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Mônica de Oliveira Benarroz AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Natal- RN 2007
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Mônica de Oliveira Benarroz
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum
L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde, do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como requisito para a obtenção do
título de Mestre em Ciências da Saúde.
Natal- RN
2007
Mônica de Oliveira Benarroz
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum
L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde, do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como requisito para a obtenção do
título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Mário Bernardo Filho
Natal, RN
2007
FICHA DE CATALOGAÇÃO DA FONTE
B456aBenarroz, Mônica de Oliveira.
Avaliação de efeitos de um extrato aquoso de cinnamomum zeylanicum L. na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia das hemácias de ratos wistar / Mônica de Oliveira Banarroz.___ Natal-RN, 2007.
51f.: il. Orientador: Profº. Mario Bernardo Filho.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) -Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde.
1.Cinnamomum zeylanicum - efeitos - Dissertação. 2. Tecnécio-99m – Dissertação. 3. Pertecnetato de sódio - Dissertação. 4. Ratos – Dissertação. I.Bernardo Filho, Mario. II. Título.
UFRN CDU: 633.832(043.3)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof.Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
iii
Mônica de Oliveira Benarroz
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum
L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Mario Bernardo Filho – UERJ
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros – UFRN
Prof. Dr. Christopher J. Palestro – Long Island Jewish Medical Center - USA
Aprovada em 05/12/2007
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus amados pais: a minha conquista é a vossa.
Aos meus preciosos filhos: fonte da minha inspiração.
Aos meus queridos irmãos: vale a pena sonhar.
A DEUS toda glória.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Deus Trino pelo dom da vida, por sua manifestação de amor, força e consolo todos
os dias.
Ao Professor Mario Bernardo Filho pela oportunidade que me proporcionou de
ingressar na área da pesquisa e por todo seu esforço em conduzir seus alunos no
caminho da busca do conhecimento e da excelência, forjando o caráter do cientista.
Ao Professor Adenilson de Souza da Fonseca pela orientação, companheirismo e
grande incentivo durante todo o processo de seleção, execução e conclusão do
mestrado.
Aos amigos e companheiros de pesquisa: Gabrielle Rocha, Márcia Pereira, Camila
Godinho, Rosane Neves, Bernardo Rebello, Angélica Garcia-Pinto, Jacques Frydman,
Maria Regina Macedo e Sebastião Santo-Filho.
Aos meus filhos Felippe e Caroline pela digitação, correção de referências, aulas de
francês e correção ortográfica e por toda vibração de cada conquista.
Ao Serviço de Medicina Nuclear e ao Laboratório de Endocrinologia do Hospital
Universitário Pedro Ernesto pelo suporte aos resultados obtidos.
À chefia do Instituto Nacional de Câncer HCIII e HCIV - Ilka Chaves e Rosângela
Cordeiro, respectivamente, pelas inúmeras trocas de plantão e liberações para concluir
os créditos exigidos.
À nutricionista e companheira solidária Samyra Kede, por sua compreensão e presteza
em me substituir em vários plantões que precisei me ausentar.
A todos os colegas do Laboratório de Radiofarmácia Experimental que contribuíram
para o êxito desta dissertação.
vi
SUMÁRIO
Dedicatória........................................................................................................................v
Agradecimentos...............................................................................................................vi
Lista de abreviaturas e símbolos….......………………….................……………………..viii
Resumo………………………………………………………….............…………………......ix
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................1
2 REVISÃO DA LITERATURA.........................................................................................3
3 ARTIGO ANEXADO......................................................................................................7
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES..........................................................33
5 ANEXOS......................................................................................................................36
6 REFERÊNCIAS...........................................................................................................37
Abstract
Apêndices
vii
Lista de abreviações, siglas e símbolos.
C célula sangüínea
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Cl- íon cloreto
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FAPERJ Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio
de Janeiro
FI-C fração insolúvel da célula
FI-P fração insolúvel do plasma
FS-C fração solúvel da célula
FS-P fração solúvel do plasma
HCO3- íon bicarbonato
MBq megabequerel
g micrograma
l microlitro
MN medicina nuclear
Mo molibdênio
NaCl cloreto de sódio
P plasma
PET positron Emission Tomography
% ATI porcentagem de radioatividade
rpm rotações por minuto
SnCl2 cloreto estanoso
SPECT single photon emission computed tomography99mTc tecnécio-99m
TcO4- íon pertecnetato
Na99mTcO4 pertecnetato de sódio
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
viii
RESUMO
Radiobiocomplexos são utilizados para obtenção de imagens em medicina nuclear e
empregados na pesquisa básica. Constituintes sangüíneos marcados com tecnécio-
99m têm sido empregados como radiobiocomplexos e utilizados como modelo
experimental para avaliação de efeitos biológicos de drogas naturais ou sintéticas. A
análise da forma e de parâmetros morfométricos (relação perímetro/área) pode ser
usada para avaliar os efeitos de drogas sobre a estrutura da membrana de hemácias.
Cinnamomum zeylanicum (canela) é uma especiaria usada como planta medicinal para
tratar doenças. O objetivo desse estudo foi avaliar efeitos de um extrato aquoso de
Cinnamomum zeylanicum na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m
e na morfologia de hemácias de ratos Wistar. No tratamento in vitro, amostras de
sangue de animais foram isoladas e incubadas com um extrato de canela. No
tratamento in vivo, animais foram tratados com um extrato de canela e amostras de
sangue foram isoladas. Em ambas as situações foram realizadas a radiomarcação de
constituintes sanguíneos e a análise morfológica. Como controle, o sangue ou os
animais foram tratados com cloreto de sódio 0,9%. Os dados obtidos nos experimentos
de marcação de constituintes sangüíneos com tecnécio-99m indicaram que o
tratamento in vitro com extrato de canela foi capaz de diminuir significativamente
(p<0,05) a porcentagem de radioatividade nos compartimentos celulares e na fixação
das proteínas celulares e plasmáticas. Esses efeitos não foram observados no
tratamento in vivo. Os resultados obtidos na morfologia de hemácias sugerem que os
tratamentos in vitro e in vivo não alteram a forma nem a razão perímetro/área. O
tratamento in vitro com o extrato aquoso de canela poderia afetar estruturas da
membrana celular relacionadas ao transporte de Íons ou ao estado de oxidação do íon
ix
estanoso ou do íon pertecnetato, alterando a marcação de constituintes sangüíneos
com tecnécio-99m. Esse estudo é uma pesquisa experimental com caráter
multidisciplinar. Foi desenvolvido em colaboração com diferentes Departamentos e
Serviços da área biomédica do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ, atestando
o caráter multidisciplinar da pesquisa .
Palavras chaves: Constituintes sangüíneos, Cinnamomum zeylanicum, Tecnécio-99m,
Pertecnetato de sódio, Ratos.
x
1 INTRODUÇÃO
As doenças crônicas são as principais causas de morte no mundo,
às quais foram atribuídos 35 milhões de óbitos em 2005 (1). O avanço da tecnologia
aplicada às ciências médicas tem garantido o aumento da expectativa de vida (2) e
dessa forma, a convivência com doenças que eram denominadas malignas ou fatais.
