MESTRADO -...

UNICAMP UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

Rodrigo Luís Taminato . .

Farmacêutico-Bioquímíco .

MESTRADO

Estudo químico do Allium tuberosuin Rottl. ex Spreng

biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida

albicans

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas, para obtenção do título

de Mestre em Odontologia - Área de

Farmacofogfa, Anestesiologia e Terapêutica .

PIRACICABA- SP 2006 BIBL!OTEI.:A CENTRAL

DESf NVO t.V!MENTO

CGtZÇÃO

UNICAMP

UNICAMP UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS


Rodrigo Luís Taminato

Farmacêutico-Bioquímico

MESTRADO

Estudo químico do Allium tuberosum Rottl. ex Spreng

biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida

albicans

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas, para obtenção do título

de Mestre em Odontologia - Área de

Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.

Orientador:

Profa. Ora. Vera lúda Gai'i:ia Rehder

Co-orientador:

Profa. Ora. Marta Cristina Teixeira Duarte

Banca Examinadora:

Profa. Ora. Vera Lúcia Garcia Rehder

Profa. Di1i. Míiiilí Villíi t-4vva Rodriguês

Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen

Piracicaba - SP Este exemplar foi devidamente corrigido, de acordo com a resolução CCPG 036/83.

CP"Gf".i),~.fo_QJi./ . .QY!.~. ....... ~ •.. :.l/$.td{}&ufL .... 1Y.fl2.... ........ . ... .

Assinatur o Orientador

2006

11

BIBLIOTECA CENTRAL

DESENVOLVIMENTO

C'" ~··õn .._,.,__'s'MIJ

L-_...;U:.:N::..:.l CAM;;:_l'_---l

Tl52e

FICHA CATALOGR.'Í.F!CA ELABORADA PELA

Bll:3LlOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

Bibliotecário: Marilenc Girello- CRB-8". I 6159

Taminato, Rodrigo Luís. Estudo quínúco do Allium tuberosum Rottl. ex Spreng

biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida albicans. I Rodrigo Luís Taminato. --Piracicaba, SP: [s.n.), 2006.

Orientadores: Vera Lúcia Garcia Rehdcr, Marta Cristina Teixeira Duarte

Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Ca..'Upinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

1. Cromatografia gasosa. 2. Espectroscopia de massa. I. Rehder, Vera Lúcia Garcia. 11. Duarte, Marta Cristina Teixeira. 111. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.

(mg!fop)

Título em Inglês: In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of Alltum tuberosum Rotth.ex Sprengel

Palavras-chave em Inglês (Keywords): 1. Chromatography, gas.

2. Mass spectrometry

Área de Concentração: Farmacologia, Anestesiologia e

Terapêutica

Titulação: Mestre em Odontologia Banca Examinadora: Vera Lúcia Garcia Rehder, Marilí Villa Nova Rodriguês, Pedro Luiz Rosalen Data da Defesa: 06-06-2006 Programa de Pós-Graduação: Odontologia

111

,·)

UNICAMP

•

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS


A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de MESTRADO, em sessão pública realizada em 06 de Junho de 2006, considerou o candidato RODRIGO LUIS TAMINATO aprovado.

DER

PROFa. ORa. ARIL! VILLA NOVA RODRIGUES

PROF. DR. PEDRO LU Z ROSALEN

DedicãtorTa

À Deus,

Aos meus pais, Luiz e Julia por serem absolutamente tudo de mais importante que eu

tenho na vida. AMO VOCES!IIII

Ao Marcos Nakao (in memorian). "Por ter passado pela minha vida e ser até hoje, um

exemplo e por me dar esperanças de que um dia nos reencontraremos para te abraçar e

dizer mais uma vez o quanto eu te amo, meu irmão."

Aos meus familiares

dedico este trabalho

v

Agradecimentos Especiais

A Profa. Dra. Vera Lucia Garcia Rehder, amtga e orientadora, agradeço pela

orientação, pelos ensinamentos compartilhados, pela paciência, pelo incentivo, pelos

momentos de descontração, pelos momentos de "chamada de atenção", pelo exemplo de

professora e pesquisadora, meu profundo respeito, admiração e carinho_

A Prof. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte pela amizade, profissionalismo, respeito

e por toda dedicação e carinho que tratou meu trabalho como Co-orientadora.

Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo, coordenador do Curso de Pós-Graduação em

Odontologia, Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica, pela amizade,

confiança, profissionalismo e carinho que sempre me tratou.

Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen, pelo profissionalismo, respeito e amizade.

Ao Prof. Dr. Eduardo Dias de Andrade, pela amizade, exemplo de professor e ser

humano.

A Adriana da Silva Santos, pela dedicação, carinho e ajuda indispensável na

realização deste trabalho, além da amizade.

Aos amigos de mestrado Michele, Karina, Gilson, Alcides e Humberto agradeço,

pelas alegrias, pelos ensinamentos, e acima de tudo pela amizade sincera de um grupo

muito unido_

Ao Alcides Moreira que esteve ao meu lado nesta jornada e que compartilhou comigo

as alegrias e os momentos dificeis, sempre me apoiando e em tudo. De fato, um amigo

MAIÚSCULO e ETERNO que a vida me deu.

Ao Humberto Moreira Spíndola pela amizade sólida e companheirismo em todos os

momentos, um "AMIGAÇO" pra toda vida.

VI

Ao Gilson Nobre Franco, pela amizade, pelos ensinamentos e pelo exemplo de ser

humano.

Aos GRANDES AMIGOS que o destino me apresentou em Piracicaba, Filipe Polese,

Ramiro Mendonça Murata e Leonardo Vedana pela amizade sincera em todos os

momentos e por fazerem parte da minha vida para sempre.

Aos queridos amtgos que fizeram minha vida ter mats sentido: Regiane Yatsuda,

Giovana Tóffoli, Roberta Baglie, Sinvaldo Baglie, Mário Neto e tantos outros

amigos, que sempre incentivaram e torceram por mim, pela amizade e ensinamentos.

A TODA TURMA 48 de graduação em odontologia da FOP- Unicamp, obrigado

pelo carinho e pela amizade sincera e tão carinhosa durante todos esses anos.

Vll

Agradecimentos

À Universidade Estadual de Campinas, por meio do Reitor: Prof Dr. José Tadeu

Jorge.

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP - UNICAMP), na pessoa de seu

diretor: Prof. Dr. Thales Rocha Mattos Filho.

Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas da

Unicamp-CPQBA.

Á secretária Maria Elisa dos Santos, pelo carinho e profissionalismo e atenção.

Aos amigos e competentes profissionais, Adilson Sartoratto, Dra. Marili Villa Nova

Rodrigues, Dr. Rodney Alexandre Rodrigues, Adriana Silva Santos e Sinésio

Boaventura Jr., Ora. Glyn Mara Figueira, ora. Mary Ann Foglio, pelo carinho, convivência,

profissionalismo e acima de tudo, pela amizade.

A Profa. .pr,. Maria Cristina Volpato, chefe do departamento de Ciências

Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

A CAPES, Coordenação de aperfeiçoamento pessoal de nível superior, pela

concessão de bolsa de estudo para realização deste trabalho.

A Fapesp, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio

financeiro.

Aos amigos e funcionários da FOP e do CPQBA, que direta ou

indiretamente, embora não citados, me incentivaram e apoiaram durante o

trabalho.

Vl11

De tudo ficaram três coisas:

A certeza de que estamos sempre recomeçando .. .

A certeza de que precisamos continuar .. .

A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar .. .

Portanto devemos fazer da interrupção um caminho novo .. .

Da queda um passo de dança .. .

Do medo, uma escada .. .

Do sonho, uma ponte .. .

Da procura, um encontro .. .

Fernando Sabino

lX

Sumário

Resumo

Abstract

1. Introdução geral

2. Proposição

3. Capítulo

3.1. Capitulo I

4. Conclusões gerais

4.1. Referência bibliográfica da introdução geral

S. Anexos

5 .1. Anexo 1 - Resolução do formato alternativo para defesa

5.2. Anexo 2- E-mail de confirmação de aceite do artigo

5.3. Anexo 3- Cromatogramas dos OF, OB, EB e frações Fl a F8 do OB

2

3

7

8

9

23

24

34

35

36

5.4 Anexo 4 -Placa de Cromatografia em Camada Delgada do OB e frações do OB 41

5.5. Anexo 5- Espectros de massa dos principais constituintes do OB 42

5.6. Anexo 6- Principais estruturas químicas identificadas por CG-EM dos OF, 08, 46

EB e frações dos OB.

5.7 Anexo 7- Fórmula para cálculo do índice de Kovatz 48

X

RESUMO

De uso freqüente na medicina popular, o gênero Allium inclui mais de 600 espéctes

encontradas em diversas regiões do mundo como Europa, América do Norte, África e Ásia.

