Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira

MODULAÇÃO DO ESTADO REDOX EM ILHOTAS

PANCREÁTICAS E SUA IMPLICAÇÃO NA SECREÇÃO

DE INSULINA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Humana do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Fisiologia Humana Orientador: Prof. Dr. Angelo Rafael Carpinelli

São Paulo

2010

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RESUMO Rebelato E. Modulação do Estado Redox em Ilhotas Pancreáticas e sua Implicação na

Secreção de Insulina 2010. 178 f. [tese (Doutorado em Fisiologia Humana)]. São Paulo:

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.

Alterações no estado de óxido-redução (redox) aparecem como importante via de controle da

funcionalidade de diferentes tipos celulares. Em ilhotas pancreáticas, níveis elevados de

peróxido de hidrogênio (H2O2) foram reportados por diminuir o conteúdo de ATP e

hiperpolarizar o potencial de membrana plasmática, suprimindo a secreção de insulina

estimulada pela glicose (GSIS). Esses achados sugerem a influência de alterações no ambiente

oxidativo sobre a função de células β pancreáticas, bem como indicam a importância de um

ajuste do estado redox para a GSIS. Neste estudo, pudemos observar que o favorecimento do

estado oxidativo, devido à adição de H2O2 tanto em concentrações elevadas, quanto em

concentrações próximas ao máximo obtido fisiologicamente, promoveram a inibição da

secreção de insulina, por inibição do metabolismo da glicose e das oscilações intracelulares de

cálcio ([Ca2+]i). De modo contrário, alterações no estado redox pela adição de antioxidantes,

como a catalase-peguilada (CAT-PEG) e a N-acetil-L-cisteína (NAC), promoveram efeitos

positivos sobre a secreção de insulina, associados ao aumento do metabolismo da glicose e

das oscilações de [Ca2+]i. Porém, os efeitos positivos dos antioxidantes sobre as ilhotas

pancreáticas foram concomitantes a pequenas diminuições no conteúdo das espécies reativas

de oxigênio (EROs). Por outro lado, diminuições mais acentuadas no conteúdo de EROs,

promovidas por maiores concentrações dos antioxidantes, suprimiram o efeito positivo

previamente observado sobre a secreção de insulina. Ademais, um efeito negativo sobre a

funcionalidade das ilhotas pancreáticas ocorreu em resposta a uma diminuição drástica no

conteúdo intracelular de EROs devido à inibição da enzima NAD(P)H oxidase. Dessa forma,

a modulação no estado redox celular, favorecendo o estado oxidativo, inibiu a funcionalidade

da célula β pancreática. Entretanto, a diminuição do estado oxidativo, exerceu efeito dual

sobre a funcionalidade da célula β pancreática, onde pequenas alterações se mostraram

estimulatórias sobre a secreção de insulina, enquanto alterações maiores suprimiram este

efeito positivo. Adicionalmente, o conteúdo de EROs foi modulado pela glicose em ilhotas

pancreáticas. O aumento na concentração de glicose diminuiu o conteúdo de EROs, sendo

este efeito correlacionado com o aumento na atividade da via das pentoses-fosfato (PPP) pela

glicose. A atividade da PPP contribui para a funcionalidade das defesas antioxidantes através

da produção de NADPH. A inibição da PPP resultou na perda do controle de EROs pela

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glicose em paralelo à perda da GSIS. Sob estes aspectos, a ativação das células β pela glicose

parece também requerer um ajuste no conteúdo intracelular de EROs para sua funcionalidade,

sendo essa regulação redox dependente do metabolismo de glicose.

Palavras-chave: Ilhota pancreática. Metabolismo da glicose. Estado redox. Secreção de

insulina.

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ABSTRACT

Rebelato E. Redox Modulation in Pancreatic Islets and its Implication for Insulin Secretion

2010. 178 f. [thesis (PhD in Human Physiology)]. São Paulo: Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.

Changes in the intracellular oxidation/reduction (redox) state have been considered an

important pathway to control cell function. Shifts toward an oxidative environment due to

addition of high concentrations of hydrogen peroxide (H2O2) to pancreatic islets was reported

to decrease the ATP content, to hyperpolarize the plasma membrane potential and suppress

glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). These findings suggest an implication of the

redox state in pancreatic β cell function, where possible adjustments of the redox state are

required for GSIS. This work shows that increases in the oxidative state by H2O2 addition, to

high or close to maximal physiological levels, decreased insulin secretion through inhibition

of glucose metabolism and of intracellular calcium oscillations ([Ca2+]i). In an opposite way,

changing the redox state by antioxidant treatment with PEG-catalase (PEG-CAT) and N-

acetyl-L-cysteine (NAC) resulted in a positive effect on insulin secretion, in association with

an increase in glucose metabolism and [Ca2+]i. This positive effect by the antioxidants was

paralleled to small changes in the reactive oxygen species (ROS) levels. However, a more

drastic decrease in ROS content, due to higher concentrations of the antioxidants, suppressed

the positive effect previously observed on insulin secretion. Moreover, a negative effect on

pancreatic β cell function was also observed during the drastic suppression of intracellular

ROS content by inhibition of the enzyme NAD(P)H oxidase. Thus, the redox modulation

favoring the oxidative state inhibits pancreatic β cell function. However, the suppression of an

oxidative state exerts a dual effect on pancreatic β cell function, where small changes in the

ROS content was positively correlated with an increase in insulin secretion, while higher

changes suppressed this GSIS. Additionally, ROS content was decreased by increasing

glucose concentrations in pancreatic islets, and such effect was correlated with the activation

of the pentose-phosphate pathway (PPP) by glucose. The PPP is a metabolic shunt which is

important for antioxidant defense due to NADPH production. PPP inhibition resulted in the

impairment of ROS control by glucose and GSIS. Thus, the mechanism of insulin secretion in

response to glucose might also request an adjustment of intracellular ROS content, which is

dependent on glucose metabolism.

Key-words: Pancreatic islets. Glucose metabolism. Redox state. Insulin secretion.

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1- INTRODUÇÃO

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Secreção de Insulina Induzida pela Glicose

O pâncreas endócrino é formado por grupamentos celulares denominados ilhotas

pancreáticas, as quais são compostas por pelo menos quatro diferentes tipos de células,

classificadas morfofuncionalmente em células alfa (α), beta (β), delta (δ) e PP. Essas células

são, sobretudo, responsáveis pela secreção de hormônios peptídicos, respectivamente:

glucagon, insulina, somatostatina e polipeptídio pancreático 1.

As ilhotas pancreáticas são constituídas em maior parte por células β, secretoras de

insulina, que é um hormônio polipeptídico constituído por duas cadeias de aminoácidos alfa e

beta, interligadas por duas pontes dissulfeto em resíduos de cisteína. Sua síntese ocorre a

partir da transcrição e tradução do gene da insulina, com a formação da pré-pró-insulina no

retículo endoplasmático. Posteriormente, pela remoção da sequência contendo 24 resíduos de

aminoácidos, forma-se a pré-insulina. No complexo de Golgi, esta é armazenada nos grânulos

de secreção, onde por clivagem forma o peptídio C e a insulina, sendo esta última a forma

com maior potencial biológico 2.

Na célula β a insulina é armazenada em grânulos que, através de exocitose deflagrada

por estímulos, liberam seu conteúdo para o meio extracelular. Devido a característica

hidrofílica e a ausência de transportadores de membrana para esse hormônio, a fusão desses

grânulos com a membrana e abertura do poro de extrusão é o único mecanismo para

transposição da membrana plasmática e consequente liberação da insulina. Cada célula β

contém aproximadamente entre 10.000 a 13.000 grânulos insulínicos, cada qual com um

diâmetro e conteúdo de moléculas de insulina de aproximadamente, 350 nm e 106 moléculas,

além de 50 outros polipeptídeos 2. O controle da extrusão dos grânulos de insulina é um

processo complexo determinado pela resultante entre diversos estímulos que atuam sobre as

ilhotas pancreáticas. Porém, apesar de ser modulada por diversos fatores, tais como outros

nutrientes, neurotransmissores e hormônios, a secreção da insulina pelas células β das ilhotas

pancreáticas tem como principal estímulo o aumento na concentração de glicose 3.

A elevação na concentração de glicose consequentemente aumenta o fluxo dessa

hexose para o interior das células β pancreáticas. A glicose permeia a membrana da célula β

através dos transportadores de glicose do tipo 1 e do tipo 2 (GLUT 1 e 2), os quais possuem

baixo e elevado Km, respectivamente 4, 5. No citosol, a glicose é inicialmente fosforilada

formando glicose-6-fosfato, principalmente pela atividade da enzima glicoquinase, a qual

também possui elevado Km. A presença de enzimas com elavado Km na metabolização da

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glicose permite que o fluxo de glicose para o interior da célula β pancreática e sua velocidade

de metabolização não se saturem, podendo assim, acompanhar as elevações na concentração

da glicose plasmática. A consequente metabolização da glicose-6-fosfato resulta no aumento

da produção de adenosina trifosfato (ATP), aumentando a razão entre ATP e adenosina

bifosfato (ADP). Carpinelli et al. (1980) 6 verificaram que a estimulação da secreção de

insulina está diretamente relacionada ao aumento desta razão, a qual é induzida pela

metabolização da D-glicose como inicialmente havia sido proposto por Malaisse et. al. (1979) 7 como a Hipótese de Regulação pelo Nutriente - The Fuel Hypothesis.

As células β são eletricamente excitáveis e mudanças no potencial de membrana

acompanham variações na concentração plasmática de glicose, inibindo ou estimulando a

secreção de insulina 8, 9. Este processo envolve o metabolismo da glicose, produção de ATP,

fechamento de canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP), despolarização de membrana

plasmática e a ocorrência de potenciais de ação. Assim, o aumento da razão ATP/ADP

promove o fechamento de KATP, impedindo o efluxo de K+ e resultando na retenção de cargas

positivas no interior celular. Esse acúmulo de cargas eleva o potencial de repouso da

membrana, diminuindo a polaridade da membrana plasmática 6, 9, 10. Essa redução na

diferença de potencial de membrana dispara potencias de ação através da abertura dos canais

para Ca2+ sensíveis à voltagem (CCSV ou do tipo - L), resultando no aumento da

concentração intracelular deste íon, e consequentemente na ativação da maquinaria secretória

da célula β e liberação de insulina 9, 11.

O processo de exocitose nas células β pancreática é dependente da elevação na

concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i), porém, as proteínas pertencentes a familia

SNARE (fator solúvel sensível a N-etilmaleimida) são elementos críticos para esse processo.

Entre as SNAREs encontram-se as t-SNAREs (proteínas de membrana plasmática) das quais

fazem parte a sintaxina 1 e a SNAP-25, e também as v-SNAREs (proteínas vesiculares) como

a sinaptobrevina/VAMP-2 2.

Como reportado em células β de camundongos, as t-SNARES sintaxina 1 e SNAP-25

agregam-se na membrana plasmática em aproximadamente 400 complexos, refletindo o

número de grânulos atracados à membrana e correlacionando-se com o número de CCSV por

célula β 2. A distribuição dos CCSVs na membrana celular colocaliza-se com os pontos de

atracamento e fusão de grânulos insulínicos à membrana plasmática 12. Dessa forma, as

alterações na concentração de [Ca2+]i ocorrem em domínios específicos de Ca2+ na membrana

plasmática 13, possivelmente, direcionando os eventos intracelulares decorrentes da

despolarização para a atividade secretória.

8

Assim, alterações na concentração intracelular de Ca2+ distantes das regiões de

microdomínios de Ca2+ podem não refletir a ativação e sustentabilidade da secreção de

insulina.

Apesar da clássica predominância da glicose sobre o mecanismo de secreção de

insulina, as células β apresentam ainda enzimas associadas à membrana plasmática que

auxiliam no processo secretório. Dentre essas enzimas, encontram-se isoformas da fosfolipase

C (PLC), fosfolipase A2 (PLA2), fosfolipase D e adenilato ciclase. Essas enzimas podem ser

ativadas pela ligação de hormonios a seus receptores de membrana, sendo as proteínas Gs ou

Gq a via de interação entre os receptores e as enzimas efetoras. A atividade dessas enzimas

resulta na formação de mensageiros intracelulares que modulam o processo de secreção de

insulina 4.

Nas células β, o metabolismo da glicose também ativa isoformas da PLC, PLA2 4 e

adenilato ciclase 14. A PLC hidrolisa fosfolipídios de membrana, resultando na formação de

diacilglicerol (DAG) e 1,4,5 inositol-trifosfato (IP3). O DAG promove a ativação da proteína

quinase C (PKC), a qual é dependente de Ca2+ e atuante na regulação da secreção da insulina.

O IP3, por sua vez atua no retículo endoplasmático desencadeando o efluxo de Ca2+, desse

estoque para o citoplasma, o que reforça o aumento intracelular de Ca2+ decorrente da

abertura dos CCSVs em resposta ao metabolismo da glicose 4, 15, 16.

A ativação da adenilato ciclase resulta no aumento intracelular de adenosina

monofosfato cíclico (AMPc), segundo mensageiro ativador da proteína quinase A (PKA), a

qual também contribui para a exocitose dos grânulos de insulina 14, 15.

Adicionalmente, tanto a PKA quanto a PKC aumentam a atividade dos CCSVs,

intensificando a entrada de Ca2+ a partir do meio extracelular. Além disso, ambas quinases

promovem a fosforilação e ativação de proteínas componentes do citoesqueleto que

participam da exocitose dos grânulos de insulina 15, 16.

Receptores acoplados a proteínas G são, por exemplo, utilizados por hormônios como

o peptídio semelhante ao glucagon (GLP-1). Esse hormônio, dentre outros, são chamados

incretinas, sendo secretados pelas células intestinais em resposta à ingestão de glicose. Na

célula β pancreática, através de seus receptores, as incretinas potencializam a secreção de

insulina induzida pela glicose. Dessa forma, a secreção e a ação das incretinas está

relacionada com a maior resposta secretória de insulina observada frente a uma carga oral de

glicose se comparada à sua infusão intravenosa 17.

9

1.2 Espécies Reativas de Oxigênio

O processo de quebra enzimática da molécula de glicose, glicólise, ocorre em diversas

etapas pouco dispendiosas energeticamente, gerando uma forma primária de energia através

do fornecimento de elétrons, os quais são abstraídos dos subprodutos formados durante o

metabolismo da glicose. Os elétrons abstraídos são transportados por carreados em sua forma

reduzida, o dinucleotídeo de nicotinamida-adenina reduzido (NADH) e o dinucleotídeo de

nicotinamida-adenina fosfato reduzido (NADPH). Esses carreadores reduzidos são

fundamentais para a produção de energia pela célula. Além disso, esses carreadores servem

ainda como substratos para demais processos celulares, como o controle do conteúdo das

espécies reativas de oxigênio, as quais têm sido recentemente prospostas como possíveis

atuantes na regulação da fisiologia da ilhota pancreática, bem como, participantes na

patogênese do diabetes 18, 19.

O oxigênio na atmosfera encontra-se 99 % sob sua forma molecular diatômica (O2), o

qual possui dois elétrons desemparelhados em sua camada de valência, podendo assim ser

caracterizado como um radical livre. Seus dois elétrons desemparelhados, por apresentarem o

mesmo valor de spin, ou seja, spins paralelos, limitam a velocidade de suas reações de

oxidação, conferindo ao oxigênio pouca reatividade e, por consequência, o estado mais

estável dessa molécula. Dessa forma, a redução do O2 ocorre em etapas gerando os

intermediários da redução do oxigênio 20. Por definição, a denominação radical livre refere-se

a qualquer elemento capaz de existir de forma independente e que possua um ou mais elétrons

desemparelhados em sua camada de valência. Essas espécies são usualmente representadas

por um ponto sobrescrito seguido do elemento atômico no qual ela está centrada (i.e. O2•).

Dessa forma, radicais livres podem ser naturalmente encontrandos nos sistemas biológicos,

gerados a partir da perda ou do ganho de elétrons 21.

Os produtos intermediários da redução do oxigênio, por sua constituição e reatividade,

são denominados espécies reativas de oxigênio (EROs). Esses intermediários reagem

quimicamente com outras biomoléculas, doando ou recebendo elétrons visando estabilidade

molecular. Categorizados como EROs encontram-se elementos centrados no átomo de

oxigênio tanto sob a forma radicalar, como não-radicalar. Porém, apesar dos elementos não-

radicalares não possuírem elétrons desemparelhados em camada de valência, ainda assim

apresentam alguma reatividade.

A reatividade entre esses elementos pode ser termodinamicamente determinada,

definindo sua possibilidade ou impossibilidade de ocorrência. Uma reação é naturalmente

favorável quando a alteração em sua energia livre é negativa. Esse fenômeno pode ser

10

classicamente observado durante reações entre elementos de alto potencial redutor com

elementos de alto potencial oxidante.

As espécies reativas de oxigênio abrangem uma diversidade de espécies químicas,

incluindo o radical ânion superóxido (O2•-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical

hidroxila (OH•). A redução da molécula de oxigênio pela incorporação de um elétron em sua

camada de valência resulta na formação do O2•-, caracterizada como etapa inicial na seqüência

de reações responsáveis pela formação das demais espécies reativas 22 (Figura 1). Por possuir

um elétron a mais do que sua carga de prótons, o superóxido é ânionico, elétricamente

carregado, o que limita sua difusão por membranas celulares.

Figura 1. Representação da distribuição eletrônica na molécula de oxigênio, no radical ânion

superóxido e no íon peróxido Distribuição dos elétrons (representados por setas ↑) nos orbitais ligantes e anti-ligantes (*) nos azimutes “s” e “p”, nas camadas energéticas da eletrosfera do oxigênio (O2), superóxido (O2

●-) e do íon peróxido (O22-), forma desprotonada do peróxido de hidrogênio.

Fonte: modificada de Halliwell e Gutteridge, 2007 21.

Essa etapa inicial, de formação de O2•-, pode ser resultante de diferentes sistemas

celulares, como a fosforilação oxidativa na cadeia respiratória mitocondrial, a auto-oxidação

da glicose, a oxidação das catecolaminas, a ativação da cascata do ácido araquidônico, ou

ainda por sistemas enzimáticos como xantina oxidase após isquemia e reperfusão,

monoxigenases citocromo P450, desacoplamento de lipoxigenases 23, 24 e uma importante

fonte descrita especialmente em fagócitos, a ativação da enzima NAD(P)H oxidase 25.

11

O ânion superóxido apresenta baixa reatividade e pode seguir diversos caminhos

metabólicos, sendo estes determinados pelo tipo e pelo estado celular. Dentre esses caminhos,

o O2•- pode reagir com óxido nítrico (NO•) resultando em peróxido nitrito (ONOO•), o qual é

muito mais reativo que seus precursores. Através da ação das enzimas superóxido-dismutase

mitocondrial (MnSOD), citoplasmática (CuZnSOD) e extracelular (EcSOD), o O2•- é

convertido em H2O2 25. Essa conversão pode ocorrer também por dismutação espontânea 23, 26.

A espécie reativa de nitrogênio, NO•, também é um radical livre formado pela conversão da

L-arginina em L-citrulina e NO•, através da ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Essa

espécie reativa atravessa a membrana plasmática e difunde-se com facilidade entre as células,

além de reagir rapidamente com demais radicais livres, em especial e de grande importância

fisiológica com o O2•- 27. Este fenômeno é classicamente descrito em células endoteliais, onde

o aumento na produção de O2•- está relacionado com a diminuição na concentração de NO•

livre e, consequentemente, na supressão do seu potencial vasodilatador 28.

Sistemas antioxidantes enzimáticos como catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) 29, tiorredoxina peroxidase (TPx), Glutarredoxina (GRx) e/ou pequenas moléculas, como

antioxidantes tióis, são responsáveis pela eliminação do H2O2, evitando assim sua conversão

em radical hidroxila, o qual é altamente reativo (Figura 2). A formação do OH• a partir do

H2O2 pode ocorrer pela oxidação de metais de transição em seu estado reduzido, como o

Fe(II), denominada reação de Fenton, resultando na fissão heterolítica do peróxido de

hidrogênio 23.

Inicialmente, os estudos sobre as espécies reativas de oxigênio focaram-se

principalmente sobre sua importante função antibactericida em células fagocitárias, como

macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e monócitos, visando a destruição de micro-organismos

invasores 30, bem como na promoção de ações deletérias em episódios fisiopatológicos 31.

Porém, essa visão tem sido modificada com a descoberta do papel de EROs em outras funções

celulares 31.

Alguns processos celulares estão submetidos à regulação por reações de óxido-redução

(redox) 32, além da ação direta de EROs como segundo mensageiros, contrapondo-se a um

papel deletério 26. Em ilhotas pancreáticas, apesar de possuirem sistemas específicos de

formação de EROs, foi reportado uma menor produção dessas espécies reativas em relação às

células do sistema imune 33, o que parece indicar um papel regulatório dessas espécies no

tecido em questão.

12

O H2O2 pode atuar como agente oxidante ou redutor de baixa reatividade, o que

suscita uma ação sinalizadora por essa espécie. Entretanto, o H2O2 é capaz de inativar

diretamente algumas enzimas por oxição de sítios tióis hiper-reativos, essenciais para a

atividade catalítica, como no caso da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase 34, 35.

A descrição da participação do H2O2 como segundo mensageiro intracelular, ocorreu

inicialmente na via de sinalização do fator de crescimento derivado de plaquetas, pelo

aumento da fosforilação em resíduos de tirosina de importantes proteínas, p42 e p44 MAP

quinase 36. Posteriormente, a participação do H2O2 foi reportada na via de sinalização do fator

de crescimento epidérmico (EGF), aumentando a fosforilação em tirosina do receptor de EGF

e fosfolipase Cγ1 36, 37. A regulação de funções protéicas por elementos redutores ou

oxidantes é semelhante e pode ter caminhos análogos à regulação por fosforilação. Contudo,

os elementos suceptíveis a essa regulação redox são aqueles que possuem aminoácidos alvo

sensíveis ao estado redox celular, como cisteína e histidina, ao invés de aminoácidos alvo

suceptíveis à fosforilação 31.

Devido às diferenças químicas entre essas espécies reativas, cada uma possue alvos

redox específicos para a tansmissão do sinal de óxido-redução. O NO• liga-se, sobretudo a

grupamentos heme para modulação da atividade de uma grande classe de enzimas. O O2•-

reage com grupamentos ferro-enxofre alterando a atividade de proteínas chave nos processos

celulares, enquanto o H2O2 modifica proteínas principalmente através da oxidação de

grupamentos tióis, favoráveis em sua forma desprotonada, tiolato 38.

Tióis, sítios sulfidrila (SH), são importantes alvos biológicos para oxidação, sendo

parte essencial de sistemas antioxidantes, de elementos críticos para a atividade de enzimas,

de fatores de transcrição e de proteínas regulatórias 39. Assim, a oxidação de proteínas pode

constituir uma via de sinalização celular, onde a alteração para um ambiente oxidativo leva a

rápida modificação de grupamentos sulfidrila para ácido sulfênico ou radical centrado no

átomo de enxofre, tiíl. Proteínas parcialmente oxidadas podem se conjugar com a glutationa,

formando proteínas S-glutationiladas. Embora a S-glutationilação iniba a atividade de

algumas proteínas contendo tióis, ela garante a reversibilidade da oxidação, impedindo a

oxidação e inativação irreversível. Pois, oxidação do ácido sulfênico e formação de ácido

sulfínico e sulfônico pode inativar irreversívelmente e levar à degradação protéica 39.

Sob esses aspectos, o direcionamento das ações dos intermediários reativos do

oxigênio é determinado pelo estado redox celular, montante das reações de óxido-redução, o

qual, sob a óptica das espécies reativas de oxigênio, é mantido pela resultante entre a

produção e eliminação de EROs 29. Dessa forma, a manutenção do equilíbrio redox pode

13

atribuir a esses intermediários um papel regulatório dos processos celulares 31, contrário às

ações patológicas desencadeadas pelo desequilíbrio crônico e descontrolado entre produção e

remoção, com predominância na produção, denominado estresse oxidativo 23.

Figura 2. Representação dos possíveis direcionamentos das espécies reativas de oxigênio

Esquematização hipotética das possibilidades de eliminação, reação e conversão das espécies reativas de oxigênio. Sistemas geradores: NAD(P)H oxidase; ETC - cadeia de transporte de elétrons; NOS - óxido nítrico sintase. Elementos reativos: O2

•- - radical ânion superóxido; H2O2 - peróxido de hidrogênio; OH• - radical hidroxila; NO• - óxido nítrico; ONOO• - peróxido nitrito; HO2

• - hidroperoxil (forma protonada do superóxido). Eliminadores: SOD - superóxido dismutase; GPx - glutationa peroxidase; GSH - glutationa reduzida; GR - glutationa redutase; TPx - tiorredoxina peroxidase; Trx - tiorredoxina; TR - tiorredoxina redutase; GRx - glutaredoxina; CAT - catalase; NADPH - dinucleotídeo de nicotinamida-adenina fosfato reduzida.