Dentre os procedimentos que têm contribuído para auxiliar os diagnósticos, destacam-
se as técnicas de imagens cintilográficas da medicina nuclear, a tomografia por
emissão de fóton único (SPECT, single photon emission computed tomography) e a
tomografia de emissão de pósitrons (PET, positron emission tomography) (3,4).
Durante os exames de medicina nuclear são administrados
quantidades mínimas de estruturas de interesse biomédico marcadas com
radionuclídeos denominadas de radiofármacos (radiobiocomplexos), para fins de
diagnóstico e terapia (5). O tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado na
para obtenção de imagens diagnósticas em virtude de suas características químicas e
físicas (6), bem como em diversos estudos na pesquisa científica básica (7, 8).
Hemácias marcadas com 99mTc têm sido muito utilizadas na
medicina nuclear para várias aplicações importantes nos exames diagnósticos (9,10). A
radiomarcação de constituintes sanguíneos pode ser alterada por uma variedade de
drogas derivadas de produtos naturais ou sintéticos (11-14).
A utilização de plantas medicinais por seres humanos data de
milhares de anos devido às suas propriedades medicinais e nutricionais (15). Contudo,
algumas plantas podem apresentar toxicidade e alguns de seus efeitos adversos têm
sido descritos (16).
A canela (Cinnamomun zeylanicum) é uma especiaria conhecida por
suas características organolépticas e por seus componentes químicos, tais como:
2
aldeído cinâmico, eugenol, cânfora (17) e compostos fenólicos (18,19). Amplamente
utilizada em aromatizantes, bebidas e produtos de perfumaria (20), a canela também é
utilizada na Medicina Tradicional devido a suas propriedades medicinais (18,21). Também
vêm sendo demonstradas ações antioxidantes (18,19,22), antibacterianas (23) e
hipoglicêmicas (20, 24, 25).
Essa pesquisa foi motivada por tentar identificar os efeitos dessa
especiaria, mas também por gerar informações sobre possível interação
radiobiocomplexo-produto nartural de interesse para a medicina nuclear. A utilização
dessa especiaria do ponto de vista alimentar também atrai o interesse para o estudo
desse produto vegetal. Além disso, não foram encontrados na literatura dados sobre a
influência da canela na radiomarcação de constituintes sanguíneos.
Assim, objetivo deste estudo foi avaliar efeitos de um extrato aquoso
de Cinnamomum zeylanicum L.. na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc
e na morfologia de hemácias de ratos Wistar.
Este trabalho teve um caráter multidisciplinar e foi realizado no
Laboratório de Radiofarmácia Experimental, Departamento de Biofísica e Biometria,
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, UERJ. Teve colaboração do Serviço de
Medicina Nuclear e do Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro
Ernesto, UERJ. Os experimentos foram possíveis através de convênio firmado entre a
UERJ e a UFRN, sob a orientação do Professor Doutor Mario Bernardo Filho, e na
vigência dos auxílios concedidos pela CAPES, FAPERJ e CNPq.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
As inovações na área da saúde têm beneficiado os seres humanos.
A redução da mortalidade, o aumento da expectativa de vida, a erradicação de
doenças endêmicas e o desenvolvimento de novas drogas são conseqüências da
inovação científica (26). Ainda assim, doenças crônicas são responsáveis por cerca de
35 milhões de mortes anuais em todo o mundo (1). Por isso faz-se necessário o
desenvolvimento de tecnologias aplicadas às ciências médicas que permitam o
aprimoramento dos procedimentos diagnósticos e terapêuticos (2).
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza técnicas
não invasivas que permitem detectar alterações funcionais, metabólicas e bioquímicas
antes das manifestações anatômicas, com o emprego de radiobiocomplexos para
procedimentos de diagnóstico e de tratamento (5,27). Essa característica de natureza
biológica possibilita o estudo detalhado de um órgão ou tecido e uma maior
fidedignidade na aplicação (3).
Os Radiobiocomplexos são complexos formados por um
radionuclídeo, emissor de radiação ionizante, ligado a estruturas moleculares ou
celulares (8). Esses complexos constituem-se em uma ferramenta clínica de relevância
devido ao seu crescente uso na área da saúde humana. Isso se deve à ausência de
ação farmacológica, ao fato de serem administrados por via oral, venosa ou aérea, e
ainda ao fato de serem utilizados para a obtenção de imagem metabólica (6). A
captação de um radiobiocomplexo por um órgão ou tecido alvo depende de suas
características fisico-químicas, do seu metabolismo e de sua excreção (6). Destacam-se
ainda as características de alta sensibilidade e especificidade dos exames para
4
diversas doenças, tais como: doenças neurológicas e psiquiátricas (28), e perfusão
miocárdica em pacientes obesos (29).
O 99mTc é um radionuclídeo amplamente utilizado na medicina
nuclear para diagnósticos (SPECT) (5) e na marcação de estruturas biológicas em
pesquisas científicas básicas (27). Esse radionuclídeo pode ser produzido em gerador
99Mo/99mTc, o que possibilita a sua disponibilidade em serviços de medicina nuclear. A
partir desse gerador, pode-se obter um eluído estéril e isento de pirógenos, com
características que o fazem ideal para as imagens de câmara de cintilação (emissão de
radiação gama de 140 keV); tendo meia-vida de 6 horas, baixo impacto ambiental e o
custo reduzido (5).
A marcação de estruturas celulares e moleculares com o 99mTc
necessita, em geral, da utilização de um agente redutor. O 99mTc é eluído do gerador
sob a forma de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) que não se liga facilmente a outras
espécies químicas, sendo necessária a redução do estado de oxidação +7 para
valências menores (5). A redução do Na99mTcO4 pode ser obtida através de diferentes
agentes químicos, sendo realizada freqüentemente com o cloreto estanoso (SnCl2) (5).
As hemácias, estruturas celulares sangüíneas anucleadas, circulam
no sangue durante 120 dias em média e exercem funções vitais no organismo (30). A
membrana plasmática das hemácias, de forma semelhante à de outras células, é
composta de uma dupla camada lipídica e de várias proteínas globulares, de acordo
com o padrão do mosaico fluido da estrutura da membrana. Ela possui várias proteínas
classificadas em dois tipos: proteínas intrínsecas, que estão firmemente ligadas à
bicamada lipídica; e proteínas extrínsecas, que estão ligadas na forma não covalente
às proteínas integrantes da membrana (30). A banda-3 é uma proteína multifuncional
5
relacionada à troca do íon bicarbonato (HCO3-) pelo íon cloreto (Cl-) (31,32), e tem
importante participação no metabolismo e na forma das hemácias (33).
Tem-se descrito que doenças (34) e drogas (7,11) poderiam alterar a
forma das hemácias. Assim, a análise da forma e de alguns parâmetros morfométricos,
tais como o perímetro e a área das hemácias, vem sendo utilizada para avaliar
propriedades relacionadas com a membrana eritrocitária (11, 35).
As hemácias são marcadas com o 99mTc através de métodos in vitro,
in vivo ou através da combinação de ambos (5). Na aplicação clínica, são muito
utilizadas para avaliar o pool sangüíneo, imagem esplênica (5) e detecção de
hemorragias gastrintestinais (5,10). Utiliza-se a técnica de marcação in vitro de
constituintes sanguíneos com 99mTc também como modelo experimental para avaliação
de efeitos biológicos de drogas naturais e sintéticas (7,36, 37).
O consumo de plantas medicinais vem alcançando relevante
importância econômica nas últimas décadas em virtude da sua ampla utilização na
cultura popular (38). Os benefícios dessas plantas estão associados aos seus princípios
ativos (39, 40), que estão presentes em todas as suas partes: folhas, flores, galhos,
raízes, sementes e grãos (16). Entretanto, os relatos sobre os efeitos adversos e as
possíveis interações farmacológicas entre os compostos químicos das plantas
medicinais e as drogas alopáticas ainda são escassos, devido ao pouco conhecimento
sobre os mecanismos de ação dessas plantas (16, 41). Além disso, diversas plantas
ainda não foram padronizadas quanto à posologia, indicação e efeitos adversos,
levando as autoridades em saúde à preocupação de criar estratégias que viabilizem a
sua segurança, eficácia e qualidade (38).
A canela é uma árvore originária da Ásia, cultivada há mais de
quatro milênios pelos chineses. Da família das Lauráceas, as duas espécies mais
6
conhecidas são: a canela-do-Ceilão (Cinnamomum zeylanicum.) e a canela da China
(Cinnamomum cassia Blume), que se diferenciam por peculiaridades, como por
exemplo, a ausência de súber na Cinnamomum zeylanicum e as concentrações de
constituintes químicos, como o eugenol (42). Seu consumo como especiaria está
relacionado às suas propriedades organolépticas (sabor e aroma) que são conferidas
pela presença de compostos químicos como o aldeído, o eugenol, a cânfora e uma
variedade de polifenóis (43-45). É muito difundida na culinária ocidental (46, 47), nas
indústrias de flavorizante, de perfumaria, de bebidas e de alimentos (20).
A canela também é utilizada como planta medicinal no Sistema de
Saúde Oficial Asiático (18,21,47). Na cultura popular, tem uma variedade de aplicações
empíricas, como por exemplo: tratamento de transtornos digestivos, resfriados (48),
hipertensão (49,50), tratamento de disfunção erétil, frigidez, inflamação dos olhos,
vaginite, reumatismo, ferimentos e cefaléia (42).
Alguns autores têm descrito para essa especiaria, propriedades
antioxidantes (17-20,44,51), antimicrobianas (23,52-54), antifúngicas (46,53) e anti-hipertensiva
(50). Além disso, muitos pesquisadores passaram a enfatizar o possível efeito
hipoglicemiante dos compostos fenólicos da canela (21, 24, 25, 47, 48).
O processo de marcação de hemácias com 99mTc pode ser alterado
por drogas terapêuticas, modificando a natureza da ligação ou a quantidade de 99mTc
fixado nas células sangüíneas (8, 27). Sugere-se que extratos de diferentes plantas
medicinais e de drogas sintéticas possam alterar a marcação de constituintes
sanguíneos com 99mTc (7, 11, 14, 37, 55-58). Essa alteração poderia ser explicada por estes
fatores: uma direta inibição (ação quelante) do íon estanoso; danos na membrana dos
eritrócitos; competição dos referidos íons pelos mesmos sítios de ligação; possível
geração de espécies reativas de oxigênio, e direta oxidação do íon estanoso (27).
7
3 ARTIGO ANEXADO
Aceito para publicação no periódico “Applied Radiation and Isotopes” (2008
Feb;66(2):139-146. Epub 2007 Aug 15), Qualis Internacional A.
Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and
the morphometry of red blood cells: in vitro assay.
M. O. Benarroz1, 2; A.S. Fonseca1* ; G. S. Rocha1; J.N.G. Frydman1, 2; V.C. Rocha1;
M.O. Pereira1 and M. Bernardo-Filho1, 2, 3.
1 - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcantara
Gomes, Departamento de Biofísica e Biometria, Avenida 28 de Setembro, 87, 4o
Andar, Vila Isabel, 20551-030, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
2 – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, Avenida General Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180,
Natal, RN, Brasil.
3 - Instituto Nacional do Câncer, Coordenadoria de Pesquisa Básica, Praça Cruz
Vermelha, 23, 20230-130, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Corresponding Author: Adenilson de Souza da Fonseca
Universidade do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Departamento de Biofísica e Biometria, Av. 28 de setembro, 87, 4o Andar, 20551-030,
Vila Isabel, Rio de Janeiro, Brasil. phone/fax: 55-21-25876432
E-mail: [email protected]
8
AbstractEffects of Cinnamomum zeylanicum(cinnamon) on the labeling of blood constituents
with technetium-99m(99mTc) and on the morphology of red blood cells were studied.
Blood samples from Wistar rats were incubated with cinnamon extract for 1hour or with
0.9% NaCl, as control. Labeling of blood constituents with 99mTc was performed.
Plasma(P) and blood cells(BC), soluble(SF-P and SF-BC) and insoluble(IF-P and IF-
BC) fractions were separated. The radioactivity in each fraction was counted and the
percentage of radioactivity incorporated(%ATI) was calculated. Blood smears were
prepared, fixed, stained and the qualitative and quantitative morphological analysis of
the red blood cells was evaluated. The data showed that the cinnamon extract
decreased significantly(p<0.05) the %ATI on BC, IF-P and IF-BC. No modifications
were verified on shape of red blood cells. Cinnamon extracts could alter the labeling of
blood constituents with 99mTc, and although our results were obtained with animals,
precaution is suggested in interpretations of nuclear medicine examinations involving
the labeling of blood constituents in patients who are using cinnamon.
Keywords: blood constituents; Cinnamomum zeylanicum; morphology; technetium-99m
1. Introduction
In the Lauraceae family, the Cinnamomum genus (cinnamon) is a very popular
spice throughout the world. This genus comprises hundred of species occurring in Asia
and Australia (Jayaprakasha et al., 2002). Cinnamomum zeylanicum (C. zeylanicum)
originates from Ceylon, being also native to South-East India. Its sensorial qualities are
flavor, slightly sweet, pleasant, warm and bitter, besides being strongly aromatic (WHO,
1999). This cinnamon specie is one of the world’s finest spices, mainly exported as
9
“cinnamon quills” (Wijesekera, 1978). It is widely used in Western cooking in various
kinds of desserts as well as in preparing flavoring teas (Mau et al., 2001; Jham, et al.,
2005).
Cinnamon is an ancient herbal medicine (Cheng et al., 2000) used as health tea to
treat gastrointestinal disturbance and loss of appetite (WHO, 1999), vasodilatation (Qin
et al., 2003), common cold, as well as, having antimicrobial action (Murcia et al., 2004).
It has the capability of inhibiting various cancer cell lines (Schoene et al., 2005). Other
data demonstrated that cinnamon could reduce glucose, triglyceride, total cholesterol
and LDL cholesterol plasma levels in people with type 2 diabetes (Khan et al., 2003).
In addition, it has been shown that cinnamon extracts could also present a potent
antioxidant effect (Mancini-Filho et al., 1998; Murcia et al., 2004).
