico para curativos de ferimentos, dores
musculares e reumáticas e contusões (32); infecções pulmonares e uso veterinário (40);
problemas respiratórios e cicatrização (41); atividade antiinflamatória (42); problemas
respiratórios, afrodisíaco e estimulante da produção de sais biliares (38).
A análise da composição química de C. brasiliense revelou que a polpa
apresenta alto teor de umidade (41,50%), além de lipídios (33,4%), carboidratos (11,45%),
fibras (10,0%) e proteínas (3,0%). A amêndoa, por sua vez, é rica em lipídios (51,51%),
apresentando em sua composição proteínas (25,27%), carboidratos (8,33%), fibra alimentar
(2,2%), baixo teor de umidade (8,68%) e elevado teor de minerais, representado pelas
cinzas (4,0%) (43). A polpa e a semente do pequi representam apenas 25% do fruto. Embora
o epicarpo (casca) represente a maior parte do pequi (75%), há poucos estudos sobre esta
parte do fruto, provavelmente por ser um resíduo rejeitado pela população (44).
40
Na composição do óleo de pequi verifica-se a presença da vitamina A e de
diversos ácidos graxos como o palmítico, oléico, mirístico, palmitoléico, esteárico,
linoléico e linolênico (45). A presença destes ácidos graxos na pele é fundamental para
manutenção da hidratação cutânea, da barreira cutânea e do manto hidrolipídico (46).
Também foram identificados carotenóides no pequi (47). Estes metabólitos conferem
proteção à pele impedindo a lipoperoxidação, evitando desta maneira a formação de
radicais livres e, consequentemente, retardando envelhecimento cutâneo.
C. brasiliense possui alto conteúdo de fenóis totais (209 g equivalentes de ácido
gálico/Kg) e atividade de varredura contra o radical estável DPPH (2,2-difenil-1-picril
hidrazil) com IC50 de 9,44 µg/mL e 17,98 µg/mL para o extrato aquoso e etanólico da
casca do fruto, respectivamente, demonstrando, assim, excelente atividade antioxidante. A
caracterização dos componentes bioativos responsáveis por essa atividade revelou a
presença de potentes antioxidantes, tais como ácido gálico, ácido quínico, quercetina e
quercetina-3-O-arabinose (48).
O óleo do pequi possui, em sua composição, o ácido graxo de cadeia média,
linoléico, sendo o mesmo aplicado no tratamento e/ou prevenção de feridas cutâneas
abertas. É relatada ação bactericida, aumento da permeabilidade da membrana celular,
facilitação da entrada de fatores de crescimento, promoção de mitose e proliferação celular,
estimulação da neoangiogênese e facilitação da quimiotaxia leucocitária (49).
O óleo de pequi apresenta atividade inseticida em milhos mantidos em
condições de armazenamento (50). Alguns resultados têm demonstrado a atividade
antimicrobiana de C. brasiliense. Os óleos fixos da semente e da amêndoa dessa planta
mostraram bioatividade elevada em testes de susceptibilidade in vitro sobre isolados de
Cryptococcus neoformans. O óleo essencial obtido das sementes, por sua vez, além de
41
inibir 24% das cepas de C. neoformans (CIM ≤ 250 µg/mL), apresentou atividade inibitória
contra cepas patogênicas de Paracoccidioides brasiliense (CIM = 500 µg/mL) (51). Ensaios
in vitro com extrato hidroetanólico das folhas de C. brasiliense demonstraram atividade
antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Enterococcus faecalis. Além disso, nos estudos de Paula-Junior et al.(52), foram
demonstradas as atividades leishmanicida e antimicrobiana do extrato das folhas de pequi.
O extrato apresentou efeito leishmanicida, inibindo a proliferação de formas promastigotas
de Leishmania amazonensis e, ainda, potencial efeito antioxidante, com atividades
similares à atividade da vitamina C e da rutina.
O extrato etanólico obtido das folhas e da casca do caule de C. brasiliense
mostrou atividades moluscicida contra Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário
esquissostomose (53) e tripanocida in vivo, reduzindo a parasitemia do Trypanosoma cruzi
em camundongos infectados por via intraperitoneal (54). Estudos demonstraram ainda que o
extrato etanólico das folhas apresenta atividade contra o sarcoma 180, um tipo de câncer de
pele. Por meio de análise cromatográfica, identificaram-se no extrato etanólico as seguintes
substâncias: friedelina, friedelanol, ácido oleanóico, β-sitosterol, estigmasterol, β-amirilina
e ácido elágico (55).
De acordo com Passos et al.(51) em seus estudos sobre a atividade antifúngica
do pequi, todas as partes do fruto possuem atividade antifúngica sobre Cryptococus
neoformans, sendo que a cera retirada da folha possui atividade mais elevada, inibindo o
crescimento de 91,3% dos isolados desse microrganismo.
O efeito tóxico de Caryocar brasiliense sobre Botrytis cineria, Colletotrichum
truncatum e Fusarium oxysporum, fungos parasitas de plantas, foi investigado usando-se
extratos etanólicos das folhas e dos botões florais, além de extratos metanólicos preparados
42
das folhas, dos botões florais, dos mesocarpos externo e interno. Entretanto, nenhum deles
apresentou efeito tóxico sobre os fungos testados. Pelo contrário, observou-se estimulação
de seu crescimento (31).
O extrato aquoso, por sua vez, apresentou efeito protetor sobre a
clastogenicidade induzida por ciclofosfamida, provavelmente, devido às propriedades
antioxidantes dessa planta (56).
Os estudos de Magalhães e colaboradores (57) sobre a atividade hemolítica
contra o vírus da estomatite vesicular, poliovírus tipo 1 selvagem e o vírus da
encefalomielite eqüina do leste, de extratos de folhas jovens e adultas de C. brasiliense
demonstraram pequena ação hemolítica frente aos vírus testados.
A capacidade terapêutica do pequi e seus derivados, é bastante difundida no
conhecimento popular e tem ganhado a atenção de pesquisadores, entretanto, existem
poucos estudos demonstrando cientificamente a atividade biológica que elucide suas
atividades terapêuticas, antibacteriana, antifúngica, parasiticida e antioxidante, assim como
uma possível toxicidade que seus componentes possam apresentar (58).
A escassez de dados na literatura, demonstrando cientificamente a atividade
biológica das diversas partes do pequi e potencial toxicidade, reforça a necessidade de
estudos dessa natureza que trarão grande contribuição para utilização segura do pequi (58).
A insatisfação com a medicina convencional, o uso abusivo ou incorreto de
drogas sintéticas, a crescente resistência microbiana a medicamentos, os efeitos tóxicos, o
custo-benefício e a dificuldade de acesso da grande maioria da população a esse tipo de
tratamento, são fatores que reforçam a necessidade de pesquisas científicas que esclareçam
as potenciais atividades biológicas do pequi, e também de outras plantas, a fim de encontrar
resultados satisfatórios.
43
Diante dos registros sobre as diversas atividades dos extratos, ou mesmo de
compostos isolados de C. brasiliense, reconhecemos a importância do estudo sobre sua
utilização; objetivando especificamente neste trabalho, a aplicabilidade antisséptica e
antioxidante em produtos cosméticos, baseando-se no fato de que muitos dos compostos
com reconhecida atividade antimicrobiana e antioxidante estão presentes nesta planta e que,
até o presente momento, poucos estudos com esta abordagem foram encontrados e nenhum
estudo envolvendo extratos obtidos por extração supercrítica foi reportado.
Este estudo buscou ainda sinalizar o aproveitamento de recursos naturais da
biodiversidade brasileira, envolvendo o desenvolvimento social, econômico e ambiental
sustentável por meio da valorização de plantas nativas. Isso implicará em uma maior
competitividade para os produtos naturais de plantas nativas, e consequente expansão
comercial.
1.2 Extração por dióxido de carbono supercrítico
Desde os primórdios históricos praticou-se a extração de substâncias a partir de
vegetais, com fins alimentícios, aromáticos e terapêuticos, buscando-se sempre obter um
produto mais específico, mais puro e mais eficaz (59).
As técnicas para a extração de ativos vegetais evoluíram e hoje é possível obter
compostos sólidos não voláteis pela utilização de solventes adequados e o emprego de
processos físicos, além da obtenção de substâncias líquidas voláteis por destilação ou
sublimação (60).
Em ambos os casos, as extrações apresentam inconvenientes: a utilização de
solventes, ou a presença de impurezas, pode provocar alterações químicas nas substâncias
44
obtidas; a necessidade eventual de elevação da temperatura pode prejudicar substâncias
termolábeis; a eliminação do solvente pode trazer instabilidade físico-química e outras
reações secundárias; a hidrodestilação, além do aquecimento, mantém o insumo em contato
com água quente (59).
Na determinação do método mais adequado a ser empregado, deve-se levar em
conta os fatores mais relevantes como a economia e a qualidade do produto final do
processo selecionado. Dessa maneira, variáveis como custo, produtividade e rendimento
aliados às restrições ambientais e de saúde pública, em relação a resíduos de solventes
orgânicos, e às exigências dos consumidores por alimentos naturais, tem estimulado o
desenvolvimento de tecnologias limpas, evidenciando a importância da otimização do
processo de extração de produtos naturais (61, 62).
A extração por dióxido de carbono supercrítico tem sido proposta como um
método não contaminante de extração de produtos de origem vegetal, em substituição aos
métodos de extração com solventes orgânicos pelos quais obtém-se compostos vegetais de
baixa qualidade e que requerem inúmeros processos de refinamento e de purificação até
chegar ao produto final, completamente isento de contaminantes químicos e efetivamente
purificados com signicativos teores de ativos (63).
O processo de extração com fluido supercrítico é uma operação unitária por
contato que se fundamenta no equilíbrio e nas propriedades físico-químicas dos fluidos
supercríticos: alto poder de solvatação, alto coeficiente de difusão, baixa tensão superficial
e baixa viscosidade (64).
Um fluido supercrítico é definido como qualquer substância que se encontra
acima de sua temperatura e de sua pressão críticas. A temperatura crítica é a temperatura
máxima na qual um vapor pode ser convertido em um líquido por aumento da pressão. A
45
pressão crítica é a pressão na qual um líquido pode ser convertido em vapor por um
aumento de temperatura (Figura 2).
Figura 2. Diagrama pressão x temperatura para um componente puro (65).
Estes valores de temperatura e de pressão definem um ponto crítico que é único
para cada substância. Quando a temperatura e a pressão de uma substância são elevadas
acima dos valores do ponto crítico, ela passa para uma condição chamada de “Estado
Fluido Supercrítico” (66).
Os fluidos na proximidade de seus pontos críticos apresentam densidades
próximas aos líquidos e compressibilidades comparáveis aos gases. As propriedades deste
método extrativo são particularmente sensíveis à temperatura e à pressão, sendo, desta
forma, altamente flexível na modificação da solubilização dos compostos através de
pequenas variações nas condições termodinâmicas de processo (67).
46
A extração supercrítica utilizando o dióxido de carbono como solvente é uma
técnica de alta eficiência na extração de óleo devido a sua natureza apolar, tendo como
produto final, compostos bioativos apolares, misturas complexas de óleo essencial, ésteres,
terpenos, ácidos graxos, ceras, resinas e pigmentos (59).
O dióxido de carbono (CO2) supercrítico possui baixa temperatura crítica
(31,04ºC), permitindo que as extrações sejam realizadas a uma temperatura que não
prejudica as propriedades organolépticas dos extratos, e uma pressão crítica (73,8 bar) de
fácil obtenção em processos de produção em escala industrial (68).
O CO2 é inerte e não oferece risco de reações secundárias, como oxidações,
reduções, hidrólises e degradações químicas, não é inflamável e é de fácil remoção do
soluto, pois é removido pela simples expansão à pressão ambiente. Estas características o
tornam favorável como solvente de extração de compostos termosensíveis como, por
exemplo, os carotenóides, uma vez que não são necessariamente expostos a altas
temperaturas, que podem induzir alterações em sua composição, e nem às altas pressões de
operação, reduzindo o investimento, e consequentemente os custos de manufatura (69, 70).
A extração é facilitada devido às propriedades dos fluidos no estado
supercrítico, tais como: compressibilidade semelhante a um gás, densidade semelhante a
um líquido, capacidade de dissolução como um líquido, viscosidade semelhante à dos gases
e difusividade intermediária entre gás e liquido, variando de acordo com a viscosidade (71).
Segundo King (66), um método ideal de extração deve ser rápido, simples,
barato, de boa eficiência para quantificação, sem perdas ou degradação das substâncias;
deve produzir uma amostra pronta para análise sem a necessidade de adição de solventes ou
de uma etapa de fracionamento e não deve acarretar resíduos de produtos químicos no
laboratório.
47
Os solventes líquidos, frequentemente, apresentam falhas em alguns destes
aspectos. Tais solventes, muitas vezes, requerem várias horas ou alguns dias para fornecer
resultados satisfatórios e resultam em extratos diluídos, que devem ser concentrados por
evaporação do solvente, quando as substâncias a serem analisadas estão presentes em
pequenas quantidades. Sob o ponto de vista ecológico e de segurança, geram acúmulos de
substâncias tóxicas ou emissão destas para a atmosfera durante a etapa de concentração (72).
Figura 3. Extrator CO2 supercrítico (Foto da autora).
Em um processo típico de extração supercrítica, o material contendo o extrato
bruto é inserido no extrator (Figura 3), onde a corrente de solvente supercrítico flui a uma
dada pressão, temperatura e vazão, extraindo, assim, alguns componentes, dependendo
diretamente da sua da solubilidade (73).
48
Este processo consiste das etapas de extração e separação do extrato do
solvente: a etapa de extração inicia quando o solvente no estado supercrítico (fluido) é
bombeado através do extrator, fluindo continuamente através da matéria-prima sólida, a
qual absorve o fluido dilatando sua estrutura celular e diminuindo a resistência ao
transporte de massa, facilitando assim a solubilização dos compostos que são transportados
para a superfície do sólido, escoando para a saída do extrator (64, 74).
A extração e o fracionamento de produtos com fluidos supercríticos podem ser
realizados em dois modos de operação: extração seletiva e/ou separação seletiva. A
primeira envolve a sintonia da capacidade de solvatação do fluido, utilizado na extração,
por meio da manipulação das condições termodinâmicas de temperatura e de pressão e/ou
da modificação da natureza química do solvente utilizado com a adição de um co-
solvente (59).
No segundo modo de operação, a separação seletiva é obtida por meio da
despressurização ou do aquecimento ou resfriamento graduais do extrato, permitindo com
isso um fracionamento controlado dos produtos a serem extraídos. A separação seletiva
pode ser obtida também pelo acoplamento do processo de extração a outro processo de
separação como, por exemplo, adsorção (73).
Após a extração, um ou mais componentes dissolvidos precipitam no vaso
separador com a descompressão do sistema. A manipulação das condições operacionais
pode tomar o solvente mais seletivo para componentes específicos. O poder de
solubilização de um solvente apoIar como o CO2, que é o solvente mais comumente
utilizado neste processo, pode ser modificado através da adição de pequenas quantidades de
substâncias polares chamadas modificadores ou co-solventes (67).
49
O método de extração utilizando fluidos supercríticos apresenta vantagens
diante dos processos convencionais para a obtenção de princípios ativos a partir da matriz
vegetal, uma vez que estes processos, na sua grande maioria, são baseados na extração com
solventes químicos, e apresentam inconvenientes como altas temperaturas de operação,
possibilitando a degradação térmica dos ativos, a presença de resíduos tóxicos no produto
final e a contaminação ocupacional e ambiental, devido à utilização de solventes orgânicos
de manipulação perigosa (73).
Diante destas vantagens, as indústrias químicas, de alimentos, farmacêuticas e
de cosméticos vêm demonstrando interesse na utilização desta nova tecnologia em
processos que priorizam a qualidade máxima dos produtos obtidos. A extração supercrítica
de produtos naturais já ocorre industrialmente em todo o mundo, particularmente no que diz
respeito à extração de cafeína de grãos de café (75). A técnica também é utilizada na
descafeinização de chá; extração, fracionamento e refinamento de gorduras e de óleos;
dealcoolização de bebidas; extração de óleos essenciais; entre outros (67, 73).
Muitos estudos demonstram a importância desta metodologia na extração de
constituintes químicos vegetais, sendo comum e inquestionável a referência da qualidade
deste método de extração quando comparadas às metodologias de extração com solventes
orgânicos. Um recente estudo realizado por Stashenko et al. (76), compara o isolamento de
dezenas de constituintes químicos vegetais utilizando quatro diferentes técnicas de
extração, inclusive a extração por CO2 supercrítico.