1.3 Sistemas Antioxidantes

A produção de espécies reativas de oxigênio apresenta características distintas de

acordo com o estado celular e a funcionalidade dessas espécies nas células em questão.

Apesar da possibilidade de ações deletérias por parte dos elementos reativos gerados no

interior celular como produtos das reações biológicas, organismos aeróbios desenvolveram

mecanismos sofisticados de detecção e eliminação de EROs, assegurando assim a manutenção

NAD(P)H oxidase

O2•- H2O2 OH•

EXTRACELULAR

NO•

ONOO-

- GPx - GSH - GR - TPx - Trx - TR - GRx - CAT - NADPH

H2O

ETC

NOS

HO2•

SOD

14

de um estado de controle sobre os níveis desses elementos 21, denominado Homeostase

Redox.

Para garantir a Homeostase Redox e proteger contra a citotoxicidade promovida por

EROs, há inúmeras proteínas antioxidantes que atuam no controle dos níveis de EROs e no

reparo de componentes celulares oxidados 40.

Esses sistemas protetores podem ser enzimáticos como, superóxido dismutase (SOD),

catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), tiorredoxina peroxidase (TRx), glutarredoxina

(GRx) e não enzimáticos, como vitamina C e E, glutationa reduzida (GSH), tioredoxina

reduzida (Trx) 41 (Figura 2), e quelantes de metais 42, atuando na manutenção do equilíbrio

redox.

As enzimas CAT, GPx, TPx e GRx atuam na decomposição de H2O2. A catalase

possui elevado KM e catalisa diretamente a decomposição de duas moléculas de peróxido de

hidrogênio em duas moléculas de água e uma de oxigênio, em duas reações. A atividade da

catalase é dificilmente saturada, devido à elevada velocidade máxima de destruição do H2O2,

apresentando constantes de reações de 1,7 x 107 M-1 s-1 e 2,6 x 107 M-1 s-1, para k1 e k2

respectivamente (reação abaixo representada). Durante a reação com o H2O2, forma-se o

componente I, no qual o Fe(III) da catalase é convertido em Fe(IV)O. A equação abaixo

mostra que a remoção completa do H2O2 requer a reação de duas moléculas de H2O2 com uma

única molécula de catalase, o que se torna menos provável com a queda nos nível de H2O2,

refletindo assim uma diminuição de sua atividade em paralelo à queda nos níveis do seu

substrato 21.

Reação da catalase: k1

Catalase-Fe(III) + H2O2 Componente I + H2O k2

Componente I + H2O2 Catalase Fe(III) + H2O + O2 ____________________________________________________

2 H2O2 2 H2O + O2

Nos animais, a catalase é formada por quatro subunidades protéicas, cada qual

contendo um grupamento heme, e a forma ativa da catalase é mantida em um processo

dependente de NADPH 43.

Diferente da catalase, peroxidases removem H2O2 através da oxidação de outros

substratos. A glutationa peroxidase acopla a redução do H2O2 à custa da oxidação de GSH,

um tripeptídio que contém um grupamento tiól. Essa reação resulta na formação de água e na

15

oxidação de duas moléculas de glutationa, que se conjugam entre si por uma ponte dissulfeto,

formando GS-SG (GSSG)44.

O conteúdo intracelular de GSH é determinado pela taxa de influxo e síntese menos a

taxa de efluxo e conjugação. A formação de GSH ocorre intracelularmente em sequências

dependentes de ATP, catalisadas pela enzima γ-glutamilcisteína sintetase e GSH sintetase, ou

redução de glutationa oxidada pela glutationa redutase 45, processo dependente de NADPH 46.

A enzima γ-glutamilcisteína sintetase é responsável pela formação do dipeptídio glutamato-

cisteína, o qual, posteriomente, sofre ação da enzima GSH sintetase concluindo a síntese do

tripeptídio GSH pela inserção do aminoácido glicina. O aminoácido cisteína, portador do sítio

tiól, pode normalmente ser obtido a partir do fluido extracelular pelo transporte da própria

cisteína e/ou transporte e redução da cistina, forma oxidada da cisteína 45.

A glutationa reduzida é uma importante molécula antioxidante que pode ser

rapidamente sintetizada em duas etapas enzimáticas, podendo ainda apresentar um turnover

elevado em alguns tecidos. Esse tripeptídio participa na sinalização intracelular, eliminando

pontes dissulfeto em receptores de membrana, fatores de transcrição e proteínas regulatórias 45.

Outra importante molécula antioxidante é a tiorredoxina (Trx), uma proteína redox-

ativa com baixo peso molecular (12kD) e um sítio ativo conservado contendo dois resíduos de

cisteína adjacentes. Após oxidação, os resíduos de cisteína ligam-se entre si por uma ponte

dissulfeto. A restauração do estado reduzido da Trx se dá pela seleno-flavoproteína

dependente de NADPH, tiorredoxina redutase (TR) 45, 47.

Trx é uma das proteínas essenciais para síntese e reparo do DNA, sendo sua síntese

induzida por vários tipos de estresse, como infecção, insultos isquêmicos e H2O2. A Trx atua

como scavenger de intermediários reativos de oxigênio e repara proteínas oxidadas por esses

intermediários 47, além de regular fatores de transcrição envolvidos na sinalização intracelular

de combate ao estresse oxidativo e apoptose 48.

In vivo, o efeito positivo da TRx foi reportado em animais transgênicos super-

expressando Trx, a qual previniu a incidência do diabetes, induzido tanto geneticamente,

quanto por estreptozotocina 47.

Semelhante à TRx, glutarredoxina também atua como um redutor ditiól, envolvida na

sinalização e no direcionamento de funções celulares, bem como, na defesa contra danos

oxidativos. A manutenção do estado reduzido da GRx se dá por um sistema, no qual os

elétrons são provenientes do NADPH, transferidos pela GR para a GSH e posteriormente para

a GRx. A glutarredoxina cataliza tanto a redução ditiól, quanto monotiól em cisteínas

16

oxidadas. Na redução ditiól o processo ocorre em etapas, onde a císteina N-terminal do sítio

ativo da GRx inicia uma reação sobre um dos átomos exofre da ponte dissulfeto da proteína

oxidada. Isso resulta na formação de uma ponte dissulfeto entre a GRx e a proteína alvo,

estabilizando esses elementos. A cisteína C-terminal do sítio ativo da GRx reduz a outra

cisteína da proteína alvo, e se desprotona, reagindo em seguida com a cisteína N-terminal da

GRx formando uma ponte dissulfeto entre as duas cisteínas da GRx e restaurando o estado

reduzido das duas cisteínas na proteína alvo 49. Em reduções monotióis, GRx utiliza apenas a

císteína N-terminal do seu sítio ativo, a qual apresenta baixo pKa. O mesmo ocorre durante a

redução de pontes dissufeto de proteínas glutationiladas, nesse processo a GRx

especificamente interage com o domínio GSH da ligação dissulfeto alvo, devido a afinidade

da GRx pelo GSH. O que resulta na formação da GRx-SG e restauração do estado reduzido da

cisteína na proteína alvo. A glutarredoxina é posteriormente reduzida pelo GSH, fomando

GSSG, que é restaurado pela GR 49.

A glutationilação de tióis de proteínas, incluindo chaperonas, proteínas de

citoesqueleto e enzimas metabólicas, tem sido proposta como um importante mecansimo de

regulação dos processos biológicos pela modificação reversível dessas proteínas em resposta

às alterações no estado redox intracelular 49.

Os aminoácidos cisteína e metionina são facilmente oxidados sob situações de

aumento no estado oxidativo, porém cisteínas podem ser regeneradas por vias enzimáticas

(NADPH-dependentes) e não enzimáticas (GSH), enquanto para redução de metionina

oxidada (MetO) é necessária a atuação da enzima metionina sulfóxido redutase (Msr) 50. A

redução de resíduos MetO para metionina em proteínas oxidadas, por ação da Msr, é uma

reação dependente de tiorredoxina 51. Esses sistemas podem ser analisados como um

processo de eliminação de EROs, por tamponamento, determinado pela oxidação inicial de

aminoácidos cisteína e metionina e posterior restauro de seu estado reduzido 50.

1.4 Produção e Controle de EROs pela Mitocôndria

Na mitocôndria a cadeia respiratória direciona a energia proveniente de substratos

reduzidos (NADH e FADH2), para o processo de fosforilação oxidativa (FosfOx) do ADP em

ATP. Os substratos reduzidos doam energia na forma de elétrons aos complexos I e II, que os

transferem para o complexo III através da coenzima Q, e subsequentemente ao complexo IV,

o qual, por fim, é responsável pela transferência dos elétrons para o oxigênio formando

moléculas de água 52, 53.

17

Na cadeia de transporte de elétrons o NADH é oxidado à NAD+ pela NADH coenzima

Q redutase ou complexo I, onde dois elétrons são liberados e transferidos para a coenzima Q

(ubiquinona). O complexo II, após a oxidação de FADH2 em FAD, também transfere seus

elétrons para a coenzima Q. A redução parcial por um elétron da ubiquinona resulta na

formação da ubisemiquinona a qual, após ser reduzida por mais um elétron, resulta no

ubiquinol, forma completamente reduzida da coenzima Q 21, 52. Posteriormente, os elétrons

são transferidos para o complexo coezima Q-citocromo c redutase, ou complexo III. Este

complexo por sua vez reduz o citocromo c, proteína pequena móvel associada ao lado

citoplasmático da membrana mitocondrial interna. Finalmente, o citocromo c é re-oxidado

pelo complexo multienzimático citocromo c oxidase ou complexo IV. Esse complexo remove

um elétron do Fe2+ de cada um dos quatro citocromo c reduzidos pelo complexo III,

oxidando-os para citocromo c férrico (Fe3+). Posteriormente, os quatro elétrons são

transferidos para o O2 formando H2O, como representado 21.

O2+4H++4e- → 2H2O

Devido à impossibilidade de transferir quatro elétrons de uma única vez para o

oxigênio, esse processo de redução tem que ser realizado em etapas. Considerando a

reatividade das espécies de oxigênio parcialmente reduzidas, no complexo IV deve haver uma

ligação suficientemente forte com o oxigênio e seus intermediários reduzidos até sua

completa conversão à água, o que se torna possível devido à elevada afinidade do complexo

IV pelo oxigênio 21.

Utilizando a energia proveniente do carreamento eletrônico, os complexos da cadeia

de transporte de elétrons transportam prótons da matriz para o espaço intermembrana

mitocondrial, criando um gradiente eletroquímico de prótons e consequentemente um

aumento na diferença de potencial na membrana mitocondrial interna (∆ψ).

O gradiente de prótons é a força necessária para a FosfOx pela ATP sintase (complexo

V). O complexo V acopla a energia eletroquímica à ligação do ADP com fosfato inorgânico

(Pi), formando ATP. A baixa condutância da membrana mitocondrial interna ao influxo de

próton é condição fundamental para garantir o importante influxo de próton através do

complexo V e consequentemente, o acoplamento entre o processo de respiração mitocondrial

e a síntese do ATP. Entretanto, a condutância da membrana interna mitocondrial ao influxo de

prótons pode variar, em resposta ao aumento do ∆ψ. Da mesma forma que, o aumento na

condutância devido a expressão de proteínas desacopladoras (UCPs), que permitem a

passagem de prótons do espaço intermembrana para a matriz mitocondrial, alteraram o ∆ψ 19.

18

UCPs são proteínas de aproximadamente 32 kDa, membros de uma família de carreadores

mitocondriais de ânions 53. A familia das proteínas desacopladoras é caracterizada por 5 UCPs

homólogas (UCP1 - UCP5), sendo a UCP2 tecidualmente mais distribuída, porém, suas

funções fisiológicas ainda não estão totalmente esclarecidas 52.

Em condições com diminuida FosfOx e sustentado consumo de oxigênio, a força

próton motriz é elevada devido a uma sobrecarga no gradiente eletroquímico. O elevado

potencial de membrana aumenta a permanência da coenzima Q em seu estado reduzido,

aumentando a probabilidade de redução por um elétron da molécula de oxigênio e formação

de superóxido 53.

Dessa forma, o elevado gradiente eletroquímico parece aumentar a resistência ao

bombeamento de prótons, prejudicando a cadeia de transporte de elétrons e favorecendo a

formação de superóxido. Por outro lado, a atividade das UCPs diminuem a formação de EROs

devido a diminuição no ∆ψ. Porém, diminuem também a síntese de ATP por desviar o influxo

de prótons da ATP sintase 52. Assim, a UCP2 tem um papel importante na célula β

pancreática, refletindo-se em aterações na funcionalidade e na sobrevivência dessas células,

por controlar a produção de ATP e de EROs pela mitocôndria. Ademais, esta proteína tem

sido proposta como um mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo causado pela

mitocôndria 52, 54.