A maioria das espécies é comestível e possui aroma e odor característicos, sendo também

utilizadas como hipocolesterolêmico, antigripal e antimicrobiano. Alguns estudos de

determinação das propriedades de Allium spp. como antifúngico e de identificação de seus

compostos voláteis foram conduzidos. A maior parte de seus constituintes são compostos

sulfurados, embora a compostção química seja variável entre os diferentes estudos_ Dentre

as espéctes de Allium spp., o A. h1herosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae) pertence a mesma

família do alho, cebola e alho-poró, é conhecido também como "Chinese chive", sendo um

importante ingrediente na culinána astática, também utihzado como erva medicinal para

muitas disfunções e doenças. Na China é popularmente chamado de "Jiucai" e no Japão de

"Nirá" Os óleos essenciais das folhas e bulbos de A. tuberosum obtidos por hidrodestilação

em sistema do tipo Clevenger. As fases aquosas ou hidrolatos foram extraídas com

diclorometano, obtendo-se o OB (óleo essencial dos bulbos)- 810 mg (0,12%) e o OF (óleo

essencial das folhas) -750 mg (0,15%). O extrato diclorometânico obtido dos bulbos- EB,

obtido em sistema Ultra-Turrax, apresentou rendimento 3,28% (497 mg).O OB foi

fracionado em coluna seca, utilizando como eluente diclorometano. Foram obtidas 8

frações (FI a F8), analisadas por CCD. As frações 3, 4 e 5 foram agrupadas resultando nas

frações: FI - !38,6mg (33%), F2- 15,3mg (3,7%), F3- 13,6mg (3,3 %), F4- 51,9

(12,6%), F5- 34,1mg (8,3%), F6- 31,2mg (7,6%). Analisados por CG-MS observa-se que

a maioria dos compostos identificados nos óleos essenciais das folhas e bulbos e das

frações obtidas do OB são compostos organosulfetos (COS). As principais classes de

sulfetos identificadas nas diferentes amostras de A. tuberosum, destacam-se os

monosulfetos, disulfetos, trisulfetos, tetrassulfetos e sulfinatos. Na avaliação do MIC

obtiveram-se atividade do OB de 2001-.Jglml e das frações mais ativas Fl (50J..Jglml) e F2

(50jJglmL). Concluii-se que os principais compostos responsáveis pela atividade anti

Candida albicans do Allium luberosum são alil,metil-disulfeto, dimetil-trisulfeto, dialil

disulfeto e alil,metil-trisulfeto, presentes no óleo essencial dos bulbos e nas frações Fl e F2.

I

Abstract

Frequently used in folk medicine, the genusA/lium include more than 600 species founded

in several world regions like Europe, North America, Africa andAs ia. The most of species

is edible and have a aroma and smell characteristics, being algo used as

hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial. Among theAI/ium species, A. tuberosum

RottL ex Spreng (Liliaceae) belongs to the same family of the garlic, anion and poro

allium. In the China, is popularly called "Jiucai" and in Japan, "Nirá" and is also know as

"Chinese chive", a important ingredient in the Asiatic culinaty. Studies aims determine the

properties of Allium spp. as antifungical and aim identify their volatile compounds are

described m literature. The essential oils from leaves (OF) and bulbs (OB) ofA. tuberosum

were obtained by hydrodistillation in a Clevenger system, yielding O, 1 5% and 0,12%,

respectively. The dichloromethanic extract from bulbs (EB), obtained in a Ultra-Turrax

system, presented yield of 3,28%. The minimal inhibitory concentration (MlC) from oils

agamst Candida albicans was: OF (>IOOOfLg/mL), OB (200flg/mL) and EB (250fLg/mL).

The OB was fractionated in dry column by use of dichloromethane as eluent, when were

obtaíned síx fracttons: FI (33%), F2 (3,7%), F3 (3,3 %), F4 (12,6%), FS (8,3%), F6

(7,6%), evaluated to anti-C. albicans activity. The volatile compounds present in the

essential oils, extract and fractions of OB were identified by CG-MS. The majority

compounds present in the OF, OB and in the F 1 and F2 from OB were organosulphides

from disulphides classes, trisulphides, tetrasulphides and sulphinides, to standing out the

allyl, methyl-dísulphíde, dímethyl-trísulphide, d!allyl-dísulphide and alíl,methyl

trisulphide. Significant quantities of limonene and sulphinades and low concentration of

other sulphides were founded in EB. The :MIC evaluation of fractions obtained from OB

revealed a significant increase of activity for Fl and F2, with MIC value of S011g/mL,

when compared to OB (200~tg/mL). These results indicate that the main compounds from

A. tuberosum responsible by anti-Candida activity are allyl, rnethyl-disulphide, dimethyl

trisulphide, diallyl-disulphide and diallyl disulphide, present in higher concentration in OB

and in the fractions Fl e F2.

2

1. Introdução

A atividade biológica de extratos de plantas e óleos essenciais tem sido objeto

de intensa investigação científica. Plantas superiores e aromáticas são amplamente

utilizadas no combate a diversos tipos de infecções pela medicina popular, uma vez que

apresentam amplo espectro de atividade antimicrobiana, com inibição comprovada contra

bactérias, leveduras e fungos filamentosos (Ankri & Mirelman, 1999; Darbyshire & Henry.,

1981; Koch & Lawson, 1996). Como descreveram Adam et al. (1998), grande parte dessas

propriedades é devida aos óleos essenciais que as plantas contém como produtos de seu

metabolismo secundário. Óleos essenciais de várias espécies mostraram-se efíctentes no

controle do cresctmento de fungos relacionados a mfecções superficiais da pele (Adam et

a!., 1998) e sobre uma ampla variedade de microrganismos, incluindo bactérias Gram

negativas e Gram-positívas (Galli et a/., 1998).

De acordo com Lentz et a!. (1998) e Rates (2001 ), o vasto conjunto de

metabólitos secundários sintetizados pelas plantas forma um reservatóno de compostos

orgânicos que são uma rica fonte de fãrmacos. No caso dos óleos essenciais, estes são

constituídos de moléculas de baixa massa molecular, principalmente mono e

sesquiterpenos, o que explica a característica organoléptica olfativa marcante deste grupo

de metabólitos.

É notável a intensa procura científica por princípios ativos de origem vegetal

nos últimos anos. Várias empresas privadas e orgamzações governamentais têm instituído

projetos de pesquisa nesta área (Calixto, 2000). É importante salientar que, na década de

70, nenhuma das 250 maiores companhias do ramo farmacêutico do mundo mantinham

qualquer programa de pesquisa na área de produtos naturais e atualmente, pelo menos

metade delas introduziram este tipo de pesquisa como uma de suas prioridades (Calixto,

2000).

Existem aproximadamente 250.000 espéctes de plantas superiores em todo

mundo e grande parte da população faz uso rotineiro das plantas medicinais nativas no

cuidado primário à saúde (Cragg et a/_, 1999). No entanto, somente 17% foram estudadas

quanto ao seu potencial medicinal (Newman eta/., 2003).

3

Até meados do século XX, os medicamentos de ongem vegetal constituíam a

base da terapia medicamentosa. Porém o desenvolvimento da síntese orgânica introduziu

raptdamente novos farmacos na terapêutica, relegando às plantas um papel menor neste

contexto. Na última década, houve um aumento do uso de plantas medicinais como fonte de

fármacos e de protótipos, sendo que cerca de 50% dos medicamentos utilizados eram

provementes de moléculas de origem sintética, 25% semi-sintética e os 25% restantes a

partir de fontes de produtos naturais (marinhos, microbiológicos, e principalmente plantas)

(Pezzuto, 1997). Um estudo sobre produtos naturais como fonte de novas drogas entre os

anos de 1981 e 2002, indicou que 67% das 877 pequenas moléculas, são de origem

sintética, porém 16,4% correspondem a moléculas sintéticas com grupos farmacofóricos

derivados diretamente de produtos naturais (Cragg & Newman, 2005).

O aperfeiçoamento dos processos de purificação e isolamento de compostos

ativos de plantas medicinais e de métodos de análise tem possibilitado a elucidação de

estruturas moleculares complexas (Calixto, 2000; Rates, 2001 ). Além dtsso, o

desenvolvimento de métodos de manejo, cultivo e melhoramento genético representa uma

nova tendência no estudo de plantas medicinais, pois assegura maior padronização e

qualidade (Calixto, 2000)

Dados da Organização Mundial de Saúde mostram que os estudos com plantas

medicinais movimentam US$ 1,8 bilhão por ano na China. No ano de 2000 foram gastos no

Japão US$ 2,4 bilhões; Malásia US$ 500 milhões; EUA US$ 2,7 bilhões; Austrália US$

800 milhões; Canadá 2,4 bilhões e Inglaterra US$ 2,3 bilhões (WHO, 2002)

Dentre os diversos causadores de infecções, os fungos merecem enfática

atenção, devido ao aumento progressivo dessas doenças nas últimas décadas (Meunier,

1995; Herbrecht, 1996; Odds, 2000). As infecções fúngicas tornaram-se um sério problema

de saúde pública, especialmente em pactentes portadores de câncer, AIDS, transplantados,

dentre outros (De Lucca & Walsh, 1999). Nestes, os casos costumam ser severos,

rapidamente progressivos, dificeis de diagnosticar e tratar (Joly et al., 1992). Verduyn

Lunel et a/., (I 999) e Pierce (2005) relataram que Pseudomonas aeruginosa e Candida

a!bicans são considerados como os mais importantes agentes de infecção hospitalar.

Em resposta a esse aumento no registro de infecções fúngicas, houve também

4

um aumento considerável no número de agentes antifúngicos nos últimos anos (Pfaller,

2005).