Chemical analysis of cinnamon extracts have revealed the presence of essential
oils, tannins (Lee and Ahn, 1998; Mau et al., 2001), phenolic acids (Anderson et al.,
2004; Schoene et al., 2005; Shan et al., 2005), cinnamaldehyde (WHO, 1999; Cheng et
al., 2000; Prasad et al., 2003; Shan et al., 2005), eugenol (Friedman et al., 2000;
Chericoni et al., 2005), cinnamophilin (Su et al., 1999), hydroxychalcone (Jarvill-Taylor
et al., 2001) and coumarin (Choi et al., 2001). However, the composition of the essential
oil and, therefore, its value and use depends very much on the species which is distilled,
as well as on the part of the plant that is utilized (Chericoni et al., 2005).
Blood constituents can be labeled with technetium (99mTc) and used in numerous
applications in nuclear medicine (Early and Sodee, 1995; Saha, 2004). Red blood cells
have been used to evaluate the cardiac function (Niemeyer et al., 1995), volemia (Harel
et al., 2005), and detection of gastrointestinal bleeding sites (Wong et al., 2004; Zaman
et al., 2004; Olds et al., 2005).
10
The labeling process of cellular and molecular structures with 99mTc depends on a
reducing agent, such as stannous ion (Dewanjee et al., 1982). In the red blood cells,
the transport of the pertechnetate ion by the band-3 system (Callahan and Rabito,
1990) and the stannous ion by the calcium channels (Gutfilen et al., 1996) to the
interior of the cells have been suggested. The binding of 99mTc is mainly on the beta
chain of hemoglobin (Dewanjee et al., 1982).
Several authors have reported the effect of synthetic and natural drugs on this
radiolabeling process (Oliveira et al., 2003; Frydman et al., 2004; Moreno et al., 2004;
Fonseca et al., 2005). The drugs could alter the labeling of blood constituents acting as
oxidant agents, modifying the membrane structure or decreasing the efficiency of
transmembrane transport system of stannous and pertechnetate ions into cells. These
findings have stimulated the process to label blood constituents with 99mTc as an in vitro
assay to screening some properties of synthetic or natural products.
Moreover, qualitative and quantitative morphological analysis has been used as a
method to evaluate if the effects of drugs on this radiolabeling process could be related
to changes in shape of red blood cells (Oliveira et al., 2003).
Cinnamon is a natural product widely used by human beings, and several
authors have reported various important biological effects associated with it. However,
the action mechanism related with cinnamon is not fully understood. The use of different
assays could allow for evaluating and obtaining more information about the possible
action mechanism of this herbal medicine and spice which would be very important to
the field of nutrition. The aim of this study was to evaluate the effect of an aqueous
cinnamon extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and on the
morphology of red blood cells isolated from Wistar rats.
11
2. Materials and methods
AnimalsAdult male Wistar rats (3-4 months of age, body weight 250-300 g) were
maintained in a controlled environment. The animals had free access to water and food,
and ambient temperature was kept at 25 2ºC. Experiments were conducted in
accordance with the Institutional Committee of Animal Care (Comissão de Ética para o
Cuidado e Uso de Animais Experimentais, Instituto de Biologia Roberto Alcantara
Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro) with the protocol number
CEA/134/2006.
Preparation of cinnamon extract
Cinnamon, powdered (lot 04E05C, validity to November 2006), the
manufacturer of which is Yoki Alimentos S.A., Brasil (www.yoki.com.br/kitano), was
purchased at a local supermarket. To prepare the extract, 1.2 g of powder were
dissolved in 20 ml of hot saline (0.9% NaCl). After 15 minutes, this preparation was
centrifuged (1500 rpm, 5 minutes) to obtain the final extract. All the experiments were
performed before November 2006. Considering the information of the manufacturer
about the expiration date of this product, it is expected that it was in condition to be
used in various situations.
Spectrophotometry of the extract
The absorbance spectrum (Analyser Comércio e Indústria Ltda, Brazil) was
determined, with the cinnamon extract prepared as described above, in the range of
400-700 nm. Absorbance value was measured at each 20 nm interval. The value of
12
the absorbance at 500 nm (1.06 0.002) was considered as a marker of the
reproducibility of the conditions of the extract at the higher concentration used.
In vitro radiolabeling of blood constituents
The experiments were carried following the protocol published elsewhere
(Bernardo-Filho et al., 1983; Bernardo-Filho et al., 1994; Vidal et al., 1998; Lima-Filho et
al., 2002; Moreno et al., 2004; Fonseca et al., 2005; Freitas et al., 2007; Fonseca et al.,
2007). The tubes used in these experiments were previously closed with a rubber cap
and a syringe was used to reduce the air atmosphere (vacuum) inside the vials.
Heparinized blood (500 l, n=10 for each concentration) was withdrawn from Wistar rats
(n=12) and incubated with 100 l of different concentrations of a cinnamon extract (0.6,
3.75, 7.5, 15, 30 and 60 mg/ml) or with a saline solution (0.9% NaCl) alone, as control,
for 1 hour (room temperature). Afterwards, 500 l of freshly prepared solution of
stannous chloride (1.20 µg/ml) was added and the incubation continued for further 1
hour. After this period of time, 100 µl 99mTc (3.7 MBq) as sodium pertechnetate
(Na99mTcO4), recently milked from a 99Mo/99mTc generator (Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares, Comissão Nacional de Energia Nuclear, São Paulo, Brasil)
were added and the incubation continued for another 10 minutes. These samples were
centrifuged in a clinical centrifuge (1500 rpm, 5 minutes) and aliquots of 20 l of plasma
(P) and blood cells (BC) were isolated. Other aliquots of 20 l of P and BC were
separated and also precipitated with 1.0ml of 5% trichloroacetic acid and centrifuged
(1500 rpm, 5 minutes) to isolate soluble (SF) and insoluble fractions (IF). The
radioactivity in P, BC, SF-P, IF-P, SF-BC and IF-BC were determined in a well counter
(Packard, model C5002, Illinois, USA) and the percentage of radioactivity incorporated
(%ATI) was calculated as described elsewhere (Bernardo-Filho, et al., 1983).
13
Morphological evaluation of red blood cells
Histological preparations were carried out with blood samples in vitro treated with
cinnamon extract at different concentrations for 60 min at room temperature, or with
saline solution as control group. Blood smears were prepared, dried, fixed and stained
by the May-Grünwald-Giensa method (Junqueira and Carneiro, 2002). After that, the
images of the red blood cells were acquired (Optronics, USA) from blood smears to
qualitative morphology analysis under optical microscopy (x1000, Olympus, BX model,
Japan). For morphometric analysis of red blood cells, the perimeter/area ratio was
obtained from images by specific program (Image ProPlus Software, USA).
Statistical analysis Data are reported as (means ± SD) of the percentage of incorporated
radioactivity (%ATI) from radiolabeling assay (n=10 for each cinnamon concentration)
and morphometric analysis (perimeter/area ratio, five smears for each cinnamon
concentration and five fields for each smear). The One-way analysis of variance –
ANOVA test was performed to verify possible statistical differences. After that, a
rigorous statistical post-test (Bonferroni) was chosen to identify the p value (p<0.05 as
lesser significant level) and to compare each treated group with the control group
(treated with 0.9% NaCl). InStat Graphpad software was used to perform statistical
analysis (GraphPad InStat version 3.00 for Windows 95, GraphPad Software, San
Diego, California, USA).
