Moreira Jr Editora _ RBM Revista Brasileira de Medicina

31/05/2015 Moreira Jr Editora | RBM Revista Brasileira de Medicina

http://www.moreirajr.com.br/revistas.asp?id_materia=4499&fase=imprime 1/8

Home Busca Avanada Normas de Publicao Assinaturas

CopyRight

Grupo Editorial Moreira JrEdies por

Data de PublicaoGostou do artigo?

Proibida a reproduo sem autorizao expressa

RBM RevistaBrasileira de

Medicina

PediatriaModerna

curta nossa pginano Facebook:

Tecnologia de PCR e RT-PCR em tempo real e suas aplicaes na rea mdica

Real time PCR and RT-PCR technology and its applications in the medicine field

Sabrina Nascimento

Estudante de Mestrado, Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC.

Eloah Rabello Suarez

MSc, Mestre, Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC. Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de So Paulo.

Maria Aparecida da Silva Pinhal PhD

Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC. Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de So Paulo.

Correspondncia:Maria Aparecida da Silva Pinhal

Professora titular da Disciplina de BioqumicaFaculdade de Medicina do ABC

Avenida Prncipe de Gales, 821 CEP 09060-650 - Santo Andr - SP

Tel.: (11) 4993-5499 - Fax: (11) 4993-5426E-mail: [email protected]

RBM Nov 10 V 67 Especial Oncologia

Indexado LILACS: S0034-72642010006400002

Unitermos: RT-PCR, PCR em tempo real, tcnicas de pesquisa, aplicao mdica.

Unterms: RT-PCR, real time pcr, investigative techniques, medical aplication.

SumrioO dogma central da biologia molecular formado por trs processos, a sntese de DNA (replicao) sntese de RNA (transcrio) esntese de protenas (traduo). Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicaoe transcrio por reao de amplificao em cadeia da DNA polimerase (PCR) e por RT-PCR, que corresponde reao de transcrioreversa, seguida da amplificao por PCR. Howard Temin, em 1961, foi pioneiro em juntar evidncias que comprovaram certainconsistncia com o dogma central da biologia molecular para provar a existncia da transcriptase reversa. Temin focava seusestudos em retrovrus, o Rous sarcoma vrus (RSV), capaz de transformar clulas normais em clulas tumorais. Temin props que omecanismo de transformao do RSV seria a converso do seu material gentico RNA em DNA e comprovou que o mecanismo detransformao de clulas normais em tumorais era bloqueado por inibidores da sntese de DNA. Tal hiptese foi confirmada por outropesquisador, David Baltimore, na mesma poca que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vrus de leucemia murinaRauscher (R-MLV). Temin e Baltimore receberam o Prmio Nobel de Fisiologia e Medicina, em 1975, pela descoberta da transcriptasereversa1. Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inmeras tcnicas para pesquisas em sade e avano nasreas de investigao clnica e preciso no diagnstico e tratamento de doenas. Este artigo tem como objetivo revisar os princpiose atualidades da tecnologia de amplificao por tempo real e suas importantes aplicaes em medicina.

SumaryThe molecular biology central dogma is composed by three process, DNA synthesis (replication) RNA synthesis (trsnacription) andprotein synthesis (translation). These processes can occur by in vitro mimetic replication and transcription mechanisms usingpolymerase chain reaction (PCR) and RT-PCR, that correspond to the reverse transcription, followed by PCR amplification. In 1961,Howard Temin began to gather evidence that was inconsistent with the molecular biology central dogma in order to provetranscriptase reverse existence. Temin focused his studies on Rous sarcoma vrus (RSV), capable of transforming normal cells intocancerous cells. Temin proposed that the transforming mechanism is converting RNA of RSV into DNA and proved that themechanisms to transform normal cells to tumoral cells was inhibit by DNA synthesis. This hypothesis was confirmed by anotherresearch, David Baltimore, at the same time was able to isolated the enzyme transcriptase reverse from leukemia murine Rauschervirus (R-MLV). Temin and Baltimore received the Nobel Prize for Physiology and Medicine in 1975 for the discovery of reversetranscripatase1. This discovery promotes continuously so many development of techniques for health research and improvement inthe clinical investigation and more precise diagnostic and disease treatment. This article has the aim to revise the actual principles ofreal time amplification technology and its important medical applications.

Numerao de pginas na revista impressa: 7 19

Resumo

O dogma central da biologia molecular formado por trs processos, a sntese de DNA (replicao) sntese de RNA (transcrio) esntese de protenas (traduo). Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicaoe transcrio por reao de amplificao em cadeia da DNA polimerase (PCR) e por RT-PCR, que corresponde reao de transcrioreversa, seguida da amplificao por PCR. Howard Temin, em 1961, foi pioneiro em juntar evidncias que comprovaram certainconsistncia com o dogma central da biologia molecular para provar a existncia da transcriptase reversa. Temin focava seusestudos em retrovrus, o Rous sarcoma vrus (RSV), capaz de transformar clulas normais em clulas tumorais. Temin props que o



mecanismo de transformao do RSV seria a converso do seu material gentico RNA em DNA e comprovou que o mecanismo detransformao de clulas normais em tumorais era bloqueado por inibidores da sntese de DNA. Tal hiptese foi confirmada por outropesquisador, David Baltimore, na mesma poca que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vrus de leucemia murinaRauscher (R-MLV). Temin e Baltimore receberam o Prmio Nobel de Fisiologia e Medicina, em 1975, pela descoberta da transcriptasereversa1. Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inmeras tcnicas para pesquisas em sade e avano nasreas de investigao clnica e preciso no diagnstico e tratamento de doenas. Este artigo tem como objetivo revisar os princpiose atualidades da tecnologia de amplificao por tempo real e suas importantes aplicaes em medicina.

Introduo

Para que a amplificao de segmentos de DNA ocorra por PCR convencional, tambm denominado PCR semiquantitativo, necessrioum par de oligonucleotdeos iniciadores especficos que reconheam o DNA que deve ser amplificado, denominado primersdesoxirribonucleotdeos trifosfatados e a enzima DNA polimerase, como exemplo a Taq DNA polimerase, muito utilizada nos ensaios emlaboratrios. Os ciclos da PCR esto esquematizados na Figura 1 e so representados por desnaturao da dupla fita do DNA, porrompimento das pontes de hidrognio, reconhecimento dos primers com o segmento especfico do DNA (anelamento ou hidridizao),seguido da polimerizao da nova fita de DNA pela incorporao dos nucleotdeos extremidade 3 dos primers iniciadores, assim ascadeias sofrem extenso no sentido 5- 3.

Pode ser observado na Figura 1 que os ciclos de anelamento e extenso da PCR em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) ocorremconcomitantemente, isto porque o produto obtido em tal reao deve apresentar no mximo 100 pb, o que no ocorre para o PCRsemiquantitativo.

A reao de transcrio reversa, seguida da reao da polimerase em cadeia (RT-PCR), possui como molde inicial a molcula de RNA,como previamente citado e gera cDNA, a partir de desoxirribonucleotdeos trifostatados. A reao inicial de transcrio reversa ocorreem geral a 420C, por 30 a 60 minutos. Aps a obteno do cDNA uma alquota desta amostra de cDNA utilizada para a reao deamplificao por PCR.

Figura 1 - Esquema comparativo das reaes de amplificao por PCR convencional e em tempo real. Os ciclos da PCR convencional,tambm denominada PCR semiquantitativa, so diferentes quando comparados aos ciclos da PCR em tempo real ou quantitativa(qPCR), como podemos observar nos esquemas acima. No eixo Y est representado a temperatura (0C) e no eixo X o tempo(minutos).

Sntese de cDNA

O DNA complementar (cDNA), isto , a fita de DNA sintetizada pela transcriptase reversa a partir do molde de RNA corresponde forma mais conveniente de se manipular a sequncia de codificao do RNA mensageiro (RNAm), isto porque o RNA uma molculafacilmente degradada por enzimas denominadas RNases. Para a sntese do cDNA necessrio o molde de RNAm, osdesoxirribonucleotdeos trifosfatados, dNTPs (dGTP, dCTP, dATP e dTTP), a enzima transcriptase reversa e oligonucleotdeosiniciadores, tambm denominados primers. Trs tipos diferentes de primers so usados para a sntese de cDNA: 1) No caso de RNAmde eucariotos que possuem uma cauda de poliadenosinas na extremidade 3da molcula (cauda poli-A), utilizado um primerdenominado oligo-dT, que contm 18 nucleotdeos de timidina e, consequentemente, hibridizar com todos os RNAs mensageiros declulas eucariticas simultaneamente 2) Opcionalmente, pode ser utilizado um coquetel de primers, chamado comumente de Randomprimers que aleatoriamente se ligam s molculas de RNAm (no exclusivamente) e servem de molde para a reao da transcrioreversa eobteno do cDNA 3) A terceira opo pode ser uma sequncia de oligonucleotdeo especfica ao RNAm que o alvo deamplificao da transcriptase reversa. Tal opo menos frequentemente utilizada, tendo em vista que as molculas de RNAmensageiro representam apenas aproximadamente 1% do RNA total presente nas clulas e, consequentemente, a probabilidade de umprimer desenhado para uma molcula especfica de RNA hibridizar com seu RNA-alvo muito pequena antes de uma reao deamplificao.

Uma vantagem da utilizao de primers de oligo (dT), que sua sequncia-alvo linear, contendo dezoito nucleotdeos quefacilmente sofrem hibridizao. Os random primers que possuem sequncias aleatrias, so oligmeros curtos com sequnciasvariveis, normalmente apresentam seis ou nove nucleotdeos constitudos por todas as combinaes possveis das quatro basesnitrogenadas. Como existem todas as combinaes possves na mistura destes primers, os mesmos podem ligar em qualquer parte doRNA. Portanto, tais primers podero tambm hibridizar com molculas de RNA transportadores e RNA ribossmicos, podendo, destemodo, interferir na converso exclusiva dos RNAs mensageiros em cDNA. Deste modo, os random primers apresentam a vantagem deapresentar teoricamente, altos rendimentos em contraposio aos primers de oligo dT, sendo essencial sua utilizao quando aexpresso de um determinado gene muito limitada. A utilizao de primers que apresentam sequncias especficas desenhadas parahibridizarem com o RNA mensageiro (RNAm) alvo a estratgia preferida quando um nmero limitado de RNAs mensageiros seroanalisados. A eficincia da hibridizao de primers especficos para a sequncia de RNAm dependente da conformao do RNAm-alvo, definida por suas estruturas secundrias e tercirias3.

Existem diversas vantagens na utilizao de reaes de PCR em tempo real, como mostra a Figura 2. O mtodo qualitativo, que eraaplicado como semiquantitativo antes da criao do PCR em tempo real, baseado na amplificao das sequncias-alvo seguidas poreletroforese em gel de agarose para deteco do DNA amplificado com um corante capaz de intercalar no DNA e fluorescer sobexposio luz ultra-violeta, tal como o brometo de etdio. Esta metodologia possui inmeras desvantagens, dentre elas podemosdestacar o fato de permitir a deteco dos produtos de reao apenas no final de todos os ciclos de termociclagem (entre 25 e 30ciclos), momento no qual o DNA-alvo se encontra amplificado em condies de saturao, como observado na Figura 2. Mesmo apscorreo pela intensidade de expresso de genes endgenos utilizados como controle da reao, housekeeping, muitas vezes no possvel detectar diferenas na expresso de determinados genes, no sendo possvel observar diferenas reais de expresso gnica.Portanto, em estudos de anlises de PCR semiquantitativa deve ser realizada uma padronizao do nmero de ciclos de termociclagempara deteco da reao no incio da fase exponencial de amplificao de cada amostra, o que bastante varivel e pode resultar emfalso-negativos.



Figura 2 - Comparao entre o PCR quantitativo e semiquantitativo. A curva indica na fase exponencial a capacidade de deteco dereaes pela tcnica de PCR em tempo real, utilizando fluorforos. Entretanto, nas reaes de PCR semiquantitativo a deteco dasreaes de amplificao realizada por eletroforese e a visualizao do DNA feita utilizando-se brometo de etdio. Na PCRsemiquantitativa a reao s pode ser visualizada em altos ciclos de amplificao, isto , em condio de saturao,consequentemente, pequenas diferenas de expresso gnica dificilmente podem ser detectadas em tal ensaio.

