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Manutenção de cepas para controle de qualidade em

microbiologia clinica

Carmen Paz OplustilAgosto 2011

carmen.oplustil@formatoclinico.com.br

Objetivo

• Manter as diversas cepas para o controle de qualidade interno de forma segura para garantir a qualidade dos processos.

Tipos de Cepas vamos manter

• Cepas de coleções conhecidas de referência

• Cepas isoladas no laboratório

• Cepas recebidas como controle externo da qualidade

Muitos nomes, mesmo significado

• Culturas padrão• Cepas padrão• Cepas controle• Cepas de referência• Culturas de referência• Cepas de teste • Cepas de controle de qualidade

ATCC

Cepas da rotina

Manutenção de cepas por curto período de tempo

• Meios mais utilizados para a manutenção: Tryptic Soy Broth (TSB), caldos nutrientes (BHI, Brucella) ou somente água destilada estéril, podendo ou não conter crioprotetores.

• Subcultivos periódicos - Cepas de enterobactérias, Staphylococcus spp. e Enterococcus spp. se mantém viáveis por este método por aproximadamente 6 meses

• Óleo mineral estéril – associado a um meio • Freezer - 20°C – meio é importante• Disco de papel-filtro estéril – fungos e bactérias esporuladas• Água mineral sem gás estéril – Microrganismos como Legionella spp e

bacilos gram-negativos não fermentadores, preservam bem nessas condições por aproximadamente 1 ano

• Solução fisiológica estéril - Cepas de EPEC, EIEC, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. empregadas no controle de qualidade dos anti-soros

Manutenção de cepas por longos períodos de tempo

• Liofilização • Temperaturas ultra-baixas • Crioprotetores – glicerol e DMSO, 5 -10% v/v

do meio

Tabela 29.1 – Procedimentos utilizados para a manutenção de microrganismos. Microrganismos Métodos de Crioprotetores Temperatura Tempo aproximado de estocagem de estocagem preservação do microrganismo

Bactérias Freezer Glicerol ou skim milk – 20°C 1 - 3 anos gram-positivas

Freezer Skim milk, glicerol – 70 a –196°C 1 a 30 anos

Liofilização Skim milk 2 a 8°C 30 anos

Subcultivos Nenhum 2 a 8°C 2 a 3 meses

Bactérias Freezer Glicose – 20°C 1 a 2 anos esporuladas

Freezer Skim milk, glicose – 70 a –196°C 3 a 30 anos

Liofilização Skim milk + lactose 2 a 8°C 30 anos

Streptococcus Freezer Skim milk – 20°C 2 meses

Freezer Skim milk – 70 a –196°C 2 meses a 1ano

Liofilização Skim milk 2 a 8°C 6 meses a 30 anos

Mycobacterium Freezer Skim milk – 20°C 3 a 5 anos

Freezer Skim milk – 70 a –196°C 3 a 5 anos

Liofilização Skim milk 2 a 8°C 16 a 30 anos

Bactérias Freezer Sacarose, lactose – 20°C 1-2 anos gram-negativas

Freezer Sacarose, lactose, – 70 a –196°C 2 a 30 anos glicerol ou skim milk

Liofilização Skim milk, lactose, 2 a 8°C 30 anos sacarose

Subcultivo Nenhum TA 1-3 meses

Leveduras Água destilada Nenhum TA 1-2 anos

Fungo Subcultivo Nenhum 4 a 25°C 2 a 10 anos filamentoso

Freezer Glicerol, DMSO –70 a –196°C 2 a 30 anos

Liofilização Glicerol, DMSO, 2 a 8°C 2 a 30 anos (formadores sacarose, skim milk de esporos)

Adaptada de: PETTI, CA. Procedures for the Storage of Microrganisms. In: Manual of Clinical Microbiology / editor in chief, Patrick R. Murray; editors, Ellen Jo Baron[et al], 9th Edition, v. 1, 2007. DMSO = dimetil-sulfóxido; TA = temperatura ambient

Livro: Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica 3ed. 2010

Cepas de referência

• As mais conhecidas são as cepas ATCC (American Type Culture Collection)

Apresentação das cepas de referência

• Em swab• Liofilizados

Manuseio das cepasDefinições

• Cepas ATCC – subcultivadas para criar as culturas de estoque

• Culturas de estoque são subcultivadas para criar as culturas de trabalho

• Culturas de trabalho são mantidas em tubos com meio de cultura para os testes do dia a dia

• Subcultura – é 1 passagem• Passagem – transferência de bactérias de uma cultura

fresca para um novo meio de cultura. Cada transferência é um subcultivo que corresponde a uma passagem

Manuseio das cepasDefinições

• Uma passagem é definida como o crescimento do microrganismo em meio de cultura sólido ou líquido.

• Ressuscitar um microrganismo congelado ou liofilizado por descongelamento ou hidratação não é considerado uma passagem.

• Subcultivar um microrganismo ATCC congelado ou liofilizado para fazer a cultura estoque é considerado a primeira passagem.

• Subcultivar esta cultura de estoque é considerada a segunda passagem

• Subcultivos subsequentes são consideradas passagens.

Esquema de manuseio das cepas de Referência

0 passagem

2 passagem

2 passagem

4 passagem

3 passagem

2 passagem

3 passagem

1 passagem

Microbiologics

1 geração

3 geração

2 geração

4 geração

Importante

• ATCC recomenda que as cepas sejam utilizadas até 5 passagens a partir da cepa ATCC.

Empresas com licença para comercializar cepas ATCC

• www.atcc.org

• Microbiologics (PlastLabor)

Pontos importantes

• Cepas ATCC comercializadas por empresas que não a própria ATCC estão em geral, a 1 ou 2 passagens da cepa de referência.

• Verificar cuidadosamente a bula do produto adquirido.

• Sempre verificar se a cepa adquirida é da ATCC• Não existe “similar a ATCC” como sendo ATCC.

Outras cepas de referência

www.wfcc.info

www.ukcc.co.uk

www.formatoclinico.com.br

Dúvidas ?

Obrigada pela oportunidade!