NATAL / RN

2016

ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS

XRCC1, TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS

CLINICOPATOLÓGICAS E SOBREVIDA EM CARCINOMA

EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL

MELKA COÊLHO SÁ

MELKA COÊLHO SÁ

ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS

XRCC1, TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS

CLINICOPATOLÓGICAS E SOBREVIDA EM CARCINOMA

EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL

NATAL / RN

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

ASSOCIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS XRCC1,

TFIIH E XPF COM CARACTERÍSTICAS CLINICOPATOLÓGICAS E

SOBREVIDA EM CARCINOMA EPIDERMOIDE DE LÍNGUA ORAL

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Patologia Oral.

Orientadora: Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas

NATAL / RN

2016

Sá, Melka Coêlho.

Associação da imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH E XPF com caracte-

rísticas clinicopatológicas e sobrevida em carcinoma epidermoide de língua oral /

Melka Coêlho Sá. – Natal, RN, 2016.

109 f.: il.

Orientadora: Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas.

Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.

1. Carcinoma de células escamosas – Tese. 2. Neoplasias bucais– Tese. 3.

Reparo do DNA – Tese. 4. Dano ao DNA– Tese. I. Freitas, Roseana de Almeida. II.

Título.

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

“Por causa da tua palavra, lançaremos as redes” (Lc 5,1-11)

DEDICATÓRIA

Ao Deus que se faz morada em cada ser humano,

Aos meus ex, futuros e eternos alunos e pacientes.

“Eu vi um menino correndo.

Eu vi o tempo brincando ao redor do caminho daquele menino.

Eu pus os meus pés no riacho e acho que nunca os tirei.

O sol ainda brilha na estrada eu nunca passei.

Eu vi a mulher preparando outra pessoa.

O tempo parou pra eu olhar para aquela barriga.

A vida é amiga da arte. É a parte que o sol me ensinou.

O sol que atravessa essa estrada que nunca passou.

Por isso uma força me leva a cantar.

Por isso essa força estranha no ar.

Por isso é que eu canto, não posso parar.

Por isso essa voz tamanha.

Eu vi muitos cabelos brancos na fronte do artista o tempo não para e, no entanto,

ele nunca envelhece.

Aquele que conhece o jogo, do fogo das coisas que são.

É o sol, é a estrada, é o tempo, é o pé e é o chão.

Eu vi muitos homens brigando. Ouvi seus gritos.

Estive no fundo de cada vontade encoberta, e a coisa mais certa de todas as

coisas. Não vale um caminho sob o sol.

E o sol sob a estrada, é o sol sobre a estrada, é o sol.”

(Força Estranha, Caetano Veloso)

AGRADECIMENTOS

Gratidão, virtude dos sábios, foi e é um sentimento presente em toda minha jornada acadêmica e vida. Entendo que minha jornada no Programa de Pós Graduação em Patologia Oral foi iniciada antes mesmo de morar em terras potiguares, recebi estímulos: positivos e desafiadores. Neste momento, sinto-me confortável em expor meus agradecimentos, que não serão breves. Primeiramente gostaria de agradecer às minhas fontes inspiradoras e motivacionais: a Deus que em seu mistério trino se faz presente em cada pessoa e inspira o surgimento de dons diversos; à minha família (nuclear e comunitária) e aos meus mestres Profª. Drª. Marcoeli, Prof. Dr. Jorge D’Alburqueque Lossio, Profª Teresinha Rego, Prof. Dr. Amilton Raposo e Profª Drª Roseana de Almeida. Antes mesmo de conhecê-los, já rezava por cada e Deus que sempre atende as minhas orações, destinou-me profissionais éticos, dedicados, zelosos e prudentes que são meus espelhos de carreira acadêmica e de vida. Sou “pupila” de grandes EDUCADORES. De cada um guardo experiências incríveis, o que me destina a responsabilidade e o desafio de tornar-me educadora segundo seus ensinamentos e exemplos. Obrigada mestres, por assumirem com amor suas vocações! Esta pesquisa, bem como toda a minha vida profissional, só foi realizada por existir uma imensa fonte de estímulo: o Deus que se fez presente em cada um dos meus ex alunos e pacientes, neste grupo por ter tido contato com alguns incluo os pacientes que foram objeto desta pesquisa. Experiências construtivas que me despertaram o exercício da docência buscando postura ética e humana. Agradeço também aos meus futuros alunos e pacientes, busco aprimoramento profissional para poder oferecer trabalho de qualidade. Compartilho o pensamento do meu pastor amigo, Pe Tony: “ a sociedade espera de cada profissional postura ética, primor no exercício laboral e responsabilidade pelo produto do seu trabalho”. Sou reflexo do conjunto de experiências que presencie, das amizades que construí e principalmente das circunstâncias que superei. Não possuo uma história de vida de privações pois todos meus familiares não poupam esforços para o meu conforto, diferente da história de vida do meu pai, minha mãe, tios, tias e avôs. Presencie a FOME, a DOR e a SEDE em vários momentos compartilhados com meus pacientes e alunos. Verdadeiramente não há experiência mais reveladora do que a da miséria e do poder transformador da educação. O solo rachado da seca, enchentes, violência, drogas, dificuldades financeiras nada disso foi capaz de apagar o brilho nos olhos de alunos e pacientes ávidos por conhecimento. Este brilho nos olhos era muito além do encantamento era a percepção da mudança que estava ocorrendo em cada um juntamente com o empoderamento do conhecimento e no descobrir-se como protagonista de sua própria vida. Educação, para mim é um tema muito familiar, minhas avós e tias avós dedicavam-se nos meus estudos. No entanto até o meu primeiro contato com a sala de aula, não imaginava que possuía dom para docência. Foram meus alunos que me revelaram a esta vocação. Sempre pensei em ser dentista clínica. Mestrado? Planejamento estratégico? Sala de aula? Doutorado? Nada disso estava nos meus planos.

Não foram as forças das circunstancias que me levaram a realizar mestrado e doutorado. Foi a força da decisão de entregar a minha vida a Deus e deixar-se direcionar pelos caminhos divinos. A fé foi e é uma companheira fiel, quando me falta este combustível possuo uma legião de amigos que oram por mim. Agradeço profundamente a todos meus amigos, anjos intercedores, que pela força de suas orações, palavras amigas e de apoio auxiliaram nos momentos difíceis na trajetória do doutorado. Obrigada a minha amiga-irmã Ana Patricia, a minha chefa Jamilla Mirck, a minha melhor aquisição de 2010 – Joseana Leitão, a prima Bárbara, a minha mãe Concita, a meu pai João, a Rafaella, ao João, aminha sobrinha Ava Beathriz, aos meus primos-irmãos (Almir, Lucas, Iago e Goeth), as minhas madrinhas (Karla e Mercedes), aos amigos da Pastoral da Juventude de Teresina – em especial aos irmãos de fé do MANÁ, ao meu best friend pe Luis Eduardo, ao pe Tony, ao Don Juarez, aos amigos do PSF48, a Carolina Tavares, a Luciana Azevedo, aos amigos do mestrado da UFPI , ao meu namorido Victor e a minha nova família baiana e paraibana. Vocês aquecem meu coração e iluminam minha vida. Na primeira vez que conheci o Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral fui apresentada à alegria e ao entusiasmo de Prof. Roseana. Lembro-me de cada detalhe de nossa conversa, mas o que mais me marcou em nosso primeiro encontro foi o zelo, o carinho e dedicação que a minha futura orientadora depositava na conversa. Não, eu não fui encantada, naquele momento eu percebi que aquele brilho no olhar dos meus alunos também estava nos olhos de Prof.ª Roseana. Gostaria de agradecer a minha orientadora por manter este brilho no olhar, por ter depositado confiança, pelos conselhos e principalmente pelo exemplo de vida. Parafraseando pe Tony: “Conselhos ajudam, mas o exemplo arrasta!” A Sra. possui atitudes coerentes com seus ensinamentos. Obrigada Agredeço especialmente ao Prof. Dr. Leão pelos ensinamentos e por todos os cafés e conversas prazerosas que tivemos, nas pessoas do Prof. Dr. Leão e da Profª Drª Lélia Batista, agradeço a todos os professores (Prof. Dr. Costa, Profª Drª Hebel, Prof. Dr. Carlos, Profª. Drª. Ericka, Prof. Dr. Manoel, Profª Drª Lelia Maria, Profª Drª Ana Miriam, Profª Drª Marcia, Profª Drª Patricia, Prof. Dr. Bruno) e funcionários (Lourdes, Gracinha, Hévio, Ricardo e Sandra) do Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN que com dedicação edificam nossa querida pós, neste agradecimento faço extensão ao Prof. Kenio, Prof. Noro (entusiasta da formação e educadores), aos funcionários do Departamento de Odontologia e a todos do Laboratório de Bioquímica e do Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutico (Tecbiofar), pessoas com quem tive o prazer de conviver. Obrigada especialmente a Sandrinha por sempre ter uma conversa prazerosa e abraço confortante. Agradeço carinhosamente aos alunos (Denise Helén, Ana Luisa, Clarissa, Natália, Roseane, Jamille, Francisco Jadson, Edilmar, Fernanda, Vilson, Laura, Laudenice, Marcelo, Tiago, Andreia, Viviane, Maria Luiza, Luciana, Salomão, Rafaela, Eduardo, Luis Arthur, Thalita, Leorik, Mara, Mariana, Rodrigo, Hugo, Amanda, Angelica, Jefferson) e ex alunos (Aguida, Felipe, Emilia, Ana Rafaela, Fernando, Rodrigo,

Marcelo, Stefania, Maiara, Nazareno, Adriana, Keila Martha, Joabe, Emeline) do Programa por compartilhar: lar, cafés, estímulos, tempo, conhecimentos,dificuldades, receitas, canetinhas, viagens, quarto, abraços, missas, orações, sorrisos, academia, almoço, livros, lágrimas, gritos, angústias, saidinhas, saladas, aulas, filmes, caronas, histórias, orientador, decepções, embriaguez, alegrias, tristezas, “orgasmos” científicos, vitórias, sorvete, finais de semana, material da arquivologia, dúvidas, bebidas, beijos, armário e fotos (muitas fotos). Formamos verdadeiramente uma família “patológica”. Preciso fazer destaque aos meus amigos irmãos acolhedores. Keila Martha que me apresentou carinhosamente o universo chamado “patox”, sua dedicação é inspiradora, amiga obrigada! Joabe, cristão impar, amigo das horas difíceis e fáceis obrigada pela amizade e companheirismo. Maria Luiza é a minha prima “mutada”, pessoa de simpatia única que emana harmonia, paciência, perseverança e tranquilidade. Sempre com atitudes positivas me ajudava nas inúmeras dificuldades, enfrentamos juntas o desafio da descrição da morfologia das lesões, a estatística e a ansiedade do nosso futuro. Thalita é uma irmã especial, agradeço pelo entusiasmo, dedicação e prior depositado nas pesquisas que realizamos juntas. Desejo que estes anos compartilhados sejam o início de nossa parceria, as maranhenses vão dominar o mundo. Tereza de Lisiex, Felipe, Stefânia, Barbara, Natália e Viviane obrigada pela convivência fraterna em nosso lar. Agradeço a Capes e ao Cnpq pelo custeio desta pesquisa Por fim, mas não menos importante, agradeço a todos que compõem a Liga Norte Riograndense Contra o Câncer: pacientes, funcionários (Narjara, Michelle, Eduardo, Renata) e voluntários. O rigor técnico, ambiente profissional e extremo zelo pelo bem-estar do paciente são apenas algumas características que merecem destaque nos hospitais da Liga. Estas características são inspiradoras para minha atuação profissional. Aqueles corredores me trouxeram à memória momentos que já vivencie, a coesão da equipe lembrava-me locais onde já trabalhei, o estímulo dos funcionários lembrava-me o brilho no olhar dos alunos no primeiro dia de estágio, o sucesso de um tratamento era a alegria de uma vitória profissional e pessoal. No entre e sai das salas, visualizava o futuro e o presente, algumas vezes a morte e a ausência eram mais presentes. No exercício do desapego, tenho a necessidade de fazer o meu melhor hoje, pois o presente é a nossa dádiva divina.

RESUMO

RESUMO

Sistemas de reparo do DNA, genes e proteínas, são essenciais para manutenção da

integridade do genoma, evitando graves doenças como o câncer. Desrregulação na

expressão destas proteínas vem sendo associado tanto ao risco do desenvolvimento,

como na evolução de variados cânceres humanos com destaque para o carcinoma

epidermoide oral. O objetivo deste trabalho foi analisar a imunoexpressão das

proteínas de reparo do DNA, XRCC1, THIIF e XPF em carcinoma epidermoide de

língua oral (CELO) e investigar associação com parâmetros clínicos, histopatológicos,

de desfecho e sobrevida em cinco anos. Setenta e quatro casos de CELO foram

analisados por meio da técnica da imuno-histoquímica de forma semiquantitativa.

Observou-se alta expressão das proteínas pesquisadas nas células parenquimatosas,

identificando associação significativa da elevada expressão de XRCC1 com melhor

estadiamento clínico (p=0,02). A regressão de Cox revelou tamanho do tumor

(p<0,01), comprometimento linfonodal (p=0,04), estágio do tumor (p=0,02) e

profundidade de invasão >4mm (p=0,05) como fatores prognósticos para CELO. Os

resultados deste experimento sugerem que as proteínas XRCC1, TFIIH e XPF

participam do processo de tumorigênese, entretanto a imunoexpressão das mesmas

não pode ser utilizada como indicador independente de prognóstico para CELO.

Palavras-chave: Carcinoma epidermoide oral, Reparo de DNA; XRCC1; TFIIH; XPF

ABSTRACT

ABSTRACT

DNA repair systems, genes and proteins are essential for genome integrity

maintenance, avoiding serious diseases such as cancer. Deregulation in the

expression of those proteins has been associated with both the risk of development

and evolution of various human cancers, including oral squamous cell carcinoma. The

purpose of this study was to analyze the immunoreactivity of the DNA repair proteins

XRCC1, THIIF and XPF in oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) and to

investigate its association with clinical and histopathological parameters, outcome and

5-year survival rate. Seventy-four cases of OTSCC were analyzed semi-quantitatively

through immunohistochemistry. We observed that DNA repair proteins were highly

expressed in parenchymal cells; however, we only observed a significant association

between XRCC1 high expression and better clinical staging (p=0,02). Cox regression

showed that tumor size (p<0,01), lymph node involvement (p=0,04), tumor stage

(p=0,02) and depth of invasion> 4mm (p=0,05) were prognostic factors. The results of

this experiment suggest that XRCC1, TFIIH and XPF participate in the tumorigenic

process, however, their immunoexpression may not be used as an independent

prognostic indicator for OTSCC.