Embora novos antifúngicos venham sendo descobertos ano a ano (Ueki et ai., 1993), as

infecções fúngicas do tipo sistêmicas são as mais preocupantes e poucos medicamentos

sistêmicos são conhecidos para o tratamento de pacientes com infecções invasivas.

Uma das razões para o lento progresso nesta área é a analogia entre as células

fungicas e as de organismos superiores, e o mecanismo de ação das drogas conhecidas

atualmente, uma vez que a maioria dos microrganismos tem mostrado resistência aos

antifú.ngicos convencionais. Assim, agentes que atuem na biossíntese de proteínas, DNA e

RNA terão maiOres chances de serem eleitos como novos medicamentos

(Georgopapadakou & Walsh, 1996) e sua busca deve ser estimulada e constante. Neste

caso, as plantas medicinais aparecem como uma boa alternativa às tradicionais triagens

smtéticas e fermentativas.

Atualmente, várias plantas medicinais têm sido estudadas quanto à atividade

antirnicrobiana (Ahmad & Beg, 1999; Panizzi et ai., 1993; Baba-Moussa et ai., 1999;

Martinez et al., 1996; Mahasneh, 2002; Duarte et al., 2005). No Brasil, devido à vasta

biodiversidade e nqueza etnofannacológica, múmeras plantas com atividade

antimicrobiana são hoje conhecidas.

De uso freqüente na medicina popular, o gênero Allium inclui mais de 600

espécies encontradas em diversas regiões do mundo como Europa, América do Norte,

África e Ásia. A maioria das espécies é comestível e possuem aroma e odor característicos

(Lancaster & Boland, 1999; Block, 1991; Pino et ai., 2001). sendo também utilizadas

como hipocolesterolêmico, antigripal e antimicrobiano (Leporatti & Corradi, 2001; Lemar

et. ai., 2002). Alguns estudos de determinação das propriedades de Allium spp. como

antifúngico e de identificação de seus compostos voláteis têm sido conduztdos (Watanabe

1966; Ankri & Mirelman 1999; Lemar et al., 2002). A maiona de seus constituintes são

compostos sulfurados, embora a composição química seja variável entre diferentes estudos

(Pinoeta/,2001)

Dentre as espécies de Ailium spp., o A. tuberosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae)

pertence a mesma família do alho, cebola e alho-poró, e é conhecido também como

5

"Chínese chive", é um importante ingrediente na culinária asiática, sendo também utilizado

como erva medicmal para muitas disfunções e doenças .. Na China é popularmente

chamado de "Jiucai" e no Japão de "nirá". É natural das regiões central e parte do norte da

Ásia e é comumente cultivado na China, no Japão, Korea, Índia, Nepal, Tailândia e nas

Filipmas (Sang etal, 2001).

O suco prensado do "nirá" tem mostrado inibição contra uma ampla faixa de

microrganismos (Mau et ai., 2001 ). Entretanto, pesquisas sobre o uso desta planta como

antimicrobiano são limitadas, havendo poucas referências com esta abordagem.

Estudos visando determinar as propriedades antifúngicas do Allium tuberosum,

em especial para Candida albicans, nos motivou a avaliar a atividade dos óleos essenciais

das folhas e bulbos e do extrato diclorometânico de seus bulbos e identificar seus principais

constituintes químicos.

6

2. Proposição

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-Candida a/bicam; dos óleos

essenciais obtidos a partir das folhas (OF), bulbos (OB), extrato diclorometânico dos

bulbos (EB) e frações obtidas do OB do A. tuberosum Rottl. ex Spreng, monitorando o

estudo químico a fim de identificar os princípios ativos responsáveis pela atividade

biológica.

Foram objetivos específicos deste estudo:

1 -Avaliar a atividade anti-Candida albicans dos óleos essenciais das folhas (OF), bulbos

(OB) e extrato de diclorometano dos bulbos (EB) de Al/ium tuhern.wm.

2- Avaliar a composição química dos óleos essenciais e do extrato diclorometânico a fim

de identificar seus principais constituintes químicos.

3 - Fracionar o óleo essencial mais ativo, avaliar a atividade anti-Candida albicans das

frações e identificar seus principais constituíntes químico

7

3. Capítulo

Essa dissertação está baseada na Informação CCPG/001/98/Unicamp que

regulamenta o formato alternativo para a dissertação de Mestrado e permite a inserção de

artigos· científicos de autoria ou co-autoria do candidato. (Anexo 1).

Desta forma, esta tese é composta de 1 artigo, o qual foi submetido para

publicação na revista Joumal of Ethnophannacology conforme descrito abaixo:

3.1.- Artigo 1 -In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of

leaves and bulbs of Allium tuberosum Rotth. ex Sprengel.

8

3.1. In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of

Allium tuberosum Rotth.ex Sprengel

Rodrigo Luís Taminatoa

Marta Cristina Teixeira Duarte h

Glyn Mara Figueira h

Adilson Sartorattob

Camila Delarmina,b

V era Lúcia Garcia Rehderb,*

aFaculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade estadual de Campinas- FOP

Unicamp. Area de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica- Piracicaba- SP- Brasil.

bCentro Pluridisciplinar de Pesquisas químicas, biológicas e agrícolas da Universidade

Estadual de Campinas - CPQBA - Unicamp - Divisão de Química Orgânica e

Farmacêutica

* Corresponding author:

V era Lúcia Garcia Rehder

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas - CPQBA -

UNJCAMP

CP617l, Paulinia-SP-Brazil.

Phone/Fax: 55 19 38847500

E-mail: [email protected]

9

Abstract

Frequently used in folk medicine, the genusAllium include more than 600 species founded

m severa! world regions like Europe, North America, Mrica andAs ia. The most of species

is edible and have an aroma and smell characteristics, being algo used as

hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial. Among theAllium species, A. tuberosum

Rottl. ex Spreng (Liliaceae) belongs to the same family of the garlic, anion and poro

allium. In the China, is popularly called "Jiucai" and in Japan, "Nirá" and is also know as

"Chinese chive", a important ingredient in the Asiatic culinary. Studies aims determme the

properties of Allium spp. as antifungical and aim identify their volatile compounds are

described in literature. The essential oils from leaves (OF) and bulbs (OB) of A. tuberosum

were obt.ained by hydrodistillation in a Clevenger system, yielding O, 15% and O, 12%,

respectively. The dichloromethan1c extract from bulbs (EB), obt.ained in a Ultra-Turrax

system, presented yield of 3,28%. The mínima! inhibitory concentration (:MIC) from oils

agamst Candida a/bicans was: OF (> 1000Dg/mL), OB (200Dg/mL) and EB (250Dg/mL).

The OB was fractionated in dry column by use of dichloromethane as eluent, when were

obtamed six fractions: F1 (33%), F2 (3,7%), F3 (3,3 %), F4 (12,6%), F5 (8,3%), F6

(7,6%), evaluated to anti-C. albicans activity. The volatile compounds present in the

essential oils, extract and fractions of OB were tdentified by CG-MS. The majority

compounds present m the OF, OB and in the FI and F2 from OB were organosulphides

from disulphides classes, trisulphides, tetrasulphides and sulphinides, to st.anding out the

allyl, methyl-disulphide, dimethyl-trisulphide, diallyl-disulphide and alil,methyl

tnsulphide. Significant quantities of limonene and sulphinades and low concentration of

other sulphides were founded in EB. The JviiC evaluation offractions obtained from OB

revealed a stgnificant increase of activity for Fl and F2, with JviiC value of 501J.g/mL,

when compareci to OB (2001J.g/mL). These results indicate that the main compounds from

A. tuberosum responsible by anti-Candida activity are allyl, methyl-disulphide, dimethyl

trisulphide, diallyl-disulphide and diallyl disulphide, present in higher concentration in OB

and in the fractions Fl e F2.

Keywords: Allium tuberosum; Candida albicans, leaves, bulbs, composition, sulphides,

antimicrobial activity

10 fsmÜmcA CENTRAL I DESHlVOLVlf;1ENTO

I COLEÇÃO !JNIC.AMP

1- Introduction

Higher and aromatic plants are widely used in folk medicine to atm contrai

severa! kind ofmfections, since they show antimicrobial activity, with confirmed mhibition

against bacteria, yeasts and filamentous fungi (Ankri and Mirelman, 1999; Darbyshire and

Henry, 1981; Koch and Lawson, 1996). The most ofthese properties is dueto essential oils

that they contain as a product oftheir secondary metabolism (Adam et ai., 1998). Essential

oils from severa! species were efficient to contrai fungi related to skin infections (Adam et

ai., 1998) and against many others microorganisms, including Gram-negative and Gram

positive bacteria (Galli et ai., 1985).

Nowadays, the scientific search for plant active principies is notable. Severa!

private industries and govemment organizations have created research projects in this area

(Calixto, 2005). Is important to point out that in 70's year, the most of the 250 main

pharmaceutical companies from the world had nane research program on natural products

and at present, half ofthem introduced this research subject as priority (Calixto, 2005).

The improvement of the isolation and purification process of the active

compounds from medicinal plants and the methods of analysis have became possible the

elucidation of complexes molecular structures (Calixto, 2005; Rates, 2001). Besides, the

development of handling methods, cultivation and genetic improvement represent a new

tendency in the medicinal plants studies, and ensure patronization and quality (Calixto,

2000).