Estudos recentes confirmaram a regulação da atividade da UCP por EROs, embora o

caminho exato pelo qual essas espécies ativem a UCP2 permaneça desconhecido. Entretanto,

esta ativação poderia ser mediada diretamente pelo radical ânion superóxido ou, como

recentemente proposto, pelo 4-hidroxinonenal (HNE), um produto de peroxidação lipídica 55.

Assim, a hiperglicemia crônica poderia prejudica a funcionalidade de célula β pancreática

através da indução na atividade da UCP2 pelo superóxido, reduzindo o potencial de

membrana, a produção de ATP e, consequentemente, a secreção de insulina estimulada pela

glicose (GSIS).

Ilhotas pancreáticas de camundongos knockout para a UCP2 mantêm a GSIS após

hiperglicemia crônica. Do mesmo modo, a remoção do superóxido endógeno previne a perda

da GSIS induzida pela hiperglicemia em camundongos controle, mas não tem efeito sobre

ilhotas pancreáticas com deficiência para UCP2 52. Esses aspectos indicam que a relação

superóxido-UCP2 resulta em prejuízo na secreção de insulina pelas células β pancreáticas.

Em contra-partida, o real efeito da relação superóxido-UCP2 sobre a proteção da célula B

contra espécies reativas ainda é incerto. Porém, a redução na secreção de insulina pela

ativação da UCP2 pode refletir a ativação de um mecanismo protetor que, através da

19

diminuição do ∆ψ, reduz a produção de superóxido para garantir a proteção contra danos

oxidativos. Dessa forma, parece haver uma inter-relação entre o controle na produção

mitocondrial de EROs pela UCP, e o controle na atividade da UCP por EROs.

Outra importante proteína localizada na membrana interna mitocondrial que contribui

para a redução no conteúdo de EROs é a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (NNT),

uma proteína mitocondrial transcrita no núcleo, envolvida na detoxificação de espécies

reativas de oxigênio.

Camundongos knockout para o gene da NNT apresentam intolerância à glicose e

redução na estimulação da secreção de insulina pela glicose. Esse defeito fenotípico foi

revertido através da expressão do gene selvagem da NNT nesses animais. A nicotinamida

nucleotídeo transhidrogenase atua como uma transferidora de elétrons que catalisa a redução

do NADP+ atavés do NADH, formando NADPH e NAD+. Em condições fisiológicas a NNT é

um eficiente gerador intramitocondrial de NADPH. Dessa forma, a NNT participa no controle

do conteúdo mitocondrial de EROs, o que impediria o aumento na atividade da UCP2 por

EROs e consequente redução na secreção de insulina estimulada pela glicose 56.

A mitocôndria apresenta ainda outros mecanismos antioxidantes, como a isoforma da

enzima superóxido dismutase (MnSOD), isoforma da GPx 57, 58 e outras enzimas dependentes

de tióis para detoxificação de H2O2, como glutarredoxina 59. Dessa forma, parece haver um

controle local de conteúdo de EROs na mitocôndria o que sugere esta organela como um

microambiente redox finamente regulado.

Fisiológicamente, alterações na produção de EROs pela mitocôndria, em resposta as

alterações glicêmicas parecem não interferir sobre os mecanismos extramitocondriais de

controle da secreção de insulina. Pois, considerando que, a ausência de UCP2 esteja associada

à perda da via de controle UCP2-EROs, mesmo assim, ilhotas isoladas de camundongos

knockout para a UCP2 apresentaram um aumento da secreção de insulina frente a qualquer

concentração de glicose 54. Assim, esse fenômeno parece indicar que a formação de EROs

pela mitocôndria pode estar implicada com a própria função mitocondrial, regulando a

atividade de componentes como UCPs, e assim o acoplamento do metabolismo energético e a

produção de ATP. Enquanto fontes extramitocondriais de EROs como a NAD(P)H oxidase,

poderiam estar associadas às alterações na sinalização intracelular e modular a secreção de

insulina por atuar em vias distais à mitocôndria 19.

20

1.5 Produção de EROs pela Enzima NAD(P)H oxidase

A descrição clássica da enzima NAD(P)H oxidase, de sua estrutura e funcionamento,

ocorreu primeiramente para a isoforma NOX2. Como descrito por Babior et. al. (2002),60a

NAD(P)H oxidase é uma enzima heteromultimérica formada por quatro componentes

essenciais para sua ativação. Um deles, uma proteína flavocitocromo b558, constituída pelos

componentes gp91PHOX (isoforma NOX2) e p22PHOX, está ligado à membrana plasmática. Os

demais componentes são citosólicos (p47PHOX, p67PHOX, p40PHOX e uma proteína de baixo

peso molecular Rho GTPase: Rac1 ou Rac2) e translocam-se para a membrana após ativação,

a qual ocorre pela fosforilação da p47PHOX em diversos resíduos de serina, sendo os resíduos

S303, S304, S358 e S370 essenciais para o recrutamento. A interação dos componetes

citosólicos com o citocromo b558 é mediada pela subunidade p22PHOX, a qual ancora esses

componentes e possibilita a ativação da NOX2 pela p67PHOX 61. Após ser ativada, a enzima

catalisa a produção do ânion superóxido a partir da redução do oxigênio, tendo o NAD(P)H

como doador de elétrons (Figura 3).

Figura 3. Representação da isoforma NOX2 da enzima NAD(P)H oxidase Esquematização da transferência de elétron (e-), formação de superóxido (O2

●-) e das subunidades protéicas que compõem a isoforma NOX2 da enzima NAD(P)H oxidase. Fonte: modificada de Newsholme et al., 2009 62.

A enzima NAD(P)H oxidase apresenta ainda outras isoformas, como os homólogos 1

e 4, denominados NOX1 e NOX4, respectivamente. Todos os membros NOX da família da

21

NAD(P)H oxidase são proteínas transmembranas que transportam elétrons através de

membranas biológicas, formando superóxido pela redução do oxigênio 63.

Semelhante à NOX2, a isoforma NOX1 gera superóxido dependente de sua ativação

por componentes citosólicos que, no caso dessa isoforma, são as subunidades citosólicas

NOXO1 (NOX Organizador, correspondente ao p47PHOX) e NOXA1 (NOX Ativador,

correspondente ao p67PHOX). Embora a ativação da NOX1 pelos componentes citosólicos

requeira a proteína p22PHOX 64, sua dependência é menor do que a observada para NOX2 63.

A isoforma NOX4 apresenta a mais distante similaridade com a NOX2, apenas 39%

de homologia, bem como uma localização primariamente observada no retículo

endoplasmático. Essa baixa homologia confere a independência dos componentes citosólicos,

porém dependência da p22PHOX, para a atividade da NOX4, que poderia estar

constituivamente ativa mesmo na ausência de estímulo 63, 64. Interessantemente, durante a

indução da expressão da NOX4, um aumento na produção de peróxido de hidrogênio, e não

de superóxido, foi detectado no meio extracelular 64. Porém, esse fenômeno não pode ser

assumido como uma prova da produção direta de H2O2 pelo NOX4 pois, devido a sua

localização em organela, o superóxido liberado pelo NOX4 no lúmen da organela poderia

rapidamente ser dismutado a peróxido de hidrogênio, o qual é capaz de se difundir por entre

membranas e alcançar o espaço extracelular 63.

A forma aniônica do superóxido limita sua difusão por membranas plasmáticas. O

superóxido em solução dismuta espontâneamente para H2O2 com uma taxa de 105 M-1s-1 em

pH 7, podendo esta constante ser aumentada em até 4 vezes pela ação de enzimas superóxido

dismutases. Assim, como sua meia vida, a distância de difusão do superóxido não é longa 38.

Considerando o tempo de vida das espécies reativas de oxigênio, suas ações e participação

como moléculas sinalizadoras são provavelmente dependentes do local de sua produção, o

que poderia indicar a NAD(P)H oxidase como uma fonte de EROs com uma área de atuação

no citoplasma e na membrana plasmática. Em células não fagocíticas a enzima NAD(P)H

oxidase libera superóxido para o meio extracelular, assim a ação intracelular dessas espécies é

dependente da difusão do superóxido através de canais de Cl- (ClC-3) ou pela dismutação do

superóxido, pela SOD extracelular, a H2O2 e difusão deste para o interior celular mediado por

aquaporinas 38.

O complexo enzimático NAD(P)H oxidase, similar ao encontrado em fagócitos, foi

descrito por Oliveira et al. (2003) 33 em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos. Os autores

mostraram que a enzima é responsável pelo aumento na produção de O2•- quando as ilhotas

são estimuladas pela glicose, tendo a PKC como reguladora através da fosforilação da p47phox

22

19, 33. O RNAm dos homólogos NOX1, NOX4, NOXO1 e NOXA1 também foram

identificados em ilhotas pancreáticas de ratos 65. Apesar da incerteza do papel dessa enzima

em células não fagocíticas, a atividade da NAD(P)H oxidase em situações fisiológicas pode

contribuir para a funcionalidade celular 19, por sua participação no controle de pH intracelular,

na facilitação do metabolismo da glicose devido à liberação de NAD+ e também pelo

suprimento de EROs 63.

Entretanto, a NAD(P)H oxidase pode também estar implicada ou ser modificada

durante a gênese de algumas patologias. Níveis aumentados de mRNA para o componente

p22PHOX foi reportado em ilhotas pancreáticas isoladas de pacientes diabéticos do tipo 2.

Porém, os níveis de p22PHOX foram revertidos paralelamente à melhora na sobrevivência e

funcionalidade das ilhotas pancreáticas devido ao tratamento com metformina 66. Esse

resultado foi o primeiro a relacionar experimentalmente, uma possível implicação da

NAD(P)H oxidase com o processo de disfunção da célula β pancreática humana, o qual

poderia estar relacionado com alterações na atividade desta enzima.

1.6 NAD(P)H oxidase, Espécies Reativas de Oxigênio e Sinalização: uma primeira

hipótese em ilhotas pancreáticas

A primeira hipótese por nós formulada sobre a possível ação de sinalização de EROs

em ilhotas pancreáticas foi estabelecida a partir dos dados da literatura discutidos abaixo, os

quais conjecturam a possibilidade de controle da funcionalidade da célula β pancreática por

EROs, através da ativação da enzima NAD(P)H oxidase.

O receptor de insulina (IR) e seus principais substratos (IRS-1 e IRS-2) os quais, após

serem fosforilados, associam-se ao fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K), estão presentes nas

células β das ilhotas pancreáticas, possibilitando um mecanismo autócrino e parácrino de ação

da insulina. Porém, há ainda controvérsias sobre o real efeito desse mecanismo autócrino e

parácrino. No entanto, foi sugerido que a inibição da atividade tirosina quinase do IR, nas

ilhotas pancreáticas, esteja relacionada com um considerável aumento na secreção da insulina 67. Posteriormente, foi observado um efeito inibitório da insulina sobre sua própria secreção

através da fosforilação de seu receptor, sendo este efeito mediado pela PI3-K, a qual promove

a abertura dos canais para K+ sensíveis ao ATP e subsequente hiperpolarização da membrana

celular 68. Esse sistema de feedback negativo foi evidenciado em ilhotas pancreáticas de

camundongos, pela amplificação da secreção de insulina frente à inibição da PI3-K em meio

contendo alta concentração de glicose 69. A ativação desse fenômeno pode ocorrer através da

23

fosforilação do IRS-2 pois, como demonstrado por Kubota et. al. (2000) 70, ilhotas de

camundongo com knockout do gene codificador do IRS-2 apresentaram aumento na resposta

secretória da insulina induzida pela glicose.

Paralelo a essas evidências, Mahadev et. al. (2001) 71, demonstraram que em

adipócitos 3T3-L1 e células hepáticas, a insulina estimula a formação de peróxido de

hidrogênio, promovendo inibição de proteínas fosfatases de tirosina (PTPs), especificamente a

PTP-1B, a qual apresenta grande afinidade pelo IR e seus substratos. Dessa forma, nessas

células, o aumento da formação de H2O2 facilitaria a propagação do sinal insulínico.

Posteriormente, os mesmos autores mostraram que o aumento na produção de H2O2 induzido

pela insulina em adipócitos foi devido à ativação da enzima NAD(P)H oxidase 72.

