MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE

MICROBIANA

Anderson Barbosa

Hadja Radtke

Mariana Uchoa

Tammy Arai

Florianópolis, 24 de junho de 2010

Introdução

• Diversidade microbiana – bactérias, protozoários, fungos e algas unicelulares

Diversidade

Riqueza(no de grupos presentes)

Homogeneidade(abundância relativa de cada

grupo)

• Maior diversidade: muitas espécies em abundância relativamente igual

• Inventário atual da biodiversidade mundial – muito incompleto (vírus, microorganismos e invertebrados)

1,7 milhões de espécies vivas no planeta

5.000 espécies identificadas de procariotos

Representam apenas 1 a 10% de todas as

espécies de bactérias

• Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana

• Solo talvez seja habitat mais explorado para isolamento de microorganismos

• Fontes naturais diversas oferecem ambientes ricos para exploração – água doce, matéria orgânica, sedimentos, folhas, frutos...

1% da população bacteriana do solo pode ser cultivada através das práticas comuns de laboratório

Grande diversidade fenotípica e genética das comunidades do solo – uma das mais difíceis de estudar

Análise da diversidade de um ambiente:

Estudos dependentes de

cultura

Estudos independentes de

culturaX

Estudos dependentes de cultura

• Bactérias isoladas de amostras do ambiente através de meio de cultura – ácido nucléico extraído

• Problema: microorganismos viáveis mas não cultiváveis (não são metabolicamente inertes: sintetizar proteínas e usar substratos)

• São limitados - apenas bactérias que podem ser cultivadas

• Não refletem a real estrutura da comunidade microbiana

Estudos dependentes de cultura

Maioria das bactérias será excluída quando diversidade for estimada

Métodos independentes de cultura

• Extração direta dos ácidos nucléicos das amostras do ambiente – métodos moleculares

• produtos podem ser clonados e sequenciados: identificar e enumerar as espécies de bactérias presentes

• amplificação do DNA extraído por PCR e análise da diversidade das moléculas amplificadas:

“fingerprinting”

% muito maior de microorganismos, que não é cultivada em laboratório

Limitações dos métodos moleculares

• método de extração do DNA ou RNA usado: muito suave gram + não são lisadas; muito severo DNA pode ser danificado

• separação das células microbianas dos componentes do solo: substâncias inibitórias (ácidos húmicos) – se co-extraídas interferem na PCR

Primeiros requisitos e obstáculo a ser superado: extração e purificação dos ácidos nucléicos

Podem influenciar a análise e interpretação dos resultados das avaliações moleculares

Métodos para medir a diversidade microbiana no solo:

Técnicas bioquímicas Técnicas moleculares

-Contagem em placas

- Nível fisiológico da comunidade (CLPP)

-Microradioautografia

- Atividade enzimática do solo

-Analise de ácidos graxos (FAME)

- Conteúdo de guanina + citosina

- Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

- Microarranjos ou microchips de DNA

- DGGE – TGGE

- SSCP

- ARDRA / RFLP

- T-RFLP

-RISA / ARISA

Contagem de placas e Níveis fisiológicos da comunidade

Representa apenas microorganismos cultiváveis Favorece organismos de rápido crescimento Só representa os organismos capazes que utilizar a fonte de carbono escolhida Mostra o potencial de diversidade metabólica e não a diversidade in situ .

Escolher condições de crescimento ótimas abrangentes Impossibilidade de cultivar grande quantidade de espécies Favorescimento de microorganismos com crescimento mais acelerado.

Diluição da amostra

Inoculação na placa

Contagem dos viáveis

Análise da capacidade da comunidade microbiana em utilizar determinadas

fontes de carbono

Microradioautografia e FISH

Através da quantidade absorvida por uma célula de um substrato

específico marcado radioativamente, pode-se detectar e quantificar a

população ativa que está usando esse substrato.

FISH (Fluorescence in situ hybridization) usada para detectar a

presença de uma sequência específica de DNA nos cromossomos. Usa-se um marcador fluorescente que

liga-se à sequência escolhida e, através da microscopia de

fluorescência pode-se visualisar a marcação.

Permite elucidação da função ecológica dos microorganismos

Permite elucidação da filogenética dos microorganismos

Atividade enzimática do solo

As enzimas encontradas naturalmente no solo provém, principalmente, de microorganismos, apesar de resíduos animais e vegetais também serem uma possível

fonte.