Como resultado, demonstraram que para alguns compostos, a utilização deste
método é mais rentável e eficaz. Corroborando com estes achados, Del Valle et al. (63),
demonstraram que a extração com CO2 supercrítico comparada à extração com solventes
orgânicos foi mais eficaz na obtenção de compostos puros com potente atividade
50
antioxidante. Resultados similares foram obtidos na extração de piretrinas de flores,
demonstrando mais uma vez a eficiência desta metodologia na extração de produtos em
maiores concentrações e com melhor qualidade final (77).
Hawthorne et al. (72) em um estudo comparativo de várias técnicas de
isolamento a partir de sólidos ambientais, apresentam conclusões similares e mostram
claramente que a qualidade difere de acordo com a metodologia empregada, indicando que
a extração por CO2 supercrítico apresenta os melhores índices de qualidade, menor
quantidade de artefatos e maior seletividade para a separação de algumas classes de
compostos. Além dos dados já discutidos, é importante referir o estudo comparativo
realizado por Bravi et al. (78), o qual reporta que esta metodologia é viável para a obtenção
de constituintes químicos vegetais de alta performance.
Estudos realizados, utilizando esta metodologia na extração de constituintes
oriundos de espécies vegetais de grande valor econômico para a indústria de cosméticos,
demonstram a adequação desta metodologia na obtenção de compostos de interesse com as
características desejadas na elaboração de produtos na área cosmética e farmacêutica (79).
Com esta finalidade, a adequação desta metodologia para a extração em escala industrial
também têm sido alvo de pesquisas. Outros estudos demonstraram que esta técnica é
excelente para a obtenção de frações enriquecidas com constituintes químicos vegetais, e
que a mesma pode ser facilmente adaptada da escala laboratorial para uma planta piloto (80).
1.3 Produtos naturais e atividade antimicrobiana
As propriedades antimicrobianas de substâncias e óleos essenciais que as
plantas contêm como produtos de seu metabolismo secundário têm sido reconhecidas
51
empiricamente durante séculos, mas foram confirmadas cientificamente apenas
recentemente. Inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas e direcionadas no
descobrimento de novos agentes antimicrobianos provenientes de produtos naturais
aplicados em produtos farmacêuticos e cosméticos (81).
A história do desenvolvimento e uso de substâncias antimicrobianas com fins
medicinais antecedeu a descoberta de espécies microbianas. Em anos remotos, Hipócrates
(460–337 a.C.) recomendava a lavagem de ferimentos com vinho para impedir a
proliferação de microrganismos e o processo infeccioso. Documentos datados de 2500 a
3000 anos atrás, mostram que alguns povos como chineses e indianos, ainda primitivos,
utilizavam mofo, infusões diversas e outros produtos correlatos para o tratamento de lesões
infectadas e processos inflamatórios (82).
A eficácia de antimicrobianos foi muito promissora logo após a sua introdução.
No entanto, em seu discurso de 1945 quando recebeu o Prêmio Nobel, Fleming advertiu
que o uso indevido de antibióticos resultaria em resistência (83). Algumas décadas após esse
discurso, o problema da resistência antimicrobiana tornou-se generalizado e uma questão
relevante na medicina.
Nas últimas décadas, foram intensificadas as investigações sobre fitoterápicos
que possam oferecer tratamento alternativo de controle bacteriano (84). O estudo desses
agentes é importante no campo da saúde visto que se buscam, mundialmente, substâncias
menos tóxicas e mais eficazes contra a resistência bacteriana, capazes de combater novos
patógenos (85, 86).
Estudos sobre as atividades antimicrobianas de extratos e óleos essenciais de
plantas nativas têm sido relatados em muitos países, como por exemplo, no Brasil, em
Cuba, na Índia, no México e na Jordânia, que possuem uma flora diversificada e uma rica
52
tradição na utilização de plantas medicinais para uso como antibacteriano ou antifúngico (87,
88, 89).
Há muitas vantagens no uso de compostos antimicrobianos de plantas
medicinais, como por exemplo, indução de menos efeitos colaterais, melhor tolerância do
paciente, valor mais econômico, melhor aceitação devido à longa história de uso e ser
renovável por estar disponível na natureza (90, 91).
Com uma estrutura química que difere daquela dos antimicrobianos derivados
de microrganismos, os antimicrobianos vegetais atuam regulando o metabolismo
intermediário de patógenos, ativando ou bloqueando reações e síntese enzimática ou ainda,
alterando a estrutura de membranas (92). Além disso, os fitoterápicos têm baixo custo e
podem ser usados conjuntamente à medicina alopática (93).
Segundo Sanches (94), os agentes antimicrobianos agem sobre microrganismos
patogênicos e oportunistas que podem conduzir ao óbito. Eles possuem vários mecanismos
de ação, destacando-se aqueles que atuam lesando ou alterando a permeabilidade da parede
celular, promovendo modificações estruturais em suas proteínas e ácidos nucléicos ou
mesmo inibindo sua síntese. Diferentemente do que ocorre com os agentes antibióticos e
quimioterápicos, há poucos registros na literatura quanto ao possível mecanismo de ação de
produtos oriundos de plantas.
Os compostos isolados de plantas são substâncias com estruturas químicas bem
diferenciadas dos antimicrobianos obtidos a partir de bactérias, de leveduras e de fungos.
Tais produtos podem atuar no metabolismo intermediário ativando enzimas, alterando a
ação de inibidores que influenciam os nutrientes do meio, inferindo nos processos
enzimáticos em nível nuclear ou ribossomal, provocando alterações nas membranas ou
ainda interferindo no metabolismo secundário (16).
53
Inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas e direcionadas no descobrimento
de novos agentes antimicrobianos provenientes de produtos naturais aplicados em produtos
farmacêuticos e cosméticos. Nestes casos, o principal objetivo é avaliar as concentrações
em que determinada substância apresenta ação sobre fungos e bactérias. Atualmente
existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana a e antifúngica destes
agentes. Os mais conhecidos incluem método de difusão em ágar, método de macrodiluição
e método de microdiluição (95).
A antissepsia é um processo de redução da carga microbiana, com o uso de
substâncias químicas, chamadas de antissépticos, usadas como bactericidas ou
bacteriostáticos, de forma que a área tratada deixa de representar um risco de disseminação
de microrganismos em tecidos vivos. Por esta razão, devem ser substâncias de baixa
toxicidade (96).
A primeira referência do uso de desinfetantes está relacionada ao uso do
enxofre, na forma de dióxido de enxofre (aproximadamente 800 a.C.), substância ainda
hoje empregada na preservação de frutas secas, sucos de frutas e vinho (97).
Louis Pasteur (1822-1895) demonstrou que os microrganismos são
responsáveis por doenças infecciosas e desenvolveu posteriormente, o método físico
denominado pasteurização, ainda hoje utilizado na higienização de produtos alimentícios,
médicos e odontológicos (98).
Relatos históricos indicam que os desinfetantes e antissépticos foram utilizados
durante o início do século XIX, quando em 1846, Ignaz Semmelweis utilizou compostos
clorados na enfermaria de um hospital obstétrico para reduzir a incidência da febre
puerperal, orientando os estudantes de medicina do hospital a lavar as mãos com água e
54
sabão e em seguida, imergí-las em uma solução de hipoclorito de sódio antes de examinar
as pacientes (97).
Os desinfetantes e antissépticos, entre outras características, devem possuir alta
eficácia germicida, o que inclui ação rápida e prolongada, amplo espectro antimicrobiano,
estabilidade química e ser inodoro ou ter odor agradável (96).
A antissepsia regular e adequada é de grande importância no controle de
infecções, embora ainda apresente alguns desafios, como a eficácia do produto e a
incorporação do ato na rotina das pessoas. Embora muitas instituições regulamentem
procedimentos de antissepsia, poucas são as regulamentações baseadas em pesquisas
científicas e, muitas vezes, esses procedimentos apresentam lacunas de quando e como a
mesma deve ser feita (99).
Os antimicrobianos são classificados por diferentes autores levando-se em
consideração critérios distintos. De acordo com Bresolin e Cechinel-Filho (100), os
antimicrobianos podem ser divididos em específicos e inespecíficos. Os específicos são
aqueles que agem sobre o organismo invasor, sem afetar o hospedeiro e os inespecíficos
são aqueles capazes de matar ou inibir o crescimento microbiano in vitro. Fazem parte
deste grupo os antissépticos, germicidas e biocidas, que são de uso exclusivamente tópico.
Outra classificação adotada separa antimicrobianos em bactericidas ou
fungicidas, quando matam os microrganismos e bacteriostáticos e fungistáticos, quando
atuam apenas impedindo seu crescimento (100).
Os principais mecanismos de ação dos antimicrobianos incluem a inibição da
síntese do peptideoglicano da parede celular bacteriana (Figura 4) ou do β-1,3-
glicano/quitina da parede celular do fungo; lesão da membrana citoplasmática e interrupção
do fluxo de elétrons, do transporte ativo e da coagulação do conteúdo celular; interferência
55
na síntese e replicação do DNA; inibição da RNA-polimerase dependente de RNA e,
consequentemente, da transcrição do ácido nucléico e síntese proteica; inibição competitiva
da síntese de metabólitos essenciais (101).
Figura 4. Parede celular bacteriana (102).
A atividade dos produtos antissépticos contra bactérias, nem sempre é a mesma
contra fungos, protozoários ou vírus, uma vez que estas células são maiores ou mais
complexas (103).
Existem várias substâncias químicas utilizadas para desinfecção ou antissepsia
atualmente disponíveis, divididas em grupos principais: fenol e compostos fenólicos,
alcoóis, halogênios (iodo e cloro), metais pesados e seus compostos e detergentes (97).
Parede
Parede
Membrana
56
Os agentes antibacterianos são incluídos também em formulações de higiene e
limpeza principalmente para aliviar condições de halitose, odor corporal e infecções de pele
mais simples, incluindo infecções secundárias associadas à acne. Estas formulações não
devem ser confundidas com produtos farmacêuticos, que são utilizados para o tratamento
de condições patológicas, os quais podem conter antibióticos e outros agentes não
comumente considerados susceptíveis para os objetivos mais gerais de higiene (98).
A microbiota normal da pele compreende dois grupos distintos de
microrganismos, a microbiota residente e a transitória. A microbiota normal, de baixa
patogenicidade, é composta por microrganismos Gram positivos, e, em menor proporção,
Gram negativos que colonizam as camadas mais profundas da epiderme e são mais
resistentes à remoção pelas técnicas de higienização (104).
A microbiota transitória ou contaminante é composta por bactérias Gram-
negativas, Gram-positivas, fungos e vírus, que colonizam camadas mais superficiais e são,
geralmente, removíveis pela higiene com água e sabão ou destruídos/inativados pelo uso de
antissépticos (104).
A população de bactérias varia consideravelmente nas diferentes partes do
corpo, sendo encontrada em maiores proporções na face, cabelos e axilas, particularmente
nos folículos pilosos e glândulas sebáceas (105).
Os antissépticos removem, destroem ou impedem o crescimento de
microrganismos da microbiota transitória e alguns residentes da pele e mucosas (106).
A utilização de sabão com antimicrobianos para lavagem rotineira das mãos
reduz transitoriamente a microbiota da pele e é recomendada em procedimentos
hospitalares diversos, laboratoriais e odontológicos. O sabão destinado à antissepsia da pele
pode conter diferentes famílias de compostos. Dentre eles, os alcoóis, tendo como principal
57
referência o etanol 70%; aldeídos, como o glutaraldeído; agentes catiônicos, como a
clorexidina; o iodo e os fenóis. Considerando, porém, o emprego de sabonetes contendo tais
antissépticos, a grande maioria destes agentes apresenta comprometida aplicação (107).
São inúmeras as formas farmacêuticas e fitoterápicas desenvolvidas utilizando-
se matérias-primas vegetais, muitas delas empregadas no desenvolvimento de preparações
para higiene. A utilização de agentes antissépticos em formulações difere do uso de agentes
conservantes (108).
Os antissépticos são ativos contra microrganismos presentes na pele, couro
cabeludo ou boca, enquanto os conservantes têm por principal função a manutenção do
produto em condições microbiológicas satisfatórias durante seu prazo de validade (108).
As substâncias antibióticas ou antimicrobianas representam um imenso avanço
da farmacoterapia nas últimas cinco décadas. Os antimicrobianos atuam sobre
microrganismos patogênicos e oportunistas que podem conduzir a uma incapacitação
prolongada ou ao óbito (94).
Considerando que a atividade antimicrobiana de determinada substância deve-se
à sua capacidade de impedir o crescimento ou mesmo, destruir os microrganismos-teste, a
avaliação da atividade antimicrobiana torna-se possível. Nestes casos, o principal objetivo é
avaliar as concentrações em que determinada substância apresenta ação sobre fungos e
bactérias (109). Atualmente existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e
antifúngica destes agentes. Os mais conhecidos incluem método de difusão em ágar,
método de macrodiluição e microdiluição (110).
As variações referentes à determinação da concentração inibitória mínima de
produtos naturais ou semi-sintéticos podem ser atribuídas a vários fatores. Dentre eles
podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e a cepa utilizada no teste, solubilidade
58
e outras propriedades físico-químicas. Assim, não existe método padronizado para
expressar os resultados de testes para avaliação da atividade antimicrobiana de produtos
naturais ou semi-sintéticos (111).
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um
método físico, no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância
biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição
de crescimento do microrganismo desafiado com a concentração da substância
ensaiada (112).
A aplicação do método de difusão se limita a microrganismos de crescimento
rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A avaliação é comparativa frente a um
padrão biológico de referência e a zona ou o halo de inibição de crescimento é medida
partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde há crescimento de
microrganismos (111).
O método de diluição em caldo considera a relação entre a proporção de
crescimento do microrganismo desafiado no meio líquido e a concentração da substância
ensaiada. A avaliação é comparada frente a um padrão biológico de referência. Entende-se
por proporção a densidade da turbidez provocada pelo crescimento microbiano (112, 113).
O método fornece resultados quantitativos e não é influenciado pela velocidade
de crescimento dos microrganismos (111). Duas metodologias podem ser empregadas: macro
e microdiluição. A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, e a microdiluição
utiliza microplacas com 96 poços (112).
59
1.4 Antioxidantes
O processo respiratório e diversas reações oxidativas, que ocorrem nas células
aeróbicas, levam à formação de radicais livres, que causam danos ao organismo e
contribuem para o aparecimento de muitas doenças, tais como: inflamações, tumores
malignos, mal de Alzheimer e doenças cardiovasculares, bem como aceleram o processo de
envelhecimento (114).
O envelhecimento cutâneo é provocado principalmente pela desorganização do
mecanismo de defesa antioxidante. Como resultado desse desequilíbrio, acontece o
aparecimento de doenças na pele, que podem ser consideradas consequências dos danos às
estruturas nela presentes, como lipídios, proteínas e DNA. Estima-se que cerca de 80% dos
sinais visíveis do envelhecimento são provocados pelos raios ultravioletas e pelos radicais
livres, formados devido à exposição aos raios (115).
As Figuras 5 e 6 representam as alterações macroscópicas que evidenciam as
diferenças entre uma área fotoexposta e uma área protegida da pele de uma mesma pessoa.
Figura 5. Área foto-exposta* Figura 6. Área não foto-exposta*
*Mulher caucasiana de 85 anos, fototipo de pele III (Fitzpatrick) (116).
60
Comparações clínicas visuais entre áreas da pele expostas à radiação
ultravioleta mediante fotoproteção e não-fotoprotegida, revelam que as principais alterações
na aparência da pele relacionadas ao envelhecimento cutâneo decorrem primariamente da
exposição solar (116).
Os radicais livres cujo elétron encontra-se centrado nos átomos de oxigênio e
nitrogênio são denominados, respectivamente, de espécies reativas de oxigênio (ERO) e
espécies reativas de nitrogênio (ERN). No organismo encontram-se envolvidos com a
produção de ATP, fagocitose, regulação do crescimento celular, entre outros. Sua produção
ocorre naturalmente como um processo fisiológico (117).
Os antioxidantes constituem um conjunto heterogêneo de substâncias formado
por vitaminas, minerais, pigmentos naturais e outros compostos vegetais e, ainda, enzimas,
que bloqueiam o efeito danoso dos radicais livres, formados nas reações metabólicas ou por
fatores exógenos, ao organismo. A geração de radicais livres, fisiológica ou não, é
normalmente equilibrada pela ação dos antioxidantes endógenos e exógenos (118).
Estas substâncias, mesmo em baixas concentrações, retardam ou previnem a
oxidação do substrato, isto é, têm ação direta ou indireta sobre espécies oxidativas,
neutralizando a sua ação (119, 120). Quando a ação do antioxidante acontece através de sua
reação com o radical livre, o novo radical formado deve ser estável e incapaz de propagar a
reação (121).
Entre as principais características de um bom antioxidante estão: presença de
substituintes doadores de elétrons ou de hidrogênio ao radical, em função de seu potencial
de redução; capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura; capacidade
61
de quelar metais de transição implicados no processo oxidativo; e acesso ao local de ação,
dependendo de sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de partição (122).