Respectivamente, Nakazaki et al. (1995) 73 verificaram inibição transiente da secreção

de insulina resultante da exposição de ilhotas pancreáticas de ratos ao H2O2. Semelhante ao

efeito descrito para a insulina, a inibição provocada pelo H2O2 foi também mediada pelo

aumento na probabilidade de abertura dos canais para K+ sensíveis ao ATP. Para este

fenômeno, foi sugerida uma ação indireta por via da inibição da glicólise e ou da fosforilação

oxidativa, resultando na redução da concentração intracelular de ATP.

Sob esses aspectos, criou-se a hipotese na qual a ação autócrina do hormônio, poderia

promover a hiperpolarização da membrana plasmática em células β pancreáticas, devido ao

aumento na concentração intracelular de H2O2 gerado pela ativação da enzima NAD(P)H

oxidase. Considerando o efeito bloqueador do H2O2 sobre o metabolismo celular, a

hiperpolarização causada pela insulina poderia ser um reflexo de uma relação entre insulina-

NAD(P)H oxidase-EROs-metabolismo.

A conexão entre esses dados da literatura foi a nossa primeira hipótese e indício acerca

da modulação endógena de EROs sobre a função de célula β e o envolvimento da enzima

NAD(P)H oxidase nesse processo.

1.7 Metabolismo, Estresse Oxidativo e Diabetes

Apesar do metabolismo de nutrientes ser um mecanismo essencial para a secreção de

insulina, a exposição crônica a elevados níveis glicêmicos, hiperglicemia, resulta na disfunção

e morte de células β pancreáticas. Embora ainda não se conheça o mecanismo exato da

toxicidade pela glicose, alguns aspectos têm sido apontados como importantes colaboradores.

Os efeitos deletérios da toxicidade pela glicose, glicotoxicidade, foram inicialmente

atribuídos à excessiva atividade da célula β, causando sua exaustão, perda de sua função e

24

consequentemente sua morte. Atualmente, os danos pela glicotoxicidade têm sido atribuídos a

um desvio no direcionamento metabólico da glicose associado à formação excessiva de

espécies reativas de oxigênio. Durante esses quadro de toxicidade, a formação excessiva de

EROs resulta em estresse causado pela alta taxa de oxidação, denominado estresse oxidativo,

o qual está relacionado com a perda de funcionalidade das células β pancreáticas 19.

A elevação sustentada na concentração de glicose aumenta o fluxo de glicose para a

via do poliol. Essa via é iniciada pela conversão enzimática da glicose às custas do consumo

dos antioxidantes NADPH ao poliálcool sorbitol, o qual, após ser metabolizado a frutose pela

sorbitol desidrogenase, aumentando a razão NADH/NAD+, é convertido a frutose-6-fosfato 74.

A via da hexosamina é um dos caminhos adicionais no metabolismo da glicose que pode

mediar efeitos tóxicos, iniciada pela conversão da frutose-6-fosfato a glicosamina-6-fosfato,

resulta na formação da UDP-N-acetilglicosamina, substrato de glicosilação de importantes

fatores de transcrição 53.

Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) também caracterizam um importante

mecanismo envolvido na complicação microvascular no Diabetes 53. A formação intracelular

dos precursores da glicação reduz a integridade da célula alvo por modificação em funções

protéicas ou pela ativação dos receptores de AGE, que estimulam a produção de EROs 75.

AGEs podem ser formados pela reação da glicose com grupamentos amino, formando um

aducto referido como base de Schiff. Essa reação ocorre na terminação aldeído do açúcar,

pela substituição da dupla ligação com o oxigênio pelo nitrogênio da amina. O rearranjo da

base de Schiff resulta na formação do produto de Amadori, o qual se acumula em proteínas,

iniciando o processo de glicação avançada 76.

Os AGEs podem ainda ser formados pela autoxidação da glicose a glioxal,

decomposição do produto de Amadori a 3-deoxiglucosona e significativamente pela

fragmentação do gliceraldeído-3-fosfato e diidroxiacetona-fosfato a metilglioxal. Glioxal, 3-

deoxiglucosona e metilglioxal são compostos dicarbonílicos reativos que interagem com os

grupamentos amino de proteínas intracelulares e extracelulares, formando os AGEs 53. Além

desses fatores, a formação excessiva de diidroxiacetona-fosfato e sua oxidação promovem o

aumento na síntese de novo de diacilglicerol (DAG), e consequente elevação na atividade da

PKC 74.

Em ilhotas pancreáticas, o aumento na atividade da PKC contribui para a elevação na

produção de superóxido pelo aumento na atividade da enzima NAD(P)H oxidase (15). Esse

mecanismo pode gerar um desbalanço no equilibrio redox intracelular e consequente inibição

de processos celulares. Dentre esses, há o bloqueio do metabolismo da glicose pela oxidação

25

do grupamento tiól da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PD), sítio

responsável pela ligação ao gliceraldeído-3-fosfato 77.

O bloqueio no metabolismo da glicose aumenta o acúmulo dos componentes

anteriores ao gliceraldeído-3-fosfato, o que é agravado pela não inibição da glicoquinase 78

com contínua entrada e fosforilação da glicose na célula. Esse acúmulo acentua o

direcionamento das cadeias carbônicas para as vias do poliol, da hexosamina, AGEs e DAG,

que consequentemente induzem a formação de EROs, caracterizando um ciclo deletério.

Apesar de a disfunção metabólica ser apontada como possível responsável pela

glicotoxicidade, fisiologicamente as células β pancreáticas saudáveis respondem de modo

apropriado às variações glicêmicas, com uma taxa adequada de secreção de insulina. O

piruvato derivado da glicose é eficientemente transportado para a mitocôndria, onde os

carbonos provenientes da glicose são prioritariamente oxidados a CO2. Sob estes aspectos, o

bloqueio no metabolismo e a excessiva formação de radicais de oxigênio, fatores

estabelecidos como mediadores dos danos hiperglicêmicos no diabetes, podem ser resultados

de defeitos genéticos e ou de condições metabólicas adversas como a dislipidemia. Pois, como

demonstrado, em ratos com pancreatectomia de 90%, não houve alteração na incidência de

apoptose, apesar da elevada glicemia 79.

Dessa maneira, o bloqueio na formação de piruvato e o direcionamento do

metabolismo para a via do poliol, hexosamina, AGEs e DAG não está unicamente associado

ao aumento na concentração de glicose, mas sim a disfunções genéticas ou ambientais

combinadas à hiperglicemia. Assim, a morte de célula β por hiperglicemia parece resultar de

uma taxa inadequada de metabolismo da glicose, ao invés de uma taxa elevada 80.

Apesar dos danos gerados na hiperglicemia crônica, agudamente o efeito do aumento

na concentração de glicose sobre o conteúdo intracelular das espécies reativas de oxigênio, e

em particular do peróxido de hidrogênio, em ilhotas pancreáticas permanece contraditório.

Considerando os aspectos supressores do H2O2 sobre a fisiologia da ilhota pancreática, o

aumento na atividade da célula β pela glicose pode requerer ajustes metabólicos e

consequentemente no conteúdo intracelular de H2O2 para a manutenção da homeostase redox.

1.8 Estado Redox e Funcionalidade de Ilhotas Pancreáticas

Células β pancreáticas estão continuamente expostas às variações glicemicas,

respondendo às mesmas com uma taxa adequada de secreção de insulina. Desse modo, apesar

26

da ocorrência de episódios hiperglicêmicos, a homeostase redox é mantida em condições

fisiológicas.

O mecanismo de secreção de insulina dependente de KATP, ou triggering pathway,

constitui o mecanismo principal de sinalização para GSIS. Esta via é ativada por nutrientes

mitocondrialmente oxidados que permitem a fosforilação oxidativa, resultam no aumento da

razão ATP/ADP e fechamento dos KATPs 81. Nas células β, essa estreita relação entre o nível

de glicose plasmático e a produção de ATP é garantida pela extraordinária taxa de oxidação

de glicose 80.

A glicose é transportada rapidamente para o interior celular por difusão facilitada,

através dos transportadores de glicose, e direcionada para a glicólise através da fosforilação

pela glicoquinase, a qual não é inibida pelo seu próprio produto, glicose-6-fosfato. Essa

característica da glicoquinase garante um sistema de baixa afinidade e de alta capacidade que

não se satura mesmo em condições de elevado fluxo glicolítico, sendo a glicoquinase, assim

denominada, como sensor de glicose da célula β 78, 80. A alta atividade metabólica nas células

β é garantida pelo eficiente consumo de piruvato pela mitocôndria com formação de CO2, de

FADH2 e NAD(P)H. Ademais, a elevada atividade das lançadeiras de hidrogênio

mitocondriais (glicerolfosfato e malato/aspartato) sustenta a reoxidação do NADH para NAD+

citosólico 82, cofator necessário para a manutenção da atividade da gliceraldeido-3-fosfato

desidrogenase 80.

A GSIS pode ainda ser potencializada por mecanismos independentes dos KATPs,

quando os mesmos já se encontram funcionalmente bloqueados, sendo estes mecanismos

caracterizados como via de amplificação da secreção de insulina, denominado amplifying

pathway. A sinalização para a via de amplificação parece apresentar-se dependente do

metabolismo da célula β e, embora muitos estudos evidenciem o envolvimento do amplifying

pathway em condições fisiológicas, não há uma explicação mecanística clara. Diversas

técnicas têm apontado o envolvimento do ATP nos passos de secreção distal ao aumento do

cálcio citosólico 81, onde os nucleotídeos de adenina poderiam atuar como segundo

mensageiro em ambas as vias, triggering e amplifying.

Estudos recentes propõem outros possíveis mensageiros para a amplifying pathway,

como o AMPc, a exportação mitocondrial de citrato para o citosol, a proteina quinase ativada

por AMP e o cofator reduzido NADPH 59, 81.

O equivalente reduzido NADPH é o principal responsável pela manutenção da

funcionalidade dos sistemas antioxidantes 83. A geração do NADPH através do metabolismo

da glicose possui importante participação da via das pentoses-fosfato (PPP). Essa via se inicia

27

com a degradação da glicose-6-fosfato, pela ação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase

(G6PD), passo enzimático limitante do processo 83, resultando na formação de 6-fosfoglucona

δ-lactona e a liberação de uma molécula de NADPH e CO2. Sobre o 6-fosfogluconato,

terceiro componente desta via, a ação da enzima 6-fosfogluconato desidrogenase resulta na

formação de D-ribulose 5-fosfato e outra molécula de NADPH.

Assim, o metabolismo da glicose desencadeia a exocitose dos grânulos insulínicos

fundamentalmente devido ao triggering pathway 81. Porém, gera sinalizadores intracelulares,

como o NADPH 59, 84, 85, o qual poderia atuar através da modulação do estado redox 59 como

um mecanismo de amplificação da secreção de insulina.

Reações de óxido-redução podem controlar vias de sinalização celular e

consequentemente processos fisiológicos. Este fenômeno foi primeiramente demonstrado por

Sundaresan et al. (1995), que reportaram a dependência do H2O2 para a sinalização mediada

pelo fator de crescimento derivado de plaquetas em células da musculatura vascular lisa 36.

Recentemente, foi demonstrado que a alteração no estado redox celular é uma

importante variável para a exocitose. A presença de NADPH e GSH durante medidas de

capacitância de membrana plasmática resultou no aumento do registro, observado frente a

trens de despolarizações em célula β pancreática. Para esse fenômeno, foi reportando a

dependência da atividade específica da glutarredoxina (GRx) como mediadora do efeito

positivo do NADPH sobre a maquinaria exocitótica 59. Pois, o efeito do NADPH sobre a

exocitose foi pontecializado por microinjeções de GRx, inibido por microinjeções de TRx 59 e

abolido pela redução na expressão de GRx 86.

Esses resultados indicam que NADPH/GRx/TRx parecem mediar uma regulação

redox sobre o mecanismo de secreção de insulina mediado por nutrientes 59. Em ilhotas

pancreáticas, a elevação na concentração de glicose resulta no aumento da atividade da PPP 84,

85 com consequente aumento na formação de NADPH 87 e de GSH 84. Associado a alta

expressão e distinta distribuição de GRx no citoplasma, especialmente em grânulos

secretórios, levanta a interessante possibilidade de que o controle redox sobre a exocitose

pode ocorrer de modo dependente do metabolsimo e em domínios específicos, como nas

regiões próximos aos grânulos insulínicos.

A importância do estado redox na fisiologia da ilhota pancreática há muito foi

demonstrada pela supressão da secreção de insulina, devido a redução no conteúdo de GSH

através da inibição da enzima glutationa redutase 88. Inversamente, a presença de GSH em alta

concentração de glicose, de forma dose-dependente aumentou a GSIS 89, bem como reduziu o

28

estresse oxidativo, melhorando a secreção de insulina, e a expressão de mRNA da insulina em

ilhotas isoladas de pacientes diabéticos tipo 2 90.