Keywords: Oral Squamous Cell Carcinoma; DNA Repair Gene; XRCC1; TFIIH; XPF

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Esquema da via de reparo de DNA por excisão de base (CHRISTMANN et al., 2003)

40

Figura 2 Esquema da via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeo (CHRISTMANN et al., 2003)

42

Figura 3 Casos de carcinoma epidermoide de língua oral registrados, entre janeiro de 2001 a dezembro de 2010, no arquivo da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer segundo seleção para o estudo. Natal- RN, 2016

58

Figura 4 Carcinoma epidermoide de língua oral - parâmetros de análise histopatológicos propostos por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015): (A) invasão perineural (barra de escala 100µm); (B) pouco infiltrado inflamatório (barra de escala de 200µm);(C) Padrão de invasão tipo 5 (barra de escala 500µm); (D) Profundidade tumoral de 14.300,75 µm (barra de escala 5000 µm); (E e F) tumor budding, barra de escala 100µm. Natal – RN, 2016 (Pannoramic Viewer, H/E)

62

Figura 5 Carcinoma epidermoide de língua oral – (A) Elevada

imunomarcação para XRCC1 no front tumoral; (B) Detalhe da

imunoexpressão da proteína XRCC1 em núcleo; (C) Elevada

imunomarcação para TFIIH no front tumoral ; (D) Detalhe da

imunoexpressão da proteína TFIIH em núcleo e citoplasma; (E)

Elevada imunomarcação para XPF no front tumoral ; (F) Detalhe da

imunoexpressão da proteína XPF em núcleo e citoplasma (A,C,D

barra de escala identificando valor de 1000µm; B,E,F barra de

escala identificando 100 µm, Pannoramic Viewer, HIDEF)

64

Figura 6 Sobrevida global dos pacientes com carcinoma epidermoide de língua oral selecionados para o estudo. Natal – RN, 2016

65

Figura 7 Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as co-variáveis (A) gênero, (B) idade, (C) tamanho do tumor (T), (D) comprometimento linfonodal no diagnóstico (N), (E) estadiamento clínico TNM e (F) a presença de metástase linfonodal com confirmação histopatológica em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

66

20

Figura 8 Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as

co-variáveis (A) tratamento e (B) recidiva loco-regional em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

67

Figura 9 Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) invasão perineural, (B) infiltrado inflamatório, (C) padrão de invasão, (D) gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler et al. (2005. Natal – RN, 2016

69

Figura 10 Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) tumor budding, (B) profundidade e (C) gradação final pelo sistema de Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016

70

Figura 11 Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as covariáveis da imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (A) XRCC1, (B)TFIIH e (C) XPF nas células do front tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

72

Quadro 1 Sistema de gradação de malignidade recomendado por

Brandwein-Gensler et al. (2005)

52

Quadro 2 Parâmetros histopatológicos avaliados no modelo de gradação BD proposto por Almangush et al. (2015)

53

Quadro 3 Clone, especificidade, fonte, diluição, recuperação antigênica e incubação dos anticorpos primários

54

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016

59

Tabela 2 Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016

60

Tabela 3 Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016

61

Tabela 4 Análise da imunorreatividade das proteínas XRCC1,TFIIH e XPF dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

63

Tabela 5 Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordoo com parâmetros clínico e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal –RN, 2016

68

Tabela 6 Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com parâmetros de análise histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015). Natal –RN, 2016

71

Tabela 7 Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com os parâmetros de expressão das proteínas de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) nas células do front tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

72

Tabela 8 Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase linfonodal, o tratamento,a presença de recidiva loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2016

74

Tabela 9 Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral que possuem cinco anos de acompanhamento, de acordo com a gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al. (2005) e por Almangush et al. (2015) e a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) Natal – RN, 2016

75

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AP - Apurínico ou apirimidínico

ADH - Enzima álcool desidrogenase

ADP-Ribose - Adenosina difosfato, do inglês “adenosine diphosphate ribose”

APEX1 – Apurinico/apiridinico endonuclease 1, do inglês “apurinic/apyrimidinic

endonuclease 1”

BER - Reparo de excisão de base; do inglês “base excision repair”

CEO - Carcinoma epidermoide oral

CELO- Carcinoma epidermoide de língua oral

CSA - Síndrome de cockayne grupo A, do inglês “cockayne syndrome group A”

CSB - Síndrome de cockayne grupo B do inglês “cockayne syndrome group B”

DNA – Ácido desoxirribonucleico; do inglês “deoxyribonucleic acid”

ERCC1 – Excisão reparação grupo cross-complementação 1, do inglês “excision

repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1”

ERCC2 – Excisão reparação grupo cross-complementação 2, do inglês “excision

repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 2”

ERCC4 - Excisão reparação grupo cross-complementação 4, do inglês “excision

repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 4”

FANCD2 – Anemia Fanconi complemento D2; do inglês “fanconi anemia

complementation group D2”

FEN – Enzima endonuclease flap1; do inglês “flap structure-specific endonuclease”

GGR- Reparo do genoma global, do inglês “global genome repair”

HPV - Papiloma Vírus Humano

HR – do inglês “hazard ratio”

HR – Reparo por recombinação; do inglês “homologous recombination’

HR23B – Proteina Rad23 homologa B; do inglês“RAD23 homolog B protein”

IC- Intervalo de confiança

MAPKAP – Proteína quinase mitogênica ativada pela quinase; do inglês “ mitogen-

activated protein kinase-activated protein kinase”

MLH1 – do inglês “mut-L homologin 1 “

MMR - Reparo de mal pareamento; do inglês “mismatch repair”

mRNA- Ácido ribonucleico mensageiro; do inglês “messenger ribonucleic”

MSH2 – do inglês “mismatch repair protein 2”

MUS81 – do inglês “ MUS81 Structure-Specific Endonuclease Subunit”

NER - Reparo de excisão de nucleotídeo; do inglês “nucleotide excision repair”

NHEJ- Junção de pontas não homólogas; do inglês “non-homologous end joining”

OGG1 - 8-oxoG-DNA glicosilase

OR – do inglês odds ratio

pb- pares de base, do inglês “pair base”

PAR - do inglês, “protein accretion rate”

PARP – do inglês, “ poly- (ADP-ribose) polymerase”

PARP1- Polymerase 1; do inglês “poly ADP-ribose”

PCNA- do inglês, “proliferating cell nuclear antigen”

Polβ - do inglês “polymerase (DNA directed), beta”

RhoA - do inglês, “ras homolog family member A”

Rac- do inglês, “Ras-related protein Rac”

Rad S- do inglês, “DNA repair exonuclease RadS homolog”

Rad 1- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad1 homolog”

Rad53- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad53 homolog”

Rad15- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad15 homolog”

Rad 16- do inglês, “DNA repair exonuclease Rad16 homolog”

RNA- Ácido ribonucleico; do inglês “ribonucleic acid”

RNA polII- RNA polimerase II

ROS- Espécies reativas de oxigênio do inglês, “reactive oxygen species”

RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase

TA - Temperatura ambiente

TCR- Reparo acoplado à transcrição

TDP1- do inglês “tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1”

TEM- Transição epitélio-mesenquimal

TFIIH – Fator de transcrição IIH; do inglês transcription factor II H

Tg – Timina glicol

TNM - Tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo regional e envolvimento por

metástase à distância; do inglês tumor-node-metastasis

UV- ultra violeta

XP - do inglês “Xeroderma pigmentosum complementary”

XPA - do inglês - “Xeroderma pigmentosum complementation group A”

XPB- do inglês -“Xeroderma pigmentosum complementation group B”

XPC- do inglês “Xeroderma pigmentosum complementation group C”

XPD - do inglês “Xeroderma pigmentosum complementation group D”

XPF - do inglês “Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency,

complementation group F”

XPG - do inglês, “Xeroderma pigmentosum complementation group G”

XRCC1 - do inglês, “X-ray repair cross-complementing group 1”

yH2AX - do inglês, “ gama histon H2AX”

3’-AP liase – b-liase do inglês “3' AP-endonucleases ou AP-liases”

8-oxoGuo - 8-oxo-7,8-diidroguanosina

SUMÁRIO

SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 276

2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 29

2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL (CEO) ................................... 30 2.2 MECANISMOS DE REPARO DO DNA ........................................... 36 2.1.1 Proteínas do reparo do DNA por excisão de base ............... 39 2.1.2 Proteínas do reparo do DNA por excisão de nucleotídeo .. 41

3 PROPOSIÇÃO .............................................................................................. 48

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 49

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ........................................................... 50 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO .................................................. 50 4.3 POPULAÇÃO .................................................................................. 50 4.4 AMOSTRA ....................................................................................... 50

4.4.1 Critérios de inclusão ........................................................ 50 4.4.2 Critérios de exclusão ....................................................... 51

4.5 COLETA DE DADOS CLÍNICOS ..................................................... 51 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO .............................................................. 51 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ................................................. 53

4.7.1 Técnica de coloração imuno-histoquímica .................... 53 4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ............................ 55

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................. 55 4.8.1 Análise de sobrevida ....................................................... 55 4.8.2 Análise de desfecho ........................................................ 56

5 RESULTADOS .............................................................................................. 58

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................... 58 5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS .................................................. 60 5.4 ANÁLISE DE SOBREVIDA .............................................................. 65 5.5 ANÁLISE DE DESFECHO ............................................................... 73

6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 77

7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 85

8 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 87

APÊNDICES .................................................................................................... 95

ANEXO .......................................................................................................... 103

26

INTRODUÇÃO

27

1 INTRODUÇÃO

Agentes carcinogênicos provocam agressões ao DNA que podem resultar

alterações celulares determinando ganhos e perdas de propriedades, resultando na

aquisição de fenótipo maligno. O câncer oral está entre as dez neoplasias malignas

de maior incidência na população mundial, onde 95% correspondem ao carcinoma

epidermoide oral (CEO). Apesar de todo o avanço no conhecimento científico e

desenvolvimento tecnológico, este câncer ainda apresenta elevadas taxas de

morbidade e mortalidade atribuídas, segundo Tseng et al. (2015), a fatores como

diagnóstico tardio, comprometimento linfonodal e altas taxas de recorrências.

No processo de carcinogênese, o genoma adquire alterações que promovem a

distúrbios de proliferação e de diferenciação celular (SIMARD; TORRE; JEMAL,

2014). O genoma humano codifica informações para proteger sua integridade, com

destaque para os genes de reparo dos danos ao DNA essenciais para manutenção

da integridade do genoma. Mutações nestes genes de reparo são responsáveis pela

formação de tumores e desenvolvimento doenças hereditárias caracterizadas por

alterações metabólicas complexas e pelo desenvolvimento de resistências das células

malignas a drogas (PRATESI et al., 2011). Apesar de existirem mecanismos atuantes

no reparo de danos do DNA, tem sido demonstrada variabilidade de expressão das

proteínas envolvidas nesse processo de reparo, o que vem suscitando

questionamentos a respeito de sua possível associação com o prognóstico tumoral.

Considerando a alta frequência do CEO na população mundial e os desfechos

distintos de lesões com estadiamentos clínicos e histopatológicos semelhantes,

pesquisas vêm buscando possíveis biomarcadores prognósticos para esta neoplasia,

com destaque para pesquisas sobre a expressão imuno-histoquímica de proteínas

envolvidas nos processos determinantes do controle do comportamento celular (AN

et al., 2007; ANG et al., 2011; DURR et al., 2013; FARNEBO et al., 2015).

Pesquisas na área da oncologia vêm relacionando a expressão imuno-

histoquímica variada das proteínas de reparo do DNA com riscos distintos ao

desenvolvimento do câncer e com respostas diferentes ao tratamento oncológico.

Entretanto, poucos estudos têm investigado essa variabilidade em lesões de CEO

28

localizados no mesmo sítio anatômico. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar

a imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH e XPF em uma série de casos de

carcinoma epidermoide de língua oral e investigar possíveis associações com

parâmetros prognósticos.

29

REVISÃO DA LITERATURA

30

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 CARCINOMA EPIDERMOIDE ORAL (CEO)

O câncer oral é um grupo de neoplasia categorizada em câncer de cabeça e

pescoço que possui incidência global de pouco mais de 640.000 casos/ano (SIEGEL

et al., 2014). No Brasil, estimou-se para os anos de 2014/2015, o surgimento de

15.290 novos casos de câncer na cavidade oral, sendo que destes, 11.140 ocorreriam

em homens e 4.350, em mulheres (INCA,2016).

O carcinoma epidermoide, também denominado carcinoma de células

escamosas ou carcinoma espinocelular, representa uma neoplasia maligna de origem

epitelial responsável por 90% dos cânceres orais. O CEO é mais comum em homens

na razão de 2:1 mulher, na quinta década de vida. No entanto, observa-se um

incremento da incidência desta neoplasia em pacientes jovens com menos de 40

anos, em pacientes idosos e em indivíduos do sexo feminino em alguns países. Fatos

que sinalizam para uma possível alteração no perfil dos pacientes acometidos pelo

CEO (HILLY et al., 2013; TROELTZSCH et al., 2014).

Procurando investigar a frequência do CEO em pacientes jovens, Mesquita et

al. (2014) realizaram uma revisão sistemática selecionando 17 artigos com total de

57.064 pacientes. A frequência de jovens (idade menor que 45 anos) em cada estudo

variou de 1% a 100%, sendo 5,03% a frequência total. Apesar desta tendência geral

nos estudos selecionados, a idade, o gênero e o sitio de acometimento também

exibiram variações, segundo as diferenças geográficas, sócio-econômicas e de etnia.

Estas diferenças foram justificadas por alterações genéticas e epigenéticas que

podem predispor à carcinogênese oral (KHAMMISSA et al.,2014, RYDRYCH et

al.,2014).

A localização anatômica do CEO é fator de influência no prognóstico,

considerando-se que os tumores apresentam comportamento clínico diferente

conforme sua localização. Os principais sítios de acometimento do CEO é a língua

oral (região de ventre lingual e 2/3 anteriores deste órgão) e o assoalho, sendo

mucosa jugal, área retromolar, gengiva, palato mole, outras áreas envolvidas. Os

sítios anatômicos de maior acometimento pelo CEO mudam de acordo com variações

31

geográficas, pois refletem os diferentes fatores a que uma determinada população

está exposta (SIMARD; TORRE; JEMAL,2014).

A língua oral tem sido o principal sítio de acometimento na Inglaterra, Estados

Unidos e Coreia, provavelmente pelo consumo de tabaco associado ao álcool

(GANLY; PATEL; SHAH, 2012; RIKARDSEN et al., 2014). Na Ásia, a mucosa jugal é

a localização mais comum, devido ao hábito de mascar betel (NIU et al., 2015). Em

países tropicais, a população é bastante exposta à radiação solar, levando à alta

incidência de carcinoma epidermoide em lábio inferior (SIMARD; TORRE; JEMAL,

2014, FERNÁNDEZ et al. 2015).

O CEO possui etiologia complexa e multifatorial, fatores extrínsecos e

intrínsecos interagem interferindo no surgimento e progressão desta condição

maligna. Os fatores extrínsecos incluem o consumo de tabaco, do álcool, a radiação

ultravioleta (restrito aos casos de carcinoma epidermoide em lábio, sobretudo o

inferior), dieta e fatores biológicos (SCULLY; BAGAN, 2009). Como fatores

intrínsecos, podem ser citados, o estado sistêmico, alterações hormonais, a

desnutrição e alterações genéticas cumulativas. A exposição crônica da mucosa oral

aos carcinógenos produz mutações genéticas e epigenéticas e a instabilidade no

genoma do ceratinócito oral, o que resulta em erros na replicação genética e no

processo de reparo do DNA, eventos que convergem para a progressão do ciclo

celular, desequilíbrio da apoptose e progressão das células neoplásicas (SPANO et

al.2012, INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014).

O hábito de fumar ou mascar tabaco é um dos principais fatores de risco para

o CEO. Os principais xenobióticos presentes no tabaco são as nitrosaminas

específicas do tabaco e os radicais livres que impedem a ação antioxidante das

enzimas glutationas peroxidase e desintegra os lipídios por peroxidação. Com a

diminuição de mecanismos antioxidantes na célula, o DNA é alvo de danos oxidativos

que provocam a formação de ligações covalentes em todo o genoma inclusive na

proteína de reparo p53 (STADLER et al., 2008).

Outro fator extrínseco importante é o álcool, que ao ser consumido, é

transformado em acetaldeído no fígado pela ação da enzima álcool desidrogenase

(ADH). Em situações de consumo excessivo de álcool não há aumento na oferta de

32

ADH suficiente para a metabolização do etanol, sendo este processo realizado por

uma via alternativa, através do citocromo p450, tendo como produto final espécies

reativas de oxigênio (ROS), moléculas desencadeadoras de danos celulares

importantes. O etanol e o acetaldeido exercem, também, efeito de solvente no epitélio

da mucosa oral o que pode facilitar a permeabilidade de outros carcinógenos nas

membranas celulares, fato que justifica o efeito carcinogênico sinérgico do etilismo e

tabagismo no CEO (ZYGOGIANNI et al., 2011).

Os vírus oncogênicos podem desempenhar um papel principal em uma grande

variedade de câncer em mucosas da região de cabeça e pescoço. A carcinogênese

viral está relacionada com a morfologia distinta do epitélio de revestimento das

mucosas. Desta forma, infecção pelo vírus Epstein-Barr está associada ao surgimento

de câncer em região de nasofaringe, enquanto infecções pelo Papiloma Vírus Humano

(HPV), especialmente o subtipo 16, relaciona-se com o surgimento de câncer em

região de orofaringe. Devido à elevada incidência de CEO em jovens não etilistas e

não tabagistas, nos últimos anos, estudos buscam investigar a presença de infecções

por HPV nesta população e os relatórios são unânimes em afirmar que não há

suficientes evidências para incluir a infecção por HPV como fator causal da

carcinogênese do CEO (ZHANG; SANT’ANA FILHO; NÖR, 2012, WITTEKINDT et al.,

2012, BUSSU et al.,2013, DENG et al.,2014, TROELTZSCH et al.,2014, WOODS et

al.,2014).

O estado nutricional do paciente e sua dieta interferem no delicado equilíbrio

de metabolização e eliminação de carcinógenos. Dietas ricas em vegetais e frutas

oferecem ao indivíduo uma série de substâncias antioxidantes como carotenos,

flavonoides, ferro, vitamina A, C, e E, além do folato, que previnem os eventos de

estresse oxidativo celular (SCULLY; BAGAN, 2009).

O desenvolvimento do câncer depende não somente de alterações genéticas

ou epigenéticas em células neoplásicas. O tumor é formado por células ancoradas no

estroma em que se originam, onde existem células de defesa que buscam eliminar o

clone anômalo. As células neoplásicas interagem com as suas congêneres, matriz

extracelular, células do estroma (fibroblastos e mastócitos) e com células de defesa.

Nesta interação as células neoplásicas desenvolvem mecanismos diversos: perda de

expressão de antígenos tumorais e de moléculas coestimuladoras bem como o

33

mascaramento antigênico, secreção de produtos imunossupressores, que permitem

que células neoplásicas se evadam da resposta imunológica à medida que avança a

progressão tumoral. Portanto, os carcinógenos induzem alterações no estroma bem

como na resposta do sistema imunológico do hospedeiro (BRASILEIRO, 2011,

INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014).

A manifestação clínica do CEO é bastante variável, podendo apresentar-se

como lesões exofíticas, endofiticas, ulceradas, endurecidas, exibindo sangramento,

associada a linfadenopatias palpáveis, sintomatologia dolorosa com relato de

dificuldade de mastigação, deglutição e fala. No entanto, lesões iniciais podem exibir

aparência clínica exofítica vegetante, papilar, verruciforme, leucoplásica, eritroplásica

e eritroleucoplásica que, normalmente, não possuem sintomatologia dolorosa

associada. Para auxiliar a classificação e o estadiamento do câncer, o Comitê

Americano de Câncer desenvolveu o sistema de estadiamento TNM que é baseado

no tamanho do tumor primário (T); quantificação de metástase linfonodais de acordo

com o tamanho, número e distribuição (N); e a presença de metástase distantes (M).

O sistema TNM é um parâmetro de avaliação clínica que auxilia a escolha do

tratamento e prediz com boa segurança o prognóstico do paciente. Entretanto, possui

a limitação de não fornecer informações biológicas referentes aos componentes

celulares malignos (KREPPEL et al., 2011).

Morfologicamente, o CEO exibe proliferação de células escamosas em

diferentes graus de diferenciação, dispostas em lençol, ilhas, finos cordões e células

dispersas de permeio a estroma de tecido conjuntivo fibroso que exibe de fraco a

intenso infiltrado inflamatório. Quando bem diferenciado, as células malignas exibem

grandes agregados celulares, disceratose e formação de pérolas de ceratina. Em

lesões moderadamente e mal diferenciadas, destaca-se o arranjo frouxo das células

onde há perda do fenótipo epitelial e aquisição de fenótipo mesenquimal. Frente à

exuberante heterogeneidade nos padrões morfológicos do CEO, alguns sistemas de

gradação foram propostos na busca de identificar aspectos morfológicos preditivos do

prognóstico desta neoplasia (BRODERS, 1941, BRYNE, 1991, BRANDWEIN-

GENSLER et al., 2005, ALMANGUSH, et al., 2015).

No sistema de gradação proposto por Broders et al. (1941), as lesões eram

classificadas conforme o estágio de diferenciação e sua semelhança com o epitélio

34

escamoso estratificado em bem, moderado e pobremente diferenciado. Avaliação

restrita às células tumorais e dificuldade na obtenção de consenso na classificação

das lesões que apresentam populações celulares heterogêneas foram algumas

deficiências deste sistema. Anneroth, Batsakis e Luna (1987) em seu modelo de

gradação estabeleceram os seguintes critérios: grau de ceratinização, pleomorfismo

nuclear, número de mitoses, estágio de invasão, padrão de invasão e infiltrado

inflamatório.

Bryne et al. (1991) sugeriram que a relação entre tumor e hospedeiro ocorre

dentro do chamado front de invasão tumoral e que as células desta localização exibem

alterações semelhantes às células metastáticas. Neste sistema, os parâmetros

analisados são os morfológicos relativos à população celular do tumor (grau de

ceratinização e pleomorfismo celular) e da relação tumor-hospedeiro (padrão de

invasão e infiltrado inflamatório).

Outra gradação que merece destaque é a proposta por Brandwein-Gensler et

al. (2005) que orienta que a análise deve ser realizada em toda a extensão do front

invasivo e o pior padrão de invasão deve ser o considerado. O grande avanço deste

sistema é a forma de avaliação criteriosa do padrão de invasão, infiltrado inflamatório

e invasão perineural, além do acréscimo do padrão de invasão tipo 5, que corresponde

à presença de células ou ninhos tumorais com pelo menos 1mm de tecido sadio

interposto entre estas e o front de invasão.

Almangush et al. (2015) avaliaram seis parâmetros histopatológicos em CEO:

o grau de diferenciação tumoral, pior padrão de invasão, resposta linfocitária do

hospedeiro, invasão perineural, presença de tumor de brotamento (tumor budding) e

a profundidade de invasão. Buds são pequenos aglomerados de células neoplásicas

(ninhos de até cinco células) indiferenciadas na margem invasiva do tumor sendo

sugerido como um sinal da presença da transição epitélio-mesenquimal nas células

neoplásicas de carcinoma colorretal, de mama e de língua. A análise dos autores

verificou que profundidade de invasão maior que quatro milímetros e a presença de

mais de cinco buds são critérios de simples aplicação e que fornecem um modelo

preditivo recorrência loco-regional que auxiliaria no planejamento de protocolos de

atendimento individualizado para o carcinoma epidermoide de língua oral (CELO).

35

A presença de padrões morfológicos heterogêneos é um fato que dificulta a

padronização de parâmetros que possam ser universalmente utilizados como

indicadores prognósticos para CEO. Estudos de validação de distintos sistemas de

gradação histopatológica em CELO, com variados estágios TNM, buscam superar as

limitações que um único modelo de gradação possa apresentar (KESKI-SÄNTTI et al.,

2007, BASTID,2012, ALMANGUSH et al., 2015, KOLOKYTHAS et al., 2015, SINHA

et al.,2015).

A ressecção cirúrgica com esvaziamento ganglionar é a terapêutica principal

do CEO. No entanto, em algumas situações clínicas como estágio avançado da lesão

e em pacientes que possuem condições clínicas inapropriadas para o procedimento

cirúrgico, é indicada a radioterapia e/ou quimioterapia prévia. Durante a ressecção

cirúrgica é necessária a análise morfológica transoperatória da margem cirúrgica livre

de lesão que deve ser de pelo menos 5mm de tecido sadio e quando da

impossibilidade de aplicação desta orientação, deve-se estabelecer tratamento

adjuvante aos pacientes como radioterapia associada ou não à quimioterapia

(ANDERSON; SISSONK; MONCRIEFF, 2015).

O prognóstico de pacientes portadores de tumores de cabeça e pescoço está

significativamente relacionado com a presença de linfonodo cervical metastático. A

condição linfática parece ser o maior determinante da evolução clínica do paciente

(PREUSS et al., 2007, THIAGARAJAN et al., 2014). No estudo de meta analise

realizado por Thompson et al. (2013), observou-se a presença de metástase linfonodal

oculta em 31% dos pacientes o que influencia significativamente o tratamento e o

prognóstico do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço.

Apesar da facilidade do diagnóstico precoce do CEO, dois terços dos

diagnósticos desta neoplasia ocorrem em estágios avançados. O estágio avançado

do tumor é o principal fator que interfere negativamente no prognóstico do CEO, por

necessitar de tratamentos agressivos, mutiladores e geralmente estar associado à

metástase cervical (GÜNERI; EPSTEIN, 2014).

O desenvolvimento de metástase envolve eventos moleculares que são

ativados em cascata durante a tumorigênese, promovendo a disseminação das

células neoplásicas do sitio primário para estruturas anatômicas distantes e

36

subsequente proliferação em um segundo sitio anatômico. Esta cascata se caracteriza

pelos seguintes eventos: desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, mecanismos

tumorais de evasão do sistema imune, invasão e migração através da membrana

basal e da matriz extracelular, adesão das células neoplásicas no endotélio capilar e

crescimento tumoral em sitio secundário. Processos de remodelação das adesões

célula a célula e célula matriz são necessários para que a célula epitelial neoplásica

obtenha capacidade migratória. A migração pode ocorrer de forma unitária (single-

cell) ou de forma coletiva. Essas estratégias migratórias envolvem diferenças na

atividade de proteases extracelulares, adesão celular mediada por integrinas e

caderinas e rearranjo do citoesqueleto. Adicionalmente, há a participação do estroma

tumoral que através da interação com outras células desenvolve o microambiente

favorável à progressão tumoral. (INGLEHART; SCANLON; D’SILVA, 2014, WANG et

al., 2014).

A migração unitária da célula neoplásica ocorre por meio de duas diferentes

estratégias: fibroblastoide e padrão ameboide. Na maioria dos casos, as células

individuais saem da periferia do tumor, desenvolvem mecanismos de perda da

polaridade epitelial e desenvolvimento da mesenquimal, processo denominado

transição epitélio-mesenquimal (TEM). Este processo é, atualmente, um importante

alvo de pesquisa para o entendimento maior do desenvolvimento de metástase. As

características principais da TEM é o rompimento da adesão célula a célula, aquisição

da morfologia fibroblastoide, alta capacidade de interação com estroma e elevadas

taxas de proliferação (BASTID, 2012, ATTRAMADAL, et al., 2015, MARKWELL;

WEED,2015).

2.2 MECANISMOS DE REPARO DO DNA

Evolutivamente, foram selecionadas várias estratégias para tolerar ou reparar

danos causados no material genético celular. Existem cinco mecanismos principais

envolvidos no reparo do DNA: reparo por excisão de base (BER –“base excision

repair”), reparo por excisão de nucleotídeo (NER– “nucleotide excision repair”), reparo

por mal pareamento (MMR- “mismatch repair”), reparo por quebra de dupla fita

(recombinação homóloga e junção terminal não homóloga) e reparo direto (exclusivo

de organismos procariotos e eucariotos não placentários). Cada via utiliza uma série

37

de genes e proteínas específicas para detecção e remoção do dano com posterior

reconstrução da dupla hélice (RICCERI; MATULLO; VINEIS, 2012).

As bases oxidadas do DNA são primeiramente corrigidas pelo mecanismo de

reparo por excisão de bases, conhecido por atuar, principalmente, em modificações

causadas por agentes endógenos. O mecanismo molecular do BER inicia-se pelo

reconhecimento e excisão de bases danificadas pelas DNA-glicosilases com ou sem

atividade 3’-AP liase associada. A excisão da base resulta em um sítio abásico (AP-

apurínico ou apirimidínico) com ou sem incisão 3’, que é reconhecido por outro grupo

de enzimas, as AP-endonucleases, que fazem a incisão na extremidade 3’ ou 5’ do

sítio AP, gerando uma lacuna que é preenchida através de polimerização e ligação de

novos nucleotídeos à sequência de DNA (BERRA;MENCK; DI MASCIO, 2006).

O NER é um dos processos de reparo que atua principalmente em danos

provocados por agentes exógenos que causam distorção da dupla-hélice do DNA,

como aqueles causados por luz UV. O processo do NER nas células humanas envolve

a ação de mais de 30 proteínas que atuam em 5 passos sucessivos: reconhecimento

da lesão; abertura da dupla hélice de DNA onde está localizada a lesão; dupla incisão

distante a alguns nucleotídeos dos lados 5’ e 3’ do sítio da lesão; síntese do novo

DNA utilizando como molde a fita não danificada e ligação da porção 5’ da nova fita

sintetizada à cadeia pré-existente. O NER possui atividade heterogênea em regiões

distintas do genoma e prossegue mais rapidamente e com maior fidelidade na fita

transcrita de um gene ativo que na fita ou em um gene não transcrito. Esse processo,

dependente da ação da RNA polimerase II (RNApolII), denomina-se reparo acoplado

à transcrição (TCR), que assegura um rápido reparo dos genes ativos em contraponto

com o reparo do genoma global (GGR), iniciado por um complexo de reconhecimento

diferente (CHEADLE; SAMPSON; MUTYH, 2007).

O MMR corrige pares errôneos de bases e alças desemparelhadas no DNA,

eventualmente introduzidos por erros de replicação, ou lesões que interfiram com a

atividade replicativa das DNA-polimerases. O MMR é a principal via de reparo da

instabilidade de microssatélite. Alterações nesta via, principalmente polimorfismos nos

genes MSH2 e MLH1, são observadas em portadores da Síndrome do Câncer

Colorretal Hereditário, de Tumor de Wilms e em pacientes jovens com CEO. (DINIZ et

al., 2013, KOSTRZEWSKA-POCZEKAJ et al., 2013).

38

A instabilidade de microssatélites do genoma é encontrada entre 7 a 100% nos

pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço, sendo mais prevalente nos pacientes

jovens, com idade menor que 45 anos. Estudos apontam que a manutenção desta

via de reparo MMR através da forte imunoexpressão das proteínas MSH2 e MLH1

está relacionada ao melhor prognóstico do CEO (THEOCHARIS et al, 2011, PEREIRA

et al, 2013).

Outro mecanismo importante na proteção da molécula de DNA é o reparo por

recombinação, capaz de reparar a quebra da dupla cadeia de DNA, dano criado por

vários processos normais da célula ou por agentes exógenos, como irradiação

ionizante. Existem dois caminhos envolvidos no reparo por recombinação:

recombinação homóloga (HR – “homologous recombination”), que assegura um

reparo bastante preciso; e junção de pontas não homólogas (NHEJ – “non-

homologous end joining”), sujeito a erro (ALBERTS et al, 2010)

Pesquisadores vêm propondo a existência de interação entre os diferentes

mecanismos de reparo de DNA. Por exemplo, embora TCR tenha sido inicialmente

descrito como sendo responsável pela remoção de lesões induzidas por luz UV, é hoje

reconhecido por ser um fenômeno mais geral que opera em outros tipos de lesões no

DNA. Entre estas, podemos citar as lesões oxidativas geradas por irradiação ionizante

ou induzidas por ROS como timina glicol (Tg) e 8-oxo-7,8-diidroguanosina (8-

oxoGuo)10. Outro exemplo pode ser a interação entre NER e MMR, onde MSH2 foi

descrita por interagir fisicamente com alguns componentes do NER. Estes eventos

sugerem que os mecanismos de reparo de DNA, apesar de possuir especificidade por

determinados danos, trabalham de uma forma bastante integrada (BERRA ;MENCK;

DI MASCIO, 2006).

