Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas

Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira

Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro.

Métodos de

Purificação de

Proteínas Nativas

Métodos de Purificação de Proteínas

1. Trabalhando com proteínas;

2. Purificação Proteica;

3. Métodos Cromatográficos;

4. Análise de Proteínas.

Trabalhando com Proteínas

• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais;

• Separadas de outras de forma pura, para a determinação de suas propriedades;

• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.

Trabalhando com Proteínas

• SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!!

• Usar tampão correto (pH, cofatores, estabilizadores, etc.)

Trabalhando com Proteínas

Como purificar uma proteína

Métodos clássicos

Diferença de propriedades das proteínas: carga,

tamanho, ligantes.

Métodos modernos

Clonagem de DNA, sequenciamento

genômico, chips de proteínas, etc.

Trabalhando com Proteínas

• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.

• Mais de um método de purificação utilizado.

• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.

• Iniciar com métodos de baixo custo.

Estratégia Geral para Obtenção da Proteína

Purificada

• Extração Isolamento

1. Material de Partida ------ Extrato Bruto

2. Desintegração celular

Fracionamento

•Solubilidade

•Tamanho

•Carga

•Afinidade Ligação

Separação

Diálise

Ultra filtração

Coluna Cromatografica

Purificação Proteica: Fonte Proteica

Purificação Proteica: Isolamento

Extrato Bruto

Agitação com pequenas partículas (beads)

Material Duro

French Press

Choque osmótico • Transferência rápida de uma solução isotônica

para uma solução hipotônica. • Devido a osmose as células ficam túrgidas

provocando a lise da membrana.

Ruptura por tratamento químico • Usa-se solvente orgânico ou detergente para

romper diferentes tipos de tecidos, células e organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e ácidos.

Material Mole

Vamos começar a purificação!

• Centrifugação diferencial é usada para separar organelas, pedaços de membranas e citosol (fração solúvel do citoplasma) do extrato celular.

Centrifugação diferencial

Purificação Proteica: Fracionamento

• Fracionamento Separação das proteínas do extrato em diferentes frações com base no tamanho, carga.

Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros fatores.

Diferenças na solubilidade proteica

Purificação Proteica: Fracionamento

• Salting out

• Precipitação proteica com elevada concentração salina.

• ((NH4)2SO4) sulfato de amônio

• A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução

Purificação Proteica: Preparação

• Solução proteica passa por modificações para uma purificação eficiente.

• Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas.

• Ex: Remoção de sulfato de

amônio da amostra.

Métodos Cromatográficos

• Poderoso método de fracionamento.

• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.

• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.

Cromatografia em Coluna

Lehninger, 5ª ed. 2010

Métodos Cromatográficos

Tipos de Cromatografia em Coluna:

o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);

o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;

o Afinidade;

o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).

Cromatografia de troca iônica

• Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH.

• Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos);

o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).

Cromatografia de troca iônica

• Afinidade afetada:

o pH (determina o estado de ionização da molécula);

o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.

Cromatografia de troca catiônica

• Matriz carregada negativamente.

• Proteínas com carga líquida positiva migram mais lentamente.

• Expansão da solução proteica na fase móvel: o separação de proteínas com diferentes

propriedades

o espalhamento difusional.

Lehninger, 5ª ed. 2010

Cromatografia de troca catiônica

• Tamanho da coluna aumenta, a resolução de dois tipos de proteínas com cargas líquidas também aumenta.

• A velocidade da solução proteica diminui com o tamanho da coluna.

• Quanto mais devagar a solução proteica gasta na coluna, a resolução diminui (espalhamento difusional).

Cromatografia de exclusão por tamanho

• Ou gel-filtração.

• Separação por tamanho.

• Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico.

• Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas.

Cromatografia de exclusão por tamanho

• Proteínas grandes não entram nas cavidades e são eluídas mais rapidamente.

• Enquanto proteínas menores percorrem um caminho maior dentro dos poros.

Lehninger, 5ª ed. 2010

Cromatografia de afinidade

• Baseado na afinidade de ligação.

• Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado).

• Proteínas com afinidade se ligam ao ligante.

Lehninger, 5ª ed. 2010

Cromatografia de Afinidade

Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada

Proteínas ligadas podem

ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes

• Formado um complexo entre proteína e ligante.

• As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna.

• Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre.

• O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante.

• O ligante livre se liga a coluna de afinidade.

Lehninger, 5ª ed. 2010

Cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC)

• Bombas de alta pressão aceleram o movimento de moléculas de proteína através da coluna.

• Reduzindo o tempo de trânsito na coluna, a difusão de bandas é diminuída e a resolução aumentada.

Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a

pureza da amostra?)

• Absorbância 280nm

• SDS-PAGE

A280

A280

Eletroforese de Proteínas

• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.

• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.

• Contribui com grande carga negativa. • SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente

as proteínas, assumindo forma semelhantes.

Eletroforese de Proteínas

Ação do SDS

SDS-PAGE

Eletroforese de Proteínas

Vantagens

• Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas.

• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.

• Permite determinação do ponto

isoelétrico e massa molecular

aproximada.

Eletroforese de Proteínas

• Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular.

• Polipeptídeos menores migram mais rápido.

• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.

• Aproximação da massa

molecular para proteínas

desconhecidas.

Eletroforese Bidimensional

• Combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE.

• Separação de mistura complexa proteica.

• Mais sensível que os métodos

isolados.

• Massa molecular e pI.

Resumindo...

• Proteínas são separadas e purificadas com base nas diferenças de suas propriedades.

• Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por mudanças no pH ou temperatura e, particularmente, pela adição de certos sais.

• Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de tamanho, afinidades de ligação, carga e outras propriedades

• Todos os procedimentos de purificação exigem um método para quantificação ou análise da proteína de interesse na presença de outras proteínas.

Proteina X • Citoplasmática • Peso molecular (616,487 g/mol) • Caráter ácido • Possui calda poli His

Proteina X • Coletar o material • Romper a membrana celular para liberação do

EXTRATO BRUTO • Centrifugar • Descartar as partes que não serão utilizadas e

manter as partes utilizáveis • Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose)

Próxima aula: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes