Manual de Instruções para Análise por HPLC de Vitamina B1 em Sangue Total

Reagente diagnóstico para determinação quantitativa in vitro de Vitamina B1 em sangue total por HPLC. Somente para uso diagnóstico in vitro.

Artigo 35000

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VITAMINAS B1 EM SANGUE TOTAL – HPLC

VITAMIN B1 (THIAMINDIPHOSPHATE) IN WHOLE BLOOD-HPLC MS: 10350840142

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Conteúdo

1 Informações para requisição ................................................................................................................... 3 2 Introdução ............................................................................................................................................... 4

3 Sistema HPLC ........................................................................................................................................ 5 3.1 Parâmetros do equipamento ............................................................................................................ 5 3.2 Coluna HPLC .................................................................................................................................. 5 3.3 Shut down ........................................................................................................................................ 5

4 Separação cromatográfica ....................................................................................................................... 6

5 Preparo da amostra ................................................................................................................................. 6 5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes ....................................................................... 6 5.2 Reconstituição do calibrador em sangue total ................................................................................. 6 5.3 Reconstituição dos controles ........................................................................................................... 7 5.4 Preparo do mix de derivatização ..................................................................................................... 7

5.5 Procedimento de preparo das amostras ........................................................................................... 8

5.6 Estabilidade das amostras preparadas ............................................................................................. 8 6 Calibração do sistema de análise ................................................................................................................ 8

7 Controle de Qualidade ............................................................................................................................ 8 8 Valores de referência .............................................................................................................................. 9 9 Fatores de Conversão .............................................................................................................................. 9

10 Armazenamento e validade dos reagentes .......................................................................................... 9 11 Descarte de resíduos............................................................................................................................ 9

12 Exemplos de cromatogramas ............................................................................................................ 10 12.1 Cromatograma de um calibrador em sangue total .................................................................... 10 12.2 Cromatograma de uma amostra de paciente ............................................................................. 10

13 Problemas e Soluções........................................................................................................................ 11

14 Literatura ........................................................................................................................................... 12

Apêndice I: Informações de segurança ........................................................................................................ 13 Apêndice II: Cálculo Manual ....................................................................................................................... 14

Apêndice III: Validação ............................................................................................................................... 15 Apêndice IV: Declaração de Conformidade ................................................................................................ 16

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1 Informações para requisição

Artigo Produto

35000

Kit reagente para determinação de Vitamina B1 em sangue total por HPLC. Para 100 análises. Fase Móvel Tampão de Extração Reagente de Precipitação Reagente de Derivatização 1 (liofilizado) Reagente de Derivatização 2 Tampão de Neutralização Tampão de Estabilização Tubos de reação, âmbar

Componentes disponíveis separadamente:

1000 ml 10 ml 30 ml

5 x 0,3 ml 20 ml 10 ml 10 ml

100 peças

35021 Fase Móvel 1000 ml 35022 Fase Móvel 10 x 1000 ml 37003 37004

Tampão de Extração Reagente de Precipitação

10 ml 30 ml

35005 Reagente de Derivatização 1 (liofilizado) 5 x 0,3 ml 35006 Reagente de Derivatização 2 20 ml 35009 Tampão de Neutralização 10 ml 35007 Tampão de Estabilização 10 ml 37008 Padrão de Calibração em Sangue Total (liofilizado) Vitaminas B1/B2 5 x 1,0 ml 33005

Tubos de reação, âmbar 100 peças

Acessórios

35110 Coluna HPLC para determinação de Vitamina B1 em sangue total (equilibrada, com cromatograma teste)

1 peça

15009 Pré-filtro em PEEK 5 peças 15010 Suporte para pré-filtro em PEEK 1 peça 18001 Suporte para cartucho de pré-coluna 4/10 1 peça 18035

Cartucho de pré-coluna 4/10 1 peça

Controles e Calibradores para vitaminas B1 e B2 em sangue total

37008 Padrão de calibração em sangue total (liof.) 5 x 1.0 ml 0033 Controle bi-nível (I + II) de Vitaminas B1/B2 em sangue total (liof.) 2 x 5 x 2 ml

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2 Introdução A vitamina B1 (tiamina) é uma vitamina hidrossolúvel que contém dois anéis heterocíclicos (um pirimidina e um tiazol) conectados por uma ponte metileno e um átomo de nitrogênio quaternário (Fig. 1). A tiamina é sensível a soluções alcalinas (que quebram o anel tiazol) e agentes oxidantes e redutores. A tiamina está majoritariamente localizada nos eritrócitos, onde pode ser encontrada em sua forma ativa, tiamina pirofosfato (TPP).

Figura 1: Vitamina B1

A vitamina B1 é sintetizada por uma variedade de plantas e microorganismos e ocorre na forma livre, ligada a proteínas, como mono-, di- ou trifosfato éster. Como os animais usualmente não podem sintetizá-la, os seres humanos devem suprir as necessidades vitamina B1 por fontes exógenas na dieta. A tiamina é absorvida no intestino delgado tanto por difusão passiva quanto por transporte ativo. Posterior fosfoliração origina a coenzima mais importante fisiologicamente, a tiamina pirofosfato (TPP). A tiamina é excretada pelos rins após sua desfosforilação até a forma livre ou como éster de sulfato conjugado. Como TTP, a tiamina é coenzima para a descarboxilação oxidativa de ácidos 2-oxo e está assim envolvida no metabolismo energético e nas principais vias biossintéticas do organismo. Como coenzima para aldeído e cetotransferases está envolvida na via das pentoses-fosfato. No sistema nervoso, tem papel na biossíntese de lipídeos e acetilcolina. A doença clássica da deficiência de vitamina B1 é o beribéri, que tem como sintomas primários, distúrbios cardiovasculares e neurológicos como lesão miocárdica, insuficiência cardíaca, neurite e paralisia neural acompanhada de alterações metabólicas na forma de acidose lática e cetoacidúria de cadeia ramificada. Outras doenças por deficiência de vitamina B1 são a encefalopatia de Wernicke, síndrome de Korsakov e várias formas da paralisia de Landry. Uso pretendido: O kit de reagentes da Chromsystems para análise de Vitamina B1 em sangue total é uma ferramenta de diagnóstico in vitro para ser usado em laboratórios clínicos para a detecção da forma fisiologicamente ativa da vitamina B1 (tiamina pirofosfato, TPP) em amostras de sangue total através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O kit é desenvolvido para testes de pacientes cujos níveis de vitamina B1 requerem monitoramento. Princípio do kit: A cromatografia líquida de alta eficiência e um sistema apropriado otimizados oferecem a possibilidade de determinação direta de tiamina pirofosfato (TPP), a forma ativa da vitamina B1, em sangue total, assim eliminando erros associados ao ensaio. O presente método é rápido, simples e específico e requer um sistema de HPLC isocrático com detector de fluorescência. A derivatização usualmente pós-coluna utilizando extensivamente o equipamento é substituída por uma simples derivatização pré-coluna. O preparo de amostra é restrito a uma única etapa de precipitação após a adição do tampão de extração e subsequente derivatização em um frasco de reação. Uma coluna selecionada de HPLC e uma fase móvel otimizada para esta separação específica permitem uma quantificação segura e confiável.

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3 Sistema HPLC

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no Apêndice I.

3.1 Parâmetros do equipamento Um sistema simples, isocrático, com bomba de HPLC, injetor e detector de fluorescência é o requerido para a análise de vitamina B1. Fritas de metal na tubulação de entrada da bomba não são necessárias. Como solução para limpeza da agulha do injetor, uma mistura de água destilada pura com no máximo de 5% de metanol é recomendada. O uso de degaseificador de solventes previne bolhas de ar e garante uma linha de base estável. Ajustes do instrumento: Amostrador: Volume de injeção 50 µL, tempo de corrida analítica 6 min, compartimento deve ser protegido da luz. Razão de fluxo: 1,0 mL/min Temperatura da coluna: Temperatura ambiente (aprox. 20ºC) Detector fluorescência: EX = 367 nm, EM 435 nm Solução de limpeza da agulha (injetor): Água destilada com no máximo 5% de metanol

3.2 Coluna HPLC

A coluna HPLC para análise de vitamina B1 é fornecida equilibrada e testada, e está pronta para o uso. Ela não deve ser lavada com nenhuma outra solução. A contrapressão de uma coluna nova na razão de fluxo de 1,0mL/min é de cerca de 80 bar (1160 psi), valor que pode elevar com a idade ou uso da coluna. Enquanto as separações estiverem satisfatórias, a contrapressão elevada não tem importância. Um pré-filtro (artigo 15009 e 15010) ou uma pré-coluna (artigo 18001 e 18035) devem ser usados para prolongar a vida da coluna. Antes de iniciar uma análise: 1. Antes de instalar a coluna HPLC, lavar o sistema com aproximadamente 30 mL de fase móvel com razão de

fluxo de 1,3 mL/min; 2. Instalar a coluna e equilibrar o sistema com razão de fluxo de 1,0 mL/min por aproximadamente 15 -20 min, até

que a linha de base esteja estabilizada; 3. Injetar repetidamente o calibrador preparado, até que dois cromatogramas sucessivos apresentem picos com

tempo de retenção e área/altura praticamente idênticos; 4. Depois disso, a fase móvel pode ser recirculada.

3.3 Shut down Para períodos de shut down de até 1 dia, a fase móvel deve ser recirculada numa razão de fluxo baixa (aproximadamente 0,2 mL/min) para prevenir a cristalização de sais nos selos da bomba. A coluna HPLC permanece conectada, mas, para aumentar o tempo de vida da lâmpada, o detector deve ser desligado. Para longos períodos de desuso, a coluna HPLC deve ser desconectada. Limpeza ou conservação não é necessária. Armazenar a coluna na fase móvel a temperatura ambiente. A coluna deve ser substituída por uma união e o sistema HPLC limpo com cerca de 50 mL de H2O/metanol (90/10 vol/vol).

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4 Separação cromatográfica O tempo de retenção para a vitamina B1 na razão de fluxo de 1,0 mL/min é em torno de 3,2 min. A corrida cromatográfica dura aproximadamente 5 a 6 min (veja exemplos de cromatogramas no capítulo 13). Pequena variação nos tempos de retenção pode ocorrer, por exemplo, devido a flutuações na temperatura.

5 Preparo da amostra

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no capítulo 10.

5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes

A amostra é sangue total (EDTA), suspensão de eritrócitos. O sangue deve ser coletado pela manhã em jejum e antes de qualquer medicação. A amostra deve ser extraída com garroteamento leve e com cuidado para prevenir hemólise. Proteger as amostras da luz. Num frasco fechado as amostras são estáveis por 24 horas entre +2 a +8°C. Amostras que não forem analisadas imediatamente devem ser conservadas abaixo de -18 ºC e são estáveis por até 6 meses.

Atenção: É responsabilidade individual dos laboratórios usar todas as referências disponíveis ou seus próprios estudos para determinar critérios específicos de estabilidade para o seu laboratório.

5.2 Reconstituição do calibrador em sangue total

O calibrador (no. ordem 37008) é rastreável a substância de referência adquirida de fornecedor certificado. Após reconstituição, o calibrador é submetido ao mesmo processo de preparo das amostras de pacientes. O calibrador preparado é utilizado para calibrar o sistema. Para reconstituir o calibrador liofilizado, pipetar exatamente 1,0 ml de água destilada no frasco. Homogeneizar repetidamente por 10-15 minutos até que o conteúdo esteja homogêneo. A concentração atual depende do lote e será encontrada no folheto de informações que acompanha o calibrador.

Atenção: Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo resultados negativos para anticorpos HIV-1+2, HIV-, HCV- e HBV-DNA (PCR), antígeno HBs, anticorpos HBc, anticorpos HCV e TPHA. Como não existem métodos que dêem segurança absoluta de que produtos contendo materiais de fonte humana serão livres de agentes infecciosos, um possível risco de infecção deve ser levado em conta. Este produto também pode conter agentes desconhecidos e outros patógenos para os quais não existem testes aprovados. Nós assim recomendamos considerar todos os produtos contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.

Estabilidade do calibrador em sangue total reconstituído: O calibrador reconstituído é estável por até 24 horas quando mantido protegido da luz e refrigerado (+2 a +8°C). Por períodos maiores (até 3 meses) armazenar ultracongelado (abaixo de -18 ºC).

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5.3 Reconstituição dos controles

Os controles em sangue total (artigo 0033, 0034, 0035), são submetidos a todo o processo de preparo das amostras, do mesmo modo que as amostras de pacientes. Os controles são incluídos em cada série analítica, para monitorar a exatidão e a precisão do sistema. Para reconstituir o soro controle liofilizado, pipetar exatamente 2,0 ml de água destilada no frasco. Homogeneizar repetidamente por 10-15 minutos até que o conteúdo esteja homogêneo. A concentração atual depende do lote e será encontrada no folheto de informações que acompanha os controles.

Atenção: Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo resultados negativos para anticorpos HIV-1+2, HIV-, HCV- e HBV-DNA (PCR), antígeno HBs, anticorpos HBc, anticorpos HCV e TPHA. Como não existem métodos que dêem segurança absoluta de que produtos contendo materiais de fonte humana serão livres de agentes infecciosos, um possível risco de infecção deve ser levado em conta. Este produto também pode conter agentes desconhecidos e outros patógenos para os quais não existem testes aprovados. Nós assim recomendamos considerar todos os produtos contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.

Estabilidade do soro controle reconstituído: Os controles reconstituídos são estáveis por até 24 horas quando mantido protegido da luz e refrigerado (+2 a +8°C). Por períodos maiores (até 3 meses) armazenar ultracongelado (abaixo de -18 ºC).

5.4 Preparo do mix de derivatização 1. Primeiro reconstitua o conteúdo do frasco do Reagente de Derivatização 1 (artigo 35005) com exatamente 0,3

ml de água destilada. Mantenha refrigerado (+2 a +8°C), a estabilidade desta solução é de aproximadamente 2 semanas.

2. Misture 100 µl do reagente reconstituído com 2,0 ml do Reagente de Derivatização 2 (artigo 35006). Proporção

1:20.

3. Para cada amostra, 200 µl desta mistura (= mistura de derivatização) são usados no preparo.

Nota: O mix de derivatização deve ser preparado imediatamente antes do preparo das amostras. A temperatura ambiente, a estabilidade é de pelo menos 12 horas.

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5.5 Procedimento de preparo das amostras Num vial de reação âmbar, pipetar: 1. 200 µL de sangue total - EDTA (ou calibrador ou controle reconstituído)

+ 100 µL de Tampão de extração (artigo 37003) 2. Agitar por 2 s (vortex). 3. Adicionar 300 µL de Reagente de Precipitação (artigo 37004). 4. Agitar por 30 s (vortex). 5. Centrifugar por 5 min a 9.000 g.

Nota: Importante! Para obter uma derivatização satisfatória, não altere a seqüência dos passos seguintes.

6. Pipetar 200 µL do mix de derivatização (veja capítulo 5.4) num novo vial. 7. Adicionar 100 µL do sobrenadante e agitar brevemente. 8. Adicionar 100 µL de tampão de neutralização (artigo 35009). 9. Adicionar 100 µL de tampão de estabilização (artigo 35007) e agitar brevemente. 10. Deixar descansar por 20 min, então injetar 50 µL no sistema HPLC.

5.6 Estabilidade das amostras preparadas Preparadas como acima, as amostras são estáveis entre +2º a +8ºC aproximadamente 3 dias.

6 Calibração do sistema de análise Concentração do calibrador: A concentração de vitamina B1 (TPP) no calibrador depende do lote e será encontrada no folheto de informações que acompanha o padrão. Antes de iniciar a análise quantitativa de amostras de pacientes, é recomendado correr um cromatograma de calibração. Após a estabilização da linha de base, injete repetidamente 50 µL do calibrador preparado, e aguarde a separação. Para medir o equilíbrio do sistema, repetir esse processo até que dois cromatogramas sucessivos apresentem picos com tempo de retenção, resolução e área/altura praticamente idênticos (veja exemplos de cromatogramas no capítulo 13). Esses cromatogramas podem ser utilizados para definir corretamente os parâmetros de integração. O cromatograma da última injeção teste é usado para calibrar o sistema de análise de dados (software, integrador). Entre com o tempo de retenção obtido e a concentração do calibrador (veja folheto de informações) na tabela de análise.

Analito Tempo de Retenção Concentração

Tiamina pirofosfato (TPP) Aprox. 3,2 min Veja folheto de informações Para assegurar que nem a calibração nem as condições do HPLC (tempos de retenção, etc.) modificaram-se no decorrer da corrida analítica, o calibrador preparado deve ser injetado no curso da corrida e novamente no final. Escolha “Calibração Externa one-point” como método de integração.

7 Controle de Qualidade Precisão e exatidão podem ser monitoradas pela adição de controles adicionais em cada corrida analítica (Chromsystems Controles de Vitaminas B1/B2, artigo 0033). Caso a análise desses controles mostre resultados fora do intervalo fornecido nos folhetos de informação, o sistema deve ser avaliado, e, se necessário, recalibrado.

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8 Valores de referência As seguintes faixas de referência foram retiradas da literatura [5].

Analito Faixa de Referência

[µg/l] [nmol/l]

Tiamina pirofosfato (TPP) * 28-85 66.5-200

*Valores convertidos a partir da tiamina

9 Fatores de Conversão

Analito µg/L para nmol/L nmol/L para µg/L

Tiamina pirofosfato (TPP) x 2,357 x 0,424

10 Armazenamento e validade dos reagentes

Reagentes não abertos podem ser utilizados até a data de validade estabelecida no rótulo, desde que as condições de estocagem indicadas no rótulo sejam obedecidas. Condições de armazenamento dos reagentes:

Produto Armazenamento

Fase móvel +18° a +30°C

Tampão de Extração +18° a +30°C

Reagente de Precipitação +18° a +30°C

Reagente de Derivatização 1 +18° a +30°C

Reagente de Derivatização 2 +18° a +30°C

Tampão de Neutralização +18° a +30°C

Tampão de Estabilização +2 a +8 ºC

Padrão de Calibração em Sangue Total abaixo de -18 ºC

Controles nível I e nível II, em Sangue Total abaixo de -18 ºC

Os reagentes devem ser adequadamente fechados e armazenados nas condições estabelecidas imediatamente após o uso. Desde que nada além tenha sido estipulado, a estabilidade será de 1 ano após a data da abertura, mas, não excederá o prazo de validade. Para calibradores e controles, ver os capítulos 5.2 e 5.3.

11 Descarte de resíduos A Fase Móvel e o Reagente de Derivatização 2 contém solventes orgânicos. Descarte os resíduos dos produtos em um contêiner para solventes orgânicos livres de halogênio. O Reagente de Precipitação, o Tampão de Neutralização e os resíduos de espécimes preparados contêm ácidos fortes. Neutralize as soluções e descarte em um contêiner para soluções salinas. As soluções mencionadas não devem ser descartadas juntamente com lixo doméstico. Não circule no abastecimento principal de água. Descarte de acordo com a diretiva 2008/98/EC e de acordo com as exigências locais e nacionais. Os contêineres de lixo devem ser armazenados apropriadamente e o acesso só deve ser permitido a pessoas autorizadas.

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12 Exemplos de cromatogramas 12.1 Cromatograma de um calibrador em sangue total

12.2 Cromatograma de uma amostra de paciente

Tiamina difosfato: 74,4 µg/L

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13 Problemas e Soluções Problema Possível causa Solução

Flutuações na linha de base

Lâmpada do detector ainda não aquecida Lâmpada do detector velha Sistema ainda não equilibrado Fluxo inconstante

Aguardar Substituir a lâmpada Repetir a injeção do padrão até que dois cromatogramas consecutivos sejam quase idênticos Verificar a bomba do HPLC

Linha de base instável

Bomba do HPLC Ar no sistema Célula do detector contaminada Fase móvel contaminada

Verificar a bomba do HPLC (ar, selos) Degaseificar a fase móvel Limpar a célula Trocar fase móvel

Picos interferentes

Ar no sistema Injetor contaminado Frascos do amostrador automático contaminados Seringa de injeção contaminada Coluna HPLC contaminada Amostras não armazenadas adequadamente Reagente de derivatização muito velho

Degaseificar a fase móvel Limpar o injetor Usar frascos novos ou limpá-los com metanol Limpar a seringa com metanol Substituir a coluna Utilizar amostras recentes Preparar novos

Alargamento de picos, cauda

Coluna HPLC velha Substituir a coluna

Picos duplicados Volume morto nas conexões Volume morto na coluna HPLC

Substituir as conexões Substituir a coluna

Sem picos Vazamento no sistema Verificar o injetor, pressão

Sem sinal

Conexão com integrador ou impressora defeituosa ou interrompida Lâmpada do detector

Verificar o sinal do cabo e as conexões Verificar a voltagem da lâmpada, substituir se necessário

Sensibilidade diminuindo

Lâmpada do detector velha Célula do detector contaminada Válvula de injeção defeituosa

Substituir a lâmpada Limpar a célula Avaliar o injetor

Mudanças no tempo de retenção

Variações de temperatura Razão de fluxo instável pulsação da bomba Sistema não está equilibrado

Usar forno de coluna Avaliar bomba do HPLC Repetir a injeção do padrão até que dois cromatogramas consecutivos sejam quase idênticos

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14 Literatura

1. Bertelsmann Stiftung (Hrsg). Mineralstoffe, Spurenelemente und Vitamine – Klinische Aspekte und chemische Analyse, Verlag Bertelsmann Stiftung Gütersloh (1997).

2. Isler O, Brumacher G, Ghisla S, Kräuter B. Vitamine II. 2. Aufl, Georg Thieme Verlag Stuttgart, (1988).

3. Greiling H, Gressner AM (Hrsg). Lehrbuch der klinischen Chemie und Pathobiochemie. Schattauer Verlag Stuttgart, (1987).

4. Baltes W. Lebensmittelchemie. 2. Aufl, Springer Verlag Berlin (1989). 5. Krapf PE, Bieger WP, Tiller FW. Labordaten-Buch S. 361. Verlag Urban & Schwarzenber München

(1995).

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Apêndice I: Informações de segurança As seguintes informações devem ser observadas e as respectivas medidas de segurança deverão ser adotadas. Maiores informações podem ser obtidas nos respectivos folhetos de segurança dos materiais ou mediante solicitação.

Produto Risco

Fase móvel (artigo 35021, 35022)

Perigo H226 Líquido e vapor inflamáveis. H302+H312+H332 Tóxico por inalação, ingestão e contato com a pele. H370 Causa danos sérios aos órgãos. P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na face. P301+P312 Em caso de ingestão: ligue imediatamente para um centro de intoxicação ou médico. P302+P352 Em caso de contato com a pele: lave abundantemente com sabão e água. P403+P233 Armazenar em local bem ventilado. Manter bem fechado.

Reagente de Precipitação (artigo 37004)

Perigo H272 Pode intensificar o fogo; oxidante. H290 Pode ser corrosivo a metais. H314 Causa queimaduras severas e danos aos olhos. P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na face. P305+P351+P338 Em caso de contato com os olhos: Lave cautelosamente com água por vários minutos. Remova lentes de contato, se presentes e de fácil remoção. Continue lavando. P309+P311 Em caso de acidente ou mal estar, procurar auxílio médico imediatamente, de preferência levar esse manual. P301+P330+P331 Em caso de ingestão: lave a boca. Não induza ao vomito.

Reagente de Derivatização 2 (artigo 35006)

Perigo H226 Líquido e vapor inflamáveis. H290 Pode ser corrosivo a metais. H301+H311+H331 Tóxico por inalação, ingestão e contato com a pele. H314 Causa queimaduras severas e danos aos olhos. H370 Causa danos aos órgãos. P210 Mantenha distância do calor, superfícies quentes, faíscas chamas abertas e outras fontes de ignição. Não fume. P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na face. P301+P310 Em caso de ingestão: ligue imediatamente para um centro de intoxicação ou médico. P305+P351+P338 Em caso de contato com os olhos: Lave cautelosamente com água por vários minutos. Remova lentes de contato, se presentes e de fácil remoção. Continue lavando. P301+P330+P331 Em caso de ingestão: lave a boca. Não induza

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ao vomito. P403+P233 Armazenar em local bem ventilado. Manter bem fechado.

Reagente de Estabilização (artigo 35007)

Perigo H318 Causa danos sérios aos olhos. P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na face. P305+P351+P338 Em caso de contato com os olhos: Lave cautelosamente com água por vários minutos. Remova lentes de contato, se presentes e de fácil remoção. Continue lavando. P313 Em caso de acidente ou mal-estar, procurar auxílio médico imediatamente, de preferência levar esse manual. P332+P313 Em caso de irritação na pele: Procure atenção médica.

Tampão de Neutralização (artigo 35009)

Perigo H290 Pode ser corrosivo a metais. H315 Causa irritação na pele. H319 Causa irritação séria aos olhos. P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na face. P305+P351+P338 Em caso de contato com os olhos: Lave cautelosamente com água por vários minutos. Remova lentes de contato, se presentes e de fácil remoção. Continue lavando. P309+P311 Em caso de acidente ou mal-estar, procurar auxílio médico imediatamente, de preferência levar esse manual. P332+P313 Em caso de irritação na pele: Procure atenção médica.

Esses componentes não são classificados como perigosos de acordo com a legislação da União Europeia: Tampão de extração (artigo 37003) Reagente de derivatização 1 (artigo 35005) Padrão de calibração em sangue total (artigo 37008) Controles em sangue total (artigo 0033, 0034, 0035)

Apêndice II: Cálculo Manual Para o cálculo manual os seguintes dados são necessários: Área/altura do pico do analito A no cromatograma da amostra

= AAmostra

Área/altura do pico do analito A no cromatograma do calibrador

= ACalibrador

Concentração C do analito A no calibrador (veja folheto de informações) =CCalibrador

A concentração do analito A na amostra CAnalito,Amostra é então calculada como a seguir:

CAnalito,Amostra [µg/L] = ____AAmostra x CCalibrador ACalibrador

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Apêndice III: Validação Para verificar a linearidade e validar o método, amostras de sangue total foram preparadas com quantidades definidas de tiamina pirofosfato. Múltiplas alíquotas destes preparos foram sujeitas ao processo de preparação. Recuperação A recuperação analítica foi determinada a partir do slope da curva de calibração de amostras de sangue total e soluções de padrão diluídas.

Analito Recuperação [%]

Tiamina pirofosfato 91

Linearidade e menor limite de quantificação (LLOQ): A linearidade foi determinada por múltiplos preparos da amostra de sangue. O limite de quantificação foi determinado pela diluição definida do controle nível I (0034) com solução de fosfato tamponada com cloreto de sódio. Este método é linear a partir do menor limite de quantificação (LLOQ) a concentração indicada.

Analito LLOQ [µg/l] Faixa linear [µg/l]

Tiamina pirofosfato 0.8 Até pelo menos 750

Precisão intra-ensaio: A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada a partir da média e coeficiente de variação de múltiplos preparos (n=10) de uma mesma amostra e a determinação da concentração de tiamina pirofosfato em 3 diferentes concentrações:

Analito Coeficiente de variação (%) (concentração em µg/)

n=10 n=10 n=10

Tiamina pirofosfato 2.8 (24.5) 4.0 (93.3) 4.9 (35.6)

Precisão inter-ensaio: A determinação da precisão inter-ensaio foi realizada a partir de 10 preparos e determinação da concentração do analito em pool de sangue total em 10 diferentes séries de testes.

Analito Coeficiente de variação (%) (concentração em µg /L)

n = 99 n = 99 n = 100

Tiamina pirofosfato (TPP) 4.6 (24.0) 4.7 (96.0) 4.3 (36.5)

Página 16 IM 35000 Vitamin B1 EN 10/2015 R4

Apêndice IV: Declaração de Conformidade