A cisteína, amino ácido portador de sítio tiól, também pode participar da modulação

redox como substrato para a síntese de glutationa ou ainda como agente redutor direto.

Agudamente, a presença da cisteína ou do seu análogo permeável à membrana plasmática a

N-acetil-L-cisteína (NAC), potente antioxidante, foram reportados por aumentar a secreção de

insulina em resposta à alta concentração de glicose 91. Efeito positivo foi ainda observado em

ilhotas de camundongos, pela presença do doador de cisteína (L-2-oxotiazolidina-4-ácido

carboxilico), o qual aumentou a liberação de insulina em paralelo ao aumento no inflxo de

cálcio 92.

O tratamento de células secretoras de insulina com cisteína promoveu proteção contra

danos induzidos por H2O2 93, 94 e pelo produto de peroxidação lipídica, 4-hidroxi-2-nonenal

(4-HNE) 93. Essa proteção foi correlacionada com um aumento no conteúdo de glutationa

nessas células 93-95, sendo ainda acompanhado pela supressão da translocação do fator de

transcrição pancreatic duodenal homeobox 1 (PDX-1) do núcleo para o citoplasma induzido

pelo 4-HNE 93.

Entretanto, concentrações elevadas de cisteína foram reportadas por inibir a GSIS,

devido à formação de sulfeto de hidrogênio (H2S), produto do metabolismo da cisteína 96. H2S

é endogenamente produzido pela cistatinonia β-sintase (CBS) e cistatinonia γ-liase (CSE)

enzimas-chave no processo de transulfuração a partir da cisteína. Ambas CBS e CSE são

expressas em ilhotas pancreáticas de camundongos e em células secretoras de insulina, onde o

efeito inibitório de altas concentrações de cisteína (3 mM) sobre a secreção de insulina,

correlaciona-se com a formação de H2S 96, o qual prejudica o fechamento dos KATPs 97 e a

oscilação intracelular de cálcio induzido pela glicose 96.

Diversos estudos mostraram o efeito negative do H2O2 sobre a função de células β

pacreáticas 73, 98-100. Em ilhotas pancreáticas tanto a exposição aguda ao H2O2, quanto a

exposição crônica a alta concentração de glicose suprimiram a atividade da G3PD 101, porém

sem aumentar o conteúdo dos metabolitos precedentes ao gliceraldeído 3-fosfato, sugerindo o

desvio desses matabólitos para a via das hexosaminas, poliol e para a formação dos produtos

finais de glicação avançada 101.

A inibição da maquinaria metabólica por EROs pode ocorrer pelo bloqueio da

atividade da enzima mitocondrial aconitase 102 e da enzima citosólica gliceraldeído 3-fosfato

desidrogenase (G3PD) as quais são suceptíveis à modificação oxidativa 34, 35, 103. G3PD possui

um papel crítico na catálise do glicareldeído 3-fosfato para 1,3-bisfosfoglicerato e para a

29

geração de NADH na via glicolítica. Um dos quatro monômeros de cisteína da G3PD é

especialmente reativo (Cis 149) e está localizado no sítio catalítico da enzima, próximo à

coenzima NAD 104. Como alguns tióis são essenciais para a atividade ezimática, a oxidação

destes implica na inativação de enzimas.

De modo semelhante, a atividade da aconitase é também suceptível a mecanismos

oxidativos. A aconitase mitocondrial pertence a uma família de desidratases contendo ferro-

enxofre, nas quais a atividade é dependente do estado redox dos grupamentos [4Fe-4S]2+.

Assim, tem sido demonstrado que a exposição de mitocondria isolada à oxidantes, em

particular O2•- e H2O2, inativa a enzima de forma reversível, impedindo a conversão de citrato

para isocitrato. Entretanto, é sugerido que o H2O2 não iniba diretamente a aconitase, sedo esta

inibição mediada pela interação da aconitase com componentes responsivos ao H2O2 102.

A inibição do metabolismo pelas espécies reativas de oxigênio em ilhotas pancreáticas

foi primeiramente sugerido por Nakazaki et al. (1995) 73. Através da técnica de patch-clamp,

os autores observaram uma ativação rápida de KATPs e inibição da excitabilidade elétrica

estimulada pela glicose. Este fenômeno foi proposto devido à inibição do metabolismo da

glicose pelo H2O2 73. Poteriormente, experimentos semelhantes realizados em células β

primárias e células secretoras de insulina, mostraram a inibição rápida no metabolismo e na

secreção de insulina pelo H2O2 99, 100. Recentemente, foi ainda demonstrado que a adição de

H2O2 (10-100 µM) suprime a frequência de disparo de potencias de ação, as oscilações

intracelulares de cálcio e a secreção de insulina, estimulados pela alta concentração de glicose

em ilhotas pancreáticas de camundongos 98.

Entretanto, uma ação estimulatória do H2O2 sobre a GSIS foi recentemente sugerida,

onde a adição de doses baixas (1-4 µM) de H2O2 estimulou a secreção de insulina na presença

de baixa concentração, mas sem efeito demonstrado em alta concentração de glicose.

Ademais, a diminuição drástica nos níveis de EROs pelo tratamento de ilhotas pancreáticas de

camundongos com antioxidantes, aboliu a secreção de insulina estimulada pela glicose 105, 106

e por alta concentração de K+ 106. Esses achados parecem sugerir as EROs, como elementos

fundamentais de sinalização para a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas.

Entretanto, apesar dessas observações, Martens et al. (2005) 107 mostraram que o

aumento na concentração de glicose associado à sua elevada taxa metabólica preveniu o

acúmulo de EROs em células β primárias. Onde o efeito supressor foi mais pronunciado em

células com maior responsividade metabólica à glicose 107. O metabolismo da glicose,

intimamente relacionado com a secreção de insulina, está também relacionado com a

supressão dos níveis de EROs em ilhotas pancreáticas, suscitando uma reavaliação do

30

conceito no qual a exposição à altos níveis de glicose invariavelmente aumenta os níveis de

EROs induzindo a disfunção e morte de célula β. Dessa forma, o efeito da elevada

concentração de glicose sobre os níveis de EROs e a funcionalidade da célula β pancreática

pode variar em relação ao tempo de exposição. Pois, cronicamente, estimula a formação

dessas espécies, enquanto que agudamente, diminui seu conteúdo intracelular em paralelo ao

efeito positivo sobre a secreção de insulina.

Sob estes aspectos, há a possibilidade de que o desequilíbrio no estado redox

intracelular decorrente do aumento no estado oxidativo, promova a oxidação de elementos

importantes para o funcionamento celular. Dentre esses, enzimas metabólicas como a

glicoquinase 32, a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase 34, 35, 103 e a aconitase 102 possuem

sítios tióis susceptíveis à regulação redox. O aumento no estado de oxidação celular, promove

bloqueio metabólico e redução na razão ATP/ADP, resultando na redução da probabilidade de

fechamento dos KATPs e na hiperpolarização da membrana plasmática, com consequente

redução da secreção da insulina 73, 98-100.

Entretanto, apesar dessas observações, o efeito das alterações no estado redox sobre os

mecanismos de secreção de insulina permanece incerto, havendo ainda uma contradição na

literatura em questão.

31

2- CONCLUSÃO

32

6 CONCLUSÃO

O presente estudo mostrou que mudanças no estado de óxido-redução celular alteram a

resposta de secreção de insulina pela glicose em ilhotas pancreáticas. O aumento no estado

oxidativo devido à adição de H2O2 suprimiu a GSIS. Inversamente, efeitos positivos sobre a

GSIS foram observados pela adição de antioxidantes. Entretanto, a modulação no estado

redox celular em favor da capacidade redutora, exerceu um efeito dual na funcionalidade da

célula β pancreática, onde pequenas alterações no conteúdo de EROs foram estimulatórias

sobre a secreção de insulina, enquanto alterações maiores suprimiram esse efeito positivo.

Dessa forma, apesar dos efeitos positivos observados pela diminuição nos níveis de

EROs, uma diminuição acentuada prejudicou a função das ilhotas pancreáticas, mostrando a

existência e a importância de um estado redox para a secreção de insulina.

Adicionalmente, o conteúdo de EROs foi modulado pela glicose em ilhotas

pancreáticas. O aumento na concentração de glicose diminuiu o conteúdo de EROs, sendo

este efeito correlacionado com a atividação da via das pentoses-fosfato.

Assim, dentre os mecanismos de ativação das células β pela glicose, a modulação no

estado redox parece ser parte do mecanismo de secreção de insulina.

33

REFERÊNCIAS

34

REFERÊNCIAS

1 Orci L. Macro- and micro-domains in the endocrine pancreas. Diabetes. 1982;31:538-565.

2 Eliasson L, Abdulkader F, Braun M, Galvanovskis J, Hoppa MB, Rorsman P. Novel

aspects of the molecular mechanisms controlling insulin secretion. J Physiol. 2008;586:3313-3324.

3 Prentki M, Tornheim K, Corkey BE. Signal transduction mechanisms in nutrient-

induced insulin secretion. Diabetologia. 1997;40 Suppl 2:S32-41. 4 Haber EP, Ximenes HM, Procopio J, Carvalho CR, Curi R, Carpinelli AR. Pleiotropic

effects of fatty acids on pancreatic beta-cells. J Cell Physiol. 2003;194:1-12. 5 Schuit FC. Is GLUT2 required for glucose sensing? Diabetologia. 1997;40:104-111. 6 Carpinelli AR, Malaisse WJ. Regulation of 86Rb+ outflow from pancreatic islets III.

Possible significance of ATP. J Endocrinol Invest. 1980;3:365-370. 7 Malaisse WJ, Sener A, Herchuelz A, Hutton JC. Insulin release: the fuel hypothesis.

Metabolism. 1979;28:373-386. 8 Ashcroft FM, Rorsman P. Electrophysiology of the pancreatic beta-cell. Prog Biophys

Mol Biol. 1989;54:87-143. 9 Rorsman P. The pancreatic beta-cell as a fuel sensor: an electrophysiologist's

viewpoint. Diabetologia. 1997;40:487-495. 10 Ashcroft FM, Harrison DE, Ashcroft SJ. Glucose induces closure of single potassium

channels in isolated rat pancreatic beta-cells. Nature. 1984;312:446-448. 11 Gilon P, Ravier MA, Jonas JC, Henquin JC. Control mechanisms of the oscillations of

insulin secretion in vitro and in vivo. Diabetes. 2002;51 Suppl 1:S144-151. 12 Bokvist K, Eliasson L, Ammala C, Renstrom E, Rorsman P. Co-localization of L-type

Ca2+ channels and insulin-containing secretory granules and its significance for the initiation of exocytosis in mouse pancreatic B-cells. EMBO J. 1995;14:50-57.

* de acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references available from: http://www.icmje.org [2007 May 22].

35

13 Hoppa MB, Collins S, Ramracheya R, Hodson L, Amisten S, Zhang Q, Johnson P, Ashcroft FM, Rorsman P. Chronic palmitate exposure inhibits insulin secretion by dissociation of Ca(2+) channels from secretory granules. Cell Metab. 2009;10:455-465.

14 Thams P, Anwar MR, Capito K. Glucose triggers protein kinase A-dependent insulin

secretion in mouse pancreatic islets through activation of the K+ATP channel-dependent pathway. Eur J Endocrinol. 2005;152:671-677.

15 Ashcroft FM, Proks P, Smith PA, Ammala C, Bokvist K, Rorsman P. Stimulus-

secretion coupling in pancreatic beta cells. J Cell Biochem. 1994;55 Suppl:54-65. 16 Nesher R, Anteby E, Yedovizky M, Warwar N, Kaiser N, Cerasi E. Beta-cell protein

kinases and the dynamics of the insulin response to glucose. Diabetes. 2002;51 Suppl 1:S68-73.

17 Buteau J. GLP-1 receptor signaling: effects on pancreatic beta-cell proliferation and

survival. Diabetes Metab. 2008;34 Suppl 2:S73-77. 18 Barthel A, Klotz LO. Phosphoinositide 3-kinase signaling in the cellular response to

oxidative stress. Biol Chem. 2005;386:207-216. 19 Newsholme P, Haber EP, Hirabara SM, Rebelato EL, Procopio J, Morgan D, Oliveira-

Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity. J Physiol. 2007;583:9-24.

20 Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J

Neurochem. 2006;97:1634-1658. 21 Banting FG. Early Work on Insulin. Science. 1937;85:594-596. 22 Babior BM, Curnutte JT, McMurrich BJ. The particulate superoxide-forming system

from human neutrophils. Properties of the system and further evidence supporting its participation in the respiratory burst. J Clin Invest. 1976;58:989-996.