A instabilidade genômica compõe um dos eventos principais da carcinogênese

e progressão tumoral. O reconhecimento dos mecanismos que preservam a

integridade do DNA auxilia na predição, no prognóstico e na terapia personalizada em

oncologia, uma vez que o aparecimento de resistência ao tratamento, invasão e

metástase são processos relacionados com mutações específicas em diversas

neoplasias. No CEO, as lesões cromossômicas mais comuns são influenciadas pelo

acúmulo de danos e defeitos no sistema de reparo do DNA (JENKINS et al., 2013).

39

2.1.1 Proteínas do reparo do DNA por excisão de base

O mecanismo do BER inicia-se na atividade de uma enzima DNA-glicosilase

lesão específica e completa-se seguindo por um dos dois sub-caminhos: um curto

(‘short-patch’ BER) o mais frequente, no qual apenas um nucleotídeo é substituído,

ou um longo (‘long-patch’ BER), onde de 2 a 13 nucleotídeos são substituídos. Falhas

no BER têm sido associadas a mutações em alguns genes desta via como o ‘X-ray

repair cross-complementing group 1’ (XRCC1), ‘apurinic/apyrimidinic endonuclease 1’

(APEX1), 8-oxoG-DNA glicosilase (OGG1) e Poly (ADP-Ribose) Polymerase 1

(PARP1), as quais possuem fundamental importância na via BER. Estudos no campo

da genética verificaram que esses genes possuem polimorfismos com potencial para

modular a função e alterar a capacidade do reparo (CHEADLE; SAMPSON; MUTYH,

2007).

A XRCC1 é uma proteína que possui 633 aminoácidos e peso de 70kDa e

está envolvida no BER, participando como uma proteína multidomínio que serve como

âncora nesse mecanismo, interagindo com a maioria das enzimas envolvidas nesse

processo. A XRCC1 não possui atividade catalítica por si própria, mas possui ação

moduladora de diferentes etapas do BER e na quebra de fita simples do DNA

(CHRISTMANN, 2003).

A interação e formação de um complexo com as proteínas DNA polimerase β,

DNA ligase III e poly (ADP-ribose) polimerase ocorrem através das regiões N-terminal,

C-terminal com a polinucleotídeo quinase humana, trazendo o complexo próximo ao

sítio de dano do DNA (Figura 1). Dessa forma, a XRCC1 fornece uma ligação física

nas etapas de incisão e ligação do BER (GINSBERG et al., 2011, JAREMKO et al.,

2007).

As bases danificadas removidas durante a BER são removidas pela DNA

glicosilase, a qual recruta a Pol β para o local para inserir de um a vários nucleotídeos,

podendo seguir dois caminhos: o curto (dano indireto) e longo (dano direto).

Posteriormente, a XRCC1 é recrutada para o local depois da incisão inicial e serve

para estabilizar a estrutura intermediária do DNA, como os sítios sem bases, para que

outras enzimas de reparo possam atuar, inserindo os novos nucleotídeos. Naqueles

casos em que o dano foi provocado por agentes endógenos diretos, como a oxidação

40

ou alquilação, a BER segue a via longa, pois a Pol β não pode remover a porção

terminal 5’-dRP porque ela está oxidada ou reduzida, sendo necessário recrutamento

de outras proteínas como a PARP, PCNA e FEN, Figura 1 (GINSBERG et al., 2011).

Figura 1 - Esquema da via de reparo de DNA por excisão de base (CHRISTMANN et

al., 2003)

Mahjabeen et al. (2014), quantificaram mRNA de XRCC1 e avaliaram

imunoexpressão desta proteínas em pacientes com carcinoma epidermoide de

cabeça e pescoço. A análise da expressão de mRNA identificou 64% casos com baixa

regulação, 30% alta e 6% não foi identificado alteração. A análise da imunorreação

identificou 48% casos com fraca, 32% moderada e 20% forte ao investigar a diferença

da expressão segundo parâmetros de desfecho os autores não observaram

diferenças. Entretanto, identificaram que tumores mal diferenciados exibiram menor

expressão em relação aqueles bem diferenciados.

A relação entre a ocorrência de tolerância e resistência a quimioterápicos e a

elevada expressão da proteína XRRC1, bem como seu mRNA correspondente, tem

41

sido relatada em estudos clínicos retrospectivos com pacientes acometidos por

diversos tipos de cânceres: gástrico, colorretal, ovariano, esofaringe e fígado. Os

resultados suportam a hipótese de que a elevada da expressão tumoral de XRCC1

pode ser um fator preditivo de menor resposta clínica ao tratamento quimioterápico

possuindo , principalmente em terapias que utilizam a cisplatina. (OLAUSSEN et al.,

2006; JENKINS et al., 2013).

O mecanismo de ação da cisplatina está relacionado à formação de adutos

na fita do DNA, o que impede a replicação e transcrição da fita. Células que possuem

o sistema de reparo eficiente são propícias a apresentarem resistência à terapia com

cisplatina. A remoção do complexo cisplatina DNA é realizada por diversas proteínas

de reparo do DNA, com destaque a XRCC1 (LANGER et al., 2012).

2.1.2 Proteínas do reparo do DNA por excisão de nucleotídeo

A via de reparo de DNA por NER inclui mais de 35 genes e possui a função

de remover danos induzidos, principalmente, por raios ultravioleta (dímeros de

pirimidina) e adutos de DNA associados com exposição a agentes químicos (WOGAN

et al., 2004).

NER é um dos principais meios pelo qual as células de mamíferos removem

as lesões de DNA causadas por agentes endógenos e exógenos. A via NER repara

lesões volumosas, como dímeros de pirimidina, outros fotoprodutos ultravioletas,

adutos químicos volumosos e “cross-links”. No processo de reparo, os produtos de

mais de uma dúzia de genes estão envolvidos nesta via, que envolve pelo menos

quatro etapas: (a) o reconhecimento do dano por um complexo de proteínas ligadas,

incluindo XPC, (b) estabilização do DNA pelo complexo TFIIH que inclui XPD; (c)

remoção do fragmento danificado “single-stranded” (geralmente cerca de 27-30 pb)

por moléculas incluindo ERCC1 e complexo XPF e (d) ligação para restaurar a

estrutura de DNA normal. Proteínas envolvidas nestes quatro passos foram

identificadas por meio de estudos de reparo ao DNA em indivíduos com xeroderma

pigmentoso (XP) (HAKEM, 2008).

Neste processo, o reconhecimento do dano é executado pelo complexo XPC

formado pelas proteínas XPC, HR23B e Centrina-2, que se liga à fita de DNA não

lesionada (NOUSPIKEL, 2009). O complexo TFIIH (transcription factor II H), que é um

42

heterodímero com duas helicases diferentes – XPD (atividade 5’- 3’) e XPB (atividade

3’- 5’) ligadas à um complexo quinase ciclina-ativada (cyclin-activated kinase), é

recrutado e separa a dupla fita de DNA envolvendo a mutação (JENSEN et al., 2011).

Posteriormente, um complexo XPA se liga à fita de DNA lesionada, sendo seguido

pela chegada de um complexo de incisão que consiste das endonucleases XPG e

XPF (NOUSPIKEL, 2009). Este evento causa a excisão de 25 a 30 nucleotídeos,

incluindo o DNA lesionado. Logo depois, a DNA-polimerase δ ou a ε sintetiza

novamente a fita de DNA. Ocasionalmente, a enzima DNA-ligase III une as

extremidades formadas pela remoção dos nucleotídeos (CHRISTMANN et al., 2003;

JENSEN et al., 2011) (Figura 2).

Figura 2 - Esquema da via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeo

(CHRISTMANN et al., 2003)

43

A via de reconhecimento que envolve o complexo XPC é denominada reparo

de genoma global, “global genome repair”, e corrige falhas em todo o genoma. O

reconhecimento do dano pelo reparo de transcrição unida, “transcription-coupled

repair”, que repara genes ativamente transcritos, envolve o retardamento da RNA-

polimerase, seguido pelo recrutamento de moléculas sinalizantes, como as proteínas

CSA “cockayne syndrome group A” ou CSB “cockayne syndrome group B” (JENSEN

et al., 2011).

O XPD (“Xeroderma pigmentosum complementation group D”), complexo

TFIIH 80, também conhecido como ERCC2 “excision repair cross-complementing

rodent repair deficiency, complementation group 2” é um tipo de gene de reparo de

DNA por excisão de nucleotídeos. Esta via é uma das mais importantes na remoção

de danos no DNA causados por carcinógenos do tabaco, bem como de distorções na

dupla hélice que podem interferir no pareamento das bases obstruindo a replicação e

a transcrição, além de reparar danos causados por drogas alquilantes, análogos da

platina e radiação (AN et al., 2007).

Ye et al. (2012), identificaram o envolvimento da proteína XPD (complexo

TFIIH 80) em displasia e carcinomas de células escamosas de colo uterino, através

da quantificação do mRNA por RT-PCR e imunoexpressão em tecido parafinado. Os

casos de carcinoma de células escamosas apresentaram maiores níveis de XPD. Os

autores justificam que mudanças no padrão de transcrição de XPD resultam em níveis

elevados do mRNA e acúmulo de proteínas que não são capazes de realizar

corretamente o processo de reparo do DNA. Os autores acrescentam que são

necessárias mais pesquisas que possam esclarecer os mecanismos específicos

envolvidos no acúmulo de mRNA e proteína XPD na carcinogênese de células

escamosas.

Dentre os genes envolvidos no reparo do DNA na via NER, também se

menciona o gene ERCC4 ou XPF, que foi inicialmente identificado a partir de

indivíduos com xeroderma pigmentoso do grupo F (XPF). Esse gene possui uma

sequência de 2751 pb de comprimento, é composto por 11 éxons e codifica uma

proteína chave de mesmo nome (ERCC4 ou XPF) que forma um complexo estável

com a proteína ERCC1 e realiza uma incisão na terminação 5’ da lesão reconhecida

do DNA, enquanto que a proteína XPG realiza uma incisão na terminação 3’ da lesão.

44

A família XPF de genes é evolutivamente conservada. Existe uma extensa homologia

entre XPF humanos, Drosophila Mei-9, Saccharomyces cerevisiae Rad1 e S. pombe

Rad16, todos possuindo funções semelhantes no NER (FAN et al., 1999).

Jagdis et al. (2013) verificaram em seus estudos que a imunoexpressão

nuclear de XPF apresentou níveis baixos nos casos de carcinoma nasofaringe não

metastático; entretanto, não foi possível Identificar relação da imunomarcação desta

proteína de reparo com o tempo de desenvolvimento de recorrência locorregional,

com o tempo de sobrevida livre de doença e com o tempo de sobrevida global.

A compreensão do mecanismo de resistência a drogas na terapia do câncer

é necessária para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, e

pesquisadores têm correlacionado a regulação aumentada de vários genes de reparo

do DNA com resistência às drogas. A relação do XPF com resistência a drogas pode

ser deduzida a partir de estudos sobre seu parceiro ERCC1, MUS81 e o TDP1 (LIU

et al., 2007, KOBERLE et al., 2010).

Xuelei et al. (2015) realizaram um estudo de meta-análise com o objetivo de

investigar a hipótese que a superexpressão de ERCC1 pode interferir na resposta

clínica de regimes de quimioterapia e radioterapia no tratamento do carcinoma

epidermoide em região de cabeça e pescoço. Os pesquisadores reuniram 193 estudos

com total de 1263 pacientes, identificando o efeito da expressão do ERCC1 na

sobrevida de pacientes com carcinoma epidermoide da raça asiática, não sendo um

fator preditivo aos pacientes não asiáticos. A análise da relação entre expressão do

ERRC1 e a resposta ao tratamento, só foi possível demonstrar que a baixa expressão

do ERCC1 é um fator preditivo positivo à sobrevida dos pacientes asiáticos. Devido

ao escasso número de estudos com populações não asiáticas, a presente meta-

análise não pode identificar esta relação nestas populações. Os autores destacam,

ainda, que devem ser investigada a relação entre as proteínas de vias de reparo do

DNA distintas, a citar ERCC1 e XPF, pois são vias que convergem ao mesmo tipo de

resposta, o reparo do dano do DNA e interferência no mecanismo de ação de

fármacos que promovem o dano ao DNA.

Tem sido demonstrado que um risco aumentado ao carcinoma epidermoide

de cabeça e pescoço está associado com redução da capacidade de reparo do DNA.

45

Na pesquisa de Wei et al. (2005), foi verificado que os casos de carcinomas

epidermoides de cabeça e pescoço apresentavam níveis mais baixos de expressão

para todas as proteínas NER, particularmente XPC e XPF, com redução em cerca de

25%. Além disso, houve associação da baixa expressão XPF com um maior risco para

o desenvolvimento desta neoplasia (OR, 11,5; IC 95%, 2,01-56,6).

Estudos têm relatado que a via NER pode estar associada à resistência de

células tumorais à cisplatina na terapia do câncer. Tumores testiculares de células

germinativas têm mostrado menor sensibilidade à cisplatina, e isso tem sido

correlacionado a baixos níveis do complexo de proteína NER, ERCC1/XPF (WELSH

et al., 2004).

Pouco se sabe sobre os níveis de ERCC1-XPF em tecidos e em linhagens de

células de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Koberle et al. (2010)

investigaram mRNA e níveis da proteína ERCC1 e XPF em linhagens de células de

carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e linhagens de células tumorais de

testículos e examinou a correlação entre níveis de ERCC1 e XPF e a resistência

celular à cisplatina. Esse estudo não revelou diferença significativa na expressão de

mRNA do ERCC1 ou XPF nas linhagens analisadas. No entanto, os resultados

indicaram uma contribuição da proteína XPF na resistência à

cisplatina.Posteriormente, a expressão da proteína XPF e ERCC1 foi investigada em

tecido de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e foram encontrados níveis

significativamente maiores de XPF em pacientes com metástases. Estes resultados

indicam uma contribuição da proteína XPF à quimiorresistência à cisplatina, além de

sugerir que carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço com metástases possuem

menor capacidade de resposta à cisplatina.

Buscando a relação da imunoexpressão de proteinas de reparo do DNA (XPF,

ERCC1, FANCD2, PAR, ƴH2AX, MLH1 e MAPKAP) com o tipo de resposta ao

tratamento quimioterápico, Seiwert et al. (2014) selecionaram pacientes com

carcinoma de cabeça e pescoço com estágio TNM IV. Ao final dos ciclos de quimio e

radioterapia os pacientes que apresentaram elevada imunoexpressão de XPF

exibiram as piores evoluções clinicas segundo os critérios de RECIST (29,7%

resposta completa, 51,4% resposta parcial, 18,9% doença estável) em comparação

com os pacientes que apresentaram menor imunoexpressão de XPF. Entretanto,

46

estes pesquisadores verificaram não existir associação da imunoexpressão de XPF e

a sobrevida global de paciente com carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço.

Adicionalmente, os autores afirmam que a heterogeneidade dos cânceres da região

de cabeça e pescoço sugere que a ação antineoplásica da terapêutica será diferente

conforme o sitio anatômico, uma vez que existem distintos mecanismos de reparo do

DNA envolvidos em cada região anatômica.

47

PROPOSIÇÃO

48

3 PROPOSIÇÃO

A proposição deste experimento foi analisar a imunoexpressão das proteínas

dos genes de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF em carcinoma epidermoide de

língua oral, investigando possíveis associações com os seguintes parâmetros

prognósticos: estadiamento clínico, grau histopatológico de malignidade, presença de

metástase linfonodal e sobrevida de 05 anos. Com esta pesquisa, pretende-se

contribuir com o maior entendimento a respeito do papel destas proteínas no

desenvolvimento do CELO.