A tcnica de PCR em tempo real, por sua vez, permite a deteco, ciclo a ciclo, com elevada sensibilidade e especificidade daintensidade de fluorescncia emitida em decorrncia da amplificao da sequncia de DNA-alvo, possibilitando a anlise comparativada expresso de tal gene entre as amostras logo no ncio da fase exponencial de amplificao, em que no h saturao daamplificao, eliminando um vis da tcnica semiquantitativa (Figura 2). Em alguns casos as reaes de RT e PCR podem ser combinadas em uma nica reao. Tal processo conveniente quando se analisaapenas um ou poucos genes. No entanto, as condies ideais para a reao de RT e PCR em tempo real geralmente so processadasseparadamente, visto que as reaes que ocorrem em uma nica etapa tendem a apresentar menor sensibilidade, quando comparadasnormalmente com os resultados obtidos de reaes que ocorrem em duas etapas4.

Durante a realizao qRT-PCR falsos sinais positivos podem surgir a partir da amplificao do gene ou pseudogene no caso decontaminao das amostras por DNA genmico. Este problema pode ser evitado se os primers utilizados na PCR subsequente transcrio reversa, hibridizarem em dois xons diferentes, de forma que tenha pelo menos um ntron entre as regies de hibridizao.Outro cuidado a ser tomado a no contaminao com DNA, portanto o tratamento das amostras com DNase e testes para verificarse houve contaminao por DNA genmico deve ser constante para toda a reao5.

Cumpre ser observado que a eficincia das reaes de amplificao por RT-PCR depende de diversos fatores, tais como: o cuidadonas pipetagens, a qualidade e integridade das amostras (molde de RNA e cDNA), desenho dos primers, condies de termociclagem(temperatura de desnaturao, anelamento dos primers), qualidade e quantidade dos reagentes e tambm o tamanho do produto aser amplificado. Condies especficas para cada experimento devem ser padronizadas.

O desenho dos primers um dos principais fatores limitantes para a eficincia da tcnica da PCR em tempo real e deve seguir umasrie de regras. Os primers devem apresentar temperatura de anelamento ideal entre 58 e 60C para eficincia do ciclo padro determociclagem que consiste em uma primeira etapa de desnaturao realizada geralmente em 95C por 10 minutos, e 35 ciclos de95C por 15 segundos para abertura das fitas, seguida de 60C por 60 segundos para anelamento dos primers e extenso dosfragmentos pela DNA polimerase. Se as sequncias-alvo forem de cDNA, os primers devem ser desenhados para uma regio localizadaentre dois xons, evitando-se a amplificao de DNA genmico por eventual contaminao. Deve ser verificada tambm apossibilidade de formao de homodmeros, heterodmeros e de hairpin entre os primers (Figura 3). Para evitar a formao de taisestruturas, indesejveis principalmente quando so aplicados sistemas de fluorescncia que reconhecem inespecificamente fita duplade DNA, devemos verificar o valor de variao de energia livre de Gibbs (DG) para a ocorrncia destas interaes. O valor de DG deveser positivo, indicando menor probabilidade de formao espontnea destes dmeros indesejveis entre os primers. Pela mesma razo,os produtos de amplificao devem apresentar entre 80 e 150 pares de bases (pb) e a quantidade de guanina e citosina no deveultrapassar 50% do total de bases nitrogenadas presentes nos primers, uma vez que tais bases fazem trs ligaes de hidrognio emsuas interaes (enquanto adenina e timina fazem apenas duas), podendo formar estruturas dimricas indesejveis entre os primers,com maior fora de interao, reduzindo a eficincia da interao dos mesmos com o DNA-alvo.

Transcriptase reversa seguida da reao da polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR em tempo real)

Por ser uma tcnica de elevada sensibilidade e acurcia, a PCR em tempo real tem sido uma ferramenta aplicada em diversas reasbiomdicas, destacando-se na pesquisa bsica e no diagnstico clnico-laboratorial.

Figura 3 - Esquema da formao de harpin. A formao da estrutura de harpin representa o pareamento intracadeia por pontesde hidrognio entre bases nitrogenadas de um segmento do primer que serve de iniciador em reaes de PCR ou RT-PCR. Talestrutura impede a utilizao de tal primer nas reaes de amplificaes.

Na pesquisa biomdica bsica a aplicao mais frequente da RT-PCR (PCR aps transcrio reversa) em tempo real na determinaoda expresso absoluta ou relativa de um gene de interesse. Neste caso a extrao do RNA da amostra realizada, seguida porconverso deste RNA em cDNA pela tcnica de transcrio reversa e, finalmente, amplificao do cDNA por PCR (ao da DNApolimerase). Este cDNA utilizado nas reaes da PCR em tempo real, aplicando-se oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficospara a sequncia gnica-alvo que se deseja estudar/avaliar. Nas reaes de amplificao esto associados compostos que emitemfluorescncia e apresentam correlao direta com o nmero de cpias amplificadas do gene-alvo (DNA amplificado). Durante aamplificao, um programa de computador especfico (software) constri em tempo real um grfico relacionando os ciclos determociclagem com a intensidade de fluorescncia emitida durante a amplificao do DNA nas amostras, ciclo a ciclo. A partir destegrfico se deve traar uma linha de maneira paralela ao eixo referente ao nmero de ciclos (abscissas), na altura em que se inicia afase exponencial da amplificao gnica (incio da elevao exponencial na emisso da fluorescncia). Este parmetro representa olimiar de deteco, ou seja, o nmero mnimo de ciclos para amplificao, e denominado threshold pelo sistema de anlisesoftware utilizado. O ponto em que o threshold cruza com a linha de amplificao da amostra, permite determinar o nmero deciclos necessrios para o incio da amplificao da sequncia gnica-alvo presente no DNA de cada amostra. Este valor denominadoCt (Cycle Threshold) e permite a quantificao relativa do DNA de cada uma das amostras, aps ser corrigido pelos Ct dos genes-controle endgenos e das amostras-controle.



O Ct proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de expresso do gene-alvo em uma determinada amostra, quanto menor for onmero inicial do Ct obtido do gene-alvo existente na amostra, comparativamente com outro gene, porque houve maior amplificaodo gene-alvo e, consequentemente, o mesmo apresenta maior expresso (Figura 4).

A expresso gnica relativa determinada a partir da comparao da expresso do gene-alvo com um ou mais genes denominadoshousekeeping ou genes endgenos-controle. Tais genes so utilizados como controles internos da expresso gnica, uma vez queapresentam expresso teoricamente constante, ou seja, sofrem pequena oscilao na expresso mediada por fatores reguladoresexternos, tais como hormnios, fatores de crescimento, entre outros. Devido a esta propriedade, tais genes so utilizados paracorreo da expresso gnica do gene-alvo. Como exemplos de genes housekeeping podem ser citados: ciclofilina, gliceraldedo 3-fosfato desidrogenase, protena ribossomal 36B4, b-actina, RNA ribossmico 18S, receptor de transferrina, entre outros2.