Os antioxidantes podem ser classificados em sintéticos ou naturais, sendo que os
sintéticos são comumente usados na indústria alimentícia, para aumentar a vida de
prateleira de alimentos lipídicos ou que contenham lipídeos em sua composição. Dentre os
sintéticos, os mais conhecidos são o butilhidroxitolueno (BHT), o butilhidroxianisol
(BHA), o propilgalato (PG) e o terciobutilhidroquinona (TBHQ) (123), cujas estruturas
químicas estão demonstradas na Figura 7.
Figura 7. Estrutura química dos principais antioxidantes sintéticos (124).
Dentre os antioxidantes naturais pode-se destacar os compostos enzimáticos
como Glutation-Peroxidase, Catalase, Metionina-Redutase e Superóxido-Dismutase (125) e
os não enzimáticos, como por exemplo, as substâncias da classe de fenóis, terpenos, ácidos
62
fenólicos e seus derivados, flavonóides, tocoferóis, fosfolipídios, aminoácidos, ácido fítico,
ácido ascórbico, pigmentos e esteróis (40, 126, 127).
As plantas possuem dois tipos de metabólitos: os metabólitos primários,
responsáveis pela sobrevivência do vegetal, exercendo função ativa nos processos de
fotossíntese, respiração e assimilação de nutrientes e os metabólitos secundários, que estão
intimamente associados à estratégias de defesa das plantas (128).
Os principais metabólitos secundários são distribuídos em três grupos de acordo
com sua rota biossintética: terpenos, compostos fenólicos e compostos contendo
nitrogênio (129).
Na região do Cerrado, as árvores recebem alta incidência de raios solares, o que
favorece a geração de radicais livres. Essas condições favorecem a biossíntese de
compostos secundários com propriedades antioxidantes (compostos fenólicos e
terpenos) (43).
Os compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas na natureza,
fazendo parte dos constituintes de uma variedade de vegetais, frutas e produtos
industrializados. São essenciais para o crescimento e reprodução do vegetal, além disso, se
formam em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiações UV, dentre
outros. São incluídos na categoria de interruptores de radicais livres, sendo muito eficientes
na prevenção da autoxidação (121).
Esses compostos têm função antioxidante, não somente pela sua habilidade em
doar hidrogênio ou elétrons, mas também por impedir a oxidação de várias estruturas,
particularmente de lipídios (130).
Esta classe de compostos apresenta uma grande diversidade e divide-se em
flavonóides (polifenóis) e não-flavonóides (fenóis simples ou ácidos). Os átomos de
63
hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes (orto-difenóis), localizados em várias posições
dos anéis A, B e C, as duplas ligações dos anéis benzênicos e a dupla ligação da função oxo
(-C=O) de algumas moléculas de flavonóides garantem a esses compostos sua alta atividade
antioxidante (131, 132).
Os terpenos ou terpenóides constituem uma classe de produtos naturais obtidos
de plantas com a maior variedade estrutural e funcional. Alguns destes compostos
participam de processos vitais aos vegetais, como respiração e desenvolvimento celular.
Quimicamente, os terpenos, em sua maioria, são hidrocarbonetos insaturados cíclicos, com
diferentes posições de oxigênio no grupo constituinte, ligados ao esqueleto básico
isopreno (133).
Estes metabólitos atuam ainda em diferentes funções, como por exemplo, na
produção de hormônios (giberelinas), pigmentos fotossintéticos (carotenóides), carreadores
de elétrons (ubiquinonas), e em mecanismos de defesa e comunicação. Normalmente, são
compostos de baixo peso molecular, natureza lipofílica, grande variedade de estruturas e
alta pressão de vapor à temperatura ambiente (133).
Em relação ao mecanismo de combate aos radicais livres, os antioxidantes
podem ser classificados em primários e secundários. Os primários atuam como doadores de
prótons, impedindo o processo de iniciação desencadeado pelos radicais livres. Nesta classe
de antioxidantes são encontrados os compostos fenólicos, tocoferol, aminoácidos,
carotenóides e os antioxidantes sintéticos (134).
Os antioxidantes secundários atuam no bloqueio da decomposição dos
peróxidos e hidroperóxidos, convertendo-os na forma inativa, por ação de agentes
redutores, bloqueando a reação em cadeia através da captação de intermediários reativos,
64
como os radicais peroxila e alcooxila. Nesta classe estão os antioxidantes sintéticos, os
compostos fenólicos e as vitaminas A, C e E (135).
A busca por novas fontes de antioxidantes naturais é crescente e visa,
principalmente, substituir o uso dos antioxidantes sintéticos, que podem causar danos à
saúde humana como câncer, aumento do peso do fígado e significativa proliferação do
retículo endoplasmático celular (136). Em contrapartida, estudos clínicos e epidemiológicos
demonstram que os antioxidantes naturais de fontes vegetais como fenóis encontrados nos
cereais e nas frutas são os três principais fatores que contribuem com significativa redução
da incidência de doenças crônicas e degenerativas (40, 125).
No pequi é possível encontrar compostos antioxidantes como os carotenóides,
que estão presentes em quantidades consideráveis na polpa, e compostos fenólicos, que são
citados como principais substâncias responsáveis pela atividade antioxidante observada (48).
1.5 Testes de segurança in vitro
Devido à evolução técnico-científica, na década de 80 iniciou-se o
desenvolvimento de modelos experimentais alternativos para a área cosmética, em
substituição ao uso de animais de laboratório. Metodologias foram desenvolvidas,
inicialmente, para responder corretamente às necessidades de pesquisa em farmacologia,
onde se sabe que o comportamento animal pode ser diferente do humano. Os métodos
alternativos também foram contemplados para a avaliação de efeitos toxicológicos (137).
Para avaliação toxicológica de produtos, são necessários testes que comprovem
a segurança, tais como toxicidade sistêmica aguda, irritação e corrosividade cutânea,
irritação ocular, sensibilização dérmica, absorção cutânea, toxicidade subaguda e
65
subcrônica, genotoxicidade e mutagenicidade, efeitos tóxicos induzidos por raios UV
(fototoxicidade, fotoalergia e fotogenotoxicidade), toxicocinética e metabolismo,
carcinogenicidade e reprodução e toxicidade do desenvolvimento (137).
Visando a segurança do consumidor frente aos produtos com componentes
naturais, novas substâncias ativas de origem vegetal devem ser avaliadas extensivamente,
quanto a sua toxicidade. Atualmente, os testes de toxicidade em animais são contestados
pelos pesquisadores, levando ao desenvolvimento de novas metodologias que utilizam
linhagens especializadas de células, resultando em ensaios confiáveis e esclarecedores (138).
A União Europeia determinou prazos para a redução e substituição de testes em
animais. Isto atingiu o mercado mundial e os países vêm tentando se adequar a esta
realidade. Estas considerações e avanços em testes clínicos e in vitro têm colaborado para
um intenso esforço da comunidade científica para o desenvolvimento de métodos
alternativos baseados em sistemas de testes in vitro (uso de pele de ratos, suínos ou
humanos ex vivo ou em modelos de pele reconstituída) (139).
Vários esforços têm sido efetuados para a diminuição do uso e do sofrimento de
animais (140). Em 1984, o Governo Britânico concedeu fundos para o desenvolvimento de
métodos alternativos ao FRAME - Fund for Replacement of Animal Medical Experiments
que, desde 1983, edita uma revista internacional intitulada ATLA - Alternatives to
Laboratory Animals.
Em 1994, foi inaugurado o ECVAM – European Committee for Validation of
Alternative Methods - instituição da Comissão Européia encarregada de promover e validar
técnicas e metodologias destinadas à substituição dos ensaios em animais (141).
Algumas instituições, como CTFA - Cosmetic, Toiletries and Frangrance
Association, IRAG - Interagency Regulatory Alternatives Group, FDA - Food and Drug
66
Administration e Alternatives to Animal Testing, John Hopkins University, Baltimore -
EUA, são referências para acelerar a padronização e a harmonização de metodologias in
vitro (137).
A ideia de ensaios alternativos é muito mais abrangente do que a substituição do
uso de animais, incluindo também a questão da redução e refinamento na utilização dos
mesmos. Este princípio está baseado no conceito dos 3R’s (Three R’s), o qual foi definido
por William Russell e Rex Burch (142), no livro Principles of Human Experimental
Technique. Os 3 R’s, que representam o refinamento, redução e substituição (Refine,
Reduction e Replacement), têm como estratégia uma pesquisa racional minimizando o uso
de animais e o seu sofrimento, sem comprometer a qualidade do trabalho científico que está
sendo executado, visualizando, futuramente, a total substituição de animais por modelos
experimentais alternativos (142).
O termo refinamento refere-se à modificação de algum procedimento
operacional envolvendo animais, objetivando minimizar a dor e o estresse. A experiência
da dor e do estresse resulta em mudanças psicológicas que aumentam a variabilidade
experimental dos resultados. O interesse dos cientistas é assegurar que as condições
ambientais para os animais sejam as melhores possíveis. Os testes considerados menos
invasivos podem ser utilizados para diminuir a angústia causada durante o estudo. Além
disto, é importante que toda a equipe envolvida seja bem treinada e competente no que se
refere a correta atitude em relação aos animais (143).
A concepção de redução como alternativa estratégica, resulta em menor número
de animais sendo utilizados para obter a mesma informação, ou maximização da
informação obtida por animal. Existem várias possibilidades para redução do uso de
67
animais, de forma que se opte pelas pesquisas que utilizem os vários órgãos de um mesmo
animal, associadas aos dados apropriados e princípios estatísticos. Em outros casos, pode-se
executar um estudo piloto indicando se o procedimento será apropriado para um estudo
maior. Para tanto, é possível a utilização de estudos preliminares in vitro, os quais podem
indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas (137).
Os ensaios biológicos utilizados para avaliação de segurança de produtos
cosméticos, entre eles o teste de sensibilidade de pele, irritação ocular, fototoxicidade e
citotoxicidade geram discussão entre os pesquisadores, e cabe, portanto, ao profissional
envolvido em questões técnico-científicas, o bom senso na utilização de ensaios
toxicológicos e a busca de abordagens alternativas, evitando sempre que possível a morte e
o sofrimento desnecessários dos animais de experimentação (144).
Um sistema experimental que esteja vinculado à totalidade da condição de vida
animal, pode ser considerado como um substituto alternativo. Pode-se citar a proposta de
obtenção de células, tecidos ou organismos para subsequentes estudos in vitro ao invés da
matança de animais (137).
Cerca de 20 diferentes critérios são utilizados na determinação da toxicidade
geral. As células são expostas a diferentes concentrações da substância-teste por um
período de tempo e, posteriormente, o grau de inibição de viabilidade e/ou condições
funcionais das células são avaliados. Os métodos mais utilizados são: análise histológica
através de microscopia comum, número, morfologia, crescimento, divisão e metabolismo
celular, integridade de membrana, atividade mitocondrial, lisossomal e ribossomal (145).
Critérios menos comuns, mas também de grande valor (estudos mecanísticos),
são: análise ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão, frequência mitótica
utilizando análise cariotípica, retenção do azul de tripan entre outras (146).
68
Os testes de citotoxicidade definem o potencial de degeneração ou morte celular
provocado pela formulação cosmética. Assim, resultados positivos no ensaio de
citotoxicidade descaracterizam a condição de inocuidade do cosmético, sendo possível
causar processos de irritabilidade nos usuários (147).
Algumas técnicas para determinação de citotoxicidade utilizam substâncias que
são incorporadas ou transformadas em produtos coloridos apenas por células vivas, mas
não por células mortas ou são transformados pelo próprio meio de cultivo. A formação
desses produtos reflete o endpoint tóxico e quantifica o número de células viáveis,
mostrando uma relação linear entre esses dois parâmetros (148).
Os métodos colorimétricos são realizados em placas de microtitulação, leitura
em espectrofotômetro multicanal automático e oferecem vantagens como simplicidade,
rapidez, custo e segurança. A técnica desenvolvida por Mosmann (149) baseia-se na quebra
do sal de MTT tetrazólio (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), o
qual é reduzido em produto corado por enzimas microssomais e, em menor parcela, pela
enzima mitocondrial succinato desidrogenase. Esta reação ocorre exclusivamente em
células vivas e a quantidade de formazana formada é proporcional ao número de células
viáveis (150).
Outro método colorimétrico utiliza o vermelho neutro (2,8-Phenazinediamine,
N8,N8,3-trimethyl-, hydrochloride), corante supra vital, fracamente básico, catiônico e
solúvel em água, que é absorvido pelas células por pinocitose ou transporte ativo através da
membrana plasmática e acumulam-se apenas nos lisossomas de células vivas (151).
A fototoxicidade é uma reação aguda, que pode ser induzida por um simples
tratamento com uma substância química e concomitante exposição à radiação ultravioleta
ou visível (152).
69
As dermatites fototóxicas são limitadas à área de exposição à luz, decorrentes de
mecanismos imunológicos e geralmente são acompanhadas de hiperpigmentação e
descamação (Figura 8). As dermatites fotoalérgicas são menos comuns e geralmente
necessitam de exposições repetidas, sendo caracterizadas por eritema e edema (153).
Figura 8. Dermatite fototóxica (Copyright 1996 - 2014 DermIS) (154).
Para a determinação do potencial fototóxico, normalmente emprega-se o teste de
captação do vermelho neutro, onde, células chamadas 3T3 são mantidas em cultura durante
24 horas para a formação de monocamadas. Duas placas por substância teste são pré-
incubadas com concentrações diferentes da substância e em seguida, uma das placas é
exposta à radiação UV e a outra é mantida no escuro, para ser usada como controle. Em
ambas as placas, o meio de tratamento é depois substituído por meio de cultura e após 24
horas de incubação, a viabilidade celular é determinada por meio da incorporação do
corante vermelho neutro (155).
Considerando-se que pode ocorrer a introdução acidental de cosméticos nos
olhos, o teste de irritação ocular é extremamente importante para esta categoria de
produtos. Atualmente, vários pesquisadores sugerem a utilização de métodos alternativos
para a determinação da irritação ocular, como por exemplo, o teste de membrana
70
córioalantóide do ovo de galinha (HET-CAM - Hen’s Egg Chorioallantoic Membrane
Test) (155).
O teste é baseado na observação, por um técnico treinado, dos sinais
característicos de irritação (hiperemia, hemorragia e coagulação) (Figura 9) que podem
ocorrer dentro de 5 minutos após a aplicação do produto-teste, puro ou diluído, em
membrana corioalantóide (CAM) de ovo de galinha embrionado, no 9° ou 10º dia de
incubação (156).
Figura 9. Membrana corioalantóide de ovo de galinha embrionado (157).
.
O ensaio de HET-CAM visa avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante
de um produto-teste após sua aplicação em membrana corioalantóide de ovo de galinha
embrionado (156).
Embora não seja um método oficialmente validado, o método HET-CAM é um
modelo alternativo comumente utilizado pelas indústrias cosméticas e é aceito pelas
autoridades regulatórias da Comunidade Européia (152).
71
OBJETIVOS
72
73
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a segurança e a eficácia do
extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico visando sua aplicação
cosmética.
2.2 Objetivos específicos
Avaliação da atividade antimicrobiana extrato de Caryocar brasiliense
obtido por CO2 supercrítico.
Avaliação do potencial antioxidante d o e xtrato de Caryocar brasiliense
obtido por CO2 supercrítico;
Avaliação da segurança do referido extrato, priorizando a utilização de
testes alternativos ao uso de animais;
Desenvolvimento das formulações de sabonete líquido e loção com os
extratos obtidos;
Avaliação da atividade antisséptica das formulações desenvolvidas;
Avaliação da estabilidade das formulações que se apresentaram eficazes
para os propósitos desejados;
Avaliação dos grupos químicos responsáveis pelas atividades
antimicrobiana e antioxidante.
74
75
MATERIAL E MÉTODOS
76
77
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção do material vegetal
As folhas de Caryocar brasiliense foram coletadas na cidade de Montes Claros,
Minas Gerais nos meses de janeiro e junho de 2011, tendo amostras retiradas para a
montagem de exsicatas que foram identificadas e depositadas no Herbário UEC da
Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP sob número UEC 150024.
As folhas foram desidratadas em estufa de ar circulante a 40ºC, trituradas em
moinho de facas e foram armazenadas em local fresco, ao abrigo da umidade.
As atividades foram conduzidas com aprovação IBAMA para acesso ao
patrimônio genético com finalidade de pesquisa científica, sob número 016/2009 (Processo
nº 02001.003785/2011-59).