.

49

MATERIAL E MÉTODOS

50

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A presente pesquisa é parte integrante da pesquisa intitulada “Correlações

clinicopatológicas, imuno-histoquimicas e de resposta ao tratamento quimioterápico e

radioterápico com polimorfismo em genes de reparo do DNA em pacientes com

Carcinoma de Células Escamosa de Cabeça e Pescoço”, que foi aprovado pelo

Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Dr. Luiz Antônio da Liga Norte Riograndense

Contra o Câncer CAAE:22714.1.0000.5293, Parecer: 838.556 (Anexo A). Os

pacientes incluídos no estudo foram devidamente esclarecidos quanto aos objetivos

da pesquisa e, quando concordarem em participar, foram convidados a assinar o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A).

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

O presente trabalho é um estudo longitudinal retrospectivo com análise de

características clínico-histopatológicas e a imunoexpressão das proteínas dos genes

de reparo do DNA (XRCC1, TFIIH e XPF) em casos de carcinoma epidermoide de

língua oral (CELO).

4.3 POPULAÇÃO

A população deste estudo é representada pelos pacientes com CELO

atendidos na Liga Norte Riograndense Contra o Câncer nos anos de 2001 a 2010.

4.4 AMOSTRA

A amostra deste estudo foi por conveniência, constituída por todos os casos

selecionados segundo os seguintes critérios de inclusão e exclusão.

4.4.1 Critérios de inclusão

Foram incluídos na amostra, apenas os casos de CELO tratados por ressecção

cirúrgica do tumor primário, que apresentaram quantidade suficiente de tecido

neoplásico no bloco de parafina, possibilitando a avaliação histológica do front de

51

invasão tumoral e cujos prontuários dos pacientes contenham informações relativas à

presença ou ausência de metástase linfonodal com comprovação histopatológica.

4.4.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos da amostra lesões de recorrência ou de doença residual

Para análise de desfecho os casos que não possuíam data do óbito ou

informação clínica de cinco anos após o diagnóstico foram excluídos.

4.5 COLETA DE DADOS CLÍNICOS

Através do preenchimento da ficha de coleta (Apêndice B) foi realizado o

levantamento das variáveis clínicas: gênero, idade, presença de metástase linfonodal

(ou TNM quando possível), tipo de tratamento e estado atual da doença. Quando

constante nos prontuários, foram anotadas as seguintes datas: primeira recidiva loco-

regional, metástase linfonodal, presença de novo tumor primário, metástase à

distância, óbito e último seguimento.

O cálculo do tempo de sobrevida global foi obtido da seguinte forma:

Tempo de sobrevida global = data do último seguimento ou do óbito –

data do início do tratamento;

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO

Para o estudo morfológico os cortes histológicos de 5µm de espessura de

CELO, corados pela técnica de rotina da hematoxilina e eosina (H.E.) foram

escaneados com auxílio do equipamento Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft.

29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121). As imagens foram

analisadas através do programa de visualização Panoramic Viewer 1.15.2

(3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121) em

diferentes amplitudes.

Todos os casos foram analisados utilizando-se dois métodos distintos de

gradação histopatológica: um proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) (Quadro

1) e outro, por Almangush et al. (2015) (Quadro 2). Esta análise foi realizada por dois

patologistas previamente treinados, sempre no front de invasão tumoral em momentos

52

distintos e sem acesso a informações clínicas do caso que estava sendo avaliado. Os

casos que apresentaram classificação discordantes foram reavaliados até obter

consenso no valor do parâmetro.

Quadro1- Sistema de gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler

et al. (2005)

Parâmetro Valor Escore 0 Escore 1 Escore 3

Invasão perineural

Nenhuma Nervos com menos de 1mm de diâmetro

Grandes nervos, diâmetro maior igual

a 1mm

Infiltrado linfocítico Contínuo Grandes agregados Pouco ou nenhum

Pior Padrão de Invasão Padrão 1,2 ou 3 Padrão 4 Padrão 5

No sistema de gradação proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) (Quadro

1), o padrão de invasão 1 consiste em lesões com bordas infiltrativas bem delimitadas,

padrão 2 quando as células tumorais se organizam em cordões, bandas e/ou

trabéculas sólidas infiltrativas, padrão 3 em pequenos grupos ou cordões celulares

infiltrativos com mais de 15 células, padrão 4 em dissociação celular disseminada e

pronunciada, em pequenos grupos e/ou individual com menos de 15 células e padrão

5 em infiltração tumoral vastamente dispersa, com pelo menos 1mm de tecido sadio

interposto entre as ilhas satélites e o front de invasão. Foi considerado para

pontuação, o pior padrão de invasão encontrado no espécime. A análise de cada

parâmetro resultou em um escore que somados resultam em um valor total com a

seguinte classificação: 0 (lesões de baixo risco), 1 ou 2 (lesões de risco intermediário)

e 3 a 9 (lesões de alto risco).

A segunda análise morfológica realizada foi seguindo o modelo de gradação BD

(B- tumor budding; D-depth of invasion) recomendado por Almangush et al. (2015).

Esta análise propõe a avaliação dos parâmetros: profundidade do tumor (ponto de

corte de 5mm) e a presença de pequenos aglomerados constituídos por menos de 05

células (bud) no front de invasão tumoral em um campo com amplitude de 200

(Quadro 2). Nesta análise, os escores são interpretados da seguinte forma: 0 (lesão

de baixo risco); 1 (lesão de risco intermediário) e 2 (lesões de alto risco de recorrência

loco-regional e baixa sobrevida).

53

Quadro 2 - Parâmetros histopatológicos avaliados no modelo de gradação BD

proposto por Almangush et al. (2015)

Parâmetro Valor

escore 0 escore 1 escore 2

Profundidade de invasão Até 4mm Profundidade até 4mm e

presença de mais 5 buds OU

Profundidade maior que 4mm e possuir até 5

buds

Maior que 4mm

Tumor budding

Até 5 buds Mais que 5 buds

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

4.7.1 Técnica de coloração imuno-histoquímica

Toda amostra selecionada, incluída em parafina, foi submetida a cortes

histológicos de 3 µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro,

previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de

organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA).

Os cortes histológicos foram corados pelo método da imunoperoxidase através da

técnica do polímero de dextrano, utilizando-se anticorpos anti-XRCC1, -TFIIH e -XPF

e a diaminobenzidina como cromógeno, de acordo com protocolo descrito a seguir:

1) Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente

(TA);

2) Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis. Álcool etílico absoluto I (5

minutos) TA; álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5

minutos) TA; álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA; álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;

3) Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°

por 10 minutos, à temperatura ambiente;

4) Lavagem em água corrente por 10 minutos;

5) Três ou 4 passagens em água destilada;

6) Recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 3);

7) Lavagem em água corrente por 5 minutos e 2 passagens em água destilada;

8) Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos cada, em solução de

peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio da

peroxidase endógena tecidual;

9) Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada;

54

10) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;

11) Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 3) diluídos em solução

diluente Diamond (Cell Marque; Rocklin CA, USA);

12) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;

13) Incubação com solução amplificadora (HiDef, Cell Marque; Rocklin CA, USA)

durante 15 minutos - TA;

14) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;

15) Incubação com o anticorpo polimerizado à peroxidase (HiDef, Cell Marque;

Rocklin CA, USA) durante 15 minutos, à temperatura ambiente;

16) Duas passagens em solução de TRIS-Tween 20 pH 7,4 por 5 minutos cada;

17) Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (Liquid DAB + Substrato, Dako

North America, Carpinteria, CA, USA), durante 7 minutos – TA;

18) Lavagem em água corrente por 10 minutos;

19) Duas passagens em água destilada;

20) Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 5 minutos - TA;

21) Lavagem em água corrente – 10 minutos;

22) Duas passagens em água destilada;

23) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis. Álcool etílico 80°GL (2 minutos)

TA; álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA; álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;

álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;

24) Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);

25) Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,

USA).

Quadro 3 - Clone, especificidade, fonte, diluição, recuperação antigênica e incubação

dos anticorpos primários

Especificidade e Clone

Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação

XRCC1 Ab-1 (clone 33-2-5)

Lab Vision 1:2000 Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC,

microodas 2x5’ Overnight

TFIIH p80 (H-150)

Santa Cruz Biotechnology

1:1000 Citrato pH 6,0,Pascal 121 oC,

microodas 2x5’ Overnight

XPF Ab-1 (clone 219)

Lab Vision 1:800 Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC,

microodas 2x5’ Overnight

55

4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico

Foi realizada uma análise descritiva da imunoexpressão das três proteínas

utilizadas, quanto à intensidade da reação (intensa, moderada ou fraca) e à

imunolocalização celular da reação (nuclear, citoplasmática ou ambos).

Para a análise semiquantitativa da imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH

e XPF foram analisadas células neoplásicas do front tumoral de CELO. Inicialmente,

a imunorreatividade foi quantificada para núcleo e citoplasma, separadamente

segundo categorias propostas por Huang et al. (2013): 0 - até 10%´de células

positivas; 1 de 11% a 50% de células positivas; 2 - > 50% de células positivas.

Posteriomente para análise estatística os casos foram estratificados em baixa e

alta expressão celular, independentemente da localização da imunorreação, de

acordo com o seguinte critério: baixo (até 50% de células positivas) e alto (>50% de

células) como proposto por Seiwert et al., 2014.

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As informações clinicas, morfológicas e imuno-histoquímicas das proteínas de

reparo da amostra do presente estudo foram tabuladas no software Microsoft Excel

(Microsoft Corporation, USA) e posteriormente transferidas para o software SPSS 20

for Windows (Statistical Package for Social Sciences; IBM, USA) para análise

estatística. Inicialmente, foi realizada uma análise descritiva, e posteriormente, a

variáveis quantitativas apresentadas na forma de frequências absolutas e relativas,

enquanto a variável idade foi descrita por meio de média e desvio-padrão.

4.8.1 Análise de sobrevida

As taxas de sobrevida foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e a

comparação das curvas de sobrevida foram feitas através do teste de log-rank,

adicionalmente realizou-se a regressão de Cox com o auxílio do software STATA 1.0.

56

4.8.2 Análise de desfecho

Procurando identificar a relação existente entre a imunoexpressão das proteínas

de reparo do DNA (XRCC1, TFIIH e XPF) com o desfecho da doença selecionou-se

os casos que possuíam registro de óbito ou cinco anos de seguimento após o

diagnóstico da doença atendendo aos critérios de inclusão e exclusão. Foram

consideradas duas variáveis de desfecho: presença de recidiva loco-regional e estado

da doença (óbito ou remissão da doença, um foi excluído desta análise por apresentar

doença em progressão como desfecho).

Em seguida, para avaliar a associação entre os valores de imunoexpressão com

as variáveis gradação histopatológica e os diferentes desfechos dos casos de CELO

os dados foram submetidos aos testes Qui-quadrado de Pearson e nos casos que não

foi possível utilizá-lo, foi usado o teste Exato de Fisher. Foi adotado nível de

significância de 5% para todos os testes, sendo considerados significativos os valores

de p≤0,05.

57

RESULTADOS

58

282 diagnósticos

138 cirurgias

74 selecionados para estudo

56 (42,10%) blocos não encontrados

8 (6,01%) casos que não exibiram front

51 casos possuíam 5 anos de seguimento

5 RESULTADOS

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Entre janeiro de 2001 e dezembro de 2010 foram diagnosticados 282 CELO

nos hospitais da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, dos quais 133 (47,16%)

foram tratados por ressecção cirúrgica, que era condição necessária para seleção da

amostra. Segundo os critérios de inclusão estabelecidos para este estudo, foram

eliminados os casos cujo material arquivado era insuficiente para análise do “front” de

invasão tumoral ou quando não encontrado no arquivo. A amostra final ficou

constituída por 74 casos, nos quais realizou-se investigação de sobrevida. A análise

de desfecho foi realizada somente com os casos que possuíam o registro de 05 anos

de seguimento ou registro de óbito (n=51, 68,92%) (Figura 3).

Dos 74 casos selecionados, a maioria era de homens na proporção 2:1, etilistas

e tabagistas que exibiram estágio III ou IV do estadiamento clínico TNM (Tabela 1). A

idade média dos pacientes foi de 62,69 (±14,84) anos, onde 43,2% (n=32) possuíam

idade até 60 anos e 56,8% (n=42), idade maior que 60 anos.

Figura 3 - Casos de carcinoma epidermoide de língua oral registrados, entre janeiro de 2001 a

dezembro de 2010, no arquivo da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer segundo seleção para o

estudo. Natal- RN, 2016

Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer

59

Tabela 1 - Parâmetros clínicos e demográficos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral

selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016

Parâmetro n(%)

Gênero Masculino Feminino

49 (66,2) 25 (33,8)

Idade 10 a 40 anos 41 a 59 anos 60 a 74 anos > 75 anos

4 (5,4) 27 (36,5) 29 (39,2) 14 (18,9)

Tabagismo Não Sim Não informado

10 (13,5) 55 (74,3) 9 (12,2)

Etilista Não Sim Não informado

19 (25,7) 40 (54,1) 15 (20,3)

Tamanho do tumor (T)* T1 T2

T3 T4

Não informado

16 (21,6) 32 (43,2) 19 (25,7) 6 (8,1) 1 (1,4)

Comprometimento de linfonodos (N)* N0

N1 N2 Não informado

38 (51,4) 20 (27,0) 15 (20,3) 1 (1,4)

Estágio do tumor* I ou II III ou IV Não informado

29 (39,2) 44 (59,5) 1 (1,4)

Legenda: * Um caso não apresentou os valores do estadiamento clínico TNM

Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer

A presença de comprometimento linfonodal comprovado histologicamente foi

observada em 47,3% da amostra sendo a maioria identificada no início do tratamento.

O tratamento de escolha para maioria dos casos foi constituído pelas três

modalidades: cirurgia, radioterapia e quimioterapia, sendo que apenas 4,1%

realizaram tratamento prévio à cirurgia. Dezoito casos (24,3%) foram tratados

somente com cirurgia e 56 (75,7%), com cirurgia e outras formas de tratamento.

Quanto à presença de recidiva loco-regional, ocorreu em 32,4% dos casos e

destes, dois casos apresentaram mais de uma recidiva e 7 casos preenchiam os

critérios descritos como novo segundo tumor primário. Frente à baixa frequência de

novo segundo tumor primário, este evento foi adicionado ao parâmetro presença de

recidiva loco-regional na análise de desfecho. A presença de metástase à distância

foi observado em 5 (6,8%) casos (Tabela 2).

60

Tabela 2 - Parâmetros clínicos de seguimento dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral

selecionados para análise de sobrevida. Natal –RN, 2016

Parâmetro n (%)

Metástase linfonodal (comprovação histopatológica)

Ausente Presente

35 (47,3) 39 (52,7)

Etapa do comprometimento linfonodal Início do tratamento Durante o tratamento

37 (94,9) 2 (5,1)

Tratamento Cirurgia Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio Cirurgia, radio e quimio Tratamento prévio a cirurgia

18 (24,3) 24 (32,4) 29 (39,2) 3 (4,1)

Presença de novo tumor primário Não houve Carcinoma epidermoide Carcinoma não epidermoide

66 (89,2) 7 ( 9,5) 1 (1,4)

Recidiva loco-regional Não Sim

50 (67,6) 24 (32,4)

Número de recidiva loco-regional 1 Mais de 1

22 (91,7) 2 (8,3)

Metástase à distância Não Sim

69 (93,2) 5 (6,8)

5 anos de seguimento Não Sim ou há data do óbito

23 (31,1) 51 (68,9)

Fonte: Liga Norte Riograndense Contra o Câncer

5.2 RESULTADOS MORFOLÓGICOS

A análise morfológica dos casos de CELO segundo o modelo proposto por

Brandwein-Gensler et al. (2005), demonstrou 59,5% dos casos classificados como de

risco intermediário, sendo os parâmetros invasão perineural em pequenos nervos e a

presença de invasão tipo 4 os de maior frequência (64,9% e 77% respectivamente).