A seguir sero apresentados alguns detalhes tcnicos especficos que devem ser seguidos para o entendimento de quem desejarealizar ensaios de RT-PCR ou PCR em tempo real, bem como sero apresentados exemplos da aplicao de tais metodologias e suasvariaes nas diversas reas clnicas e bsicas da medicina.

Figura 4 - Determinao dos ciclos de amplificao de amostras por reao em tempo real. A) amplificao de um determinadosegmento gnico que identifica um determinado marcador tumoral em clulas neoplsicas B) amplificao do mesmo segmentognico em clulas no neoplsicas. O Ct pode ser determinado pela interseco da linha do limiar de deteco da reaothreshold, com a linha da amplificao gnica de cada amostra. Observa-se menor Ct (17) para o incio da fase exponencial deamplificao do marcador tumoral em clulas neoplsicas (A), indicando que tal marcador apresenta maior expresso em clulastumorais, comparativamente s clulas no neoplsicas (B), que apresentam Ct=26, isto , menor expresso.

Figura 5 - Tcnicas de RT-PCR por tempo real. A) Reao de tempo real com sistema TaqMan. 1A) sonda fluorescente hibridiza naregio-alvo que deve ser amplificada pelo primer sense. A sonda possui fluorforo ligado na extremidade 5(reporter = R),responsvel pela emisso da fluorescncia e um composto que bloqueia a emisso desta fluorescncia (quencher =Q) 2A) durante aextenso a partir do primer sense, a DNA polimerase cliva o reporter e a fluorescncia emitida 3A) a cada ciclo de amplificaoocorre liberao de fluorescncia, portanto, a reao de amplificao diretamente proporcional fluorescncia emitida. B) Reaode tempo real com sistema SYBR Green. 1B) os fluorforos presentes no SYBR Green ligam-se em toda a dupla fita de DNAformada, emitindo fluorescncia 2B) Durante a desnaturao da dupla fita a fluorescncia drasticamente reduzida 3B) durante aextenso das novas fitas, no processo de polimerizao da DNA polimerase, os fluorforos se ligam s duplas fitas em formao,resultando na emisso de fluorescncia.

TaqMan versus Sybr Green

Comercialmente existem vrias especificaes para os instrumentos disponveis para realizao da tcnica de PCR em tempo real,incluindo diferentes formatos de sondas de cidos nucleicos aplicveis, comprimentos de onda de excitao e deteco de fluorforosespecficos, o nmero mximo de amostras por corrida, volumes de reao e tempos de termociclagem. No entanto, em relao aosreagentes de amplificao, h dois sistemas precursores, SybrGreen e TaqMan, que deram origem a diferentes produtos similares



disponveis atualmente no mercado. Cada um destes sistemas apresenta vantagens e desvantagens, que podem ser observadasanalisando-se a Tabela 1. O mecanismo de funcionamento de ambos os mtodos est ilustrado na Figura 5, itens A e B. Os itens 1, 2e 3A da Figura 5 esquematizam o funcionamento do sistema TaqMan de amplificao de DNA por tempo real. No item 1A pode serobservada a hidridizao de sonda fluorescente na regio complementar-alvo que deve ser amplificada na fita 5-3. A sonda possuium fluorforo ligado na extremidade 5, tambm conhecido por reporter (R), o qual responsvel pela emisso da fluorescncia, e umcomposto denominado quencher (Q) localizado no terminal 3 que impede a emisso da fluorescncia do reprter. Em 2A, durante aextenso a partir do primer sense realizada pela DNA polimerase, ocorre clivagem do reprter, com consequente emisso dafluorescncia, sendo que a cada ciclo de amplificao ocorre liberao de fluorescncia (Figura 5, item 3A), portanto, a reao deamplificao diretamente proporcional fluorescncia emitida. A Figura 5, item B, mostra o funcionamento do sistema SYBR Greende amplificao de DNA por tempo real. Os fluorforos presentes no SYBR Green se ligam em toda a dupla fita de DNA formada,emitindo fluorescncia (Figura 5, item 1B). Durante a desnaturao da dupla fita, a fluorescncia drasticamente reduzida (Figura 5,item 2B). Porm, como podemos verificar no item 3B (Figura 5), durante a extenso das novas fitas por ao da DNA polimerase, osfluorforos se ligam s duplas fitas em formao, resultando na emisso de fluorescncia, que tambm diretamente proporcional amplificao do DNA-alvo6.

Figura 6 - Determinao da curva de dissociao na reao de RT-PCR tempo real. A) curva de dissociao ideal, formao de umnico produto B) formao de dois picos, sendo um com temperatura entre 80 e 87C, relativo ao produto de amplificao e umnico pico de baixa intensidade, com temperatura de dissociao inferior, sugerindo a formao de produto inespecfico na reaode amplificao C) dmeros de primers, formao de uma ondulao na base da curva sugerindo a presena de dmeros de primersou outros produtos inespecficos.

Curva de dissociao dos primers

Para a realizao da curva de dissociao dos primers, tambm denominada curva de melting, deve-se ajustar o aparelho parainiciar a temperatura por volta dos 70C e variar de grau em grau at no mximo 95C. Este procedimento realizado pelo aparelhoaps o ciclo de amplificao da PCR em tempo real. Neste processo pode ser determinado o ponto correspondente temperatura dedissociao dos primers de suas sequncias-alvo. A incluso da curva de dissociao essencial para verificar se houve formao deum nico produto ou se produtos inespecficos tambm foram formados. O aparecimento de um nico pico na curva de meltingsugere a existncia de um nico produto (Figura 6A), porm, se for observado o aparecimento de vrios picos na curva, pode-seconsiderar a hiptese de formao de produtos inespecficos na reao (Figura 6B) ou a eventual formao de dmeros de primers,denominados primer-dimers (Figura 6C). Durante a padronizao da reao se sugere a realizao de eletroforese em gel de agarosepara confirmao da presena destes produtos indesejveis6.