3.2 Obtenção dos extratos supercríticos
Os extratos supercríticos foram fornecidos pela empresa Chemyunion Química
Ltda. Os parâmetros de extração dos extratos de Caryocar brasiliense foram determinados
em escala laboratorial, utilizando-se o sistema de extração supercrítica marca Autoclave
Engineers, composto de coluna de extração aquecida de 300 mL de volume interno; bomba
de CO2 M111L Maximator e bomba de co-solvente LC-6AD Liquid Chromatography,
Shimadzu; banho termostatizado MQBTC99-20 Microquímica Ind. Com. Ltda e medidor
de pressão 901A Heise Digital Pressure Indicator.
Na escala piloto, os extratos foram obtidos utilizando o sistema semi-
automatizado de extração supercrítica, composto de bombas de CO2 e co-solvente, duas
colunas de extração de 10L de volume interno e dois ciclones de coleta de 1 L de volume
interno.
78
Para a realização dos experimentos, a coluna de extração foi preenchida com
folhas de Caryocar brasiliense triturada comprimida. Após o término das extrações, as
tubulações, foram lavadas com etanol P.A. para recuperar o extrato acumulado nas mesmas.
O resíduo (extrato + etanol) foi submetido à evaporação a vácuo para retirada do etanol.
Foram utilizados 2,397 Kg de planta na extração. O extrato apolar de Caryocar brasiliense
foi obtido a 300 bar, 40°C e vazão de CO2 de 5 L/min (valores médios).
3.3 Avaliação do perfil fitoquímico
O perfil fitoquímico do extrato bruto foi avaliado qualitativamente por
cromatografia em camada delgada (CCD) para a pesquisa de compostos fenólicos e
terpenos, classes de metabólitos bioativos identificados como agentes antimicrobianos e
antioxidantes (52, 53, 158, 159, 160). Todo o procedimento foi executado de acordo com o método
padrão descrito por Harborne (161).
A fração de terpenos foi observada com o uso do reagente anisaldeído e
também 0,2% de permanganato de potássio (KMNO4). A fração fenólica foi detectada após
hidrólise ácida do extrato, sendo conduzida com a utilização de ácido clorídrico (HCl) 2 M
por 30 minutos. O produto resultante, separado da fração orgânica, foi analisado por CCD
tendo sílica gel como suporte cromatográfico, utilizando 45% de acetato etílico em hexano.
3.4 Determinação da atividade antimicrobiana
3.4.1 Microrganismos utilizados
Os microrganismos testes utilizados foram os preconizados pelo Microbiology
Guidelines (162). As cepas liofilizadas dos microrganismos foram doadas pela FIOCRUZ e
79
incluem as bactérias: Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Gram-positiva); Escherichia coli
ATCC 25922 e Pseudomonas aeuroginosa ATCC 9027 (gram-negativas).
3.4.2 Meios de cultura
Foram utilizados os meios de cultura ágar tiptona de soja (TSA) e caldo triptona
de soja (TSB), adquiridos do fabricante Difco®; ágar sabouraud dextrose (SAB), caldo
infusão de cérebro e coração (BHI), ágar e caldo Mueller Hinton (MH), ambos adquiridos
do fabricante Merck®.
3.4.3 Preparo dos meios de cultura
Os meios de cultura foram preparados de acordo com as instruções dos
fabricantes, sendo esterilizados a 121ºC por 15 minutos. Uma quantidade representativa
(5%) de placas e tubos dos lotes de meio de cultura, utilizados para pesquisa de bactérias,
foram incubados a 32,5ºC ± 2,5ºC por 24 horas para verificação de sua
esterilidade (163).
Após o período de incubação, os meios de cultura foram avaliados quanto à
ausência de microrganismos. Os lotes que apresentaram qualquer crescimento foram
descartados.
Finalizado o teste de esterilidade, os meios de cultura aprovados foram testados
para avaliação da capacidade e qualidade da promoção do crescimento do meio de cultura
ao microrganismo específico. Os meios de cultura foram inoculados com as bactérias
separadamente e incubados a 32,5ºC ± 2,5ºC por 24 horas.
80
Após o período de incubação, os meios foram verificados quanto ao
crescimento e recuperação dos microrganismos. Os lotes dos meios de cultura que não
promoveram o crescimento de microrganismos durante a realização do teste de fertilidade
foram descartados.
Após a finalização dos testes de esterilidade e promoção de crescimento, os
meios de cultura foram armazenados em geladeira a 4,0ºC ± 0,5ºC.
3.4.4 Obtenção e conservação dos microrganismos
As cepas liofilizadas foram hidratadas com aproximadamente 0,5 mL de
solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) e transferidas com auxílio de alça bacteriológica
para tubos de ensaio contendo meio de cultura agar tripticaseína soja esterilizado e
inclinado e incubadas a 32,5ºC ± 2,5ºC, por 24 horas.
Após os períodos de incubação, os tubos contendo os microrganismos foram
armazenados em geladeira, a 4,0ºC ± 0,5ºC. Para a realização do teste, o repique foi
efetuado a partir de um tubo armazenado de cada microrganismo.
3.4.5 Padronização dos inóculos
A partir de culturas estoques armazenadas em geladeira, as bactérias foram
repicadas em estrias na superfície de meio de cultura TSA inclinado e incubadas a 32,5ºC
± 2,5ºC por 24 horas.
A suspensão dos microrganismos foi preparada utilizando-se solução fisiológica
estéril (NaCl 0,9%), ajustando a concentração do inóculo para 1,0 x 108 UFC/mL, cuja
leitura foi realizada no equipamento Densimat®, um fotômetro usado para determinar a
81
densidade óptica de um inóculo bacteriano, fornecendo resultados equivalentes ao padrão
da escala de MacFarland.
3.4.6 Determinação da concentração inibitória mínima
Foi avaliado o extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico
(CBSE) e a solução de etanol a 20%. A concentração inibitória mínima (CIM) foi
determinada por meio do método clássico de diluição sucessiva adaptada em microplacas
de 96 poços. Estas adaptações permitem a realização de triplicata do ensaio.
Nas microplacas foram colocados, nos poços do perímetro exterior, 200µL de
água estéril deionizada para minimizar a evaporação do meio de cultura dos poços de teste
durante a incubação.
Em doze poços da microplaca foram distribuídos 100µL caldo de Mueller-
Hinton, previamente estéril. No primeiro poço da série, foram adicionados 100µL do
extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico diluído em 20% de etanol,
homogeneizando-se com o auxílio da micropipeta.
Procedeu-se à diluição seriada com a transferência de 100µL do poço 1 para o
poço 2, repetindo-se este procedimento sucessivamente até o poço 11. Foram adicionados
em todos os poços, exceto no de número 11, 10µL do inóculo (microrganismo em teste) em
concentração conhecida, estipulada em 106 UFC/mL. A placa foi tampada e incubada à
temperatura ótima de crescimento do microrganismo (32,5ºC ± 2,5ºC), por 24 horas.
Após este período, procedeu-se à leitura do resultado, inoculando o conteúdo de
cada poço em placas de Petri contendo ágar do meio de cultura específico para o
microrganismo em teste.
82
Os poços 11 e 12 foram os controles negativo (Meio de cultura +
antimicrobiano) e positivo (Meio de cultura + inóculo), respectivamente (164, 165, 166).
Para a verificação da interferência do solvente no ensaio, o mesmo
procedimento foi repetido para a solução de etanol a 20%.
A fim de validar os experimentos, foram utilizadas soluções aquosas do
antibiótico ciprofloxacino (fabricante Sigma®) na concentração de 1,0 mg/mL e a cada
experimento as soluções também foram desafiadas frente aos microrganismos testados.
3.5 Preparo das formulações
A loção hidratante e o sabonete líquido utilizados no teste de avaliação da
atividade antisséptica foram preparados conforme descrito nos itens seguintes. O extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico foi adicionado a ambas as formulações na
concentração de 2,5 %. As formulações também foram preparadas sem a adição do extrato
para comparação com a atividade demonstrada pelas preparações testadas.
3.5.1 Loção hidratante
A loção hidratante foi preparada em escala laboratorial utilizando-se as
matérias-primas listadas na Tabela 1 por meio da nomenclatura internacional de
ingredientes cosméticos (INCI).
As matérias-primas da fase A foram adicionadas em um béquer e submetidas a
aquecimento à aproximadamente 75 - 80°C. Em outro béquer, as matérias-primas da fase B
foram aquecidas à mesma temperatura. Em seguida, a fase B foi adicionada sobre a fase A
em agitação vigorosa, mantendo-se a temperatura e agitação por aproximadamente 10
83
minutos. Após este período, a loção hidratante foi resfriada sob agitação moderada e a fase
C foi adicionada à mistura, sendo mantida em agitação até completa homogeneização.
Tabela 1. Composição da loção hidratante
Fases Nomenclatura INCI Concentração (% p/p)
A
Cetearyl Alcohol 5,000
Mineral Oil 4,000
Caryocar Brasiliense Fruit/Leaf Extract 2,500
Astrocarym Murumuru Seed Butter 2,000
Lanolin Alcohol 1,000
B Water (Aqua) q.s. 100%.
Glycerin 2,000
C
Phenoxyethanol 0,380
Methylparaben 0,003
Butylparaben 0,002
Ethylparaben 0,002
Propylparaben 0,018
3.5.2 Sabonete líquido
O sabonete líquido também foi preparado em escala laboratorial utilizando-se
as matérias-primas listadas na Tabela 2 também por meio da nomenclatura internacional de
ingredientes cosméticos (INCI).
As matérias-primas da fase A e da fase B foram misturadas separadamente e
em seguida, a fase A foi adicionada lentamente sobre a fase B sob agitação moderada. Após
completa homogeneização, o pH da formulação foi ajustado a 5,5 – 6,5 utilizando o ácido
cítrico (fase C).
84
Tabela 2. Composição do sabonete líquido
Fases Nomenclatura INCI Concentração (% p/p)
A
Water (Aqua) q.s. 100%.
Sodium Laureth-2 Sulfate 25,000
Cocamidopropyl Betaine 2,000
Disodium EDTA 0,20
B
Cocamide DEA 5,000
Caryocar Brasiliense Fruit/Leaf Extract 2,500
PEG-120 Methyl Glucose Dioleate 2,000
Phenoxyethanol 0,300
Methylparaben 0,010
Butylparaben 0,002
Ethylparaben 0,002
Propylparaben 0,018
C Citric Acid q.s. pH 6,5
3.6 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações
A qualidade microbiológica das formulações preparadas foi avaliada de acordo
com os métodos recomendados por Pinto et al. (95). Para a avaliação microbiológica da
loção hidratante determinou-se a contagem total de microrganismos aeróbios, transferindo-
se assepticamente, exatamente 10,0 g de cada formulação para 90,0 mL de solução tampão
fosfato pH 7,2. Uma amostra da diluição 1:10 foi submetida à agitação durante 10 minutos.
Após a homogeneização, foi pipetado 1,0 mL da amostra para placas de Petri, às quais
adicionou-se meio TSA para avaliação do crescimento de bactérias e o meio SAB para
avaliação do crescimento de fungos, através da técnica pour plate.
As placas para avaliação das bactérias totais foram incubadas a 32,5ºC ± 2,5ºC
durante 48 horas e as placas para avaliação dos fungos foram incubadas a 22,5ºC ± 2,5ºC,
durante o período de 5 dias. Após este período, foi realizada a contagem do número de
85
microrganismos com o auxílio de contador de colônias, calculando o número de unidades
formadoras de colônia (UFC/mL).
3.7 Avaliação da atividade antisséptica
A atividade antisséptica foi avaliada por meio da técnica de inibição em placa,
realizando-se o ensaio frente aos microrganismos mencionados no item 3.4.1.
O inóculo de cada microrganismo (0,2 mL), previamente padronizado conforme
item 3.4.5 foi adicionado ao meio de cultura. A região central da placa contendo o meio de
cultura solidificado foi retirada com o auxílio de cilindros metálicos e preenchida com
100µL da formulação contendo CBSE. As placas foram incubadas a 32,5ºC ± 2,5ºC por 48
horas (86, 167).
O mesmo procedimento foi repetido para as formulações sem CBSE e
também utilizando solução salina 0,9%. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e a
média dos diâmetros das zonas de inibição foi avaliada.
3.8 Avaliação da atividade antioxidante
3.8.1 Cultura de fibroblastos humanos
Fibroblastos humanos (Human adult dermal fibroblasts CC-2511, Clonetics,
Cambrex/Lonza, USA) foram semeados em garrafas de 75 cm2 (Corning Inc, USA),
cultivados e expandidos em estufa úmida a 37ºC em presença de 5% de CO2, utilizando
meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 0.001% de
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e uma associação de antibióticos contendo 0,10%
de gentamicina e 0,80% de anfotericina B (Amphotericin, Sigma–Aldrich).
86
Ao atingirem 80 a 90% de confluência, as células foram tripsinizadas (Trypsin-
EDTA, Gibco/Invitrogen, Cat. 25200-072), neutralizadas com o próprio meio de cultura,
centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e semeadas em placas de 24 poços (Nunc, USA)
na densidade de 1x105 células/poço para posterior incubação com o produto-teste e
avaliação do mediador proposto.
3.8.2 Incubação com o produto-teste
CBSE foi dissolvido no meio de cultura utilizado na cultura celular e aplicado
nas culturas nas concentrações de 0,2; 0,1; 0,05 e 0,025 % (p/v). A seleção destas
concentrações foi baseada em ensaios prévios de viabilidade/citotoxicidade celular por
meio do método XTT (item 3.10.2). As culturas celulares permaneceram em contato com
10 µL destas concentrações do CBSE por 48 horas, para então coleta do lisado celular.
3.8.3 Determinação da atividade antioxidante
A concentração de antioxidantes totais foi medida em lisado celular, utilizando
um kit de teste disponível comercialmente (Sigma-Aldrich Inc., Saint Louis, MI).
O princípio do ensaio antioxidante é a formação de um radical de mioglobina
ferril a partir de metamioglobina e peróxido de hidrogênio, que oxida o ABTS (2,2'-azino-
bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) para produzir um radical cátion, ABTS+, um
cromógeno solúvel, que apresenta coloração verde e pode ser determinado em
espectrofotômetro a 405 nm.
A concentração de antioxidantes é calculada com base no padrão Trolox
(Vitamina E - 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid – Sigma-Aldrich
Inc., Saint Louis, MI) e representada em unidades de densidade óptica (DO).
87
O Kit de teste é composto por solução tampão fosfato salina (PBS), solução de
mioglobina, solução do substrato ABTS e solução de dodecil sulfato de sódio (SDS). A
solução de trabalho do substrato ABTS foi preparada por meio da adição de 25 µL de
solução de peróxido de hidrogênio a 3% em 10 mL solução do substrato ABTS.
Após incubação e tratamento das culturas celulares por 48 horas, as células
foram tripsinizadas e coletadas em microtubos, os quais foram centrifugados a 1.500 rpm
por 15 minutos; o sobrenadante foi cuidadosamente removido, por inversão do tubo,
observando sempre a permanência dos pellets. Foram adicionados 500 µL de PBS aos
microtubos contendo os pellets, que foram centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos a
4°C.
Após a centrifugação, o lisado celular (sobrenadante) foi recolhido,
conduzindo-se o ensaio em microplacas de 96 poços. Foram adicionados 20 µL da solução
de mioglobina aos poços contendo o lisado celular e posteriormente 150 µL da solução de
trabalho do substrato ABTS. A microplaca foi incubada por 5 minutos em temperatura
ambiente. Após o período de incubação, para interromper a reação, foram adicionados
100 µL de solução 5% de SDS (Figura 10).
88
Figura 10. Etapas de execução do método ABTS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
20µL – Solução de
mioglobina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
10µL - Amostra
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
150µL – Solução
ABTS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
100µL – Solução
SDS
89
A absorbância de cada poço foi determinada a 405 nm em um leitor de
microplacas (Multiscan MS, Labsystems, Helsinki, Finland). Como controle positivo do
teste foram utilizados 10 µL do padrão Trolox seguindo-se o mesmo procedimento adotado
para a amostra teste.
As condições experimentais adotadas condizem com as metodologias atuais
aplicadas, aceitas e validadas pela comunidade científica internacional. O método
empregado é aprovado pelo Comitê de Coordenação Interinstitucional sobre Validação de
Métodos Alternativos (ICCVAM), além de ser aceito por agências regulatórias, tais como
Food and Drugs Admnistration (FDA) e o National Institute of Environmental Health
Sciences (NIEHS).
3.9 Avaliação da irritação ocular - HET-CAM (Teste na membrana corioalantóide do
ovo de galinha)
A técnica utilizada foi uma adaptação daquela descrit por Luepeke e
Kemper (156) em conjunto com a metodologia descrita pelo ECVAM (European Centre for
the Validation of Alternative Methods, Invitox). Conforme anexo I deste relatório, este
estudo obteve parecer favorável do comitê de ética em animais, estando de acordo os
princípios éticos na experimentação animal, adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência
em Animais de Laboratório (SBCAL) e com a legislação vigente.