Na análise morfológica utilizando o sistema proposto por Almangush et al (2015),

identificou-se maior frequência de mais de 5 buds e profundidade tumoral maior que

4mm (58,1% e 77,0%) o que agrupou a maioria dos casos na classificação de alto

risco (Figura 4 e Tabela 3).

61

Tabela 3 - Distribuição absoluta e relativa dos parâmetros de análise histopalógicos dos casos de

carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al. (2005) e

Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016

Parâmetro n (%)

Invasão perineural Não há Em nervos pequenos

26 (35,1) 48 (64,9)

Infiltrado linfocitário Contínuo Em placas Pouco ou nenhum

41 (55,4) 18 (24,3) 15 (20,3)

Pior padrão de invasão Padrão 1, 2 ou 3 Padrão 4 Padrão 5

14 (18,9) 57 (77,0)

3 (4,1)

Gradação final pelo sistema de Brandwein Gensler Baixo risco Risco intermediário Alto risco

4 (5,4)

44 (59,5) 26 (35,1)

Tumor budding Até 5 5 ou mais

31 (41,9) 43 (58,1)

Profundidade de invasão Até 4mm Maior que 4 mm

17 (23,0) 57 (77,0)

Gradação final pelo sistema de Almangush Baixo risco Risco intermediário Alto risco

12 (16,2) 24(32,4) 38 (51,4)

Fonte: Elaboração própria

62

Figura 4 – Carcinoma epidermoide de língua oral - parâmetros de análise histopatológicos propostos por Brandwein-Gensler et al. (2005) e Almangush et al. (2015): (A) invasão perineural (barra de

escala 100µm); (B) pouco infiltrado inflamatório (barra de escala de 200µm);(C) Padrão de invasão tipo 5 (barra de escala 500µm); (D) Profundidade tumoral de 14.300,75 µm (barra de escala

5000 µm); (E e F) tumor budding, barra de escala 100µm. Natal – RN, 2016 (Pannoramic Viewer, H/E)

Fonte: Elaboração própria

62

1.175,5 µm

63

5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

A reatividade aos anticorpos anti-XRCC1, -TFIIH e -XPF foi observada em

todos os casos, sendo considerada positiva toda célula que mostrou coloração

acastanhada em núcleo e/ou citoplasma, independente da intensidade. A proteína

XRCC1 mostrou marcação nuclear de intensidade moderada a fraca na maioria dos

casos. Destaca-se que apenas dois casos de toda amostra exibiram células

neoplásicas com imunorreatividade citoplasmática. A expressão de TFIIH nas

células neoplásicas foi predominantemente citoplasmática com fraca

imunorreatividade. A proteína XPF exibiu moderada a forte imunorreatividade

nuclear e citoplasmática na maioria dos casos (Tabela 4 e Figuras 5).

Tabela 4 – Análise da imunorreatividade das proteínas XRCC1,TFIIH e XPF dos casos de carcinoma

epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

Parâmetros n (%)

Intensidade nuclear de XRCC1 Fraca Moderada Forte

42 (56,8) 21 (28,4) 11 (14,9)

Expressão nuclear de XRCC1

Até 10% 11% a 50% >50%

9 (12,2)

16 (21,6) 49 (66,2)

Intensidade nuclear de TFIIH

Fraca Moderada Forte

57 (77,0) 16 (21,6) 1 (1,4)

Expressão nuclear de TFIIH

Até 10% 11% a 50% >50%

56 (75,7) 5 (6,8) 13 (17,6)

Intensidade citoplasmática de TFIIH

Fraca Moderada Forte

61 (82,4) 12 (16,2) 1 (1,4)

Expressão citoplasmática de TFIIH

Até 10% 11% a 50% >50%

9 (12,2) 9 (12,2) 56 (75,7)

Intensidade nuclear de XPF

Fraca Moderada Forte

16 (21,6) 32 (43,2) 26 (35,1)

Expressão nuclear de XPF

Até 10% 11% a 50% >50%

9 (12,2)

14 (18,9) 51 (68,9)

Intensidade citoplasmática de XPF

Fraca Moderada Forte

20 (27,0) 34 (46,0) 20 (27,0)

Expressão citoplasmática de XPF

Até 10% 11% a 50% >50%

3 (4,1) 6 (8,1) 65 (87,8)

Fonte: Elaboração própria

64

Figura 5 – Carcinoma epidermoide de língua oral – (A) Elevada imunomarcação para XRCC1 no

front tumoral; (B) Detalhe da imunoexpressão da proteína XRCC1 em núcleo; (C) Elevada

imunomarcação para TFIIH no front tumoral ; (D) Detalhe da imunoexpressão da proteína TFIIH em

núcleo e citoplasma; (E) Elevada imunomarcação para XPF no front tumoral ; (F) Detalhe da

imunoexpressão da proteína XPF em núcleo e citoplasma (A,C,D barra de escala identificando valor

de 1000µm; B,E,F barra de escala identificando 100 µm, Pannoramic Viewer, HIDEF)

Fonte: Elaboração própria

XR

CC

1

TF

IIH

X

PF

65

5.4 ANÁLISE DE SOBREVIDA

A taxa de sobrevida global em cinco anos nos pacientes estudados foi de

58,03% com mediana de 28 meses (Figura 6).

Figura 6 - Sobrevida global dos pacientes com carcinoma epidermoide de língua oral selecionados

para o estudo. Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

Para todas as co-variáveis foi utilizado o estimador de Kaplan-Meier para

obtenção das curvas de sobrevida. As Figuras 7 a 11 compreendem as curvas de

sobrevida estimadas para as co-variáveis clinicas, demográficas, de seguimento,

de análise histopatológica e da imunorreatividae das proteínas de reparo do

DNA,TFIIH, XPF, e XRCC1.

Foi realizado o teste de log-rank para verificar se havia associação das co-

variáveis com o tempo de sobrevida dos pacientes e através de regressão de Cox

obteve-se o HR de cada variável (Figura 7 a 11e Tabelas 5, 7 e 9).

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Sobrevida global

n = 74

S (

t)

66 Figura 7 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as co-variáveis (A)

gênero, (B) idade, (C) tamanho do tumor (T), (D) comprometimento linfonodal no diagnóstico (N),

(E) estadiamento clínico TNM e (F) a presença de metástase linfonodal com confirmação

histopatológica em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Masculino Feminino

Gênero

p = 0,22

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

até 60 anos Maior que 60 anos

Idade

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

T1 E T2 T3 E T4

Tamanho do tumor (T)0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

N 0 N1 ou N2

Comprometimento de linfonodos (N)

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Estagios I ou II Estagios III ou IV

Estágio do tumor

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Ausente Presente

Metástase linfonodal

A B

C D

E F

p = 0,51

S (

t)

S (

t)

S (

t)

p = 0,51

p = 0,03

S (

t)

S (

t)

S (

t)

p < 0,03

p < 0,01 p = 0,12

67

Figura 8 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as co-variáveis (A)

tratamento e (B) recidiva loco-regional em carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

A regressão de Cox demonstrou que dentre as variáveis clinico-patológicas,

o tamanho do tumor (T), metástase para linfonodos (N) e estadiamento clínico TNM

e profundidade de invasão demonstraram possuir associação significativa com o

óbito por CELO (Tabelas 5 a 7).

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Ausente Presente

Recidiva loco-regional

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Apenas cirurgia Cirurgia e outros

Tratamento

A B

p = 0,37

S (

t)

p = 0,27 S

(t)

68

Tabela 5 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordoo com parâmetros clínico e demográficos

dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal –RN, 2016

Parâmetro N Nº de óbitos

Sobrevida em 5 anos

(%) IC 95% HR (IC 95%) p

Gênero

Masculino Feminino

49 25

14 12

63,66 47,86

46,11 – 76,85 26,29 – 66,61 1,60(0,74 – 3,47) 0,23▲

Idade

Até 60 anos > 60 anos

32 42

13 13

52,15 62,50

31,78 – 69,08 43,93 – 76,45 0,77(0,36 – 1,67) 0,51▲

Tabagismo

Não Sim

10 55

4 19

60,00 60,81

25,27 – 82,72 45,44 – 73,08 0,97(0,34 -2,81) 0,96▲

Etilista

Não Sim

19 40

5 16

72,70 54,44

46,27 – 87,64 36,57 – 69,25 0,82(0,28 – 2,43) 0,73▲

Tamanho do tumor (T)*

T1 ou T2

T3 ou T4

48 25

11 14

73,32 27,80

56,87– 84,31 9,80– 49,38 3,08(1,39 – 6,86) <0,01▲

Comprometimento de linfonodos (N)*

N0

N1, N2 e N3

38 35

9 16

69,57 48,26

49,40– 8297 29,47 – 64,76 2,40(1,06 – 5,48) 0,04▲

Estágio do tumor*

I ou II III ou IV

29 44

5 20

76,99 47,57

53,05– 89,78 30,65– 62,70 3,24(1,21 – 8,66) 0.02▲

Metástase linfonodal

Não Sim

35 39

9 17

66,87 51,08

45,68 – 81,33 33,04– 66,53 1,87(0,83 – 4,22) 0,12▲

Tratamento

Só cirurgia

Cirurgia e outros

20 54

4 22

68,94 55,41

35,78 – 87,41 40,31 – 68,13 1,62(0,56 – 4,71) 0,38▲

Recidiva loco-regional

Não Sim

50 24

14 12

63,68 48,75

46,07 – 76,89 27,45 – 67,08 1,54(0,71 – 3,32) 0,28▲

Legenda: HR - hazard ratio ▲ regressão de Cox; * Um caso não foi possível identificar os valores de estadiamentoTNM; IC 95% - intervalo de confiança de 95% Fonte: Elaboração própria

69 Figura 9 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise

histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) invasão perineural, (B)

infiltrado inflamatório, (C) padrão de invasão, (D) gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler

et al. (2005. Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Ausente Em pequenos nervos

Invasão Perineural

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Contínuo Em placas

Pouco ou nenhum

Infiltrado linfocitário

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Padrão 1 2 ou 3 Padrão 4

Padrão 5

Padrão de invasão0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Baixo risco Risco intermediário

Alto risco

Gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler

B A C

D

p = 0,14

S (

t)

S (

t)

S (

t)

S (

t)

p = 0,97 p = 0,75

p = 0,74

70 Figura 10- Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para o parâmetros de análise

histopatológicos dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral (A) tumor budding, (B)

profundidade e (C) gradação final pelo sistema de Almangush et al. (2015). Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Até 5 5 ou mais

Tumor budding

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Até 4mm Maior que 4mm

Profundidade

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Baixo risco Risco intermediário

Alto risco

Gradação final pelo sistema de Almangush

B A

C

S (

t)

p = 0,05

S (

t)

p = 0,03

S (

t)

p = 0,11

71

Tabela 6 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com parâmetros de análise histopatológicos

dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral segundo proposto por Brandwein-Gensler et al.

(2005) e Almangush et al. (2015). Natal –RN, 2016

Parâmetro N Nº de óbitos

Sobrevida em 5 anos

(%) IC 95% HR (IC 95%) p

Invasão Perineural Ausente Pequenos nervos

26 48

6 20

71,48 51,34

47,01 – 86,13 34,94 – 65,52

1,96(0,79 – 4,89) 0,15▲

Infiltrado Linfocitário Contínuo Em placas Ausente

41 18 15

14 6 6

60,59 55,28 55,28

42,32 – 74,68 13,72 – 26,01 13,72 – 26,01

1( - -) 1,12 (0,43 – 2,91) 1,07(0,41 – 2,79)

- - 0,82▲ 0,88▲

Padrão de invasão 1 ou 2 ou 3 4 5

14 57 3

4 21 1

67,31 55,59 50,00

34,03 – 86,47 40,07 – 68,60 0,06 – 91,04

1(- -) 1,48(0,51 – 4,31)

1,67(0,18 – 14,95)

- - 0,47▲ 0,65▲

Gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler Baixo risco Risco intermediário Alto risco

4 44 26

1 17 18

50,00 56,37 61,80

0,06 – 91,04

39,11 – 70,47 37,65 – 78,89

1 (- -) 0,57(0,07 – 4,32) 0,47(0,05 – 3,81)

- - 0,59▲ 0,48▲

Tumor budding Até 5 5 ou mais

31 43

7 19

71,14 49,46

50,41 – 95,90 32,51 – 64,32

1,99(0,83 – 4,74) 0,12▲

Profundidade de invasão Até 4 mm > 4 mm

17 57

2 24

84,42 50,85

52,45 – 96,30 35,79 – 64,08

4,12(0,97 –17,48) 0,05▲

Gradação final pelo sistema de Almangush Baixo risco Risco intermediário Alto risco

12 24 38

0 9 17

100,00 55,56 48,03

----- 31,19 – 74,34 30,02 – 63,97

4,6 .10-16 (- -)

1,05 (0,47 – 2,36) 1,94 (0,86 – 4,37)

1,00▲ 0,90▲ 0,10▲

Legenda: HR - hazard ratio; ▲ regressão de Cox; IC 95% - Intervalo de confiança de 95% Fonte: Elaboração própria

72

Tabela 7 - Taxa de sobrevida em 5 anos e HR de acordo com os parâmetros de expressão das proteínas

de reparo do DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) nas células do front tumoral de carcinoma epidermoide de

língua oral. Natal – RN, 2016

Parâmetro N Nº de óbitos

Sobrevida em 5 anos

(%) IC 95% HR (IC 95%) p

XRCC1 Baixo Alto

25 49

11 15

52,29 61,71

30,33 70,31 44,32 75,10

0,86 (0,58 – 1,26) 0,44▲

TFIIH Baixo Alto

17 57

6 20

59,26 58,10

30,70 79,31 42,53 70,83

1,19 (0,48 – 2,97) 0,71▲

XPF Baixo Alto

5

69

2

24

60,00 57,90

12,57 88,18 43,72 69,71

1,17 (0,28 – 4,97) 0,83▲

Legenda: HR - hazard ratio; ▲ regressão de Cox; IC 95% - Intervalo de confiança de 95% Fonte: Elaboração própria

Figura 11 - Curvas de sobrevida obtidas pelo método de Kaplan-Meier para as covariáveis da

imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA (A) XRCC1, (B)TFIIH e (C) XPF nas células do front

tumoral de carcinoma epidermoide de língua oral. Natal – RN, 2016

Fonte: Elaboração própria

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Baixo Alto

XRCC1

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Baixo Alto

TFIIH

0.0

00.2

50.5

00.7

51.0

0

0 20 40 60Meses

Baixo Alto

XPF

A B

C

S (

t)

p = 0,43

S (

t)

p = 0,83

S (

t)

p = 0,71

73

5.5 ANÁLISE DE DESFECHO

Dos 74 casos de CELO selecionados para a investigação de sobrevida, 51 (68,92%)

possuíam registro, em prontuário, de seguimento de cinco anos após o diagnóstico. Deste

grupo, identificou-se 26 (51,0%) óbitos, 24 (47,1%) apresentaram remissão da doença e 1

(2,0%) paciente exibiu doença em progressão. Para a análise de desfecho após cinco anos de

diagnóstico de CELO foram selecionados apenas os desfechos óbito e remissão.

A investigação da relação da imunoexpressão das proteínas de reparo XRCC1, TFIIH e

XPF com parâmetros clínicos de diagnóstico e seguimento identificou que CELO com

estadiamento clínico TNM I ou II possuíam alta expressão de XRCC1 diferente do grupo

estadiamento clínico III ou IV (Tabela 11).

O teste de associação realizado entre as imunoexpressões das proteínas de reparo

XRCC1, TFIIH e XPF com os parâmetros morfológicos propostos por Brandwein-Gesler et al.