Padronizao da PCR em tempo real

A padronizao da concentrao dos primers de cada amostra realizada com um cDNA-controle, isto , uma amostra de cDNAobtido de clulas ou tecido que apresenta expresso conhecida da sequncia a ser amplificada pelo conjunto de primers. necessriaa realizao de uma diluio seriada dos primers para a padronizao da melhor concentrao para a realizao da amplificao.Sugere-se, primeiramente, a utilizao do cDNA-controle concentrado para a padronizao e os primers variando nas diluies de 0,5M a 3,0 M. Aps a determinao da menor concentrao dos primers capaz de amplificar o cDNA adequadamente, partimos para aelaborao da curva de eficincia. Para obteno da melhor eficincia da reao, devem ser realizadas diluies seriadas em baseduas das amostras de cDNA, utilizando as mesmas concentraes de primers determinadas previamente. Como a amplificao exponencial, deve haver uma diferena de um Ct na amplificao de cada uma das diluies seriadas realizadas, sendo que a maisconcentrada, por exemplo, 1:2, deve apresentar um Ct menor que a mesma amostra diluda 1:4, como podemos observar na Figura 7.Quando traamos uma reta relacionando a potncia da diluio (abscissas) e o Ct (ordenadas), ser obtida a chamada curva deeficincia do primer, a qual deve apresentar o valor de R2 mais prximo possvel de 1 (100%). Se a eficincia do primer for um poucomenor que 100%, a mesma deve ser usada na correo dos clculos de expresso relativa, uma vez que a reao no ir maisapresentar 21 cpias por ciclo e sim 2x, sendo x igual eficincia dos primers. A Figura 8 mostra uma curva de eficincia ideal obtidade uma reao de RT-PCR padronizada para reao de tempo real, evidenciando os valores obtidos de Ct em relao s diferentesconcentraes de amostras de cDNA. Uma srie de fatores pode influenciar esta anlise e a otimizao da reao consiste emcompensar esses fatores para obter a razo de 16.

Aps a padronizao das condies adequadas para a reao e a realizao das amplificaes de DNA, devem ser realizados osclculos para determinao da expresso relativa ou absoluta de DNA nas amostras. Na determinao da expresso relativa deve sercalculada, primeiramente, a relao entre o gene referncia (controle endgeno ou housekeeping) e o gene-alvo (gene em estudo)em todas as amostras. Este ndice denominado DCt. Deve ser calculado o -DDCt, que a correo do DCt das amostras pelo DCt dogrupo controle, o qual pode ser calculado subtraindo-se o DCt da amostra pela mdia dos DCts da triplicata de seus controles. Estevalor deve ser multiplicado por -1. Em seguida, deve-se calcular 2-(DDCt), se a eficincia do primer for 100%, ou seja, se aamplificao estiver sendo feita de maneira exponencial em base 2. Caso contrrio, o nmero 2 deve ser corrigido pela eficincia dosprimers, determinada previamente. O 2DDCt deve ser considerado 1 para a amostra-controle, pois, valor de DCt da amostra, menoso valor obtido da prpria amostra igual a zero e 20 = 1 6.



Figura 7 - Padronizao da reao de RT-PCR tempo real. Diluio em srie das amostras de cDNA-controle obtido de clulas outecidos para a mesma concentrao de primers. A reao de amplificao realizada de forma exponencial, portanto observa-seque a cada diluio do cDNA em base 2, o nmero de ciclos (Ct) aumenta uma vez.

Tanto a expresso gnica relativa quanto a absoluta determinada pela PCR em tempo real utilizam o valor de Ct como referncia paraa quantificao da expresso de determinada sequncia gnica-alvo. Entretanto, na quantificao absoluta o valor Ct comparadocom uma curva padro de amplificao do gene-alvo utilizando-se um padro com concentrao inicial conhecida (nmero de cpiasde DNA/uL) em diferentes diluies. Desta maneira o Ct determinado na amostra desconhecida pode ser relacionado com o Ctdeterminado na curva padro, o qual se relaciona diretamente a uma concentrao especfica de DNA.

Aplicaes da PCR em tempo real

Perfilamento gentico ou microarrayNo campo da pesquisa bsica, a PCR em tempo real tem sido utilizada tambm para a validao de resultados de microarray. Omicroarray uma tcnica de hibridizao que permite a investigao da anlise da expresso de milhares de genes ao mesmotempo. Para tal, utiliza matrizes contendo sondas complementares a diversos genes e permite, por tcnicas de hibridizao com ocDNA-alvo marcado com fluorforo, avaliar a expresso gnica. Alguns arrays possuem todo o genoma de um organismo e podem serutilizados para avaliar alteraes da expresso gnica (transcriptoma). O problema que o mtodo basicamente qualitativo e nopermite uma anlise estatisticamente confivel e de fcil correlao. Por tal motivo a PCR em tempo real utilizada como uma tcnicade apoio para validar e quantificar os genes escolhidos nas anlises de microarray8.

PolimorfismosA identificao de mutaes pontuais (ou polimorfismos de nucleotdeos), muito utilizadas nas reas clnica e de pesquisa bsica,pode ser feita por anlise da curva de dissociao obtida aps a amplificao por PCR em tempo real.

Esta tcnica adequada para avaliar mutaes, incluindo polimorfismos contendo um nico nucleotdeo modificado, substituindomuitas vezes outras tcnicas muito mais trabalhosas e de maior custo como sequenciamento, ensaios de polimorfismo de conformaode fita nica ou anlises de polimorfismo de fragmentos de restrio (RFLP)9.

Para deteco de mutaes na sequncia-alvo necessria a anlise do produto amplificado (amplicon) na curva de dissociao, que realizada automaticamente aps a termociclagem por PCR em tempo real.

Figura 8 - Curva de eficincia ideal para um determinado par de primers. Esta curva desenhada colocando-se a concentraopredeterminada por espectrofotometria dos cDNAs diludos no eixo das abscissas e o Ct para amplificao de cada cDNA no eixo dasordenadas utilizando-se para tal reao um determinado par de primers. A reta mdia traada a partir da mdia de Cts de cadadiluio de cDNA deve apresentar seu R2 o mais prximo possvel de 1,00, indicando 100% de eficincia de um determinado par deprimers em amplificar o cDNA-alvo exponencialmente a cada ciclo.

Portanto, para a deteco destas mutaes necessria a utilizao da tcnica de PCR em tempo real baseada no uso de sondas dehibridizao, denominada FRET (fluorescence resonance energy transfer - energia de ressonncia transferida por fluorescncia).Nesta tcnica so utilizadas duas sondas de DNA desenhadas que sofrem hibridizao prximas, no produto da PCR, sendo que aextremidade 3 da primeira sonda fique prxima extremidade 5 da sonda adjacente. A primeira sonda apresenta um fluorforo ligadoa sua extremidade 3 e a segunda sonda apresenta um fluorforo aceptor da fluorescncia emitida pela primeira sonda em suaextremidade 5. Se ambas as sondas sofrem hibridizao, o produto-alvo da PCR, a fluorescncia da extremidade 3 absorvida peloaceptor localizado na extremidade 5 da segunda sonda e, assim, o segundo fluorforo excitado e emite luz em outro comprimentode onda, o qual detectado pelo aparelho. Se as duas sondas no hibridizam, devido a no existncia de uma sequncia de DNAcomplementar, no ocorre o FRET entre os dois fluorforos e, consequentemente, no h emisso da ltima fluorescncia10.

Como a temperatura aumenta durante a curva de melting, a sonda doadora de fluorescncia ir dissociar-se do amplicon, resultandoem uma diminuio da fluorescncia. Se houver qualquer mutao na regio de hibridizao do amplicon, a sonda doadora ligar demaneira mais fraca e se dissociar do amplicon em temperaturas mais baixas11.

Genotipagem e discriminao allicaAlm da anlise da curva de melting, a tcnica de PCR multiplex tambm pode ser aplicada. Neste caso vrios produtos gnicosdiferentes so amplificados no mesmo tubo. Em tal ensaio so utilizados primers sintticos marcados com fluorforos com emisso emdiferentes comprimentos de onda, permitindo a mltipla deteco dos polimorfismos. Entretanto, este tipo de ensaio apresenta maiordificuldade de realizao, pois conforme os diferentes produtos se acumulam durante o processo, as diferentes reaes competempelos reagentes. Para minimizar este problema, devem ser utilizadas quantidades limitantes de primers devendo ser muito bemdesenhados para evitar complementaridade entre si. Alm disso, a utilizao de sondas preferencial ao uso de primers marcadoscom fluorescncia3. Este tipo de anlise pode ser aplicada na genotipagem de indivduos ou organismos experimentais permitindo, porexemplo, a discriminao allica ou a deteco de mutaes pontuais que predisponham os indivduos a doenas genticasparticulares.

Deteco de translocaes cromossmicasEm relao s aplicaes em oncologia, a PCR em tempo real permite a deteco e, em certos casos, a quantificao detranslocaes cromossmicas ou de seus transcritos de fuso gnica em uma amostra do paciente para uso na determinao dedoena residual mnima ou para avaliar a possibilidade de progresso da doena. Pode ser citada, como exemplo, a deteco dealguns dos possveis produtos de rearranjos encontrados na leucemia linfoblstica aguda, a avaliao do produto de fuso do geneAML-1/MTG8 utilizado como marcador de doena residual mnima na leucemia mieloblstica aguda, a resposta de pacientes aotratamento com interferon por medida do produto de fuso dos genes BCR-ABL, frequentemente encontrado na leucemia mieloidecrnica, entre outros12.



Farmacogentica

O uso da PCR em tempo real no campo da farmacogentica tem sido ampliado atualmente no intuito de analisar a expresso gnicaem resposta a determinados tratamentos medicamentosos. Tal anlise permite uma melhor seleo do medicamento para um pacientee permite a determinao da cintica de ao de um medicamento atravs da avaliao da expresso do gene-alvo em resposta aotratamento ou a resposta de transportadores ou enzimas do metabolismo que facilitem a distribuio ou a eliminao do frmaco.Pode, ainda, auxiliar no teste de novos medicamentos e na verificao de seu potencial mutagnico, por exemplo13. A resposta aosmedicamentos varia muito entre os indivduos, o que faz com que a escolha de um determinado frmaco seja muitas vezes difcil.Diversos fatores genticos afetam o metabolismo e o transporte de medicamentos no organismo, sendo as principais causas davariao individual ao tratamento medicamentoso. A existncia de polimorfismos nos genes que codificam para as enzimas quemetabolizam medicamentos separa a populao em geral em diferentes classes de indivduos em funo de suas capacidadesmetablicas relacionadas a uma determinada enzima. Dessa maneira os mtodos de genotipagem permitem determinar ou predizer ostatus metablico do indivduo e saber se ele apresentar o risco de ineficcia ou de toxicidade a um determinado medicamento quedepende de uma determinada enzima para exercer sua atividade. A validao clnica de testes farmacogenticos ir contribuir demaneira significativa para o rpido desenvolvimento da farmacogentica dentro da prtica mdica corrente, com a perspectiva de umaindividualizao do tratamento medicamentoso e melhora na resposta teraputica. Diversos estudos farmacogenticos tm sidorealizados na rea oncolgica, permitindo um tratamento cada vez mais individualizado e eficiente14,15.

O uso do tempo real em microbiologia e doenas infecto-contagiosas

A PCR em tempo real tambm permite a distino de sequncias especficas dentro de uma mistura complexa de DNA o que faz comque, na rea de apoio ao diagnstico, tal tcnica seja utilizada na determinao especfica da presena e quantidade dedeterminados vrus, bactrias ou fungos. Devido relao entre a carga viral e a gravidade da doena, a PCR em tempo real, por serum mtodo quantitativo, capaz de mensurar indiretamente a progresso da doena e a eficcia das terapias antivirais.

O uso da PCR em tempo real na deteco e identificao de bactrias tambm um campo em expanso. Atualmente, quando umaamostra chega ao laboratrio clnico necessrio primeiro que a bactria presente na amostra cresa em meio de cultura, somenteassim a mesma pode ser identificada de maneira presuntiva. Ainda, para determinar o espectro de sensibilidade aos antibiticos decada cepa, a mesma deve crescer em uma placa contendo meio de cultura na presena de pequenos discos de papel impregnados deantibiticos, ou seja, a identificao associada ao antibiograma demora no mnimo trs dias para ser concluda. A substituio desteprocesso pelo uso da PCR em tempo real, principalmente no sentido de viabilizar o rpido acesso ao espectro de sensibilidade dabactria, facilitaria infinitamente a prescrio adequada de antibiticos. Um dos principais impactos sentidos seria a minimizao dautilizao em massa de antibiticos de amplo espectro de alta potncia em casos desnecessrios, reduzindo os custos associados.Alm disso, permitiria a deteco precoce de cepas multirresistentes a antibiticos, evitando sua disseminao16.

