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Eduardo Alécio – CEFET/PE

Métodos Microbiológicos para Contagem de Fungos e Bactérias

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Contagem Padrão em PlacaÉ um método de inoculação, onde se introduz uma quantidade de amostra num meio de cultura adequado.

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• Inoculação em placas de Petri: Técnica em superfície (Spread Plate)

IncubaçãoMeio Sólido

Espalhamento

Amostra

Adiciona-se 0,1 mL de uma diluição da amostra com pipeta estéril no centro da placa e espalha-se com o auxílio de uma alça de Drigalski ou um bastão estéril.




Contagem Padrão em Placa (cont.)3

• Inoculação em placas de Petri:

Técnica em Profundidade (Pour Plate)

Incubação

Meio Líquido

Amostra

Adiciona-se 1 mL da amostra ou sua diluição na placa de Petri vazia. Verte-se 20 mL de meio de cultura fundido e resfriado a 45ºC. Agita-se a placa em movimentos circulares .





Resultado a ser alcançado:

• Que no meio sólido cada célula viável (UFC) dê origem a uma colônia isolada.

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Contagem Padrão em Placa (cont.)





Número Mais Provável - NMPTécnica de diluição idealizada por McCrady (1915), onde se faz uma estimativa da densidade média dos microrganismos na amostra

De fácil execução, mas é laboriosa.

Baseia-se em fórmulas de probabilidade

É estimada utilizando fórmula ou tabelas

A densidade microbiana é estimada pela relação de tubos positivos e negativos

Aplicado apenas para contagem de Bactérias

5Eduardo Alécio – CEFET/PE




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Número Mais Provável - NMP (cont.)

1. Diluições sucessivas:

10 g

da Amostra

1mL 1mL

90mL

9 mL 9 mL

Dil 1/10 Dil 1/100 Dil 1/100

1 mL Dil. 1/10

1 mL Dil. 1/100

1 mL Dil. 1/1000

1 mL Diluente

2. Incubação: Em meios adequados





Número de tubos cujo crescimentoé visível para cada quantidade do

produto sob exame

NúmeroMais

Provávelde

microrganismos

por g oumL

Limite NMP

100 mg ou 0,1 mL

/tubo

10 mg ou0,01 mL

/tubo

1 mg ou0,001 mL

/tubo

Inferior

Inferior

00011111222233333

00100112001123333

01001010010120123

<333477

11119

141520210240460

1100>2.400

-<0,5<0,50,511331337

35367150-

-913202123363636374489

470130024004800

-

Número Mais Provável - NMP (cont.)

Leitura: Tabela estatística

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Filtração por Membrana8

O método baseia-se na filtração de volumes adequados da amostra diluída através de membrana filtrante com porosidade de 0,45 µm.

As bactérias e fungos a serem detectados, apresentando dimensões maiores, ficarão retidas na superfície da membrana, a qual é então transferida para placa de Petri contendo meio seletivo e diferencial.





Filtração por Membrana (cont.)9

2. Montar assepticamente a membrana no sistema de filtração

3. Ligar a fonte de vácuo

1. Diluir a amostra





Filtração por Membrana (cont.)

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4. Filtrar a amostra diluída (Equivalente a 1g da amostra)

5. Transferir o filtro para o meio sólido em placa de Petri





Filtração por Membrana (cont.)

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6. Incubar em temperatura para bactéria e fungo

7. Contar as colônias e calcular o nº de microrganismo / g ou mL





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•Determinar o número total de bactérias e fungos em produtos e matérias-primas Não-estéreis


Contagem de Microrganismos Viáveis Totais em Produtos Farmacêuticos (Farmacopéia Brasileira 4ª edição, 1988)

-Contagem da população microbiana que cresce após 4 dias emágar Caseína-soja a 30-35ºC

-Contagem da população microbiana que cresce após 7 dias emágar Sabouraud Dextrose a 20-25ºC

Sobre o Método:

Realizar o teste preferencialmente em capela de fluxo laminar.

Quando possível utilizar filtração por membrana.




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•Limites Microbianos para Produtos Farmacêuticos (USP XXIV)


Contagem de Microrganismos Viáveis Totais em Produtos Farmacêuticos (cont.)

-Preparações para Uso Oral e Tópico:

Bactérias mesófilas aeróbias: Máximo 500/g ou mLBolores e leveduras: Ausência

-Outros Produtos

Bactérias mesófilas aeróbias: Máximo 103/g ou mLBolores e leveduras: Máximo 102/g ou mL




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