Among the severa} infections agents, the fungi deserve emphatic attention, due

the progressive mcrease of these diseases in the last decades (Herbrecht, 1996; Odds,

2000). The fungical infections beco me a serious problem of public health, espectally in

patients with cancer, AIDS, transplanted, among others (De Lucca & Walsh, 1999). In

answer to this increase, there was a considerable increase in the number of antifungical

agents in the last years (Pfaller, 2005). Although new antifungal drugs have been

discovered year to year (Ueki et ai., 1993), the systemic infections are the most worrying

and few medicines are known for the treatment of patients undergoing invasive infections.

At present, severa! medicinal plants have been studied regard to antimicrobial

activity (Ahmad and Beg, 2001; Panizzi et a/., 1993~ Baba-Moussa et ai., 1999; Martinéz

et a/., 1996; Mahanesh, 2002; Duarte et ai., 2005). The genusAllium is frequently used in

li

folk medicine, and includes more than 600 species founded in severa! world regions as

Europe, North America, Africa and Asia. The most of species are edible and presented

aroma and smell characteristics (Lancaster and Boland, 1999; Block, 1991; Pino et ai.,

2001 ), andare also used as hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial (Leporatti and

Corradi, 2001; Lemar et a/., 2002). Some studies on detennination of Allium spp

antimicrobial properties and about the identification of their volatile compounds were

carried out (Watanabe 1966; Ankri and Mirelman, 1999; Lemar et ai., 2002). The most

part of their constituents are sulphur compounds, although the chemical composition be

variable among different studies (Pino et ai., 2001 ).

Allium tuberosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae), one of Allium species, belongs

to the same family of the garlic, anion and poro~allium and is also know as "Chinese

chive", a important ingredient in the Asiatic culinary, being also used as medicinal herb

against severa! disfunctions and diseases. In the China, is popularly called "Jiucat" and in

Japan, "Nirá" (Sang et a/., 2001 ).

The juice of"Nirá" presents inhibition against a wide range ofmicroorganisms

(Mau et a/., 2001). However, researches on the use of this plantas antimicrobial are

limited and there is few references focusing this subject. Studies aims detennine their

properties as antifungical and aim identify their volatile compounds are important to

complement the accounts from literature and to contribute for the development of new

phytotherapics.

The aim ofthis study was to evaluate the anti~Candida albicans activity ofthe

essential oils from leaves and bulbs and from the dichloromethanic extracts from bulbs of

A. tuberosum, and to identi(y their main chemical constituents.

2- Material and Methods

2.1. Plant Material

Aiiium h1berosum Rottl ex Spreng was grown in the CPMA (Collection of

Medicinal and Aromatic Plants) at the Research Center for Chemistry, Biology and

Agriculture (CPQBA- UNlCAMP, Campinas, São Paulo, Brazil). The plant (leaves and

bulbs) was collected in 2005, between July 20 and 22, at voucher number CPMA 490. An

12

exsieeate from plant was deposited in the herbarium ofthe State University from Campmas

(UEC) and identified by Dr. Washington Marcondes Ferreira Neto (curator). The plant

material for the assays was stored at -25°C.

2.2. Essential oils extraction from leaves and bulbs

The essential oils extraction from fresh bulbs from A tuberosum was carned out

by steam distillation in a type Clevenger system. A 750 g sample of bulbs, previoüsly

washed and dried, whteh were ground in a inox industnal blender with 3000 rnL dtstilled

water and distilled by 4 h. After oil separation, the aqueous phase was extracted three times

with diehloromethane (300 rnL) that were grouped. The organie phases were dried with

anhydrous sodium sulphate, filtered and the solvent removed at vacuum in a rotative

evaporator without heating resulting in the essential oils from bulbs (OB). The extraetion of

the essential oil from fresh leaves was carried out on similar manner, by use of 500 g of

\eaves and 3000 mL distilled water, following the distillation for 4 h. After oil separation,

the aqueous phase was extraeted three times with dichloromethane (300 mL) that was

grouped, dried, filtered and the solvent was removed by vaeuum, supplying the essential oi!

from leaves (OL).

2.3. Dicloromethanic extract.fi-om bulbs

Around 15 g of fresh bulbs were extraeted twiee m an ultra turrax system using

100 mL of diehloromethane during 3 min atroam temperature, following vacuum filtration.

The residue from bulbs was washed with diehloromethane and the organie phase was dried

with anhydrous sodium sulphate. The solvent was evaporated in a rotative evaporator

v.rithout heating, providing the dicloromethanic extract from bulbs (EB).

2.4. Fractionation of essential oilsfrom bulbs (OB)

The fraetionation ofOB (41 O mg) was carried out in dry eolumn, by using a

acetate of cellulose filter as support (2 em diameter and 16 em height), packing with silica

gel 60 (0,063- 0,200 mm) Merck 1.07734.1000, and dichloromethane as eluente. After

elution, the column was cut in 8 same parts and the material was extracted from silica by

13

using ethyl acetate. Subsequently, the material was filtered and evaporated in a rotative

evaporator without heating. After solvent evaporation were obtained the fractions F1 - F8.

2.5. Cltromatographic Metlwds

Thin Layer Cltromatography (TLL)

The essential oils OL, OB, the extract EB and the fractions from OB were

analyzed by thin layer chromatography (TLC), in silica gel plates (60 F254, Merck), by

using chloroform as eluent. After elution, the plates were analyzed under UV (A 254 and

366 nm), and revealed with anisaldehyde solution.

Gas Chromatography- Mass Spectroscopy (GC-MS)

The analysis and identification ofthe essential oils constituents from leaves

and bulbs, and the dicloromethanic extract from A. tuberosum was performed using a

Hewlett~Packard 6890 gas chromatograph, equipped with a HP~5971 mass selective

detector and capillary column HP-5 (30m x 0,25 J..Lill x 0,25 J..Lm), automatic injector 7683.

Temperature: injector = 220°C, detector= 250°C, column = 60°C, 3°C.min-1, 240°C. Flow

ofthe carrier gas (He super dry) = 1,0 mL.min-1. Mass spectra were obtained at 70 e V. The

samples ofthe OL, OB, EB and fractions obtained to OB were solubilized in ethyl acetate.

Retention indices (RI) were determmed by injection ofhydrocarbon standards (C9 to C20).

The essential oil components were identified by companson with data from literature

(Adams, 1995), the agar-agar, 15,0.profiles from the Nist Librn.ry Software 599438, and by

co-mjection ofauthentic standards, when available.

2.6. Anti-Candida albicans activity assays

Microorganism: Candida albicans CBMAI 0475 (ATCC 10231) was obtained

from the cbmai (Brazilian Colletion of Environmental and Industrial Micoorganisms,

CPQBNUNICAMP, Brazíl).

Culture medium: Agar Sabouraud Dextrose 4% (Merck), contained (g/L):

peptone, 1 0,0; dextrose, 40,0.

14

Culture storage: C. a/bicam; was maintained in Sabouraud Dextrose Agar

(Merck), replicated monthly and incubated at 36°C during 24 h. The culture was storage

under refrigeration at 4°C. Culture clones were also maintained in criotubes with glycerol at

-70°C.

2. 7. Anti-Candida assay- Minimal Inhibitory Concentration (MTC) Test

Candida albicans was grown overnight at 36°C in Sabouraud Dextrose Agar

(Merck) plates. Inoculum for the assays was prepared by diluting scraped cell mass in

0.85% NaCI solution, adjusted to McFarland scale 0.5 and confirmed by

spectrophotometrical reading at 580 nm. Cell suspensions were finally diluted to 104

UFC.mL·1 for use in the assays.

MlC tests were carried out according to Eloff (1998), using a tis sue culture test

plate (96 wells). The stock solutions of the extracts and oils were diluted and transferred

mto the first well, and serial dilutions were performed so that concentrations in the range of

1000 -15,6 J.1LmL·1 were obtained. Nistatin (Merck) was used as the reference antimycotic

contrai in the range of 60-5 1.1g/mL. The yeast inoculum was added to ali wells and the

plates were incubated at 36°C for 48 h. Antimicrobial activity was detected by adding 20

1.1L of 0.5% TTC (triphenyl tetrazolium chloride, Merck) aqueous solution. J\.1IC was

defined as the lowest concentration of oil and extract that inhibited visible growth, as

indicated by the TCC staining (dead C. albicans cells are not stained by TTC).

3. Results and Discussion

The essential oils o f the leaves and bulbs of A. tuberosum were obtained by

hydro distillation using a Clevenger type system. The aqueous phases were extracted with

dichloromethane, when there was obtained the OB (bulbs essential oil)- 810 mg (0.12 %,

w/w) and the OF (leaves essential oil)- 750 mg (0.15 %, w/w). The dichloromethanic

extract from bulbs EB was obtained in Ultra-Turrax system in 3.28% (w/w).

The OB was fractionated in dry column using dichlorometane as eluent. There

were obtained eight fractions (FI to F8), analyzed by TLC and the fractions 3, 4 and 5 were

15

grouped to produce the fractions: Fl- 138,6mg (33 %), F2- 15,3mg (3.7 %), F3 -FS

13,6mg (3.3 %), F6- 51,9mg (12.6 %), F7- 34, lmg (8.3 %), F8- 31,2mg (7.6 %)

The evaluation of the chemical composition of the essential oils,

dichloromethanic extract and fractions obtained from OB of A. tuberosum was carried out

by Gas chromatographic coupled in the mass spectrometry (GC-MS). The majority volatíle

constituents were identified by comparison of the mass spectra with those o f the NIST

electronic libnuy, with the standards of fragmentation of sulphides described in the

literature (Pino et ai., 2001; Martin-Lagos et ai., 1995), as well as for comparison ofthe

Retention lndices data and mass spectra with either those compounds published data (Pino

et al., 2001), collected in similar chromatographic conditions. When no information was

available, the identification was made by interpreting the fragmentation ofthe mass spectra.

The main volatile compounds identified in the different evaluated samples, the

retention índices (RI) and the relative percentages ofthe areas ofthe peaks are presented in

the Table 1.

Table 1

The organosulphides compounds (OSC) represent the main class of compounds

presents in essential oils OL, OB and fractions Fl and F2 ofOB oftheA.tuberosum. The

majority compounds are disulphides, trisulphides, tetrasulphides and sulphinates, as listed

in Table 2. Similar results were also observed by Pino et al., (2001 ).

Table 2

Forthe OL, the disulphides are the majority compounds (26.33 %), followed by

the trisulphides (20.30 %). Dialtyl disulphide was detected in 13.14 %, allyl, methyl

trisulphide in 14.16%, allyl, methyl-dtsulphide in 5.70 %, dimethyl-tnsulphide in 5 14%

and diallyl, trisulphite in 3. 72 % (Table 1 ). In the OB, the trisulphides are the majority ones

(60.50 %), followed by the disulphides (26.90 %). We also observed in fractions Fl and F2

higher trisulphides concentration, followed by disulphides. In the OB, the main compounds

identified were dimethyl-trisulphide (35.14 %), allyl, methyl-trisulphide (22.24 %) resulted

16

from the disulphides: allyl, methyl-disulphide (1 5.65 %), diallyl disulhide (4.72 %) and

dimethyl-tetrasulphide (3.08 %), Table1

Theses sulphurated oxygenated compounds, similar to allicin, were not detected

in the essential oils from leaves and bulbs, which can be explained by the decomposition of

the compounds for the heating used in the extractions. Alheio is one of the main

compounds of Allium spp with potential antimicrobial activity (Lemar et a!., 2002). Most of

the sulphurated compounds founded in extracts and essential oils ofAI/ium spp are result of

the allicin decomposition or transformation process according to shown in Figure 1. Severa!

works for evaluation ofthe percentage of allicin in Allium ssp are described in the literature

(Kubec ela/., 1999; Arnault ela/., 2003)

Figure 1

The antimicrobial properties of the Allium spp can be more explored as an

effective alternative in phannaceutical preparations. A wide scale of effects, particularly

antifungical properties have been investigated, including the organosulphides compounds

for specific inhibition effects (Lemar et ai., 2002). The propose of which ali antimicrobial

properties are produced by the allicin has been descnbed in severa1 in vitro studies (Dt

Paolo and Carruthers, 1960; Bouchara et a/., 1990; De Pauw et a!., 1995). The ability for

affecting the lipidic components of the extern surface of C. albicans was described by

Lemar et al. (2002).

There is not a consensus on the levei of acceptable inhibitlon for natural

products when compareci with antibiotic standards, so much what any authors consider only

results similar to that of antibiotics, while others consider with good potential itself those

with leveis of superior inhibitions. Aligiannis et al., (2001) proposed a classification for

vegetable materiais on basis of the results of N.IIC, considering how: strong inhibition -

IvliC up to 500 )lg/mL; modemte inhibition - MIC between 600 and 1500 )lg/mL and like

weak inhibition - MIC above 1500 )lg/mL.

The determination of the MIC (Mínima! Inhibitory Concentration) of the

essential oils from leaves (OL) and bulbs (OB), crude extract ofthe bulbs (EB) and also of

the fractions F1 to F8, obtained of the OB of A. tuberosum was carried out for C. albicans

17

ATCC 10231. The results are presented in Table 3.

Table 3

The values ofMIC obtained for the OL (>IOOOjtg/mL), OB (200 ~g/mL), and

EB (250 1-Lg/mL), show that the OB presented better inhibitory activity against C. albicans.

The OB was fractionated in dry column and the fractions evaluated for anti-C.albicans

activity. The fractions FI and F2, less polar, presented the better :MIC value (50 )..lg/mL),

followed by F6 and F7 fracions (100 )..lg/mL), Table 3 The F8, containing more polar

compounds, presented :MIC similar to obtained for the OB.

The increase of the activity observed for the Fl and F2 can be explained in

function ofthe chemical composition. The main compounds present in these fractions are di

and tri-sulphides, as allyl methyl disulphide, dimethyl trisulphide, diallyl disulphide and

allyl methyl trisulphide. On the other side, there were not observed in these fractions, the

presence ofsulphinates, compounds present in the OB and in the fractions FS and F6, Table

I and 2

4. Conclusions

In conclusion, the essential oil, extract and fractions Fl and F2 ofbulbs from A.

tuberosum showed important activities agamst C. albicans at lowconcentrations, especially

the FI and F2 fractions. This finding imphes that the pharmacologically active compounds

responsible by the activity from A. tuberosum are allyl methyl disulphide, dimethyl

trisulphide, diallyl disulphide and allyl methyl trisulphide, presents in OB and in fractions

FI and F2.

Acknowledgements

Research was supported bay a grant from CAPES and F APESP (SP, Brazil).

18

5. References

Adam, K., Sivropoulou, A., Kokkini, S., Lanaras, T., Arsenakis, M., 1998. Antífungal

activíties of Origanum vulgare subsp. hirtum, Menfha .\picata, Lavandu!a

angust{/0/ia, and Saivia fruticosa Essential Oils against Human Pathogenic F ungi.

Journal of Agriculture Food Chemistry 46, 1739-1745.

Adams, R.P., 2001. ldentífication of essential oils components by Gas Chromatography/

Quadrupole Mass Spectroscopy. Allured Pubhshing Corporation,Illinois, USA

Ahmad, I. Beg A.Z., 2001. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 lndian

medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. Journal of

Ethnopharmacology 74, 113-123.

Aligiannis, N., Kalpoutzakis E., Mitaku S., Chinou I.B. Composition and antÍmJcrobial

activíty of the essential oi! of two Origanum species., 2001. Journal of Agriculture.

Food Chemistry 49,4168-4170.

Ankri S., Mirelman D., 1999. Antimicrobial propertics of allicin from garlic, Microbes and

Infection 1,125-129.

Amault 1., Christides J.P., Mandon N., Haffuer T., Kahane R., Auger J., 2003. High

performance ion-pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin,

deoxyalliin, allicin and dipeptide precursors m garlic products using multiple mass

spectrometry and UV detection. Journal ofChromatography 991,69-75.

Baba-Moussa F., Akpagana K., Bouchet P., 1999. Antifungal activíties of seven West

African Combretaceae used in traditional medicine. Joumal ofEthnopharmacology.

66, 335-338

Block, E., 1991. The organosulfur chemistry of the genus Allium-lmplications on the

organic chemistry ofsulfur. Angewandte Chemie International Edition 31, 1135-1178

Bouchara JP., Tronchin G., Annaix V., Robert R., Senet JM., 1990. Laminin receptors on

Candida albicans germ tubes. Infect hnmunity 58, 48-54.

Calixto, J.B. 2005. Twenty-five years ofresearch on medicinal plants m Latin Amenca: a

personal view. Joumal ofEthnopharmacology 100, 131-134.

19

Calixto, JB. 2000. Efficacy, safety, quality contrai, marketing and regulatory guidelines for

herbal medicines (phytotherapeutic agents). Braz J Med Biol Res. 33, 179-189.

Darbyshire B., Henry R.J., 1981. Differences in fructan content and synthesis in some

Allium species, New Phytology 87,249-256.

De Lucca, A.J., Walsh,T.J., 1999. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds

against emerging pathogens, Antimicrobial Agents Chemotherapy 43,1-11.

De Pauw B.E, Raemaekers J.M, Donnelly J.P, Kullberg B.J, Meis J.F., 1995. An open

study on the safety and efficacy of fluconazole in the treatment of disseminated

Candida infections in patients treated for hematological malignancy., Ann

Hematology 70,83-87

Di Paolo, J.A., Carruthers, C., 1960. The effect of allicin from garlic on tumour growth,

Cancer Research 20, 431-434

Duarte, M. C. T., Figueira, G. M.; Sartoratto, A.; Rehder, V. L. G., Delarmelina, C. 2005.

Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Joumal of Ethnopharmacology

97, 305-311

Eloff, J.N., 1998. A sensitive and qmck microplate method to determine the minimal

inhibitory concentration ofplant extracts for bacteria. Planta Medica 64, 711-713

Galli, A, Franzetti, L., Briguglio, D., 1985. Attività antimicrobica in vitro di ali essenziali

ed estratti di spezie di uso alimentare. lndustrie alimentari, 463-466.

Herbretcht, R., 1996. The changing epidemiology of fungal infections: are the lipid-forms

ofamphotencin B an advanced. European Joumal ofHaematology Supply 57,12-17.

Koch HP., Lawson L.D., 1996. Garlic, the science and therapeutic application of Allium

sattvum L. and related species, in: Retford D.C. (Ed.), Williams and Wilkins,

Baltimore, l-233 pp.

Kubec R, Svobodova M, Velisek J., 1999. Gas chromatographic determination of S

alk(en)ylcysteine sulfoxides. Joumal ofChromatography A 862, 85-94.

Lancaster, J. E.; Boland, M. J., 1999. Onions and allied crops. In Flavor Biochemislry;

Brewster, J. L., Rabintowich, H E., Eds.; CRC Press: Boca Raton, FL 33-72 pp.

20

Lemar KM, Turner M.P, Lloyd D., 2002. Garlic (A//ium sativum) as an anti-Candida

agent: a comparison of the efficacy of fresh garlic and freeze-dried extracts. Joumal

of Applied Microbio1ogy 93, 398-405.

Leporatti M.L, Corradi L, 2001. Ethnopharmacobotanical remarks on the province of

Chieti town (Abruzzo, central Jtaly). Journal ofEthnopharmacology 74, 17-40.

Mahasneh AM., 2002. Screening of some indigenous Qatari medicinal plants for

antimicrobial activity. Phytotherapy Research 16, 751-753.

Martinez M.J, Betancourt J, Alonso-Gonzalez N, Jauregui A, 1996. Screening of some

Cuban medicinal plants for antimicrobial activity. Joumal of Ethnopharrnacology.

52,171-174.

Matín-Lagos, RA, Aerrano, A. F. 0., Lopez, M.D.R., 1995. Determination of organic

sulphur compounds in garlic extracts by gas chromatography and mass spectrometry.,

Food Chemistry 53,91-93.

Mau, J.L., Chen, C.P., Hsieh, P.C., 200.1 Antimicrobial effect of extracts from Chinese

Chive, Cinnamon, and Comi fructus. Journal of Agriculture and Food Chemistl)' 49,

183-188.

Meunier, F., 1995. Targeting fungi: a challenge, The American Joumal of the Medicai

Science. 99, 60S-67S.

Odds, F.C., 2000. Pathogenic fungi in the 21st century. Trends Microbiology 8, 200-201.

Panizzi, L., Flamini, G., Cioni P.L, Morelli l., 1993. Composition and antimicrobial

properties of essential oils of four Mediterranean Lamiaceae. Joumal of

Ethnophannaco1ogy. 39,167-170.

Pfaller, M.A, 2005. Antifungal susceptibility testing methods, Currenty Drug Targets. 6,

929-943.

Pino, J.A, Fuentes V, Correa, M.T., 2001. Volatile c-onstituents of Chinese chive (AI/ium

tuberosum Rottl. ex Sprengel) and rakkyo (Allium chinense G. Don). J Agric F ood

Chem. 49,1328-3130.

Rates, S.M.; 2001. Plants as source of drugs; Toxicon 39(5):603-13.

21

!l!SLIOTECA CENTRAL

I DESENI!OLVIMENro

I COl ~'<·.;o

l UNI~;;p

Sang ,S., Mao, S., Lao, A, Chen, Z., Ho, C.T., 2001. Four new steroidal saponins from the

seeds of Allium tuberosum. Joumal of Agriculture and Food Chemistry 49, 1475-

1478.

Ueki, M., Ueno, K., Miyadoh, S., Abe, K, Shibata, K., Tamguchi, M, O. S., 1993. UK-1, a

novel cytotoxtc metabolite from Streptomyces sp. 517-02.1. Taxonomy, fermentation,

isolation, physico-chemical and biological properties. Journal of Antibiotics (Tokyo)

46, I 089-9104.

Watanabe, T., 1966. Allium tuberosum. K.agaku (Kyoto) 21, 507-513.

22

Conclusões gerais

Este trabalho demonstrou que o óleo essencial extraído com diclorometano por

hidrodestilação em sistema Clevenger (OB), o extrato diclorometânico extraído por ultra

turrax (EB) e as frações F 1 e F2 do OB apresentaram forte inibição ao apresentarem MIC

contra C. a/bicans de 200 ~g/mL (OB), 250 ~g/mL (EB) e 50 ~g/mL (Fl e F2).

Os óleos essenciais apresentaram rendimentos de 0.12% w/w(OB), 0.15% w/w

(OL) e 3.28% w/w (EB), observa-se que o extrato p-ossui rendimento melhor que o dos

óleos brutos.

As amostras analisadas por CG-EM apresentaram compostos sulfurados, sendo

que os majoritários principais foram dissulfetos, trissulfetos e sulfinatos. Várias substâncias

foram encontradas e identificadas nas amostras, o que poderia demonstrar um sinergismo

entre as moléculas químicas, ou seja, interagem entre si em uma mesma amostra, formando

fitocomplexos químicos, conferindo assim a atividade anti-C. a/bicam·. Nenhuma

substância foi isolada e testada separadamente, sendo assim, a atividade antifúngica dos

extratos brutos e frações podem ser consideradas promissoras.

23

6. Referências Bibliográficas da Jntt·odução Geral.

Adam K, Sivropoulou A, Kokkini S, Lanaras T, Arsenakis M. ~ Antifungal activities of

Origanum vulgare subsp. hirtztm, Mentha spicata, J,avandula angust(folia, and Sa/via

fruticosa Essential Oils against Human Pathogenic F ungi. J. Agric. Food Chem. 1998; 46:

1739-1745.

Ahmad 1, Beg AZ., Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants

against multi-drug res1stant human pathogens. J Ethnopharmacol. 2001; 74(2): 113-23.

Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes lnfect.

1999; 1 (2) 125-9

Amault I, Christides JP, Mandon N, Haffuer T, Kahane R, Auger J. High-performance ion

pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin, deoxyalliin, allicin and

dipeptide precursors in garlic products using multi pie mass spectrometly and UV detection.

J Chromatogr A. 2003; 28; 991(1): 69-75.

Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. MicJ"obes lnfect.

1999; 1(2) 125-9.

Baba-Moussa F, Akpagana K, Bouchet P. Antifungal activities of seven West African

Combretaceae used in traditional medicine. J Ethnopharmacol. 1999; 66(3): 335-8.

Block, E. The organosulfur chemistry of the genus Allium-Implications on the organic

chemistry of sulfur. Angew. Chem. Int. Ed. Engl 1991; 31, 1135-1 1 78

24

Calixto JB. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal

medicines (phytotherapeutic agents), Braz J Med Biol Res. 2000; 33{2):179-89

Cecanho R, Koo H, Rosalen PL, Cury JA, Pierobon CN, Park YK, Rehder VLG, Foglio

MA, Queiroga CL. XV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 1998. Águas de Lindóia

- SP, p. 14-17.

Cragg GM, Newman DJ. Discovery and development ofantineoplastic agents from natural

sources. Cancer Invest. 1999; 17(2): 153-63

Cragg GM, Newman DJ. Plants as a source of anti-cancer agents. J Ethnopharmacol.

2005; 100(1-2): 72-9.

Darbyshire B., Hemy R.J., Differences in fructan content and synthesis in some Allium

species, New Phytol. 87 (1981) 249-256.

De Lucca AJ, Walsh TJ. Antífungal peptides: novel therapeutic compounds against

emerging pathogens. Antimicmb Agents Chemother4 1999; 43{1 ): 1-11

Duarte MCT, Figueira GM, Sartoratto A, Rehder VLG, Delarmelina C. Anti-Candida

activity ofBrazilian medicinal plants. J. of Ethnopharmacol. 2005; 97: 305-311

Galli A, Franzetti L, Briguglio D. - Attività antimicrobica in vitro di oli essenziali ed

estratti di spezie di uso alimentare. lndustrie alimentary. 1998; 463-466.

25

Georgopapadakou NH, Walsh TJ, Antifungal agents: chemotherapeutic targets and

immunologic strategtes. Antimicrob Agents Chemother. 1996; 40(2): 279-91

Herbretcht R, The changing epidemiology of fungai infections: are the lipid-forms of

amphotericin B an advance? Eur J Haematol Suppl. 1996; 57: 12-7.

Joly V, Bolard J, Yeni P. In vitro models for studying toxicity of antifungal agents.

Antimicrob Agents Chemother. 1992; 36(9): 1799-804

Koch HP, Lawson LD, Garlic, the science and therapeutic application ofAllium salivum L.

and related species, in: Retford D.C. (Ed.), Williams and Wilkins, Baltimore 1996, pp. 1-

233.

Lancaster JE, Boland MJ Onions and allied crops. In Flavor Biochemistry; Brewster, J. L.,

Rabintowich, HE. Eds. CRC Press: Boca Raton, FL, 1999; pp 33-72

Lemar KM, Turner :MP, Lloyd D. Garlic (Allium sativum) as an anti-Candida agent: a

comparison of the efficacy of fresh garlic and freeze-dried extracts. J Appl Microbiol.

2002; 93(3): 398-405.

Lentz DL, Clark AM, Hufford CD, Meurer-Grimes B, Passreiter CM, Cordero J, et ai.

Antimicrobial properties ofHonduran medicinal plants. J Ethnopharmacol. 1998; 63(3):

253-63.

Leporatti 1\IIL, Corradi L, Ethnopharmacobotanical remarks on the province ofChieti town

(Abruzzo, central ltaly). J Ethnopha,.macol. 2001; 74(1 ): 17-40.

26

1\llahasneh AM., Screening of some indigenous Qatari medicinal plants for antimtcrobial

activíty. Phytother Res. 2002; 16(8): 751-3.

Martinez MJ, Betancourt J, Alonso-Gonzalez N, Jauregui A, Screening of some Cuban

medicinal plants for antimicrobial activity. J Ethnopharmacol. 1996; 52(3): 171-4.

1\llau JL, Chen CP, Hsieh PC. Antimicrobial effect of extracts from Chinese Chive,

Cinnamon, and Comi fructus. J. Agric. Food Chem. 2001; 49: 183-188.

Meumer, F., Targetíng fungi: a challenge, Am J Med. 1995; 99(6A): 60S-67S

Newrnan DJ, Cragg GM, Snader KM., Natural products as sources of new drugs over the

period 1981-2002. JNatProd. 2003; 66(7): 1022-37

Odds FC. Pathogenic fungi in the 21st centmy. Trends Microbiol. 2000; 8(5): 200-1

Panizzi L, Flamini G, Cioni PL, Morelli I., Composition and antimicrobial properties of

essential oils offour Mediterranean Lammceae. J Ethnopharmacol. 1993; 39(3 ): 167-70.

Pezzuto JM., Plant-derived anticancer agents. Biochem Pharmacol. 1997; 53(2): 121-33.

Pfaller MA. Antifungal susceptibility testing methods. Cun Drug Targets. 2005; 6(8):

929-43

27

Pierce GE. Pseudomonas aerugmosa, Candida albicans, and device~related nosocomial

infections: implications, trends, and potential approaches for contrai. Journal oflndustrial

Microbiology and Biotechnology, 2005 Volume 32, lssue 7, 309-318

Pino JA, Fuentes V, Correa MT. Volatile constituents ofChinese chive (Allium tuberosum

Rottl. ex Sprengel) and rakkyo (Allium chinense G. Don). J Agric Food Chem. 2001;

49(3) 1328-30.

Rates SM. Plants as source ofdrugs. Toxicon. 2001; 39(5): 603~13.

Sang S, Mao S, Lao A, Chen Z, Ho CT. Four new steroidal saponins from the seeds of

A/li um tuberosum. J Agric Food Chem. 2001; 49(3): 1475-8.

Ueki M, Ueno K, Miyadoh S, Abe K, Shibata K, Taniguchi M et a/. UK-1, a novel

cytotoxic metabolite from Streptomyces sp. 517-02. I. Taxonomy, fennentation, isolation,

physico-chemical and biological properties. J Antibiot. 1993; 46(7): 1089-94

Verduyn Lunel FM, Meis JF, Voss A Nosocomial fungai infections: candidemia, Diagn

Microbiollnfect Dis. 1999; 34(3 ): 213-20

Watanabe T. Allium tuberosum. Kagaku. 1966; 21(5): 507-513

WORLD HEALTH ORGANIZATION, Tradicional medicine strategy. World Health

Organization Headquarters and Regional Office. 2002.

28

Table 1. Compounds identifíed in the essential oils ofthe leaves (OL), bulbs (OB), ofthe

fractions Fl to F8, obtained of the OB and dichloromethanic extract from bulbs of

A.tuberosum, Retention Indices (RI) and relative percentages (%)for GC-MS.

GCarea 0/o

Compound RI OL EB OB Fl F2 F3-5 F6 F7

Furfural - - - 3.60 - - - 37.70 --·· ...

2 fumnmcthanol - - - 0.80 - - - 5.84 10.04

F8

1.93

1.93

3-Propanal meU1yl sulphide 915 2.52 - 1.55 - 1.15 1.38 36.73 4.95 4.08

Allyl methyl disulphidc 926 5.70 15.65 12.94 10.86 1.16

Mclhyl prupyl di~ulphidc 929 0.58 - - -l.i.IJithiane 937 - - 0.72 0.52 - - -

? · Furanecarboxaldehyde,5- 970 - - 0.87 - - 12.40 1.55 -mdhyl

Dimethyl iri~ulphide 98, ::>.\6 - 35.14 33.71 40.77 - - - -Dimethyl disulphidc 986 - 8.05 3.58 - - - - 18.62 42.45

sulphinate

Limonenc 1035 1.81 67.02 t - - -S methyl- 1062 - 2.62 ' - 1.28 7.3(, - -

mcthanotiosulphinate

11iallyl disulphíde 1087 13.14 - 4.72 6.30 6.30 - - - -Allyl propenyl disulphide 1102 4.42 - 0.57 0.37 - - -

Mcthyl mctyltio disulphide 1124 3.07 - 0.76 0.38 4.03 - -.A.Jlyl mdhyl !risulphide 1148 14.16 - 22.24 28.25 30.50 - - - -Dimethy tetrasulphide 1235 3.32 - 3.08 5.55 4.00 - - -

Diallyl trisulphide 1307 3.72 - 3.12 5.05 2.34 1.66 - -2·Methoxy-4 vinylphcnol 1311 5.20 - 0.03 - - -

2- Methoxy ·2· 1356 2.24 - - - - - -propenylphenol

Allyl methyl tetrasulphide 1371 1.68 0.45 2.18 0.35 - - -Buthyl methyltrisulphide 1411 0.98 - - - - -

[) Gutjunene 1491 - 3.60 - - - - -

• - no detected, t traces ( < O, 1 O%)

29

Table 2: Relative percentages of total sulphides class presented m essential oils of leaves

(OL), bulbs (OB), fractions FI to F8, obtained from OB, ande dichloromethamc extract of

bulbs (EB) of A. tuberosum.

Total Sulphides (% ) OL EB OB FI F2 F3-5 F6 F7 F8

GC-MS

Sulphides 2,52 - L 55 - 1 '15 1,38 36,73 4,95 4,08 i

Disulphides 26,33 - 26,90 20,60 21,20 - - 1,16 -

Trisulphides 20,30 3,60 60,50 67,00 73,60 1,66 -

letrasulphides 5,00 0,45 5,26 5,90 4,00 - - - -

Sulphinates - 10,67 3,::.8 - - 1,28 7,36 18,62 42,45 I

- no detected

30

Table 3: Values of minimal inhibitory concentration (MIC - 11g/mL) of essential oils from

leaves (OL) and bulbs (OB), extract from bulbs (EB) and fractions FI to F8 of the A

tuberosum against C. albicans ATCC 10231.

Microorganism Nistatin OF EB OB Fl F2 F3-5 F6 f7 fR

'

C afbicans 2 -~ 1000 ?SQ i - i 200 50 50 200 100 100 200

31

FIGURE 1

Allicin

' l deoomposition I transformatlon

~s,8~ ~s,8...,.s~

diallyl-disulphide diallyl-trlsulphide

3-vinyi-[4H]-1 ,2-dlthin

(1 dlaUyt-tetrasulphlde diallyl-pentasulphide

2-vinyi-[4H]-1 ,3.-dithiin

Figure 1 - Organosulphides compounds obtained from decomposition o r transformation of

the allicin.

32

FIGURE2

Muller-Hinton medium: 104UFC/ml lncubation: 36"C /24h Ref: Chloranpheniool Revelation: 20 ,,L TTC 0,5%

[0,015 mg ml

Figure2. Minimallnhibitory Concentration (MIC) lest by microdilution method (EIIof, 1998}.

Posilive contrai

Negative contrai

Figure 2 ~ Minimal Inhibitory Concentration (MIC) test by microdilution method (Ellof, 1998).

33

lll!lLIOTECA CENTRAL

DE!lENVOL VIMENTO t;(JtEÇÃO

UNICAMP

Anexo 1 -Resolução do formato alternativo para defesa

DELIBERAÇÃO CCPG- 001/98

Dispõe a respeito do formato das tese~ de Mestrado e de Doutorado aprovadas pela UN!CAMP

Tendo em vista a possibilidade, segundo parecer PG Na 1985/96. das teses de Mestrado e Doutorado terem um formato altematívo âquele já bem estabelecido, a CCPG resolve:

Artigo 1° - Todas as teses de mestrado e de doutorado da UN!CAMP h1t'ão o seguinte formato padrão:

l) Capa com formato úníco, dando visibilidade ao nfve! (mestrado e doutorado). e à Universidade.

H) Primeira fo!ha interna dando visibilidade ao nível (mestrado ou dolltorado), á Universidade, à Unidade em foi defendida e â banca examina.dora. ressaltando o nome do orientador e co-orientadores. No seu verso deve constar a ficha catalográfíca.

!I!) Segunda folha interna onde conste o resumo em português e o Abstract ern inglês.

IV) Introdução Geral. V) Capitulo. VI) Conclusão geraL VI!} Referência~ Bibliográficas. VIII) Apéndices (se necessários).

Artigo 2° - A critérío do orientador, os Capitulas e os Apêndices poderão conter cópias de artigos de autorta ou de co-autoria do candidato, já publicados ou submetidos para publ!cação em revístas científicas ou anais de congressos sujf)itos a arbitragem, escritos no idioma exigido pelo veículo de divulgação.

Parágrafo único~ Os veículos de divulgação deverão ser expressamente indicados.

Art1go 3° -A PRPG providenciara o projeto gráfico das capas bern como a impressao de um número de exemplares, da versão final da tese a ser !lomologada.

Artigo 4°- Fica revogada a resoluçao CCPG 17/97.

34

Anexo 2- E-mail de confirmação da submissão do artigo no Journal ofEthnopharmacology

Pasta Atual: INBOX.Sent Escrever Endereços Pastas Opções Procurar .A.i.lli.ill

Lista de

Desconectar

SQuirre!Mail

Mensagens I Apagm: I Editar Anterior I Próxima Encaminhar I Encaminhar como anexado I Responder I Responder a tod( mensagem como nova

Assunto: [Fwd: Submission Confirrnation for your paper] De: [email protected]

Data: Qui, Junho I, 2006 !0:19am Para: [email protected]

CC: [email protected]

Prioridade: Normal Opções: Vçr cabecalho con:mlcto I Ver Ver:>ã9_Rara lmp.r~.:::.;;ão

--------------------------- Mensagem Original ----------------------------Assunto: Submission Confirmation for your pape= De: Data:

"Journal o f Ethnopharmacology" < j eth~oph@l§l.cdr. leidenuni v_ nl > Qui, Junho 1, 2006 10:34 am

Para: rehder@cp~ba.u~icamp.br

Dear Dr.Rehder,

Your submission entitled "In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of Allium tuberosum Rotth.eK Sprengel" has been received by journal Journal of Ethnopharmacology

You will be able to check on the Elsevier Editorial as an author.

progress The U?.L

of your paper by logging on to is b.t.!;,p__UÉ_es. elsev!_~r. com/ i_~L.

Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned.

Thank you for submitting your work to t:-,.:..s jo:...::::nal.

Kind regards,

Journal of Ethnopharmacology

35

Anexo 3- Cromatogramas dos OF, OB, EB e frações Fl a F8 do OB

=i ' = i

4CXXX:Oj

=

Figura 1: Cromatograma do óleo essencial das folhas- OF de A. tuberosum

TIC c:B.jb03a.D.data.rn;

Figura 2: Cromatograma do óleo essencial dos bulbos extraídos- OB de A. tuberosum

36

Figura 3: Cromatograma do extrato diclorometânico dos bulbos - EB de A. tuberosum.

I 45.00 ff)_(X} 55_(X}

Figura 4: Cromatograma da Fl da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.

37

r t!Í.sÜnn:cA CENTRAL

I !J';S~lJVOLV!MENTO ('. '" ;.;.;····~()I ·' '. ·~·~..., .... UNlCAMP

' ~I

' -o= I

=

Figura 5: Cromatograma da F2 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.

-o=.

a'llXX)l ::m::rni

i =I =i

' I 1EaXO! 1oco:Dj

8X.()J! l

' sm 10.00 lcllG)~, ~,~. ~, I~J

35.00 40.00 45.00 8000 5S.CO

I 15.00 2[)_(X) 25.00 30.C:O

Figura 6: Cromatograma da F3-5 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.

38

S.CD 10:CD 15.CD 2D.CD 25.CD 30.CD 35_CD 40_CD 45.CD !'n.CD 55_CD


3ECO:Di =' =I =I :::r~ ~~~,. ,c,,.l~'""'· ~~*',..,i,Jl;.Jl.~"+~'+·~~~. ~~·~.-.... L~

5_CD 10.CD 15.CD 2D.CD 25_CD 3Q_(X) 35_CD 4Üo:> 45o:> EO.CD 55.CD


39

= "="

1lC Fi<lcao6.0..dala...-s

,=1 , iUJ~,, •. J.~~~~ l ~ k.,

S.CO 1Q(X) 15.00 2íHD 25.00 3CHXl 35_CO 40.00

11 I I~ 45.00 !1)_00 55_00


40

Anexo 4- Placa de CCD (cromatogra:fia em camada delgada) das frações de OB

41

[SÍBI.IVTECA CENTRAL

I !lF-SENifOLVIMENTO

CCH .. f.:ÇÃO

UNICAMI'

Anexo 5- Espectros de massa dos principais constituintes do OB

I=<XJOOj

IIC~

'

o

·~ 120:)00!

s s H3G_.... 'S/ 'CH3

dimatil~trisulfeto

MM= 126

T

::;; .!1 ~~· ·="~71 ~~·~·~e;:,~~~~-~~1~1 -=-;::t} ,=~. ~.,;,.~.~~.~1~·~~.0~~-m.~;:,~·~~

.,

I '

dialil-disulfeto MM= 146

s.,.__..-, 1268 (9_931 nin): CEAit"K> Ro<:*>:l<>.D.d"-an--..

1oxooj

=I I "' I =:1 ~= Ü~.l~7-=~=~·-,~·~·-~~ ~·~·~~~~~l,_,l~~~+ll~,-.-~T ~;"r~, ~·~·,~r-·~·~"c.-ccl"~'~"'c--1j"'"~ ~ ......- 'su eo 70 so so 1m' 110 12D 1:\.o 1.J.o 1k

42

'~I

=:I

==j 500Cúl

' ~·

::1 oi = I

' =

~5's/5'cH3 alil,metil-trisuifeio

MM= 152

=

I

~ "' ' ,I, I. ~li,, 11~-, ~

' ' = ~ '~

H3c/s'-s/s,s/cH3

dimetil-tetrasu ifeto

"o 1201:<E

' '"" '=

Sc:an22!90 (152SO .-ril): CEAiho R=tigo_D.dorn._ns

79

'= " '~ '= '=

I 1

~ ,li!, ,,):-'i'C:I "Í)'""' -4!J'"I ~,c'iccl "'~cf!',l,~T~,.;, . , .. ,'.'i'--c,~"±~ :~~ 40 50 80 70 80 90 1CO 110 120 130 140 150 160

43

I =I

=I I

~I

~ ...... s_....s~ dialif..trisulfeto

MM= 178

Sc-..an2913 (1aS17 n"in): CEAir>o R:>driQC>.DI.ddarT»

= I

I

=LJl' ,li ' I 64 i·

0 = _ÍI · 48 ~1 , __ j, , 1j 96 103 Jl, ,-, -·~,:c'o'~~C:'"~"''==-CCJ'::c-·cc:::c-'cS~,~-- .

90 1CK> 110 120 130 140 150 160 170 180

~'-''-'"1

' ~~"'"'I

' """'"! 2<0·00~

'-''-''-'''1 '

30 40 50 60 70

o li

H3C-8-SCH3

~ 8-metil,metano-sulfinato

MM= 126

'!

44

I 4000001 '-''-'<>~•<><>

"DODDD

'-'<>uoool

260000,

74<><><>'-'j

1-4U000

120000

20000

o

I li

I 02

'~dl .• 40 oO

o 11

H3C_...S,S_....CH3

dimetil-disulfeto-S-óxido

MM:: 110

.,,.., li· ·'I ' I 'o I'-'-!' ~·.

45

_," '

ao

[, .t .. ,,, " '-~"

Anexo 6- Principais estruturas químicas identificadas por CG-EM dos OF, OB, EB e

frações dos OB

H3C'--./s,8

/CH3

metil,etil-disu~eto

MM= 108

_/---,,/_s,8/c H3

metil,propil-disulfeto

MM= 122

metil,2-propenil-disu~eto propil,etil-disu~eto

MM= 120 MM= 136

butil,meti~disu~eto

MM= 136 dialü-disulfeto MM= 146

o 11

_......S....__ _......CH3 H3C S

H3C'--./S, /"'-. S CH3

dietil-disulfeto

MM= 122

dipropil-disulfeto MM= 150

alil-1-propenil-disu~eto

MM= 146

o 11

H3C-S-SCH3 g

metil,metiltio-disulfeto

MM= 152

dimetil-disulfeto-S-óxido

MM= 110

s-metil,metano-sulfinato

MM= 126

46

1 ,3-ditiano

MM; 120

dimeti\-trisulfeto

MM; 126

dimeti\-tetrasuWeto

MM;158

diali\-tetrasuWeto

MM;210

propana\,3-metil-suWeto

MM; 104

dialil-trisuWeto ali\,meti\-trisuWeto

MM; 178

a\i\,propi\-tetrasuWeto MM; 212

a\i\,metil-tetrasuWeto MM;184

47

MM; 178

Anexo 7- Fórmula para cálculo de índice de Kovatz

Q_ llM>.lo<!eO"ir;ie<l

O'>)l--t<;> • ••rrt.lc .'<JIQ

IK=--·

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

CENTRO PLURJDISCIPUNAR DE PESQUISAS QUÍMICAS1 BIOLÓGICAS E AGRÍCOLAS

DIVISÃO DE QUÍMICA ORGÂNICA E FARMACÊUTICA

ÍNDICE DE KOVATZ

+ 100 C~, Tr cn- Tr cn-1

Tr, Tempo de retenção da amostra

'NT'10 PLURIO!SCIPLIW>.R DE PESQUISAS OUIMJCAS, BIOLOG\CAS E AGR[CQU\5

onde:

Trc, Tempo de retenção do hidrocarboneto com "n" carbonos Tren-, Tempo de retenção-do hidrocarboneto com "n-1" carbonos C, Número de carbonos do hidrocarboneto "n" C"' Número de carbonos do hidrocarboneto "n-1"

48

MESTRADO -...

Documents

Transcript of MESTRADO -...