Atividade enzimática

Exoenzimas

Endoenzimas

São avaliadas as atividades de enzimas do solo associadas:- ao ciclo do carbono b-glucosidase- do fósforo fosfatase ácida- do enxofre arilsulfatase

Dessa forma, pode-se associar a atividade enzimática com o papel ecológico do microorganismo presente no solo

Análises dos ácidos graxos

Esse método informa sobre a composição da comunidade microbiana baseado em grupos de

ácidos graxos.

Análise por cromatografia de gás

coleta

saponificação

metilação

extração

lavagem

- Ácidos graxos - Ácidos graxos específicosde grupos taxonômicos

Uma mudança no perfil da comunidade significa uma mudança na microbiota

Perfil

• Conteúdo guanina + citosina• Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização• Microarranjos de DNATécnicas de PCR• DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

Técnicas moleculares para o estudo da diversidade

microbiana

• SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples• RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal

amplificado• T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos

de restrição terminais• RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal• Rep-PCR – caracterização de sequências altamente

repetitivas ou microssatélites

Técnicas moleculares para o estudo da diversidade

microbiana

• Diferenças na quantidade de guanina + citosina no DNA

• Diversidade bacteriana de comunidades do solo

• Diferem entre 3% e 5%

Conteúdo guanina + citosina

• Vantagens de análises G+C– Sem influência de PCR– Inclui todo o DNA extraído– Pode detectar membros raros de uma

comunidade– Método quantitativo

Conteúdo guanina + citosina

• Análise de mudanças na diversidade microbiana no solo havaiano

Conteúdo guanina + citosina

• DNA total é extraído, purificado e desnaturado

• A taxa de hibridização ou reassociação depende da similaridade das sequências

• Tempo relacionado com a diversidade

• Importante ferramenta qualitativa e quantitativa na ecologia molecular bacteriana

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

• Sondas de ácidos nucleicos– Sondas são pequenas porções de DNA (ou

RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra

– A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina HIBRIDIZAÇÃO

• Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

• Desvantagens– Pouca sensibilidade– Sequências necessitam de um grande

número de cópias para serem detectadas

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

Microarranjos de DNA

“DNA microarrays”

Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes.

Microarranjos ou microchips de DNA

Microarranjos ou microchips de DNA

Microarranjos ou microchips de DNA

DGGE e TGGE

• Analise de produtos de PCR de acordo com suas sequências de pares de base*

• DGGE utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes ( uréia e formamida)

• TGGE utiliza um gradiente térmico com concentração constante de uréia e formamida

DGGE e TGGE

• Técnica rápida, relativamente barata e reproduzível

DGGE e TGGE

• Fitas simples formam estruturas secundárias que dependem do seu comprimento e da sequência de bases

• Detecção por autorradiografia dos produtos do PCR com marcadores radioativos ou por coloração com nitrato de prata

• Vantagens e desvantagens similares ao DGGE• Algumas fitas podem formar mais de uma

conformação

SSCP

RFLP/ARDRA

• Enzimas de restrição – fragmentos de restrição• Separação por gel agarose• Southern blot - Hibridização a um DNA de prova e

detecção com moléculas radioativas ou fluorescentes

• Detecção de genótipos: MM Mm mm• Útil para detectar mudanças estruturais nas

comunidades bacterianas mas não para medir a diversidade ou detectar grupos específicos

• (Extração, PCR)

RFLP/ARDRA

• Mesmo princípio da RFLP• Um primer do PCR é marcado com uma

substância fluorescente• Leitura do padrão de banda simplificada• Uso de sequenciador automático – altamente

reproduzível• Possibilita a análise de comunidades complexas

e a coleta de informações sobre a diversidade, mas pode trazer distorções aos resultados (escolha primer)

T-RFLP

• Região IGS entre as subunidades ribossomais 16S e 23S

• Heterogeneidade – útil para diferenciar estirpes bacterianas diferentes e espécies muito próximas

• RISA requer muito DNA, marcador de prata pode ser insensível

• ARISA ainda possui as limitações tradicionais do PCR

RISA/ARISA

• Sequencias de DNA repetidas de 1-10 pb - microssatélites

• Pode servir para diagnóstico da espécie ou linhagem

• Sequência deve ser conhecida para uso do primer apropriado

Rep-PCR

Considerações finais

• Grande número de métodos disponíveis para estudar diversidade microbiana do solo

• Cada método tem suas limitações – fornece apenas um retrato parcial

• Aconselhável utilizar uma variedade de métodos, incorporando resultados de métodos tradicionais e moleculares