A PCR em tempo real tem sido utilizada na deteco de Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes,e Neisseria gonorrhoeae. A anlise de mutaes tem permitido monitorar a resistncia aos antibiticos de cepas de Staphylococcusaureus, Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium12.

Um crescente volume de artigos publicados demonstra a utilidade da PCR em tempo real relacionada rea microbiolgica. A elevadasensibilidade e especificidade, associada a um curto tempo para a liberao dos resultados e facilidade de realizao da tcnica, temfeito da PCR em tempo real uma metodologia atrativa na substituio da cultura convencional e dos ensaios baseados em antgenos(10).

Entretanto existem limitaes no uso da PCR em tempo real aplicada microbiologia. Em contraposio aos mtodos de culturabacteriana tradicionais, esta tcnica baseada na amplificao do DNA bacteriano e, portanto, no diferencia entre patgenos vivose mortos12. A associao de ambas as tcnicas: crescimento tradicional da bactria em meios de cultura, com posterior identificaoe determinao do espectro de sensibilidade a antibiticos por PCR em tempo real poderia ser uma estratgia adotada para controlareste problema.

As bactrias tradicionalmente identificadas por imunoensaios diretos, tais como estreptococos do grupo A, comuns em infeces degarganta e Clostridium difficile e Escherichia coli O157:H7 presente nas fezes, possuem disponveis reagentes e kits especficos parasua deteco por tempo real, como, por exemplo, o Light-Cycler Strep-A para uso no LightCycler da Roche Diagnostics Corporationpara deteco de estreptococos do grupo A e os kits IDI-StrepB assay para uso com o SmartCycler, da Infectio Diagnostics, Inc.,Sainte-Foy, Quebec, Canada LightCycler StrepB pts1, Roche Diagnostics Corporation para deteco de estreptococos do grupo B10.

As bactrias de crescimento lento e/ou difcil em cultura tambm se beneficiaram das tcnicas de tempo real para sua identificao,como exemplos podem ser citadas: Anaplasma phagocytophila, Bartonella henselae, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Ehrlichiaspp., Legionella spp., Mycoplasma pneumonia, Chlamydophila pneumonia, assim como bactrias para as quais ainda no existemmtodos de identificao tais como a Tropheryma whipplei. A PCR em tempo real tem sido utilizada tambm na identificao deagentes causadores de pneumonia comunitria, tais como: Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. eStreptococcus pneumoniae, de agentes causadores da meningite: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilusinfluenzae10.

Por ser uma tcnica que permite a obteno de resultados rpidos, a PCR em tempo real tem sido utilizada atualmente naidentificao de potenciais agentes de bioterrorismo, tais como Bacillus anthracis e Yersinia pestis.Outro campo de aplicao da PCR em tempo real dentro da microbiologia a identificao de genes bacterianos envolvidos naresistncia teraputica com antibiticos em contraposio s tcnicas de antibiograma em placa. Tal abordagem essencial para aidentificao de cepas de Staphylococcus aureus meticilina (oxacilina)-resistentes (MRSA) ou Enterococcus spp. resistentes avancomicina (VRE), as quais representam uma ameaa sade e altos custos associados. Dois fabricantes apresentam kitscomercialmente disponveis na deteco de VRE ou MRSA utilizando plataformas de tempo real: a Infectio Diagnostic, Inc., querecebeu aprovao de um kit para deteco direta de MRSA de swabs nasais utilizando o aparelho SmartCycler. A RocheDiagnostics Corporation possui o ensaio de deteco para VRE (Light Cycler vanA/vanB) e para MRSA (LightCycler mecA detectionassay), ambos padronizados para uso no LightCycler10.

Tambm foram desenvolvidos pares de primers que permitem a distino pela PCR em tempo real de polimorfismos referentes aos locinarG, oxyR, and RD1 do complexo de Mycobacterium tuberculosis, permitindo a diferenciao entre Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium bovis e Mycobacterium bovis BCG, respectivamente10.

A PCR em tempo real tem sido padronizada para a deteco e quantificao de patgenos virais em humanos. Dentre eles podemosdestacar: vrus do herpes simples, vrus do varicella Zoster, citomegalovrus, Epstein-Barr vrus, enterovrus, poliomavrus, parvovrus,vrus do sarcoma de Rous, parinfluenza, influenza, entre outros10,17. Na rotina assistencial de alguns laboratrios de referncia seuemprego limitado para determinao da carga viral, com poucas excees, de um grupo reduzido de vrus com grande interesseeconmico, para os quais esto disponveis kits comerciais bem padronizados. Dentre eles podemos citar o HIV-1 e 2 e os vrus dashepatites.

Os primeiros testes aplicados na deteco do HPV, vrus do papiloma humano, que possui diversos subtipos associados aodesenvolvimento do cncer de colo uterino, foram desenvolvidos baseados nas tcnicas de biologia molecular com o uso de sondas deoligonucleotdeos marcadas com fsforo radioativo complementares s sequncias dos subtipos oncognicos. Estes testes no erammuito eficientes porque no conseguiam detectar vrios subtipos de HPV ao mesmo tempo. O kit atual de deteco dos HPVs porcaptura hbrida detecta os subtipos atravs de dois grupos de sondas fluorescentes diferentes misturadas: as capazes de detectar ossubtipos de alto risco e as capazes de detectar os de baixo risco, entretanto no capaz de discernir qual o subtipo especfico queest alterado dentro destes grupos. Com o uso da PCR em tempo real se consegue determinar no somente o gentipo do vrus, mastambm a carga viral a partir das curvas de cintica resultantes do ensaio18. A atual pandemia causada pelo vrus da influenza A(H1N1)v tornou necessria a procura por metodologias que permitissem a distino entre os diferentes tipos de vrus da influenza. Amaior parte dos laboratrios mundiais realizava somente a deteco do vrus influenza responsvel pela gripe comum. Recentemente,pesquisadores desenvolveram ensaios que utilizam a tcnica de PCR em tempo real para identificar facilmente os tipos e subtipos dos



vrus da influenza A e B19.

Algumas reaes de PCR multiplex esto sendo realizadas com o intuito de permitirem a deteco simultnea de patgenos em casosde suspeita de coinfeco, comuns em alguns tipos de doena, como na Aids. Nestes casos so detectados simultaneamente, porexemplo, o vrus da imunodeficincia humana-1 (HIV-1) e o Treponema pallidum, agente etiolgico causador da sfilis20.