Ovos brancos de galinhas Leghorn, classificados entre 40 a 75 g foram
fornecidos pela Granja Dr. Nakano (ovos para pesquisa científica e produtos biológicos),
Sorocaba, São Paulo, Brasil.
No recebimento, os ovos passaram pelo procedimento de conferência:
integridade e controle de peso, para posterior incubação. Os ovos foram posicionados em
90
incubadora com rolagem automática com controle de temperatura (37,8ºC ± 1°C). Os ovos
foram incubados por um período de 9 a 10 dias.
3.9.1 Preparação do produto-teste
O extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico foi avaliado tal e
qual, na concentração de 100%, sendo mantido em banho-maria para atingir 37°C antes do
inicio do procedimento. Após finalização do estudo e obtenção dos resultados, o ensaio foi
repetido utilizando-se a concentração de 10%.
3.9.2 Preparação dos ovos
Todo o experimento foi conduzido embaixo de uma luminária, sem causar
lesões da membrana corioalantóide. No 10° dia de incubação, os ovos foram retirados da
incubadora e verificados, quanto à sua integridade.
Os ovos defeituosos (imagem que não corresponde à fase de desenvolvimento
esperados) foram eliminados e os ovos selecionados foram enviados ao teste, com "bolsa de
ar" (célula aérea) para cima.
3.9.3 Determinação do potencial irritante
A casca de cada ovo selecionado foi perfurada (com uma agulha lanceolada),
aberta e cortada (com tesoura ou alicate) da bolsa de ar até os limites da membrana.
Em seguida, toda a superfície da membrana foi umedecida com uma solução de
cloreto de sódio a 0,9% e aquecida a 37°C (banho-maria). Então, o ovo foi inclinado para
eliminar o excesso de solução de cloreto de sódio a 0,9% e a membrana da casca foi
91
removida delicadamente com uma pinça a fim de descobrir a membrana corioalantóide
(CAM). Os ovos que tiveram a membrana corioalantóide danificada foram imediatamente
rejeitados.
Foram utilizados 4 ovos para cada teste realizado, adicionando-se 0,3 g do
extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico diretamente na CAM.
Imediatamente após aplicação, o cronômetro foi acionado para a observação dos fenômenos
desencadeados.
Após 20 segundos de contato, a CAM foi lavada com 10 mL de solução de
cloreto de sódio a 0,9% (mantida a 37°C em banho-maria), com o auxílio de uma seringa,
evitando qualquer projeção brutal. Esta solução foi removida com a inclinação dos ovos.
Os fenômenos desencadeados, indicativos de irritação, foram observados
durante 5 minutos, de acordo com o processo descrito no tópico seguinte. O tempo exato de
cada fenômeno observado foi registrado. Os 20 segundos de contato foram inclusos nos 5
minutos de observação. No final do estudo, os embriões foram descartados por resfriamento
rápido (-20°C).
Os seguintes fenômenos observados (Hiperemia, hemorragia e coagulação)
foram avaliados visualmente de acordo a presença e não de acordo com sua intensidade,
seguindo a Tabela 3:
Hiperemia: aumento do fluxo sanguíneo;
Hemorragia: extravasamento de sangue dos vasos sanguíneos;
Coagulação: presença de coágulo sanguíneo.
92
Tabela 3. Pontuação dos fenômenos ocorridos em função do tempo (Luepke) (168).
Fenômenos Pontuação em função do tempo
Hiperemia
T ≤ 30 Seg
30 Seg < T ≤ 2 Min
2 Min < T ≤ 5 Min
5
3
1
Hemorragia
T ≤ 30 Seg
30 Seg < T ≤ 2 Min
2 Min < T ≤ 5 Min
7
5
3
Coagulação
T ≤ 30 Seg
30 Seg < T ≤ 2 Min
2 Min < T ≤ 5 Min
9
7
5
Cada fenômeno visualizado só foi contado uma vez, quando ocorreu. A
pontuação para cada ovo foi obtida a partir da soma das notas de hiperemia, hemorragia e
coagulação. A classificação do extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico
foi baseada na pontuação média obtida na avaliação dos 4 ovos, conforme Tabela 4.
Tabela 4. Classificação do potencial irritante de acordo com a pontuação atingida (P).
Pontuação média (4 ovos) Classificação
P < 1 Praticamente não irritante
1 P < 5 Fracamente irritante
5 P < 9 Moderadamente irritante
P 9 Irritante
O ensaio foi conduzido em triplicata, tendo como controle negativo a solução
de cloreto de sódio a 0,9% e como controle positivo a solução padrão de sodium dodecyl
sulphate; N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfate (Sigma D4516) em água.
O controle positivo estava validado, quando:
A concentração 0,05% pontuava de 0,5 a 5,0.
93
A concentração 0,4% pontuava de 10,5 a 12,5.
A concentração 3,2% pontuava de 17,0 a 21,0.
3.10 Avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade
3.10.1 Cultivo celular
Fibroblastos murinos (3T3) (ATCC® CCL-92™; American Type Culture
Collection, Manassas, VA, USA), não ultrapassando 3ª a 5ª passagem, foram semeados e
cultivados, em estufa úmida a 37°C em presença de 5% de CO2, utilizando meio de cultura
específico Dulbecco´s modified Eagle medium (DMEM; Sigma–Aldrich, Saint Louis, MO,
USA), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 0,001% de Fator de Crescimento
Epidérmico (EGF) e uma associação de antibióticos contendo 0,10% de gentamicina e
0,80% de anfotericina (B Amphotericin, Sigma–Aldrich).
O monitoramento do crescimento celular foi realizado a cada 24 horas, de
forma que, ao atingirem aproximadamente 80-90% de confluência, as células foram
tripsinizadas (tripsina 0,25%) durante 1 minuto e semeadas na densidade de 1x104 células
por poço em placas de 96 poços para posterior incubação com o CBSE e avaliação do
potencial citotóxico.
As condições experimentais adotadas nas avaliações de citotoxicidade e
fototoxicidade, envolvendo a utilização de células em condições ótimas de cultivo, também
condizem com as metodologias atuais aplicadas, aceitas e validadas pela comunidade
científica internacional (ECVAM 3T3-NRU Phototoxicity Assay Invittox n. 78) (169).
94
3.10.2 Determinação da citotoxicidade pelo método do XTT
A viabilidade celular foi determinada por um método colorimétrico que utiliza
o corante XTT (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.). Esse ensaio é baseado na conversão do
hidróxido de tetrazolium amarelo (XTT – Sodium 3´-[1-(phenylaminocarbonyl) – 3,4–
tetrazolium]–bis (4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate) para formazan laranja
pela enzima succinato desidrogenase mitocondrial nas células viáveis metabolicamente
ativas. Em contraste com o formazan azul insolúvel formado pelo MTT, o XTT é
convertido para formazan solúvel em água.
Figura 11. Esquema das etapas do método XTT (170).
95
O meio de cultura foi removido das placas de 96 poços (Nunc, Roskilde,
MD, USA) contendo as células previamente cultivadas em estufa úmida a 37°C em
presença de 5% de CO2. CBSE (0,0001% – 50,00% p/v) foi dissolvido em meio de
cultura, adicionado à placa de 96 poços e mantido em contato por um período de 48
horas. Após este período, o conteúdo dos poços foi cuidadosamente aspirado, lavando-os
3 vezes com solução salina balanceada de Earle (EBSS - Earle´s balanced salt solution).
O XTT (In Cytotox XTT KXT 96.300, Xenometrix AG) foi então adicionado à cultura, a
qual foi incubada a 37ºC por um período de mais 4 horas (Figura 11).
O ensaio foi realizado em triplicata, tendo como controle negativo os poços
contendo apenas meio de cultura e como controle positivo os poços contendo meio de
cultura e células em proliferação, como mostra a Figura 12.
Figura 12. Esquema da distribuição dos controles do teste em microplaca de 96 poços.
A absorbância de cada poço foi determinada a 450 nm em um leitor de
microplacas (Multiscan MS, Labsystems, Helsinki, Finland). A morte celular foi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Co
ntro
le
Co
ntro
le
E1
E1
E1
E2
E2
E2
E3
E3
E3
E4
E4
E4
E5
E5
E5
E6
E6
E6
E7
E7
E7
E8
E8
E8
E9
E9
E9
E10
E10
E10
E11
E11
E11
E12
E12
E12
E13
E13
E13
E14
E14
E14
E15
E15
E15
E16
E16
E16
E17
E17
E17
E18
E18
E18
-
-
-
-
Água estéril
Controle negativo
Controle positivo
96
expressa em porcentagem, conforme a Equação 1 a seguir e a IC50 do extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico foi estimada através de análise de
interpolação linear.
Equação 1: Cálculo da % de morte celular - Citotoxicidade
A classificação da citotoxicidade do extrato de Caryocar brasiliense obtido por
CO2 supercrítico foi estabelecida de acordo com os resultados para a IC50, seguindo os
seguintes parâmetros:
Tabela 5: Classificação da citotoxicidade em função da IC50.
IC50 (Concentração do produto que inibe 50% da viabilidade celular)
Classificação
>50% Citotoxicidade negligível
50% Citotoxicidade pouco importante
>25% e <50% Citotoxicidade moderada
≤25% Citotoxicidade importante
3.10.3 Avaliação da fototoxicidade pelo método do vermelho neutro (3T3
NRU)
A Cultura celular foi preparada conforme descrito no item 3.10.1, utilizando-se 2
placas de 96 poços. O extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico foi
dissolvido em EBSS, adicionado às placas nas concentrações de 0,0001% a 50,00% (p/v) e
mantido em contato por um período de 60 minutos (a 37C, 5% CO2).
100
controle do aAbsorbânciamostra da aAbsorbânci100 mortas células %
97
Antes do experimento, foi verificada a confluência e aparências das células em
microscópio invertido, removendo cuidadosamente todo meio de cultura (200 L) de cada
poço das duas placas de 96 poços contendo as células em proliferação. Os poços foram
lavados duas vezes com EBSS e em seguida adicionou-se 200 µL de EBSS nos poços B2,
C2, D2, E11, F11 e G11 para obter o controle positivo (+) do teste. Foram adicionados 200
L de cada concentração do PT, em 3 poços (triplicata), iniciando no poço E2, sempre no
sentido vertical.
Uma das placas foi exposta à radiação UVA (5 J/cm2) (SOL-500, Honle)
enquanto a outra placa foi mantida no escuro. Após a irradiação, o EBSS foi removido das
duas placas e as mesmas foram lavadas duas vezes com EBSS, adicionando-se 200 L de
meio de cultura nas placas para incubação a 37C, 5% CO2 por mais 24 horas (overnight) e
após este período a viabilidade celular foi mensurada pelo método Vermelho Neutro
utilizando o NR (Neutral Red) Kit (In Cytotox KRCV 96.300, Xenometrix AG).
Foram observados a morfologia e o crescimento das células em microscópio
invertido, removendo cuidadosamente o meio de cultura dos poços contendo células. As
placas foram lavadas 2 vezes com 300 L/poço da solução de lavagem NR I.
Após o preparo da solução de Vermelho Neutro NR II na diluição de 1:100 em
meio de cultura, foram adicionados 200 L desta solução em cada poço e as placas foram
novamente incubadas por 2-4 horas a 37C e 5% CO2. Finalizado o tempo de incubação, a
solução NR II foi cuidadosamente removida por aspiração, para não remover a camada de
células.
Na etapa final, foram adicionados 200 L da solução de fixação NR III em cada
poço, que permaneceu em contato com as células por 1 minuto. Esta solução foi removida
98
por aspiração, para a adição de 200 L da solução de solubilização NR IV em cada poço. As
placas foram incubadas por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Finalizado o tempo
de incubação, as mesmas foram agitadas para a completa homogeneização da solução. As
bolhas foram removidas e a leitura da absorbância foi realizada em espectofotômetro a
540 nm.
Os parâmetros de avaliação de fototoxicidade levaram em consideração a
porcentagem de morte celular, a IC50 (concentração que inibe 50% da viabilidade) e o PIF
(fator de foto-irritação).
A porcentagem de morte celular foi calculada para cada concentração,
conforme Equação 2:
Equação 2: Cálculo da % de morte celular – Fototoxicidade.
A média dos valores de densidade óptica (OD) foi calculada para cada grupo.
Os valores de OD obtidos no controle positivo correspondem à viabilidade celular de
100%. O Fator de Fotoirritação (PIF) foi determinado de acordo com a Equação 3:
PIF = IC50 do produto teste em condição escuro
IC50 do produto teste submetido a 5 J UVA
Equação 3: Cálculo do Fator de Fotoirritação.
99
O potencial fototóxico do produto teste foi classificado de acordo com a tabela
a seguir:
Tabela 6. Classificação da Fototoxicidade em função do PIF.
PIF Classificação
<5
>5
Não fototóxico
Fototóxico
Fonte: 3T3 NRU Phototoxicity Assay Invittox n 78, ECVAM (169).
3.11 Avaliação da estabilidade das formulações
Vinte e quatro horas após o preparo das formulações desenvolvidas (tempo zero
– T0), as mesmas foram avaliadas quanto às características organolépticas (aspecto, cor e
odor) e valores de pH.
Os resultados obtidos em T0 foram considerados como referência para
comparação com as demais avaliações durante o teste de estabilidade.
As formulações foram acondicionadas em frasco de vidro transparente, com
capacidade nominal de 20 g e sua estabilidade foi avaliada com a finalidade de determinar
o seu comportamento nas seguintes condições: escuro/temperatura ambiente,
luz/temperatura ambiente, estufa a 40ºC e geladeira a 5ºC.
Os parâmetros avaliados foram monitorados em 30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias.
A aparência e a cor da loção foram verificadas visualmente, o odor foi verificado por meio
do método organoléptico e o pH foi determinado utilizando-se pHmetro (Hanna
Instruments 8417), após a diluição das amostras na proporção de 1:10 (p/v) em água
destilada, previamente neutralizada (pH 7,0).
100
3.12 Análises estatísticas
Quando aplicável, os dados foram avaliados por um método paramétrico de
análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Dunnett para comparar dados entre
todos os grupos. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
101
RESULTADOS
102
103
4. RESULTADOS
4.1 Obtenção dos extratos supercríticos
Para que a seletividade de extração fosse diminuída e a maior quantidade
possível de compostos pudesse constituir o extrato supercrítico obtido, optou-se por
utilizar-se uma alta pressão de extração (300 bar).
A vazão de CO2 foi fixada em 5 LPM. A partir do estabelecimento das
condições para extração foi preparada uma curva de extração para determinação do tempo
de extração (Figura 13).
(A)
(B)
Figura 13: (A) Curva global de extração de Caryocar brasiliense e (B) Curva de extração referente à massa de extrato obtida versus tempo de extração; à 300 bar e 40°C.
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempos (minutos)
Massa d
a f
ração (
g)
0,1500
0,1900
0,2300
0,2700
0,3100
0,3500
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (minutos)
Massa g
lobal extr
ato
(g)
104
Quanto à temperatura, optou-se por utilizar uma temperatura intermediária de
extração (40°C) para que não houvesse decomposição de componentes termossensíveis.
Observando a curva de extração apolar é possível visualizar duas regiões com
inclinação de retas distintas. Até 40 minutos de extração a inclinação da reta é mais
acentuada, sendo a taxa de extração no primeiro ponto muito maior que a do segundo
ponto.
Tal comportamento está, em geral, relacionado com a preparação (moagem) da
amostra. Após 40 minutos de extração ocorre uma alteração na inclinação da reta,
caracterizando uma região na qual a taxa de extração é decrescente.
A partir de 80 minutos, a massa global extraída varia muito pouco com o tempo
de extração, visto que a massa extraída versus tempo é praticamente constante, o que pode
ser observado através da variação do rendimento da extração (Tabela 7).
Tabela 7. Rendimento de extração de Caryocar brasiliense.
Tempo (min)
Rendimento fração* (%p/p)
Rendimento Global* (%p/p)
0 0,00 0,00
20 0,26 0,26
40 0,11 0,37
60 0,04 0,41
80 0,03 0,43
100 0,02 0,46
120 0,01 0,47
* Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 processos independentes.
A análise dos dados da Tabela 7 mostra que o rendimento em 60-80 minutos é
cerca de 90% do rendimento obtido em 2 horas de extração (fase em que a transferência de
massa é difusiva), indicando que, se a extração fosse prolongada por mais tempo, o
105
rendimento final obtido não seria muito diferente do obtido em 120 minutos, devido às
baixas taxas de extração verificadas após 60-80 minutos. Dessa forma optou-se por adotar
um tempo de extração de 2 horas para a fase apolar.