14
3. Results
Figure 1 shows the absorbance spectrum of the cinnamon extract at higher
concentration used in the range of 400-700 nm. The data in this figure indicate that the
extract studied presents an absorption peak (1.06 0.002) at 500 nm.
Figure 2 shows the ATI% in insoluble (IF-P) and soluble (SF-P) fractions isolated
from plasma separated from whole blood incubated with different concentrations of an
aqueous cinnamon extract. The analysis of this data indicates that aqueous cinnamon
extract has significantly (p<0.05) reduced the ATI% of IF-P in the incubation with the
highest doses (30 and 60 mg/ml) suggesting a reducing of 99mTc fixation by plasma
proteins at this concentration.
Figure 3 shows the ATI% in insoluble (IF-BC) and soluble (SF-BC) fractions
isolated from blood cells separated from blood incubated with different concentrations of
an aqueous cinnamon extract. Similarly in the results obtained with plasma proteins,
aqueous cinnamon extract has also significantly (p<0.05) reduced the ATI% of IF-BC at
highest doses suggesting a reducing of 99mTc fixation by the cellular proteins at these
concentrations studied.
Figure 4 shows the ATI% in blood cells (BC) and plasma (P) compartments from
whole blood incubated with different concentrations of an aqueous cinnamon extract.
The analysis of these data indicates that aqueous cinnamon extract in various
concentrations decreases the ATI% of cells suggesting an alteration in the distribution
of the 99mTc between cellular and plasma compartments.
Figures 5 and 6 show the photomicrographs of the blood smears from blood
treated with saline solution (control) and with an aqueous cinnamon extract at the
highest concentration used (60.0 mg/ml), respectively. The qualitative morphological
analysis by the comparison between these figures suggests the treatment with
15
cinnamon does not induce important changes on shape of red blood cells observed
under optical microscopy.
The figure 7 shows the perimeter/area ratio for red blood cells from blood
samples treated with aqueous cinnamon extract at different concentrations. The
analysis of these data confirms the qualitative evaluation (Figure 6), indicating that the
extract used didn’t modify the perimeter/area ratio of the red blood cells.
4. Discussion
There are numerous clinical and experimental studies about the effects and
pharmacological interactions between natural and synthetic drugs. The data concerning
interaction of diagnostic agents, including radiopharmaceuticals, with therapeutic drugs
are relatively scarce. The development and use of in vitro tests can bring important
information about the possible drug/radiopharmaceutical interactions. The labeling of
blood constituents with 99mTc could be an useful method to study this labeling process
and important findings have already been published (Bernardo-Filho et al., 1983;
Bernardo-Filho et al., 1986). These works revealed that further manipulations of the
blood was not necessary after the labeling process, as centrifugation or treatment with
chelating agents (Brunelle and Nouel, 1970; Sodee and Early, 1995), although it would
need to increase the incubation time with stannous chloride. Moreover, our
experimental model has permitted evaluating some properties of various products used
by the human beings (Oliveira et al., 2003; Moreno et al., 2004; Fernandes et al., 2005;
Fonseca et al., 2007).
It has been reported that a number of natural or synthetic substances (caffeine,
acetylsalicylic acid, phytic acid) can alter the labeling of blood constituents with 99mTc
(Lima-Filho et al., 2003; Frydman et al., 2004; Fonseca et al., 2005). However, other
products are not able to interfere in this labeling process, as Pfaffia sp. (Fernandes et
16
al., 2005). This procedure has been proposed as an in vitro assay to attempt ascertain
some effects, as redox activities, of products used daily by the human beings.
The analysis of data presented in this study shows that the aqueous cinnamon
extract should alter the fixation of 99mTc in plasma and cellular proteins in the treatments
with the highest doses (30 and 60 mg/ml, Figures 2 and 3). Moreover, the data show
that the aqueous cinnamon extract seems to modify the distribution of 99mTc between
cellular and plasma compartments when low and high concentrations of this natural
product (Figure 4) were used in the experiments. To ascertain whether if the aqueous
cinnamon extract used could cause morphological modifications in the membrane of red
blood cells and alter the labeling of these cells with 99mTc, qualitative (Figures 5 and 6)
and quantitative (Figure 7) morphological analyses was carried out. These analyses
suggested no modifications on shape of red blood cells.
Pharmacological effects of interest to human health have been reported with 1 up
to 6 g per day of cinnamon as crude drug or extracts (Safdar et al., 2004; Khan et al.,
2003; Mang et al., 2006). These values are close to commonly-suggested doses (2 up
to 4 g) to cinnamon as crude drug (WHO, 1999). Although our experiments were carried
out in an in vitro assay, the data with cinnamon extract could correspond to these
doses, since alterations in radiolabeling of red blood cells and plasma proteins were
obtained at low doses (3.75 mg/ml and 7.5 mg/ml, respectively).
Data have shown biological effects for different cinnamon species (Su et al.,
1999; Verspohl et al., 2005; Chericoni et al., 2005). Studies have shown that the spices
available in the market under a different brand name produced similar effect
(Kreydiyyeh et al., 2000). Phenolic compounds present in water cinnamon extracts (as
hydroxychalcone) are transported in blood attached to plasma proteins (Podhajcer et
al., 1980). If these binding sites in plasma proteins could be the same binding sites of
17
99mTc in these proteins, in the presence of cinnamon extract, plasma protein labeling
with 99mTc could be reduced. This fact was observed with 30 mg/ml (Figure 2).
Antioxidant compounds are of great interest because could they be used to
prevent several chronic diseases such as heart disease, diabetes, cancer, arterial
thrombosis, and may provide health-promoting effects (Kimura et al., 1985; Craig, 1999;
Ferrari, 2004; Treasure, 2005). The antioxidant effect of phenolic compounds present in
cinnamon extracts is mainly due to their redox properties and could result in various
mechanisms: free-radical scavenging activity, transition-metal-chelating and singlet-
oxygen-quenching capacity (Shan et al., 2005). These substances could act as
chelating on stannous ions decreasing the fixation of 99mTc on plasma and cellular
proteins (Figure 2 and 3), as well as could be related to radiolabeling alteration of blood
cells (Figure 4).
Data have demonstrated that cinnamon extracts present activity against a
number of microorganisms such as: Salmonella typhimurium and Escherichia coli (Mau
et al., 2001; Alzoreky and Nakahara, 2003; Yuste and Fung, 2004), Salmonella infantis,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus (Mau et al., 2001;
Alzoreky and Nakahara, 2003). This effect may be related to action on plasma
membrane modifying its structure and decreasing or impeding the transport of stannous
and pertechnetate ions into blood cells.