Na deteco de adenovrus, testes cada vez mais otimizados e rpidos tm sido desenvolvidos. Um novo mtodo conhecido comoHyper-PCR utiliza uma enzima Taq DNA polimerase de alta velocidade e um tubo com espessura fina que permite mudanas detemperatura decorrentes da termociclagem ainda mais rpidas em um aparelho especial. O tempo total na deteco de adenovrus poresta metodologia, excluindo o tempo referente a extrao do material gentico, de 17 minutos, ou seja, bem inferior PCR emtempo real convencional a qual, neste caso, teve como tempo de durao 62 minutos (21).

Em relao aplicao da PCR em tempo real na deteco de fungos, os principais ensaios padronizados tiveram como alvo diferentesespcies de Aspergillus. A razo para tal esforo o fato de que a rpida deteco de Aspergillus spp. pode reduzir a extensamorbidade e mortalidade associadas aspergilose invasiva. Alguns ensaios foram desenvolvidos para a deteco de outros fungos,tais como Candida spp. e Pneumocystis jiroveci. Na deteco de parasitas a PCR em tempo real tem sido aplicada principalmente nadeteco do agente etiolgico causador da malria, o Plasmodium falciparum. Alguns outros parasitas possuem ensaios padronizados,tais como: Babesia, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania, Trichomonas, Cryptosporidium, Entamoeba e Giardia spp10.

Na indstria alimentcia e na agricultura a PCR em tempo real tem sido utilizada na identificao de micrbios, parasitas ou organismosgeneticamente modificados. Na rea forense o uso desta tcnica permite resultados de elevada sensibilidade, especificidade evelocidade, o que de grande valia em maior parte das investigaes criminais em que o tempo crucial para a soluo do caso e aquantidade de amostra normalmente limitada22.

Concluso

Nos ltimos anos a reao em cadeia de polimerase por tempo real emergiu como uma tcnica amplamente utilizada na investigaobiolgica devido capacidade de amplificao e deteco simultneas de quantidades muito pequenas de sequncias especficas decidos nucleicos. Como uma ferramenta de pesquisa extremamente til na determinao da expresso gnica resultante da ao dediversos fatores. No diagnstico clnico-molecular a PCR em tempo real pode ser utilizada para avaliao da carga viral ou bacteriana,determinao da resistncia a antibiticos e at mesmo para o prognstico de tumores malignos.

Devido realizao das etapas de amplificao dos cidos nucleicos e deteco do produto amplificado no interior de um nico tubodurante a PCR em tempo real traz inmeras vantagens na utilizao desta tcnica como ferramenta na pesquisa e diagnstico. Dentreelas podemos citar: reduo do risco de contaminao cruzada, curto tempo necessrio para a realizao da tcnica, permite rpidosresultados, alm de apresentar execuo simples associada excelente sensibilidade e especificidade. Cumpre ser observado queatualmente a utilizao das tecnologias de amplificaes por tempo real ainda permanecem com uso limitada devido aos elevadoscustos relacionados aos reagentes e, principalmente, aos sistemas de deteco empregados. Entretanto, tal vis possui a tendnciade resoluo em curto prazo com a ampliao e importncia das aplicaes multidisciplinares do uso rotineiro da PCR e RT-PCR emtempo real, como citado neste artigo.

Bibliografia

1. Temin HM, Baltimore D. RNA-directed DNA synthesis and RNA tumor viruses. Adv Virus Res. 1972 17:129-86.2. Dheda K, Huggett JF, Bustin SA, Johnson MA, Rook G, Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression inreal-time PCR. Biotechniques. 200437:112-4.3. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonak J, Lind K, et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol AspectsMed. 2006 27:95-125.4. Stahlberg A, Hakansson J, Xian X, Semb H, Kubista M. Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. ClinChem. 2004 50:509-15.5. Wang X, Seed B. A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Res. 2003 19: 796-802.6. Ponchel F, Toomes C, Bransfield K, Leong FT, Douglas SH, Field SL, et al. Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: analternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions.BMC Biotechnol. 2003 13 3:18.7. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996t 6:986-94.8. Provenzano M, Mocellin S. Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR. Adv ExpMed Biol. 2007 593:66-73.9. Edwards K LJ, and Saunders N. Real-time PCR: an Essential Guide. London: Horizon Bioscience 2004.10. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications forroutine laboratory testing. Clin Microbiol Rev. 200619:165-256.11. Ruiz-Ponte C, Carracedo A, Barros F. Duplication and deletion analysis by fluorescent real-time PCR-based genotyping. Clin ChimActa. 2006 363:138-46.12. Valasek MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ. 200529:151-9.13. de Chaisemartin L, Loriot MA. [Pharmacogenetics of anticancer drugs.]. Pathol Biol (Paris). 2005 53:116-24.14. Allorge D, Loriot MA. [Pharmacogenetics or the promise of a personalized medicine: variability in drug metabolism and transport].Ann Biol Clin (Paris). 2004 62:499-511.15. Ma BB, Hui EP, Mok TS. Population-based differences in treatment outcome following anticancer drug therapies. Lancet Oncol.2010 11:75-84.16. Garcia de Viedma D. Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches. ClinMicrobiol Infect. 2003 9:349-59.17. Costa J. [Real-time PCR]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004 22:299-304.18. Hubbard RA. Human papillomavirus testing methods. Arch Pathol Lab Med. 2003 127:940-5.19. Schulze M, Nitsche A, Schweiger B, Biere B. Diagnostic approach for the differentiation of the pandemic influenza A(H1N1)v virusfrom recent human influenza viruses by real-time PCR. PLoS One 2010 5:e9966.20. Tang J, Zhou L, Gao W, Cao X, Wang Y. Visual DNA microarrays for simultaneous detection of human immunodeficiency virustype-1 and Treponema pallidum coupled with multiplex asymmetric polymerase chain reaction. Diagn Microbiol Infect Dis. 200965:372-8.21. Fujimoto T, Konagaya M, Enomoto M, Tsuboi K, Hashimoto K, Taniguchi K, et al. Novel high-speed real-time PCR method (Hyper-PCR): results from its application to adenovirus diagnosis. Jpn J Infect Dis.2010 63:31-5.22. Wu YY, Csako G. Rapid and/or high-throughput genotyping for human red blood cell, platelet and leukocyte antigens, and forensicapplications. Clin Chim Acta. 2006 363:165-76.

Moreira Jr Editora _ RBM Revista Brasileira de Medicina

Documents

Transcript of Moreira Jr Editora _ RBM Revista Brasileira de Medicina