23 Cai H. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: origins, mechanisms,

and consequences. Cardiovasc Res. 2005;68:26-36.

36

24 Niedowicz DM, Daleke DL. The role of oxidative stress in diabetic complications. Cell Biochem Biophys. 2005;43:289-330.

25 Babior BM. NADPH oxidase. Curr Opin Immunol. 2004;16:42-47. 26 Goldstein BJ, Mahadev K, Wu X. Redox paradox: insulin action is facilitated by

insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 2005;54:311-321.

27 Beckman JS, Koppenol WH. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the

bad, and ugly. Am J Physiol. 1996;271:C1424-1437. 28 Rubanyi GM, Vanhoutte PM. Oxygen-derived free radicals, endothelium, and

responsiveness of vascular smooth muscle. Am J Physiol. 1986;250:H815-821. 29 Lenzen S, Drinkgern J, Tiedge M. Low antioxidant enzyme gene expression in

pancreatic islets compared with various other mouse tissues. Free Radic Biol Med. 1996;20:463-466.

30 Pithon-Curi TC, Levada AC, Lopes LR, Doi SQ, Curi R. Glutamine plays a role in

superoxide production and the expression of p47phox, p22phox and gp91phox in rat neutrophils. Clin Sci (Lond). 2002;103:403-408.

31 Finkel T. Oxygen radicals and signaling. Curr Opin Cell Biol. 1998;10:248-253. 32 Tiedge M, Krug U, Lenzen S. Modulation of human glucokinase intrinsic activity by

SH reagents mirrors post-translational regulation of enzyme activity. Biochim Biophys Acta. 1997;1337:175-190.

33 Oliveira HR, Verlengia R, Carvalho CR, Britto LR, Curi R, Carpinelli AR. Pancreatic

beta-cells express phagocyte-like NAD(P)H oxidase. Diabetes. 2003;52:1457-1463. 34 Chatham JC, Gilbert HF, Radda GK. The metabolic consequences of hydroperoxide

perfusion on the isolated rat heart. Eur J Biochem. 1989;184:657-662. 35 Little C, O'Brien PJ. Mechanism of peroxide-inactivation of the sulphydryl enzyme

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur J Biochem. 1969;10:533-538.

37

36 Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K, Finkel T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 1995;270:296-299.

37 Bae YS, Kang SW, Seo MS, Baines IC, Tekle E, Chock PB, Rhee SG. Epidermal

growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J Biol Chem. 1997;272:217-221.

38 Fisher AB. Redox signaling across cell membranes. Antioxid Redox Signal.

2009;11:1349-1356. 39 Shelton MD, Chock PB, Mieyal JJ. Glutaredoxin: role in reversible protein s-

glutathionylation and regulation of redox signal transduction and protein translocation. Antioxid Redox Signal. 2005;7:348-366.

40 Bast A, Wolf G, Oberbaumer I, Walther R. Oxidative and nitrosative stress induces

peroxiredoxins in pancreatic beta cells. Diabetologia. 2002;45:867-876. 41 Demasi AP, Pereira GA, Netto LE. Cytosolic thioredoxin peroxidase I is essential for

the antioxidant defense of yeast with dysfunctional mitochondria. FEBS Lett. 2001;509:430-434.

42 Halliwell B, Clement MV, Long LH. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS

Lett. 2000;486:10-13. 43 Kirkman HN, Rolfo M, Ferraris AM, Gaetani GF. Mechanisms of protection of

catalase by NADPH. Kinetics and stoichiometry. J Biol Chem. 1999;274:13908-13914.

44 Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme

of aerobic life. Plant Physiol. 2006;141:312-322. 45 Powis G, Briehl M, Oblong J. Redox signalling and the control of cell growth and

death. Pharmacol Ther. 1995;68:149-173. 46 Dalton TP, Chen Y, Schneider SN, Nebert DW, Shertzer HG. Genetically altered mice

to evaluate glutathione homeostasis in health and disease. Free Radic Biol Med. 2004;37:1511-1526.

38

47 Hotta M, Tashiro F, Ikegami H, Niwa H, Ogihara T, Yodoi J, Miyazaki J. Pancreatic beta cell-specific expression of thioredoxin, an antioxidative and antiapoptotic protein, prevents autoimmune and streptozotocin-induced diabetes. J Exp Med. 1998;188:1445-1451.

48 Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation of cellular activation. Annu

Rev Immunol. 1997;15:351-369. 49 Fernandes AP, Holmgren A. Glutaredoxins: glutathione-dependent redox enzymes

with functions far beyond a simple thioredoxin backup system. Antioxid Redox Signal. 2004;6:63-74.

50 Moskovitz J. Methionine sulfoxide reductases: ubiquitous enzymes involved in

antioxidant defense, protein regulation, and prevention of aging-associated diseases. Biochim Biophys Acta. 2005;1703:213-219.

51 Stadtman ER, Van Remmen H, Richardson A, Wehr NB, Levine RL. Methionine

oxidation and aging. Biochim Biophys Acta. 2005;1703:135-140. 52 Krauss S, Zhang CY, Lowell BB. The mitochondrial uncoupling-protein homologues.

Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:248-261. 53 Rolo AP, Palmeira CM. Diabetes and mitochondrial function: role of hyperglycemia

and oxidative stress. Toxicol Appl Pharmacol. 2006;212:167-178. 54 Zhang CY, Baffy G, Perret P, Krauss S, Peroni O, Grujic D, Hagen T, Vidal-Puig AJ,

Boss O, Kim YB, Zheng XX, Wheeler MB, Shulman GI, Chan CB, Lowell BB. Uncoupling protein-2 negatively regulates insulin secretion and is a major link between obesity, beta cell dysfunction, and type 2 diabetes. Cell. 2001;105:745-755.

55 Echtay KS, Esteves TC, Pakay JL, Jekabsons MB, Lambert AJ, Portero-Otin M,

Pamplona R, Vidal-Puig AJ, Wang S, Roebuck SJ, Brand MD. A signalling role for 4-hydroxy-2-nonenal in regulation of mitochondrial uncoupling. EMBO J. 2003;22:4103-4110.

56 Freeman H, Shimomura K, Cox RD, Ashcroft FM. Nicotinamide nucleotide

transhydrogenase: a link between insulin secretion, glucose metabolism and oxidative stress. Biochem Soc Trans. 2006;34:806-810.

39

57 Green K, Brand MD, Murphy MP. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes. Diabetes. 2004;53 Suppl 1:S110-118.

58 Smith RA, Kelso GF, Blaikie FH, Porteous CM, Ledgerwood EC, Hughes G, James

AM, Ross MF, Asin-Cayuela J, Cocheme HM, Filipovska A, Murphy MP. Using mitochondria-targeted molecules to study mitochondrial radical production and its consequences. Biochem Soc Trans. 2003;31:1295-1299.

59 Ivarsson R, Quintens R, Dejonghe S, Tsukamoto K, in 't Veld P, Renstrom E, Schuit

FC. Redox control of exocytosis: regulatory role of NADPH, thioredoxin, and glutaredoxin. Diabetes. 2005;54:2132-2142.

60 Babior BM, Lambeth JD, Nauseef W. The neutrophil NADPH oxidase. Arch Biochem

Biophys. 2002;397:342-344. 61 Sorce S, Krause KH. NOX enzymes in the central nervous system: from signaling to

disease. Antioxid Redox Signal. 2009;11:2481-2504. 62 Newsholme P, Morgan D, Rebelato E, Oliveira-Emilio HC, Procopio J, Curi R,

Carpinelli A. Insights into the critical role of NADPH oxidase(s) in the normal and dysregulated pancreatic beta cell. Diabetologia. 2009;

63 Bedard K, Krause KH. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases:

physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 2007;87:245-313. 64 Martyn KD, Frederick LM, von Loehneysen K, Dinauer MC, Knaus UG. Functional

analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases. Cell Signal. 2006;18:69-82.

65 Uchizono Y, Takeya R, Iwase M, Sasaki N, Oku M, Imoto H, Iida M, Sumimoto H.

Expression of isoforms of NADPH oxidase components in rat pancreatic islets. Life Sci. 2006;80:133-139.

66 Marchetti P, Del Guerra S, Marselli L, Lupi R, Masini M, Pollera M, Bugliani M,

Boggi U, Vistoli F, Mosca F, Del Prato S. Pancreatic islets from type 2 diabetic patients have functional defects and increased apoptosis that are ameliorated by metformin. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89:5535-5541.

40

67 Velloso LA, Carneiro EM, Crepaldi SC, Boschero AC, Saad MJ. Glucose- and insulin-induced phosphorylation of the insulin receptor and its primary substrates IRS-1 and IRS-2 in rat pancreatic islets. FEBS Lett. 1995;377:353-357.

68 Khan FA, Goforth PB, Zhang M, Satin LS. Insulin activates ATP-sensitive K(+)

channels in pancreatic beta-cells through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Diabetes. 2001;50:2192-2198.

69 Zawalich WS, Tesz GJ, Zawalich KC. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase

amplify insulin release from islets of lean but not obese mice. J Endocrinol. 2002;174:247-258.

70 Kubota N, Tobe K, Terauchi Y, Eto K, Yamauchi T, Suzuki R, Tsubamoto Y,

Komeda K, Nakano R, Miki H, Satoh S, Sekihara H, Sciacchitano S, Lesniak M, Aizawa S, Nagai R, Kimura S, Akanuma Y, Taylor SI, Kadowaki T. Disruption of insulin receptor substrate 2 causes type 2 diabetes because of liver insulin resistance and lack of compensatory beta-cell hyperplasia. Diabetes. 2000;49:1880-1889.

71 Mahadev K, Zilbering A, Zhu L, Goldstein BJ. Insulin-stimulated hydrogen peroxide

reversibly inhibits protein-tyrosine phosphatase 1b in vivo and enhances the early insulin action cascade. J Biol Chem. 2001;276:21938-21942.

72 Mahadev K, Wu X, Zilbering A, Zhu L, Lawrence JT, Goldstein BJ. Hydrogen

peroxide generated during cellular insulin stimulation is integral to activation of the distal insulin signaling cascade in 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 2001;276:48662-48669.

73 Nakazaki M, Kakei M, Koriyama N, Tanaka H. Involvement of ATP-sensitive K+

channels in free radical-mediated inhibition of insulin secretion in rat pancreatic beta-cells. Diabetes. 1995;44:878-883.

74 Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications.

Nature. 2001;414:813-820. 75 Yan SD, Schmidt AM, Anderson GM, Zhang J, Brett J, Zou YS, Pinsky D, Stern D.

Enhanced cellular oxidant stress by the interaction of advanced glycation end products with their receptors/binding proteins. J Biol Chem. 1994;269:9889-9897.

76 Ulrich P, Cerami A. Protein glycation, diabetes, and aging. Recent Prog Horm Res.

2001;56:1-21.

41

77 Du XL, Edelstein D, Rossetti L, Fantus IG, Goldberg H, Ziyadeh F, Wu J, Brownlee M. Hyperglycemia-induced mitochondrial superoxide overproduction activates the hexosamine pathway and induces plasminogen activator inhibitor-1 expression by increasing Sp1 glycosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:12222-12226.

78 Matschinsky FM, Glaser B, Magnuson MA. Pancreatic beta-cell glucokinase: closing

the gap between theoretical concepts and experimental realities. Diabetes. 1998;47:307-315.

79 Weir GC, Bonner-Weir S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during

progression to diabetes. Diabetes. 2004;53 Suppl 3:S16-21. 80 Martens GA, Van de Casteele M. Glycemic control of apoptosis in the pancreatic beta

cell: danger of extremes? Antioxid Redox Signal. 2007;9:309-317. 81 Henquin JC. Regulation of insulin secretion: a matter of phase control and amplitude

modulation. Diabetologia. 2009;52:739-751. 82 Rubi B, del Arco A, Bartley C, Satrustegui J, Maechler P. The malate-aspartate

NADH shuttle member Aralar1 determines glucose metabolic fate, mitochondrial activity, and insulin secretion in beta cells. J Biol Chem. 2004;279:55659-55666.

83 Kletzien RF, Harris PK, Foellmi LA. Glucose-6-phosphate dehydrogenase: a

"housekeeping" enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients, and oxidant stress. FASEB J. 1994;8:174-181.

84 Ammon HP, Grimm A, Lutz S, Wagner-Teschner D, Handel M, Hagenloh I. Islet

glutathione and insulin release. Diabetes. 1980;29:830-834. 85 Verspohl EJ, Handel M, Ammon HP. Pentosephosphate shunt activity of rat

pancreatic islets: its dependence on glucose concentration. Endocrinology. 1979;105:1269-1274.