Aqueous extracts from cinnamon have been shown to increase in vitro glucose
uptake, glycogen synthesis and to increase phosphorylation of the insulin receptor
(Impar-Radosevich et al., 1998). Anderson et al. (2004) have ascertained that the
aqueous cinnamon extract contains a mixture of polymeric polyphenols which inhibit the
activity of a purified phosphatase. These authors have also shown that this extract could
mimic the action of insulin-induced signaling via its receptor. It has been demonstrated
18
that this extract could inhibit the Na+ - K+- ATPase in rat intestines and kidneys
(Verspohl et al., 2005). Other data have demonstrated that cinnamophilin could inhibit
potassium, sodium and calcium currents in rat cardiac tissues (Su et al., 1999). In
addition, trans-cinnamaldehyde, the main component of cinnamon extracts, can
depolarize the membrane and release noradrenaline from ileal synaptosomes by
calcium-dependent and cyclic AMP-related systems (Cheng et al., 2000). Thus,
cinnamon extract could cause alterations in membrane structures involved in ion
transport and alter the internal cellular conditions and/or stannous and pertechnetate
ions transport into cell thus explaining the decrease in radiolabeling of blood cells with
99mTc (Figure 4). However, these effects on membrane structure could not induce
alterations on shape of red blood cells, as ascertained by morphological analysis
(Figures 6 and 7).
Moreover, in general, the labeling of blood constituents could decrease due to
drug action in: (i) binding at same sites on the blood constituents; (ii) direct oxidation or
generation of free radicals which could oxidize the stannous ion; (iii) direct inhibition
(chelating action) of the stannous and pertechnetate ions, and (v) alteration of the
plasma membrane structure or modifying the transport systems of stannous and
pertechnetate ions into cells.
In conclusion, our data suggest that aqueous cinnamon extracts could alter the
labeling of blood constituents with 99mTc by its chelating action and/or effects on the
membrane structures involved in transport of ions. Although the experiment described
have been carried out with animals, precaution is suggested in the interpretations of the
nuclear medicine examinations involving the labeling of blood constituents in patients
that are using cinnamon.
19
Acknowledgements
This research was supported by Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) and Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). We are
grateful to Carlos Brown Scavarda (B.A. University of Michigan) for the English
grammar review.
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Figure and legends
Figure 1: spectrum of absorbance of an aqueous extract of cinnamon. Cinnamon
extract, 1.2 g of powder were dissolved in 20 ml of hot saline (0.9% NaCl). After 15
minutes, this preparation was centrifuged (1500 rpm, 5 minutes) to obtain the final
extract.
26
Figure 2: Effect of cinnamon extract on uptake of 99mTc by insoluble (IF-P) and soluble
(SF-P) fractions of plasma (P), in the radiolabeling procedure of blood elements.
Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
of cinnamon extract (1 hour) and after with SnCl2 (1.20 g/ml, 1 hour) and in sequence
with Na99mTCO4 (3.7 MBq 10 minutes). Insoluble and soluble fractions of plasma (IF-P
and SF-P) were obtained by precipitation with trichloroacetic acid (5%) and
centrifugation (1500 rpm, 5 minutes). The radioactivity in these fractions was counted
and the %ATI was calculated. ( ) IF-P and ( ) SF-P. (***) p 0.001, when compared to
control group of IF-P.
Figure 3: Effect of cinnamon extract on uptake of 99mTc by insoluble (IF-BC) and soluble
(SF-BC) fractions of blood cells (BC), in the radiolabeling procedure of blood elements.
Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
of cinnamon extract (1 hour), after with SnCl2 (1.20 g/ml, 1 hour) and in sequence with
Na99mTcO4 (3.7 MBq 10 minutes). Insoluble and soluble fractions of blood cells (IF-BC
and SF-BC) were obtained by precipitation with trichloroacetic acid (5%) and
centrifugation (1500 rpm, 5 minutes). The radioactivity in these fractions was counted
and the %ATI was calculated. ( ) IF-BC and ( ) SF-BC. (*) p<0.05 and (***) p 0.001,
when compared to control group of IF-BC.
Figure 4: Effect of cinnamon extract on the distribution of the 99mTc in the plasma and
blood cells (BC) compartments in the radiolabeling procedure of blood elements.
Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
of cinnamon extract (1 hour) and after with SnCl2 (1.20 g/ml, 1 hour) and in sequence
27
with Na99mTcO4 (3.7 MBq 10 minutes). After centrifugation, plasma (P) and blood cells
(BC) were isolated, the radioactivity was counted and the %ATI calculated. ( ) P and
( ) BC. (***) p 0.001, when compared to control group of BC.
Figure 5: Photomicrography of blood smears from blood samples treated with NaCl
0.9% solution (control group). Samples of whole blood from Wistar rats were treated
with NaCl 0.9% solution for 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and
staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was
evaluated under optical microscopy after image capture.
Figure 6: Photomicrography of blood smears from blood samples treated with
cinnamon extract. Samples of whole blood from Wistar rats were treated with aqueous
cinnamon extract (60.0 mg/ml) for 60 minutes. Blood smears were prepared, dried,
fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells
was evaluated under optical microscopy (x 1000) after image capture.
Figure 7: Effects of a cinnamon extract on the perimeter/area ratio of red blood cells.
Samples of whole blood from Wistar rats were treated with an aqueous cinnamon
extract at different concentrations for 60 minutes. Blood smears were prepared, dried,
fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells
was evaluated under optical microscopy (x 1000) after image captures of five fields for
each smear and five smears for each extract concentration. After that, morphometric
measurements (perimeter and area) were carried out and perimeter/area calculated.
28
Figure 1
0
0,2
0,4
,6
0,8
1
2
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
WAVE LENGTH
AB
SOR
BA
NC
1,
E
0
Figure 2
0 0.6 3.5 7.5 15 30 600
20
40
60
80
100
******
%AT
I
CINNAMON EXTRACT (mg/ml)
Figure 3
0 0.6 3.5 7.5 15 30 600
20
40
60
80
100
***
****
%AT
I
CINNAMON EXTRACT(mg/ml)
29
Figure 4
0 0.6 3.5 7.5 15 30 600
20
40
60
80
100
***************
%AT
I
CINNAMON EXTRACT(mg/ml)
Figure 5
30
Figure 6
Figure 7
0.00 0.60 3.75 7.50 15.00 30.00 60.000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
PERI
METE
R/AR
EA R
ATIO
(1/
m)
CINNAMON EXTRACT (mg/ml)
31
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES.
Todo profissional que busca a excelência no desempenho e
vislumbra a possibilidade de ser um formador de opinião e um multiplicador de
conhecimentos, precisa cumprir uma etapa marcante e fundamental na carreira
acadêmica: o mestrado.
A educação continuada, através de um curso de pós-graduação
strictu sensu, possibilita ao aluno participar das mudanças no contexto social
decorrentes dos avanços tecnológicos, a partir do aperfeiçoamento, capacitação e
qualificação técnica, bem como agregar valores inerentes ao cientista: criatividade,
investigação e crítica.
Ingressar no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi uma experiência ímpar. Ainda que
cumprindo créditos e exercendo as atividades acadêmicas e científicas em outra
Universidade, na UERJ. Cursar as disciplinas em diferentes departamentos e
compartilhar o saber com profissionais das áreas mais diversas foi muito enriquecedor.
