MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE
MICROBIANA
Anderson Barbosa
Hadja Radtke
Mariana Uchoa
Tammy Arai
Florianópolis, 24 de junho de 2010
Introdução
• Diversidade microbiana – bactérias, protozoários, fungos e algas unicelulares
Diversidade
Riqueza(no de grupos presentes)
Homogeneidade(abundância relativa de cada
grupo)
• Maior diversidade: muitas espécies em abundância relativamente igual
• Inventário atual da biodiversidade mundial – muito incompleto (vírus, microorganismos e invertebrados)
1,7 milhões de espécies vivas no planeta
5.000 espécies identificadas de procariotos
Representam apenas 1 a 10% de todas as
espécies de bactérias
• Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana
• Solo talvez seja habitat mais explorado para isolamento de microorganismos
• Fontes naturais diversas oferecem ambientes ricos para exploração – água doce, matéria orgânica, sedimentos, folhas, frutos...
1% da população bacteriana do solo pode ser cultivada através das práticas comuns de laboratório
Grande diversidade fenotípica e genética das comunidades do solo – uma das mais difíceis de estudar
Análise da diversidade de um ambiente:
Estudos dependentes de
cultura
Estudos independentes de
culturaX
Estudos dependentes de cultura
• Bactérias isoladas de amostras do ambiente através de meio de cultura – ácido nucléico extraído
• Problema: microorganismos viáveis mas não cultiváveis (não são metabolicamente inertes: sintetizar proteínas e usar substratos)
• São limitados - apenas bactérias que podem ser cultivadas
• Não refletem a real estrutura da comunidade microbiana
Estudos dependentes de cultura
Maioria das bactérias será excluída quando diversidade for estimada
Métodos independentes de cultura
• Extração direta dos ácidos nucléicos das amostras do ambiente – métodos moleculares
• produtos podem ser clonados e sequenciados: identificar e enumerar as espécies de bactérias presentes
• amplificação do DNA extraído por PCR e análise da diversidade das moléculas amplificadas:
“fingerprinting”
% muito maior de microorganismos, que não é cultivada em laboratório
Limitações dos métodos moleculares
• método de extração do DNA ou RNA usado: muito suave gram + não são lisadas; muito severo DNA pode ser danificado
• separação das células microbianas dos componentes do solo: substâncias inibitórias (ácidos húmicos) – se co-extraídas interferem na PCR
Primeiros requisitos e obstáculo a ser superado: extração e purificação dos ácidos nucléicos
Podem influenciar a análise e interpretação dos resultados das avaliações moleculares
Métodos para medir a diversidade microbiana no solo:
Técnicas bioquímicas Técnicas moleculares
-Contagem em placas
- Nível fisiológico da comunidade (CLPP)
-Microradioautografia
- Atividade enzimática do solo
-Analise de ácidos graxos (FAME)
- Conteúdo de guanina + citosina
- Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização
- Microarranjos ou microchips de DNA
- DGGE – TGGE
- SSCP
- ARDRA / RFLP
- T-RFLP
-RISA / ARISA
Contagem de placas e Níveis fisiológicos da comunidade
Representa apenas microorganismos cultiváveis Favorece organismos de rápido crescimento Só representa os organismos capazes que utilizar a fonte de carbono escolhida Mostra o potencial de diversidade metabólica e não a diversidade in situ .
Escolher condições de crescimento ótimas abrangentes Impossibilidade de cultivar grande quantidade de espécies Favorescimento de microorganismos com crescimento mais acelerado.
Diluição da amostra
Inoculação na placa
Contagem dos viáveis
Análise da capacidade da comunidade microbiana em utilizar determinadas
fontes de carbono
Microradioautografia e FISH
Através da quantidade absorvida por uma célula de um substrato
específico marcado radioativamente, pode-se detectar e quantificar a
população ativa que está usando esse substrato.
FISH (Fluorescence in situ hybridization) usada para detectar a
presença de uma sequência específica de DNA nos cromossomos. Usa-se um marcador fluorescente que
liga-se à sequência escolhida e, através da microscopia de
fluorescência pode-se visualisar a marcação.
Permite elucidação da função ecológica dos microorganismos
Permite elucidação da filogenética dos microorganismos
Atividade enzimática do solo
As enzimas encontradas naturalmente no solo provém, principalmente, de microorganismos, apesar de resíduos animais e vegetais também serem uma possível
fonte.
Atividade enzimática
Exoenzimas
Endoenzimas
São avaliadas as atividades de enzimas do solo associadas:- ao ciclo do carbono b-glucosidase- do fósforo fosfatase ácida- do enxofre arilsulfatase
Dessa forma, pode-se associar a atividade enzimática com o papel ecológico do microorganismo presente no solo
Análises dos ácidos graxos
Esse método informa sobre a composição da comunidade microbiana baseado em grupos de
ácidos graxos.
Análise por cromatografia de gás
coleta
saponificação
metilação
extração
lavagem
- Ácidos graxos - Ácidos graxos específicosde grupos taxonômicos
Uma mudança no perfil da comunidade significa uma mudança na microbiota
Perfil
• Conteúdo guanina + citosina• Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização• Microarranjos de DNATécnicas de PCR• DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante
Técnicas moleculares para o estudo da diversidade
microbiana
• SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples• RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal
amplificado• T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos
de restrição terminais• RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal• Rep-PCR – caracterização de sequências altamente
repetitivas ou microssatélites
Técnicas moleculares para o estudo da diversidade
microbiana
• Diferenças na quantidade de guanina + citosina no DNA
• Diversidade bacteriana de comunidades do solo
• Diferem entre 3% e 5%
Conteúdo guanina + citosina
• Vantagens de análises G+C– Sem influência de PCR– Inclui todo o DNA extraído– Pode detectar membros raros de uma
comunidade– Método quantitativo
Conteúdo guanina + citosina
• Análise de mudanças na diversidade microbiana no solo havaiano
Conteúdo guanina + citosina
• DNA total é extraído, purificado e desnaturado
• A taxa de hibridização ou reassociação depende da similaridade das sequências
• Tempo relacionado com a diversidade
• Importante ferramenta qualitativa e quantitativa na ecologia molecular bacteriana
Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização
• Sondas de ácidos nucleicos– Sondas são pequenas porções de DNA (ou
RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra
– A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina HIBRIDIZAÇÃO
• Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos
Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização
• Desvantagens– Pouca sensibilidade– Sequências necessitam de um grande
número de cópias para serem detectadas
Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização
Microarranjos de DNA
“DNA microarrays”
Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes.
Microarranjos ou microchips de DNA
Microarranjos ou microchips de DNA
Microarranjos ou microchips de DNA
DGGE e TGGE
• Analise de produtos de PCR de acordo com suas sequências de pares de base*
• DGGE utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes ( uréia e formamida)
• TGGE utiliza um gradiente térmico com concentração constante de uréia e formamida
DGGE e TGGE
• Técnica rápida, relativamente barata e reproduzível
DGGE e TGGE
• Fitas simples formam estruturas secundárias que dependem do seu comprimento e da sequência de bases
• Detecção por autorradiografia dos produtos do PCR com marcadores radioativos ou por coloração com nitrato de prata
• Vantagens e desvantagens similares ao DGGE• Algumas fitas podem formar mais de uma
conformação
SSCP
RFLP/ARDRA
• Enzimas de restrição – fragmentos de restrição• Separação por gel agarose• Southern blot - Hibridização a um DNA de prova e
detecção com moléculas radioativas ou fluorescentes
• Detecção de genótipos: MM Mm mm• Útil para detectar mudanças estruturais nas
comunidades bacterianas mas não para medir a diversidade ou detectar grupos específicos
• (Extração, PCR)
RFLP/ARDRA
• Mesmo princípio da RFLP• Um primer do PCR é marcado com uma
substância fluorescente• Leitura do padrão de banda simplificada• Uso de sequenciador automático – altamente
reproduzível• Possibilita a análise de comunidades complexas
e a coleta de informações sobre a diversidade, mas pode trazer distorções aos resultados (escolha primer)
T-RFLP
• Região IGS entre as subunidades ribossomais 16S e 23S
• Heterogeneidade – útil para diferenciar estirpes bacterianas diferentes e espécies muito próximas
• RISA requer muito DNA, marcador de prata pode ser insensível
• ARISA ainda possui as limitações tradicionais do PCR
RISA/ARISA
• Sequencias de DNA repetidas de 1-10 pb - microssatélites
• Pode servir para diagnóstico da espécie ou linhagem
• Sequência deve ser conhecida para uso do primer apropriado
Rep-PCR
Considerações finais
• Grande número de métodos disponíveis para estudar diversidade microbiana do solo
• Cada método tem suas limitações – fornece apenas um retrato parcial
• Aconselhável utilizar uma variedade de métodos, incorporando resultados de métodos tradicionais e moleculares
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