86 Reinbothe TM, Ivarsson R, Li DQ, Niazi O, Jing X, Zhang E, Stenson L, Bryborn U,

Renstrom E. Glutaredoxin-1 mediates NADPH-dependent stimulation of calcium-dependent insulin secretion. Mol Endocrinol. 2009;23:893-900.

87 Malaisse WJ, Hutton JC, Kawazu S, Herchuelz A, Valverde I, Sener A. The stimulus-

secretion coupling of glucose-induced insulin release. XXXV. The links between metabolic and cationic events. Diabetologia. 1979;16:331-341.

42

88 Malaisse WJ, Dufrane SP, Mathias PC, Carpinelli AR, Malaisse-Lagae F, Garcia-Morales P, Valverde I, Sener A. The coupling of metabolic to secretory events in pancreatic islets. The possible role of glutathione reductase. Biochim Biophys Acta. 1985;844:256-264.

89 Ammon HP, Mark M. Thiols and pancreatic beta-cell function: a review. Cell

Biochem Funct. 1985;3:157-171. 90 Del Guerra S, Lupi R, Marselli L, Masini M, Bugliani M, Sbrana S, Torri S, Pollera

M, Boggi U, Mosca F, Del Prato S, Marchetti P. Functional and molecular defects of pancreatic islets in human type 2 diabetes. Diabetes. 2005;54:727-735.

91 Ammon HP, Hehl KH, Enz G, Setiadi-Ranti A, Verspohl EJ. Cysteine analogues

potentiate glucose-induced insulin release in vitro. Diabetes. 1986;35:1390-1396. 92 Han MK, Kim SJ, Park YR, Shin YM, Park HJ, Park KJ, Park KH, Kim HK, Jang SI,

An NH, Kim UH. Antidiabetic effect of a prodrug of cysteine, L-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid, through CD38 dimerization and internalization. J Biol Chem. 2002;277:5315-5321.

93 Numazawa S, Sakaguchi H, Aoki R, Taira T, Yoshida T. Regulation of the

susceptibility to oxidative stress by cysteine availability in pancreatic beta-cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2008;295:C468-474.

94 Rasilainen S, Nieminen JM, Levonen AL, Otonkoski T, Lapatto R. Dose-dependent

cysteine-mediated protection of insulin-producing cells from damage by hydrogen peroxide. Biochem Pharmacol. 2002;63:1297-1304.

95 Kaneko Y, Kimura T, Taniguchi S, Souma M, Kojima Y, Kimura Y, Kimura H, Niki

I. Glucose-induced production of hydrogen sulfide may protect the pancreatic beta-cells from apoptotic cell death by high glucose. FEBS Lett. 2009;583:377-382.

96 Kaneko Y, Kimura Y, Kimura H, Niki I. L-cysteine inhibits insulin release from the

pancreatic beta-cell: possible involvement of metabolic production of hydrogen sulfide, a novel gasotransmitter. Diabetes. 2006;55:1391-1397.

97 Yang W, Yang G, Jia X, Wu L, Wang R. Activation of KATP channels by H2S in rat

insulin-secreting cells and the underlying mechanisms. J Physiol. 2005;569:519-531.

43

98 Gier B, Krippeit-Drews P, Sheiko T, Aguilar-Bryan L, Bryan J, Dufer M, Drews G. Suppression of KATP channel activity protects murine pancreatic beta cells against oxidative stress. J Clin Invest. 2009;119:3246-3256.

99 Krippeit-Drews P, Kramer C, Welker S, Lang F, Ammon HP, Drews G. Interference

of H2O2 with stimulus-secretion coupling in mouse pancreatic beta-cells. J Physiol. 1999;514 ( Pt 2):471-481.

100 Maechler P, Jornot L, Wollheim CB. Hydrogen peroxide alters mitochondrial

activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. J Biol Chem. 1999;274:27905-27913.

101 Sakai K, Matsumoto K, Nishikawa T, Suefuji M, Nakamaru K, Hirashima Y,

Kawashima J, Shirotani T, Ichinose K, Brownlee M, Araki E. Mitochondrial reactive oxygen species reduce insulin secretion by pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun. 2003;300:216-222.

102 Bulteau AL, Ikeda-Saito M, Szweda LI. Redox-dependent modulation of aconitase

activity in intact mitochondria. Biochemistry. 2003;42:14846-14855. 103 Lind C, Gerdes R, Schuppe-Koistinen I, Cotgreave IA. Studies on the mechanism of

oxidative modification of human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by glutathione: catalysis by glutaredoxin. Biochem Biophys Res Commun. 1998;247:481-486.

104 Molina y Vedia L, McDonald B, Reep B, Brune B, Di Silvio M, Billiar TR, Lapetina

EG. Nitric oxide-induced S-nitrosylation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase inhibits enzymatic activity and increases endogenous ADP-ribosylation. J Biol Chem. 1992;267:24929-24932.

105 Leloup C, Tourrel-Cuzin C, Magnan C, Karaca M, Castel J, Carneiro L, Colombani

AL, Ktorza A, Casteilla L, Penicaud L. Mitochondrial reactive oxygen species are obligatory signals for glucose-induced insulin secretion. Diabetes. 2009;58:673-681.

106 Pi J, Bai Y, Zhang Q, Wong V, Floering LM, Daniel K, Reece JM, Deeney JT,

Andersen ME, Corkey BE, Collins S. Reactive oxygen species as a signal in glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 2007;56:1783-1791.

107 Martens GA, Cai Y, Hinke S, Stange G, Van de Casteele M, Pipeleers D. Glucose

suppresses superoxide generation in metabolically responsive pancreatic beta cells. J Biol Chem. 2005;280:20389-20396.

44

108 Lacy PE, Kostianovsky M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 1967;16:35-39.

109 Carpinelli AR, Curi R, Malaisse WJ. Long-term regulation of pancreatic B-cell

responsiveness to D-glucose by food availability, feeding schedule, and diet composition. Physiol Behav. 1992;52:1193-1196.

110 el Razi Neto S, Zorn TM, Curi R, Carpinelli AR. Impairment of insulin secretion in

pancreatic islets isolated from Walker 256 tumor-bearing rats. Am J Physiol. 1996;271:C804-809.

111 Morgan D, Oliveira-Emilio HR, Keane D, Hirata AE, Santos da Rocha M, Bordin S,

Curi R, Newsholme P, Carpinelli AR. Glucose, palmitate and pro-inflammatory cytokines modulate production and activity of a phagocyte-like NADPH oxidase in rat pancreatic islets and a clonal beta cell line. Diabetologia. 2007;50:359-369.

112 Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, Korbutt GS, Toth E, Warnock GL, Kneteman NM,

Rajotte RV. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 2000;343:230-238.

113 Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olack BJ, Scharp DW. Automated method for

isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 1988;37:413-420. 114 Robinson JP, Bruner LH, Bassoe CF, Hudson JL, Ward PA, Phan SH. Measurement

of intracellular fluorescence of human monocytes relative to oxidative metabolism. J Leukoc Biol. 1988;43:304-310.

115 Bindokas VP, Kuznetsov A, Sreenan S, Polonsky KS, Roe MW, Philipson LH.

Visualizing superoxide production in normal and diabetic rat islets of Langerhans. J Biol Chem. 2003;278:9796-9801.

116 Myhre O, Andersen JM, Aarnes H, Fonnum F. Evaluation of the probes 2',7'-

dichlorofluorescin diacetate, luminol, and lucigenin as indicators of reactive species formation. Biochem Pharmacol. 2003;65:1575-1582.

117 Silveira LR, Pereira-Da-Silva L, Juel C, Hellsten Y. Formation of hydrogen peroxide

and nitric oxide in rat skeletal muscle cells during contractions. Free Radic Biol Med. 2003;35:455-464.

45

118 Zhu H, Bannenberg GL, Moldeus P, Shertzer HG. Oxidation pathways for the intracellular probe 2',7'-dichlorofluorescein. Arch Toxicol. 1994;68:582-587.

119 Larrabee MG. Evaluation of the pentose phosphate pathway from 14CO2 data.

Fallibility of a classic equation when applied to non-homogeneous tissues. Biochem J. 1990;272:127-132.

120 Quesada I, Nadal A, Soria B. Different effects of tolbutamide and diazoxide in alpha,

beta-, and delta-cells within intact islets of Langerhans. Diabetes. 1999;48:2390-2397. 121 Akerboom TP, Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione

mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol. 1981;77:373-382. 122 Anderson ME. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological

samples. Methods Enzymol. 1985;113:548-555. 123 Cross AR, Jones OT. The effect of the inhibitor diphenylene iodonium on the

superoxide-generating system of neutrophils. Specific labelling of a component polypeptide of the oxidase. Biochem J. 1986;237:111-116.

124 Stolk J, Hiltermann TJ, Dijkman JH, Verhoeven AJ. Characteristics of the inhibition

of NADPH oxidase activation in neutrophils by apocynin, a methoxy-substituted catechol. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;11:95-102.

125 Tian WN, Braunstein LD, Apse K, Pang J, Rose M, Tian X, Stanton RC. Importance

of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in cell death. Am J Physiol. 1999;276:C1121-1131.

126 Tian WN, Braunstein LD, Pang J, Stuhlmeier KM, Xi QC, Tian X, Stanton RC.

Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity for cell growth. J Biol Chem. 1998;273:10609-10617.

127 Katz J, Wood HG. The use of C14O2 yields from glucose-1- and -6-C14 for the

evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 1963;238:517-523. 128 Larrabee MG. The pentose cycle (hexose monophosphate shunt). Rigorous evaluation

of limits to the flux from glucose using 14CO2 data, with applications to peripheral ganglia of chicken embryos. J Biol Chem. 1989;264:15875-15879.

46

129 Nakazaki M, Kakei M, Yaekura K, Koriyama N, Morimitsu S, Ichinari K, Yada T, Tei C. Diverse effects of hydrogen peroxide on cytosolic Ca2+ homeostasis in rat pancreatic beta-cells. Cell Struct Funct. 2000;25:187-193.

130 Zraika S, Hull RL, Udayasankar J, Aston-Mourney K, Subramanian SL, Kisilevsky R,

Szarek WA, Kahn SE. Oxidative stress is induced by islet amyloid formation and time-dependently mediates amyloid-induced beta cell apoptosis. Diabetologia. 2009;52:626-635.

131 Stone JR, Yang S. Hydrogen peroxide: a signaling messenger. Antioxid Redox Signal.

2006;8:243-270. 132 Bari MR, Akbar S, Eweida M, Kuhn FJ, Gustafsson AJ, Luckhoff A, Islam MS.

H(2)O(2)-induced Ca(2+) influx and its inhibition by N-(p-amylcinnamoyl)anthranilic acid in the beta-cells: involvement of TRPM2 channels. J Cell Mol Med. 2009;

133 Jonas JC, Gilon P, Henquin JC. Temporal and quantitative correlations between

insulin secretion and stably elevated or oscillatory cytoplasmic Ca2+ in mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 1998;47:1266-1273.

134 Ceriello A, dello Russo P, Amstad P, Cerutti P. High glucose induces antioxidant

enzymes in human endothelial cells in culture. Evidence linking hyperglycemia and oxidative stress. Diabetes. 1996;45:471-477.

135 Laybutt DR, Kaneto H, Hasenkamp W, Grey S, Jonas JC, Sgroi DC, Groff A, Ferran

C, Bonner-Weir S, Sharma A, Weir GC. Increased expression of antioxidant and antiapoptotic genes in islets that may contribute to beta-cell survival during chronic hyperglycemia. Diabetes. 2002;51:413-423.

136 Oliveira HR, Curi R, Carpinelli AR. Glucose induces an acute increase of superoxide

dismutase activity in incubated rat pancreatic islets. Am J Physiol. 1999;276:C507-510.

137 Whillier S, Raftos JE, Chapman B, Kuchel PW. Role of N-acetylcysteine and cystine

in glutathione synthesis in human erythrocytes. Redox Rep. 2009;14:115-124. 138 Aruoma OI, Halliwell B, Hoey BM, Butler J. The antioxidant action of N-

acetylcysteine: its reaction with hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide, and hypochlorous acid. Free Radic Biol Med. 1989;6:593-597.

47

139 Tiedge M, Richter T, Lenzen S. Importance of cysteine residues for the stability and catalytic activity of human pancreatic beta cell glucokinase. Arch Biochem Biophys. 2000;375:251-260.

140 Babior BM. NADPH oxidase: an update. Blood. 1999;93:1464-1476.