A convivência com mestres e doutores, alunos de iniciação
científica, mestrandos e doutorandos foi um grande desafio. Um ambiente restrito, cujo
crivo não é apenas o saber, mas o aprimoramento do saber, o compromisso com a
ciência e a dedicação no estudo em desenvolvimento. Entretanto, o mais desafiador foi
desenvolver um projeto em modelos experimentais, avaliando efeitos biológicos e
interações entre drogas naturais e sintéticas com material radioativo, linha de pesquisa
do Laboratório de Radiofarmácia Experimental do Departamento de Biofísica e
Biometria (UERJ), local onde desenvolvi minha pesquisa.
32
Estar vinculada a uma Instituição Pública de Ensino Superior me
proporcionou inúmeras vantagens. Docentes altamente capacitados; bibliotecas com
acervo moderno; autonomia proporcionada aos alunos, os quais são estimulados a
publicar; parceria entre os departamentos de pesquisa e entre Instituições são alguns
exemplos.
Entretanto, como todo serviço público, as restrições
orçamentárias estão presentes e prejudicam muitos projetos. A restrição do número de
“bolsas de estudo” impede a dedicação integral do discente, visto que o trabalho
remunerado é uma realidade para muitos. A carência de recursos humanos (secretário
ou auxiliar administrativo) e recursos materiais (por exemplo computadores), podem ser
citados como pontos críticos nas condições gerais do desenvolvimento de uma
pesquisa científica. Contudo, as dificuldades foram superadas com o trabalho em
equipe e a boa vontade de todos os integrantes do grupo de pesquisa.
Como nutricionista, investigar os efeitos biológicos de produtos
naturais comestíveis era pertinente. Afinal, na prática clínica essa abordagem é
comum, principalmente quanto à interação droga-nutriente.
A escolha de um produto natural que tivesse efeitos biológicos
diversos e com boa aceitação no mercado mundial foi meu primeiro passo
investigatório. A canela-do-Ceilão (Cinnamomum zeylanicum), uma especiaria
largamente empregada na culinária, na medicina tradicional e na indústria de
perfumaria, tem sido investigada por inúmeras propriedades e daí a curiosidade de
estudá-la.
O desenvolvimento dos experimentos descritos nesta dissertação
baseou-se nos modelos experimentais de marcação de hemácias com material
radioativo (99mTc) e na morfologia de sangue de animais. No tratamento in vitro
33
amostras de sangue isoladas de animais foram incubadas com extrato de canela; e no
tratamento in vivo, amostras de sangue foram retiradas de animais que receberam
extrato de canela. Esses modelos são bem estabelecidos, com diversas publicações
em revistas indexadas.
Este estudo, apesar de ser uma pesquisa experimental, tem caráter
multidisciplinar. Foi realizado com a colaboração do Setor de Medicina Nuclear e do
Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ e
através do convênio entre duas universidades públicas, a UERJ e a UFRN. Essas
parcerias possibilitaram novas idéias e perspectivas, e também agregaram
conhecimentos de diferentes áreas.
Os resultados deste estudo viabilizaram a publicação de um artigo
original intitulado: Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood
constituents and the morphometry of red blood cells: in vitro assay, em revista
internacional de impacto relevante, Applied Radiation and Isotopes, com índice de
impacto 0,9 (referente ao ano de 2006) e Qualis A Internacional, bem como a possível
submissão de outro artigo, com os resultados do tratamento in vivo .
Verificou-se, através de pesquisa bibliográfica e experimental, que
as substâncias presentes nos extratos vegetais podem produzir efeitos que possibilitem
uma alteração no processo de marcação de hemácias com 99mTc, assim como na
morfologia das células vermelhas.
Neste estudo, o objeto de pesquisa foi a Cinnamomum
zeylanicum, uma especiaria popularmente conhecida como canela. O produto foi
adquirido na forma de apresentação em pó, mas foi utilizado na forma de extrato
aquoso para a metodologia aplicada.
34
Observou-se que no tratamento in vitro o extrato de canela foi
capaz de diminuir significativamente (p<0,05) a porcentagem de radioatividade nos
compartimentos celulares e na fixação das proteínas celulares e plasmáticas. Esses
efeitos não foram observados no tratamento in vivo. Os resultados obtidos para a
morfologia de hemácias sugerem que os tratamentos in vitro e in vivo não alteram a
forma nem a razão perímetro/área.
Os dados obtidos neste trabalho são de relevante importância por
descreverem algumas das interações entre a canela, como especiaria e como planta
medicinal, e os constituintes sanguíneos marcados com 99mTc, como
radiobiocomplexos. Além disso, até o momento não foram encontrados relatos dos
efeitos de extratos de canela sobre radiofármacos.
Embora, os resultados apresentados sejam experimentais, podem
ser úteis para compreensão de problemas associados à interpretação inadequada de
exames de medicina nuclear e/ou à necessidade de repetição deste tipo de
procedimento clínico em pacientes que estejam fazendo uso da canela como
especiaria ou como planta medicinal.
A canela vem sendo largamente estuda em diferentes áreas, seja
nas ciências biomédicas ou na indústria de alimentos e bebidas. Portanto colaborar
com o meio científico com informações da pesquisa básica pode em algum aspecto
trazer esclarecimentos sobre o tema.
Assim, fica o sentimento de contribuição para o progresso da
ciência e, por conseguinte, para o desenvolvimento da sociedade.
35
5 ANEXO
Carta de aceite
Ms. Ref. No.: ARI-D-07-00215R1
Title: Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and
the morphometry of red blood cells: in vitro assay
Applied Radiation and Isotopes
Dear Dr. Adenilson Souza Fonseca,
Thank you for submitting the revision, together with a detailed response to the
reviewers' critiques.
I am pleased to confirm that your paper "Cinnamomum zeylanicum extract on the
radiolabeling of blood constituents and the morphometry of red blood cells: in vitro
assay" has been accepted for publication in Applied Radiation and Isotopes.
Comments from the Editor and Reviewers can be found below.
Thank you for submitting your work to this journal.
With kind regards,
LEONARD I. WIEBE, DSc, PhD
Receiving Editor
Applied Radiation and Isotopes
36
6 REFERÊNCIAS
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57. Neves RF, Moreno SRF, Rebello BM, Caldas LQA, Fonseca AS, Bernardo-Filho M, Medeiros AC. Effect of an Arctium lappa (burdock) extract on the labeling of blood constituents with technetium-99m and on the morphology of the red blood cells. Braz Arch Biol Technol. In press.
58. Rebello BM, Moreno SRF, Neves RF, Godinho CR, Fonseca AS, Caldas LQA, Bernardo-Filho M, Medeiros AC. Effect of a peel passion fruit flour (Passifloraedulis f. Flavicarpa) extract on the labeling of blood constituents with technetium-99m and on the morphology of red blood cells. Braz Arch Biol Technol. In press.