Os extratos obtidos foram avaliados quanto às características organolépticas,
verificando-se um aspecto de sólido pastoso, cor amarelo esverdeada e odor característico
herbal.
4.2 Screening do extrato bruto
A fração de terpenos foi observada por meio da detecção com o reagente
anisaldeído sob aquecimento a 120ºC, revelando diferentes pontos de tons rosa-violeta. O
mesmo foi observado com o padrão de ácido sulfúrico (H2SO4), com o reagente cloreto de
antimônio, e permanganato de potássio a 0,2%.
A fração de fenol foi detectada após a hidrólise ácida do extrato. A hidrólise
ácida foi realizada com ácido clorídrico (HCl) 2 M, seguida da separação do produto
resultante da fração orgânica que foi analisada por cromatografia de camada delgada (CCD)
tendo sílica gel como suporte cromatográfico. A fase móvel utilizada foi a mistura de 45%
de acetato de etila em hexano. Foram observadas manchas azuis na detecção com o
reagente de Folin.
4.3 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
Após a avaliação dos meios de cultura, quanto à esterilidade e promoção do
crescimento microbiano, verificou-se que os mesmos demonstraram a capacidade de
promover o desenvolvimento das bactérias testadas e nenhum deles apresentou
contaminação microbiológica.
106
Desta forma, procedeu-se à determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) do extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico, por meio da técnica
de microdiluição, conduzindo aos valores demonstrados na Tabela 8.
Tabela 8. Valores da concentração inibitória mínima (CIM) do CBSE e da solução de etanol.
Microrganismos Amostras
CBSE (%p/v)
CBSE (mg/mL)
ES (%p/v)
ES (mg/mL)
Escherichia coli (ATCC 25922) 1,25 11,25 2,50 25,00
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 2,50 22,50 5,00 50,00
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) 1,25 11,25 10,00 100,00
ES: Solução de etanol (20%).
A concentração inibitória mínima é definida como a menor concentração de
uma formulação que inibe o crescimento microbiano visível in vitro. Os valores
apresentados indicam a concentração do extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2
supercrítico que inibiu totalmente o crescimento do microrganismo, no teste de diluições,
confirmado pelo plaqueamento destas concentrações. Estes resultados mostram que os
valores para a inibição do crescimento de E. coli e S. aureus são coincidentes e inferiores
aos valores encontrados para P. aeruginosa.
Os resultados apresentados na Tabela 8 para a concentração inibitória mínima
do etanol a 20% indicam que não há interferência do solvente na realização do ensaio, visto
que para todos os microrganismos testados, os valores da CIM do extrato de Caryocar
brasiliense obtido por CO2 supercrítico, são inferiores aos valores da CIM do etanol na
concentração testada.
Na avaliação da atividade antimicrobiana, a técnica de diluição em meio
líquido, é mais frequentemente utilizada quando comparada com o método de difusão em
ágar. Esta técnica tem sido mais utilizada para determinação da concentração inibitória
107
mínima de antibióticos, antissépticos e conservantes (86).
Tabela 9. Avaliação da sensibilidade antimicrobiana.
Microrganismo Fármaco Sensilibidade
Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
Escherichia coli (ATCC 25922)
Ciprofloxacino (1mg/mL)
Ciprofloxacino (1mg/mL)
Ciprofloxacino (1mg/mL)
Sensível
Sensível
Sensível
Para garantir a eficácia do método empregado, assim como dos meios de
cultura e das cepas de microrganismos utilizados, foi realizado o controle do ensaio com a
utilização do antibiótico Ciprofloxacino nas mesmas condições do experimento, a fim de
validar os resultados encontrados. Conforme Tabela 9, os resultados obtidos testados estão
em conformidade com a indicação de uso do antibiótico utilizado.
4.4 Avaliação da qualidade microbiológica das formulações
Para assegurar a qualidade das preparações para uso tópico é necessário realizar
ensaios de controle durante a fabricação e no produto acabado. Características
organolépticas, determinação de pH e controle microbiológico, entre outros, fazem parte
destes testes (171).
Todas as formulações avaliadas apresentaram contagem total de
microrganismos viáveis inferior a 10 UFC/g, o que significa a aprovação do produto para
uso, baseado no limite oficial de máximo 5x102 UFC/g ou mL para produtos infantis e
produtos para área dos olhos e máximo 103 UFC/g ou mL para os demais produtos
cosméticos susceptíveis à contaminação (162, 172).
108
Esta etapa do estudo torna-se importante para as análises posteriores,
envolvendo o teste de atividade antisséptica. Resultados positivos de contaminação nesta
fase podem inviabilizar a execução das demais etapas.
4.5 Avaliação da atividade antisséptica
Considerando que a atividade antisséptica de determinada substância deve-se à
sua capacidade de impedir o crescimento ou mesmo, destruir os microrganismos-teste, a
avaliação da atividade antimicrobiana de potenciais agentes antissépticos torna-se possível.
Nestes casos, o principal objetivo é avaliar as concentrações em que determinada
substância apresenta ação sobre microrganismos.
Um produto é classificado como antisséptico quando produz uma zona de
inibição superior a 8 mm (86, 173, 174). De acordo com os resultados apresentados na Tabela
10, para inibição do crescimento microbiano, ambas as formulações contendo o extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico são eficazes frente às bactérias testadas.
Tabela 10. Atividade antisséptica do CBSE
Microrganismos Zona de inibição (mm)
LSCE HLCE LSWE HLWE C (-)
Escherichia coli (ATCC 25922) 13,0 12,6 2,9 1,9 -
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 9,0 8,2 2,1 2,0 -
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) 11,0 11,0 2,3 1,9 -
LSCE: Sabonete líquido contendo extrato.
HLCE: Loção hidratante contendo extrato.
LSWE: Sabonete líquido sem extrato.
HLWE: Loção hidratante sem extrato.
C (-): Controle negativo
As propriedades antimicrobianas de extratos geram interesse na determinação
da estrutura fitoquímica e sua atividade com agente antimicrobiano de amplo espectro. Em
109
relação ao Caryocar brasiliense, a atividade antibacteriana demonstrada pode ser atribuída
às suas propriedades fitoquímicas, uma vez que os controles não apresentaram inibição do
crescimento microbiano, quando comparados às amostras testadas (P<0,05).
4.6 Atividade antioxidante
Como pode ser visto na Figura 14, o extrato supercrítico de Caryocar
brasiliense, quando aplicado a culturas de células na concentração de 0,025% (p/v)
promove um aumento significativo de aproximadamente 3% na concentração de
antioxidantes em lisados celulares, quando comparado ao grupo controle (P<0,05).
*
120,000
125,000
130,000
135,000
140,000
145,000
150,000
155,000
160,000
Controle CBSE 0,2% CBSE 0,1% CBSE 0,05% CBSE 0,025%
Co
nc
en
tra
çã
o d
e A
nti
ox
ida
ntt
es
(m
M)
Amostras
Figura 14. Concentração de antioxidantes (mM – relativo ao padrão Trolox) em lisado celular
tratado com extrato de Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico (CBSE) a 0,2; 0,1; 0,05 e
0.025% m/v. Os dados representam a média ± desvio padrão de três experimentos independentes.
*P<0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA, Dunnet).
110
Constituintes químicos como os compostos fenólicos e terpenos presentes no
pequi (Caryocar brasiliense) contribuem com esta atividade (175, 176, 177, 178), demonstrando a
capacidade antioxidante do extrato e sugerindo seu uso em produtos cosméticos com ação
antienvelhecimento.
4.7 Avaliação da irritação ocular
Seguindo a recomendação de alguns autores que avaliaram a aplicabilidade do
teste HET-CAM como método substitutivo do teste de irritação ocular de Draize, o CBSE
foi avaliado inicialmente puro (100%) (179, 180, 181).
Tabela 11. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 100%.
FENÔMENO AVALIAÇÃO OVOS
1 2 3 4
HIPEREMIA
Tempo (Seg. e Min.)
0`43`` 0`56`` 0`48`` 0`53``
Pontuação 1 3 3 3 3
HEMORRAGIA
Tempo (Seg. e Min.)
1`00`` 1`50`` 1`08`` 1`38``
Pontuação 2 5 5 5 5
COAGULAÇÃO
Tempo (Seg. e Min.)
- - - -
Pontuação 3 - - - -
Contagem = Pontuação 1 + 2 + 3 8 8 8 8
A Tabela 11 indica a pontuação média obtida entre 4 ovos, para o ensaio
realizado utilizado o CBSE indicando que nesta concentração, o referido extrato é
moderadamente irritante. Esses valores foram obtidos comparando os fenômenos
111
observados com a graduação contida na Tabela 4 do item 3.9.3, na qual estão descritos os
níveis de avaliação para cada um dos fenômenos observados.
O ensaio foi repetido 3 vezes e em todos os ensaios o resultado foi confirmado.
Tal resultado não implica na exclusão da aplicabilidade cosmética do extrato, pois,
normalmente os extratos vegetais são utilizados sempre em concentrações inferiores. Por
este motivo, o ensaio foi repetido utilizando-se a concentração de 10%, uma concentração 4
vezes maior que a concentração utilizada no preparo da das formulações, conduzindo à
pontuação P=1 demonstrada na Tabela 12, que conforme os critérios de classificação
apresentados na Tabela 4, permite classificar o CBSE como fracamente irritante.
Tabela 12. Graduação dos fenômenos observados em relação ao tempo – CBSE 10%.
FENÔMENO AVALIAÇÃO OVOS
1 2 3 4
HIPEREMIA
Tempo (Seg. e Min.)
3`28`` 4`05`` 4`19`` 3`54``
Pontuação 1 1 1 1 1
HEMORRAGIA
Tempo (Seg. e Min.)
- - - -
Pontuação 2 - - - -
COAGULAÇÃO
Tempo (Seg. e Min.)
- - - -
Pontuação 3 - - - -
Contagem = Pontuação 1 + 2 + 3 1 1 1 1
Como esperado, os controles positivos pontuaram de 0,5 a 5,0 na concentração
de 0,05%, de 10,5 a 12,5 na concentração 0,4% e de 17,0 a 21,0 na concentração de 3,2%.
O HET-CAM está atualmente no processo de validação da ECVAM (European
Centre for the Validation of Alternative Methods) e já é aceito pelo REACH (Registration,
112
Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemical Substances, EU) e pelo ICCVAM
(The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, EUA)
como um método para identificar irritantes severos e compostos corrosivos, bem como
realizar screening de formulações com o objetivo de reduzir o número de animais utilizados
no teste ocular de Draize (182).
4.8 Avaliação da citotoxicidade
O potencial citotóxico de CBSE foi determinado utilizando o método de XTT
em fibroblastos murinos (3T3) incubados com o extrato (0,0001–50,00%).
Figura 15. Placa de 96 poços utilizada na determinação do potencial citotóxico do CBSE em
fibroblastos murinos (3T3) pelo método do XTT. (Foto da autora).
Conforme resultados apresentados na Figura 16, o extrato apresenta
citotoxicidade negligível ou pouco importante, uma vez que sua IC50 determinada por
113
extrapolação linear, é >50,00% e nenhuma das concentrações testadas foi capaz de reduzir
a viabilidade celular em 50%, valor este considerado como índice de citotoxicidade in vitro
(IC50) (183).
Figura 16. Avaliação do potencial citotóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após 48 horas
de incubação pelo método do XTT. Os dados representam a média ± desvio padrão de três
experimentos independentes. *P < 0.05 comparado ao grupo controle (ANOVA, Dunnett’s test).
De acordo com a avaliação estatística, nenhuma das concentrações testadas
demonstrou diminuição da viabilidade celular em comparação ao grupo controle (p<0,05).
A citotoxicidade foi avaliada em cultura de fibroblastos, onde ocorreu contato
direto do CBSE com as células basais. Esta situação é considerada drástica, pois, nas
formulações cosméticas, o contato ocorre inicialmente com o estrato córneo, tecido
queratinizado e de proteção (184).
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Mo
rte
ce
lula
r (%
)
CBSE (% w/v)
IC50 >50.00%
114
4.9 Avaliação do potencial fototóxico
Os resultados apresentados na Figura 17 indicam a IC50 para as amostras
mantidas no escuro (6,50 % p/v) e a IC50 para as amostras submetidas à radiação UVA, 5
J/cm2 (35,53% p/v), determinadas por meio da análise de interpolação linear. De acordo
com a análise do fator de fotoirratação, CBSE não apresenta potencial fototóxico (PIF =
0.18) para as concentrações testadas.
Figura 17. Avaliação do potencial fototóxico do CBSE em fibroblastos murinos (3T3) após 60
minutos de incubação pelo método do vermelho neutro (3T3 RNU). Os dados representam a média
± desvio padrão de três experimentos independentes. *P < 0.05 comparado ao grupo controle
(ANOVA, Dunnett’s test).
O teste do vermelho neutro (NRU) utilizando células 3T3 foi validado pelo
ECVAM e é aceito por órgãos regulatórios para a determinação do potencial fototóxico de
substâncias. O potencial fototóxico é avaliado pela comparação das diferenças de
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Mo
rte
ce
lula
r (%
)
CBSE (%w/v)
Cells [-UV]
Cells [+UV]
IC50 [-UV] = 6,50 % IC50 [+UV] = 35,53 %
PIF = 0,18
115
toxicidade entre as placas do controle negativo que não foram expostas à radiação UVA e
as placas com as amostras, que sofreram exposição.
Há uma grande busca por ativos dermatológicos derivados de plantas,
entretanto, estas plantas utilizadas na medicina popular estão relacionadas à fototoxicidade
que desencadeiam inúmeras síndromes dérmicas, como por exemplo, dermatites. Por esta
razão, a avaliação do potencial fototóxico de extratos ou ativos vegetais, torna-se
imprescindível no desenvolvimento de produtos para uso dermatológico.
4.10 Avaliação da estabilidade das formulações
O teste de estabilidade tem como finalidade avaliar o comportamento dos
produtos que se alteram com o tempo, por influência de uma variedade de fatores
ambientais, tais como: temperatura, luz e umidade. O estudo da estabilidade de produtos
cosméticos possibilita verificar o grau de estabilidade relativa do produto em diversas
condições, desde produção até validade.
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 30 60 90 120 150 180
pH
Tempo (dias)
Luz
Escuro
Estufa
Geladeira
116
Figura 18. Avaliação de pH da loção hidratante testada durante o estudo de estabilidade.
Figura 19. Avaliação de pH do sabonete líquido testado durante o estudo de estabilidade.
Em todas as condições de estudo avaliadas, não foram observadas alterações
significativas de pH durante o tempo de armazenamento. Nenhum desvio foi observado na
determinação dos valores de pH quando comparados ao pH verificado no tempo zero (T0).
As Figuras 18 e 19 apresentam os valores de pH obtidos para as formulações de loção
hidratante e sabonete líquido durante todo estudo de estabilidade.
Os resultados da avaliação dos parâmetros de aparência, cor e odor estão
apresentados nas Tabelas 13 e 14. Ambas as formulações apresentaram coloração amarelo
claro no tempo inicial do estudo. O sabonete líquido manteve esta coloração durante o
período de avaliação e a loção hidratante apresentou um leve escurecimento desta
coloração.
A cor e o odor do produto devem se manter estáveis durante os primeiros 15
dias de avaliação, permitindo-se pequenas variações após este tempo. Esta observação de
leve escurecimento da amostra após o período de 30 dias está de acordo com estudos de
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 30 60 90 120 150 180
pH
Tempo (dias)
Luz
Escuro
Estufa
Geladeira
117
estabilidade citados na literatura, onde o tempo de armazenamento propicia modificações
nas características organolépticas das formulações (185).
Tabela 13. Estudo de estabilidade da loção hidratante.
Parâmetro LTA ETA E40 G5
TE
MP
O
ZE
RO
Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
30
DIA
S Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
60
DIA
S Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro
Odor Característico Característico Característico Característico
90
DIA
S Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro
Odor Característico Característico Característico Característico
12
0 D
IAS
Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro
Odor Característico Característico Característico Característico
15
0 D
IAS
Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro
Odor Característico Característico Característico Característico
18
0 D
IAS
Aparência Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso Líquido viscoso
Cor Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro Amarelo claro
Odor Característico Característico Característico Característico
LTA: Luz à temperatura ambiente
ETA: Escuro à Temperatura ambiente
E40: Estufa a 4°C
G5: Geladeira a 5°C
118
Tabela 14. Estudo de estabilidade do sabonete líquido.