(2005) e por Almangush et al. (2015) não identificou relação entre as variáveis (Tabela 12).

74

Tabela 8 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a imunoexpressão das proteínas de reparo do

DNA (TFIIH, XPF e XRCC1), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase linfonodal, o tratamento,a presença de recidiva loco-regional e o desfecho

em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2016

Parâmetro XRCC1 p TFIIH p XPF p

Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto

Estadiamento* I ou II III ou IV

4 (21,1) 16 (53,3)

15 (78,9) 14 (46,7)

0,02# 6 (31,6) 8 (26,7)

13 (68,4) 22 (73,3)

0,71# 1 (5,3) 3 (10,0)

18 (94,7) 27 (90,0)

0,99†

Metástase linfonodal Ausente Presente

8 (33,0) 12 (46,2)

16 (66,7) 14 (53,8)

0,35# 9 (37,5) 5 (19,2)

15 (62,5) 21 (80,8)

0,15# 1 (4,2) 3(11,5)

23 (95,8) 23 (88,5)

0,61†

Tratamento Cirurgia Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio Cirurgia, radio e quimio Tratamento prévio a cirurgia

4 (44,4) 6 (30,0) 9 (45,0) 1 (100,0)

5 (55,6) 14 (70,0) 11(55,0) 0 (0,0)

- - 1 (11,1) 4 (20,0) 8 (40,0) 1 (100,0)

8 (88,9) 16 (80,0) 12 (60,0) 0 (0,0)

- - 0 (0,0) 1 (5,0) 3 (15,0) 0 (25,0)

9 (100,0) 19 (95,0) 17 (85,0) 1 (100,0)

- -

Tratamento Apenas cirurgia Cirurgia e outros

5 (50,0) 15 (37,5)

5 (50,0) 25 (62,5)

0,49† 2 (20,0) 12 (30,0)

8 (80,0) 28 (70,0)

0,79† 0 (0,0) 4 (10,0)

10(100,0)

36 (90,0) 0,57†

Recidiva loco-regional Ausente Presente

15 (45,5) 5 (29,4)

18 (54,5) 12 (70,6)

0,27# 9 (27,3) 5 (29,4)

24 (72,7) 12 (70,6)

0,99† 2 (6,1) 2 (11,8)

31 (93,9) 15 (88,2)

0,60†

Desfecho Remissão Óbito

9 (37,5) 11 (42,3)

15 (62,5) 15 (57,7)

0,73# 8 (33,3) 6 (23,1)

16 (66,7) 20 (76,9)

0,42# 2 (8,3) 2 (7,7)

22 (91,7) 24 (92,3)

0,99†

Legenda: * Um caso não foi possível identificar o estadiamento clínico# Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

74

75 Tabela 9 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral que possuem cinco anos de acompanhamento, de acordo com

a gradação de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al. (2005) e por Almangush et al. (2015) e a imunoexpressão das proteínas de reparo do

DNA (TFIIH, XPF e XRCC1) Natal – RN, 2016

Parâmetro XRCC1 p TFIIH p XPF p

Baixo Alto Baixo Alto Baixo Alto

Invasão perineural

Ausente Pequeno

8 (50,0) 12 (35,3)

8 (50,0) 22 (64,7)

0,32# 7 (43,8) 7 (20,6)

9 (56,3) 27 (79,4)

0,10† 2 (12,5) 2 (5,9)

14 (87,5) 32 (94,1)

0,58†

Infiltrado linfocitário

Continuo Em placa Fraco

9 (33,3) 7 (63,6) 4 (33,3)

18 (66,7) 4 (36,4) 8 (66,7)

- - 7 (25,9) 2 (18,2) 5 (41,7)

20 (74,1) 9 (81,9) 7 (58,3)

- - 2 (7,4) 0 (0,0) 2 (16,7)

25 (92,6) 11 (100,0) 10 (83,3)

- -

Pior padrão de invasão

1 ou 2 ou 3 4 5

5 (50,0) 15 (40,5) 0 (0,0)

5 (50,0) 22 (59,5) 3 (100,0)

- - 2 (20,0)

10 (27,0) 2 (66,7)

8 (80,0) 27 (73,0) 1 (33,3)

- - 2 (20,0) 2 (5,4) 0 (0,0)

8 (80,0) 35 (94,6) 3 (100,0)

- -

Gradação final pelo sistema de Brandwein-Gensler Baixo risco Risco intermediário Alto risco

0 (0,0) 14 (46,7) 6 (31,6)

1 (100,0) 16 (53,3) 13 (68,4)

- - 0 (0,0) 8 (26,7) 6 (31,6)

1 (100,0) 22 (73,3) 13 (68,4)

- - 0 (0,0) 1 (3,3) 3 (15,8)

1 (100,0) 29 (96,7) 16 (84,2)

- - -

Tumor Budding Até 5 5 ou mais

10 (55,6) 10 (31,3)

8 (44,4) 22 (68,8)

0,09# 5 (27,8) 9 (28,1)

13 (72,2) 23 (71,9)

0,98# 2 (11,1) 2 (6,3)

16 (88,9) 30 (93,8)

0,61†

Profundidade de invasão

Até 4 mm > 4 mm

3 (30,0) 11 (42,5)

7 (70,0) 23 (57,5)

0,72† 3 (30,0) 11 (27,5)

7 (70,0) 29 (72,5)

0,99† 2 (20,0) 2 (5,0)

8 (80,0) 38 (95,0)

0,17†

Gradação final pelo sistema de Almangush Baixo risco Risco intermediário Alto risco

2 (33,3) 9 (56,3) 9 (32,1)

4 (66,7) 7 (43,8)

19 (67,9)

- - 2 (33,3) 4 (25,0) 8 (28,6)

4 (66,7) 12 (75,0) 20 (71,4)

- - 2 (33,3) 0 (0,0) 2 (7,1)

4 (66,7) 16 (100,0) 26 (92,1)

- -

Legenda: # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

75

76

DISCUSSÃO

77

6 DISCUSSÃO

O carcinoma epidermoide representa a neoplasia maligna mais prevalente em

cavidade oral, com destaque para a elevada frequência em língua e evolução

comumente associada a altos índices de morbidade e mortalidade. Possui etiologia

multifatorial onde fatores endógenos associados à ação de um ou mais agente

exógeno, determinam mudanças genéticas que progridem através de uma série de

mutações em genes específicos, resultando em erros na replicação genética e/ou no

processo de reparo do DNA. Dos fatores extrínsecos, o fumo e o álcool constituem os

principais fatores de risco para o surgimento desta neoplasia, uma vez que tais

agentes podem lesar o DNA, levando a erros que devem ser corrigidos por enzimas

envolvidas em diferentes mecanismos responsáveis pelo reparo do DNA.

Neste contexto, os genes de reparo do DNA com suas proteínas

correspondentes vêm sendo alvos de numerosas investigações a respeito de

possíveis alterações genéticas determinantes do funcionamento inadequado destas

proteínas, resultando em maior susceptibilidade individual tanto para o surgimento, de

um câncer, quanto na sua evolução. Verifica-se na literatura pertinente, escassez de

trabalhos investigando a correlação da expressão de proteínas do reparo do DNA com

o prognóstico do carcinoma epidermoide de língua.

Segundo Mahjabeen et al. (2014) o sistema de reparo desempenha papel

importante na proteção do genoma humano contra danos causados por carcinógenos

presentes no meio-ambiente, com destaque para as proteínas XRCC1 e APE1 da via

de reparo por excisão de bases (BER) e TFIIH e XPF da via de reparo por excisão de

nucleotídeos (NER). Estudo recente de Farnebo et al. (2015) demonstrou a presença

de polimorfismos em genes do reparo do DNA em pacientes com diversos tipos de

câncer, incluindo o CEO; no entanto, até o momento, poucos estudos investigaram a

expressão imuno-histoquímica das proteínas envolvidas no reparo do DNA como

biomarcadores prognósticos nesta doença.

Fundamentados nesses conhecimentos, este experimento buscou investigar se

a imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF poderia ser

utilizada como possível biomarcador prognóstico em carcinoma epidermoide de língua

78

oral avaliando possíveis associações entre a imunoexpressão das proteínas e

parâmetros clinicopatológicos e sobrevida em pacientes com essa doença.

O perfil dos pacientes acometidos por CELO caracteriza-se por homens com

idade superior a 60 anos, tabagista e etilista. Comumente, o tumor é diagnosticado no

estágio III ou IV, conforme o estadiamento TNM (LI et al., 2013, FERNÁNDEZ et al.,

2015). Mesmo sem modificar este perfil, alguns estudos apontam o incremento na

incidência de CEO em mulheres, com idade inferior a 45 anos e que não possuem

hábito de etilismo e/ou tabagismo (DURR et al., 2013, PICKERING et al., 2014).

No presente estudo, observou-se idade média de 61,6 anos, prevalência de

homens tabagistas e etilistas. Em relação aos pacientes jovens identificou-se que

apenas 5,4% dos pacientes possuíam idade igual inferior a 40 anos. Estes dados

corroboram os citados na maioria dos estudos publicados na literatura (LI et al., 2013,

GUNTINAS-LICHIUS et al., 2014, MESQUITA et al., 2014, FERNÁNDEZ et al., 2015,

MIRZAEI, et al, 2015).

Dentre as variáveis clínicas pesquisadas, tamanho do tumor (T),

comprometimento de linfonodos (N) e estágio do tumor apresentaram valor preditivo

para o CELO, identificando o forte poder preditivo do sistema TNM e de seus

parâmetros, como observado por Preuss et al.( 2007), Kreppel et al.(2011), Mucke

et al. (2014), Okuyemi, Piccirillo e Spitznagel (2014) e Thiagarajan et al. (2014).

A variabilidade na apresentação de características morfológicas do carcinoma

epidermoide suscita a investigação de parâmetros morfológicos como possíveis

parâmetros preditivos de recidiva loco-regional e até mesmo da sobrevida do paciente.

Sistemas de gradação histopatológica de malignidade vêm sendo propostos desde a

década de 20. Em 2005, Brandwein-Gensler et al. publicaram um esquema de

classificação para o CE baseado nos parâmetros: presença de invasão perineural,

distribuição do infiltrado inflamatório e pior padrão de invasão tumoral.

Na presente pesquisa observou-se maior frequência de invasão perineural em

pequenos nervos, infiltrado inflamatório contínuo e padrão de invasão tipo 4,

parâmetros que direcionaram a classificação da maioria da amostra como risco

intermediário. A análise de sobrevida não identificou valor preditivo nos parâmetros

propostos nesta gradação semelhantes ao resultado de Sawazaki-Calone et al. (2015)

79

e diferente dos apresentados por Brandwein-Gensler et al. (2005). Esta discordância

reflete a variabilidade em parâmetros clínicos, tamanho amostral e número de óbitos

das amostras de cada estudo. Adicionalmente Sawazaki-Calone et al. (2015)

descrevem que a inconsistência de resultados pode ser atribuído à subjetividade na

classificação de alguns parâmetros do sistema proposto por Brandwein-Gensler.

Segundo Almangushu et al. (2015), a classificação do infiltrado inflamatório é o

parâmetro que apresenta maior discordância.

Nossos resultados da análise morfológica pelo sistema de Almangush et al.

(2015) identificam maior frequência de casos de CELO com alto risco, elencando

profundidade de invasão como parâmetro com valor prognóstico (HR 4,12, IC 95 0,97-

17,48). Adicionalmente, observamos valores de sobrevida em cinco anos menor nos

casos de CELO com profundidade de invasão maior que 4 mm e gradação final pelo

sistema classificado como alto risco. Resultados semelhantes foram observados por

Ahmedhajiomar et al. (2015), Attramadal et al. (2015) e Sawazaki-Calone et al. (2015).

Estes achados podem estar relacionados à dispersão das células tumorais

frequentemente encontrada em lesões com elevada profundidade. As dispersões

destas células facilitam a migração e a tumorigênese, eventos que convergem ao

maior potencial invasivo e desenvolvimento de metástase.

O parâmetro denominado tumor budding é definido pelos autores como

pequenos agrupamentos celulares que refletem a transição epitelial-mesenquimal. Foi

investigado por Wang et al. (2011) e Xie et al.(2015) que identificaram a presença de

mais de 5 buds como fator preditivo independente para CELO. Em nossa pesquisa,

não foram observados resultados semelhantes neste parâmetro; entretanto

analisando o conjunto dos parâmetros da gradação de Almanghush et al. (2015)

identificamos seu forte poder preditivo nos CELO analisados.

Destaca-se que ao comparar os resultados dos dois sistemas de gradação

utilizados nesta pesquisa, a gradação de Almangush et al. (2015) exibiu resultados

mais expressivos. Acreditamos que a maior objetividade dos parâmetros desta

gradação direciona a identificação de fator preditivo para CELO.

A busca de biomarcadores prognósticos que indiquem o nível de

agressividade tumoral e de resposta do tumor/hospedeiro ao tratamento é objetivo de

numerosas pesquisas. Dentre estas, merecem destaque aquelas que analisam o

80

padrão de expressão, através de método imuno-histoquímico, de diversas proteínas

envolvidas com processos relacionados com a tumorigênese. Alguns destes

experimentos vêm demonstrando associação de proteínas do reparo do DNA tanto

com o risco para o desenvolvimento de alguns cânceres como para o estabelecimento

de agressividade e sensibilidade a radio e/ou quimioterapia.

No presente estudo, observou-se de uma maneira geral, elevada

imunoexpressão das proteínas de reparo do DNA XRCC1, TFIIH e XPF em células de

CELO. Observamos que a proteína XRCC1 exibiu marcação predominantemente

nuclear semelhante ao descrito por Ang et al. (2011) em carcinoma epidermoide de

cabeça e pescoço e por Huang et al. (2013) em carcinoma colorretal.

Contraditoriamente Mahjabeen et al. (2014) descrevem imunoexpressão de XRCC1

em núcleo e citoplasma em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Os próprios

autores descrevem que a imunolocalização citoplasmática de XRCC1 é um achado

contraditório ao que é relatado e que investigações anteriores do seu grupo de

pesquisa identificaram a presença de mutação no gene desta proteína, o que pode

influenciar da diminuição de expressão desta proteína, interferindo na incidência de

carcinoma de cabeça e pescoço na população paquistanesa, entretanto, o mecanismo

exato permanece desconhecido.

A proteína TFIIH apresentou-se predominantemente citoplasmática e

fracamente nuclear, localização equivalente à descrita por Ye et al. (2012) em

carcinomas uterinos, enquanto a proteína XPF apresentou-se predominantemente

nuclear e citoplasmática padrão semelhante ao descrito por Seiwert et al. (2014) em

carcinomas da região de cabeça e pescoço.

Em relação à proteína XRCC1 a presente pesquisa identificou elevada

expressão na maioria dos casos (66,2%) de forma semelhante ao descrito por Ang et

al. (2011) que identificaram 55,8% dos casos de carcinoma epidermoide de cabeça e

pescoço com superexpressão de XRCC1.

Diferentemente, Mahjabeen et al. (2014) descrevem redução de mRNA da

proteína XRCC1 e redução de sua imunoexpressão em pacientes com carcinoma

epidermoide de cabeça e pescoço. A expressão de mRNA identificou 64% de casos

com baixa regulação, 30% alta e 6% não foi identificada alteração. Enquanto a análise

da imunorreação identificou 48% casos como fraco, 32% moderado e 20% forte.

81

Esta diferença de resultados pode ser explicada pela tumorigenêse dos

cânceres da região de cabeça e pescoço que exibe um padrão heterogêneo de

expressão de proteínas, por vezes específico do sitio anatômico como descrito por

Seiwert et al (2014). Destaca-se que há escassez de pesquisas que investigam

proteínas de reparo do DNA em CELO pela técnica de imuno-histoquímica.

A investigação da relação da imunoexpressão de XRCC1 e sobrevida

realizada na presente pesquisa não identificou valor preditivo desta proteína.

Diferentemente, Ang et al. (2011) descrevem que alta expressão de XRCC1 está

associada a menor sobrevida em carcinoma de cabeça e pescoço.

No presente estudo, estadiamentos clínicos TNM I e II apresentaram

associação com maior imunoexpressão de XRCC1 evento não observado nas

investigações de Ang et al. (2011) e Mahjabeen et al. (2014). Esta distribuição pode

ser justificada, em parte, pela amostra do estudo possuir número reduzido de casos

com estadiamento I e II (39,2%) em relação ao estadiamento III e IV (59,5%).

A investigação da imunoexpressão de XRCC1 realizada nesta pesquisa não

identificou associação com a presença de recidiva loco-regional e óbito; entretanto,

observa-se que estes dois parâmetros apresentam maior frequência no grupo com

alta expressão (70,6% e 57,7%, respectivamente). Adicionalmente, observou-se que

níveis elevados de XRCC1 nos casos que possuíam mais de 5 de buds em CELO

embora estes dados não tenham significado estatístico, podem sinalizar a relação de

níveis elevados desta proteína com os piores desfechos.

Estudo realizado por Abdel-Fatah et al. (2013) identificou que a

superexpressão de XRCC1 está associada aos piores desfechos em carcinoma

ovariano. Entretanto, estudos realizados com melanoma (BHANDARU et al., 2014) e

carcinoma de colo uterino (BAJPAI et al., 2013) demonstram que níveis elevados de

XRCC1 estão relacionados aos melhores parâmetros clínicos, morfológicos e de

seguimento destas neoplasias.

A elevada imunoexpressão de XRCC1 identificada em diversos cânceres está

relacionada com distintos desfechos, fato que sugere que esta proteína pode exercer

efeito reparativo em células tumorais promovendo a progressão com desenvolvimento

de resistência a terapêutica e metástase. Entretanto, a XRCC1 também pode exercer

82

efeitos protetores ao paciente. Concordamos com Lianos et al. (2014) que descreve

que a heterogeneidade interpaciente e intratumoral são os eventos que melhor

explicam os eventos de progressão tumoral, aparecimento de resistência e potencial

metastático. Na dinâmica da progressão tumoral, quando uma via metabólica

encontra-se prejudicada outras relações são estabelecidas, circunstância favorecida

pela variação genotípica dos clones tumorais.

A maioria dos casos de CELO da presente pesquisa exibiu elevada

imunomarcação para TFIIH, evidenciada predominantemente em citoplasma e com

intensidade fraca nas células do front tumoral. Na investigação da relação desta

expressão com parâmetros clínicos, morfológicos e de desfecho não encontramos

associações estatisticamente significantes. Entretanto, os casos de CELO que

exibiram invasão perineural, apresentaram elevada imunoexpressão de TFIIH.

Embora este dado não tenha significado estatístico este parâmetro, indicador de

agressividade tumoral, pode estar relacionado a elevada expressão desta proteína.

Estudo de Chen et al. (2015), através de análise proteômica, identificou associação

da proteína TFIIH com a gradação morfológica em carcinoma epidermoide de laringe.

A XPF foi outra proteína da NER analisada no presente estudo, apresentando

elevada imunoexpressão nuclear e citoplasmática com intensidade moderada. Estes

resultados são semelhantes aos observados por Vaezi et al. (2011), que identificaram

elevada imunoexpressão de XPF em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço,

com destaque aos localizados na cavidade oral em relação aos outros sítios. Os

pacientes que apresentaram imunoexpressão abaixo da mediana possuíram

sobrevida de 1 ano de 28%, enquanto aqueles que demonstraram imunoexpressão

acima da mediana, 53%.

Na presente pesquisa não identificamos relação da elevada expressão de

XPF com parâmetros clínicos e de desfecho. Semelhantemente, Jagdis et al. (2013)

não identificaram relação da imunoexpressão nuclear de XPF em carcinoma de

nasofaringe não metastático com o tempo de desenvolvimento de recorrência loco-

regional, tempo de sobrevida livre de doença e tempo de sobrevida global.

No entanto Seiwert et al. (2014) identificaram que pacientes com carcinoma

epidermoide de cabeça e pescoço com estágio IV que apresentaram maior

imunoexpressão de XPF exibiram as piores evoluções clinicas em comparação com

83

aqueles que apresentaram menor imunoexpressão da proteina. Entretanto, estes

pesquisadores não verificaram associação da imunoexpressão de XPF com a

sobrevida global de pacientes com carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço,

resultado semelhante ao descrito em nossa pesquisa.

Esta pesquisa como toda pesquisa retrospectiva, apresenta algumas

limitações. Utilizar material arquivado implica na influência de fatores como condições

de catalogação, de armazenamento e processamento histológico dos blocos de

CELO. As diferenças de resultados encontrados na literatura em pesquisas que

utilizam a técnica imuno-histoquímica, no qual incluímos este estudo, deve-se a

limitações de diversas naturezas. Diversidades nas etapas laboratorias, na

categorização da expressão das proteínas são fatores que dificultam a ideal

comparação entre os diversos estudos publicados.

Nossos resultados identificam que a alta imunoexpressão das proteínas

XRCC1, THFIIH e XPF não está relacionada com parâmetros clínicos e

histopatológicos nos casos de CELO analisados, não podendo ser utilizado como

marcador prognóstico. Acredita-se que o sitio anatômico é um fator importante na

iniciação e progressão tumoral. Novos estudos com amostras maiores e envolvendo

diferentes técnicas são necessários para identificar mecanismos moleculares que

interferem a atividade das proteínas de reparo do DNA e o potencial preditivo de cada

proteína.

84

CONCLUSÕES

85

7 CONCLUSÕES

Com base nos resultados desta pesquisa, pode-se concluir que:

1. As variáveis tamanho do tumor (T), comprometimento linfonodal (N), estágio

do tumor e profundidade de invasão > 4 mm podem ser utilizados como fatores

prognósticos para carcinoma epidermoide de língua oral.

2. A elevada imunoexpressão das proteínas XRCC1, TFIIH e XPF observada

neste estudo não apresentou associação significativa com os parâmetros

clínicos estudados (estadiamento clínico, metástase, recidiva e desfecho) ou

com parâmetros de gradação histopatológica em CELO, com exceção da

elevada imunoexpressão de XRCC1 que se mostrou significativamente

associada a estadiamento clínico melhor.

3. Mesmo reconhecendo a importância das proteínas XRCC-1, TFIIH e XPF no

desenvolvimento e progressão do carcinoma epidermoide de língua oral,

nossos resultados indicam que a sua expressão imuno-histoquímica não

possui valor prognóstico para este tipo de câncer.

86

REFERÊNCIAS

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8 REFERÊNCIAS

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94

APÊNDICES

95

APÊNDICE A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

96

97

APÊNDICE B – Ficha para coleta de dados clínicos

Ficha para anotação: Data: ____/____/_______ Nº do prontuário:____________ Nº na Patologia:______________ Coleta de informações do prontuário

Nome:_______________________________________________

Gênero: ______Idade:______ Data de nascimento: ___/____/________

Localização:_____________

Estadiamento: T______ N_______ M _______

Data da biópsia excisional: ____/_____/______

Data do início do tratamento: ____/_____/______

Tratamento recebido: ( ) {[1-cirurgia; 2-radioterapia; 3-quimioterapia], mais de um

tratamento, colocar os nº correspondentes}

Metástase linfonodo: ( ) ____/____/_______

Metástase à distância: ( ) Recidiva Local ( ) ____/____/_______

Data de diagnóstico de Metástase: ____/____/_______

Estado da doença: ( )

Data do último seguimento ( ) ou data do óbito _____/_____/_____

Estado da doença: [1-remissão completa, 2-remissão parcial, 3-doença estável, 4-doença em progressão, 5-óbito por câncer, 6-óbito por não câncer] Metástase linfonodo: [1-sim, 2-não] Metástase à distância: [1-sim, 2-não]

Outras informações Bebe? Sim ( ) Não: ( ) Quantidade dose/dia: ______________ Por quanto tempo:____________ Fuma? Sim ( ) Não: ( ) Quantidade cigarro/dia: _____________ Por quanto tempo:___________

98

APENDICE C- Resultados não apresentados

Tabela 13 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de

língua oral de acordo com a recidiva loco-regional, o desfecho e o estadiamento clínico

TNM em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015

Parâmetro Estadiamento clínico* Total p

I e II III e IV

Recidiva loco-regional Ausente Presente

16 (50,0) 3 (17,6)

16 (50,0) 14 (82,4)

32 (100,0) 17 (100,0)

0,03#

Desfecho Remissão Óbito

14 (58,3) 5 (20,0)

10 (41,7) 20 (80,0)

24 (100,0) 25 (100,0)

<0,01#

Legenda: # Qui-Quadrado

Fonte: Elaboração própria

Tabela 14 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de

língua oral de acordo com a recidiva loco-regional e o desfecho em cinco anos de

acompanhamento. Natal –RN, 2015

Parâmetro Metástase linfonodal Total p

Ausente Presente

Recidiva loco-regional Ausente Presente

18 (54,5) 6 (35,3)

15 (45,5) 11 (64,7)

33 (100,0) 17 (100,0)

0,20#

Desfecho Remissão Óbito

15 (62,5) 9 (34,6)

9 (37,5)

17 (65,4)

24 (100,0) 26 (100,0)

0,05#

Legenda: # Qui-Quadrado

Fonte: Elaboração própria

99

Tabela 15 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de

língua oral de acordo com tratamento, a metástase linfonodal, a presença de recidiva

loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015

Parâmetro Recidiva loco-regional p Desfecho p

Ausente Presente Remissão Óbito

Tratamento Cirurgia Cirurgia e radio ou cirurgia e quimio Cirurgia, radio e quimio Tratamento prévio a cirurgia

8 (88,9)

12 (60,0) 12 (60,0) 1 (100,0)

1 (11,1) 8 (40,0) 8 (40,0) 0 (0,0)

- -

6 (66,7) 9 (45,0) 9 (45,0) 0 (0,0)

3 (33,3)

11 (55,0) 11(55,0) 1 (100,0)

- -

Tratamento Apenas cirurgia Cirurgia e outros

8 (80,0)

25 (62,5)

2 (20,0)

15 (37,5)

0,46†

6 (60,0) 18 (45,0)

4 (40,0)

22 (55,0)

0,49†

Metástase linfonodal (comprovação histopatológica) Não Sim

18 (75,0) 15 (57,7)

6 (25,0) 11 (42,3)

0,20#

15 (62,5) 9 (34,6)

9 (37,5) 17 (65,4)

0,05#

Legenda:# Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

Tabela 16 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de

língua oral de acordo desfecho e a presença de recidiva loco-regional em cinco anos

de acompanhamento. Natal – RN, 2015

Parâmetro Desfecho p

Remissão Óbito

Recidiva loco-regional Ausente Presente

19 (57,6) 5 (29,4)

14 (42,4) 12 (70,6)

0,06#

Legenda:# Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

100

Tabela 17 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermóide de língua oral, de acordo com a gradação

de malignidade recomendado por Brandwein-Gensler et al. (2005), o estadiamento clínico TNM, a presença de metástase

linfonodal, a recidiva loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015

Parâmetro IP p IL p PPI p GH p

Ausente Pequenos

Contínuo Em

placas Fraco

1 ou 2 ou 3 4 5

BR RI AR

Estadiamento*

I ou II III ou IV

8(42,1) 8(26,7)

11(57,9) 22(73,3)

0,26#

12(63,2) 15(50,0)

2(10,5) 9(30,0)

5(26,3) 6(20,0)

- -

2(10,5) 8(26,7)

15(78,9) 21(70,0)

2(10,5) 1(3,3)

- -

0(0,0) 1(3,3)

11(60,0) 19 (63,3)

8(42,1) 10(33,0)

- -

Metástase

Ausente Presente

10(41,7) 6 (23,1)

14(58,3) 20(76,9)

0,16#

14 (58,3) 13 (50,0)

4(16,7) 7(26,9)

6(25,0) 6(23,1)

0,68#

4(16,7) 6(23,1)

18(75,0) 19(73,1)

2(8,3) 1(3,8)

- -

1(4,2) 0(0,0)

13(54,2) 17(65,4)

10(41,7) 9 (34,6)

- -

Recidiva loco-regional

Ausente Presente

11(33,3) 5(29,4)

22(66,7) 12(70,6)

0,78#

19(57,6) 8(47,1)

6(18,2) 5(29,4)

8(24,2) 4(23,5)

- -

5(15,2) 5(29,4)

27(81,8) 10(58,8)

1(3,0)

2(11,8)

- -

0(0,0) 1(5,9)

21(63,6) 9(52,9)

12(36,4) 7(41,2)

- -

Desfecho

Remissão Óbito

10(41,7) 6(23,1)

14(58,3) 20(76,9)

0,16#

13 (54,2) 14(53,8)

5(20,8) 6(23,1)

6(25,0) 6(23,1)

- -

6(25,0) 4(15,4)

16(66,7) 21(80,8)

2(8,3) 1(3,8)

- -

0(0,0) 1(3,8)

13(54,2) 17(65,4)

11(45,8) 8(30,8)

- -

Legenda: IP - IP - Invasão perineural; IL- Infiltrado linfocitário; PPI – Pior padrão de invasão; GH- Gradação Histológica; BR- Baixo risco; RI – Risco intermediário;

AR- Alto risco; # Qui-Quadrado; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

1

05

101

Tabela 18 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de carcinoma epidermoide de língua oral, de acordo com a gradação

de malignidade recomendado por Almangush et al. (2015), a metástase linfonodal, o estadiamento clínico TNM, a recidiva

loco-regional e o desfecho em cinco anos de acompanhamento. Natal – RN, 2015

Parâmetro Tumor budding p Profundidade de

invasão p GH p

Até 5 > 5 Até 4 mm > 4mm BR RI AR

Estadiamento* I ou II III ou IV

7 (36,8)

11 (36,7)

12 (63,2) 19 (63,3)

0,99#

6 (31,6) 4 (13,3)

13 (68,4) 26 (86,7)

0,16†

3 (15,8) 3 (10,0)

7(36,8) 9(30,0)

9 (47,4) 18 (60,0)

- -

Metástase Ausente Presente

9 (37,5) 9 (34,6)

15 (62,5) 17 (65,4)

0,83#

5 (20,8) 5 (19,2)

19 (79,2) 21 (80,8)

0,89†

3 (12,5) 3 (11,5)

8 (33,3) 8 (30,8)

13 (54,2) 15 (57,7)

- -

Recidiva loco-regional Ausente Presente

11 (33,3) 7 (41,2)

22 (66,7) 10 (58,8)

0,58#

8 (24,2) 2 (11,8)

25 (75,8) 15 (88,2)

0,46†

4 (12,1) 2 (11,8)

11 (33,3) 5 (29,4)

18 (54,5) 10 (58,8)

- -

Desfecho Remissão Óbito

11 (45,8) 7 (26,9)

13 (54,2) 19 (73,1)

0,16#

8 (33,3) 2 (7,7)

16 (66,7) 24 (92,3)

0,02†

6 (25,0) 0 (0,0)

7 (29,2) 9 (34,6)

11(45,8) 17 (65,4)

- -

Legenda: IP - IP - Invasão perineural; IL- Infiltrado linfocitário; PPI – Pior padrão de invasão; GH- Gradação Histológica; BR- Baixo risco; RI – Risco intermediário;

AR- Alto risco; # Qui-Quadrado; † Exato de Fisher; - - Não foi possível realizar teste estatístico

Fonte: Elaboração própria

106

102

ANEXO

ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense

Contra o Câncer

104