Abstract
Radiobiocomplexes are used to obtain images in nuclear medicine and employed in
basic research. Blood constituents labeled with technetium-99m (99mTc) have also been
employed as radiobiocomplexes and used also experimental model for evaluation of the
biological effects of natural or synthetic drugs. The analysis of the morphology and the
morphometrics parameters (perimeter/área ratio) can be used to evaluate the effects of
drugs upon the structure of the membrane of red blood cells. Cinnamomum zeylanicum
(cinnamon) is a spice used as herbal medicine to treat diseases. The aim of this study
was to evaluate the effect of in vitro and in vivo treatment with an aqueous cinnamon
extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and on the morphology of red
blood cells from Wistar rats. In the in vitro treatment, isolated blood sample from
animals were incubated with cinnamon extract. In the in vivo treatment, blood samples
were also withdrawn from animals treated with cinnamon extract. In both cases, the
radiolabeling of blood constituents was done. The morphological analysis of red blood
cells was also done. As control, blood or animals treated with NaCl 0.9%. The data
obtained on the labeling of blood constituents with 99mTc experiments indicated that the
in vitro treatment with cinnamon extract was capable to decrease signiicantly (p<0.05)
the percentage of radioactivity in cellular compartments and on the fixation of cellular
and plasma proteins. These effects were not observed on the in vivo treatment. The
results obtained for the morphology of red blood cells suggest that the in vitro and in
vivo treatments did not alter the morphology and the perimeter/area ratio. The in vitro
treatment with aqueous cinnamon extract could affect the membrane structures related
with the oxidation status of the stannous ion pertechnetate ion, altering the labeling of
blood constituentes with 99mTc. This study was a multidisciplinary experimental
research. It was developed with the contribution of the different Departments and
Services of the Hospital Universitário Pedro Ernesto of the Universidade do Estado do
Rio de Janeiro.
Key-words: blood constituents, technetium-99m, sodium pertechnetate, rats,
Cinnamomum zeylanicum.
Apêndice
1. Efeito do tratamento in vivo com extrato aquoso de canela em diferentes doses, na
marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc.
(%ATI)Dose
(mg/kg) P C FI-P FS-P FI-C FS-C
Controle 3,5±2,48 96,5±2,48 61,9±4,48 38,1±4,48 68,8±3,44 31,2±3,44
1,5 2,0±0,59 98,0±0,59 60,8±6,52 39,2±6,52 69,4±2,59 30,6±2,59
15,0 2,4±0,70 97,6±0,70 62,5±7,53 37,5±7,53 68,9±2,55 31,1±2,55
150,0 2,6±0,91 97,4±0,91 61,3±5,66 38,7±5,66 68,5±1,67 31,5±1,67
Ratos Wistar foram tratados com um extrato aquoso de canela em diferentes doses por
60 minutos. Em seguida, o sangue foi retirado e os constituintes sanguíneos foram
marcados com 99mTc . Plasma (P) e células (C) foram separados por centrifugação.
Frações solúveis (FS) e insolúveis (FI) de plasma e células foram isoladas por meio de
precipitação em ácido tricloroacético e centrifugação. A radioatividade em cada fração
foi contada e calculada a porcentagem da radioatividade incorporada (%ATI).
2. Efeito do tratamento in vivo com extrato aquoso de canela em diferentes períodos de
tempo, na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc.
(%ATI)Tempo
(min.) P C FI-P FS-P FI-C FS-C
0 2,4±1,15 97,6±1,15 66,1±5,98 33,9±5,98 77,0±3,77 23,0±3,77
15 4,7±4,26 95,3±4,26 67,7±6,75 32,3±6,75 76,4±3,43 23,6±3,43
60 3,7±2,76 96,3±2,76 63,8 ± 7,55 36,2±7,55 76,9±4,49 23,1±4,49
120 3,2±1,47 96,8±1,47 64,6±6,79 35,4±6,79 77,7±4,00 22,3±4,00
Ratos Wistar foram tratados com um extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) em
diferentes períodos de tempo. Em seguida, o sangue foi retirado e os constituintes
sanguíneos foram marcados com 99mTc . Plasma (P) e células (C) foram separados por
centrifugação. Frações solúveis e insolúveis de plasma e células foram isoladas por
meio de precipitação em ácido tricloroacético e centrifugação. A radioatividade em cada
fração foi contada e calculada a porcentagem da radioatividade incorporada (%ATI).
3. Fotomicrografia de distensão sanguínea de amostras de sangue de ratos Wistar
tratados com salina (controle).
Ratos Wistar foram tratados com salina (0,9% NaCl) por 60 minutos. Posteriormente, o
sangue foi retirado e as distensões sanguíneas foram preparadas, coradas e
visualizadas. A coloração foi feita pelo método May-Grünwald-Giemsa. As imagens
foram analisadas em microscopia ótica (x 1000)
4. Fotomicrografia de distensão sanguínea de amostras de sangue de ratos Wistar
tratado com extrato aquoso de canela por 60 minutos.
Ratos Wistar foram tratados com extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) por 60
minutos. Posteriormente, o sangue foi retirado e as distensões sanguíneas foram
preparadas, coradas e visualizadas. A coloração foi feita pelo método May-Grünwald-
Giemsa. As imagens foram analisadas em microscopia ótica (x 1000).
5. Efeito do tratamento in vivo com um extrato aquoso de canela em diferentes doses
na razão perímetro/área das hemácias.
0,00 1,50 15,00 150,000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
RAZÃ
O P
ERÍM
ETRO
/ÁRE
A (1
/m
)
EXTRATO AQUOSO DE CANELA (mg/kg)
Ratos Wistar foram tratados com extrato de canela em diferentes doses por 60
minutos. Em seguida, distensões sanguíneas foram preparadas, coradas e visualizadas
em microscopia óptica (X1000). As imagens foram capturadas (cinco campos por
lâmina, cinco lâminas por dose). As medidas da razão perímetro/área das hemácias
foram determinadas com auxílio do programa Image Pro Plus (Media Cibernetics,
USA).
6. Fotomicrografia de distensão sanguínea de amostras de sangue de ratos Wistar
preparadas imediatamente após o tratamento com extrato aquoso de canela.
Ratos Wistar foram tratados com extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) e
imediatamente após, o sangue foi retirado e as distensões sanguíneas foram
preparadas, coradas e visualizadas. A coloração foi feita pelo método May-Grünwald-
Giemsa. As imagens foram analisadas em microscopia ótica (x 1000).
7. Fotomicrografia de distensão sanguínea de amostras de sangue de ratos Wistar
tratados com extrato de aquoso de canela por 120 minutos.
Ratos Wistar foram tratados com extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) por 120
minutos. Posteriormente, o sangue foi retirado e as distensões sanguíneas foram
preparadas, coradas e visualizadas. A coloração foi feita pelo método May-Grünwald-
Giemsa. As imagens foram analisadas em microscopia ótica (x 1000).
8. Efeito do tratamento in vivo com um extrato aquoso de canela em diferentes
períodos de tempo na razão perímetro/área das hemácias.
0 15 60 1200,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
PER]
IMET
RO/Á
REA
(1/
m)
TEMPO DE TRATAMENTO (minutos)
Ratos Wistar foram tratados com extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) em diferentes
períodos de tempo. Em seguida, distensões sanguíneas foram preparadas, coradas e
visualizadas em microscopia óptica (x1000). As imagens foram capturadas (cinco
campos por lâmina, cinco lâminas por tempo). As medidas da razão perímetro/área das
hemácias foram determinadas com auxílio do programa Image Pro Plus (Media
Cibernetics, USA).