Parâmetro LTA ETA E40 G5 T
EM
PO
ZE
RO
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
30
DIA
S
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Presença de precipitado
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
60
DIA
S
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
90
DIA
S
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
12
0 D
IAS
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
15
0 D
IAS
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
18
0 D
IAS
Aparência Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Líquido levemente viscoso a viscoso
Cor Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado Branco-amarelado
Odor Característico Característico Característico Característico
LTA: Luz à temperatura ambiente
ETA: Escuro à Temperatura ambiente
E40: Estufa a 4ºC
G5: Geladeira a 5°C
119
DISCUSSÃO
120
121
5. DISCUSSÃO
Os avanços tecnológicos, as mudanças contínuas de hábitos sociais e alterações
relacionadas aos próprios microrganismos são fatores que contribuem para o surgimento de
novas doenças, para o reaparecimento de doenças consideradas erradicadas e para o
desenvolvimento de resistência microbiana (186). Outras doenças ou eventos patológicos
não-infecciosos, como câncer, envelhecimento precoce, aterosclerose e doenças auto-
imunes, parecem estar ligadas à presença de espécies reativas do metabolismo do oxigênio
e representam também um grande problema de saúde pública (187).
O uso de ingredientes de origem natural em cosméticos, como por exemplo, os
extratos vegetais, óleos vegetais, óleos essenciais e seus derivados que, incorporados nas
formulações, agregam bioatividade, funcionalidade e apelo de marketing, tornou-se comum
nos tempos modernos (188).
Estudos de bioengenharia cutânea comprovaram a eficácia de bioativos
tropicais e assim, vários pesquisadores têm estudado ativos brasileiros aplicados em
cosméticos. A conclusão dos estudos mostra a importância da associação da tecnologia com
a cultura popular, para estudo e, consequente, uso de ingredientes naturais em
cosméticos (189). Isso tem aumentado a pesquisa referente ao isolamento, à identificação e à
quantificação de compostos ativos das plantas e suas atividades biológicas (190, 191).
Tendo em vista o potencial biológico do C. brasiliense, em particular, suas
propriedades antioxidantes e antimicrobianas, este trabalho objetivou o estudo do extrato
obtido por dióxido de carbono supercrítico, pois pesquisas demonstraram que óleos e
extratos, normalmente constituídos por um conjunto de componentes, apresentam uma
melhor atividade terapêutica do que as substâncias isoladas que representam sua
122
composição principal. Um exemplo de tal afirmação é a atividade antisséptica do óleo
essencial de Eucaliptus globulus, superior à atividade exibida pelo seu principal
constituinte ativo isolado, o cineol ou eucaliptol (representando 80% da composição) (192).
A descoberta de substâncias que podem ser utilizadas para impedir, diminuir ou
controlar a proliferação das doenças infecciosas e ainda, contribuir para a melhoria da
qualidade de vida das pessoas, inibindo a ação de espécies reativas do metabolismo do
oxigênio, motiva pesquisadores no mundo inteiro (52).
Os resultados obtidos neste estudo confirmam que extrato de Caryocar
brasiliense obtido por CO2 supercrítico apresenta atividade antimicrobiana. Não há relatos
sobre a avaliação da atividade antimicrobiana do CBSE, desta forma não é seguro comparar
os dados deste estudo com outros que envolvam diferentes extratos ou métodos analíticos
distintos. Uma comparação só é possível quando o método é idêntico, empregando-se os
mesmos microrganismos.
Ainda assim, é interessante ressaltar que a atividade antimicrobiana do pequi foi
anteriormente reportada. Paula-Junior et al.(52), demonstraram que o extrato hidroetanólico
das folhas de C. brasiliense apresentam atividade antimicrobiana frente às bactérias E. coli
e S. aureus, entretanto, em seus estudos não foi possível estabelecer a CIM para P.
aeruginosa, porque o meio de cultura tornava-se turvo à medida em que se aumentava a
concentração do extrato.
Ferreira et al. (193) mostraram que o óleo do fruto de pequi possui atividade
antimicrobiana frente a P. aeruginosa, sugerindo uma atividade bacteriostática e o seu uso
como potencial conservante. Ascari (194) avaliou o extrato etanólico bruto obtido também a
partir dos frutos e obteve resultados coincidentes, verificando halos de inibição inferiores a
7 mm para P. aeruginosa.
123
O método empregado neste estudo foi validado pela presença de crescimento
microbiano no controle positivo (meio de cultura + inóculo), bem como pela ausência de
crescimento microbiano no controle negativo (meio de cultura + antimicrobiano) e ainda,
teve sua eficácia confirmada pela utilização do antibiótico Ciprofloxacino como controle do
ensaio. A ausência de crescimento bacteriano diante do antibiótico Ciprofloxacino
demonstra a susceptibilidade das bactérias testadas frente a um antimicrobiano sintético.
A técnica da microdiluição, além de sua alta eficácia, possui como vantagens:
alta sensibilidade, baixo custo das microplacas, requer pequena quantidade de amostra e de
reagentes, o que possibilita um maior número de réplicas, aumentando a confiabilidade dos
resultados, fornece resultados quantitativos e não é influenciado pela velocidade de
crescimento dos microrganismos (86).
Na avaliação da atividade antisséptica, percebe-se a formação de pequenos
halos de inibição para as amostras controle, formuladas sem CBSE, estes resultados não são
significativos e não atendem ao parâmetro estabelecido para produtos antissépticos, que
devem apresentar uma zona de inibição superior a 8 mm (86, 173, 174). Ao contrário, as
amostras formuladas com CBSE conduzem a resultados significativos quando comparados
aos controles e também atendem ao parâmetro estabelecido para classificação de
substâncias dotadas de atividade antisséptica, permitindo atribuir esta atividade biológica
ao CBSE.
Muitas atividades biológicas demonstradas por extratos de plantas estão
relacionadas à presença de determinados grupos de compostos. Dessa forma, procedeu-se
ao screening fitoquímico com a finalidade de se confirmar a presença de grupos de
compostos reconhecidos por suas atividades antimicrobianas e antioxidantes.
124
Os resultados da abordagem fitoquímica indicaram a presença de compostos
fenólicos e terpenóides, confirmando os estudos anteriores que demonstraram que os
principais constituintes químicos do pequi são os compostos fenólicos, especificamente,
flavonóides e os terpenos, compostos bioativos identificados como agentes
antimicrobianos (52, 53, 158, 159, 160).
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais tem sido atribuída a produtos
do seu metabolismo secundário, como os terpenóides e compostos fenólicos, por exemplo:
timol, carvona, carvacrol, mentol e muuroleno, que também na forma pura exibem
atividade antibacteriana ou antifúngica (48, 136). Apesar dos mecanismos de ação destes
produtos estarem pobremente caracterizados, a atividade parece estar associada ao caráter
lipofílico dos compostos, havendo um acúmulo em membranas e perda de energia pelas
células (136, 195).
Os produtos do metabolismo secundário acumulado pelas plantas podem atuar
como potencializadores da atividade antibacteriana, favorecendo a atividade de antibióticos
cuja ação encontra-se limitada pelos mecanismos de multirresistência desenvolvidos pelos
microrganismos (196).
Os flavonóides podem interagir com a membrana citoplasmática, inibindo sua
função e prejudicando a integridade celular. Podem ainda inibir a síntese de ácidos
nucléicos e interromper o metabolismo bacteriano (197).
Os terpenos são classificados como GRAS (Generally Recognized as Safe), isto
é, reconhecidos por sua segurança, sendo verificado que inibem o crescimento de células
cancerosas, diminuem o tamanho de tumores, assim como o nível de colesterol e também
inibem o crescimento de microrganismos (198, 199). Terpenos têm características lipofílicas
125
que afetam a estabilidade da membrana citoplasmática, conduzindo à perda de enzimas
celulares e nutrientes (200).
A exposição aos terpenos pode interferir na expressão de genes codificadores
de fatores de virulência, como quando consideradas linhagens de S. aureus produtoras de
enterotoxinas (201), e com a expressão de proteínas citoplasmáticas e de membrana em
Salmonella enterica (202).
Staphylococcus aureus é um patógeno conhecido por causar infecções da
pele (203, 204). A ação do extrato de Caryocar brasiliense sobre este microrganismo sugere a
sua utilização em formulação para o tratamento de infecções cutâneas.
Escherichia coli habita o intestino sem causar problemas de saúde. No entanto,
ao se direcionar para a circulação sanguínea ou outras regiões do corpo, é capaz de
provocar infecções. Pseudomonas aeruginosa, causa infecções em indivíduos
imunocomprometidos, como pacientes de AIDS e câncer, vítimas de queimaduras, e
portadores de fibrose cística, sendo comumente encontrada em infecções hospitalares. Por
causa da alta resistência a antibióticos e do grande arsenal de fatores de virulência desta
bactéria, as infecções causadas por ela são de difícil controle (204).
E. coli e P. aeruginosa, colonizam a camada mais superficial da pele, o que
permite sua remoção mecânica pela higienização das mãos, sendo eliminada com mais
facilidade quando se utiliza uma solução antisséptica (205). Os resultados obtidos na
avaliação da atividade antisséptica também sugerem a utilização do CBSE na prevenção
destes microrganismos.
De acordo com os dados divulgados na mídia, a associação Brasileira de Defesa
do Consumidor, PROTESTE, analisou dez sabonetes bactericidas comercializados no
Brasil, sendo três líquidos e sete na versão em barra; entre as versões de sabonete liquido,
126
DETTOL® não foi eficaz frente a P. aeruginosa, LIFEBUOY® e PROTEX® não
eliminaram ou reduziram quaisquer microrganismos usados no teste, dentre os quais, as três
bactérias testadas em nosso estudo (206). Estes resultados, mais uma vez sugerem o uso de
CBSE como alternativa natural e eficaz aos antissépticos disponíveis no mercado.
A atividade antioxidante de uma substância isolada ou de uma mistura de
compostos, como por exemplo, os extratos vegetais, não pode ser mensurada diretamente,
mas através dos seus efeitos sobre um substrato ou sistema passível de ser monitorado, uma
vez que essa atividade envolve diversidade de mecanismos, destacando-se aqueles
relacionados à prevenção da cadeia iniciadora, ligação a metais de transição e
decomposição de peróxidos (207).
Os resultados apresentados para a atividade antioxidante, obtidos por meio do
método ABTS, são estatisticamente significativos quando comparados aos resultados
obtidos para a vitamina E (tocopherol), utilizada como controle do ensaio. A vitamina E
apresenta um papel fundamental na proteção do organismo contra os efeitos prejudiciais
das espécies reativas de oxigênio (ERO) que são formadas metabolicamente ou encontradas
no ambiente (208).
A maioria dos métodos de avaliação antioxidante usa processos oxidativos que
envolvem a adição de um agente iniciador (como a temperatura, agitação ou uma pressão
parcial de O2), um acelerador do processo (um metal de transição ou exposição à luz, por
exemplo), e uma fonte específica de radicais livres. Esses radicais são, então, oxidados sob
condições padronizadas e o grau de oxidação, ou a sua extensão, medido (209).
O método utilizado na determinação do potencial antioxidante do extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico consiste na produção do radical ABTS a
partir de seu precursor, o 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid. O radical
127
ABTS é um composto cromóforo muito estável quimicamente, com alta solubilidade em
água e um máximo de absorbância a 414 nm, e também de medidas secundárias de
absorbância a 645, 734 e 815 nm (132).
O método do radical ABTS é utilizado para amostras hidrossolúveis e
lipossolúveis, o que lhe confere vantagem em relação a outros métodos. Este método tem
sido utilizado para a avaliação de alimentos, amostras biológicas, compostos puros e extratos
vegetais (210, 211).
O radical ABTS pode ser gerado enzimaticamente, utilizando mioglobina e
peroxidase; quimicamente, usando dióxido de magnésio ou persulfato de potássio; ou
ainda eletroquimicamente. O sistema ABTS/mioglobina/H2O2, também conhecido como
método TAA (Total Antioxidant Activity Method) ou método de Rice-Evans, é o método de
medida da atividade antioxidante mais conhecido. Foi o primeiro a utilizar o radical
ABTS como substrato de oxidação. Serviu de base para o surgimento de outros métodos que
usam o mesmo radical (132).
Os radicais livres, por serem extremamente reativos e instáveis, participam de
reações com substâncias químicas orgânicas e inorgânicas, proteínas, lipídeos, carboidratos,
particularmente moléculas importantes nas membranas celulares e ácidos nucléicos (212).
A busca por antioxidantes naturais para produtos alimentícios, cosméticos e
farmacêuticos vem representando um importante desafio para a pesquisa industrial. Nesses
produtos, há um grande interesse pelo estudo da oxidação lipídica, que tem como
consequência a deterioração (213).
A oxidação lipídica é um processo complexo que envolve uma variedade de
radicais livres e é influenciada pela temperatura, pela luz, presença de O2, além das
propriedades físico-químicas do produto e da presença de possíveis iniciadores e
128
catalisadores da reação. O uso de antioxidantes em produtos contendo lipídios é uma das
principais formas de se minimizar a deterioração, retardar a formação de produtos tóxicos,
manter a qualidade sensorial e aumentar a vida-de-prateleira de produtos alimentícios (213).
Os principais antioxidantes nos vegetais são as vitaminas C e E, os terpenos,
principalmente os carotenóides e os compostos fenólicos, especialmente os flavonóides.
Esses antioxidantes absorvem radicais livres e inibem a cadeia de iniciação ou interrompem
a cadeia de propagação das reações oxidativas promovidas pelos radicais livres (214).
Estudos recentes mostram que o C. brasiliense possui alta concentração de
fenóis, como flavonóide, quercetina e quercetina 3-O-arabinose e componentes ácidos,
como ácido gálico e ácido quínico no fruto e na casca, principalmente, quando a extração é
etanólica (40, 56, 215).
Os compostos fenólicos são estrutruras simples presentes na maioria dos
vegetais e frutos frescos ou estruturas complexas presentes na raiz, casca e folhas das
plantas. São metabólitos secundários, que possuem diferentes atividades biológicas, dentre
as quais, a eliminação dos radicais livres está entre as mais importantes (216, 217).
Estes compostos fazem parte dos constituintes de uma variedade de vegetais,
frutas e produtos industrializados. Podem ser pigmentos, que dão a aparência colorida aos
alimentos, ou produtos do metabolismo secundário, normalmente derivado de reações de
defesa das plantas contra agressões do ambiente. Esses compostos agem como
antioxidantes, não somente pela sua habilidade em doar hidrogênio ou elétrons, mas
também em virtude de seus radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de
vários substâncias, particularmente de lipídios (130).
Os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos,
sobretudo por inibirem a peroxidação lipídica e a lipoxigenase in vitro (125). A ação desses
129
antioxidantes pode ocorrer por meio de oxiredução, em que eles próprios seriam os
reagentes, ou por interação com metais de transição (Fe+2 e Cu+2) (218).
São responsáveis por eliminar radicais devido ao grupo hidroxila que confere a
capacidade de doar elétrons (219), contribuindo diretamente com o efeito antioxidante. A
atividade antioxidante dos compostos fenólicos depende da estrutura, em particular, do
número e das posições do grupo hidroxila, da interação com outros componentes e das
condições ambientais, como por exemplo, pH (220).
Os terpenos, terpenóides ou isoprenóides constituem uma classe de produtos
naturais obtidos de plantas com a maior variedade estrutural e funcional. Alguns destes
compostos participam de processos como respiração e desenvolvimento celular, portanto
importantes ao metabolismo primário, entretanto, a maioria dos terpenóides são produtos
do metabolismo secundário (221).
Estes grupos de compostos englobam hidrocarbonetos insaturados cíclicos com
diferentes posições de oxigênio nos grupos constituintes, ligados ao esqueleto básico
isopreno, apresentando natureza lipofílica. É por serem facilmente oxidados, que os
terpenos apresentam atividade antioxidante. Além da proteção celular e in vitro contra
oxigênio singlet, os terpenos inibem a peroxidação de lipídeos em baixas pressões de
oxigênio (222).
A busca por substâncias que possam retardar ou reverter o processo de
envelhecimento é uma ferramenta constante de pesquisa e desenvolvimento em cosméticos
e na área dermatológica. Os radicais livres como grupo superóxido e radicais hidroxila são
formados pelo processo de fosforilação oxidativa e causam danos aos componentes
lipídicos celulares, proteínas e ácidos nucléicos. Para tentar reverter o processo oxidativo
prejudicial, o organismo conta com os antioxidantes endógenos e exógenos, a fim de
130
manter o equilíbrio entre a produção de radicais livres e eliminação por vários compostos
antioxidantes e enzimas (223).
Os antioxidantes exógenos são muito diversos, sendo comumente encontrados
em vegetais. As plantas contêm numerosos fitoquímicos, destacando-se os compostos
fenólicos, os terpenóides, os compostos nitrogenados, o ácido ascórbico e os tocoferóis.
Muitos desses compostos apresentam significativa atividade antioxidante, que além
auxiliarem nos processos antienvelhecimento, estão associado à menor incidência e menor
mortalidade por doenças crônicas não transmissíveis, em particular, o câncer (224, 225).
Com a tendência mundial de substituição do uso de animais, as indústrias
cosméticas nacionais e internacionais passaram a desenvolver e apresentar resultados de
testes in vitro para a comprovação da segurança de seus produtos. Além de questões éticas,
a busca por métodos alternativos que apresentem maior confiabilidade, redução de custos e
maior facilidade de difusão e incorporação por outros laboratórios é uma questão de grande
relevância para a indústria.
Os testes de toxicidade aguda sistêmica são realizados com a finalidade de
determinar os riscos que algumas substâncias podem causar à saúde. Estudos sugerem que
os métodos in vitro podem ser úteis em predizer a toxicidade aguda in vivo (226).
Embora os testes in vitro para a avaliação da toxicidade ainda não possam
substituir completamente os testes in vivo, eles fornecem informações úteis quanto aos
aspectos que influenciam o crescimento ou a sobrevivência celular. Os testes de viabilidade
celular fornecem informações quanto a respostas imediatas ou curtas, tais como alterações
na permeabilidade da membrana ou uma perturbação de um caminho metabólico
específico, medindo a proporção de células viáveis após um procedimento traumático (137).
131
A fim de estabelecer o potencial de irritação ocular do CBSE, bem como possível
irritação a membranas mucosas, foi conduzido o método HET-CAM. A classificação obtida
neste ensaio sugere que CBSE não possui potencial irritante. Este resultado associado aos
demais testes da avaliação de segurança do CBSE contribuem para estabelecer o perfil
toxicológico deste extrato e predizer possíveis irritações a membranas mucosas e ao olho,
especificamente.
Considerando que os produtos cosméticos podem ser introduzidos
acidentalmente nos olhos, pois podem deixar resíduos nas mãos e algumas vezes, são
destinados para uso nas mãos, este ensaio é de fundamental importância na determinação de
segurança de um produto.
Ovos embrionados de galinha têm sido usados em muitos laboratórios e há mais
de duas décadas na avaliação da toxicidade de uma variedade de substâncias químicas. Sua
aplicação pode ser observada em estudos de teratogenicidade, embriotoxicidade, avaliação de
efeitos sistêmicos, estudos de vias metabólicas e na avaliação do potencial irritante induzido
por ingredientes ou produtos acabados sobre membranas (156, 168).
O método HET-CAM é um método alternativo para avaliação do potencial
irritante ocular que utiliza CAM de ovo de galinha embrionado com a finalidade de avaliar o
grau de irritação de mucosas induzido por substâncias químicas aceito pelas autoridades
regulatórias como método usado no desenvolvimento de produtos cosméticos (152).
Este método possui boa correlação com os resultados obtidos nos testes in vivo
por permitir a avaliação imediata de fenômenos vasculares, como hiperemia, hemorragia e
coagulação, e os fenômenos avaliados nos testes in vivo de irritação de mucosas estão
relacionados diretamente ao surgimento de alterações vasculares. Seu uso como método
alternativo ao teste de irritação ocular em coelhos é estudado desde 1988 (152, 227).
132
O HET-CAM apresenta uma alta sensibilidade quando comparado ao modelo
animal. Um dos aspectos responsáveis por esta característica é o fato de que neste método
aplica-se o produto diretamente na membrana corioalantóide, sem que haja nenhuma
barreira protetora neste tipo de exposição (228).
O método empregado neste estudo, em particular, apresenta como vantagens:
economia, não requer equipamentos especializados, apresenta um processo simples de
implantação, não requer grande espaço físico, requer apenas um técnico treinado para
realização do teste. Adicionalmente, o teste é de rápida execução, com duração média de 1
hora.
CBSE apresentou citotoxicidade negligível ou pouco importante na avaliação in
vitro pelo método XTT, com uma IC50 estimada em >50.00%, verificando-se que nenhuma
das concentrações testadas neste estudo reduziu a viabilidade celular em 50%. Na literatura
não foram encontrados dados sobre a citotoxicidade do CBSE, entretanto, Roesler et. al (140)
avaliaram a citotoxicidade in vitro do extrato etanólico da casca do pequi e verificaram a
produção de um precipitado no meio de cultura celular, que causou apenas uma diminuição
da viabilidade celular.
Testes in vitro apresentam vantagens significativas, como por exemplo, a
redução de custos, a possibilidade de realização de repetições ou análises simultâneas
dentro de um período curto de tempo e a produção de menores volumes de resíduos
tóxicos (183).
A maioria dos testes de segurança in vitro se baseia na ruptura da integridade da
membrana que é determinada pela entrada de um corante, ao qual a célula é geralmente
impermeável ou à liberação de um corante, normalmente adquirido e retido por células
133
viáveis (229). Entre os métodos de bioensaios, os ensaios de toxicidade celular são os
primeiros a serem realizados para predizer a toxicidade de substâncias a vários tecidos (230).
A principal vantagem da avaliação da toxicidade em culturas de células em
relação aos ensaios tradicionais de toxicidade in vivo realizados em camundongos, é que em
relação aos primeiros se espera uma resposta mais simples, sensível, econômica e
homogênea (231).
Estudos preliminares in vitro apresentam ainda como benefício, a redução do
número de testes que, na maioria das vezes, envolvem o uso e o sacrifício de animais, os
quais podem indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas (137).
A descoberta de novos agentes químicos com atividade biológica constitui uma
atividade multidisciplinar, onde os estudos sobre eficácia, mecanismos de ação, potencial
tóxico e genotóxico dependem de bioensaios fármaco-toxicológico in vitro e in vivo para
que estas substâncias tenham suas atividades confirmadas frente a estes aspectos. Apesar
dos testes celulares in vitro não substituírem os testes in vivo para a avaliação da atividade
biológica de diversas substâncias, inicialmente, estes testes são aplicados em estudos-piloto
de novos fármacos servindo como modelo econômico para uma rápida triagem de
xenobióticos (137).
Em algumas situações, os resultados dos testes que avaliam a citotoxicidade in
vitro podem não estar diretamente relacionados aos resultados obtidos nos ensaios in vivo,
entretanto, pode-se afirmar que se um material induz uma reação citotóxica em testes
envolvendo cultura de células, é bem provável que irá demonstrar potencial citotóxico
quando aplicado em tecidos vivos (232).
O uso tópico de produtos obtidos a partir do pequi, como por exemplo, óleo,
pomadas, infusões (32) e a existência de poucos estudos sobre a atividade fototóxica de
134
extratos de plantas utilizadas como cosméticos nos levou a investigar o possível efeito
fototóxico do CBSE.
Como demonstrado por vários estudos de validação, o potencial fototóxico das
substâncias químicas pode ser avaliado de forma eficaz por métodos in vitro (233).
Na determinação da fototoxicidade in vitro pelo método 3T3 NRU, pode-se
observar que CSBE não apresenta potencial fototóxico, não sendo observada redução da
viabilidade celular das culturas de fibroblastos tratadas com este extrato e expostas à
radiação. Embora não haja nenhum estudo investigando a citotoxicidade e fototoxicidade
de CBSE, Roesler et al. (140) mostraram que os extratos etanólico de casca de pequi não são
fototóxicos (PIF < 5).
Resultados para avaliação da citotoxicidade in vitro são utilizados para
determinar a toxicidade e para estimar o valor da IC50 de substâncias químicas. O ensaio de
fototoxicidade pelo método 3T3 NRU é um método validado para a substituição dos testes
com animais (234), aceito por agências regulatórias como método para determinação do
potencial fototóxico. A fototoxicidade é avaliada comparando as diferenças de toxicidade
entre as placas do controle negativo, não expostas à radiação UVA e placas de teste,
expostas a radiação (140).
Entre as substâncias presentes em cosméticos, que podem causar fototoxicidade
estão: algumas fragrâncias, como metilcoumarina, musk, ambrette, substâncias
antibacterianas e ésteres ácidos p-aminobenzóico (235, 236, 237, 238, 239).
Os resultados de fototoxicidade apresentados neste trabalho são de grande
importância, especialmente para aplicação farmacêutica e cosmética, porque as
formulações tópicas são comumente usadas durante o dia e envolvem a exposição ao sol e à
luz artificial.
135
Existe uma grande procura por ativos dermatológicos derivados de plantas, por
exemplo, perfumes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, no entanto, muitas plantas
utilizadas na medicina tradicional “popular" estão associadas a reações de citotoxicidade e
fototoxicidade. À luz desta observação, a avaliação do potencial citotóxico e fototóxico de
extratos vegetais ou derivados torna-se essencial para o desenvolvimento de produtos
destinados ao uso dermatológico (235, 236, 237, 238, 239).
Os testes de avaliação do potencial de irritação ocular ou irratação de mucosas,
determinação da citotoxicidade e fototoxicidade são testes premilinares de avaliação
toxicológica. Associados a estes, de acordo com a finalidade de uso do produto, é
necessária a avaliação da toxicidade aguda, do potencial de sensibilização, do potencial de
irritação da pele, avaliação da absorção cutânea, mutagenicidade, entre outros (137). Em
relação a este último, percebe-se que há uma crescente preocupação com o uso de produtos
associados ao desenvolvimento do câncer.
Referente a esta abordagem, há estudos in vitro conduzidos em células CHO-
K1, mostrando que o extrato de pequi não induziu aberrações cromossômicas, quando
testado nas concentrações de 0,05 mL/mL de meio de cultura por 24 e 48 h. Foi
demonstrado ainda que o extrato de pequi reduziu significativamente os efeitos
clastogênicos da ciclofosfamida, concluindo-se que o extrato de pequi apresenta uma
atividade de proteção das células contra a indução de danos cromossômicos por
determinados agentes químicos (56, 215).
A dificuldade de encontrar dados na literatura, demonstrando cientificamente a
atividade biológica das diversas partes do pequi e potencial de toxicidade, reforça a
necessidade de estudos dessa natureza que trarão grande contribuição para sua utilização
segura.
136
A estabilidade dos extratos vegetais é normalmente questionada pelos
formuladores. Além de fornecer dados sobre a segurança eficácia dos extratos vegetais, é
importante verificar a sua aplicabilidade, o que inclui a incorporação em fórmulas e a
avaliação da estabilidade.
CBSE foi utilizado no desenvolvimento de duas formulações, sabonete líquido e
loção hidratante, demonstrando excelente incorporação, caracterizada pela ausência de
alterações na aparência, cor e odor das formulações desenvolvidas. As formulações foram
preparadas sem a utilização de essência/fragrância e o odor das formulações não foi
alterado com a incorporação de CBSE, embora o mesmo apresentasse odor classificado
inicialmente como característico herbal, permanecendo inalterado durante todo o período
de avaliação.
Estas formulações foram ainda avaliadas quanto à estabilidade durante seis
meses, sendo desafiadas nas condições de escuro e exposição à luz, à temperatura ambiente
e mantidas em geladeira. Em todas as condições avaliadas, não foram observados sinais de
instabilidade físico-química.
A coloração branco-amarelada observada era esperada, pois não foram
utilizados pigmentos durante a manipulação das formulações. Colorações diferentes dos
tons de amarelo claro a verde claro poderiam ser provocadas pela interação entre os
componentes da formulação. Em relação à aparência, as formulações mantiveram a
característica de líquido viscoso durante todo o estudo.
A loção hidratante é constituída por duas fases distintas, uma de natureza
aquosa e outra oleosa, estabilizada pela presença de um terceiro componente, o tensoativo
emulsificante, álcool cetoestearílico. A grande vantagem deste tipo de preparação é a
137
possibilidade de incorporar ativos hidrossolúveis e lipossolúveis sem perda de estabilidade
e/ou modificação em suas características físicas finais (240).
Na área cosmética não existe nenhum protocolo oficial padronizando os testes
de estabilidade, pois estes devem ser adequados aos objetivos do formulador, da forma
cosmética e dos constituintes da formulação. No entanto, com o intuito de direcionar as
indústrias cosméticas e/ou os formuladores, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), publicou um Guia de estabilidade sugerindo parâmetros de avaliação e os testes
de estabilidade (241).
O estudo da estabilidade contribui para orientar o desenvolvimento da
formulação e do material de acondicionamento; fornecer subsídios para aperfeiçoamento das
formulações; estimar o prazo de validade; auxiliar no monitoramento da estabilidade
organoléptica, físico-química e microbiológica, produzindo informações sobre a
confiabilidade e segurança dos produtos (242).
O teste de estabilidade preliminar, realizado em um curto intervalo de tempo,
pode ser considerado um teste orientativo no desenvolvimento de produtos. Consiste em
submeter a amostra a condições extremas de temperatura, objetivando acelerar processos de
instabilidade, para auxiliar na triagem de formulações e não ser estimativo de vida útil do
produto (243).
A exposição do produto à radiação luminosa pode alterar a cor, devido ao
desencadeamento de reações de oxido-redução, levando à degradação de ingredientes da
formulação (241). Por isso, deve-se conduzir os estudos de avaliação da estabilidade frente à
exposição luminosa, pois quando se observa que uma formulação é sensível à ação da luz,
esta deve receber a indicação de que deve ser acondicionada ao abrigo da luz, em frascos
opacos ou escuros, a fim de retardar o processo oxidativo.
138
Não há relatos sobre a estabilidade de uma formulação contendo CBSE,
entretanto, foi demonstrado que é possível formular emulsões múltiplas do tipo O/A/O
estáveis com o óleo de pequi pela técnica de preparo de duas etapas. Foi demonstrado ainda
que, além dos benefícios atribuídos ao óleo de pequi, a formulação desenvolvida pode ser
utilizada como um veículo diferenciado, ressaltando as vantagens desse sistema para
associação de outros ativos cosméticos (244).
Em outro estudo, observou-se que uma emulsão O/A composta por 10% de óleo
de pequi apresentou excelente estabilidade. A partir das avaliações do valor do pH,
viscosidade e comportamento reológico durante os testes de estabilidade acelerada pode-se
presumir a estabilidade da formulação, que apresentou características desejáveis
cosmeticamente como a pseudoplasticidade e a tixotropia. Estes resultados permitiram mais
uma vez sinalizar a aplicabilidade cosmética desta espécie do cerrado brasileiro para a
cadeia produtiva de cosméticos naturais (245).
A estabilidade é um parâmetro de validação ainda pouco descrito, mas
necessária para assegurar a qualidade dos produtos cosméticos, principalmente os de
origem vegetal, desde a fabricação até a completa validade, pois variáveis relacionadas à
formulação, ao processo de fabricação, ao material de acondicionamento e às condições
ambientais e de transporte, assim como cada componente da formulação seja ativo ou não,
podem influenciar na estabilidade de um produto (246).
Os extratos vegetais podem ser incorporados em diferentes preparações
cosméticas, podendo ter a função de ativo da formulação. Podem ou não alterar a forma
cosmética e o comportamento reológico da preparação, entretanto, estas preparações devem
passar por todas as etapas de pesquisa: proposição, criação e desenvolvimento, incluindo os
testes de estabilidade, para assegurar a atividade durante toda sua vida útil (242).
139
O uso popular do pequi pela população de diferentes regiões do Brasil pode
encontrar subsídios nos estudos científicos, que comprovam sua segurança e eficácia, a
fim de evitar que a utilização inadequada de seus derivados conduza a efeitos
indesejáveis.
Os dados obtidos neste trabalho encorajam a realização de novos estudos
visando determinar as substâncias que contribuem para a atividade biológica, entender
seu mecanismo de ação e complementar a determinação do perfil toxicológico, buscando
uma aplicação cosmética e também farmacêutica.
140
141
CONCLUSÃO
142
143
6. CONCLUSÃO
O presente estudo sobre a avaliação da segurança e eficácia do extrato de
Caryocar brasiliense obtido por CO2 supercrítico, demonstrou que este extrato:
Apresenta atividade antimicrobiana frente às bactérias Escherichia coli,
Pseudomonas aeuroginosa e Staphylococcus aureus.
Atende aos requisitos de uma substância dotada de atividade antisséptica.
Aumenta a atividade antioxidante em culturas celulares quando comparado
ao tocopherol (vitamina E), apresentando antioxidantes naturais com ação
comprovada como os compostos fenólicos e terpenos.
Não apresenta efeitos citotóxicos ou fototóxicos, uma vez que não reduz a
viabilidade celular.
Não induz irritação ou corrosividade à mucosa ocular, conforme
demonstrado em teste alternativo ao modelo animal.
É estável quando utilizado na formulação de composições cosméticas e não
afeta as características organolépticas, como aparência, cor e odor durante a
aplicação inicial.
Estes resultados proporcionaram a publicação de artigos científicos e, ainda,
fornecem perspectivas de desenvolvimento de produtos para o cuidado pessoal,
principalmente aqueles com atividade antisséptica e os que minimizam os danos causados
pelos radicais livres.
144
145
REFERÊNCIAS
146
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ANEXOS
182
183
ANEXO I
APROVAÇÃO PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA)
184
ANEXO II
COMPROVANTE DE DEPÓSITO DE SUBAMOSTRA
185
ANEXO III
ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO
