NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO DA VASSOURA DE …

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL

DE PERNAMBUCO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM FITOPATOLOGIA

Tese de Doutorado

NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO

DA VASSOURA DE BRUXA DO CACAUEIRO

Antônio Alves Pimenta Neto

Recife – PE

2016

ii

ANTÔNIO ALVES PIMENTA NETO

NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO DA VASSOURA DE BRUXA DO

CACAUEIRO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Fitopatologia da Universidade Federal Rural de

Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do

título de Doutor em Fitopatologia.

COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:

Orientador(a): DELSON LARANJEIRA

Co-Orientador(a): EDNA DORA MARTINS NEWMAN LUZ

RECIFE-PE

FEVEREIRO – 2016

iii

Ficha Catalográfica

P644n Pimenta Neto, Antônio Alves.

Novos componentes para o manejo da vassoura de bruxa do

cacaueiro / Antônio Alves Pimenta Neto. – Recife, 2016.

142 f. : il.

Orientador: Delson Laranjeira.

Tese (Doutorado em Fitopatologia) – Universidade Federal

Rural de Pernambuco, Departamento de Agronomia, Recife, 2016.

Inclui referências.

1. Theobroma cação. 2. Manejo integrado. 3. Leveduras nativas.

4. Melhoramento genético. 5. Biocontrole. I. Laranjeira, Delson,

Orientador. II. Título

CDD 632

iv

NOVOS OMPONENTES PARA O MANEJO DA VASSOURA DE BRUXA DO

CACAUEIRO

ANTÔNIO ALVES PIMENTA NETO

Tese defendida e aprovada pela Banca Examinadora em: 26/02/2016

ORIENTADOR(A):

____________________________________________________

DELSON LARANJEIRA

EXAMINADORES:

_____________________________________________________

EDNA DORA MARTINS NEWMAN LUZ (CEPLAC)

_____________________________________________________

JOSÉ LUIZ BEZERRA (UFRB)

_____________________________________________________

ELINEIDE BARBOSA DE SOUZA (UFRPE)

_____________________________________________________

MARCO AURÉLIO SIQUEIRA DA GAMA (UFRPE)

RECFE-PE

FEVEREIRO – 2106

v

Ao Grande Arquiteto do Universo, por

me conceder a vida, e oportunidade diária de

crescimento e evolução. Aos meus amados pais

Joel e Islene, meus irmãos Felipe e Renata, e a

Thaís pelo companheirismo, apoio e amor

incondicional.

DEDICO

vi

A existência na Terra é um livro que estás escrevendo...

Cada dia é uma página...

Cada hora é uma afirmação de tua personalidade, através das pessoas e das situações que te

buscam.

Não menosprezes o ensejo de criar uma epopéia de amor em torno de teu nome.

As boas obras são frases de luz que endereças à Humanidade inteira.

Em cada resposta aos outros, em cada gesto para com os semelhantes, em cada manifestação

dos teus pontos de vista e em cada demonstração de tua alma, grafas com tinta perene, a

história de tua passagem...

CHICO XAVIER

A sabedoria não é um produto da escolaridade, mas

da tentativa, ao longo de uma vida, para obtê-la

ALBERT EINSTEIN

O rio atinge seus objetivos, porque

aprendeu a contornar obstáculos.

LAO-TSÉ

AGRADECIMENTOS

Ao Grande Arquiteto do Universo, por me conceder saúde, sabedoria e segurança,

para manter sempre de pé e a ordem diante das provas e desafios;

Aos meus pais por sempre me incentivarem e abrirem mão de seus sonhos para a

realização dos meus;

Aos meus irmãos, Renata e Felipe, pelo incentivo e companheirismo;

À Thaís, pela tolerância, cumplicidade, companheirismo, amor, paciência e incentivo;

À professora Dra. Edna Dora Martins Newman Luz, pela orientação durante todos

estes anos trabalhos, pela amizade e carisma;

Ao Professor Delson, pelo apoio e ensinamentos;

Aos professores Dra Ana Paula T. Uetanabaro, Dr Eduardo Gross, Dr Carlos Priminho

e Dra Andréa Costa, pela orientação e disponibilização dos Laboratórios de Microbiologia,

Microscopia Eletrônica e Proteômica da UESC;

Aos pesquisadores MSc Dilze A. Magalhães, Dr Givaldo Niella e Dr João de Cássia,

Dra Karina Gramacho, Dra Elizabeth Duarte, Dr Thiago Oliveira, pelo incentivo e instrução

nas tomadas de decisão;

Ao Dr José Luiz Pires pela colaboração científica desde o planejamento à execução e

discussão, além disponibilização de recursos para a realização dos experimentos;

Aos técnicos, operários de campo, bolsistas e a todos os funcionários da CEPLAC

(Cenilda, Joel, Maguinaldo, Orlando, Ananias, Elenízio, Orlando, Belmiro, Virgínia, Ana

Rosa, Catarino, Edarcy (Tita), Lourdes (Lurdinha), Denise, Laiane, João Marcos, William,

Francis, Tacila, Carolina, Elizângela, Gisele, Raquel, Carlisly e Vanessa), pela colaboração na

execução das atividades e manutenção de mudas em casa de vegetação;

À Universidade Federal Rural de Pernambuco pelo apoio institucional e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de

bolsa de estudo;

À Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, pela estrutura e recurso

concedido;

Aos amigos e irmãos pelo incentivo e por suportarem as ausências e afastamento

durante esta fase tão importante na minha vida. Enfim, a todos aqueles que de forma direta ou

indireta participaram da minha trajetória me incentivando a seguir em frente e nunca desistir

principalmente nos momentos mais difíceis.

8

SUMÁRIO

RESUMO GERAL ................................................................................................................... 10

GENERAL ABSTRACT .......................................................................................................... 11

CAPÍTULO 1 - 1 INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................... 13

1.1 O CACAUEIRO (Theobroma cacao L.) E A CULTURA DO CACAU.................... 13

1.2 A VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO ...................................................... 16

1.4 MANEJO INTEGRADO DA VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO .......... 20

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 23

CAPÍTULO 2 - SELEÇÃO DE PROGÊNIES DE CACAUEIRO QUANTO A

RESISTÊNCIA À VASSOURA DE BRUXA E MONILÍASE ............................................. 50

Resumo - ........................................................................................................................... 51

Introdução .......................................................................................................................... 52

Material e métodos ............................................................................................................ 53

Resultados e Discussão ..................................................................................................... 56

Referências ........................................................................................................................ 62

CAPÍTULO 3 - DIVERSIDADE E ANTAGONISMO DE LEVEDURAS NATIVAS

CONTRA O AGENTE DA VASSOURA DE BRUXA DO CACAUEIRO ........................... 71

Resumo .............................................................................................................................. 72

Abstract ............................................................................................................................. 73

Introdução .......................................................................................................................... 74

Materiais e Métodos .......................................................................................................... 75

Resultados ......................................................................................................................... 81

Discussão ........................................................................................................................... 87

Conclusões ........................................................................................................................ 91

Agradecimentos ................................................................................................................. 91

Referências ..................................................................... Erro! Indicador não definido.91

CAPÍTULO 4 - LEVEDURAS NATIVAS COMO POTENCIAIS AGENTES DE

BIOCONTROLE À VASSOURA DE BRUXA E PROMOTORES DE CRESCIMENTO EM

PLÂNTULAS DE CACAUEIRO .......................................................................................... 109

Resumo ............................................................................................................................ 110

Abstract ........................................................................................................................... 111

Introdução ........................................................................................................................ 111

Material e Métodos .......................................................................................................... 113

9

Resultados ....................................................................................................................... 119

Discussão ......................................................................................................................... 123

Conclusões ...................................................................................................................... 127

Agradecimentos ............................................................................................................... 128

Referências ...................................................................................................................... 128

CONCLUSÕES GERAIS....................................................................................................... 143

10

RESUMO GERAL

A vassoura de bruxa (VB) é considerada a principal doença do cacaueiro no Brasil. Os

objetivos deste trabalho de tese foram: 1. Gerar uma população de cacaueiros resistentes à VB

e que, preventivamente, também carreguem em sua estrutura genética, genes de clones que

tem indicativo, através de testes realizados em outros países, resistência a monilíase (MN)

(praga quarentenária A1); 2. Avaliar a diversidade de fungos leveduriformes presentes na

superfície de órgão vegetais de genótipos de cacaueiro, selecionados para a resistência à VB e

MN; 3. Estudar os mecanismos que permitem a colonização e o estabelecimento das

leveduras nos substratos vegetais em condições de cultivo, e seu efeito no crescimento e

esporulação de Moniliophthora perniciosa (Mp); 4. Avaliar a capacidade de leveduras nativas

no controle da VB e, na promoção de crescimento em plântulas seminais. Dos 59

cruzamentos avaliados, 58 geraram grupos de progênies que diferiram significativamente

(p<0,05) de catongo e 52 de SIC 23, padrões de suscetibilidade. Progênies de nove

cruzamentos, diferiram significativamente (p<0,05) do padrão de resistência SCA 6,

demonstrando alto potencial para seleção quanto a resistência à VB. Houve destaque para os

descendentes diretos de materiais oriundos da Amazônia Brasileira (CAB) e clones que foram

adicionados à população como portadores de resistência a monilíase, a exceção do clono ICS

95 que gerou grupos de indivíduos com índice de doença médio similar à testemunha

suscetível. Todas as leveduras caracterizadas molecularmente, foram pela primeira vez

identificadas na microbiota epifítica de órgãos vegetais do cacaueiro e, mesmo apresentando

comportamentos distintos para as variáveis analisadas, são potenciais agentes de biocontrole

da vassoura de bruxa do cacaueiro. As leveduras LEV 169 (Rhodosporidium sp.) e LEV 207

(Hannaella sp.) se destacaram nos testes in vitro por inibirem 87,5% dos basidióporos e 100%

o crescimento micelial de Mp em meio líquido, respectivamente. Os isolados LEV 207 e LEV

179 (Rhodosporidium sp.) foram responsáveis pelos maiores níveis de controle, tanto em

plântulas quanto na inibição da produção de basidiomas em vassouras secas. O trabalho de

tese apresenta dois novos grupos de integrantes para o manejo da vassoura de bruxa do

cacaueiro: 1. Progênies de cacaueiro portadoras de genes de resistência à VB obtidos de

diferentes origens; 2. Leveduras nativas com ação inibitória contra Mp, efetivas no controle

da VB e possibilidade de associação com utilização de fungicidas cúpricos.

Palavras-chaves: Theobroma cacao, manejo integrado, leveduras nativas, melhoramento de

plantas.

11

GENERAL ABSTRACT

The witches' broom (WB) is considered the main disease of cacao in Brazil. The objectives of

this thesis were: 1. Generate a population of cocoa trees resistant to WB and preventively also

carry in their genetic structure, clone genes has indicated, through tests conducted in other

countries, moniliasis resistance (MN ) (A1 quarantine pest); 2. Evaluate the diversity of yeast

fungi present in the plant body surface cacao genotypes, selected for resistance to WB and

MN; 3. To study the mechanisms that allow the colonization and the establishment of yeast in

plant substrates in cultivation conditions and their effect on growth and sporulation of

Moniliophthora perniciosa (Mp); 4. To assess the ability of native yeasts in controlling the

WB and the growth promotion in seminal seedlings. Of 59 crosses this, 58 groups generated

progeny that differed significantly (p <0.05) of catongo and 52 of SIC 23, susceptibility

patterns. Progeny nine intersections, differed significantly (p <0.05) resistance pattern SCA 6,

showing high potential for selection for resistance to WB. There was emphasis on the direct

descendants of materials from the Brazilian Amazon (CAB) and clones that were added to the

population as moniliasis resistance carriers, except for the clonus ICS 95 generating groups of

individuals with similar medium disease index to the susceptible control. All yeasts

molecularly characterized, were first identified in the epiphytic microflora of plant organs of

the cacao tree, and even with different behaviors for the variables are potential biocontrol

agents witch's broom cacao. The LEV 169 yeast (Rhodosporidium sp.) And LEV 207

(Hannaella sp.) Stood out in vitro in tests to inhibit 87.5% of basidióporos and 100% mycelial

growth in liquid medium Mp, respectively. Isolated LEV LEV 207 and 179 (Rhodosporidium

sp.) Were responsible for the highest levels of control, both in seedlings and in the inhibition

of the mushroom production in dry brooms. The thesis presents two new members of groups

for the management of witches' broom disease of cocoa: 1. Progeny of cocoa with WB

resistance genes obtained from different sources; 2. native yeasts with inhibitory activity

against Mp, effective in controlling the WB and possible association with the use of copper

fungicides.

Keywords: Theobroma cacao, integrated management, native yeasts, plant breeding.

12

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO GERAL

13

NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO DA VASOURA DE BRUXA DO

CACAUEIRO

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 O CACAUEIRO (Theobroma cacao L.) E A CULTURA DO CACAU

1.1.1 CLASSIFICAÇÃO E DESCRIÇÃO BOTÂNICA

A espécie Theobroma cacao L. foi descrita inicialmente por Charles de L'Êcluse e

citada pela primeira vez na literatura botânica como Cacao fructus (L’ÊCLUSE, 1601). Em

1737, a espécie foi classificada pelo botânico sueco Carolus Linneu (Linnaeus) como

Theobroma fructus, que é traduzido como “alimento dos deuses”, em alusão à crença indígena

na origem divina do cacaueiro. Mais tarde (1753), foi modificado pelo próprio Linnaeus, para

o binômio T. cacao, designação que permanece até hoje. A palavra cacau deriva de

cacauhuatl, diretamente do Nahuatl, a língua maia (DIAS, 2001a; CEPLAC, 2013).

O cacaueiro é uma planta umbrófila, arbórea, perene, que pertencia anteriormente a

família Sterculiaceae e atualmente integra a família Malvaceae, ordem Malvales, e gênero

Theobroma (ALVERSON et al., 1999; SOUNIGO et al., 2003). É considerada uma espécie

cauliflora, devido a formação das inflorescências ao longo do tronco, em estruturas

denominadas de almofadas florais, compostas por flores hermafroditas e pentâmeras,

apresentando pétalas, sépalas, estames e estaminoides (TOXOPEUS, 1972).

A espécie T. cacau pode atingir 5 a 8 m de altura e 4 a 6 m de diâmetro de copa,

quando oriunda de semente. Entretanto, pode ocorrer variações devido às condições de

cultivo, sendo também encontradas em habitat natural com porte de até 20 m. As folhas são

alternas simples, oblongas, acuminadas e glabras com nervura central proeminente e

secundárias filiformes, pecíolo cerca de um a três cm de comprimento, espessados nas duas

extremidades (SILVA NETO et al., 2001); as folhas apresentam lâmina hipoestomática, com

estômatos do tipo anomocítico, quatro tipos de tricomas em ambas as faces do limbo, sendo

dois tectores e dois glandulares, e presença de glândulas secretoras de mucilagem na epiderme

adaxial (NAKAYAMA et al., 1996); flores hermafroditas, completas, pentâmeras, cálice

formado de cinco pétalas, avermelhada e limbo branco-amarelado, inflorescência nos ramos

ou no tronco, sobre pequenas dilatações nodulares; fruto drupáceo, pericarpo carnoso-

consistente e amarelo quando maduro variando na forma e no tamanho; a semente é de cor

roxa e em número de 20 a 40 amêndoas, tem forma quase arredondada e dispõe-se em cinco

fileiras, achatado pela compressão mútua vertical; a testa é recoberta por uma polpa escassa,

14

branca e adocicada e encerra o embrião, composto de dois cotilédones plicado-enrugado

(CUATRECASAS, 1964; SILVA NETO et al., 2001).

Apresenta sistema reprodutivo misto que se caracteriza pela predominância de

fecundação por cruzamentos, ocorrendo autofecundações inferiores a 50% e superiores a 5%,

podendo a taxa de cruzamento alcançar até 100% (VELLO; NASCIMENTO, 1971).

A polinização do cacaueiro é essencialmente entomófila por possuir características

morfológicas das estruturas florais que impedem a autofecundação natural (ASCENSO,

1962), além da disposição em massa dos grãos de pólen devido a sua viscosidade, o que

dificulta o transporte pelo vento (VELLO; NASCIMENTO, 1971). Esta dificuldade de

transporte promove a deposição de grãos de pólen de flores da própria planta e de plantas

vizinhas sobre o estigma das flores, resultando assim em heterogeneidade na obtenção das

sementes (TOXOPEUS, 1972).

A polinização natural no cacaueiro é realizada principalmente por um pequeno grupo

de dípteros da família Ceratopogonidae e do gênero Forcipomyia, podendo também ter a

participação acidental de outros insetos como trips, formigas e afídeos. Tais insetos pelo

hábito de locomoção garantem, na maioria das vezes, a ocorrência da polinização cruzada

(SORIA et al., 1975; CHAPMAN; SORIA, 1983).

1.1.1 CENTRO DE ORIGEM E DISPERSÃO

O cacaueiro cresce de forma espontânea desde o sul do México até a Bolívia, e nas

margens dos rios da Floresta Amazônica, com provável centro de origem no Alto

Amazonas, na confluência dos rios Solimões, Putamaio e Caquetá (LACHENAUD; ZHANG,

2008). O cacaueiro encontrado sob condições silvestres, se desenvolve em bosques e

florestas úmidas, sombreado com árvores de grande porte e margeando os grandes rios,

onde predominam condições de temperatura e umidade elevadas, típicas das regiões tropicais

(CHEESMAN, 1944; CUATRECASAS, 1964; BARTLEY, 2005). Entretanto, em condições

de cultivo apresenta porte que varia de 3 a 5 metros.

Trabalhos com marcadores moleculares, isoenzimáticos, agronômicos e morfológicos,

indicam que a partir do centro de origem, provavelmente o cacaueiro tenha sido dispersado

em duas direções, sendo uma para o leste, sentido do curso do rio Amazonas e a outra para o

norte, rumo a Mesoamérica, dando origem aos dois grupos raciais, Crioulo e Forasteiro

Amazônico, respectivamente. A partir de cruzamentos naturais entre os referidos grupos

genéticos ocorridos em Trinidad, originou-se um terceiro tipo denominado Trinitário (DIAS,

15

2001b). Além disso, a população do grupo Forasteiro pode ser subdivida em Forasteiro do

Alto Amazonas e Forasteiro do baixo Amazonas, conforme a localização de sua ocorrência

(TOXOPEUS, 1969).

Genótipos do grupo Crioulo caracterizam por sementes redondas ou róseas, de sabor

adocicado e fermentação rápida, apresentam padrão de suscetibilidade à maioria das doenças

que acometem a cultura; os frutos são grandes, geralmente apresentam casca fina e rugosa,

coloração verde-escura quando imaturos, passando para amarelo ou alaranjado quando

amadurecem (HANCOCK, 1994; BART-PLANGE; BARYEH, 2003). As variedades

Forasteiro, cultivadas no Baixo Amazonas, principalmente no Brasil e na Venezuela

(SOUNIGO et al., 2003), são amplamente cultivados devido à alta produtividade e resistência

às doenças e a variabilidade genética (MARITA et al., 2001). O híbrido Trinitário produz

sementes de coloração que varia de amarelo pálido a roxo escuro, e no geral produzem cacau

de qualidade intermediária (HANCOCK, 1994; BART-PLANGE; BARYEH, 2003).

O crescente interesse e incentivo ao cultivo do cacaueiro proporcionou sua dispersão

para regiões de semelhantes aspectos edafoclimáticos, e suas sementes foram se

disseminando gradualmente pelo mundo, atravessando o oceano e chegando ao continente

africano na segunda metade do século XIX. As primeiras plantações africanas foram feitas

por volta de 1855, nas ilhas de São Tomé e Príncipe, colônias portuguesas ao largo da costa

ocidental africana (CEPLAC, 2013).

O cacaueiro foi introduzido na Bahia em meados de 1746, quando o colono francês

Luís Frederico Warneaux, plantou sementes de cacaueiro oriundas da população de

forasteiros baixo amazônicos, trazidas do Pará, no atual município de Canavieiras (VELLO;

GARCIA, 1971). Devido ao ambiente favorável ao cultivo, a região sul da Bahia veio a se

tornar a maior região produtora de amêndoas no país, e até a penúltima década do século

passado o cacau era o principal produto de exportação na Bahia (ALMEIDA, 2009). Apesar

do estado da Bahia ainda ser o maior produtor nacional, a cacauicultura brasileira está

distribuída nas regiões Nordeste (Bahia), Sudeste (Espírito Santo), Centro-Oeste (Mato

Grosso) e Norte (Pará, Rondônia e Amazonas) (IBGE, 2014).

1.1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA

O cacaueiro é um dos cultivos perenes mais importantes do mundo, com uma

produção mundial estimada em 4,2 milhões de toneladas de sementes secas (ICCO, 2015). A

exploração comercial desta cultura não se restringe apenas à produção de chocolate, mas para

16

outros ramos da indústria, como de cosméticos e farmacêuticos, geleias, sucos e licores

obtidos através do processamento da polpa do fruto de cacaueiro. A Costa do Marfim é

líder na produção mundial de cacau, com 42%, seguida de Gana, com 17,9%, e Indonésia

com 7,16%. Na sequência vem, Equador, República dos Camarões e Brasil. Os principais

países consumidores de cacau são os Estados Unidos, com 689 mil t, seguidos pela

Alemanha, França e Reino Unido (ICCO, 2015). O Brasil, que há três décadas se manteve como

um dos maiores produtores de cacau do planeta, produziu no ano de 2014, 273.793 t de

amêndoas secas, equivalente à R$ 1.589.535 reais (IBGE, 2014), O sul da Bahia é a principal

região produtora de cacau do Brasil, retomando o crescimento no ano de 2015 com a

participação no mercado internacional através da exportação de 6,6 mil toneladas de

amêndoas de cacau – avaliadas em R$ 15 milhões (BRASIL, 2015).

Durante muitos anos o cacau da Bahia contribuiu para que o Brasil fosse um dos

maiores produtores mundiais, entretanto, a competição nos países concorrentes, o aumento

das áreas de produção, atraídos pelos elevados preços no mercado internacional, a

descapitalização dos produtores brasileiros, problemas climáticos, com a ocorrência de seis

anos consecutivos de estresse hídrico na região e principalmente o surgimento da vassoura-

de-bruxa (VB), causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-

Mora, promoveram uma enorme crise socioeconômica, agronômica e ecológica na região,

levando o Brasil a alterar sua situação de exportador para importador de cacau (MIDLEJ;

SANTOS, 2012).

Na safra de 1984/1985 o Brasil foi o segundo maior produtor mundial de amêndoas,

produzindo aproximadamente 400.000 t, e no ano de 2000, a produção caiu para 210.000 t.,

passando de exportador para importador a partir de 1997 (FAO, 2002). O principal fator

responsável pela queda nas produções foi o surgimento da VB, a mais prejudicial enfermidade

do cacaueiro, constatada em 1989 na região Sul da Bahia (PEREIRA et al., 1989), que ao

encontrar condições favoráveis na região, disseminou-se rapidamente, atingindo níveis

epidêmicos e acarretando redução drástica na produção.

1.2 A VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO

O cacaueiro é ameaçado por diversas enfermidades fúngicas, sendo a VB, causada

pelo basidiomiceto M. perniciosa (=Crinipellis perniciosa) (AIME; PHILLIPS-MORA,

2005), a doença de maior impacto atualmente e, portanto, a mais preocupante no Brasil (LUZ

et al., 2006).

17

A doença foi mencionada pela primeira vez por Went em 1904, causando sérios

prejuízos no município de Saramacca, no Suriname (HOLLIDAY, 1952). No entanto o seu

agente etiológico só foi descrito por Stahel em 1915. Mesmo com esforços para impedir a

introdução do patógeno no estado da Bahia, a doença foi constatada em 1989, e apesar da

erradicação de 12 ha do cultivo na cidade de Uruçuca, novos focos foram identificados no

mesmo ano na cidade de Camacã, disseminando-se assim para todas as regiões produtoras do

estado (PEREIRA et al., 1989; ROCHA et al., 1993; ANDEBRHAN et al., 1999), sendo

atribuída a ela a devastação da lavoura cacaueira no Sul da Bahia no final do século passado.

A VB que já era um dos maiores entraves ao desenvolvimento do cultivo do cacaueiro na

América do Sul, incluindo a região amazônica brasileira, ao ser introduzida na Bahia, causou

sérios prejuízos à cacauicultura baiana, que utilizava principalmente variedades altamente

suscetíveis (PEREIRA et al., 1989).

A vassoura de bruxa distribui-se geograficamente por todos os países produtores da

América do Sul e Central como o Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana, Peru,

Venezúela, Panamá e nas ilhas do Caribe, Trinidad, Tobago, Granada, Santa Lucia e São

Vicente. Baker e Holliday (1957) afirmaram que desde 1920, a doença já estaria disseminada

por todo o vale do Amazonas e seus inúmeros afluentes, indo desde o leste no estado do Pará

até os planaltos aos pés da cordilheira dos Andes.

Atualmente essa doença ainda é um entrave para implantação de novas áreas de

cultivo e para a competitividade da cacauicultura nacional no mercado internacional

(BRASIL, 2015). Uma das consequências da doença para a sociedade regional foi o elevado

índice de desemprego e êxodo rural, que afetou todos os segmentos da cadeia produtiva do

cacau, particularmente os trabalhadores rurais e os pequenos produtores (TREVIZAN;

MARQUES, 2004). O fitopatógeno contribuiu também para grande índice de desmatamento

na região com a eliminação em várias propriedades dos remanescentes da Mata Atlântica,

sendo o cultivo de cacaueiro substituído pela atividade madeireira que foi estimulada como

alternativa para a então desempregada população de trabalhadores rurais (LUZ et al., 2006).

O fungo afeta principalmente os tecidos meristemáticos da planta (caules, almofadas

florais, flores e frutos), causando sintomas que variam de acordo com o órgão infectado e o

seu estádio de desenvolvimento (SILVA et al., 2003), levando à morte da planta, quando

afetada por sucessivos surtos de infecção e fatores abióticos em concomitância

(ANDEBRHAN, 1984; QUEIROZ et al., 2003).

As plântulas infectadas apresentam engrossamento do meristema apical, acompanhada

da proliferação de brotos inchados e lançamento foliar, folhas retorcidas, podendo apresentar

18

pecíolos e pulvinos inchados. Ainda visualiza-se em plântulas de alguns genótipos, uma

proliferação a partir das axilas (vassoura axilar) e cotilédones (vassoura cotiledonar), além do

fendilhamento da casca (cancro). Em plantas adultas, as gemas vegetativas infectadas dão

origem a ramos hipertrofiados, com internódios curtos, intensa brotação lateral (vassoura

vegetativa) e folhas grandes e retorcidas. Inicialmente as vassouras são verdes e depois

começam a secar da base para o ápice (SILVA et al., 2002).

Os basidiósporos são os únicos propágulos comprovadamente infectivos (SILVA et

al., 2002) e penetram no tecido hospedeiro por aberturas naturais (estômatos) e ferimentos

(FRIAS et al., 1991; SREENIVASAN; DABYDEEN, 1989) ou diretamente

(SREENIVASAN; DABYDEEN, 1989). Os frutos podem ser infectados a partir de flores

infectadas, e através da penetração dos basidiósporos através do epicarpo, apresentando uma

variedade de sintomas, dependentes do tipo de infecção e idade. Quando originado de flores

afetadas, os frutos são partenocárpicos, assumem forma de “morango” e paralisam o

crescimento sendo inicialmente verdes ou avermelhados, tornando-se negros e petrificados

quando secos. Quando infectados ainda jovens (± 1 cm de comprimento) e diretamente

através do pericarpo, assumem a forma de “cenoura”, e paralisam o crescimento com

aproximadamente 15 cm de comprimento. Os frutos que são infectados com 2 a 5 cm de

comprimento, tornam-se inchados e deformados, com amadurecimento precoce; já quando a

infecção ocorre frutos maduros, forma-se lesões externas com manchas negras, brilhantes, de

formato circular. Com o desenvolvimento da infecção, os frutos se tornam secos e

petrificados, com formação de basidiocarpos na superfície. O fungo coloniza inicialmente os

tecidos internos dos frutos e, quando é possível a visualização dos sintomas externos, as

sementes já estão impróprias para a comercialização, pois já ocorreu a invasão do micélio e as

sementes já se encontram fortemente aderidas entre si (ALBUQUERQUE et al., 2005).

O risco de infecção aumenta com a proximidade da fonte de inóculo e exposição de

regiões meristemáticas (LUZ et al., 2006), diminuindo gradualmente a medida em que se

distancia, pois a quantidade de basidiósporos no ar cai sensivelmente a distâncias superiores a

300 m da fonte de inóculo. Entretanto, quando as condições climáticas são favoráveis à

disseminação, poderá ocorrer o transporte de esporos e infecções em plantas situadas a alguns

quilômetros da fonte de inóculo (LUZ et al., 1997). Nas gemas dormentes a infecção torna-se

latente, assumindo o aspecto de pequenos cancros ou pontos necróticos que entram em

atividade quando a planta reinicia a brotação. Essas infecções têm importância

epidemiológica, pois permitem a sobrevivência do fungo entre os períodos sucessivos de

crescimento (lançamentos foliares) e de frutificação (safras) da planta. Após infecção e

19

colonização, ocorre uma intensa multiplicação celular (hipertrofia) que dura algumas semanas

e, em seguida as células morrem ocorrendo a necrose generalizada dos tecidos (SILVA et al.,

2002). O micélio saprofítico cresce nos tecidos necrosados (frutos e vassouras secas), e após

um período de dormência, se dá o aparecimento dos basidiomas ou frutificações do patógeno.

Este ciclo de basidioma a basidioma ocorre uma vez por ano na Amazônia, mas, na Bahia

pode ocorrer até duas vezes: uma na safra temporã (1° semestre) e outro na safra principal

(2°semestre) (LUZ et al., 2006).

Estas desordens fisiológicas são frequentemente causadas pela liberação intracelular

de grande quantidade de compostos fenólicos, etilênicos, açúcares solúveis e taninos, levando

a morte celular ou alterações no balanço hormonal (ODJAKOVA; HADJÜVANOVA, 2001;

SCARPARI et al., 2005).

A VB é considerada uma doença monocíclica, pois os tecidos infectados não

produzem esporos capazes de iniciar novas infecções na mesma estação (safra). Mesmo

havendo a contínua liberação dos basidiósporos durante toda a estação (LUZ et al., 1994),

estes provêm de basidiomas desenvolvidos em tecidos infectados em estações anteriores

(LUZ et al., 2006). Os períodos de duração das diferentes fases do ciclo vital de M. perniciosa

foram estudados na Bahia por LUZ et al. (1994), sendo período de incubação (4 semanas em

média), período entre o aparecimento de vassouras verdes e o seu secamento (7,5 semanas em

média), período de dormência das vassouras secas (13 semanas, a depender do tamanho e

localização da vassoura), período de produção de basidiomas em frutos mumificados (24

meses); e período de liberação de esporos (na Bahia ocorre o ano todo, com picos maiores nos

meses mais frios). Um basidioma se mantém ativo durante cinco dias em média, liberando

milhões de esporos nas primeiras horas do dia durante sua vida útil (LUZ et al., 1997).

As condições ambientais são preponderantes para o processo de esporulação,

disseminação e infecção de tecidos vegetais. Rocha e Wheeler (1985) descrevem como

condições favoráveis para a liberação dos basidiósporos, umidade próximo a saturação e

temperaturas entre 20 e 30°C. Quando os basidiósporos são expostos a radiação ultravioleta,

são facilmente desidratados, diminuindo drasticamente a porcentagem de germinação dos

esporos viáveis. Entretanto, quando os basidiósporos são liberados à noite, a probabilidade de

infecção aumenta, como ocorrido em Trinidad e Equador, onde foi verificado que a maior

liberação ocorreu entre 22 h e 4 h, com umidade relativa em torno de 95% e temperatura

entre 20 e 24 °C (BAKER; CROWDY, 1943; EVANS; SOLORZANO, 1982).

Na Amazônia Brasileira as vassouras localizadas na copa são as principais fontes

de inóculo enquanto aquelas na superfície do solo produzem poucos basidiomas e com

20

menor chance do basidiósporo atingir os órgãos suscetíveis (ANDEBRHAN, 1981). O vento

e altura em que o basidioma é produzido é preponderante para o mecanismo de dispersão e

progresso da doença (COSTA, 1993), entretanto, os casqueiros também se constituem

importantes fontes de inóculo, pois no estado da Bahia, vassoura e frutos infectados quando

dispostos sobre o solo, são importante fonte de inóculo para infecções futuras (NIELLA,

1997).

Mesmo o basidiósporo sendo o principal propágulo infectivo, o micélio saprotrófico

do fungo pode sobreviver por vários anos, em vassouras secas e frutos mumificados, bem

como no interior dos tecidos infectados como vassouras vegetativas, frutos e folhas, que ao

serem transportados indevidamente, quando expostos aos efeitos alternados de chuva e sol,

podem produzir basidiomas favorecendo a infecção pelo fungo (BAKER; CROWDY, 1943;

BASTOS, 1990; NIELLA et al., 1999).

1.3 BIOLOGIA E TAXONOMIA DO FUNGO Moniliophthora perniciosa

A vassoura de bruxa foi notificada inicialmente em 1700, mas somente em 1890 foi

esclarecido o agente causal através de Gregor Stahel, que isolou e nomeou o fungo causador

Marasmius perniciosa. Em 1942, foi transferido para o gênero Crinipellis por Singer e, na

revisão da sistemática do fungo, foi mantido o binômio Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer

(SINGER, 1942). Por fim, em 2005, foi transferido para o gênero Moniliophthora por Aime e

Phillips-Mora (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005) com base em características moleculares.

O fungo M. perniciosa pertence à divisão Basidiomycota, subdivisão

Agaricomycotina, classe Agaricomycetes, sub classe Agaricomycetidae, ordem Agaricales,

família Marasmiaceae (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005), que é constituída de espécies com

basidiomas pileados, lignicolas ou habitantes da serrapilheira, e que possuem a capacidade

recuperar sua morfologia após o secamento quando novamente são umedecidos

(ALEXOPOULOS et al., 1996; EVANS, 1980).

Apesar de existirem outros patógenos causando doenças de impacto econômico à

cultura do cacau, o fungo M. perniciosa quando em condições favoráveis, é o principal

patógeno do cacaueiro na Bahia atualmente, sendo capaz de colonizar, além do cacaueiro,

várias outras plantas hospedeiras, como espécies do gênero Theobroma e Herrania

(Malvaceae) e alguns representantes das famílias Solanaceae e Bixaceae (BASTOS;

ANDEBRHAN, 1986), cuja adaptação nestas plantas podem contribuir para o aumento da

variabilidade genética desse microrganismo (LUZ et al., 2006).

21

O patógeno M. perniciosa é um fungo hemibiotrófico, pois apresenta ciclo de vida

com uma fase parasítica e outra saprofítica. O micélio primário formado após emissão do tubo

germinativo e que coloniza intercelular mente o tecido vegetal é monocariótico e representa a

fase biotrófica, já o micélio secundário é dicariótico e corresponde a fase necrotrófica.

(PEGUS, 1972). Os dois tipos de micélios são distintos e podem ser separados morfológica,

fisiológica e geneticamente em: micélio monocariótico, parasítico sem grampo de conexão,

encontrado em tecidos vivos infectados; e micélio dicariótico, saprofítico, com grampo de

conexão, encontrado em tecidos mortos e em meio de cultura (EVANS e BASTOS, 1979;

EVANS, 1980; CALLE et al., 1982).

Na fase biotrófica, o fungo se desenvolve a partir dos tecidos vivos do hospedeiro,

direcionando o metabolismo da planta para as suas necessidades básicas, como nutrição,

crescimento e desenvolvimento do micélio (SCARPARI et al., 2005; KILARU,

HASENSTEIN, 2005). A mudança da fase biotrófica para necrotrófica é estimulada pela

alteração na concentração carboidratos específicos, pois o fungo ao desviar o fluxo destes

carboidratos das partes saudáveis da planta para as regiões infectadas, leva à necrose rápida

dos tecidos, tanto por inanição como por resposta de defesa da planta, pela alteração de sua

fisiologia (ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; SCARPARI et al., 2005; GALANTE,

2008).

O fungo M. perniciosa possui quatro biótipos, sendo o biótipo C específico para o

cacau, possuindo dois patótipos (A e B). O A está presente na Bolívia, Colômbia e Equador,

sendo considerado mais virulento e o B, com uma menor virulência está presente no Brasil,

Trinidade-Tobago e Venezuela (MOTILA; BUTLER, 2003). O conhecimento dos aspectos

biológicos do patógeno, hospedeiro e condições edafo-climáticas subsidiam a adoção de

diferentes métodos de controle, minimizando assim, os impactos causados pelo patógeno na

cultura (FALEIRO et al., 2004). Assim como Delgado e Cook (1976) relataram a severidade

da vassoura de bruxa em variedades selecionadas como resistentes no Equador, casos

semelhantes podem surgir, pois a anastomose de hifas provenientes da germinação de

basidiósporos de origens distintas, possibilitam o surgimento de heterocário no micélio

saprofítico, aumentando a variabilidade genética quando da formação de novos basidiósporos.

Os basidiósporos, produzidos no himenóforo localizado na face abaxial do píleo dos

basidiomas, são esporos sexuais unicelulares, hialinos, com parede celular delgada, e tamanho

médio de 12 x 6 µm (BAKER, CROWDY, 1943), que germinam rapidamente quando em

condições de saturação de umidade, com início da germinação aproximadamente 1 hora após

exposição a estas condições e término quatro horas depois (BASTOS, 1990; NIELLA et al.,

22

1999). Os basidiomas apresentam coloração avermelhadas a purpúrea, com píleo variando

entre 5 – 30 mm de diâmetro, radialmente sulcados, convexos à deprimidos no centro,

himenóforo branco com aproximadamente 15 lamelas, correspondente aos sulcos dos píleos;

o estipe apresenta coloração esbranquiçada, medindo de 5 a 10 mm de altura, com

engrossamento na base e coloração parda. Os basídios produzem quatro basidiósporos

unicelulares (BAKER, CROWDY, 1943).

1.4 MANEJO INTEGRADO DA VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO

O manejo integrado consiste na forma mais eficiente e econômica de controle,

associando todos os métodos de controle disponíveis (cultural, químico, biológico,

genético e outros), de maneira que o custo do controle seja reduzido, permitindo um

cultivo economicamente rentável. Os maiores benefícios do manejo integrado são seus

efeitos acumulativos, em que, através do emprego de combinações de diferentes métodos de

controle, cada um deles com diferentes modos de ação, reduzam progressivamente a

possibilidade do desenvolvimento da doença (PEREIRA; VALLE, 2012).

Apesar da utilização de defensivos químicos ainda ser a alternativa mais utilizada para

o controle de doenças de plantas, para o patossistema cacaueiro x M. perniciosa, existem

vários fatores que induzem a uma grande variação na eficiência desta técnica, principalmente

quando utilizada isoladamente. A alta variabilidade dentro da espécie tem sido detectada

quando isolados, de várias regiões de um país, de diferentes países ou de diferentes

hospedeiros são comparados. Tal variabilidade tem sido traduzida, por exemplo, em termos

de crescimento micelial em meios de cultura, tipos de reação em alguns testes bioquímicos,

compatibilidade somática e patogenicidade ao cacaueiro e a outros hospedeiros (BARTLEY,

1977; BASTOS, 1986; McGEARY; WHEELER, 1988). Em função desse comportamento,

pode ocorrer variação do patógeno até mesmo com referência à sensibilidade a fungicidas, o

que poderia eventualmente explicar o maior ou menor sucesso das recomendações de controle

da doença em determinadas situações (DELGADO; COOK, 1976).

A Comissão Executiva da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) recomenda o manejo

integrado para o controle da VB composto por clones resistentes, aplicação de fungicidas,

poda fitossanitária, e agentes de biocontrole (OLIVEIRA; LUZ, 2012). Esforços têm sido

voltados para a busca de medidas alternativas que aumentem a eficiência do pacote de

manejo, racionalizando o uso de agroquímicos, e reduzindo a frequência de práticas agrícolas

23

como realização de podas e retiradas de vassouras (COSTA et al., 2009; MEDEIROS et al.,

2010).

Desde os primeiros estudos referentes ao controle desta enfermidade, foi recomendado

o uso do controle cultural associado ao químico (Sthael, 1915). No entanto, o controle

químico com fungicidas a base de cobre não protege os tecidos em crescimento (OLIVEIRA,

2004a) e as aplicações visam principalmente proteger os frutos, sendo necessárias aplicações

em períodos corretos e obedecendo rigorosamente doses, intervalos e forma de aplicação

adequada, evitando os períodos chuvosos que podem facilmente lixiviar os fungicidas

protetores. Em diversas pesquisas realizadas na região cacaueira da Bahia, constatou-se que o

fungicida sistêmico tebuconazole (OLIVEIRA, 2004a) e outros do grupo das estrobilurinas

(OLIVEIRA, 2004b), com destaque para a azoxystrobina, apresentaram os melhores

resultados para o controle da VB, tanto em viveiros quanto em campo (OLIVEIRA; LUZ,

2005).

Objetivando reduzir as fontes de inóculo, recomenda-se ainda a remoção de tecidos

infectados, seguido de queima, cobertura com folhas, e/ou aplicação de cal, para acelerar a

decomposição e evitar a esporulação do fungo (LUZ et al., 2006; STAHEL, 1915). Contudo,

a determinação do número, época de remoções e eficiência dessa prática depende de vários

fatores, principalmente, das condições climáticas da região (LUZ et al., 1997) e do nível de

infecção da planta (BASTOS, 1996). Na Bahia, são necessárias pelo menos quatro remoções

ao ano, realizadas normalmente nos meses de fevereiro, maio, agosto e novembro,

antecedendo os lançamentos foliares do cacaueiro. A eficácia deste método também é

influenciada pela presença de frutos mumificados ou vassouras que ficam no solo, ou ainda

através de inóculo proveniente de áreas onde o controle cultural não foi realizado (LUZ et al.,

2006). Tais riscos tornam o controle cultural menos eficiente, sendo necessária a aplicação de

fungicida para minimizar as perdas (ANDEBRHAN; BASTOS, 1985; OLIVEIRA; LUZ,

2005).

Além da aplicação de antifúngicos e poda fitossanitária, acrescenta-se às medidas de

controle da vassoura de bruxa, a busca por variedades resistentes, indução de resistência do

hospedeiro e a prospecção por micro-organismos antagônicos ao M. perniciosa, garantindo

desta forma a utilização de tecnologias com menor impacto ambiental e mais econômicas

(COSTA et al., 2009).

1.4.1 CONTROLE GENÉTICO DO CACAUEIRO QUANTO À RESISTÊNCIA A VASSOURA DE BRUXA

24

O emprego de variedades resistentes e de alta produtividade, desenvolvidas em

programas de melhoramento genético do cacaueiro é a alternativa mais recomendada para se

manejar a VB (PINTO; PIRES, 1998). Essa medida de controle é fundamental haja vista os

controles químico e cultural terem se mostrado onerosos e ineficazes quando não executados

rigorosamente de acordo com as recomendações técnicas da pesquisa, em se tratando de

lavouras formadas por variedades de alta suscetibilidade e de baixa produtividade (PINTO;

PIRES, 1998).

Alguns autores dividem didaticamente a história do melhoramento genético do

cacaueiro em antes e depois do desenvolvimento do cacaueiro híbrido, cuja implementação

ocorreu em Trinidad no início da década de 1930, realizando os primeiros estudos sobre a

frutificação, a propagação vegetativa e a herança da pigmentação dos cotilédones

(CHEESMAN; POUND, 1934). Também, foi a partir destes estudos que se detectou a

presença da autoincompatibilidade em cacaueiros do Alto Amazonas e foram definidas as

características para a seleção de cacaueiros superiores (DIAS, 2001b). O primeiro programa

de melhoramento do cacaueiro visando a obtenção de genótipos resistentes a M. perniciosa

foi iniciado no Equador em 1918, através da seleção massal de plântulas originadas de árvores

sem sintomas (BARTLEY, 1986).

Com a disseminação da VB nos cacauais do sul da Bahia a partir de 1989 (PEREIRA

et al., 1989) os métodos de melhoramento visando à obtenção de variedades clonais, bem

como, a utilização da clonagem para a rápida substituição de plantas suscetíveis, quer na

implantação de plantios novos ou por substituição de copas, tornou-se estratégia para a

recuperação da cacauicultura daquela região e consequentemente o resgate da cacauicultura

nacional (LOPES et al., 2011).

Uma das dificuldades encontradas no melhoramento genético do cacaueiro é a

limitada fonte de resistência utilizada até o início das pesquisas com a doença na Bahia. Os

clones e cultivares conhecidos como resistentes eram quase todos descendentes dos clones

Scavina-6 e 12 (SCA 6 e SCA 12), que foram selecionados no Peru e vem sendo utilizados

como fonte de resistência à VB desde 1940 (BARTLEY, 2005). No entanto, o clone SCA 6, o

mais utilizado, havia apresentado quebra de resistência à VB em algumas regiões. Wheeler e

Mepsted (1988) relatam a suplantação de resistência no Equador e Andebrhan et al. (1998)

constataram quebra da resistência em Rondônia, na Amazônia. Em meados da primeira

década deste século, descendentes deste clone, também começaram a apresentar

susceptibilidade na Bahia, o que justifica a busca de novas fontes de resistência (PAIM et al.,

2006).

25

Desde 1996, a CEPLAC disponibilizou aos produtores mais de 40 variedades clonais

de cacaueiro com diferentes níveis de resistência à VB entretanto, algumas foram retiradas e

não mais recomendadas e distribuídas, devido a suscetibilidade à outras doenças. Mesmo com

a atual recomendação de variedades clonais com características qualitativas e quantitativas de

frutos e sementes (FA-13, VEM-20, SJ-02, CEPEC 2002, CCN-51, PH-09, LP-06, PH-15,

BJ-11, CA-1.4, PS-13.19, CCN-10, PH-16) adequadas às exigências do mercado (PEREIRA;

VALLE, 2012), o programa de melhoramento genético do cacaueiro segue em busca do maior

número possível de fontes de resistência, combinando-as em cruzamentos de primeira e

segunda geração e proporcionando a obtenção de material genético com genes de resistência

de diferentes origens, aumentando assim a estabilidade, durabilidade e dificultando o aumento

da população e a evolução do fungo sobre tais materiais (PINTO; PIRES, 1998; PIRES,

2003).

Modelos experimentais de cruzamentos visando estimar parâmetros genético

quantitativos são desenhados de acordo com as especificidades de cada cultura. Comstock e

Robinson (1952), desenvolveram uma série de projetos experimentais para situações em que

um ou ambos os sexos podem proporcionar múltiplos cruzamentos. Tais protocolos

conhecidos como delineamento Carolina do Norte, receberam tal designação por serem muito

utilizados em programas de melhoramento naquele estado americano. Os delineamentos

Carolina do Norte I e II são utilizados quando pólen geralmente é produzido em abundância,

espécies com sexos separados, e o tamanho do experimento é geralmente limitado, pelo

número de flores produzidas por plantas fêmeas (LYNCH; WALSH, 1998).

Um sistema de cruzamentos dialélicos define-se como sendo aquele no qual é

escolhido um grupo de linhagens autofecundadas, as quais são cruzadas entre si, fornecendo

um máximo de p2 combinações (HAYMAN, 1954; GRIFFING, 1956). O termo dialelo,

porém, tem sido utilizado para expressar um conjunto de p (p – 1) /2 híbridos, resultantes do

acasalamento entre p genitores (linhagens, cultivares, clones etc.) (CRUZ et al., 2004).

As metodologias de análise dialélica têm por finalidade analisar o delineamento

genético, fornecendo estimativas de parâmetros úteis na seleção de parentais para a hibridação

e no entendimento dos efeitos gênicos envolvidos na herança dos caracteres (CRUZ et al.,

2004). De acordo com Geraldi e Miranda Filho (1988), os sistemas de cruzamentos dialélicos

são bastante utilizados no melhoramento de plantas, uma vez que possibilitam a avaliação da

capacidade combinatória e do potencial heterótico de variedades ou linhas em cruzamentos,

ou nos estudos básicos da estrutura genética das populações.

26

A seleção de parentais com base na avaliação “per se” nem sempre conduz a

resultados satisfatórios (ALLARD, 1971). Assim, a escolha de parentais deve ser

fundamentada na informação genética como um todo e no conhecimento do potencial da

capacidade combinatória dos parentais (AHMED et al., 1998).

Devido as características morfo-genéticas do cacaueiro, os dialelos formados são

desbalanceados, construídos de acordo com a disponibilidade de sementes obtidas dos

cruzamentos, seguindo o delineamento Carolina do Norte II (SILVA et al., 2010).

O emprego de variedades resistentes e de alta produtividade, desenvolvidas em

programas de melhoramento genético do cacaueiro (PMGC) é a base para o manejo de

doenças de plantas (PINTO; PIRES, 1998). Entretanto, alguns materiais mesmo apresentando

genes de resistência, têm, com o tempo e extensão do cultivo, demonstrado suscetibilidade,

devido às condições ambientais favoráveis à doença, à rápida mutação e grande variabilidade

do patógeno (BARTLEY, 2005). Sendo assim, o PMGC segue buscando ampliar a base

genética para resistência, combinando o maior número possível de genes através de

cruzamentos em primeira e segunda geração, no chamado processo de piramidação de genes,

para obter resistência mais estável, durável e efetiva, dificultando o aumento da população do

fungo e a sua evolução do sobre tais materiais (PINTO; PIRES, 1998; PIRES, 2003).

O uso de alguns clones, com diferentes níveis de resistência, em associação a outras

práticas do manejo integrado da vassoura-de-bruxa, tem possibilitado avanços na recuperação

da lavoura cacaueira sul baiana (LUZ et al., 2013). Nas últimas décadas, vários acessos foram

identificados como fontes de resistência à VB e monilíase, através de programas de

melhoramento em vários países produtores, que estão utilizando as coleções de germoplasma

que possuem em busca de fontes de resistência estáveis e duradouras. A CEPLAC possui duas

grandes coleções de germoplasma de cacau. A coleção localizada no município de Ilhéus, no

estado da Bahia, é considerada a mais diversificada por possuir 1.300 acessos, incluindo

germoplasmas selvagens e melhorados (LOPES et al., 2011), e também alguns clones

considerados na Costa Rica como resistentes à monilíase como: EET 75 e 233, ICS 95 e UF

273 (PHILLIPS-MORA et al., 2007). A outra coleção trata-se do maior banco de

germoplasma de cacau do mundo e está localizada no município de Marituba, no estado do

Pará (MONTEIRO; AHNERT, 2012).

O PMGC no Brasil, por outro lado, já gerou várias populações estruturadas e não

estruturadas visando a piramidação de genes para a resistência à VB, e destas vários clones

foram indicados para o cultivo na região (MONTEIRO; AHNERT, 2012). As populações

estruturadas foram geradas a partir de cruzamentos dialélicos realizados entre materiais

27

selecionados de três outras populações: A- alto amazônicos; B- Baixo amazônicos; e AB

cruzamentos entre alto e baixo amazônicos, distantes geneticamente, para exploração da

heterose, adição de características interessantes, além de resistência à VB e outras doenças, e

produção (PIRES et al., 1999). Uma dessas população estruturada foi construída a partir de

um ciclo de seleção recorrente e as plantas desta população avaliadas a campo por mais de

seis anos, para compor um segundo ciclo de seleção. Plantas elite destas populações foram

cruzadas entre si para a piramidação de genes de diferentes fontes e testadas neste trabalho em

um dialelo (10 x 8) pelo delineamento Carolina do Norte II (COMSTOCK; ROBINSON,

1952), incluindo também clones doadores de genes de resistência a monilíase.

Diversos trabalhos já foram também realizados visando associar marcadores

moleculares para acelerar o processo de melhoramento para resistência. Dantas Neto et al.

(2005) realizaram estudos em plantas com oito anos de idade, visando identificar oito genes

de resistência e Quantitative trait loci (QTL), dissimilares dos encontrados no clone Scavina-

6, em populações derivadas do cruzamento entre os clones SIC-864 e CCN-51. Faleiro et al

(2006) e Santos et al (2007) identificaram novos QTL relacionados a resistência à VB.

Populações estão sendo desenvolvidas e testadas gerando a possibilidade de futuros

materiais a serem distribuídos que apresentem além do caráter resistência, genes para outras

características agronomicamente desejáveis (MONTEIRO et al., 2006). Através de técnicas

de RAPD (Random amplified polymorphic DNA), Yamada et al. (2002) demonstraram

diversidade genética em estudo com 27 acessos de cacaueiro da série Cepec. Leal et al. (2008)

utilizando também técnicas de RAPD encontraram elevada diversidade genética entre as

seleções de cacaueiros em 17 fazendas de sete municípios do Sul da Bahia. Paim et al. (2006)

demonstraram o alto nível de resistência de progênies da série CAB (Cacau da Amazônia

Brasileira) na Bahia e que estas são distintas geneticamente de SCA 6 (PAIM, 2005).

Portanto, há variabilidade de resistência à VB tanto nos materiais de bancos de germoplasma

(BAG) como nas plantações de cacau no Sul da Bahia.

1.4.2 CONTROLE BIOLÓGICO DA VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO

Alternativamente, o controle biológico por meio de micro-organismos antagônicos a

M. perniciosa tem sido bastante utilizado, recebendo destaque o Tricovab, produto

desenvolvido pela CEPLAC e formulado a partir do fungo Trichoderma stromaticum Samuels

& Pardo-Schultheiss, que parasita M. perniciosa impedindo a produção de basidiomas

28

(BASTOS, 2000; LOGUERCIO et al., 2009; BEZERRA et al., 2000; SANTOS, 2005;

SOUZA et al., 2006).

As primeiras pesquisas com biocontrole da VB foram realizadas no final da década de

1970. Nesse período, foram testados vários micro-organismos em condições de laboratório,

havendo destaque para Cladobotryum amazonense C.N. Bastos, H.C. Evans & Samson, por

apresentar potencial para o controle da doença. Este fungo foi encontrado no Pará,

parasitando basidiomas de M. perniciosa (BASTOS et al., 1981). Em ensaios de laboratório e

de campo, verificou-se que este antagonista era capaz de colonizar basidiomas do patógeno,

impedindo a produção de inóculo, mas é de difícil esporulação. Optou-se então pelo uso do

sobrenadante obtido a partir do cultivo in vitro deste antagonista, que já havia demonstrado

ser ativo contra M. perniciosa e outros patógenos de outras culturas. O composto ativo foi

identificado e demonstrou ser absorvido e translocado por mudas de cacaueiro (BASTOS,

1988). Assim como C. amazonense, Verticillium lamellicola (F.E.V. Sm.) W. Gams também

foi detectado parasitando basidiomas de M. perniciosa, sendo capaz de produzir uma

substância altamente antagônica ao patógeno (ANDEBRHAN, 1981). Entretanto, mesmo

sendo realizadas várias pesquisas, por razões comerciais, biofungicidas baseados nestes

fungos não foram desenvolvidos LOGUERCIO et al., 2012).

Em 1987, um isolado fúngico do gênero Trichoderma com capacidade de colonizar

vassouras secas, foi identificado no Pará, inicialmente como T. viride Pers. Posteriormente, o

isolado foi classificado como T. polysporum (Link) Rifai e finalmente descrito como uma

nova espécie, recebendo o binômio, Trichoderma stromaticum (SAMUELS et al., 2000).

Os resultados das primeiras pesquisas com T. stromaticum, realizadas no Pará e

Rondônia, mostraram sua capacidade de reduzir a formação de basidiomas de M. perniciosa

em vassouras secas, culminando com a morte do patógeno (BASTOS, 1996a). Sua maior

vantagem sobre os outros antagonistas avaliados é a alta capacidade de sobrevivência em

vassouras secas, especificidade por M. perniciosa, alta esporulação no ambiente e fácil

cultivo. Ensaios enzimáticos demonstraram que o fungo é capaz de produzir enzimas

hidrolíticas como quitinase, endoglucanase e amilase (BASTOS, 1996 b), além da citação de

efeitos indiretos no aumento da produção de frutos de cacau após três anos em ensaios de

campo (COSTA et al., 2009; MEDEIROS et al., 2010).

Apesar dos estudos relacionados ao controle biológico da VB concentrar-se na

interação T. cacao x Trichoderma x M. perniciosa, a mistura de organismos benéficos,

buscando conjuntamente efeitos antagônicos, protetores e/ou antiesporulante do patógeno,

deve ser realizada visando promover um sistema integrado de biocontrole (ELAD, 2003).

29

As leveduras são promissores agentes de biocontrole de doenças de plantas, por

estarem tanto na filosfera, quanto na rizosfera de vários cultivos, inclusive o cacaueiro

(CABRAL et al., 2009), atuando de forma antagônica à diversos patógenos, através da

competição por nutrientes e espaço, parasitismo, antibiose, além de apresentarem potencial

indutor de resistência à doenças e promoção de crescimento de plantas (EL-TARABILY;

SIVASITHAPARAM, 2006; VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000).

1.4.3 LEVEDURAS COMO AGENTES DE BIOCONTROLE E PROMOTORES DE

CRESCIMENTO

Leveduras são fungos unicelulares e não filamentosos, que são frequentemente

encontradas na natureza (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005), apresentam geralmente células

ovais, esféricas, ou cilíndricas com dimensões maiores do que a de uma bactéria,

apresentando núcleo como estrutura interna diferencial, e sendo capaz de se dividir por fissão

binária ou brotamento celular, são encontradas abundantemente em habitats que contenham

açúcar como por exemplo flores, frutos e cascas de árvores (MADIGAN; MARTINKO;

PARKER, 2004), sendo também são encontrados em solos, sedimentos, água bem como sobre

as superfícies externas e tratos intestinais de animais, especialmente insetos (LACHANCE;

STARMER, 1998). As condições ideais para o crescimento da maioria das leveduras

encontram-se na faixa de pH entre 4 e 5, temperatura de crescimento entre 20 e 30ºC e sendo

o Carbono (C), o Fosforo (P) e o Nitrogênio (N) elementos químicos limitantes ao seu

crescimento (REHN, 1995).

As espécies de levedura integram os filos Ascomycota e Basidiomycota

(FUENTREFIA, 2007). São bastante utilizadas pelo homem para fins variados, a exemplo da

espécie Sacharomyces cerevisiae, microrganismo bastante utilizado pela indústria alimentícia

na produção de pães e massas, produção de álcool, vinhos, cerveja (SCHENBERG, 2010) na

alimentação humana e animal (COSTA, 2004) e no controle de doenças de plantas (LOPES et

al., 2015; SHALABY; EL-NADY, 2008; WACHOWSKA et al., 2013).

Leveduras, bactérias e fungos são constantemente isolados do filoplano de diversas

espécies vegetais, devido a riqueza de nutrientes disponíveis (ANDREWS; HARRIS, 2000).

Entretanto, rápidas alterações das condições ambientais consideradas ótimas para o

crescimento microbiano, promovem alterações na densidade populacional e na quantidade de

organismos epifíticos (INÁCIO et al., 2005). As bactérias iniciam o processo de colonização

foliar (BLAKEMAN, 1991), mas com o passar do tempo, as leveduras se tornam mais

abundantes devido a aumento na disponibilidade de nutrientes, oriundos da deposição de

30

grãos de polén e extravasamento de fotoassimilados com o processo de alimentação de afídios

e outros insetos (STADLER; MULLER, 1996). Após o estabelecimento na superfície foliar,

os micro-organismos epifíticos aderem fortemente à superfície, utilizando a matriz

extracelular como proteção (BEATTIE; LINDOW, 1999), e formação de biofilmes como

estratégia de sobrevivência em ambientes variáveis (CHEN et al., 2013).

As leveduras predominam nas gemas e nas folhas em termos de biomassa e, nesses

locais, sobressaem as leveduras com colônias vermelhas dos gêneros Sporobolomyces e

Rhodothorula e as brancas do gênero Cryptococcus. Na microbiota dos solos, mesmo em

quantidade menor que as bactérias, podem ser encontradas leveduras, e os principais gêneros

encontrados nesse ambiente são Cryptococcus, Torulaspora, Tremella e Trichosporon.

(VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000). Dentre as leveduras citadas na literatura como

agentes de biocontrole, destacam-se os gêneros: Debaryomyces, Kloeckera, Saccharomyces,

Zygosaccharomyces, Sporobolomyces, Metschnikowia, Tilletiopsis, Rhodotorula,

Cryptococcus, Aureobasidium, Pichia e Candida. Espécies pertencentes a alguns destes

gêneros correspondem ao composto ativo de produtos registrados em muitos países como

biocontroladores de patologias pós-colheita, a exemplo de Aureobasidium pullulans (de Bary)

G. Arnaud, Cryptococcus albidus (Saito) C. E. Skinner, Metschnikowia fruticola (Kurtzman e

Droby), inibindo o desenvolvimento de patógenos como Botrytis, Penicillium, Rhizopus,

Monilia, Sclerotinia, Erwinia amylovora (Burril) Winslow (EL-TARABILY;

SIVASITHAPARAM, 2006).

A rápida capacidade de reprodução e assimilação de nutrientes, confere às leveduras

uma ótima ação competitiva no ambiente em que se encontram, sendo a competição por

nutrientes e espaço um dos principais mecanismos de biocontrole destes micro-organismos

(LAHLALI et al., 2011). Alguns representantes do gênero Candida e Rhodotorula também já

foram relatados como produtores de compostos quelantes de íons férricos (sideróforos) (EL-

TARABILY; SIVASITHAPARAM, 2006; ROSA et al., 2010). Estas características também

permitem o bloqueio da entrada de patógeno por meio de lesões na epiderme devido a

velocidade de colonização de ferimentos (ROBLIGLIO et al., 2011).

Pesquisas recentes têm revelado o potencial de leveduras no controle da VB do

cacaueiro, ao inibir o crescimento de M. perniciosa (CABRAL et al., 2009). A utilização de

tais micro-organismos como agentes biocontroladores se dá devido ao alto potencial

competidor (ZHANG et al., 2007) ao secretarem toxinas killer (WALKER et al., 1995),

produzirem compostos voláteis (BRUCE et al., 2004) e secretarem enzimas hidrolíticas

capazes de degradar a parede celular de fitopatógenos (MASIH; PAUL, 2002; URQUHART;

31

PUNJA, 2002), capacidade de suportar mudanças no ambiente e condições de estresse (SUI et

al., 2015), tolerância à poluentes, óleos essenciais dos vegetais, fitoalexinas e alguns

fungicidas (VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000); sobreviverem saprofiticamente (AFSAH-

HEJRI, 2013); e tolerarem condições adversas (HU et al., 2015). Apesar destas

características, algumas práticas de manejo podem influenciar a microbiota epifítica das

leveduras, inclusive a utilização de alguns defensivos como os ditiocarbamatos e os

benzimidazóis, os quais apresentam efeito inibitório (VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000).

A utilização de leveduras para o biocontrole de fitopatógenos ainda se concentra na

patologia pós-colheita (TIAN et al., 2004; HU et al., 2015). Entretanto, pesquisas recentes

têm demonstrado o potencial destes micro-organismos no controle de doenças ocasionadas

ainda no campo, promovendo também a germinação de sementes, o crescimento de plantas

(EL-MEHALAWY et al., 2004; EL-TARABILY, 2004; KAMAL et al., 2009; KHAN et al.,

2012) e a indução de resistência, através do próprio organismo, ou seus derivados como

carboidratos, proteínas, ácidos graxos, entre outros (SPADARO; GULLINO, 2004;

WALTERS et al., 2005), atuando como elicitores capazes de ativar respostas de defesa

localizada ou sistêmica em plantas (DI PIERO et al., 2005; ZANARDO et al., 2009).

Diversas pesquisas estão sendo realizadas no sentido de elucidar quais as substâncias

secretadas pelas leveduras que estão atuando na inibição do crescimento, germinação e/ou

esporulação do patógeno, ou como bioelicitores de respostas de defesa da planta (ZANARDO

et al., 2009) e secreção de fitohormônios (SUN et al., 2014). Dentre estas substâncias

destacam-se enzimas como peroxidases, glucanases e quitinase, que além de atuarem

diretamente sobe o patógeno, são consideradas bioelicitores pela indução à produção de

substâncias que estão relacionadas à resistência das plantas à patógenos como fitoalexinas, a

felilalamina amônio liase e o fitohomônio etileno (EL-TARABILY; SIVASITHAPARAM,

2006; HAÏSSAM, 2011). Diversos relatos sobre a produção de enzimas hidrolíticas por

leveduras são citados na literatura, a exemplo de isolados das espécies de A. pullulans, T.

albescen e C. saitoana, com ação sobre os patógenos P. expansum, P. xantii e B. cinerea,

repectivamente (EL-TARABILY; SIVASITHAPARAM, 2006; ROSA et al., 2010;

URQUHART; PUNJA, 2002)

Paredes das células fúngicas contêm α quitina, que difere da alomorfa β quitina em

relação ao empacotamento e à polaridade de cadeias adjacentes (AAM et al., 2010; CHEN et

al., 2010). As quitinases são enzimas sintetizadas por vários organismos como bactérias,

fungos filamentosos e leveduras, que possuem atividade quitinolítica responsável por clivar

ligações glicosídicas β-1,4 presentes nos polímeros de N-acetilglicosamina (GlcNac),

32

apresentando como principal função a remodelação da parede celular e outros, como

processos que envolvem a patogênese e a separação de células filhas, função utilizado pela S.

cerevisiae em reprodução (GOHEL et al.,2006). Além de quitina, a parede celular de

leveduras é formada por outros componentes principais como mananaproteínas e glucanas

(polímeros de β-1,3 e β-1-6 glicose), presentes na parede externa e interna respectivamente

(KIM; YUN, 2006). As glucanases também estão envolvidas em eventos morfogenéticos,

como brotamento celular, conjugação e esporulação, entretanto o aumento da atividade desta

enzima foi relatado quando a levedura S. cerevisae foi cultivada meios indutores com

concentrações de glicose entre 2 e 8 % m/v (DRAKE et al., 2012).

As leveduras têm sido relatadas como promissores agentes de biocontrole, pois além

de atuarem por diversos mecanismos, apresentam características que as diferem de alguns

fungos filamentosos utilizados em formulações comerciais, a exemplo da capacidade de

produzirem toxinas killer, uma glicoproteína que pode agir diretamente sobre o patógeno

(COELHO et al., 2011) e atuar em concomitância com outros mecanismos antagônicos, e por

não produzirem micotoxinas e esporos alergênicos como os fungos filamentosos (GOUVEA,

2007; VIANA et al., 2012).

Apesar da crescente busca por produtos e métodos sustentáveis, que minimizem os

impactos causados pela utilização de agroquímicos no controle de doenças de plantas, o

número de bioprodutos disponíveis para comercialização ainda é pequeno. Até o ano de 2014,

apenas sete produtos microbiológico possuíam registro no Ministério da Agricultura Pecuária

e Abastecimento (MAPA) para utilização na agricultura brasileira, sendo seis deles a base de

fungos filamentosos e um a base de bactéria (GIARETTA, 2014). Atualmente alguns

produtos cujo princípio ativo são fungos leveduriformes, estão disponíveis comercialização e

utilização em alguns países, a exemplo do Aspire® e Next® que são produzidos a base da

espécie Candida oleophila e atuam sobre diversas culturas em pós-colheita (DROB et al.,

1998; DROB et al., 2002; VERO et al., 2002).

Mesmo diante dos resultados obtidos até o momento, a bioprospecção por agentes de

biocontrole que co-habitem o mesmo nicho de espécies vegetais de grande importância

econômica como cacaueiro, associada a busca por genótipos que apresentem genes

responsáveis pela manutenção e durabilidade do caráter de resistência a vassoura de bruxa e

monilíase, é de suma importância para a mitigação dos impactos causados por estas

fitomoléstias.

Diante do exposto, o presente trabalho objetivou a seleção genótipos de cacaueiro com

resistência a vassoura de bruxa, ampliando-se a fonte de resistência a VB nos materiais já

33

anteriormente selecionados como resistentes a esta doença, e incorporar à população gerada,

genes de resistência à monilíase (M. roreri), além de determinar a diversidade e biologia de

leveduras que habitam a superfície de órgãos vegetais de cacaueiros, avaliar o potencial

antagônico destas leveduras contra M. perniciosa, investigar a sua ação no biocontrole da VB

e na ativação de crescimento de plântulas e mudas de cacaueiro.

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AFSAH-HEJRI, L. Saprophytic yeasts: effective biocontrol agents against Aspergillus flavus.

International Food Research Journal, Toronto, v. 20, n. 6, p. 3403-3409, 2013.

AHMED, N.; SHAH, F. A.; ZANGAR, G. H.; WANI, S. A. Line x tester analysis for the

study of combining ability in hot pepper (Capsicum annuum L.). Capsicum and Eggplant

Newsletter, Turin, n. 17, p. 38-41, 1998.

AIWE M. C.; PHILLIPS-MORA, W. The causal agents of witches´broom and frost pod rot of

cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new linage of Marasmiaceae. Mycologia, New

York, v. 97, p. 1012-1022, 2005.

ALBUQUERQUE, P. S. B.; BASTOS, C. N.; LUZ, E. D. M. N.; SILVA, S. D. V.

M. Doenças do cacaueiro. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.;

BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. F. A. (Eds.). Manual de fitopatologia. 4.

ed., Piracicaba: Ceres, 2005. v. 2, cap. 18, p. 151-164.

ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. 4ª ed.

New York: John Wiley & Sons, 1996. 878 p.

ALLARD, R. W. Princípios do melhoramento genético das plantas. São Paulo: Edgard

Blucher, 1971. 381 p.

ALMEIDA, R. B. Traços da história econômica da Bahia no último século e meio. Revista de

desenvolvimento econômico, Salvador, n. 19, p. 82-101, 2009.

ALVERSON. W. S.; WHITLOCK, B. A.; NYFFELER, R.; BAYER, C.; BAUM, D. A.

Phylogeny of the core Malvales: evidence from ndhF sequence data. American Journal of

Botany, Lancaster, v. 89, p. 1474-1486, 1999.

ANDEBRHAN, T. Relação entre a idade do fruto do cacaueiro e suscetibilidade a

Crinipellis perniciosa. Belém: CEPLAC/ CEPEC, 1981. p. 315-317 (Informe Técnico).

34

ANDEBRHAN, T. Studies on the epidemiology and controlo f witches’ broom disease of

cocoa in the Brazilian Amazon. In: 9th Internacional Cocoa Research Conference.

Proceedings… Lome, 1984. p. 395-402.

ANDEBRHAN, T.; ALMEIDA, L. C.; NAKAYAMA, H. I. Resistência de Theobroma cacao

L. a Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer: a experiencia da Amazônia Brasileira.

Agrotrópica, Itabuna, v. 10, p. 49-60, 1998.

ANDEBRHAN, T.; FIGUEIRA, A.; YAMADA, M. M.; CASCARDO, J.; FURTEK, D. B.

Molecular fingerprinting suggests two primary outbreaks of witches’ broom disease

(Crinipellis perniciosa) of Theobroma cacao in Bahia, Brazil. European Journal of Plant

Pathology, Dordrecht, v. 105, n. 2, p. 167-175, 1999.

AAM, B. B.; HEGGSET, E. B.; NORBERG, A. L.; SORLIE, M.; VARUM, K. M.; EIJSINK,

V. G. Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine.

Marine Drugs, v. 8, p. 1482-1517, 2010.

CHEN, C. Y.; YANG, C. Y.; CHEN, A. H. Biosorption of Cu(II), Zn(II), Ni(II) and Pb(II)

ions by cross-linked metal-imprinted chitosans with epichlorohydrin. Journal of

Environmental Management, London, v. 92, p. 796-802, 2011.

ANDEBRHAN, T.; BASTOS, C. N. Variabilidade de isolados de Crinipellis perniciosa.

Belém: CEPLAC/ CEPEC, 1985. p. 51-56 (Informe Técnico).

ANDREWS, J. H.; HARRIS, R. F. The ecology and biogeography of microorganisms of plant

surfaces. Annual Review Phytopathology, Saint Paul, v. 38, p. 145-180, 2000.

ASCENSO, J. C. O seminário sobre seleção e melhoramento do cacaueiro da VIII conferência

internacional do cacau. Estudos Agronómicos, Lisboa, v. 3, n. 8, p. 135-141, 1962.

ASSIS, S. M. P.; MARIANO, R. L. R.; SILVA-HANLIN, D. M. W.; DUARTE, V. Mancha-

aquosa do melão causada por Acidovorax avenae subsp. citrulli no Estado do Rio Grande do

Norte. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 24, n. 2, p. 191, 1999.

BAKER, R.E.D; CROWDY, S.H. Studies in the witches’ broom disease of cocoa caused by

Marasmius pernicious Stahel.: Introduction, symptons and a etiology. Mem Imperial

College Tropical Agriculture, Trinidad and Tobago, n. 7, p. 1-28, 1943.

35

BAKER, R. E. D.; HOLLIDAY, P. Witches' broom disease of cocoa (Marasmius perniciosus

Stahel). Phytopathological Papers, Oxon, n. 2, 1957.

BARTLEY, B. G. D. The genetic diversity of cacao and its utilization. Cambridge: CABI

Publishing, 2005. 341 p.

BARTLEY, B. G. D. Cacao, Theobroma cacao. FAO Plant Production and Protection

Paper, Rome, v. 70, p. 25-42, 1986.

BARTLEY, B. G. D. The status of genetic resistance in cocoa to Crinipellis perniciosa

(Stahel) Singer. In: INTERNATIONAL COCOA RESEARCH CONFERENCE, 6. 1977,

Caracas. Proceedings... Caracas: Alliance of Cocoa Producing Countries, 1977. p. 1-18.

BART-PLANGE, A.; BARYEH, E. A. The physical properties of Category B cocoa beans.

Journal of Food Engineering, Essex, v. 60, n. 3, p. 219-227, 2003

BASTOS, C. N. Resultados preliminares sobre a eficácia de Trichoderma viride no controle

da vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira,

Brasília, v. 13, p. 340-342, 1988.

BASTOS, C. N. Comparação morfológica e patológica de isolados de Crinipellis perniciosa

(Stahel) Singer. Belém: CEPLAC/ CEPEC, 1986. p. 45-49 (Informe Técnico).

BASTOS, C. N. Patogenicidade e características do isolado de Crinipellis perniciosa de

Uruçuca, Bahia. Fitopatologia brasileira, Brasília, v. 15, p. 344-346, 1990.

BASTOS, C. N. Potential de Trichoderma viride no controle da vassoura-de-bruxa

(Crinipellis perniciosa) do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 21, p. 509-512,

1996.

BASTOS, C. N. Effect of water potential on growth and viability of conidia of Trichoderma

viride after storage at different temperatures. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 22, p.

258-261, 1996.

BASTOS, C. N. Mycoparasitic nature of the antagonism between Trichoderma viride and

Crinipellis perniciosa. Fitopatologia Brasileira, v. 21, n. 1, 1996.

BASTOS, C. N. Retrospectiva e avanços no controle da vassoura-de-bruxa do cacaueiro.

Fitopatologia Brasileira, v.25, p. 305-306, 2000.

36

BASTOS, C. N.; ANDEBRHAN, T. Urucu (Bixa orellana): nova espécie hospedeira da

vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa) do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, Brasília,

v. 11, p. 963-965, 1986.

BASTOS, C. N.; EVANS, H. C.; SAMSON, R. A. A new hiperparasitic fungus,

Cladobobryum amazonense, with potential for control of fungal pathogens of cocoa.

Transactions of the British Mycological Society, Cambridge, v. 77, p. 273-278, 1981.

BLAKEMAN, J. P. Foliar bacterial pathogens: epiphytic grown and interaction on leaves.

Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 70, p. 49-50, 1991.

BEATTIE, G. A.; LINDOW, S. E. Bacterial colonization of leaves: a spectrum of strategies.

Phytopathology, Saint Paul, v. 89, n. 5, p, 353-359, 1999.

BEZERRA, J. L.; COSTA, J. C. B.; POMELA, A. W. V.; ALMEIDA, O. C. Como produzir

Tricovab para controlar a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, Brasília,

v.25, p.359, 2000.

BRUCE, A.; VERRALL, S.; HACKETT, C. A.; WHEATLEY, R. E. Identification of volatile

organic compounds (VOCs) from bacteria and yeast causing growth inhibition of sapstain

fungi. Holzforschung, Berlin, v.58, p.193-198, 2004.

BRASIL. Portal Brasil. Economia e emprego. Bahia retoma exportações de cacau

após vencer a vassoura-de-bruxa. Disponível em <http://www.brasil.gov.br/economia-e-

emprego/2015/11/bahia-retoma-exportacoes-de-cacau-apos-vencer-a-vassoura-de-

bruxa>. Acesso em: 26 jan. 2016.

CABRAL, A. S. Killer yeasts inhibit the growth of the phytopathogen Moniliophthora

perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease. Brazilian Journal of Microbiology,

São Paulo, v. 40, p. 108-110, 2009.

CHAPMAN, R. K.; SORIA, S. J. Comparative Forcipomyia (Diptera, Ceratopogonidae)

pollination of cacao in Central America and Southern Mexico. Revista Theobroma, Itabuna,

v. 13, p. 129-139, 1983.

CHEESMAN, E. E. Notes on the nomenclature, classification and possible relationships of

cacao populations. Tropical Agriculture, Ibadan, v. 21, p. 144-159, 1944.

CHEESMAN, E. E.; POUND, F. J. Further notes on criterion of selection in cacao. Annual

Report on Cacao Research. Trinidad, n. 3, p. 21-24, 1934.

37

CHEN, Y.; YAN, F.; CHAI, Y.; LIU, H.; KOLTER, R.; LOSICK, R.; GUO, J. Biocontrol of

tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on

conserved genes mediating biofilm formation. Environmental microbiology, Oxford, v. 15,

n. 3, 2103.

COMISSÃO EXECUTIVA DO PLANO DA LAVOURA CACAUEIRA. Cacau:

História e Evolução. Disponível em: <http://www.ceplac.gov.br/radar/radar_cacau.htm>

Acesso em: 04 fev. 2016.

COSTA, J. C. B.; BEZERRA, J. L.; SANTOS FILHO, L. P.; ALVES, M. C.; MOURA, E. M.

Controle biológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro da Bahia, Brasil. In: W. BETTIOL; M.

A. B. MORANDI (Orgs.). Biocontrole de Doenças de Plantas: uso e perspectivas. Embrapa

Meio Ambiente, Jaguariúna, p. 245–266, 2009.

CALLE, H.; COOK, A. A.; FERNAND, S. Y. Histology of witches’ broom caused in cacao

by Crinipellis perniciosa. Phytopathology, Saint Paul, v. 72, p. 147-148, 1982.

CHEN, Y. C.; MILLIMAN, E. J.; GOULET, I.; COTE, J.; JACKSON, C. A.;

VOLLBRACHT, J. A.; YU, M. C. Protein Arginine Methylation Facilitates

Cotranscriptional Recruitment of Pre-mRNA Splicing Factors. Molecular and Cellular

Biology, Washington, v. 30, n. 21, p. 5245-5256, 2010.

COELHO, A. R.; NÓBREGA, G. M. A.; PAGNOCCA, F. C.; HOFFMANN, F. L.;

HARADA, K. I.; HIROOKA, E. Y. Avaliação do potencial antagônico de leveduras, visando

biocontrole de deterioração por Penicillium expansum. Semina Ciências Agrárias,

Londrina, v. 32, p. 1879-1892, 2011.

COMSTOCK, R. E.; ROBINSON, H. F. Estimation of overage dominance of genes. In:

GOWEN, J. W. Heterosis. Ames: Iowa State College, 1952. p. 494-516.

COSTA, J. C. B. Progresso da vassoura-de-bruxa em órgãos vegetativos do cacaueiro em

Altamira e Tomé- Açu, Pa. 1993. 52 f. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) -

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.

COSTA, J. C. B. et al. Controle biológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro da Bahia,

Brasil. In: BETTIOL, W. Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna:

Embrapa meio ambiente, 2009. p. 245-266.

CRUZ, C. D.; REGAZZI, A. J.; CARNEIRO, P. C. S. Modelos biométricos aplicados ao

melhoramento genético. Viçosa, MG: UFV, 2004. Cap. VII, p. 223-375.

38

CUATRECASAS, J. Cacao and its allies: a taxonomic revision of the genus Theobroma.

Contributions from the United States National Herbarium. Washington, n. 35, p. 379-

614, 1964.

DANTAS NETO, A. et al. Caracterização de uma população de cacaueiro para mapeamento

de genes de resistência à vassoura-de-bruxa e podridão-parda. Fitopatologia Brasileira,

Brasília, v. 30, p. 380-386, 2005.

DELGADO, J. C.; COOK, A. A. Nuclear condition of the basidia, basidiospores, and

mycelium of Marasmius perniciosus. Canadian. Journal.of Botany, Ottawa, v. 54, p. 66-72,

1976.

DROBY, S.; COHEN, L.; DAUS, A.; WEISS, B.; HOREV, E.; CHALUTZ, E.; KATZ, H.;

KEREN-TZOUR; M.; SHACHNAI, A. Commercial testing of Aspire: a biocontrol

preparation for the control of postharvest decay of citrus. Biological Control, Orlando, v.12,

p.97-101, 1998.

DROBY, S., VINOKUR, V., WEISS, B., COHEN, L., DAUS, A., GOLDSCHMIDT, E. E.,

PORAT, R. Induction of resistance to Penicillium digitatum in grapefruit by the yeast

biocontrol agent Candida oleophila. Phytopathology, Saint Paul, v. 92, p. 393-399, 2002.

DI PIERO, R. M.; GARCIA JUNIOR, D.; TONUCCI, N. M. Indutores bióticos. In:

ALVALCANTI, L. S.; DI PIERO, R. M.; CIA, P.; PASCHOLATI, S. F.; RESENDE, M.

L.V.; ROMEIRO, R. da S. (Eds.). Indução de resistência em plantas a patógenos e insetos.

Piracicaba: FEALQ, 2005. p. 29-50.

__________. Origem e dispersão de Theobroma cacao L.: um novo cenário. In: DIAS, L. A.

S (editor). Melhoramento genético do cacaueiro. Viçosa, MG: FUNAPE, UFG, 2001a, p.

81-127.

DIAS, L. A. S. Contribuições do melhoramento. In: DIAS, L. A. S. (editor) Melhoramento

genético do cacaueiro. Viçosa, MG: FUNAPE, UFG, 2001b, p. 493-529

ELAD Y. Biocontrol of foliar pathogens: mechanisms and application. Communications in

Agricultural and Applied Biological Sciences, v. 68, p. 17-24, 2003

EL-MEHALAWY, A. A. et al. Influence of maize root colonization by the rhizosphere

actinomycetes and yeast fungi on plant growth and on the biological control of late wilt

disease. International journal of agriculture and biology, Beijing, v. 6, n. 4, 599-605,

2004.

39

EL-TARABILY, K. A. Suppression of Rhizoctonia solani diseases of sugar beet by

antagonistic and plant growth-promoting yeasts. Journal of Applied Microbiology, Oxford,

v. 96, p. 69-75, 2004.

EL-TARABILY, K. A.; SIVASITHAMPARAM, K. Potential of yeasts as biocontrol agents

of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Mycoscience, Tokyo, v.

47, p. 25-35, 2006.

EVANS, H. C. Pleomorphism in Crinipellis perniciosa causal agent witches’broom disease of

cocoa. Transactions of the British Mycological Society, Cambridge, v. 74 p. 515-523, 1980.

EVANS, H.C.; BASTOS, C.N. Uma reavaliação do ciclo de vida da vassoura de bruxa,

Crinipellis perniciosa. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.4, p.104, 1979.

EVANS, H. C.; SOLORZANO, G. R. Witches’s broom disease:wrong experimente right

results. In International Cocoa Research Conference, 8., Cartagena, Colombia, 1982.

Proceeedings...Lagos: Cocoa Producers Alliance, 1982. p. 415-318.

FALEIRO, F. G. et al. Mapping QTLs for witches’broom (Crinipellis perniciosa) resistance

in cacao. Euphytica, Wageningen, v. 149, p. 227-235, 2006.

FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BELLON, G.; BORGES, T.A.; ANJOS, J. R. N.;

PEIXOTO, J. R.; BRAGA, M. F.; SANTOS, D. G. Diversidade genética de espécies silvestres

de maracujazeiro com resistência múltipla a doenças com base em marcadores RAPD.

Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 29, p. 325, 2004. Suplemento.

FAO. Prodution Yearbook. v. 54. Roma. 2002.

FRIAS, G. A.; PURDY, L. H.; SCIMIDT, R. A. Infection biology of Crinipellis perniciosa

on vegetable flushes of cacao. Plant Disease, Sain Paul, v. 75, n. 6, p.552-556, 1991.

FUENTEFRIA, A. M.; FAGANELLO, J.; PAZZINI, F.; SCHRANK, A.; VALENTE, P.;

VAINSTEIN, M. Typing and patterns of cellular morphological alteration in Cryptococcus

neoformans and Cryptococcus gatti isolates exposed to a panel of killer yeats. Medical

Mycology, Oxford, v. 45, p. 1-10, 2007.

GALANTE, R. S. Estudos de quitinases de Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime &

Phillips-Mora, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro: purificação,

caracterização e modelagem comparativa. 2008. 90 f. Dissertação (Mestrado em

Biotecnologia). Universidade Estadual de Feira de Santana, 2008.

40

GERALDI, I. O.; MIRANDA FILHO, J. B. Adapted models for the analysis of combining

ability of varieties in partial diallel crosses. Revista Brasileira de Genética, Ribeirão Preto,

v. 11, n. 2, p. 419-430, 1988.

GOHEL, V.; SINGH, A.; VIMAL, M.; ASHWINI, P.; CHHATPAR, H. S Bioprospecting

and antifungal potential of chitinolytic Microorganisms. African Journal Biotechnology,

Nairobi, v. 5, p. 54-72, 2006.

GOUVEIA, A. Controle em campo de pó-colheita de doenças e metabolismo do

morangueiro após tratamento com Saccharomyces cerevisiae. 2007. 85 f. Tese (Doutorado

em Agronomia) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba.

GIARETTA R. D.; FREITAS, L. G.; XAVIER, D. M.; ZOOCA, R. J. F.; FERRAZ, S.;

LOPES, E. A. Incorporação ao solo de substrato contendo micélio e conídios de Pochonia

chlamydosporia para o manejo de Meloidogyne javanica. Ciência Rural, Santa Maria, v. 44,

n. 4, p. 629-633, 2014.

GRIFFING, B. A concept of general and specific combining ability in relation to diallel

crossing systems. Australian Journal of Biological Sciences, East Melbourn, v. 9, p. 463-

493, 1956.

HANCOCK, B. L. Producción y transporte del haba de cacao. In: BECKETT, S. T. (Ed.).

Fabricación y utilización industrial del chocolate. Zaragoza: Acribia, 1994. p. 9-32

HAYMAN, B. I. The theory and analysis of diallel crosses. Genetics, Bethesda, v. 39, p. 789-

809, 1954.

HOLLIDAY, P. Witches’s broom disease of cacao (Marasmius pernicious Stahel). London.

Her Majesty’s Stationery Office (HMSO). 1952.

HU, H.; XU, Y.; LU, H.; XIAO, R.; ZHENG, X.; YU, T. Evaluation of yeasts from Tibetan

fermented products as agents for biocontrol of blue mold of Nashi pear fruits. Journal of

Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology), Hangzhou, v. 16, n. 4,

275-285, 2015.

HAISSAM, J.M. Pichia anomala in biocontrol for apples: 20 years of fundamental research

and practical applications. Antonie Van Leeuwenhoek, Amsterdam, v. 99, n. 1, p. 93-105,

2011.

41

ICCO. International Cocoa Organization. Produção mundial de cacau. Disponível em:

<http://www.icco.org/>. Acesso em 16 fev. 2016.

INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Sistema IBGE de

Recuperação Eletrônica (SIDRA). 2014. Disponível em:

http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/agric/. Acesso em: 26 jan. 2016.

INACIO, J.; PORTUGAL, L.; MARTINS, I. S.; FONSECA, A. Phylloplane yeasts from

Portugal: seven novel anamorphic species in the Tremellales lineage of the Hymenomycetes

(Basidiomycota) producing orange-coloured colonies. FEMS Yeast Research, Oxford, v. 5,

p. 1167-1183, 2005.

KAMAL A. M. et al. Biological control of Fusarium wilt in tomato by plant growth

promoting yeasts and rhizobacteria. Plant Pathology Journal, v. 25, p. 199-204, 2009.

KILARU, A.; HASENSTEIN, K. H. Development and pathogenicity of the fungus Crinipellis

perniciosa on interaction with cacao leaves. Phytopathology, Saint Paul, v. 95, p. 101–107,

2005.

KANG, B. G.; KIM, W. T.; YUN, H. S.; CHANG, S. C. Use of plant growth-promoting

rhizobacteria to control stress responses of plant roots. Plant Biotechnology Reports, New

York, v. 4, p. 179-183, 2010.

KIM, K. S.; YUN, H. S. Production of soluble β-glucan from the cell wall of Saccharomyces

cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 39, n. 3, p. 496-500, 2006.

LACHANCE, M. A.; STARMER, W. T. Ecology and yeasts. In: KURTZMAN, C. P.; FELL,

W. F. (Eds.). The Yeast, a Taxonomic Study. 4ª. ed. Amsterdam: Elsevier, 1998, p. 21-30.

LACHENAUD, P.; ZHANG, D. Genetic diversity and population structure in wild stands of

cacao trees (Theobroma cacao L.) in French Guiana. EDP Sciences, Montpellier, v. 65, n.

310, p. 1-7, 2008.

L'ÊCLUSE, C. Rariorum plantarum historia. 1601. Disponível em: <http://caliban.mpiz-

koeln.mpg.de/~stueber/ecluse/index.html>. Acesso em: 14 jan. 2016.

LOGUERCIO, L. L. et al. Controle biológico das doenças do cacaueiro. In: VALLE, R. R.

(Ed.). Ciência, Tecnologia e Manejo do Cacaueiro. 2ª. ed. Brasília: CEPLAC, 2012. p. 11-

30.

42

LOGUERCIO, L. L.; CARVALHO, A. C.; NIELLA, G. R.; SOUZA J. T.; POMELLA, A.

W. V. Selection of Trichoderma stromaticum isolates for efficient biological control of

witches’ broom disease in cacao. Biological Control, Orlando, v. 51, p. 130-139, 2009.

LOPES, U. V.; et al. Cacao breeding in Bahia, Brazil - strategies and results. Crop breeding

and applied biotechnology, Londrina, p. 73-81, 2011.

LUZ, E. D. M. N. et al. Evaluating resistance/tolerance to Witches' Broom disease in

Bahia, Brazil. Final Report to ACRI. CEPLAC/CEPEC, p. 56, 1997.

LUZ, E. D. M. N.; ALMEIDA, H. A.; MACHADO, R. C. R. Períodos de incubação,

secamento de vassouras, produção de basidiomas e atividade de Crinipellis perniciosa em

ramos e frutos de cacaueiro na Bahia. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE

FITOPATOLOGIA, 27. 1994. Itajaí. Anais... Itajaí: Sociedade Brasileira de Fitopatologia,

1994. p. 341-341.

LUZ, E. D. M. N. et al. Vassoura-de-bruxa do cacaueiro: novos enfoques sobre uma velha

doença. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 14, p. 59-111, 2006.

LUZ, E. D. M. N. et al. Atualidades no manejo de doenças do cacaueiro. In: Patologia

Florestal: desafios e perspectivas. NEFIT: Suplema, p. 313-329, 2013.

LEAL, J. B.; SANTOS, L. M.; SANTOS, C. A. P.; PIRES, J. L.; AHNERT, D.; CORRÊA, R.

X. Diversidade genética entre acessos de cacau de fazendas e de banco de germoplasma na

Bahia. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 43, n. 7, 2008.

LOPES, R. B. M.; COSTA, L. E. O; VANETTI, M. C. D.; ARAÚJO, E. F.; QUEIROZ, M.

V. Endophytic bacteria isolated from common bean (Phaseolus vulgaris) exhibiting high

variability showed antimicrobial activity and quorum sensing inhibition. Current

microbiology, New York, v. 71, n. 4, p. 509-516, 2015.

LAHLALI, R.; HAMADI, Y.; EL GUILLI, M.; JIJAKLI, M. H. Efficacy assessment of

Pichia guilliermondii strain Z1, a new biocontrol agent, against citrus blue mould in Morocco

under the influence of temperature and relative humidity. Biological Control, Orlando, v. 56,

p.:217-242011

LYNCH, M.; WALSH, B. Genetics and analysis of quantitative traits. Sinauer Associates,

Inc. Sunderland 1998.

MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia. São Paulo: Pearson

Education, 2004. 608 p.

43

MASIH, E. I.; PAUL, B. Secretion of beta-1,3-glucanase by the yeast Pichia

membranifaciens and its possible role in the biocontrol of Botrytis cinerea causing mold

disease of the grapevine. Current Microbiology, New York, v. 44, p. 391-395, 2002.

McGEARY, F. M.; WHEELER, B. E. J. Growth rates of, and mycelial interactions, between

isolates of Crinipellis perniciosa from cocoa. Plant Pathology, Saint Paul, v. 37, p. 489-498,

1988.

MEDEIROS, F. H. V. et al. A novel, integrated method for management of witches’broom

disease in Cacao in Bahia, Brazil. Crop Protection. Guildford, n. 29, p. 704-711, 2010.

MIDLEJ, R. R.; SANTOS, A. M. Economia do Cacau. In: VALLE, R. R. (Ed.). Ciência,

Tecnologia e Manejo do Cacaueiro. 2ª. ed. Brasília: CEPLAC, 2012. p. 655-672.

MONTEIRO, W. R. et al. Population breeding activities in Brazil. In: ESKES, A. B.;

EFRON, Y. (Org.). Global approaches to cocoa germplasm utilization and conservation.

1 ed.: CFC/OCCO/IPGRI, v. 1, p. 28-34, 2006.

MONTEIRO, W. R.; AHNERT, D. Melhoramento Genético do Cacaueiro. In: VALLE, R.

R. (Ed.). Ciência, Tecnologia e Manejo do Cacaueiro. 2ª. ed. Brasília: CEPLAC, 2012. p.

11-30.

MOTILAL L; BUTLER D. Verification of identities in global cacao germplasm collections.

Genetic Resources and Crop Evolution, Dordrecht, v. 50, p. 799–807, 2003.

NAKAYAMA, L. H. I.; SOARES, M. K. M.; DA APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO ANATÔMICO DA FOLHA E DO CAULE DO

CACAUEIRO (Theobroma cacao L.) Scientia Agricola, Piracicaba, v. 53, n. 1, 1996.

NIELLA, G. R. Esporulação de Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer em frutos de cacau

no Sudeste da Bahia e sensibilidade “in vitro” a quatro compostos sulfurados. 1997. 60

f. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras.

NIELLA, G. R.; RESENDE, M. L. V.; CASTRO, H. A.; CARVALHO, G. A.; SILVA, L. H.

C. P. Aperfeiçoamento da metodologia de produção artificial de basidiocarpos de Crinipellis

perniciosa. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 24, p. 523-527, 1999.

ODJAKOVA M. E.; HADJÜVANOVA, C. The complexity of pathogens defense in plants.

Journal of plant physiology, Stuttgart, v. 27, n. 12, p. 101-109, 2001.

44

OLIVEIRA, M. L. Eficácia de fungicidas triazóis no controle da vassoura-de-bruxa do

cacaueiro causada por Crinipellis perniciosa. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 29, p.

149, 2004a.

__________. Estrobilurinas: novo grupo de fungicidas com eficácia contra a vassoura-de-

bruxa do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 29, p. 285, 2004b.

OLIVEIRA, M. L.; LUZ, E. D. M. N. Vassoura-de-bruxa. In:__________. Identificação e

manejo das principais doenças do cacaueiro no Brasil. Ilhéus, CEPLAC/CEPEC/SEFIT,

2005, p. 1533.

PAIM, V. R. L. et al. Sources of resistance to Crinipellis perniciosa in progenies of cacao

accessions collected in the Brazilian Amazon. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 63, n. 6, p.

572-578, 2006.

PAIM, V. R. L. M. Estudo da diversidade genética de novas fontes de resistência à

vassoura-de-bruxa do cacaueiro. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia

Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus.

PEGUS, J. E. Aspects of the host-parasite relationship in the Theobroma cacao

L./Marasimus perniciosus Stahel disease complex. 1972. Dissertação (Mestrado) -

University of West Indies, Trinidad.

PEREIRA, J. L.; VALLE, R. R. Manejo Integrado da vassoura de bruxa do cacaueiro. In:

VALLE, R.R. Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro. 2ª. ed. Brasília: CEPLAC, 2012

p. 11-30, 2012.

PEREIRA J. L.; RAM, A.; FIGUEIREDO J. M; ALMEIDA L. C. C. Primeira ocorrência de

vassoura-de-bruxa na principal região produtora de cacau do Brasil. Agrotrópica, Itabuna, v.

1, p.79-81, 1989.

PINTO, L. R. M.; PIRES, J. L. Seleção de plantas de cacau resistentes à vassoura-de

bruxa. Ilhéus: CEPLAC/ CEPEC, 1998. 181 p. (Boletim Técnico).

PIRES, J. L. Avaliação quantitativa e molecular de germoplasma para o melhoramento

do cacaueiro com ênfase na produtividade, qualidade do fruto e resistência a doenças.

2003. Tese (Doutorado em Melhoramento de Plantas) - Universidade Federal de Viçosa,

Viçosa.

45

PIRES, J. L.; MONTEIRO, W. R.; LUZ, E. D. M. N.; SILVA, S. D. V. M.; PINTO, L. R. M.;

FIGUEIRA, A.; GRAMACHO, K. P.; LOPES, U. V.; AlBUQUERQUE, P. S. B.;

YAMADA, M. M.; AHNERT, D. E.; BRUGNEROTTO, M. I. B.; Cocoa breeding for

Witches´ broom resistance at CEPEC, Bahia, Brazil. In: INTERNATIONAL WORKSHOP

ON THE CONTRIBUTION OF DISEASE RESISTANCE TO COCOA VARIETY

IMPROVEMENT, 1999. Salvador. Proceedings... Salvador: INGENIC, UK. p. 91-101.

PHILLIPS-MORA, W.; AIME, M. C.; WILKINSON, M. J. Biodiversity and biogeography of

the cacao (Theobroma cacao) pathogen Moniliophthora roreri. Plant Pathology, London, v.

56, p. 911-922, 2007.

QUEIROZ, V. T. et al. Identification of a major QTL in cocoa (Theobroma cacao L.)

associated with resistance to witches’ broom disease. Plant Breeding, Berlin, v. 122, n. 3, p.

268-272, 2003.

REHM, H. J. et al. Biotechnology a multi-volume comprehensive treatise, 2ª ed. vol.9.

Enzymes, biomass, food and feed. G. REED; T. W. NAGODAWITHANA. (Eds.). 1995. Cap.

5.

ROCHA, H. M. et al. Wiches’ broom in Bahia Brazil. In: RUDGARD, S. A. et al. (Eds.).

Disease Management in cocoa: comparative epidemiology of witches’ broom. London:

Chapman and Hall, p. 189-200, 1993.

ROCHA, H. M.; WHEELER, B. E. J. Factor influencing production of basidiocarps and the

deposition and germination of basidiospores of Crinipellis perniciosa, the causal fungus of

witches'broom on cocoa (Theobroma cacao). Plant Pathology, Oxford, v. 34, p. 319-328,

1985.

ROSA, M. M.; TAUK-TORNISIELO, S. M.; RAMPAZZO, P. E.; CECCATO-ANTONINI,

S. R. Evaluation of the biological control by the yeast Torulaspora globosa against

Colletotrichum sublineolum in sorghum. World Journal of Microbiology and

Biotechnology, Oxford, v. 26, n. 8, p. 1491-1502, 2010.

ROBIGLIO, A.; SOSA, M. C.; LUTZ, M. C.; LOPES, C. A. SANGORRÍN, M. P. Yeast

biocontrol of fungal spoilage of pears stored at low temperature. International Journal of

Food Microbiology, Amsterdam, v.1 47, n.3, p.211-216, 2011

SAMUELS, G. J. et al. Trichoderma stromaticum sp. nov., a parasite of the cacao witche’s

broom pathogen. Mycological research, Cambridge, v. 104, p. 760-764, 2000.

SANTOS, L. S. Interação antagônica Trichoderma stromaticum - Crinipellis perniciosa:

efeito do clima no biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro e desenvolvimento de

46

marcadores microssatélites. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia

Molecular). Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus.

SANTOS, R. M. F. et al. Marcadores microssatélites relacionados com a resistência à

vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 42, p.

1137-1142, 2007.

SAS Institute Inc (1989) SAS/STAT User´s Guide, version 6.4 ed. Cary, SAS Institute, North

Caroline State University. 846 p.

SCARPARI, L. M. et al. Biochemical changes during the development of witches’ broom: the

most important disease of cocoa in Brazil caused by Crinipellis perniciosa. Journal

Experimental Botany, Oxford, p. 113, 2005.

SCHENBERG, A. C. G. Biotecnologia e Desenvolvimento Sustentável. Estudos Avançados,

São Paulo, v. 24, n. 70, 2010.

SHALABY, M. E.; EL-NADY, M. F. Application of Saccharomyces cerevisiae as a

biocontrol agent against Fusarium infection of sugar beet plants. Acta Biologica

Szegediensis, Szeged, v. 52, n. 2, p. 271-275, 2008.

SILVA, S. D. V. M. et al. Parent selection for cocoa resistance to witche' s broom. Pesquisa

Agropecuária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 45, p. 680-685, 2010.

SILVA, S. D. V. M. et al. Redescrição da sintomatologia causada por Crinipellis

perniciosa em cacaueiro. Agrotrópica, Itabuna, v. 14, n. 1, p. 1-28, Edição especial, 2002.

SILVA, S. D. V. M. Histologia e seleção de variáveis para avaliar resistência de

cacaueiro a Crinipellis perniciosa. 1997. Tese (Doutorado em Fitopatologia) - Universidade

Federal de Viçosa, Viçosa.

SILVA, S. D. V. M.; LUZ, E. D. M. N.; PIRES, J. L.; YAMADA, M. M.; SANTOS FILHO,

L. P. Cacao resistance to Crinipellis perniciosa: diallelic crosses increase genes for

resistance. In: 8th International Congress of Plant Pathology, Christchurch Addendum to

Abstracts of Offered Papers, Christchurch, p. 8, 2003.

SILVA NETO, P. J. et al. Sistema de produção de cacau para a Amazónia brasileira.

Belém, CEPLAC, 2001. 125 p. ISSN 0102-5511

47

SINGER, R. A monographic study of the genera “Crinipellis” and “Chaetocalathus”. Lilloa,

Tucuman, v. 8, p. 441-514, 1942.

SORIA, J. S. de; TONOSAKI, S.; MORENO, J. A polinização do cacaueiro ao vivo. Cacau

Atualidades, Itabuna, n. 3, v. 12, p. 14-18, 1975.

SOUNIGO, O.; LACHENAUD, P.; BASTIDE, P.; CILAS, C.; N'GORAN, J.; LANAUD, C.

Assessment of the value of doubled haploids as progenitors in cocoa (Theobroma cacao L.)

breeding. Journal Applied Genetics, v. 44, p. 339-353, 2003.

SREENIVASAN, T. N., DABYDEEN, S. Modes of penetration of young cocoa leaves by

Crinipellis perniciosa. Plant Disease, Saint Paul, v. 73, n. 6, p. 478-481, 1989.

SOUZA, C. A. S.; DIAS, L. A. S. Melhoramento ambiental e sócio-economia. In: DIAS, L.

A. S (editor). Melhoramento genético do cacaueiro. Viçosa: FUNAPE-UFG, 2001. p. 1-47.

SOUZA, J. T.; POMELLA, A. W. V.; BOWERS, J. H.; PIROVANI, C. P.; LOGUERCIO, L.

L.; HEBBAR, K. P. Genetic and biological diversity of Trichoderma stromaticum, a

mycoparasite of the cacao witches’-broom pathogen. Proceedings of the American

Phytopathological Society, Saint Paul, v. 96, n. 1, p. 61-67, 2006.

SPADARO, D.; GULLINO, M. L. State of the art and future prospects of the biological

control of postharvest fruit diseases. International Journal Food Microbiology, Amsterdan,

v. 91, p. 185-194, 2004.

STADLER, B.; MULLER, T. Aphid honeydew and its effect on the phyllosphere microflora

of Picea abies (L.) Karst. Oecologia, Berlin, v. 108, p. 771-776, 1996.

STAHEL, G. Marasmius perniciosus nov.spec.: the cause of the krulloten-disease of cacao in

Suriname. Bulletin, van den Landbouw, n. 33, p. 1-26, 1915.

SUI, Y.; WISNIEWSKI, M.; DROBY, S.; LIUA, J. Responses of yeast biocontrol agents to

environmental stress. Applied and environmental microbiology, Washington, v. 81, n. 9, p.

2968-2975 2015.

TIAN, S.; QIN, G.; XU, Y.; WANG, Y. Application of antagonistic yeasts under field

conditions and their biocontrol ability against postharvest diseases of sweet cherry. Acta

Botanica Sinica, Peiping, v. 46, n. 11, p. 1324-1330, 2004.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed,

2005.

48

TOXOPEUS, H. Cacao (Theobroma cacao L.). In: FERWERDA, F. P; WIT, F. Outlines of

perennial crop breeding in the tropics. Wageningen: Veenman and Zonen, 1969. p. 79-108.

TOXOPEUS, H. Cacao breeding: a consequence of mating system, heterosis and population

structure. In: International Cocoa Research Conference, 4th, 1972. Saint Augustine.

Proceedings…Port-of-Spain: Governnment of Trinidad and Tobago, 1972. p. 3-12.

TREVIZAN, S. D. P.; MARQUES, M. Impactos socioeconômicos da crise do cacau: um

estudo de comunidade-caso. Agrotrópica, Itabuna, v. 14, n. 3, p. 127-136, 2002.

URQUHART, E. J.; PUNJA, Z. K. Hydrolytic enzymes and antifungal compounds produced

by Tilletiopsis species, phyllosphere yeasts that are antagonists of powdery mildew fungi.

Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v.48, n.3, p.219-229, 2002.

VALDEBENITO-SANHUEZA, R. M. V. Leveduras para o biocontrole de fitopatógenos. In:

MELO, I. S; AZEVEDO, J. L. (Eds.). Controle biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio

Ambiente. p. 41-56, 2000.

VELLO, F.; GARCIA, J. R. Características das principais variedades de cacau cultivadas na

Bahia. Revista Theobroma, Itabuna, v. 1, p. 3-10, 1971.

VELLO, F.; NASCIMENTO, I. F. Influência da origem do pólen na produção do cacaueiro.

Revista Theobroma, Itabuna, v. 1, p. 7-14, 1971.

VERO, S.; MONDINO, P.; BURGAENO, J.; SOUBES, M.; WISNIEWSKI, M.

Characterization of biological activity of two yeast strains from Uruguay against blue mold of

apple. Postharvest Biology and Technology, Amsterdam, v. 26, p. 91-98, 2002.

VIANA, P. T.; PIRES, A. J. V.; OLIVEIRA, L. B.; CARVALHO, G. G. P.; RIBEIRO, L. S.

O.; CHAGAS, D. M. T.; NASCIMENTO FILHO, C. S.; CARVALHO, A. O. Fracionamento

de carboidratos e de proteína das silagens de diferentes forrageiras. Revista Brasileira de

Zootecnia, Viçosa, v. 41, n. 2, p. 292-297, 2012.

WALTERS, D. et al. Induced resistance for plant disease control: maximizing the efficacy of

resistance elicitors. Phytopathology, Saint Paul, v. 95, p. 1368-1373, 2005.

WACHOWSKA, U.; KUCHARSKA, K.; JEDRYCZKA, M.; ŁOBIK, N. Microorganisms as

biological control agents against Fusarium pathogens in winter wheat. Polish Journal of

Environmental Studies, Olsztyn, v. 22, n. 2, p. 591-597, 2013.

49

WALKER, V. K.; RANCOURT, D. E.; DUNCKER, B. P. The transfer of fish antifreeze

genes to Drosophila: A model for the generation of transgenic beneficial insects. Proceedings

of the Entomological Society of Ontario, Ontario, v. 126, p. 3-13, 1995.

WHEELER, B. E. J.; MEPSTED, R. Pathogenic variability amongst isolates of Crinipellis

perniciosa from cocoa (Theobroma cacao). Plant Pathology, Saint Paul, v. 37, p. 475-488.

1988.

YAMADA, M. M. et al. Diversidade genética de acessos de cacaueiro da série CEPEC por

meio de marcadores RAPD. Agrotrópica, Itabuna, v. 14, n. 3, p. 137-140, 2002.

ZANARDO, N. M. T.; PASCHOLATI, S. F.; FIALHO, M. B. Resistência de plântulas de

pepineiro a Colletotrichum lagenarium induzida por frações de extrato de Saccharomyces

cerevisae. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 44, n.11, p. 1499-1503,

2009.

ZHANG, H. Y. et al. Postharvest biological control of gray mold decay of strawberry with

Rhodotorula glutinis. Biological Control, Orlando, v. 40, p. 287-292, 2007.

ZHAO, K.; SUN, L.; MA, X.; LI, X.; WANG, X.; PING, W.; ZHOU, D. Improved taxol

production in Nodulisporium sylviforme derived from inactivated protoplast fusion. African

Journal of Biotechnology, v.10, n. 20, p. 4175-4182, 2011.

50

CAPÍTULO 2

Seleção de progênies de cacaueiro quanto a resistência à vassoura de bruxa e monilíase

51

Seleção de progênies de cacaueiro quanto a resistência à vassoura de bruxa 1

2

Antônio Alves Pimenta Neto(1), José Luiz Pires(2), Edna Dora Martins Newman Luz(2) 3

4

(1)Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manuel Medeiros, s/n, Dois Irmãos, 5

CEP 52171-900, Recife, PE, Brasil. Email: [email protected] (4)Comissão 6

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Centro de Pesquisas do Cacau, Rodovia Ilhéus-7

Itabuna, Km 22, s/n, CEP 45660-000, Ilhéus, BA, Brasil. Email: [email protected], 8

[email protected] 9

10

Resumo - Objetivando a ampliação e a estabilidade do caráter resistência à vassoura de bruxa 11

em progênies de cacaueiro, e a incorporação de genes de resistência à monilíase, genótipos 12

pertencentes a uma população estruturada, foram selecionados em avaliação a campo, para 13

compor o segundo ciclo de seleção, e suplementados com doadores de genes de resistência a 14

monilíase pelos clones EET 233, EET 75, ICS 95 e UF 273. Cruzamentos dialélicos (10x8) 15

foram realizados com delineamento Carolina do Norte II. Vinte dias após a emergência, 56 16

plântulas de cada cruzamento (4 repetições de 14 plântulas) foram inoculadas com uma 17

suspensão de 2 x 105 basidiósporos/mL de Moniliophthora perniciosa depositadas no 18

meristema apical. Aos 60 dias da inoculação, as plântulas foram avaliadas quanto aos 19

sintomas da VB, calculado o índice de doença (ID) e os dados corrigidos para o efeito de 20

ensaio e de repetição por ensaio. A análise dos contrastes entre as progênies e os demais 21

procedimentos foram realizados utilizando o pacote estatístico LS Means SAS. Dos 59 22

cruzamentos avaliados, todas as progênies geradas, a exceção de uma, diferiram 23

significativamente (p<0.05) de Catongo e 52 delas de SIC 23, padrões de suscetibilidade. O 24

ID médio em progênies de nove cruzamentos diferiu significativamente (p<0,05) do padrão 25

de resistência SCA 6, demonstrando alta a resistência à VB. Houve destaque para os 26

descendentes diretos de materiais oriundos da Amazônia Brasileira (CAB) e clones portadores 27

de resistência a monilíase, a exceção do clone ICS 95 que gerou progênies com ID médio 28

similar à testemunha suscetível. São apresentadas progênies que carregam genes de 29

resistência à VB oriundos de fontes diversas, e seis oriundas de parentais portadores de genes 30

de resistência à monilíase. 31

32

Palavras Chave: Melhoramento genético, Theobroma cacao, Moniliophthora perniciosa, 33

Moniliophthora roreri, seleção recorrente. 34

52

35

Introdução 36

37

O cacaueiro, espécie arbórea, nativa das florestas equatoriais da América do Sul, pertencente 38

à ordem Malvales, família Malvaceae e gênero Theobroma (Alverson et al. 1999), é cultivada 39

e explorada comercialmente para produção de chocolate, sucos, geleia, licores, sorvete e 40

fortemente pela indústria de cosméticos nas Américas do Sul e Central, África e Ásia. O 41

cacaueiro é um dos cultivos perenes mais importantes do mundo, com uma produção mundial 42

estimada em 4,2 milhões de toneladas de sementes secas (ICCO 2015), com cerca de 70% das 43

sementes produzidas no mundo, oriundas do leste da África, com destaque para a Costa do 44

Marfim (40%), Gana (20%), Nigéria (5%) e Camarões (5%) (Lopes et al. 2011). O Brasil, já 45

foi o segundo maior produtor de cacau do mundo, mas após a introdução do fungo causador 46

da vassoura de bruxa, Moniliopththora (ex. Crinipellis) perniciosa na região sul da Bahia em 47

1989 (Pereira et al, 1989), maior região produtora do país, caiu para a quinta posição no 48

ranking dos maiores produtores de cacau (ICCO 2015). 49

A VB é considerada a principal doença do cacaueiro no Brasil. Entretanto, existem 50

outras doenças com igual ou maior poder devastador que ainda não foram relatadas no Brasil, 51

e representam uma ameaça potencial à cultura caso sejam introduzidas e encontrem condições 52

favoráveis ao seu estabelecimento. A monilíase (Moniliophthora roreri (Cif.) H.C. Evans, 53

Stalpers, Samson e Benny) é uma doença de grande importância nos países da América do Sul 54

e Central onde ocorre, sendo limitante à expansão da cacauicultura (Albuquerque et al. 2005). 55

No Brasil, embora ainda não tenha sido detectada, apresenta-se como uma séria ameaça uma 56

vez que levantamentos realizados na década atual constataram a doença na fronteira do Peru 57

com o Brasil (Moraes et al. 2012). 58

Nos últimos 50 anos, a monilíase se espalhou do Equador para o sul do Peru, 59

Colômbia, e países centro americanos, resultando em abandono das plantações, devido as 60

perdas que podem variar de 50 a 100% (Ram et al. 2004). Seu comportamento invasivo 61

representa uma séria ameaça para a cacauicultura do Brasil, que começa a soerguer-se do 62

impacto da VB, com reflexos na produção mundial. O fruto, em qualquer idade de seu 63

desenvolvimento, é a única parte do cacaueiro infectada por M. roreri, daí a importância da 64

doença, já que o fruto é a parte comercial do cacaueiro (Ram et al. 2004), de onde são 65

extraídas as amêndoas e todos os demais subprodutos que são utilizados na manufatura de 66

alimentos, cosméticos, etc (Efraim et al. 2011). 67

53

O emprego de variedades resistentes e de alta produtividade, desenvolvidas em 68

programas de melhoramento genético do cacaueiro (PMGC) é a base para o manejo de 69

doenças do cacaueiro e outras espécies arbóreas (Pinto e Pires 1998). Entretanto, alguns 70

materiais mesmo apresentando genes de resistência, têm demonstrado suscetibilidade, devido 71

às condições ambientais favoráveis, à rápida mutação e grande variabilidade de M. perniciosa 72

(Leung et al. 1993, McDonald e Linde 2002, Patrocínio et al. 2012) além de limitadas fontes 73

de resistência, predominando descendentes dos clones Scavina-6 e 12, selecionados no Peru, e 74

que indubitavelmente carregam genes de resistência a vários patógenos (Bartley 2005). Sendo 75

assim, o PMGC vem buscando ampliar a base genética para resistência à VB, combinando por 76

piramidação, o maior número possível de genes cruzando genótipos em primeira e segunda 77

geração, para obter resistência mais estável, durável e efetiva, dificultando o aumento da 78

população e a evolução do fungo sobre tais materiais (Lopes et al. 2012, Paim et al. 2006, 79

Pinto e Pires 1998, Pires 2003, Silva et al. 2010). 80

O PMGC no Brasil já gerou várias populações estruturadas e não estruturadas visando 81

a piramidação de genes para a resistência à VB, e destas, vários clones foram indicados para o 82

cultivo na região cacaueira do sul da Bahia (Monteiro e Ahnert 2012). As populações 83

estruturadas foram geradas a partir de cruzamentos dialélicos realizados entre materiais 84

selecionados de três populações: A- alto amazônicos; B- Baixo amazônicos; e AB- 85

cruzamentos entre alto e baixo amazônicos, distantes geneticamente, para exploração da 86

heterose, adição de características interessantes, além de resistência à VB e outras doenças, e 87

produção (Albuquerque et al. 2011, Paim et al. 2006, Pires et al. 1999). De uma dessas 88

populações foram selecionados clones com alta capacidade combinatória (Silva et al. 2011), 89

alguns dos quais serviram para formar o 2º ciclo de seleção de que trata o presente estudo. 90

Com isso, pretende-se ampliar as fontes de resistência a VB nos materiais já anteriormente 91

selecionados como resistentes a esta doença, e incorporar à população gerada, genes de 92

resistência à monilíase, através da inclusão dos clones ICS 95, EET 75, EET 233, e UF 273 93

como doadores de genes de resistência a monilíase (Phillips-Mora et al., 2007), no dialelo 94

(10x8), utilizando o delineamento Carolina do Norte II (Comstock e Robinson 1952). 95

96

Material e métodos 97

98

Os ensaios foram realizados em laboratórios, casas de vegetação e áreas experimentais da 99

Seção de Fitopatologia do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC) na sede da Comissão 100

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), situada em Ilhéus, BA. 101

54

102

103

Material genético 104

105

Cruzamentos entre dois grupos de genótipos selecionados quanto a resistência a vassoura de 106

bruxa em avaliação a campo " per se " foram realizadas seguindo o delineamento Carolina do 107

Norte II (Comstock e Robinson 1952), e algumas progênies selecionadas dentro das 108

populações com o caráter resistência, para a composição do segundo ciclo de seleção 109

recorrente (Silva et al. 2010). A seleção de plantas dentro das progênies foi realizada com 110

base no número de vassouras e frutos infectados, número de frutos produzidos e aspectos 111

vegetativos das plantas em avaliações realizadas periodicamente durante no mínimo seis anos 112

de plantio em campo. Igualmente foram selecionadas plantas obtidas de progênies de 113

polinização livre dos clones CAB 270, CAB 208, CAB 214 e EET 392. Assim, 16 genótipos 114

oriundos desta seleção (CAB 270, CAB 208, CAB 214, EET 392, e dos cruzamentos: CSUL 115

3 x SCA 6, SGU 26 x SCA 6, NA 33 x RB 39, CEPEC 86 x SCA 6, RB 36 x SCA 6, CEPEC 116

90 x CHUAO 120, NA 33 x CSUL 7, MA 16 x SCA 6, CEPEC 86 x RB 39) foram utilizados 117

para compor o grupo de progenitores, que foi suplementado com genótipos selecionados 118

quanto a resistência à monilíase (EET 233, EET 75, ICS 95 e UF 233) (Phillips-Mora et al. 119

2007), visando a obtenção da agregação de características de interesse, e seleção de clones e 120

progênies para plantio comercial (Pires et al. 1999). 121

Cruzamentos entre os progenitores foram realizados e após a maturação dos frutos, as 122

sementes foram pré-germinadas por 48 horas em serragem esterilizada e umedecida e 123

plantadas em tubetes de 288 cm3 contendo aproximadamente 300 g de terriço esterilizado 124

(substrato comercial Plantmax® + solo, proporção 1:1). As plantas permaneceram em casa de 125

vegetação em condições de cultivo, submetidas à irrigação diária por um período de 20 126

minutos às 9:00 e às 14:00h, adicionando mais uma rega em dias com temperatura mais 127

elevada, por três a quatro semanas antecedendo a inoculação. As condições de temperatura, 128

umidade relativa e luminosidade foram monitoradas através de sensor HOBO® Data Logger 129

(U12-012). 130

Sementes dos clones SCA 6, SIC 23 e Catongo, sendo as do primeiro utilizadas como 131

padrão de resistência e as dos últimos como padrões de suscetibilidade, foram plantadas em 132

todos os ensaios. Devido às condições climáticas, às vezes adversas, e à disponibilidade de 133

flores nos genitores selecionados, os cruzamentos foram sendo realizados em diferentes 134

épocas e tiveram que ser avaliados quanto a resistência à VB em vários ensaios. Os ensaios 135

55

foram estabelecidos em delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições de 14 136

plântulas cada, e o número de cruzamentos variado, devido à dificuldade de obtenção de 137

frutos por polinização cruzada. Foram realizados ao todo 24 ensaios que totalizaram 59 138

progênies avaliadas, de 80 previstas. 139

140

Obtenção de suspensão de basidiósporos 141

142

Para obtenção de inóculo, ramos de cacaueiro apresentando sintoma de “vassoura vegetativa 143

seca” foram coletadas, desinfestados com lavagens rápidas em hipoclorito de sódio a 0,1%, 144

fixadas em arames esticados horizontalmente em casa de vegetação otimizada (vassoureiro), 145

coberta com sombrite de 50% de luminosidade, e então submetidas a um regime diário de 8 h 146

de molhamento e 16 h de secamento. Após o período de dormência, as vassouras foram 147

pulverizadas com solução de estreptomicina a 1%, e lavadas mais duas vezes em água 148

destilada. Com o surgimento dos basidiomas de M. perniciosa, estes foram então coletados e 149

secos em folhas de papel absorvente, seccionando os píleos que foram fixados com vaselina 150

pastosa (Silinol SG) em tampas de placas de Petri de vidro, com o himênio voltado para 151

baixo, sobre um béquer contendo uma solução de glicerina a 16%, e sob agitação constante, 152

permitindo a captação dos basidiósporos liberados. As suspensões de basidiósporos foram 153

quantificadas em câmara de Neubauer e estocadas em nitrogênio líquido, acondicionadas em 154

tubos criogênicos de 2 mL, até o momento de serem utilizadas, conforme metodologia 155

descrita por Dickstein et al. (1987). Antes da estocagem, uma alíquota de 25 µL de cada uma 156

das suspensões de basidiósporos obtidas foi retirada e espalhada com alça de Drigalski sobre a 157

superfície do meio ágar-água a 2%, em placas de Petri de 5 cm de diâmetro, para avaliar a 158

germinação dos esporos. Antes da estocagem e por ocasião da inoculação, procedia-se o teste 159

de germinação para determinar a viabilidade dos basidiósporos (Frias e Purdy 1995). Após 160

seis horas de incubação a 25°C, a percentagem de basidiósporos germinados foi mensurada 161

através da visualização em microscópio ótico e somente suspensões que apresentaram 162

percentual de germinação acima de 80% foram utilizadas. Estes foram repetidos antes da 163

inoculação para todos os ensaios. 164

165

Inoculação 166

167

No dia precedente à inoculação, o tamanho das folhas do lançamento apical das plântulas foi 168

reduzido a 1/3, para acelerar o crescimento apical e melhor expor a área da gema apical onde 169

56

seria depositado o inóculo. Em seguida as plântulas foram transportadas para câmara de 170

inoculação e mantidas sob condições de saturação de umidade e temperatura entre 25-27°C. 171

Vinte e quatro horas após, as plântulas foram inoculadas com uma gota de 20 µL da 172

suspensão do inóculo, na concentração de 2x105 basidiósporos/mL em meio ágar-água 0,2%, 173

depositada na gema apical das plântulas, permanecendo em câmara de inoculação com 174

saturação de umidade por mais 24h e em seguida transportadas e mantidas em casa de 175

vegetação sob as mesmas condições de cultivo, até a data da avaliação. 176

177

Avaliação dos sintomas 178

179

Aos 60 dias após a inoculação as plântulas foram avaliadas individualmente quanto a 180

incidência e severidade da doença, observando o tipo de vassoura formada: VT (vassoura 181

terminal), VA (vassoura axilar) e VC (vassoura cotiledonar), com tomada de dados binários, 182

além da quantificação de vassouras axilares maiores que 1 cm e mensuração do comprimento 183

da vassoura terminal. Para análise dos dados, foi calculado o índice de doença (calculado pela 184

seguinte fórmula: ID = VT + VA * (0,5 * CVT) + NVA, em que: VT = número de vassouras 185

terminais; VA = número de vassouras axilares; CVT = comprimento da vassoura terminal; 186

NVA = número de vassouras axilares maiores que 1cm (Frias e Purdy 1995) 187

188

Análise dos dados 189

190

As médias foram corrigidas por ensaio e ensaio dentro de repetição, obedecendo o princípio 191

de blocos incompletos, considerando progênie como única fonte de variação não casual. 192

Todas as análises foram conduzidas ao nível de 5% de significância utilizando-se o pacote 193

estatístico LSmeans SAS (SAS 1998), análise de variância e contrastes realizados entre as 194

médias das progênies dos cruzamentos e as das progênies dos controles, bem como entre si. 195

196

Resultados e Discussão 197

198

Foram avaliadas progênies de 59 cruzamentos e de três controles, dois suscetíveis 199

(CATONGO e SIC 23) e um resistente (SCA 6), totalizando 62 progênies. As progênies dos 200

59 cruzamentos apresentaram comportamento variáveis nos diferentes ensaios realizados (24), 201

bem como nas repetições dentro de cada ensaio e quando comparadas entre progênies obtidas 202

de cruzamentos diferentes (Tabela 1). Isto é fácil de entender, tendo em vista que em 203

57

condições diferentes nem sempre genes que estão presentes em um genótipo, nesse caso os de 204

resistência à VB, conseguem expressar-se, por não ser um caráter dominante (Silva et al. 205

2014). A capacidade de transferência de genes de um genótipo em combinação com outros é 206

conhecida como capacidade geral de combinação e é considerada um indicador da 207

superioridade do parental e de sua divergência relativa entre os demais parentais (Viana 208

2000). 209

Quando as progênies de cada cruzamento foram comparadas ao nível de p<0,05 com 210

testemunhas suscetíveis (SIC 23 e Catongo) e resistentes (Scavina 6 -SCA 6), inoculadas 211

conjuntamente em cada ensaio realizado, dos 59 cruzamentos realizados 52 geraram grupos 212

de progênies que diferiram da testemunha SIC 23, a qual apresentou ID médio de 5,47. 213

Apenas as plantas oriundas dos cruzamentos 11, 18, 39, 51, 54, 55 e 57 diferiram 214

estatisticamente da testemunha SIC 23, entretanto, dentre estes sete cruzamentos, o 215

cruzamento 39 não diferiu da testemunha resistente (Tabela 2). Apesar de ser observado 216

diferenças entre a suscetibilidade de plântulas seminais obtidas das testemunhas SIC 23 e 217

SCA 6, alguns materiais mesmo apresentando genes de resistência, têm demonstrado 218

suscetibilidade, devido às condições ambientais favoráveis, à rápida mutação e grande 219

variabilidade do patógeno, além de limitadas fontes de resistência, predominando 220

descendentes dos clones SCA-6 e 12, selecionados no Peru, e que indubitavelmente carregam 221

genes de resistência a vários patógenos (Bartley 2005). Apenas o cruzamento 26 não diferiu 222

da outra testemunha suscetível (Catongo) avaliada, destacando a importância da utilização 223

desta testemunha como padrão de suscetibilidade e avaliação do potencial do inóculo em 224

causar doença. 225

De modo geral pode-se avaliar a eficiência da seleção para resistência à VB 226

comparando as médias de ID obtidas nas progênies, quando contrastadas com as dos padrões 227

de suscetibilidade (Tabela 2), 58 das progênies foram estatisticamente diferentes das de 228

Catongo, cujo ID médio foi de 13,43, o mais alto entre as 61 progênies avaliadas (Tabela 2). 229

Apenas a progênie do cruzamento 26 [(SCA 6 x CSUL 3) x (ICS 95], com ID = 11,12, foi tão 230

suscetível quanto o padrão de suscetibilidade. Em relação ao SIC 23, cujo média do ID diferiu 231

significativamente do Catongo e, portanto, pode ser considerado moderadamente suscetível à 232

VB, 52 progênies foram distintas dele, apresentando médias inferiores a 5,48, o valor 233

corrigido para a média de ID obtida pelas progênies de SIC 23 testadas nestes ensaios. 234

Diferiram do padrão de resistência, SCA 6 (ID = 1,45), por apresentarem médias de ID 235

inferiores à daquele padrão, nove progênies dos seguintes cruzamentos: [CAB 270 livre x 236

(EET 75)]; [(CHUAO 120 x CEPEC 90) x (EET 75)]; [(NA 33 x CSUL 7) x (EET 75)]; 237

58

[(SCA 6 x P4 B) x (EET 233)]; [(SCA 6 x P4 B) x (UF 273)]; [(EET 233) x (CAB 214 livre)]; 238

[(UF 273) x (CHUAO 120 x CEPEC 90)], entre elas, seis portando como um dos genitores 239

EET 75 (3), EET 233 (1) e UF 273 (2), clones considerados como resistentes à monilíase (Ali 240

et al. 2015, Arciniega 2005; Evans 1981, Evans et al. 1998, Morera et al. 1991, Phillips et al. 241

2009). 242

Duas das progênies que se mostraram altamente resistentes à VB, têm como uma das 243

fontes de resistência os clones CAB 270 (cruzamento 1) e o CAB 214, considerados como 244

resistentes à VB e que já apresentaram outras progênies F1 resistentes em condições de 245

campo no Pará e na Bahia destacando-se por manterem-se resistentes por vários anos em 246

condições de campo (Albuquerque et al. 2010). De CAB 214 (progênie 232), 11 cruzamentos 247

foram avaliados (Tabela 2), demonstrando que a planta selecionada para o 2º ciclo de seleção 248

produziu flores suficientes para suportar todos os cruzamentos, indício de alta produção. 249

Dentre essas progênies de CAB 214, nove delas diferiram (p≤0,01) de SIC 23 e não diferiram 250

de SCA 6 [(CAB 214 livre) x (EET 75)]; [(SCA 6 x CEPEC 86) x (CAB 214 livre)]; [(SCA 251

6 x RB 36) x (CAB 214 livre)]; [(SCA 6 x SGU 26) x (CAB 214 livre)]; [(SCA 6 x CSUL 3) 252

x (CAB 214 livre)]; [(NA 33 x CSUL 7) x (CAB 214 livre)]; [(SCA 6 x MA 16) x (CAB 214 253

livre)]; [(SCA 6 x P4 B) x (CAB 214 livre)]; [(SCA 6 x SILECIA 1) x (CAB 214 livre)]; [(UF 254

273) x (CAB 214 livre)]; uma (cruzamento 50) foi mais resistente que o padrão e apenas 255

uma (cruzamento 11) teve ID médio similar ao de SIC 23. 256

O genótipo CAB 214 é, portanto, importante fonte de resistência à VB e segundo Leal 257

et al. (2007) foram identificados e caracterizados neste clone e também no CAB 208, genes 258

relacionados à defesa (Albuquerque et al. 2009). Estes dois clones são oriundos da bacia do 259

rio Purus, no Amazonas (Almeida et al. 1997, Barriga et al. 1985). Outro clone, CAB 270, 260

que também gerou uma das progênies altamente resistentes a VB é originário de Tefé, na 261

bacia do rio Solimões, também no Amazonas (Almeida 1982). Este clone participou como 262

genitor em sete cruzamentos avaliados neste trabalho, gerando além da progênie já 263

mencionada como altamente resistente (1), três resistentes por não diferirem de SCA 6 (21, 29 264

e 36), e três que foram distintos de SCA 6 e SIC 23 (15 e 39), portanto, consideradas 265

moderadamente resistentes. Famílias também dele originadas mostraram-se resistentes a VB 266

no Pará (Albuquerque et al. 2010) e na Bahia (Gramacho et al. 2016). 267

Outro clone da série CAB utilizado neste ciclo de seleção, foi o CAB 208 (progênie 268

225), que foi genitor de oito das progênies testadas (4, 10, 16, 22, 30, 37, 42, 52), sendo que 269

destes, seis não diferiram estatisticamente de SCA 6, comportando-se como resistentes e duas 270

59

(10 e 22), com valores médios de ID superiores a SCA 6 e inferiores, e distintos de SIC 23, 271

consideradas moderadamente resistentes. 272

Os cruzamentos que possuem descendentes diretos de genótipos obtidos de acessos da 273

Amazônia Brasileira (CAB) apresentaram resultados importantes para a piramidação de 274

genes/alelos para a ampliação da estabilidade e durabilidade da resistência. Dos 59 275

cruzamentos realizados, 26 possuem genitores descendentes diretos dos clones CAB 208, 276

CAB 214 e CAB 270, portanto, 46,06% das progênies avaliadas. Destes 26 cruzamentos, dois 277

estão entre os nove mais resistentes que a testemunha SCA 6, 84,61% diferiram (p<0,01) da 278

testemunha suscetível SIC 23 e comportaram-se similarmente ao SCA 6, sendo considerados 279

resistentes à VB. 280

Dentre os nove cruzamentos que diferiram da testemunha suscetível (SCA 6), o 281

cruzamento 50 gerou o grupo de progênies com menor índice de doença avaliado (-4.7273), 282

se destacando e diferenciando estatisticamente dos demais (Tabela 3). Não houve diferença 283

estatística entre os demais cruzamentos que compõem o grupo das interações que geraram as 284

melhores progênies para o caráter de resistência à VB. 285

O EET 233, usado como progenitor em apenas três cruzamentos avaliados, gerou duas 286

progênies altamente resistentes a VB (46 e 50) e outra (51) cujo ID médio corrigido foi de 287

4,7277, distinto de SIC 23, mas também de Catongo. Os clones CHUAO 120 e CEPEC 90, 288

outros parentais envolvidos neste cruzamento são considerados tolerantes a VB (Luz et al., 289

1997). SCA 6 e P4 B, são reconhecidos por apresentarem alta capacidade combinatória e 290

gerarem progênies no 1º ciclo de seleção com resistência a VB (Silva et al. 2010). 291

Embora a resistência dos clones SCA já tenha sido suplantada em campo (Pires et al., 292

2012), e cepas de M. perniciosa capazes de infecta-los já tenham sido selecionadas 293

(Patrocinio et al. 2012) e alguns dos seus descendentes já mostrarem no seu comportamento 294

ao longo dos anos este efeito (Benjamin et al. 2016, Paim et al. 2006), outras, mantem-se 295

resistentes quando o outro clone doador também é resistente (Benjamin et al. 2016, Pires et al. 296

2012; Paim et al. 2006). Ressalta-se que o comportamento das progênies de SCA 6 usadas 297

para inoculações artificiais em casa de vegetação, continua sendo de resistência (Albuquerque 298

et al. 2009, Kuhn et al. 2003, Yamada et al. 2005), o que ficou evidenciado também neste 299

trabalho, mesmo com a variação do inóculo do patógeno utilizado, pois, as vassouras são 300

coletadas a campo, nas áreas experimentais do CEPEC, e renovadas a cada seis meses para a 301

produção de basidiomas e estocagem dos basidiósporos usados nas inoculações. Portanto, 302

teoricamente, acompanha-se a possível evolução do patógeno. O comportamento do grupo de 303

progênies de SCA 6 que compõem estes cruzamentos, sugere que este clone possui genes de 304

60

resistência, de menor expressão, que não foram suplantados pelo patógeno. Além do locus 305

dominante para a resistência quantitativa (QRL), responsável por 51% da variação fenotípica 306

para a resistência identificada em SCA 6 através de mapeamento molecular (Brown et al. 307

2005, Faleiro et al. 2006), os clones originários do Peru, como Scavina, carregam também 308

genes de resistência à vários patógenos (Bahia et al. 2015, Bartley 2005). 309

Progenitores de elite dentre os testados em um dos dialelos (8 x 8) do 1º ciclo de 310

seleção recorrentes e envolvidos também no cruzamento que originou outra progênie destaque 311

(35), NA 33 e RB 39 são também clones conhecidos como resistentes a VB (Bemjamin et al. 312

2014). O clone CEPEC 90 também foi considerado como resistente a VB em avaliações em 313

campo e em casa de vegetação (Luz et al. 1997, Pires et al. 1996). CHUAO 120, um crioulo 314

venezuelano, tem se comportado como resistente a VB e tolerante em condições de campo no 315

Brasil (Pires et al. 1996) e foi considerado por Phillips-Mora et al. (2009), como 316

moderadamente resistente à monilíase, na Costa Rica. 317

Os outros dois clones resistentes a monilíase (Phillips-Mora et al. 2009) usados como 318

genitores das progênies testadas, EET 75 e UF 273, também geraram progênies que se 319

destacaram como altamente resistentes a VB, sendo três (1, 27, 35) descendentes de EET 75 e 320

uma (59) de UF 273. Não foram encontradas referências quanto ao comportamento em 321

relação a VB no banco internacional de dados de germoplasma do cacau (Turnbull e Hadley 322

2016), mas EET 75 é citado como resistente a Phytophthora palmivora na Costa Rica 323

(Arciniegas e Phillips-Mora 2006). As origens distintas destes clones e a distância genética já 324

determinada entre muitos deles (Marita et al. 2001, Montamayor et al. 2008, Sereno et al. 325

2006) atestam o sucesso da piramidação de genes. 326

Em relação aos clones utilizados no dialelo como padrão de resistência à M. roreri, 327

apenas o clone ICS 95, não combinou positivamente para o caráter resistência com o grupo de 328

progenitores selecionados quanto a resistência à VB, os demais EET 75 (3), EET 233 (2), UF 329

273 (1) integraram cruzamentos que apresentaram as menores médias de ID nos ensaios 330

avaliados (Tabela 3). Mesmo que não tenha sido identificada a transferência do caráter 331

resistência a M. perniciosa para as progênies oriundas de cruzamentos entre genótipos 332

selecionados como portadores deste caráter e o clone ICS 95, o PMGC segue na busca de 333

novas fontes de resistência que possam capacidade combinatória com este clone, que foi 334

citado por Argüello (2000), Phillips-Mora e colaboradores (2005) como um genótipo com 335

significante nível de resistência a isolados de M. roreri distintos geneticamente e avaliados 336

quanto ao índice de doença, severidade externa e severidade interna de sintomas de monilíase. 337

61

Destaca-se a importância da utilização do CATONGO como padrão de suscetibilidade 338

em experimentos realizados para avaliação a VB. No entanto deve ser observado o 339

procedimento de seleção das sementes brancas, tendo em vista que, embora auto compatível 340

(Yamada et al. 2005), pode ocorrer a fertilização cruzada em algumas flores, gerando algumas 341

sementes roxas, o que acontece com frequência. Estas sementes não têm homozigose para 342

suscetibilidade a VB. 343

Assim, demonstrou-se que está ocorrendo a piramidação de genes para a resistência a 344

M. perniciosa e a incorporação de genes de resistência a M. roreri, praga quarentenária A1, 345

nas progênies ora selecionadas e que estas constituem um importante material para o 346

programa de melhoramento genético visando resistência ás duas doenças. 347

Os resultados alcançados por este trabalho apresentam-se como satisfatórios quanto à 348

seleção de plantas para compor o segundo ciclo de seleção e apresenta não mais potenciais 349

progenitores, mas progênies que carregam genes de resistência à VB oriunda de fontes 350

diversas, além da incorporação de genes de resistência à monilíase, praga quarentenária A1 de 351

relevante impacto à cultura do cacaueiro. Todos as progênies obtidas dos cruzamentos e que 352

não apresentaram sintomas de VB foram transplantadas para sacos de polietileno (16 x 40 x 353

08 cm) e conduzidas ao campo para avaliação da estabilidade da resistência, produtividade e 354

autocompatibilidade em ensaios multiregionais. 355

O desenvolvimento de técnicas e produtos que visam mitigar os impactos causados por 356

doenças de plantas é de suma importância para o estabelecimento de cultivos agrícolas e 357

melhor exploração dos recursos ambientais em determinadas localidades. O presente trabalho 358

evidencia resultados de altíssima relevância para os países produtores de cacau afetados pela 359

VB e monilíase, gerando um grupo de indivíduos portadores de genes de resistência à essas 360

doenças, oriundos de fontes diversas. Além disso, demonstra a possibilidade de seleção de 361

progênies para a resistência à VB com base na resistência à monilíase, sendo sem dúvida, uma 362

valiosa contribuição para a viabilidade em bases sustentáveis da lavoura cacaueira em países 363

que já convivem com as duas doenças ou que trabalham de modo a conter a entrada do 364

patógeno em seus territórios. 365

366

Agradecimentos 367

368

Ao FINEP, FAPESB e MAPA através do orçamento da CEPLAC pelo apoio financeiro; À 369

Joel Feitosa, Magnaldo Nascimento, Layane Alves, Orlando Garcia, João Marcos Gouveia e 370

William Dias pela valiosa ajuda nas polinizações; À Virgínia Damaceno, Ananias, Orlando, 371

62

Elenísio e demais operários de campo pela ajuda nas inoculações e manutenção das plantas na 372

casa de vegetação. 373

374

Referências 375

376

Albuquerque PSB et al (2005) Doenças do cacaueiro. In: Kimati H et al Manual de 377

fitopatologia, 4th edn. v. 2. Ceres, Piracicaba, pp 151-164 378

Albuquerque PSB, Silva SDVM, Luz EDMN, Pires JL, Vieira AMC, Demétrio CGB, 379

Pascholatti SF, Figueira A (2009) Novel sources of witches’ broom resistance (causal agent 380

Moniliophthora perniciosa) from natural populations of Theobroma cacao from the Brazilian 381

Amazon. Euphytica. DOI 10.1007/s10681-009-0068-4 382

Ali SS, Shao J, Strem MD, Phillips-Mora W, Zhang D, Meinhardt LW, Bailey BA (2015) 383

Combination of RNAseq and SNP nanofluidic array reveals the center of genetic diversity of 384

cacao pathogen Moniliophthora roreri in the upper Magdalena Valley of Colombia and its 385

clonality. Frontiers in Microbiology 6. doi: 10.3389/fmicb.2015.00850 386

Almeida CMVC de (1982) Relatório da expedição botânica para coleta de cacau nativo na 387

região de Ariquemes, Rondônia, 1982. CEPLAC/DEPEA Belém, PA, Brasil. pp 23 388

Almeida CMVC, Barriga JP, Machado PFR, Bartley, BGD (1987) Evolução do programa de 389

conservação dos recursos genéticos de cacau na Amazônia Brasileira. CEPLAC/DEPEA, 390

Boletim Técnico, Belém, Brasil 5: pp.108. 391

Alverson WS et al (1999) Phylogeny of the core Malvales: evidence from ndhF sequence 392

data. Amer. Journal of Botany 89:1474-1486 393

Arciniegas A, Phillips-Mora W (2006) Caracterización de Genotipos Superiores de Cacao 394

Seleccionados por el Programa de Mejoramiento Genético del CATIE por Su Rendimiento 395

Y/O Resistencia a Moniliasis In: Proceedings of the 15th International Cocoa Research 396

Conference, San Jose, Costa Rica (2006). Cocoa Producers' Alliance, Lagos, Nigeria 397

Argüello O (2000) Variabilidad morfoagronómica de 59 árboles elite de cacao (Theobroma 398

cacao L.) en Santander. In: Mejía LA, Argüello CO (ed) Tecnología para el Mejoramiento del 399

Sistema de Producción de Cacao. Corpoica, Bucaramanga, pp 50-4 400

Bartley BG (2005) The genetic diversity of cacao and its utilization. CABI Publishing, 401

Massachusetts, 341p 402

Benjamin CS, Luz EDMN, Monteiro WR, Santos Filho LP, Santos WO (2014) Avaliação de 403

progênies de clones de cacaueiros (série CP) quanto à resistência a Moniliophthora 404

perniciosa. Agrotrópica 26:17 405

63

Comstock RE, Robinson HF (1952) Estimation of overage dominance of genes. In: Gowen J. 406

Heterosis. Iowa State: Iowa State College, pp 494-516. 407

Danquah OA (1986) Growth of Crinipellis perniciosa in cacao resistant and susceptible to 408

witches’ broom. PhD thesis, University of London. 409

Dickstein ER, Purdy LH, Frias GA (1987) Crinipellis perniciosa, the cacao witches’ broom 410

fungus: Inoculum production and storage. Phytopathology 77:1747 411

Efraim P, ALVES AB, Jardim DCP (2011) Polifenóis em cacau e derivados: teores, fatores de 412

variação e efeitos na saúde. Brazilian Journal Food Technology 14:181-201 413

Evans H, Krauss U, Rios RR, Zecevich AT, Arevalo GE (1998). Cocoa in Peru. Cocoa 414

Growers’. Bulletin 51:7–22 415

Evans, H. (1981). Pod rot of cacao caused by Moniliophthora (Monilia) roreri 416

Phytopathological papers 24:1–44 417

Frias GA, Purdy LH, Schmidt RA (1995) An Inoculation Method for Evaluating Resistance 418

of Cacao to Crinipellis perniciosa. Plant Disease 79:787-791. doi: 10.1094/PD-79-0787 419

Gramacho KP, Luz EDMN, Silva FS, Lopes UV, Pires JL, Pereira L (2016) Pathogenic 420

variability of Moniliophthora perniciosa in three agroecological zones of the cacao region of 421

Bahia, Brazil. Crop Breeding and Applied Biotechnology 16: 7-13. doi:10.1590/1984-422

70332016v16n1a2 423

ICCO (2015) Production of cocoa beans. International Cocoa Organization. http:// 424

http://www.icco.org/statistics/production-and-grindings/production.html. Acessado em 26 425

Janeiro 2016 426

Kuhn DN, Heath M, Wisser RJ, Meerow A, Brown JS, Lopes U, Schnell RJ (2003) 427

Resistance gene homologues in Theobroma cacao as useful genetic markers Theor Appl 428

Genet 107:191–202. DOI 10.1007/s00122-003-1239-7 429

Leung H, Nelson R.J, Leach JE (1993) Population structure of plant pathogenic fungi and 430

bacteria. Plant Pathology 10:157-205 431

Lopes UV, Monteiro WR, Pires JL, Clement D, Yamada, MM, Gramacho KP (2011) Cacao 432

breeding in Bahia, Brazil - strategies and results. Crop breeding and applied biotechnology 433

11:73-81.doi: 10.1590/S1984-70332011000500011 434

Marita JM, Nienhuis J, Pires JL, Aitken WM (2001) Analysis of Genetic Diversity in 435

Theobroma cacao with Emphasis on Witches’ Broom Disease Resistance. Crop Science. 436

41:1305-1316. 437

Mcdonald BA, Linde C (2002) Pathogen population genetics, evolutionary potential, and 438

durable resistance. Annual Review of Phytopathology 40:349-379 439

64

Monteiro WR, Ahnert D (2012) Melhoramento genético do cacaueiro. In: Valle RRM (ed) 440

Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro. 2ed. Brasilia, p.11-30, 2012. 441

Moraes WB, Jesus Júnior WC, Peixoto LA, Moraes WB, Furtado EL, Silva LG, Cecílio RA, 442

Alves FR (2012) An analysis of the risk of cocoa moniliasis occurrence in Brazil as the result 443

of climate change. Summa Phytopathologica 38:30-35. doi: 10.1590/S0100-444

4052012000100005 445

Morera J, Paredes A, Mora A (1991) Germoplasma de cacao en el CATIE entre 1947 y 1991, 446

Programa II: Generacion y transferencia de tecnologia. IICA, San Jose, Costa Rica, pp 49. 447

Paim VRLM, Luz EDMN, Pires JL, Silva SDVM, Souza JT, Albuquerque PSB, Santos Filho 448

LP (2006) Sources of resistance to Crinipellis perniciosa in progenies of cacao accessions 449

collected in the Brazilian Amazon. Scientia Agricola 63:572-578 450

Patrocinio NGRB, Moreira RFC, Serra WO, Pires JL, Gramacho KP (2012) Temporal genetic 451

characterization of isolates of Moniliophthora perniciosa in southeast of Bahia, Brazil 452

Agrotrópica 24(3) 453

Phillips W, Castillo J, Arciniegas A, Mata A, Sánchez A, Leandro M, Astorga C, Motamayor 454

J, Guyton B, Seguine E, Schnell R (2009) Overcoming the main limiting factors of cacao 455

production in central america through the use of improved clones developed at CATIE In: 456

Proceedings of the 16th International Cocoa Research Conference, Bali, Indonesia. Cocoa 457

Producers' Alliance, Lagos, Nigeria. 458

Phillips-Mora W, Aime MC, Wilkinson MJ (2007) Biodiversity and biogeography of the 459

cacao (Theobroma cacao) pathogen Moniliophthora roreri. Plant Pathology 56:911-922. doi: 460

10.1111/j.1365-3059.2007.01646.x 461

Phillips-Mora W, Castillo J, Krauss U, Rodríguez E, Wilkinson MJ (2005) Evaluation of 462

cacao (Theobroma cacao) clones against seven Colombian isolates of Moniliophthora roreri 463

from four pathogen genetic groups. Plant Pathology 54:483-490. doi:10.1111/j.1365-464

3059.2005.01210.x 465

Pinto LRM, Pires JL (1998) Seleção de plantas de cacau resistentes à vassoura-de-bruxa. 466

Ilhéus, CEPLAC/ CEPEC. Boletim Técnico. 181p 467

Pires JL (2003) Avaliação quantitativa e molecular de germoplasma para o melhoramento do 468

cacaueiro com ênfase na produtividade, qualidade do fruto e resistência a doenças. Tese, 469

Universidade Federal de Viçosa 470

Pires JL, De Melo GP, Yamada MM, Gramacho KP (2012) Association among sources of 471

resistance to witches’ broom disease for the increment of the level and durability of the 472

character. Agrotropica 24:27–30 473

65

Pires JL, Monteiro WR, Pinto LRM, Figueira A, Yamada MM, Ahnert D (1999) A proposal 474

for cacao breeding. In: Proceedings of the 12th International Cocoa Research Conference, 475

Cocoa Producers’ Alliance, Lagos, Nigeria. pp 287-292 476

Pires, JL., Monteiro, WR., Pinto, LRM; Luz, EDMN. (1996) Resistance to Witches Broom - 477

Evaluation of genotypes from different origins. In: Proceedings of the 12th International 478

Cocoa Research Conference, Salvador, Brasil 1996 Cocoa Producers' Alliance (in press). 479

Pokou ND, N’Goran JAK, Lachenaud Ph., Eskes AB, Montamayor JC, Schnell R, 480

Kolesnikova-Allen M, Clément D, Sangaré A (2009), Recurrent selection of cocoa 481

populations in Côte d’Ivoire: comparative genetic diversity between the first and second 482

cycles. Plant Breeding, 128: 514–520. doi: 10.1111/j.1439-0523.2008.01582.x 483

Ran A, Valle RR, Gardini EA (2004). Monília do Cacaueiro. Fundação Cargill, São Paulo, pp 484

36 485

RC Bahia, Aguilar-Vildoso CI, Luz EDMN, Lopes UV, Machado RCR, Corrêa RX (2015) 486

Resistance to black pod disease in a segregating cacao tree population Tropical plant 487

pathology. DOI 10.1007/s40858-014-0003-7 . 488

SAS INSTITUTE INC. SAS/STAT User’s Guide. Release 6.03. Cary, NC: SAS Institute 489

Inc.1028p. 1998. 490

Silva CRS, Albuquerque PSB, Ervedosa FR, Mota JWS, Figueira A, Sebbenn AM (2010) 491

Understanding the genetic diversity, spatial genetic structure and mating system at the 492

hierarchical levels of fruits and individuals of a continuous Theobroma cacao population from 493

the Brazilian Amazon. Heredity 106:973–985 494

Silva DV, Araújo IS, Branco SMJ, Aguilar‐Vildoso CI, Lopes UV, Marelli JP, Motamayor 495

JC, Royaert S, Rebouças RC, Corrêa RX (2014) Analysis of resistance to witches’ broom 496

disease (Moniliophthora perniciosa) in flower cushions of Theobroma cacao in a segregating 497

population Plant Pathology 63:1264-1271 498

Silva SDVM, Luz EDMN, Pires JL, Yamada MM, Santos Filho LP (2010) Parent selection 499

for cocoa resistance to witches’‐broomParent selection for cocoa resistance to witches’‐broom 500

Pesquisa Agropecuária Brasileira. doi: 10.1590/S0100-204X2010000700007 501

Turnbull CJ, Hadley P. International Cocoa Germplasm Database (ICGD). [Online Database]. 502

CRA Ltd./ICE Futures Europe/University of Reading, UK. http://www.icgd.reading.ac.uk. 503

Acessado 11 February 2016 504

Viana JMS (2000) The parametric restristions of the gardner and eberhart diallel analysis 505

model: heterosis analysis. Genetics and Molecular Biology 23:869-75 506

66

Yamada MM, Flores AB, Faleiro FG, Melo GRP, MM Macedo, Lopes UV, Corrêa RX, 507

Santos RF (2005) Identificação e variabilidade genética de acessos de cacaueiros 508

autocompatíveis selecionados para resistência à vassoura-de-bruxa em fazendas produtoras. 509

Agrotrópica 17:17-22. 510

67

Tabela 1. Análise de variância do índice de doença em plântulas de cacaueiro com sintomas

causados por Moniliophthora perniciosa, oriundas de cruzamentos (64) entre progênies

selecionadas quanto a resistência à M. perniciosa e M. roreri e características agronômicas

desejáveis, avaliadas em 24 ensaios e 4 repetições/ensaio.

FONTE DE VARIAÇÃO GL SQ TIPO 3 QM VALOR F P

ENSAIO 21 19059.1063 907.5765 21.09 <.0001

REP(ENSAIO) 60 4938.4887 79.6530 1.85 <.0001

PROG/CRUZAMENTO 60 59619.1705 961.5995 22.35 <.0001

68 Tabela 2. Índice de doença em plântulas de cacaueiro com sintomas causados por Moniliophthora perniciosa, oriundas de

cruzamentos entre progênies selecionadas quanto a resistência à M. perniciosa (213, 225, 232, 238, 243, 245, 247, 253, 258, 278,

282, 285, 300, 309, EET 392), M. roreri (ICS 95, EET 75, EET 233, UF 273) e características agronômicas desejáveis, e a

significância pelo teste F.

(CONTINUA)

Nº CRUZAMENTOS

(PROGENITORES)

CRUZAMENTOS

(PROGÊNIES)

ID1

LSMEAN

TESTEMUNHAS

SIC 23 CATONGO SCA 6

Pr > F2 Pr > F2 Pr > F2

1 (CAB 270 X LIVRE) X (EET 75) 213 X EET 75 -0.2470 <0.0001 <0.0001 0.0429

2 (CAB 214 X LIVRE) X (EET 75) 232 X EET 75 -0.1095 <0.0001 <0.0001 0.0899

3 (SCA 6 X CEPEC 86) X (CAB 270 X LIVRE) 238 X 213 3.4264 0.0078 <0.0001 0.0106

4 (SCA 6 X CEPEC 86) X (CAB 208 X LIVRE) 238 X 225 1.9929 <0.0001 <0.0001 0.4541

5 (SCA 6 X CEPEC 86) X (CAB 214 X LIVRE) 238 X 232 1.4130 0.0008 <0.0001 0.9751

6 (SCA6 X CEPEC 86) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) 238 X 278 1.2815 <0.0001 <0.0001 0.8186

7 (SCA6 X CEPEC 86) X (NA 33 X CSUL 7) 238 X 282 1.9183 0.0054 <0.0001 0.7147

8 (SCA 6 X CEPEC 86) X (CEPEC 86 X RB 39) 238 X 309 2.1440 <0.0001 <0.0001 0.3304

9 (SCA 6 X RB 36) X (CAB 270 X LIVRE) 243 X 213 3.1460 0.0056 <0.0001 0.0444



12 (SCA 6 X RB 36) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) 243 X 278 -0.2096 0.0479 <0.0001 0.5525

13 (SCA 6 X RB 36) X (CEPEC 86 X RB 39) 243 X 309 2.3941 0.0024 <0.0001 0.3525

14 (NA 33 X RB 39) X (EET 75) 245 X EET 75 -0.6965 <0.0001 <0.0001 0.1144

15 (SCA 6 X SGU 26) X (CAB 270 X LIVRE) 253 X 213 3.1039 0.0013 <0.0001 0.0252

16 (SCA 6 X SGU 26) X (CAB 208 X LIVRE) 253 X 225 1.8135 <0.0001 <0.0001 0.5936

17 (SCA 6 X SGU 26) X (CAB 214 X LIVRE) 253 X 232 1.7687 <0.0001 <0.0001 0.6936

18 (SCA 6 X SGU 26) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) 253 X 278 5.2880 0.8723 <0.0001 0.0011

19 (SCA 6 X SGU 26) X (P4 B X OC 7) 253 X 285 1.5198 0.0263 <0.0001 0.9692

20 (SCA 6 X SGU 26) X (CEPEC 86 X RB 39) 253 X 309 2.8275 0.001 <0.0001 0.0883

21 (SCA 6 X CSUL 3) X (CAB 270 X LIVRE) 258 X 213 1.8234 <0.0001 <0.0001 0.5994



24 (SCA 6 X CSUL 3) X (NA 33 X RB 39) 258 X 245 0.9536 0.0003 <0.0001 0.6927

25 (SCA 6 X SGU 26) X (P4 B X OC 67) 258 X 285 1.5188 0.0005 <0.0001 0.9523

26 (SCA 6 X CSUL 3) X (ICS 95) 258 X ICS 95 11.1237 0.0008 0.1813 <0.0001

27 (CHUAO 120 X CEPEC 90) X (EET 75) 278 X EET 75 -0.1521 <0.0001 <0.0001 0.0041

28 (CHUAO 120 X CEPEC 90) X (ICS 95) 278 X ICS 95 3.4260 0.0210 <0.0001 0.0248

29 (NA 33 X CSUL 7) X (CAB 270 LIVRE) 282 X 213 2.3021 <0.0001 <0.0001 0.2428

30 (NA 33 X CSUL 7) X (CAB 208 X LIVRE) 282 X 225 1.5908 <0.0001 <0.0001 0.8544

31 (NA 33 X CSUL 7) X (CAB 214 X LIVRE) 282 X 232 1.9396 0.0101 <0.0001 0.7229

32 (NA 33 X CSUL 7) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) 282 X 278 3.1630 <0.0001 <0.0001 <0.0001

33 (NA 33 X CSUL7) X (P4 B X OC 67) 282 X 285 -0.0751 <0.0001 <0.0001 0.0328

34 (NA 33 X CSUL 7) X (CEPEC 86 X RB 39) 282 X 309 1.0115 <0.0001 <0.0001 0.6927

35 (NA 33 X CSUL 7) X (EET 75) 282 X EET 75 -1.1474 <0.0001 <0.0001 0.0042

36 (NA 33 X CSUL 7) X (CAB 270 X LIVRE) 284 X 213 1.8534 0.0193 <0.0001 0.7949

37 (SCA 6 X MA 16) X (CAB 208 X LIVRE) 284 X 225 2.8301 0.0003 <0.0001 <0.0001

38 (SCA 6 X MA 16) X (CAB 214 X LIVRE) 284 X 232 -0.9195 0.0005 <0.0001 0.1950

39 (SCA 6 X MA 16) X (NA 33 X RB 39) 284 X 245 4.0529 0.2966 <0.0001 0.0568

40 (SCA 6 X MA 16) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) 284 X 278 2.3228 <0.0001 <0.0001 0.2083

41 (SCA 6 X MA 16) X (CEPEC 86 X RB 39) 284 X 309 -0.1117 <0.0001 <0.0001 0.0254

42 (SCA 6 X P4 B) X (CAB 208 X LIVRE) 300 X 225 0.6585 <0.0001 <0.0001 0.1413

43 (SCA 6 X P4 B) X (CAB 214 X LIVRE) 300 X 232 0.7979 0.0002 <0.0001 0.6076

44 (SCA 6 X P4 B) X (NA 33 X RB 39) 300 X 245 0.6829 <0.0001 <0.0001 0.4683

69 Tabela 2. Índice de doença em plântulas de cacaueiro com sintomas causados por Moniliophthora perniciosa, oriundas de

cruzamentos entre progênies selecionadas quanto a resistência à M. perniciosa (213, 225, 232, 238, 243, 245, 247, 253, 258, 278,

282, 285, 300, 309, EET 392) e M. roreri (ICS 95, EET 75, EET 233, UF 273) e características agronômicas desejáveis, e a

significância pelo teste F.

(CONCLUSÃO)

CRUZAMENTOS

(PROGENITORES)

CRUZAMENTOS

(PROGÊNIES)

ID1

LSMEAN

TESTEMUNHAS

Nº SIC 23

Pr > F2

CATONGO

Pr > F2

SCA 6

Pr > F2

45 (SCA 6 X P4 B) X (CEPEC 86 X RB 39) 300 X 309 2.2035 <0.0001 <0.0001 0.2725

46 (SCA 6 X P4 B) X (EET 233) 300 X EET 233 -0.9673 <0.0001 <0.0001 <0.0001

47 (SCA 6 X P4 B) X (EET 75) 300 X EET 75 -0.0001 <0.0001 <0.0001 0.1197

48 (SCA 6 X P4 B) X (ICS 95) 300 X ICS 95 -1.6167 0.0001 <0.0001 0.0991

49 (SCA 6 X P4 B) X (UF 273) 300 X UF 273 -1.1336 <0.0001 <0.0001 <0.0001

50 (EET 233) X (CAB 214 X LIVRE) EET 233 X 232 -4.7243 <0.0001 <0.0001 <0.0001

51 (EET 233) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) EET 233 X 278 4.7277 0.4258 <0.0001 0.0005

52 (SCA 6 X SILECIA1) X (CAB 208 X LIVRE) EET 392 X 225 0.3433 <0.0001 <0.0001 0.1193

53 (SCA 6 X SILECIA1) X (CAB 214 X LIVRE) EET 392 X 232 2.3448 0.0007 <0.0001 0.3326

54 (SCA 6 X SILECIA1) X (NA 33 X RB 39) EET 392 X 245 5.4786 0.9986 <0.0001 0.0025

55 (SCA 6 X SILECIA1) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) EET 392 X 278 3.8655 0.2121 <0.0001 0.0615

56 (SCA 6 X SILECIA1) X (CEPEC 86 X RB 39) EET 392 X 309 2.9211 0.0031 <0.0001 0.0885

57 (SCA 6 X SILECIA1) X (ICS 95) EET 392 X ICS 95 5.2349 0.8264 <0.0001 0.0006

58 (UF 273) X (CAB 214 X LIVRE) UF 273 X 232 -1.1098 0.0007 <0.0001 0.1871

59 (UF 273) X (CHUAO 120 X CEPEC 90) UF 273 X 278 -1.3041 <0.0001 <0.0001 <0.0001

60 CATONGO - 13.4348 <0.0001 - <0.0001

61 SCA 6 - 1.4510 <0.001 <0.0001 -

62 SIC 23 - 5.4764 - <0.0001 <0.0001 1ID LSMEANS – Índice de doença obtido através da quantificação e mensuração de sintomas: VA – presença de vassoura axilar;

NVA – número de vassouras axilares maiores que 1cm; VT – presença de vassoura terminal; CVT – comprimento da vassoura

terminal, calculado pela fórmula VT + VA (0,5 * CVT) + NVA, avaliado pelo procedimento LSMEANS do software estatístico

SAS e corrigido para o efeito de ensaio e de repetição por ensaio. 2Probabilidade de cometer um erro ao aceitar a hipótese de

diferença entre as médias das progênies.

70

Tabela 3. Índice de doença em plântulas de cacaueiro com sintomas causados por Moniliophthora perniciosa, oriundas de cruzamentos entre progênies selecionadas

quanto a resistência à M. perniciosa (213, 232, 278, 282, 285, 300), M. roreri (EET 75, EET 233, UF 273) e características agronômicas desejáveis, e a significância pelo

teste F.

PROGÊNIES

ID

LSMEANS1 Nº Nº PROGÊNIES (CRUZAMENTOS E TESTEMUNHAS) Pr > F4

1 27 33 35 41 46 49 50 59 60 61 62

CRUZ.2

213 x EET 75 -0.2470 1 - 0.9682 0.8753 0.4096 0.9007 0.4063 0.3091 0.0032 0.2593 <0.0001 0.0444 <0.0001

278 X EET 75 -0.1521 27 - - 0.9318 0.291 0.9637 0.2007 0.1277 0.0046 0.1013 <0.0001 0.0041 <0.0001

282 X 285 -0.0751 33 - - - 0.3506 0.9636 0.3231 0.2454 0.0017 0.1925 <0.0001 0.0328 <0.0001

282 X EET 75 -1.1474 35 - - - - 0.3632 0.8477 0.9883 0.0218 0.8753 <0.0001 0.0042 <0.0001

284 X 309 -0.1117 41 - - - - - 0.3366 0.2556 0.0018 0.2003 <0.0001 0.00254 <0.0001

300 X EET 233 -0.9673 46 - - - - - 0.7809 0.0069 0.6435 <0.0001 <0.0001 <0.0001

300 X UF 273 -1.1336 49 - - - - - - <0.0001 0.8166 <0.0001 <0.0001 <0.0001

EET 233 X 232 -4.7243 50 - - - - - - - 0.0132 <0.0001 <0.0001 <0.0001

UF 273 X 278 -1.3041 59 - - - - - - - - <0.0001 <0.0001 <0.0001

TEST.3

CATONGO 13. 4348 60 - - - - - - - - - <0.0001 <0.0001

SCA 6 1.4510 61 - - - - - - - - - - <0.0001

SIC 23 5.4664 62 - - - - - - - - - - - 1ID LSMEANS – Índice de doença obtido através da quantificação e mensuração de sintomas: VA – presença de vassoura axilar; NVA – número de vassouras axilares

maiores que 1cm; VT – presença de vassoura terminal; CVT – comprimento da vassoura terminal, calculado pela fórmula VT + VA (0,5 * CVT) + NVA, avaliado pelo

procedimento LSMEANS do software estatístico SAS e corrigido para o efeito de ensaio e de repetição por ensaio; 2CRUZ. – Genótipos que compõem os cruzamentos; 3TEST. – Testemunhas com padrão de suscetibilidade e resistência, utilizadas em todos os ensaios realizados.4Probabilidade de cometer um erro ao aceitar a hipótese de

diferença entre as médias das progênies.

71

CAPÍTULO 3

Diversidade e antagonismo de leveduras nativas contra o agente da vassoura de bruxa

do cacaueiro

72

Diversidade e antagonismo de leveduras nativas contra o agente da vassoura de bruxa 1

do cacaueiro 2

3

Antônio Alves Pimenta Neto(1), Tacila Ribeiro Santos(2), Elizabeth Amélia Alves Duarte(3) 4

Francis Tocafundo(2), Thiago Alves Santos de Oliveira(3), Edson Mário de Andrade Silva(2), 5

Edna Dora Martins Newman Luz(4), Ana Paula Trovatti Uetanabaro(2), Delson Laranjeira(1) 6

7


CEP 52171-900, Recife, PE, Brasil. Email: [email protected], 9

[email protected] (2)Universidade Estadual de Santa Cruz, Campus Soane Nazaré de 10

Andrade, Rod. Jorge Amado, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA, Brasil. Email: 11

[email protected], [email protected], [email protected], 12

[email protected] (3) Universidade Federal do Recôncavo Baiano, Laboratório de 13

Biologia Molecular, Av. Rui Barbosa, 710, 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brasil. Email: 14

[email protected], [email protected] (4)Comissão Executiva do Plano da 15

Lavoura Cacaueira, Centro de Pesquisas do Cacau, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 22, s/n, CEP 16

45660-000, Ilhéus, BA, Brasil. Email: [email protected] 17

18

19

Resumo - Os objetivos deste trabalho foram avaliar a diversidade de leveduras na superfície 20

de órgão vegetais do cacaueiro e caracterizá-las quanto ao potencial antagônico à M. 21

perniciosa. Foi avaliado o comportamento de compostos difusíveis e voláteis de leveduras 22

nativas na inibição do crescimento micelial e germinação de basidiósporos de M. perniciosa. 23

Das 172 leveduras avaliadas, 18 apresentou inibição ≥50% o crescimento dos quatro isolados 24

do patógeno estudados. Oitenta isolados de leveduras foram identificados molecularmente 25

com amplificação da região D1/D2 da subunidade maior (26S) do rDNA. Os isolados (LEV 26

162, 194, 210 e 211), identificados como Hanseniaspora sp., se encontram no grupo de 27

isolados que apresentaram as maiores médias para as quatro variáveis analisadas. A levedura 28

LEV 169 (Rhodosporidium sp.) destacou-se por apresentar porcentagem média de 87,5% de 29

inibição da germinação de basidiósporos do patógeno. Quanto à inibição do crescimento de 30

M. perniciosa em meio líquido o isolado LEV 207 (Hannaella sp.) atingiu 100%, 31

demonstrando atuar na competição por nutrientes conforme os mecanismos avaliados e 32

supramencionados. Das leveduras identificadas, 18 do gênero Hannaella, quatro do gênero 33

Hanseniaspora, um do gênero Kwoniella, três do gênero Occultifur, 17 do gênero 34

73

Rhodosporidium, dois do gênero Pichia, um do gênero Sporobolomyces, um do gênero 35

Wicherhamomyces, um do gênero Yamadazyma e são relatadas pela primeira vez na 36

microbiota epifítica do cacaueiro e, mesmo apresentando comportamentos distintos para as 37

variáveis analisadas, são potenciais agentes de biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro, 38

sendo recomendados para testes posteriores in vivo. 39

40

Termos para indexação: leveduras nativas, Moniliophthora perniciosa, Theobroma cacao, 41

bioprospecção, controle biológico. 42

43

44

Diversity and antagonism of native yeasts against the causal agent of the cocoa witch's 45

broom disease of cocoa 46

47

Abstract - The objectives of this study were to evaluate the diversity of epiphytic yeasts of the 48

cocoa and characterize them as potential antagonistic to Moniliophthora perniciosa. It 49

evaluated the behavior of diffusible and volatile compounds of native yeasts in inhibiting 50

mycelial growth and germination of basidiospores of M. perniciosa. Of the 172 yeast 51

evaluated, 18 showed ≤50% inhibition of growth of the four isolates studied pathogen. Eighty 52

yeast isolates were identified molecularly amplification of D1 / D2 region of the large subunit 53

(26S) rDNA. Isolates (LEV 162, 194, 210 and 211), identified as Hanseniaspora sp. Are in 54

the group of isolates showed the highest average for the four variables. The LEV 169 yeast 55

(Rhodosporidium sp.) stood out by presenting average percentage of 87.5% inhibition of the 56

pathogen basidiospores germination. As for the inhibition of M. perniciosa growth in liquid 57

isolated LEV 207 (Hannaella sp.) was 100%, demonstrating work in competition for nutrients 58

as the evaluated and above mechanisms. The identified yeast, 18 gender Hannaella, four 59

Hanseniaspora gender, one Kwoniella gender, three Occultifur gender, 17 of gender 60

Rhodosporidium, two Pichia genus, one Sporobolomyces gender, one Wicherhamomyces 61

gender, one Yamadazyma and gender are first reported in epiphytic microbiota cocoa and 62

even with different behaviors for the variables are potential biocontrol agents witch's broom 63

cacao, being recommended for further testing in vivo. 64

65

Index terms: Native yeast, Moniliophthora perniciosa, Theobroma cacao, bioprospecting, 66

biocontrol. 67

68

74

Introdução 69

70

O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é considerado um dos cultivos perenes mais 71

importantes do mundo, com uma produção estimada em 4,2 milhões de toneladas de 72

amêndoas secas (ICCO, 2015). Esta espécie se desenvolve de forma espontânea em florestas 73

tropicais da América do Sul (Cuatrecasas, 1964) e é explorada comercialmente pela indústria 74

alimentícia para a produção de chocolate, geleias, polpas e outros derivados em países da 75

região equatorial das Américas, África e Ásia. 76

A Costa do Marfim é líder na produção mundial de cacau, com 42%, seguida de 77

Gana, com 17,9%, e Indonésia com 7,16%. Equador, Camarões e Brasil aparecem em 78

seguida dentre os maiores produtores. Os principais países consumidores de cacau são os 79

Estados Unidos que em 2014, apresentaram m o a g e m d e 418 mil toneladas de amêndoas 80

secas, seguidos pela Alemanha, França e Reino Unido (ICCO, 2015). O Brasil, que há três 81

décadas se manteve como um dos maiores produtores de cacau do planeta, produziu 273.793 82

toneladas de amêndoas secas no ano de 2014, o equivalente R$ 1.589.535 (IBGE, 2014), e 83

hoje ocupa a quinta posição (ICCO, 2015). 84

Durante muitos anos, a produção de cacau no sul do estado da Bahia contribuiu para 85

que o Brasil fosse um dos maiores produtores mundiais, entretanto, fatores econômicos, 86

problemas climáticos, e principalmente o surgimento da vassoura-de-bruxa (VB), causada 87

pelo fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, ocasionaram uma 88

enorme crise sócio-econômica na região, levando o Brasil passar da situação de exportador 89

para importador de cacau (Midlej & Santos, 2012). 90

Apesar do impacto causado à lavoura cacaueira baiana, a vassoura de bruxa não está 91

restrita somente ao território brasileiro, mas ocorre em todos os países produtores da América 92

do Sul e Central como a Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana, Peru, Venezuela, Panamá e nas 93

ilhas do Caribe, Trinidad, Tobago, Granada, Santa Lucia e São Vicente (Purdy & Schmidt, 94

1996). Em 2008, a doença foi relatada pela primeira vez em Union Vale, La Dauphine e Saint 95

Lucia, ilhas caribenhas (Kelly et al., 2009). 96

Mesmo com a diversificação através da exploração de outros cultivos, o cacaueiro 97

ainda é uma cultura de grande importância econômica, ecológica e social para os países 98

produtores. Grandes impactos na cultura do cacau foram provocados pela vassoura de bruxa e 99

esta permanece causando queda de produção, aumento dos custos e gastos diretos, em função 100

da necessidade do uso de medidas de controle, nem sempre aplicadas pelos produtores 101

75

descapitalizados. Sendo assim, torna-se de suma importância o estudo e a descoberta de 102

tecnologias que visem integrar o programa de manejo da cultura. 103

O controle biológico é um importante componente no manejo das doenças do 104

cacaueiro, entretanto o produto comercial Tricovab® desenvolvido e produzido pela 105

CEPLAC é o único produto biológico com registro no Ministério da Agricultura Pecuária e 106

Abastecimento (MAPA) para a comercialização e utilização nesta cultura. Mesmo com os 107

resultados promissores obtidos com o fungo Trichoderma stromaticum (princípio ativo do 108

Tricovab®) para o biocontrole do agente causal da VB, novos micro-organimos devem ser 109

investigados quanto ao potencial biocontrolador, principalmente os que co-habitam no mesmo 110

nicho, por serem ótimos competidores e competentes. As leveduras apresentam este potencial 111

por estarem tanto na filosfera quanto na rizosfera de vários cultivos, inclusive o cacaueiro 112

(Cabral et al., 2009). 113

Os micro-organismos são potenciais agentes biocontroladores por apresentarem 114

diversas características e mecanismos funcionais tais como o alto potencial competidor 115

(Zhang et al., 2007) ao secretarem toxinas “killer” (Platania et al., 2012), produzirem 116

compostos antifúngicos voláteis (Bruce et al., 2004) e secretarem enzimas hidrolíticas capazes 117

de degradar a parede celular de fitopatógenos (Lu et al., 2014; Masih & Paul, 2002; Urquhart 118

& Punja, 2002), capacidade de suportar mudanças no ambiente e condições de estresse (Sui et 119

al., 2015), tolerância a poluentes, óleos essenciais vegetais, fitoalexinas e alguns fungicidas 120

(Valdebenito-Sanhueza, 2000), além de sobreviverem saprofiticamente (Afsah-Hejri, 2013) e 121

tolerarem condições adversas (Hu et al., 2015). 122

Diante do exposto, buscamos neste estudo isolar, identificar e avaliar o potencial de 123

leveduras obtidas a partir de órgãos vegetais do cacaueiro como possíveis agentes de 124

biocontrole contra M. perniciosa. 125

126

Materiais e Métodos 127

128

Isolamento e preservação de fungos leveduriformes 129

Fungos leveduriformes foram obtidos a partir de diferentes órgãos vegetais (flor, folha 130

e fruto) de cacaueiro de acordo com o método descrito por Assis et al. (1999). As amostras 131

foram obtidas de plantas de cacaueiro pertencentes ao Programa de Melhoramento Genético 132

do Cacaueiro da CEPLAC e previamente selecionadas como padrão de resistência à 133

Moniliophthora perniciosa e M. roreri. Cinco repetições dos diferentes órgãos vegetais (flor, 134

folha e fruto) por genótipos foram coletadas e transportadas para isolamento em laboratório. 135

76

Um grama de cada amostra foi suspensa em 9 ml de solução salina (NaCl 0,85%) contendo 136

cloranfenicol (50 mg/L) e sonicados durante 15 min em ultrassonicador (Quimis 0335D). 137

Diluições em série da suspensão da amostra de levedura foram realizadas em solução salina + 138

cloranfenicol (50mg/L). Alíquotas de 300 µL de cada diluição foram distribuídas em placas 139

esterilizadas contendo o meio de cultura extrato de levedura peptona ágar - yeast extract 140

peptone dextrose agar (YEPD - 0,15% extrato de levedura, 1% neopeptona, 4% dextrose, 2% 141

ágar e 0,05% cloranfenicol). As placas foram incubadas a 28°C por 48 h e as colônias de 142

leveduras foram analisadas pelas características morfológicas de colônias e células. Uma 143

amostra representativa de cada colônia de levedura foi re-semeada em YEPD para obtenção 144

de culturas puras e posteriormente mantidos em tubos contendo meio batata dextrose ágar 145

(BDA) Himedia® à 4°C, e glicerol 2% a -80°C. 146

147

Organismos e condições de cultivo 148

Para cada experimento, os isolados de leveduras testados foram cultivados em meio 149

YEPD, em triplicata, por 72h a 28°C. Transcorrido o tempo de cultivo, as colônias de 150

leveduras foram raspadas e suspensas em solução salina (NaCl 0,85%). A concentração da 151

suspensão de leveduras foi ajustada a 108 ufc/mL com base na quantificação em câmara de 152

Neubauer e mensuração da densidade ótica com leitura (SpectraMax® Paradigm Multi-Mode 153

Detection Platform, Molecular-Devices Japan, Tóquio, Japão) a 595 nm. Quatro isolados de 154

M. perniciosa (Mp 4009, Mp 4010, Mp 4031 e Mp 4145) distintos molecularmente e 155

pertencentes à Coleção de Cultura Fúngica do Brazilian Culture Collection de Moniliophthora 156

(ex. Crinipellis) perniciosa (BCCCp), foram cultivados em meio BDA Himedia® e incubados 157

a 25°C por 15 dias. Basidiósporos foram obtidos a partir de vassouras coletadas na área da 158

Estação Experimental Arnaldo Medeiros, no CEPEC. As vassouras foram desinfestadas com 159

lavagens rápidas em hipoclorito de sódio a 0,1% e penduradas em arames esticados 160

horizontalmente sob um telado (vassoureiro), e então submetidas a um regime diário de 8 h de 161

molhamento e 16 h de secamento. Após o período de dormência das vassouras, foi aplicada 162

solução de estreptomicina a 1%, e lavadas mais duas vezes em água destilada. Os basidiomas 163

produzidos foram então coletados e secos em folhas de papel absorvente, seccionando os 164

píleos e fixando-os com vaselina pastosa (Silinol SG) em tampas de vidro, com himenóforos 165

voltados para baixo, sobre um béquer contendo uma solução de glicerina a 16%, e sob 166

agitação constante, permitindo a deposição dos basidiósporos liberados. As suspensões de 167

basidiósporos foram quantificadas em câmara de Neubauer e estocadas em nitrogênio líquido, 168

acondicionadas em tubos criogênicos de 2 mL, até o momento de serem utilizadas, conforme 169

77

metodologia descrita por Dickstein et al. (1987). Antes da estocagem, uma alíquota de 25 µL 170

de cada uma das suspensões de basidiósporos obtidas foi retirada e espalhada com alça de 171

Drigalski sobre a superfície do meio ágar-água a 2%, em placas de Petri de 5 cm de diâmetro, 172

para avaliar a germinação dos esporos. Após seis horas de incubação a 25°C, a percentagem 173

de basidiósporos germinados foi mensurada através da visualização em microscópio ótico. 174

Este procedimento foi realizado tanto no momento da estocagem como também vinte e quatro 175

horas antes da utilização do inóculo. Somente suspensões com mais de 80 % de basidiósporos 176

germinados foram utilizadas. 177

178

Detecção da atividade antifúngica por compostos difusíveis e voláteis 179

A atividade antifúngica dos isolados de levedura (172) foi avaliada através do 180

confronto em co-cultivo com quatro isolados de M. perniciosa distintos molecularmente (Mp 181

4009, Mp 4010, Mp 4031, Mp 4145), conforme Mariano et al. (2005). Discos (5mm) de meio 182

de cultura contendo estruturas fúngicas de M. perniciosa foram retirados da região periférica 183

do isolado em crescimento e repicados ao centro de placas de Petri (Ø 9,5 cm) contendo meio 184

BDA Himedia®. Os isolados de leveduras foram repicados em placas contendo isolados de 185

M. perniciosa, margeando os discos depositados ao centro da placa. As placas foram 186

incubadas por 10 dias à temperatura de 25°C em câmara de crescimento e avaliadas quanto à 187

inibição do crescimento micelial, através da mensuração diária do diâmetro da colônia a partir 188

do sexto dia. O diâmetro da colônia foi avaliado com paquímetro Mitutoyo® (Japão) em duas 189

medidas ortogonais. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco 190

repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de Petri. A testemunha consistiu 191

de placas contendo meio de cultura, semeado apenas com o patógeno. Quando o crescimento 192

do patógeno na testemunha alcançou os bordos das placas, as porcentagens de inibição 193

(PIN%) foram calculadas de acordo a fórmula de Topps e Wain (1957): I% = [(A - B) / A] x 194

100 onde, I% = percentagem de inibição de A = diâmetro médio do crescimento no controle, 195

B = crescimento médio de diâmetro num dado tratamento. 196

197

Determinação do potencial produtor de compostos voláteis com ação antifúngica 198

Para detecção de compostos voláteis com ação antifúngica, foi utilizada a técnica de 199

cultivo em placas de Petri bipartidas contendo meio BDA Himedia®. O confronto foi 200

realizado entre 66 isolados de leveduras previamente selecionados com atividade antifúngica 201

à M. perniciosa e os quatro isolados deste. Em um lado da placa foram realizadas estrias 202

contínuas com o isolado de levedura e no centro, do outro lado da placa, depositado um disco 203

78

contendo estruturas fúngicas do patógeno. As placas foram incubadas por 10 dias à 204

temperatura de 25°C em câmara de crescimento e avaliadas diariamente através da 205

mensuração com paquímetro, com precisão de abertura de 0,5 mm, em sentidos 206

diametralmente opostos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 207

cinco repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de Petri. A testemunha 208

consistiu de placas contendo meio de cultura semeada apenas com o patógeno. A 209

porcentagem de inibição do crescimento foi calculada conforme Topps e Wain (1957). 210

211

Aplicação de bioinformática para avaliação dos compostos difusíveis e voláteis 212

Uma matriz gerada para os tratamentos (isolados de levedura) foi avaliada através do 213

software R 2.12, o que permitiu a construção de heatmaps a partir de distância Euclidiana, 214

para avaliar a ação de compostos difusíveis e voláteis na inibição do crescimento micelial de 215

4 isolados de M. perniciosa. 216

217

Determinação do potencial inibidor da germinação de basidiósporos 218

Os isolados de levedura a serem testados foram cultivados em meio YEPD líquido 219

incubados sob agitação de 150 e 28°C em incubadora com agitação orbital tipo Shaker 220

(ACBLABOR® AC-830) por 72h. A obtenção do secretoma ou extrato bruto foi baseado no 221

trabalho de Coelho et al. (2011) e Cabanas (2013) com otimizações em seus métodos. Foram 222

utilizados 45 ml de meio líquido YEPD mais 5 ml da suspensão de leveduras padronizadas à 223

108 ufc/mL através da mensuração de densidade ótica em espectrofotômetro a 595 nm. A 224

amostra foi centrifugada a 6.500 g por 15 minutos a 10ºC, com separação entre o secretoma e 225

as células das leveduras. O sobrenadante foi filtrado com seringa estéril e filtro para seringa 226

Millipore® 0,22 µm, separando células remanescentes e posteriormente armazenado em 227

ultrafreezer a -80ºC. Alíquotas do secretoma das leveduras testadas e suspensão de 228

basidiósporos (106) na proporção 1:1 foram homogeneizadas em microtubos eppendorf 2 mL 229

e vertidas em placas de Petri (60 x 15mm). O desenho experimental foi inteiramente 230

casualizado, com duas placas divididas em quadrantes e cada quadrante constituindo uma 231

repetição, totalizando oito repetições/tratamento. A avaliação do ensaio foi realizada 6 h após 232

o início da incubação, através da contagem do número de esporos totais e germinados, no 233

campo de visão da objetiva de 40X do microscópio óptico, em três pontos distintos de cada 234

quadrante. Foi considerado germinado o basidiósporo cujo tubo germinativo era maior ou 235

igual ao seu comprimento e calculada a porcentagem de esporos em cada repetição. 236

237

79

Determinação do fator “killer” 238

A atividade “killer” foi investigada através do co-cultivo dos isolados de levedura 239

selecionados e linhagens de referência como padrão de sensibilidade “killer”. Os testes foram 240

realizados utilizando a técnica de semeadura em meio ágar YEPD-MB (extrato de levedura 241

1%, glicose 2%, peptona 2%, ágar 2%, azul de metileno 0,003%, tamponado ao pH 4,0 com 242

tampão citrato fosfato 0,5 M) contido em placa de Petri conforme descrito por Sangorrín et al. 243

(2001). As leveduras foram ressuspensas em solução salina 0,85% até a concentração de 244

aproximadamente 5 x 105 ufc/mL. Em seguida, 100μL desta suspensão celular correspondente 245

a cada uma das linhagens sensíveis (Saccharomyces cerevisae NCYC1006 e Candida 246

glabrata Y55 ATCC90525) foram espalhados, com auxílio da alça de Drigalski, sobre a 247

superfície do meio ágar YEPD-MB contido em placas de Petri (90 x 15 mm). Após a secagem 248

da suspensão, os isolados de levedura foram inoculados em forma de ponto com auxílio da 249

alça de platina, sobre cada uma das placas correspondentes a uma linhagem sensível de 250

referência, de forma que, em cada placa de Petri, foi possível inocular 11 isolados teste mais a 251

linhagem produtora de toxina “killer”. O delineamento experimental foi inteiramente 252

casualizado, com três repetições, senda cada repetição constituída por uma placa de Petri. As 253

placas foram incubadas em estufa B.O.D. a 25 C por 72 horas e observadas diariamente. A 254

presença do fenótipo “killer” (K +) foi constatada nos isolados em que houve formação de 255

uma zona clara de inibição em volta da colônia, onde não houve crescimento da levedura 256

sensível, delimitada por um halo adjacente de células coradas em azul que evidencia morte 257

celular e é indicativo de atividade “killer” (Young, 1987). 258

259

Análise multivariada dos dados de atividade antifúngica, compostos voláteis, inibição da 260

germinação de basidiósporos e atividade “killer” 261

A análise dos dados binários e agrupamento por dissimilaridade dos perfis, utilizando 262

o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Grou Method wiht Arithmetical Average) e distância 263

euclidiana, foi realizada através da utilização do software SAS® (SAS Corporation, Cary, 264

NC). Foi empregada a Análise de Componentes Principais (Principal Coordenates Analysis – 265

PCA) para avaliar a variação entre os grupos encontrados nas diferentes análises (Clarke, 266

1993). 267

268

Identificação molecular das leveduras 269

Para a identificação molecular das leveduras isoladas de diferentes órgãos do 270

cacaueiro, foi realizada a extração do DNA total utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA 271

80

Isolation (MoBio, USA), seguindo recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade 272

do DNA foram verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 1,0% corado com brometo 273

de etídio e visualizado sobre luz ultravioleta, seguida da fotodocumentação. As amplificações 274

da região D1/D2 da subunidade maior (26S) do rDNA foram realizadas com os primers NL1 275

(5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG - 3’) e NL4 (5’-276

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (O’DONNELL, 1993). Para tanto, as reações foram 277

preparadas com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra; 1x 278

de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL de dNTPs; 0,4 279

pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com volume final ajustado para 50 280

μL com água ultra pura. Os ciclos de amplificações foram realizados no Veriti Thermal 281

Cycler PCR (Appplied Biosystems) com temperatura inicial de desnaturação 95 °C por 5 282

minutos; 35 ciclos de amplificação a 95 °C por 30 segundos; 54 °C por 30 segundos; 72 °C 283

por 7 minutos e temperatura de extensão final de 72 °C por 10 minutos. Os produtos 284

amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e 285

visualizados sobre luz ultravioleta. Em seguida, os amplicons foram purificados utilizando o 286

kit PureLink™ PCR Purification (Invitrogen), quantificados com o Qubit® 2.0 Fluorometer 287

(Invitrogen) para posterior identificação nucleotídica, utilizando o sequenciador automático 288

ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). A edição e montagem das 289

sequências foram realizadas com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code Corporation). A 290

identidade taxonômica dos isolados foi verificada através do banco de dados GenBank, 291

usando o BLASTn “basic local alignment search tool” (BLAST) do NCBI 292

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 293

294

Avaliação da interação levedura x Moniliophthora perniciosa em meio de cultivo líquido 295

Foi realizado um co-cultivo da LEV 207 com o patógeno M. perniciosa (Mp 4009) em 296

erlenmeyers de 125mL contendo 22,5 mL de meio batata dextrose (BD), adicionando a estes 297

alíquotas de 2,5 mL de suspensão de células do isolado de levedura e disco contendo 298

estruturas fúngicas do patógeno em diferentes tipos de tratamento e reinóculo da levedura, 299

com agitação de 150 rpm a 28ºC em termo shaker. Os tratamentos utilizados foram: T1 – 107 300

células da levedura 207; T2 – M. perniciosa; T3 - 107 células da levedura 207 + M. perniciosa 301

(simultâneo); T4 - 107 células da levedura 207 + M. perniciosa (simultâneo) + 1 reinóculo de 302

107 células da levedura 207 (120h após); T5 - 107 células da levedura 207 + M. perniciosa 303

(simultâneo) + 2 reinóculo de 107 células da levedura 207 (96 e 1920h após); T6 - 107 células 304

da levedura 207 + M. perniciosa (simultâneo) + 3 reinóculo de 107 células da levedura 207 305

81

(48, 144 e 216h após); T7 - 107 células da levedura 207 + M. perniciosa (simultâneo) + 1 306

reinóculo de 107 células da levedura 207 (48, 96, 144 e 192h após); T8 - 107 células da 307

levedura 207 + M. perniciosa (simultâneo) + 1 reinóculo de 107 células da levedura 207 (192h 308

após); T9 - M. perniciosa + 107 células da levedura 207 (168h após + 1 reinóculo 216h após). 309

O reinóculo foi realizado preservando a inocuidade da amostra, sendo retirada 310

momentaneamente das condições de cultivo e retornando em seguida. Dez dias após o início 311

do ensaio, as amostras foram coletadas e filtradas a vácuo em papel filtro Whatman® 110 mm 312

Ø, quantificando em seguida a biomassa fresca e seca em balança analítica. A amostra seca 313

foi obtida a partir da desidratação em estufa a 70°C por 48h. O consumo de glicose foi 314

inferido pela quantificação de açúcares redutores em ensaio de DNS (ácido dinitrosalicílico). 315

O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado em triplicata. 316

317

Resultados 318

319

Foram encontrados 172 isolados de leveduras na superfície de folhas (62,8%), frutos 320

(12,8%) e flores (24,4%) de genótipos de cacaueiro selecionados como portadores de genes 321

de resistência à vassoura de bruxa (VB) e monilíase. A maior quantidade de isolados oriundos 322

do limbo foliar se deve à maior disponibilidade deste órgão vegetal. Leveduras foram 323

encontradas em 100% das plantas amostradas. A densidade total de leveduras variou de 3,2 x 324

104 ufc/g a menos de 50 ufc em fruto; de 2,8 x 104 ufc/g a menos de 50 ufc em flor; e de 2,0 x 325

104 ufc/g a menos de 50 ufc em folha. Devido a maior disponibilidade de genótipos com 326

resistência a VB, 84% dos isolados de levedura foram obtidos destes materiais e apenas 16% 327

de genótipos utilizados como padrões de resistência a monilíase. 328

A análise de agrupamentos (heatmap) baseada na ação antifúngica de 172 isolados de 329

leveduras nativas do cacaueiro (eixo y) à quatro isolados distintos do patógeno M. perniciosa 330

em cinco dias de avaliação (6 – 9 dias após pareamento) (eixo x), permitiu inferir sobre a 331

separação de dois grupos (clados) (Figura 1). A maioria dos isolados de leveduras avaliados 332

foi capaz de inibir o crescimento micelial dos quatro isolados do patógeno com níveis acima 333

de 50%, à exceção dos isolados LEV 136, LEV 019 e LEV 110. Estes três isolados fazem 334

parte do clado que reúne as leveduras que menos inibiram o crescimento do patógeno (Figura 335

1). 336

Os isolados de levedura LEV 079, 139, 002, 047, 023, 034, 210, 194, 211, 030, 028, 337

097, 227, 204, 206, 189, 007, 021, 162 e LEV 212 destacaram-se por compor o clado de 338

82

segundo nível que se distingue das demais leveduras que mais inibiram o crescimento dos 339

quatro isolados do patógeno nos cinco dias de avaliação. 340

O padrão de inibição de cada levedura não foi uniforme para todos os isolados de M. 341

perniciosa, apresentando variações entre os isolados e dentre os dias de avaliação para cada 342

isolado (Figura 1). Houve variações na velocidade de crescimento e produção de compostos 343

antimicrobianos difusíveis e voláteis. O isolado Mp 4145 apresentou a menor velocidade de 344

crescimento dentre os demais isolados do patógeno testados e, devido a esta característica, 345

quando os pareamentos com as leveduras foram comparados com testemunhas somente com 346

plug (discos de 0,5 cm) do patógeno, geraram um falso positivo em relação à sensibilidade 347

deste isolado aos compostos antifúngicos secretados pelas leveduras, caracterizando-o como o 348

menos sensível. O potencial fungistático das leveduras foi semelhante para os isolados de Mp 349

4010 e Mp 4031, já para o isolado Mp 4009 foram identificados os maiores percentuais de 350

inibição (Figura 1). 351

Houve uma tendência crescente na evolução do percentual de inibição ao longo dos 352

dias para a maioria dos tratamentos avaliados, entretanto alguns tratamentos apresentaram 353

inibição constante durante todo o período de avaliação para alguns isolados: LEV 039, 168, 354

169, 18, 006, 164, 018, 166, 182, 067, 036, 039, 010, 084, 023, 047, 002, 139, 179, 085, 212, 355

013 e LEV 202 para o isolado Mp 4009; LEV 010, 067, 212, 021, 162, 097, 078, 194 e LEV 356

210 para o isolado Mp 4010; LEV 001, 018, 006, 212, 084, 002, 139, 162, 021, 097, 078, 194 357

e LEV 210 para o isolado Mp 4031; LEV 006, 018, 182, 036, 039, 010, 047, 162 e LEV 021 358

para o isolado Mp 4145. Também foi observado oscilação de inibição ao longo dos dias de 359

avaliação para as leveduras LEV 067, 202, 064, 069, 096, 074, 062, 110, 210 e LEV 211. As 360

leveduras LEV 039, 074, 212, 096 e LEV 069 apresentaram tendência decrescente na 361

evolução do percentual de inibição para alguns isolados de M. perniciosa (Figura 1). 362

A maioria dos tratamentos (leveduras) oscilaram em relação ao potencial inibidor do 363

crescimento micelial por compostos voláteis, entretanto alguns mantiveram constância 364

durante os dias de avaliação para alguns dos quatro isolados de M. perniciosa testados (Figura 365

2): Os isolados de levedura LEV 165, 002, 118, 084, 140, 111, 169, 082, 209, 059, 226 e LEV 366

088 para o isolado Mp 4009; LEV 002, 101, 140, 161, 178, 109, 090, 077, 185, 189 e LEV 367

225 para o isolado Mp 4010; LEV 162, 118, 166, 149, 143, 111, 178, 109, 100, 211 e LEV 368

080 para o isolado Mp 4031; e o somente LEV 162 para o isolado Mp 4145. 369

Para a avaliação de compostos voláteis, houve a formação de dois grupos (clados) de 370

levedura separados por distância euclidiana e visualizadas em heatmap (Figura 2). Vinte e 371

dois isolados (33,33 %), LEV 001, 014, 038, 139, 229, 088, 027, 078, 147, 023, 034, 115, 372

83

079, 063, 080, 226, 059, 209, 082, 169, 170 e LEV 225 compõem o clado que se distingue por 373

apresentar os menores percentuais de inibição, entretanto os isolados LEV 170, LEV 169 e 374

LEV 082, quando avaliados somente com os isolados Mp 4009, Mp 4010 e Mp 4031, 375

apresentam comportamento semelhante aos isolados de levedura que mais inibiram o 376

crescimento do patógeno. 377

Dentre os indivíduos que compõem o grupo que apresentou os maiores percentuais de 378

inibição por compostos voláteis, quatro isolados (LEV 225, LEV 206, LEV 166, LEV 092) se 379

distanciam em um subgrupo (clado de 2º nível) por se destacarem com percentuais acima de 380

50% de inibição, principalmente para os isolados Mp 4009 e Mp 4010. Leveduras 381

pertencentes ao segundo subgrupo formado (LEV 074, LEV 210, LEV 089, LEV 189 e LEV 382

211), mantiveram o padrão de inibição para os quatro isolados de M. perniciosa (Figura 2). 383

Todos os filtrados obtidos de cultivo de 66 isolados de levedura em meio YEPD, em 384

diluição 1:1 (filtrado:suspensão de basidiósporos), inibiram a germinação de basidiósporos 385

em meio ágar água após seis horas de incubação, quando comparados com a testemunha 386

(Figura 3). Três grupos foram formados a partir da comparação de médias pelo teste Scott-387

Knott. Dentre os isolados que mais inibiram, dezenove se destacaram (LEV 049, 063, 065, 388

093, 101, 105, 111, 147, 149, 166, 168, 169, 185, 204, 207, 210, 211, 219 e LEV 225) por 389

apresentarem percentuais de inibição de germinação de basidiósporos variando de 54,5 – 390

87,5%, produzidos por LEV 014 e LEV 169 respectivamente (Figura 3). 391

Apenas 13 isolados (19,69 %) não produziram halo de inibição quando cultivados com 392

padrões “killer” sensíveis: LEV 049, 077, 78, 88, 090, 092, 101, 106, 109, 118, 143, 161 e 393

LEV 229 (Figura 3). Apenas dois isolados (LEV 049 e LEV 101) foram do grupo com 394

maiores inibições. 395

Os resultados da análise multivariada mostraram haver diferença significativa para os 396

tratamentos (leveduras) e variáveis (antibiose, compostos voláteis, inibição de germinação e 397

atividade “killer”). 398

Na distribuição biplot (Figura 4), observa-se a dispersão dos isolados de levedura no 399

gráfico tridimensional das três primeiras componentes principais (variáveis sintéticas), que 400

juntas, correspondem a 79,78 % da variação total da análise. 401

O componente principal 1(PC1) representa 31,72 % da variação total e a variável 402

antibiose (AB) representa a maior variação desta componente por apresentar o maior 403

coeficiente (auto vetor: 0,62). As variáveis atividade “killer” (AK), compostos voláteis (CV) e 404

inibição da germinação (IG) apresentaram coeficientes de 0,60, 0,48 e 0,06, respectivamente. 405

A variável IG apresentou maior peso (0,85) na variação da componente principal 2 (PC2), já 406

84

para a componente principal 3 (PC3), a variável CV foi a que mais contribuiu para a variação 407

deste componente. As componentes CP2 e CP3 são responsáveis por 26 % e 22% da variação 408

total dos dados, respectivamente. 409

Quanto menor o ângulo entre os vetores das variáveis, maior a correlação. A variável 410

AB não apresentou alta correlação com as demais variáveis, porém se correlacionou 411

positivamente com as variáveis CV e AK, mais do que com a inibição da germinação (IG). A 412

correlação negativa entre as variáveis CV e IG é demonstrada através da vetorização oposta. 413

Os coeficientes dos autovetores explicam a correlação entre as variáveis reais e as variáveis 414

sintéticas, entretanto destaca-se a correlação negativa significativa da variável CV para PC2 e 415

variáveis AB e AK para PC3. A relação entre as variáveis (vetores) e distribuição dos 416

tratamentos (dispersão) são explicadas pela análise de componentes principais (PCA) 417

representada no biplot (Figura 4). 418

Os tratamentos que apresentaram as maiores médias em cada uma das variáveis são 419

representados na figura 4 próximos ao ápice do vetor, como os tratamentos LEV 169 e 219 420

para a variável IG, localizados no ápice do biplot. Quando os tratamentos apresentam as 421

menores médias para as variáveis, estes localizam-se em direção oposta ao vetor da variável 422

analisada, como os tratamentos LEV 49, 106, 88, 78, 109, 229, 74, 148, 90, 100, 179, 92, 161, 423

143, 118 que se distanciam inversamente do vetor PC1, indicando que esses isolados 424

apresentaram as menores médias para as variáveis que mais explicam a variação PC1, AB e 425

AK. 426

O LEV 210 está em posição central em relação aos vetores das quatro variáveis, por 427

ser o tratamento que mais se destacou com primeira, segunda e quarta maior média para as 428

variáveis AB, CV e IG, além de apresentar a característica qualitativa AK. Apesar do 429

tratamento LEV 169 apresentar a maior média para a variável IG, este se encontra próximo 430

apenas do vetor desta variável e do vetor CP2, componente que mais sofre influência desta 431

variável. O tratamento LEV 169 não proporcionou alta inibição do crescimento micelial por 432

compostos difusíveis e voláteis. 433

A divergência do comportamento dos tratamentos (leveduras) nas quatro variáveis 434

analisadas foi observada pelo dendograma de análise de agrupamento (Figura 5), formando 435

seis grupos distintos. No grupo 1, formado pelos tratamentos LEV 169 e 219, encontram-se os 436

dois isolados que mais inibiram a germinação (IG) dos basidiósporos de M. perniciosa, 437

entretanto sua atuação na inibição do crescimento micelial do patógeno foi mediana e 438

atribuída em maior parte aos compostos difusíveis e toxinas “killer”, pois apresentaram baixa 439

inibição do crescimento micelial por compostos voláteis (Tabela 2). O grupo 2 é formado por 440

85

nove leveduras com resultados medianos para todas as variáveis analisadas, sendo importante 441

ressaltar que apresentaram as maiores médias para a produção de compostos voláteis, mesmo 442

esta característica correspondendo com 50% para a inibição do crescimento micelial, a 443

exemplo do isolado LEV 174 que inibiu 50,28 % e 24, 58 % do crescimento micelial de 444

isolados de M. perniciosa por compostos difusíveis e voláteis (em conjunto) e voláteis 445

isoladamente (Figuras 2 e 3, respectivamente). Mesmo sendo agrupados separadamente, os 446

tratamentos do grupo 3 também apresentaram comportamento mediano. O maior número de 447

tratamentos (40%) foi reunido no grupo 4 por atuarem na inibição da germinação e 448

crescimento micelial principalmente por compostos difusíveis, pois apresentaram baixos 449

percentuais para a variável compostos voláteis. O grupo 5 se assemelha ao grupo 4 por reunir 450

tratamentos que atuam principalmente por compostos liberados no meio de cultivo, entretanto 451

difere por apresentar percentual de inibição do crescimento micelial maior do que o grupo 4. 452

Um sexto grupo foi formado pela proximidade de quatro tratamentos que apresentaram 453

atuação média-baixa para os parâmetros avaliados. 454

Sessenta isolados de levedura foram selecionados como amostras significativas do total de 455

leveduras isoladas por inibirem o crescimento micelial de M. perniciosa acima de 60% e 20 456

isolados selecionados aleatoriamente foram adicionados a este grupo, formando um conjunto 457

de 80 isolados com características representativas, de inibição do crescimento micelial e 458

germinação de basidiósporos, além de plasticidade fenotípica, correspondendo a 46,5% do 459

total de leveduras isoladas (Tabela 1). 460

Amostras do DNA genômico das 80 amostras foram sequenciadas e indexadas (Index 461

fungorum) como integrantes dos filos Ascomycota (25%) e Basidiomycota (67,5%) e seis 462

com identidade indeterminada (7,5%). Em relação ao filo Ascomycota, houve a 463

predominância da família Saccharomycetaceae e apenas dois integrantes da família 464

Pichiaceae. Integrantes do filo Basidiomycota foram identificados como membros de duas 465

famílias (Trichosporonaceae e Cystobasidiaceae) e isolados com incapacidade de estabelecer 466

posição exata de sua família dentro da classificação (Insertae sedis). Foram identificadas 14 467

espécies e 7 gêneros, levando em consideração as sinonímias. Os fungos leveduriformes 468

isolados com a maior frequência eram da ordem Tremellales, principalmente do gênero 469

Hannaella (18 isolados) e o gênero Rhodosporidium (17 isolados) dentre os isolados 470

sequenciados. Não houve predominância de gêneros representantes de um determinado filo 471

por genótipo ou órgão de cacaueiro, demonstrando haver grande diversidade na distribuição 472

de leveduras na planta (Tabela 1). 473

86

Houve variação em relação a prevalência de gêneros de leveduras por genótipo, 474

padrão de resistência (VB e monilíase) e órgão vegetal do cacaueiro. Os tratamentos LEV 169 475

e LEV 219 são formados por metabólitos de leveduras identificadas como Rhosdosporidium. 476

sp. e Candida sp. e isoladas de folha e fruto de genótipos de cacaueiro selecionados com 477

resistência a vassoura de bruxa (VB) e monilíase, respectivamente (Tabela 2). Os isolados 478

LEV 162, LEV 194, LEV 210 e LEV 211, foram identificados como Hanseniaspora sp., 479

sendo o primeiro obtido de folha e os três últimos de flores de diferentes genótipos de 480

cacaueiro, três dos quais selecionados para resistência à VB e um para monilíase (Tabela 2). 481

Os metabólitos obtidos destes micro-organismos mantiveram alto padrão de inibição para 482

todas as variáveis analisadas. 483

. O isolado 207 (Hannaella sp.) foi selecionado dentre os isolados pertencentes ao 484

gênero com maior prevalência, para avaliar a interação direta entre a levedura e o patógeno, 485

além de inferir sobre a competição por nutrientes através da determinação de açúcares 486

redutores. Quando cultivados em meio líquido, o isolado LEV 207 (Hannaella sp.) inibiu o 487

crescimento de M. perniciosa em todos os tratamentos avaliados, independentemente do 488

número de reinóculo e época de aplicação (Figura 6). A biomassa micelial do patógeno, 489

mensurada após 240h de cultivo, foi semelhante para as variáveis biomassa fresca (BF) e 490

biomassa seco (BS) em relação aos tratamentos avaliados (Figura 6A-B). Os pesos fresco e 491

seco do tratamento 1, correspondente ao cultivo apenas do fungo M. perniciosa, diferiram 492

significativamente dos demais tratamentos que receberam alíquotas de suspensão de células 493

(108 ufc/mL). Os tratamentos em que a levedura foi adicionada ao meio em concomitância 494

(T3, T4, T5, T6, T7) proporcionaram inibição mínima de 95,3% (Figura 6B), já os 495

tratamentos em que foi adicionado a levedura 192h (T8) e 168h com reinóculo após 216h 496

(T9), mesmo apresentando médias maiores, não diferiram estatisticamente (p<0.05) em 497

relação à variável PS. Quando a levedura foi adicionada ao meio de cultivo apenas uma vez, 498

em conjunto com M. perniciosa, no início do experimento, a inibição do crescimento micelial 499

de M perniciosa não diferiu dos tratamentos com 1 (T4), 2 (T5), 3 (T6), 4 (T7) reinóculos, 500

demonstrando que o isolado LEV 207 não necessita de reinóculos para aumentar a capacidade 501

de inibição do crescimento do patógeno in vitro. Mesmo não apresentando diferença 502

significativa (p<0.05) em relação aos tratamentos T3, T4, T5, o peso seco de co-cultivos do 503

T7 (4 reinóculos) possibilitou um maior crescimento do patógeno, indicando que a partir de 3 504

reinóculos, o aumento do número de células de levedura não influencia positivamente na 505

inibição do crescimento micelial do patógeno. 506

87

O consumo de carboidratos no meio de cultivo foi maior para tratamentos que 507

receberam alíquotas de suspensões de células de levedura, não havendo diferença significativa 508

(p<0.05), entre T2, tratamento com crescimento apenas de levedura, e os tratamentos T3, T4, 509

T5, T6 e T7, onde foram realizados co-cultivos de levedura e M. perniciosa (Figura 6C). Nos 510

tratamentos T8 e T9, que receberam células de levedura tardiamente, sem ou com um 511

reinóculo respectivamente, foram identificadas as maiores concentrações de açúcares 512

redutores. 513

Houve diferenças significativas (p<0,05) em relação à concentração de células de 514

levedura nos cultivos dos tratamentos avaliados (Figura 6D). O tratamento T3 (apenas uma 515

alíquota de células de levedura no início do co-cultivo) e os tratamentos T5 e T6 (alíquotas no 516

início do co-cultivo + 2 e 3 reinóculos respectivamente), diferiram do tratamento T2, onde 517

houve crescimento de levedura na ausência do patógeno, com média menor e maiores, 518

respectivamente. Foi identificado um decréscimo na concentração de células no meio de 519

cultivo após 3 reinóculos (T7) e baixo crescimento em tratamentos que receberam células de 520

leveduras após o crescimento micelial do patógeno por no mínimo 168h em meio caldo de 521

BD (Figura 6D). 522

523

Discussão 524

525

Vários trabalhos têm relatado a diversidade de leveduras associadas ao processo de 526

fermentação de amêndoas do cacaueiro (Daniel et al., 2009; Moreira et al., 2013), bem como 527

a utilização destes microorganismos como potencializadores de atributos da qualidade do 528

produto destinado a fabricação de chocolate (Leal Jr et al., 2008). Entretanto o potencial 529

biotecnológico destes microorganimos ainda se restringe ao desenvolvimento de tecnologias 530

para o beneficiamento do cacau. 531

Trabalhos a respeito da bioprospecção de microorganimos e metabólitos de interesse 532

são citados na literatura (Duarte et al., 2013; Gohel et al., 2006; McCormick et al., 2012), 533

entretanto evidencia-se o elevado número de organismos avaliados devido a diversidade de 534

mecanismos de ação e interação com outros organismos e meio ambiente. Rubini et al. (2005) 535

avaliaram a diversidade de fungos endofíticos em ramos sadios e infectados por M. perniciosa 536

de genótipos de cacaueiro selecionados como resistentes e suscetíveis à vassoura de bruxa, e 537

apesar de um total de 265 fungos endofíticos avaliados, apenas 16,22% dos isolados inibiram 538

o crescimento micelial do patógeno e apenas o isolado identificado como Gliocladium 539

catenulatum reduziu em 70,84% os sintomas da vassoura de bruxa em plântulas. Os 540

88

resultados alcançados na fenotipagem dos isolados de levedura obtidos quanto à inibição do 541

crescimento e germinação de esporos de M. perniciosa permitem inferir sobre a capacidade de 542

estabelecimento e colonização de sítios de infecção ocupados por estes micro-organimos e 543

consequente controle da vassoura de bruxa. 544

A maioria dos fungos conhecidos estão associados a outros organismos através de 545

relações parasíticas, comensalísticas ou mutualísticas (Barbieri & Carvalho, 2001). A 546

superfície de órgãos vegetais tem sido descrita como substrato colonizado por diversos micro-547

organimos como bactérias, fungos leveduriformes e filametosos (Andrews & Harris, 2000; 548

Leff & Fierer, 2013; Mautone, 2008), que desenvolvem estratégias de estabelecimento, 549

desenvolvimento e competição. O isolado 207 (Hannaella sp.) inibiu completamente o 550

crescimento de M. perniciosa quando cultivados concomitantemente em caldo BD devido a 551

rápida capacidade de reprodução e assimilação de nutrientes inerente à maioria das leveduras, 552

conferindo à estes micro-organimos uma ótima ação competitiva no ambiente em que se 553

encontram, sendo a competição por nutrientes e espaço um dos principais mecanismos de 554

biocontrole (Lahlali et al., 2011; Zhao et al., 2011). Alguns representantes do gênero Candida 555

e Rhodotorula já foram relatados como produtores de compostos quelantes de íons férricos 556

(sideróforos) (El-Tarabily & Sivasithaparam, 2006; Rosa et al., 2010). 557

Fungos leveduriformes preferencialmente colonizam ambientes ricos em carboidratos, 558

como a carposfera, espermosfera e antosfera, mas também estão presentes na superfície de 559

folhas, atuando por mecanismos diversos como produção de enzimas hidrolíticas, toxinas 560

“killer”, inibição da germinação de esporos fúngicos (Lutz et al., 2013), produção de 561

fitohormôios (Sun et al., 2014), indução de resistência (Lu et al., 2013) e formação de 562

biofilmes (Li et al., 2015), possibilitando a sua estabilização em ambientes hostis, expostos a 563

variações de temperatura, umidade relativa. A anatomia e morfologia dos órgãos vegetais, 564

como estômatos, nervuras, e apêndices na superfície, incluindo tricomas e hidatódios, podem 565

afetar a disponibilidade de nutrientes na filosfera, contribuindo assim para o estabelecimento 566

de microorganimos nestes substratos (Leveau & Lindow, 2001), sendo assim, muitos 567

genótipos selecionados para a resistência a doenças de plantas, podem ser favorecidos pela 568

interação com microorganimos benéficos capazes de potencializar características fenotípicas 569

desejáveis. 570

A prospecção de microorganismos que co-habitem o mesmo nicho do patógeno 571

aumenta a chance de eficiência na seleção de indivíduos com características relacionadas ao 572

biocontrole, pois a seleção do antagonista é relativa para cada patossistema (Bettiol, 1997). 573

89

Dentre os microorganismos citados na literatura como agentes de biocontrole, El-574

Tarabily e Sivasithamparan (2006) destacam leveduras pertencentes aos gêneros 575

Debaryomyces, Kloeckera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Sporobolomyces, 576

Metschnikowia, Tilletiopsis, Rhodotorula, Cryptococcus, Aureobasidium, Pichia e Candida. 577

Sun et al. (2014) isolaram leveduras da filosfera de Drosera indica L. e identificaram o 578

potencial de leveduras pertencentes aos filos Ascomycota (Aureobasidium pullulans, Candida 579

apicola e Candida floricola) e Basidiomycota (Cryptococcus flavus, Hannaella 580

coprosmaensis, Pseudozyma aphidis, Sporisorium cruentum, Sporisorium reilianum, Ustilago 581

alcornii), para a produção de ácido indol-acético (AIA). 582

A espécie Hanseniaspora uvarum , pertencente à família Saccharomycetaceae, ordem 583

Saccharomycetales, classe Saccharomycetes, filo Ascomycota, é amplamente utilizada no 584

processo de fermentação de uvas para a produção de vinhos (Escalante et al., 2011; Moreira et 585

al., 2011) e produção de enzimas de interesse agroindustriais (López et al., 2016), além de ser 586

relatada como micro-organismo utilizado para o controle de patologias pós colheita 587

(Janisiewicz et al., 2010), atuando através da secreção de toxinas “killer” (Schmiti & 588

Neuhausen, 1994) compostos voláteis (Moreira et al., 2011), corroborando com os resultados 589

alcançados por este trabalho, onde todos os isolados deste gênero (LEV 162, LEV 194, LEV 590

210 e LEV 211) se destacaram com alto potencial antagônico à M. perniciosa para as 591

variáveis analisadas. Apesar da H. uvarum já ser citada como integrante da microbiota 592

presente na fermentação de amêndoas de três híbridos de cacaueiro, este é o primeiro relato 593

deste gênero habitando a superfície de folhas e flores de cacaueiro, além do seu potencial para 594

inibir o crescimento de M. perniciosa. 595

Outros gêneros da família Saccharomycetaceae, como Rhodosporidium, 596

Wicherhamomyces, Hansenula, Pichia, foram identificadas pela primeira vez na filosfera, 597

carposfera e antosfera do cacaueiro. Alguns destes gêneros já foram citadas na literatura como 598

portadoras de características de interesse para o biocontrole de doenças de plantas, a exemplo 599

de R. palludigenum (Lu et al., 2014; Lu et al., 2013), P. sporocuriosa (Péter et al., 2000), 600

além de Wickerhamomyces anomalus (Hashem et al., 2014). No entanto deve-se realizar um 601

estudo mais criterioso sobre a utilização de alguns representantes deste clado, como as 602

espécies do gênero Candida que devem ser estudadas cuidadosamente pois apesar de ser um 603

gênero muito utilizado no controle de doenças de plantas (Droby et al., 2003; Zhang et al., 604

2014), abriga espécies que podem ser consideradas patógenos humanos (Bertini et al., 2013). 605

O filo basidiomycota também reúne uma diversidade de fungos leveduriformes que 606

habitam a superfície de órgãos vegetais como Hannaella oryzae em arroz (Nakase & Suzuki, 607

90

1985) e em feijão (Phaseolus vugaris L.) (Gonzaga et al., 2015); H. pagnoccae em néctar de 608

Heliconia psittacorum (Heliconiaceae), flores de pimenta (Myrtaceae), raízes e folhas de 609

cana-de-açúcar (Saccharum spp.) no Brasil, folhas de Cratoxylum maingayi, Arundinaria 610

pusilla e Vitis vinifera na Tailândia, amostras de solo em Taiwan e USA (Landell et al., 611

2014). Estudos recentes têm revelado a diversidade de leveduras residentes de órgãos 612

vegetais, com identificação e descrição de novas espécies, a exemplo de Cryptococcus 613

foliicola e Cryptococcus taibaiensis (Wang et al., 2011). Representantes do clado Tremellales 614

são utilizadas como biocontroladores de doenças de plantas, a exemplo das espécies 615

Cryptococcus albidus (Tian et al., 2002), Cryptococcus laurentii (Tian et al., 2007; Wang et 616

al., 2008), Cryptococcus flavus, Hannaella sinensis, R. paludigenum, (Nutaratat et al., 2014). 617

Divergências em relação ao mecanismo intraespecífico de biocontrole também são 618

citadas em diversos trabalhos, por haver particularidades quanto ao modo de ação antagônica 619

em leveduras da mesma espécie. Portes et al. (2013) estudando o papel de leveduras “killer” 620

na inibição e atividade de biocontrole contra Penicillium expansum e Aspergillus orchraceus, 621

demonstraram que as leveduras avaliadas foram mais efetivas na inibição da germinação dos 622

conídios do que em relação à inibição do crescimento micelial dos patógenos. No presente 623

trabalho, isolados identificados como Rhosdosporidium sp. diferiram em relação a todos os 624

parâmetros avaliados, alguns apresentando atividade “killer”, mas não sendo identificada 625

secreção de tais toxinas para todos os isolados (LEV 161, LEV 101 e LEV 092). Em relação à 626

inibição da germinação de basidiósporos, o isolado LEV 169 se destaca com a maior 627

porcentagem de inibição e o LEV 161 se enquadra dentre os isolados que pouco inibiram a 628

germinação. 629

Apesar de receber pouca atenção quando comparados com compostos difusíveis, os 630

compostos voláteis orgânicos tem sido alvo de trabalhos que visam compreender os 631

mecanismos de síntese, reconhecimento e papel no ecossistema (Hung et al., 2015). Mesmo 632

não identificando a capacidade de produção de compostos antifúngicos voláteis em todos os 633

isolados testados, estes compostos podem ser responsáveis pela inibição do crescimento 634

micelial de M. perniciosa. As leveduras podem reduzir o crescimento micelial de 635

fitopatógenos por compostos difusíveis, mas não constatar semelhante ação inibitória por 636

compostos voláteis (Rosa et al., 2010). Isto pode significar na prática que se essas leveduras 637

que apresentam esta característica, se aplicadas nas vassouras secas, podem impedir o 638

desenvolvimento do micélio do patógeno e, portanto, a produção de basidiomas. 639

O presente trabalho contribui para o conhecimento de fungos leveduriformes, ainda 640

que genéricos, que habitam e colonizam a superfície de órgãos vegetais do cacaueiro, até 641

91

então pouco explorados (Cabral, 2009), além de caracterizá-los quanto ao potencial de 642

inibição do crescimento de M. perniciosa, agente causador da vassoura de bruxa do cacaueiro, 643

determinando mecanismos de ação direta às estruturas fúngicas do agente etiológico desta 644

doença. Os resultados alcançados apresentam leveduras nativas tais como Hannaella sp., 645

Cryptococcus sp., Hanseniasora sp., Rhodosporidium sp., Candida sp., que atuando na 646

inibição do crescimento micelial e germinação de basidiósporos, por compostos difusíveis e 647

voláteis, são potenciais agentes de biocontrole, sendo recomendados para testes de 648

estabilidade dos mecanismos in vivo e em condições de cultivo para posterior inserção como 649

novos componentes do manejo integrado da vassoura de bruxa do cacaueiro. 650

651

Conclusões 652

653

1. A microbiota epifítica residente em folhas, flores e frutos de cacaueiro abriga uma 654

diversidade de fungos leveduriformes, até então não citados na literatura. 655

2. Leveduras nativas do cacaueiro são produtoras de compostos difusíveis e voláteis 656

que atuam na inibição da germinação de basidiósporos e crescimento micelial de M. 657

perniciosa. 658

4. A maioria dos isolados de leveduras nativas do cacaueiro são produtoras de toxina 659

“killer”. 660

5. Na superfície de diferentes órgãos vegetais de cacaueiros selecionados como 661

resistentes à vassoura de bruxa e monilíase, existem uma diversidade de fungos 662

leveduriformes que podem estar atuando de forma positiva na inibição de M. perniciosa e 663

evolução do quadro sintomatológico. 664

665

Agradecimentos 666

667

À Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), através da Fundação Pau Brasil 668

(FUNPAB) e Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), 669

à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e a Fundação de 670

Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) por concessão de bolsas e recursos. 671

672

Referências 673

674

92

ASSIS, S.M.P.; MARIANO, R.L.R.; MICHEREFF, S.J.; SILVA, G.; MARANHÃO, E.A.A. 675

Antagonism of yeasts to Xanthomonas campestris pv. Campestris on cabbage phylloplane in 676

field. Revista de Microbiologia, v. 30, p. 191-195, 1999. 677

AFSAH-HEJRI, L. Saprophytic yeasts: effective biocontrol agents against Aspergillus flavus. 678

International Food Research Journal, v.20, n.6, p.3403-3409, 2013. 679

BARBIERI, R.; CARVALHO, I. F. Coevolução de plantas e fungos fitopatogênicos. Revista 680

Brasileira de Agrociência, v.7, p.79-83, 2001. 681

BERTINI, A.; DE BERNARDISB, F.; HENSGENSA, L.A.M.; SANDINIB, S.; SENESIA, 682

S.; TAVANTIA, A. Comparison of Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis, and 683

Candida metapsilosis adhesive properties and pathogenicity. International Journal of 684

Medical Microbiology, v.303, p.98-103, 2013. 685

BETTIOL, W. Biocontrole na filosfera: problemas e perspectivas. Revisão Anual de 686

Patologia de Plantas, v.5, p.59-97, 1997. 687

BRUCE, A.; STEWARTA, D.; VERRALLB, S.; WHEATLEY, R.E. Effect of volatiles from 688

bacteria and yeast on the growth and pigmentation of sapstain fungi. International 689

Biodeterioration & Biodegradation, v.51, n.2, p.101-108, 2003. 690

CABANAS, Andreia Sofia Pereira. Avaliação da atividade antifúngica de quitinases de 691

macieira. 2013. 64 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia Agronómica, Instituto 692

Superior de Agronomia Univercidade de Lisboa, Lisboa, 2013. 693

CABRAL, A.S. Killer yeasts inhibit the growth of the phytopathogen Moniliophthora 694

perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease. Brazilian Journal of Microbiology, 695

v.40, p.108-110, 2009. 696

COELHO, A.R.; NÓBREGA, G.M.A.; PAGNOCCA, F.C.; HOFFMANN, F.L.; HARADA, 697

K.; HIROOKA, E.Y. Avaliação do potencial antagônico de leveduras, visando biocontrole de 698

deterioração por Penicillium expansum. Semina: Ciência Agrárias, v.32, p.1879-1892, 2011. 699

CLARKE, K.R. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. 700

Australian Journal of Ecology, v.18, p.117-143, 1993. 701

CUATRECASAS, J. Cacao and its allies: a taxonomic revision of the genus Theobroma. 702

Contributions from the United States National Herbarium. n.35, p.379-614, 1964. 703

COSTA, J.C.B.; BEZERRA, J.L.; SANTOS FILHO, L.P.; ALVES, M.C.; MOURA, E.M. 704

Controle biológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro da Bahia, Brasil. In: BETTIOL, W.; 705

MORANDI, M.A.B. (Org.). Biocontrole de Doenças de Plantas: uso e perspectivas. 706

Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2009, p.245–266. 707

93

DANIEL, H.; VRANCKEN, G.; TAKRAMA, J.F.; CAMU, N.; De Vos, P.; DE VUYS, L. 708

Yeast diversity of Ghanaian cocoa bean heap fermentations. FEMS Yeast Research, v.9, p. 709

774–783, 2009. 710

DICKSTEIN, E.R.; PURDY, L.H.; FRIAS, G.A. Crinipellis perniciosa, the cacao witches’ 711

broom fungus: Inoculum production and storage. Phytopathology, v.77, p.1747, 1987. 712

DROBY, S.; WISNIEWSKI, M.; EL GHAOUTH, A.; WILSON, C. Influence of food 713

additives on the control of postharvest rots of apple and peach and efficacy of the yeast-based 714

biocontrol product Aspire. Postharvest Biology and Technology, v.27, p.127-135, 2003. 715

DUARTE, S.H.; de ANDRADE, C.C.; GHISELLI, G.; MAUGERI, F. Exploration of 716

brazilian biodiversity and selection of a new oleaginous yeast strain cultivated in raw 717

glycerol. Bioresource Technology, v.138, p.377–381, 2013. 718

EL-TARABILY, K.A.; SIVASITHAMPARAM, K. Potential of yeasts as biocontro agents of 719

soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Mycoscience, v.47, p.25-720

35, 2006. 721

ESCALANTE, W.E.; RYCHTERAA, M.; MELZOCHA, K.; SAKODAB, B.H.; POLOC, 722

E.Q.; CERVANTESD, Z.L.; CASAVILCAD, V.S.; QUILCAD, G.C. Actividad fermentativa 723

de Hanseniaspora uvarum y su importancia en la producción de bebidas fermentadas. Revista 724

de la Sociedad Venezolana de Microbiología, v. 31, p.57-63, 2011. 725

GOHEL, V.; SINGH, A.; VIMAL, M.; ASHWINI, P.; CHHATPAR, H.S.Bioprospectingand 726

antifungal potential of chitinolytic microorganism. African Journal Biotecnology, v.5, n.3, 727

p.54-72, 2006. 728

GONZAGA, L.L.; COSTA, L.E.O.; SANTOS, T.T.; ARAUJO, E.F.; QUEIROZ, M.V. 729

Endophytic fungi from the genus Colletotrichum are abundant in the Phaseolus vulgaris and 730

have high genetic diversity. Journal Applied Microbiology, v.118, n.2, p.1-12, 2015. 731

HASHEM, M.; ALAMRI, S. A.; HESHAM, A.E.; AL-QAHTANI, F.M.H.; KILANY, M. 732

Biocontrol of apple blue mould by new yeast strains: Cryptococcus albidus KKUY0017 and 733

Wickerhamomyces anomalus KKUY0051 and their mode of action. Biocontrol Science and 734

Technology, v.24, v.10, 2014. 735

HU, H.; XU, Y.; LU, H.; XIAO, R.; ZHENG, X.; YU, T. Evaluation of yeasts from Tibetan 736

fermented products as agents for biocontrol of blue mold of Nashi pear fruits. Journal of 737

Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology), v.16, n.4, 275-285, 2015. 738

HUNG, R.; LEE, S.; BENNETT, J.W. Fungal volatile organic compounds and their role in 739

ecosystems. Applied Microbiology and Biotechnology, v.99, p. 3395-3405, 2015. 740

ICCO Quarterly Bulletin of Cocoa Statistics, Vol. XLI, No. 4, Cocoa year 2014/15 741

mailto:[email protected]

94

Published: 27-11-2015 742

INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Sistema IBGE de 743

Recuperação Eletrônica (SIDRA). 2014. Disponível em: 744

http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/agric/. Acesso em: 26 jan. 2016. 745

JANISIEWICZ, W.J.; KURTZMAN, C P.; BUYER, J.S. Yeasts associated with nectarines 746

and their potential for biological control of brown rot. Yeast, v.27, p.389–398, 2010. 747

KELLY, P.L.; REEDER, R.; RHODES, S.; EDWARDS, N. First confirmed report of 748

witches’ broom caused by Moniliophthora perniciosa on cacao, Theobroma cacao, in Saint 749

Lucia. Plant Pathology, v.58, p.798-798, 2009. 750

LANDELL, M.F.; BRANDÃO, L.R.; BARBOSA, A.C.; RAMOS, J.P.; SAFAR, S.V.B.; 751

GOMES, F.C.O.; SOUSA, F.M. P.; MORAIS, P.B.; BROETTO, L.; LEONCINI, O.; 752

RIBEIRO, J.R.; FUNGSIN, B.; TAKASHIMA, M.; NAKASE, T.; LEE, C.; VAINSTEIN, 753

M.H.; FELL, J.W.; SCORZETTI, G.; VISHNIAC, H.S.; ROSA, C.A.; VALENTE, P. 754

Hannaella pagnoccae sp. nov., a tremellaceous yeast species isolated from plants and soil. 755

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.64, p.1970-1977, 756

2014. 757

LAHLALI, R.; HAMADI, Y.; EL GUILLI, M.; JIJAKLI, M.H. Efficacy assessment of Pichia 758

guilliermondii strain Z1, a new biocontrol agent, against citrus blue mould in Morocco under 759

the influence of temperature and relative humidity. Biological Control, v.56, n.3, p.217-224, 760

2011. 761

LEAL JR, G.A.; GOMES, L. H.; EFRAIM, P.; TAVARES, F. C. A.; FIGUEIRA, A. 762

Fermentation of cacao (Theobroma cacao L.) seedswith a hybrid Kluyveromyces marxianus 763

strain improved product quality attributes. FEMS Yeast Research, v.8, p.t88–798, 2008. 764

LEFF, J.W.; FIERE, N. Bacterial communities associated with the surfaces of fresh fruits and 765

vegetables. PLoS ONE, v.8, n.3, 2013. 766

LEVEAU, J.H.; LINDOW, S.E. Appetite of an epiphyte: quantitative monitoring of bacterial 767

sugar consumption in the phyllosphere. Proceedings of the National Academy of Science of 768

The United States of America. v.98, p.3446–3453, 2001. 769

LI, X.; YU, V.Y.; LIN, Y.; CHOMVONG, K.; ESTRELA, R.; PARK, A.; LIANG, J.M.; 770

ZNAMEROSKI, E.A.; FEEHAN, J.; KIM, S.R.; JIN, Y; GLASS, N.L.; CATE, J.H.D. 771

Expanding xylose metabolism in yeast for plant cell wall conversion to biofuels. Elife, v.4, 772

p.1-16, 2015. 773

LÓPEZ, S.; MATEO, J.J.; Maicas, S. Screening of Hanseniaspora strains for the production 774

of enzymes with potential interest for winemaking. Fermentation, v.1, p.1-16, 2016. 775

95

LU, L.; LU, H.; WUC, C.; FANGD, W.; YUA, C.; YEA, C.; SHIA, Y.; YUA, T.; ZHENGA, 776

X. Preharvest application of antagonistic yeast Rhodosporidium paludigenum induced 777

resistance against postharvest diseases in mandarin orange. Biological Control, v. 67, n. 2, p. 778

130–136, 2013. 779

LU, H.; LU, L.; ZENG, L.; FU, D.; XIANG, H.; YU, T.; ZHENG, X. EFFECT of chitin on 780

the antagonistic activity of Rhodosporidium paludigenum against Penicillium expansum in 781

apple fruit. Postharvest Biology and Technology, v.92, p.9-15, 2014. 782

MARIANO, R.L.R; GOMES, A. M. A.; ASSIS, S. M. P; SILVEIRA, E. B. Mecanismos de 783

ação de bactérias promotoras de crescimento de plantas. In: MARIANO, R. L. R.; 784

SILVEIRA, E. B. (Coord.). Manual de práticas em fitobacteriologia. 2.ed. Recife: UFRPE, 785

2005. p. 143-157. 786

MILLER, W.G.; BRAND, M.T.; QUIÑONES, B.; LINDOW, S.E. Biological sensor for 787

sucrose availability: relative sensitivities of various reporter genes. Applied and 788

Environment Microbiology, v.67, p.1308–1317, 2001. 789

MASIH, E.I.; PAUL, B. Secretion of beta-1,3-glucanase by the yeast Pichia membranifaciens 790

and its possible role in the biocontrol of Botrytis cinerea causing mold disease of the 791

grapevine. Current Microbiology, v.44, p.391-395, 2002. 792

MIDLEJ, R. R.; SANTOS, A. M. Economia do Cacau. In: VALLE, R. R. (Org). Ciência, 793

Tecnologia e Manejo do Cacaueiro. Brasília: Ceplac, 2012. p. 655-672. 794

MOREIRA, N.; PINA, C.; MENDES, F.; COUTO, J.A.; HOGG, T.; VASCONCELOS, I. 795

Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora 796

uvarum during red wine vinifications. Food Control, v. 22, n. 5, p.662-667, 2011. 797

Moreira, N.; Pina, C.; Mendes, F.; Couto, J.A.; Hogg, T.; Vasconcelos, I. Volatile compounds 798

contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora uvarum during red wine 799

vinifications. Food Control, v 22, p.662-667, 2011. 800

McCORMICK, M.K.; WHIGHAM, D.F.; O’NEILL, J.P.; BECKER, J.J.; WERNER, S.; 801

RASMUSSEN, H.N.; et al. Abundance and distribution of Corallorhiza odontorhiza reflects 802

variations in climate and ectomycorrhizae. Ecological Monographs, v.79, n.4, p.619-635, 803

2009. 804

MAUTONE, J.N. Biodiversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos 805

semelhantes a leveduras isoladas de folhas de figueiras do Parque de Itapuã-Viamão/RS. 806

2008. 109p. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Meio Ambiente) 807

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. 808

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09567135

96

NAKASE, L.; M. SUZUKI. Ballistospore-forming yeasts found on the surface of the 809

Japanese rice plant, Oryza sativa L. Journal of General and Applied Microbiology, v.31, 810

n.5, p.468, 1985. 811

NUTARATAT, P.; SRISUK, N.; ARUNRATTIYAKORN, P.; LIMTONG, S. Plant growth-812

promoting traits of epiphytic and endophytic yeasts isolated from rice and sugar cane leaves 813

in Thailand. Fungal biology, v.118, n.8, p.683-194, 2014. 814

OLIVEIRA, M. L.; LUZ, E. D. M. N. Principais doenças do cacaueiro e seu manejo. In: 815

VALLE, R. R. M. (Ed.). Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro. Brasília: 2012, 688 p. 816

O’DONNELL, K. (1993). Fusarium and its near relatives. In: REYNOLDS, D.R.; TAYLOR, 817

J.W. (Ed.). The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation. Fungal 818

Systematics, pp. 225–233. 819

Wallingford, UK: CAB International.PÉTER, G.; TORNAI-LEHOCZKI, J.; DLAUCHY, 820

D.; VITÁNYI, G. Pichia sporocuriosa sp. nov., a new yeast isolated from rambutan. Antonie 821

van Leeuwenhoek, v.77, p.37-42, 2000. 822

PLATANIAA, A.; RESTUCCIAB, C.; MUCCILLIB, S.; CIRVILLERIA, G. Efficacy of 823

killer yeasts in the biological control of Penicillium digitatum on Tarocco orange fruits 824

(Citrus sinensis). Food Micrrobiology, v.30, n.1, p.219-225, 2012. 825

PORTES, C.S.; DE OLIVEIRA A.V.; SIMER, P.; LUNKES, A.M.; COELHO, A.R. Role of 826

killer factors in the inhibitory activity of bio-control yeasts against Penicillium expansum and 827

Aspergillus ochraceus. Brazilian Archives of biology and technology, v.56, n.4, p.619-627, 828

2013. 829

PURDY, L.H.; SCHMIDT, R A. Status of cacao witches’ broom, biology, epidemiology, and 830

management. Annual Review of Phytopathology, v.34, p.573-594, 1996 831

ROSA, M.M.; TAUK-TORNISIELO, S.M.; RAMPAZZO, P.E.; CECCATO-ANTONINI, 832

S.R. Evaluation of the biological control by the yeast Torulaspora globosa against 833

Colletotrichum sublineolum in sorghum. World Journal of Microbiology and 834

Biotechnology, v.26, n.8, p.1491-1502, 2010. 835

RUBINI, A.S. et al. Molecular identification and characterization of canine Hepatozoon 836

species from Brazil. Parasitology Research, v.97, n.2, p.91-93, 2005. 837

SANGORRÍN, M.P., ZAJONSKOVSKY, I.E., LOPES, C.A., RODRÍGUEZ, M.E., DE VAN 838

BROOCK, M.R.G., CABALLERO, A.C. Killer behaviour in wild wine yeasts associated with 839

Merlot and Malbec type musts spontaneously fermented from northwestern Patagonia 840

(Argentina). Journal of Basic Microbiology, v.41, p.105-113, 2001. 841

97

SCHMITI, M.J.; NEUHAUSEN, F. Killer Toxin-secreting double-stranded RNA 842

mycoviruses in the yeasts Hanseniaspora uvarum and Zygosaccharomyces bailii. Journal of 843

virology, p.1765-1772, 1994. 844

SUI, Y.; WISNIEWSKI, M.; DROBY, S.; LIU, J. Responses of Yeast Biocontrol Agents to 845

Environmental Stress. Applied and environmental microbiology, v.81, n.9, p.2968-2975 846

2015. 847

SUN, P.; FANG, W.; SHIN, L.; WEI, J.; FU, S.; CHOU, J. Indole-3-acetic acid-producing 848

yeasts in the phyllosphere of the carnivorous plant Drosera indica L. Plos one, p.1-22, 2014. 849

TIAN, S.P.; FAN, Q.; XU, Y.; LIU, H. B. Biocontrol efficacy of antagonist yeasts to gray 850

mold and blue mold on apples and pears in controlled atmospheres. Plant Disease, v.86, 851

p.848-853, 2002. 852

TIAN, S.P.; YAO, H.J; DENG, X.; XU, X.B.; QIN, G.Z.; CHAN, Z.L. Characterization and 853

expression of β-1,3-glucanase genes in jujube fruit induced by the microbial biocontrol agent 854

Cryptococcus laurentii. Phytopathology, v.97, p.260-268, 2007. 855

TOPPS, J.H.; WAIN, R.L.; Investigation on fungicides. III. The fungi toxicity of 3-and 5- 856

alkyl salicylanilide and P-chloronilines. Annals of Applied Biology, v.45, n.3, p.506-511, 857

1957. 858

URQUHART, E.J.; PUNJA, Z.K. Hydrolytic enzymes and antifungal compounds produced 859

by Tilletiopsis species, phyllosphere yeasts that are antagonists of powdery mildew fungi. 860

Canadian Journal of Microbiology, v.48, n.3, p.219-229, 2002. 861

VALDEBENITO-SANHUEZA, R. M. V. Leveduras para o biocontrole de fitopatógenos. In: 862

MELO, I. S; AZEVEDO, J. L. (Ed.). Controle biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio 863

Ambiente. p. 41-56, 2000. 864

YOUNG, T.W. Killer yeasts. In: Rose, A.H.; Harrison, J.S.(Ed.). The yeasts. v.2. London: 865

Academic Press, 1987. 866

pp. 131 -164. WANG, Y.F., BAO, Y.H., SHEN, D.H., FENG, W., YU, T., ZHANG, J., 867

ZHENG, X.D., 2008. Biocontrol of Alternaria alternata on cherry tomato fruit by use of 868

marine yeast Rhodosporidium paludigenum. International. Journal of Food Microbiology, 869

Amsterdam, v.123, p.234-239, 2008. 870

WANG, Y.F.; TANG, F.; XIA, J.D.; YU, T.; WANG, J.; AZHATI, R.; ZHENG, X.D. A 871

combination of marine yeast and food additive enhances preventive effects on postharvest 872

decay of jujubes (Zizyphus jujuba). Food Chemistry, v.125, n.3, p.835-840, 2011. 873

98

ZHANG, H.Y.; WANG, L.; DONG, Y.; JIANG, S.; CAO, J.; MENG, R. Postharvest 874

biological control of gray mold decay of strawberry with Rhodotorula glutinis. Biological 875

Control, v 40, p.287-292, 2007. 876

ZHANG, D.; LU, C.; ZHANG, T.; SPADARO, D.; LIU, D.; LIU, W. Candida pruni sp. nov. 877

is a new yeast species with antagonistic potential against brown rot of peaches. Archives of 878

Microbiology, v.196, n.7, p.525-530, 2014. 879

99

Tabela 1. Classes e gêneros de isolados de leveduras nativas do cacaueiro,

verificados através do banco de dados GenBank, utilizando o BLASTn “basic

local alignment search tool” (BLAST) do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

(continua)

CLASSE ISOL TAXONOMIA

ASCOMYCETES

LEV 002 Candida sp.

LEV 008 Yamadazyma sp.

LEV 030 Candida sp.

LEV 047 Wicherhamomyces sp.

LEV 049 Candida sp.

LEV 068 Candida sp.

LEV 074 Candida sp.

LEV 082 Candida sp.

LEV 084 Candida sp.

LEV 089 Candida sp.

LEV 098 Candida sp.

LEV 118 Candida sp.

LEV 162 Hanseniaspora sp.

LEV 189 Pichia sp.


LEV 204 Pichia sp.



LEV 219 Candida sp.

LEV 225 Candida sp.

BASIDIOMYCETES

LEV 001 Sporobolomyces sp.

LEV 007 Rhodosporidium sp.

LEV 014 Hannaella sp.

LEV 016 Cryptococcus sp.







LEV 065 Occultifur sp.










100

Tabela 1. Classes e gêneros de isolados de leveduras nativas do cacaueiro,

verificados através do banco de dados GenBank, utilizando o BLASTn “basic

local alignment search tool” (BLAST) do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

(conclusão)

CLASSE ISOL TAXONOMIA

BASIDIOMYCETES















LEV 164 Hannaella sp


















LEV 226 Hannaella sp

LEV 227 Kwoniella sp.

INDEFINIDO

LEV 059 .

LEV 097 .

LEV 137 .

LEV 146 .

LEV 209 .

LEV 229 .

101

Tabela 2. Grupos de 66 leveduras nativas do cacaueiro, formados a partir das medidas de dissimilaridade

das variáveis antibiose (AB), compostos voláteis (CV), inibição da germinação de basidiósporos (IG) e

toxina killer (TK) e análise de agrupamento obtido pelo método UPGMA (distância euclidiana). Os

isolados de levedura foram obtidos a partir do isolamento de diferentes genótipos (GEN), padrões de

resistência (RESIST) à vassoura de bruxa (VB) e monilíase (ML) e diferentes substratos (SUBST)

(continua)

GRUPO LEV TAXONOMIA

FENOTIPAGEM

GEN RESIT SUSBT AB CV IG TK SM

1 169 Rhodosporidium sp. 5 1 10 1 17 EET233 ML FOLHA

219 Candida sp. 5 1 9 1 16 EET 392 VB FRUTO

2

92 Rhodosporidium sp. 6 3 6 0 15 P253 VB FOLHA

165 Rhodosporidium sp. 6 3 6 1 16 EET 233 ML FOLHA

174 Rhodosporidium sp. 6 3 5 1 15 EET 392 VB FOLHA

162 Hanseniaspora sp. 7 3 6 1 17 P232 VB FOLHA

194 Hanseniaspora sp. 8 3 5 1 17 ICS 95 ML FLOR

211 Hanseniaspora sp. 7 3 7 1 18 P282 VB FLOR

206 Cryptococcus sp. 7 4 5 1 17 UF 273 ML FLOR

2 Candida sp. 7 3 4 1 15 P243 VB FOLHA

189 Pichia sp. 7 3 6 1 17 EET 75 ML FLOR

3

101 Rhodosporidium sp. 6 2 8 0 16 P213 VB FLOR

168 Rhodosporidium sp. 6 2 7 1 16 EET233 ML FOLHA

149 Cryptococcus sp. 6 3 8 1 18 P247 VB FLOR

166 Hannaella sp. 6 3 7 1 17 EET233 ML FOLHA

207 Hannaella sp. 6 2 8 1 17 UF 273 ML FLOR

210 Hanseniaspora sp. 8 4 8 1 21 P282 VB FLOR

225 Candida sp. 5 3 7 1 16 EET 233 ML FRUTO

4


185 Rhodosporidium sp. 6 1 8 1 16 ICS 95 ML FOLHA

63 Hannaella sp. 6 1 7 1 15 P282 VB FOLHA

147 Hannaella sp. 6 1 7 1 15 P247 VB FLOR






65 Occultifur sp. 5 1 7 1 14 P284 VB FOLHA

78 Occultifur sp. 5 1 6 0 12 P285 VB FOLHA

111 Cryptococcus sp. 5 1 7 1 14 P253 VB FOLHA









102

Tabela 2. Grupos de 66 leveduras nativas do cacaueiro, formados a partir das medidas de dissimilaridade

das variáveis antibiose (AB), compostos voláteis (CV), inibição da germinação de basidiósporos (IG) e

toxina killer (TK) e análise de agrupamento obtido pelo método UPGMA (distância euclidiana). Os

isolados de levedura foram obtidos a partir do isolamento de diferentes genótipos (GEN), padrões de

resistência (RESIST) à vassoura de bruxa (VB) e monilíase (ML) e diferentes substratos (SUBST)

(conclusão)

GRUPO LEV TAXONOMIA FENOTIPAGEM

GEN RESIST SUBST AB CV IG TK Σ

4

47 Wicherhamomyces sp. 7 1 7 1 16 P232 VB FOLHA

204 Pichia sp. 7 1 7 1 16 P278 VB FLOR

227 Kwoniella sp. 7 1 6 1 15 EET 233 ML FRUTO


229 - 5 1 5 0 11 EET 233 ML FRUTO

137 - 5 1 6 1 13 P247 VB FOLHA

187 Cryptococcus sp. 5 2 5 1 13 EET 75 ML FLOR

5


118 Candida sp. 6 2 4 0 12 P247 VB FRUTO




193 Hannaella sp. 6 1 4 1 12 ICS 95 ML FLOR

226 Hannaella sp. 6 1 4 1 12 EET 233 ML FRUTO


164 Hannaella sp 6 1 5 1 13 EET233 ML FOLHA

1 Sporobolomyces sp. 6 1 4 1 12 P243 VB FOLHA

59 - 6 1 4 1 12 P232 VB FLOR

216 Cryptococcus sp. 6 1 4 1 12 EET 392 VB FRUTO


97 - 7 1 3 1 12 P309 VB FLOR

154 Hannaella sp. 7 2 4 1 14 EET 392 VB FOLHA


170 Rhodosporidium sp. 5 2 4 1 12 EET233 ML FOLHA

6


148 Occultifur sp. 3 1 4 1 9 P300 VB FLOR



*FENOTIPAGEM – As variáveis antibiose (AB), compostos voláteis (CV) e inibição da germinação (IG)

foram avaliadas quantitativamente em percentuais e os dados representados em escala descritiva unidade

de variação de 10%. 1. 0-10%; 2. 10-20%; 3. 20-30%; 4. 30-40%; 5. 40-50%; 6. 50-60%; 7. 60-70%; 8.

70-80%; 9. 80-90%; 10. 90-100%. A variável toxina killer (TK) foi avaliada qualitativamente (positivo –

1; negativo – 0).

103

Figura 1. Heatmap do efeito in vitro de compostos difusíveis e voláteis, produzidos por leveduras nativas do

cacaueiro, no crescimento micelial de diferentes isolados de Moniliophthora perniciosa do sexto ao décimo dia

após pareamento dos microorganismo.

104

Figura 2. Heatmap do efeito in vitro de voláteis, produzidos por leveduras nativas do cacaueiro, no crescimento

micelial de diferentes isolados de Moniliophthora perniciosa do sexto ao décimo dia após pareamento dos

microorganismo.

105

Figura 3. Inibição da germinação de basidiósporos (%) e capacidade de produção de toxinas killer por

diferentes isolados de leveduras nativas do cacaueiro. *Leveduras não produtoras de toxinas killer. As médias

das porcentagens de inibição foram transformadas Sqrt (x + 0.5) e analisadas pelo teste de Scott-Knott (p

<0.05).

106

Figura 4. Diagrama Biplot (3D em cubo) da relação entre mecanismos de biocontrole

(variáveis reais), antibiose: compostos difusíveis e voláteis (AB), compostos voláteis

(CV), inibição da germinação (IG), atividade killer (AK), produzidos por leveduras

nativas do cacaueiro e avaliadas contra o patógeno Moniliophthora perniciosa.

1

2

7

14

16 23

34

27

47

30

49

38 59

63 65

74

77 78

79

84

88

89

90

92

93

97

100

101

106

109

111

118

137

139

143

47 147

148

149

154

161

164

165

166 168

169

170

174

178

179

185

187

189

193

194

204

206

207

210

211 216

219

225

226

227

229 162

1

AK

IG

AB

CV

107

Figura 5. Dendrograma de análise de agrupamento obtido pelo método de UPGMA

(distância Euclidiana), a partir das medidas de dissimilaridade entre 66 isolados de

leveduras nativas do cacaueiro avaliados in vitro para as variáveis antibiose, compostos

voláteis, inibição da germinação dos basidiósporos, capacidade de produção de toxina

killer. Grupos formados após corte na altura de θ = 25: I, II, III, IV, V, VI, VII.

108

Figura 6. Avaliação da interação levedura (Hanella sp.) x Moniliophthora perniciosa cultivados em meio líquido batata dextrose por 240h. A.

Biomassa Fresca – BF; B. Biomassa Seca - BS; C. Açúcares totais – AT; Concentração de células - CC (_x107; ufc); 1. Moniliophthora

perniciosa; 2. Hanella sp.; 3. M. perniciosa + Hanella sp. (mesmo dia); 4. M. perniciosa + Hanella sp. (mesmo dia + 1 reinóculo); 5. M.

perniciosa + Hanella sp. (mesmo dia + 2 reinóculos); 6. M. perniciosa + Hanella sp. (mesmo dia + 3 reinóculos); 7. M. perniciosa + Hanella

sp. (mesmo dia + 4 reinóculos); 8. M. perniciosa + Hanella sp. (192h após); 9. M. perniciosa + Hanella sp. (168h após + 1 reinóculo 216h

após). Médias seguidas com a mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os dados de PS foram

transformados para √x+1.

A

D C

B

a

d d d d d

b c

e

c

e

b

d cd cd bcd d

bc

b

bc

c

a

b

c c c c

c

ab

d

e

c

e

bc

ab

a

109

CAPÍTULO 4

Leveduras nativas como potenciais agentes de biocontrole à vassoura de bruxa e

promotores de crescimento em plântulas de cacaueiro

110

Leveduras nativas como potenciais agentes de biocontrole à vassoura de bruxa e 1

promotores de crescimento em plântulas de cacaueiro 2

3

Antônio Alves Pimenta Neto(1), Tacila Ribeiro dos Santos(2), Carolina Benjamin (2), Eduardo 4

Gross(2), Edna Dora Martins Newman Luz(3), Delson Laranjeira(1) 5

6


CEP 52171-900, Recife, PE, Brasil. Email: [email protected], 8

[email protected] (2)Universidade Estadual de Santa Cruz, Campus Soane Nazaré de 9

Andrade, Rod. Jorge Amado, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA, Brasil. Email: 10

[email protected], [email protected], [email protected] (3)Comissão 11

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Centro de Pesquisas do Cacau, Rodovia Ilhéus-12

Itabuna, Km 22, s/n, CEP 45660-000, Ilhéus, BA, Brasil. Email: [email protected] 13

14

Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de leveduras nativas no controle da 15

vassoura de bruxa (VB) e promoção de crescimento do cacaueiro (PC). Cem leveduras foram 16

avaliadas quanto ao controle da VB em plântulas, através da inoculação em sementes e 17

pulverização na parte aérea. A influência do período de aplicação do tratamento (1, 2, 7, 14 18

dias antes da inoculação do patógeno) foi avaliado pela pulverização de quatro leveduras e o 19

produto Agromós®. Leveduras foram analisadass isoladamente e em concomitância com 20

outras leveduras e produtos comerciais quanto ao controle em plântulas e inibição da 21

produção de basidiomas em vassouras secas (IPB). Foi investigado o efeito de aplicações (1, 22

2, 3) de leveduras quanto a PC, através da aplicação isolada e em consórcio. Houve diferenças 23

estatísticas (p<0,05) entre os 100 isolados de levedura, com distribuição em três grupos 24

(clusters) separados por dissimilaridade das médias dos sintomas de VB. O grupo II.1 reúne 25

os isolados que mais controlaram a VB. Tratamentos com isolados pertencentes aos gêneros 26

Rhodosporidium, Hanseniaspora, Candida e Hannaela foram responsáveis pelos maiores 27

níveis de controle e promoção de crescimento independente do experimento realizado. Houve 28

diferenças significativas entre período e número de aplicação da levedura. O Agromós® 29

proporcionou 100% de controle de VB independente da época de aplicação. Os fungicidas 30

quando aplicados isoladamente e associados a leveduras inibiram o aparecimento dos 31

sintomas em 100% das plântulas. Todas as leveduras avaliadas colonizaram os sítios de 32

infecção do patógeno e, permaneceram por 10 dias após a aplicação. Leveduras nativas 33

111

mostraram potencial para o biocontrole da vassoura de bruxa e promoção de crescimento do 34

cacaueiro. 35

Termos para indexação: controle biológico, leveduras, Rhodosporidium, Hanseniaspora, 36

Candida, Hannaela, Moniliotphora perniciosa, Theobroma cacao. 37

38

39

Native yeasts as potential biocontrol agent to witches' broom and growth promoters in 40

cocoa seedlings 41

42

Abstract - The objective of this study was to evaluate the efficiency of native yeasts to control 43

witches' broom (WB) and promote cacao growth (PG). One hundred yeasts were evaluated for 44

control of WB in seedlings by inoculating seeds and spraying aerial part of the plant. The 45

influence of the application of the treatment period (1, 2, 7, 14 days before pathogen 46

inoculation) was evaluated by spraying four yeasts and Agromós® product. Yeasts were 47

evaluated alone and associated with other yeasts and commercial products as to control in 48

seedlings and inhibition of the mushroom production in dry brooms (IMP). It investigated the 49

effect of applications (1, 2, 3) yeast as the PG with alone application and consortium. There 50

were statistical differences (p <0.05) among 100 isolates from yeast, with distribution in three 51

groups (clusters) separated by means of the dissimilarity of the symptoms of WB. The group 52

meets II.1 isolated more controlled the VB. Treatments with isolates from genre 53

Rhodosporidium, Hanseniaspora, Candida and Hannaela were responsible for the highest 54

levels of control and promotion of growth, independent of the experiment conducted. There 55

were significant differences between time and yeast application number. The Agromós® 56

provided 100% control, independent of the application time. The fungicides when applied 57

alone and in combination with yeast, inhibited the onset of the symptoms in 100% of the 58

seedlings. Native yeasts are potential agents of biocontrol of witches' broom disease of cocoa 59

and growth promoters. 60

61

Index terms: Biocontrol, yeast, Rhodosporidium, Hanseniaspora, Candida, Hannaela, 62

Moniliotphora perniciosa, Theobroma cacao. 63

64

65

66

67

112

Introdução 68

69

O fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, anteriormente 70

descrito como Crinipellis perniciosa, é o agente etiológico da vassoura de bruxa (VB) do 71

cacaueiro e um dos patógenos mais importantes para os países produtores de cacau nas 72

Américas (Meinhardt et al. 2008). Esta doença foi responsável pela queda da produção de 73

cacau no sul da Bahia, principal região produtora do Brasil, de 400.000 toneladas em 1980, 74

para 12.000 após a entrada deste patógeno nos cacauais baianos (FAO, 2002), levando o 75

Brasil a alterar sua situação de exportador para importador de cacau (Midlej & Santos, 2012) 76

e permanece sendo a doença de maior relevância para a lavoura cacaueira baiana e o principal 77

entrave para a retomada do Brasil ao topo do ranking internacional dos maiores produtores de 78

cacau. 79

Este patógeno é um basidiomiceto hemibiotrófico que apresenta dois tipos de micélio, 80

biotrófico (parasítico) e necrotrófico (saprofítico) (Scarpari et al., 2005), afeta principalmente 81

os tecidos meristemáticos da planta (caules, almofadas florais, flores e frutos), causando uma 82

gama de sintomas, que varia de acordo com o órgão infectado e o seu estádio de 83

desenvolvimento (Silva et al., 2003), levando à morte da planta, quando afetada por 84

sucessivos surtos de infecção e fatores abióticos em concomitância (Andebrhan, 1984; 85

Queiroz et al., 2003). 86

Desde o estabelecimento da doença em regiões produtoras no Brasil e em países das 87

Américas do Sul e Central, diferentes estratégias de manejo da doença têm sido buscadas. 88

Atualmente é recomendado pela CEPLAC, a utilização de várias medidas de controle em 89

concomitância. Esforços têm sido voltados para a busca de medidas alternativas para o 90

controle efetivo da VB, podendo ir desde a racionalização do uso de agroquímicos, à redução 91

da frequência de realizações do saneamento vegetal (Costa et al., 2009; Medeiros et al.,2010). 92

O controle biológico, importante componente no manejo de doenças de plantas, utiliza 93

micro-organismos antagônicos e competidores, envolvido em diferentes mecanismos de ação: 94

competição, antibiose, hiperparasitismo, indução de resistência, e promoção de crescimento 95

(Valdebenito-Sanhueza, 2000). Resultados promissores estão sendo obtidos com o fungo 96

Trichoderma stromaticum para o biocontrole do agente causal da VB, entretanto novos micro-97

organimos devem ser testados, principalmente os que co-habitam no mesmo nicho, e que 98

possam ter ação sobre várias doenças, sendo ótimos competidores e competentes. As 99

leveduras apresentam este potencial por estarem tanto na filosfera, quanto na rizosfera de 100

vários cultivos, inclusive o cacaueiro (Cabral et al., 2009). 101

113

Apesar da utilização de fungos leveduriformes como agentes de biocontrole ainda se 102

concentrar na patologia pós colheita (Janisiewicz et al., 2010), estes micro-organismos 103

reúnem características de interesse que estimulam a investigação do potencial biocontrolador 104

em doenças pré colheita, bem como a ação antagônica a patógenos habitantes do solo, 105

rizosfera e filosfera. Diversos relatos descrevem o alto potencial competidor (Zhang et al., 106

2007) destes micro-organismos, que se reproduzem rapidamente em ambientes ricos em 107

açúcares (Lutz et al., 2013), secretam toxinas “killer” (Platania et al., 2012), compostos 108

voláteis (Bruce et al., 2004) e enzimas hidrolíticas capazes de degradar a parede celular de 109

fitopatógenos (Lu et al., 2014; Masih & Paul, 2002; Urquhart & Punja, 2002), apresentam a 110

capacidade de suportar mudanças no ambiente e condições de estresse (Sui et al., 2015), 111

tolerância à poluentes, óleos essenciais vegetais, fitoalexinas e alguns fungicidas 112

(Valdebenito-Sanhueza, 2000), além de sobreviverem saprofiticamente (Afsah-Hejri, 2013) e 113

tolerarem condições adversas (Hu et al., 2015). 114

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de leveduras nativas como possíveis 115

agentes de biocontrole à vassoura de bruxa e promotores de crescimento de plântulas do 116

cacaueiro. 117

118

Material e Métodos 119

120

Microrganismos e condições de cultivo 121

Os isolados de leveduras testados foram cultivados em meio de cultivo yeast extract peptone 122

dextrose (YEPD - 0,15% extrato de levedura, 1% neopeptona, 4% dextrose, 2% ágar e 0,05% 123

cloranfenicol), em triplicata, por 72h à 28°C. Transcorrido o tempo de cultivo as colônias de 124

leveduras separadas do meio com alça de Drigaslki previamente flambada e suspensas em 125

solução salina (NaCl 0,85%). A concentração da suspensão de leveduras foi ajustada à 108 126

ufc/mL com base na quantificação em câmara de Neubauer (marca) e mensuração da 127

densidade ótica em espectrofotômetro (SpectraMax® Paradigm Multi-Mode Detection 128

Platform, Molecular-Devices Japan, Tóquio, Japão) à 595 nm. Para obtenção de suspensão de 129

basidiósporos de M. perniciosa, vassouras vegetativas secas foram coletadas, desinfestadas 130

com lavagens rápidas em hipoclorito de sódio a 0,1%, fixadas em arames esticados 131

horizontalmente em casa de vegetação otimizada (vassoureiro), e então submetidas a um 132

regime diário de 8 h de molhamento e 16 h de secamento. Após o período de dormência das 133

vassouras, foi aplicada solução de estreptomicina a 1%, e lavadas mais duas vezes em água 134

destilada. Com o surgimento dos basidiomas, estes foram então coletados e secos em folhas 135

114

de papel absorvente, seccionando os píleos e fixando-os com vaselina pastosa (Silinol SG) em 136

tampas de vidro, com o himênio voltado para baixo, sobre um béquer contendo uma solução 137

de glicerina a 16%, e sob agitação constante, permitindo captação dos basidiósporos 138

liberados. As suspensões de basidiósporos foram quantificadas em câmara de Neubauer e 139

estocadas em nitrogênio líquido, acondicionadas em tubos criogênicos de 2 mL, até o 140

momento de serem utilizadas, conforme metodologia descrita por Dickstein et al. (1987). 141

Antes da estocagem, uma alíquota de 25 µL de cada uma das suspensões de basidiósporos 142

obtidas foi retirada e espalhada com alça de Drigalski sobre a superfície do meio ágar-água a 143

2%, em placas de Petri de 5 cm de diâmetro, para avaliar a germinação dos esporos. Após seis 144

horas de incubação a 25°C, a percentagem de basidiósporos germinados foi mensurada 145

através da visualização em microscópio ótico e somente suspensões que apresentaram 146

percentual de germinação acima de 80% foram utilizadas. Este procedimento foi realizado 147

tanto no momento da estocagem como também 24 h antes da utilização do inóculo. 148

149

Produção de plântulas 150

Plântulas de cacaueiro (Catongo), suscetíveis a M. perniciosa, foram obtidas a partir de 151

sementes pré-germinadas por 48h em serragem esterilizada e umedecida, e transferidas para 152

tubetes de 288 cm3 contendo terriço (solo + substrato) previamente esterilizados por 153

tindalização (autoclavados por 2x com intervalo de 24h) na proporção 1:1. As plântulas foram 154

mantidas em condições de casa-de-vegetação, submetidas à irrigação diária por um período de 155

20 minutos às 9:00 e às 14:00h, adicionando mais uma rega em dias com temperatura mais 156

elevada, por três a quatro semanas antecedendo a inoculação. As condições de temperatura, 157

umidade relativa e luminosidade foram monitoradas através de sensor HOBO® Data Logger 158

(U12-012). 159

160

Testes de biocontrole 161

Potencial biocontrolador em plântulas 162

O potencial biocontrolador foi avaliado através da inoculação dos isolados de leveduras em 163

sementes “nuas” e no meristema apical em genótipo suscetível de cacaueiro. Sementes de 164

cacau desprovidas de pericarpo e tegumento foram pré-germinadas durante 48 horas em água 165

corrente, desinfestadas por imersão em NaOCl a 0,5% durante 2 min, lavadas várias vezes em 166

água esterilizada e seca em câmara de fluxo laminar. As sementes foram imersas nas 167

suspensões dos isolados de levedura e mantidas nesta condição em over night, sendo em 168

seguida semeadas em tubetes contendo terriço e mantidas sob condição de cultivo em casa de 169

http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/u12-012

115

vegetação. Sementes não tratadas com leveduras foram utilizadas como controle, e imersas 170

em água. Vintes dias após a semeadura, as plântulas foram pulverizadas até o ponto de 171

escorrimento com suspensões de células de leveduras nos tratamentos correspondentes às 172

inoculações em sementes e posteriormente transportadas para a câmara de inoculação. Em 173

câmara de inoculação, as plântulas foram mantidas sob condições de saturação de umidade e 174

temperatura entre 25-27°C. 175

176

Influência do período de aplicação de suspensão de leveduras 177

Plântulas de cacaueiro (Catongo) mantidas em casa de vegetação sob condições de cultivo por 178

20 dias foram tratadas com a pulverização de suspensão de células de leveduras pré-179

selecionadas com potencial biocontrolador (LEV 074 e LEV 098 – Candida sp., LEV 162 e 180

LEV 210 – Hanseniaspora sp.) com 1, 2, 7, 14 dias antes da inoculação do patógeno. 181

182

Associação de leveduras e produtos comerciais 183

Dez isolados de levedura pré-selecionados com potencial biocontrolador (LEV 007 – 184

Rhodosporidium sp.; LEV 027 – Hannaella sp.; LEV 074; LEV 079 – Rhodosporidium sp.; 185

LEV 098; LEV 162; LEV 179 – Rhodosporidium sp.; LEV 193 – Hannaella sp.; LEV 207 – 186

Hannaella sp.; LEV 210) foram aplicados isoladamente, em consórcio com outra levedura e 187

todos em conjunto, em plântulas de cacaueiro suscetíveis, a fim de avaliar a interação entre os 188

mesmos para o biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro. Também foram adicionados 189

como tratamentos, os fungicidas comerciais Folicur 200 EC® (tebuconazol, Bayer S.A.) e 190

Cobre Atar BR® (óxido cuproso, Atar do Brasil Defensivos Agrícolas LTDA) nas 191

concentrações de 0,3 mL/L e 0,9 g/L, respectivamente e a associação destes com a mistura de 192

células das 10 leveduras avaliadas. Paralelamente a este experimento, foi realizado um ensaio 193

in vitro para avaliar o efeito fungicida dos produtos comerciais utilizados. Alíquotas das 194

concentrações 1 (1,8g/L), 2 (0,9/L) e 3 (0,45/L) de Cobre Atar®, 1 (10 ml/L), 2 (5 mL/L) e 3 195

(1/L) de Agromós®, 1 (0,6 mL/L), 2 (0,3 mL/L) e 3 (0,1 mL/L) de Folicur®, foram 196

incorporadas em meio YEPD fundente, sendo em seguida semeado o isolado LEV 207 (108 197

ufc/mL) e espalhado com alça de Drigaslki. As placas foram incubadas à 28°C por 48h e 198

avaliadas através da visualização e contagem de colônias formadas. O experimento in vitro foi 199

realizado em triplicata. 200

201

Inoculação e avaliação dos sintomas 202

116

Vinte e quatro horas após a pulverização com leveduras, as plântulas de cada tratamento 203

foram inoculadas na gema apical com 30 µL da suspensão de basidiósporos na concentração 204

de 2x105 esporos/mL de meio ágar-água 0,2%. Plântulas tratadas apenas com leveduras e 205

apenas com o patógeno foram utilizadas como testemunhas relativas, recebendo apenas uma 206

gota de ágar-água a 0,2% ou com suspensão de basidiósporos respectivamente, enquanto que 207

testemunhas absolutas cresceram na ausência de leveduras e patógeno. Após a inoculação, 208

todas as plântulas permaneceram por 24 h em câmara de inoculação, sendo então transferidas 209

novamente para a casa de vegetação sob condições de cultivo. 210

As plantas foram avaliadas 30 dias após a inoculação quanto ao aparecimento dos 211

sintomas, incidência e severidade da doença, observando o tipo de vassoura formada, o 212

número de vassouras axilares, o diâmetro e a altura das vassouras terminais. Para análise dos 213

dados, foram analisadas: incidência (INC), percentagem de plantas apresentando qualquer 214

sintoma da doença, (vassoura terminal, axilar, cotiledonar e seca, intumecimento do caule, do 215

hipocótilo, dos pecíolos e dos pulvinos, cancro, superbrotamento ou hipertrofia); 216

comprimento da vassoura terminal; e índice de doença (calculado pela seguinte fórmula: ID= 217

VT+VA (0,5*CVT)+NVA, em que: VT = número de vassouras terminais; VA = número de 218

vassouras axilares; CVT = comprimento da vassoura terminal; NVA = número de vassouras 219

axilares maiores que 1cm. O desenho experimental foi em blocos casualizados, com quatro 220

repetições de 20 plantas cada. 221

222

Potencial biocontrolador em vassouras secas 223

A inibição da produção de basidiomas em vassouras secas foi avaliada pulverizando a 224

suspensão de células de leveduras, individualmente ou em conjunto. O experimento foi 225

realizado na Unidade de Biocontrole do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC/CEPLAC) 226

em vassoureiros construídos para possibilitar a produção de basidiomas e em câmara de 227

inoculação. Vassouras secas foram coletadas em cacaueiros infectados nas áreas 228

experimentais do CEPEC, padronizadas, por diâmetro e comprimento, desinfestadas com 229

lavagens rápidas em hipoclorito de sódio a 0,1%, fixadas em arames esticados 230

horizontalmente em casa de vegetação otimizada (vassoureiro), e então submetidas a um 231

regime diário de 8 h de molhamento e 16 h de secamento. Com o surgimento de basidiomas 232

(quebra de dormência), vassouras produtivas foram selecionadas, transferidas para gabinetes 233

de vidro em condições ideais para a produção de basidioma, onde foram penduradas em 234

hastes de aço inox. O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, 235

com 40 repetições (vassouras) por tratamento. Cada tratamento foi aplicado em vassouras 236

117

dispostas em um único gabinete para evitar transferência de inóculo e contaminação. Em cada 237

gabinete foi aplicado suspensão de células por pulverização das leveduras: LEV 007, LEV 238

027, LEV 074, LEV 079, LEV 098, LEV 162, LEV 179, LEV 193, LEV 207, LEV 210, além 239

da aplicação da mistura de todas as leveduras testadas. Foram incluídos como controle 240

positivo e negativo, o tratamento com o Trichovab, (Trichoderma stromaticum), biofungicida 241

registrado no Ministério da Agricultura Pecuária de Abastecimento (MAPA) para a cultura do 242

cacau, e testemunha absoluta apenas com aplicação de água. As vassouras foram submetidas a 243

um regime diário de 8 h de molhamento e 16 h de secamento, fotoperíodo de 12h e 244

temperatura de 25-27°C, durante 60 dias e avaliadas através da contagem e retirada dos 245

basidiomas produzidos, duas vezes por semana. As vassouras secas foram pulverizadas com 246

leveduras três vezes a cada 15 dias. Os basidiomas coletados foram armazenados em solução 247

salina com cloranfenicol em tubos de ensaio e submetidos a banho de ultrassom em 248

ultrassonicador (Quimis 0335D) para posterior isolamento de micro-organismos em placas de 249

Petri contendo meio YEPD. 250

251

Microscopia Eletrônica de Varredura 252

Pequenos fragmentos (3x3) do limbo, nervura e meristema apical de amostras foram 253

coletados em plântulas de cacaueiro (CATONGO) uma e 240 horas (10 dias) após a 254

pulverização da suspensão de células (1x 108 ufc/mL) das leveduras LEV 098, LEV 162 e 255

LEV 210 no meristema apical e limbo foliar. Alíquotas de 3µL da suspensão de basidiósporos 256

de M. perniciosa foram depositadas no meristema apical de plântulas inoculadas com 257

suspensão de leveduras, 168 h (7 dias) após a pulverização. As plântulas da testemunha 258

absoluta foram pulverizadas apenas com água destilada esterilizada, e plântulas inoculadas 259

apenas com M. perniciosa foram utilizadas como testemunha relativa. As amostras foram 260

selecionados em fragmentos de aproximadamente 3mmx3mm, fixados em gluteraldeído 2,5% 261

tamponado com cacodilato de sódio 0,1M em pH 6,9 e armazenados à 4°C. Após a fixação, os 262

espécimes foram lavados em tampão cacodilato de sódio 0,1M pH 6,9, duas vezes em 263

intervalo de 10 min. Os espécimes foram posteriormente desidratados em série gradual (50, 264

60, 70, 80, 90 %) de acetona e três vezes em acetona 100% com intervalos de 10 min cada. 265

Após a desidratação, os espécimes foram levados ao ponto crítico (BALZER, CPD020), 266

fixados em stub com fita dupla face de carbono e cobertos por pulverização catódica com um 267

filme de aproximadamente 20 a 30 nm de espessura de ouro, utilizando o aparelho SPUTTER 268

COATER, marca BALZERS. Posteriormente, foram observados no microscópio eletrônico de 269

varredura, modelo JSM T200, marca JEOL, à voltagem de aceleração a 10 ou 15 kV. 270

118

271

Testes de Promoção de Crescimento de Plantas 272

Avaliação do crescimento de plântulas seminais 273

O substrato utilizado para o cultivo das plântulas de cacaueiro nos experimentos 274

realizados neste trabalho apresentou pH 6,6, acidez total (Al + H) de 4,3 cmol/dm3, saturação 275

de bases (SB) de 19,6 cmol/dm3, potássio (K) – 0,34 cmol/dm3, magnésio (Mg) – 5,3 276

cmol/dm3, cálcio (Ca) – 14,0 cmol/dm3, capacidade de troca catiônica (CTC) de 23,9 277

cmol/dm3, além de fósforo (P) – 294 mg/Kg, Ferro (Fe) – 211,1 mg/Kg, zinco (Zn) – 0,7 278

mg/Kg, cobre (Cu) – 0,1 mg/Kg e manganês 1,7 mg/Kg. 279

Sementes de cacaueiro (clone PS 1319) foram selecionadas, escarificadas através da 280

retirada de pericarpo e tegumento, pré-germinadas durante 48 horas em água corrente, 281

desinfestadas por imersão em NaOCl a 0,5% durante 2 min, lavadas em água esterilizada e 282

imergidas em suspensão de células de leveduras [LEV 210, LEV 84 (Candida 283

nondorbophila), LEV 206 (Cryptococcus heimaeyensis), LEV 93 (Cryptococcus sp.), LEV 284

149 (Cryptococcus sp.), LEV 162, LEV 98, LEV 170 (Rhodosporidium paludigenum), LEV 285

79, LEV 168 (Rhodosporidium paludigenum)] por 24 h a 25-27°C. Foram adicionados como 286

tratamentos, uma mistura com as 10 leveduras que foram inoculadas individualmente, a 287

adição com fosfafato monoamônico (NH4H2PO4) (1g/ 200mL - 5mL/plântula) como 288

testemunha relativa e aplicação apenas de água destilada esterilizada como testemunha 289

absoluta. Após o período de incubação, as sementes foram plantadas em tubetes de 288 cm3 290

contendo terriço (substrato vegetal + solo 1:2) esterilizado e mantidas em casa de vegetação 291

sob condições de cultivo. O efeito da quantidade de aplicações foi avaliado através da injeção 292

de 5 mL de suspensão de levedura correspondente ao tratamento da semente, no terriço ao 293

redor da plântula, uma e duas vezes após a semeadura, correspondendo a um fatorial 11 x 3 + 294

2 (10 leveduras aplicadas isoladamente e em conjunto x 3 quantidade de aplicação do 295

tratamento + 2 testemunhas), totalizando 35 tratamentos. Sessenta dias após a semeadura, o 296

diâmetro da região do coleto foi mensurado com paquímetro Mitutoyo® (Japão), as plântulas 297

coletadas, separadas do terriço, as raízes lavadas em água corrente, transferidas para bancada 298

em laboratório para retirada de umidade e posterior mensuração da biomassa fresca da parte 299

aérea e sistema radicular (SR). Após a pesagem, as plântulas (parte aérea e SR) foram 300

transferidas para sacos de papel e secas em estufa de circulação forçada à 65°C por 48h (até a 301

estabilização do peso). O peso fresco da parte aérea e SR foi mensurado, assim como o peso 302

fresco, em balança semi-analítica centesimal (BEL M5202). 303

304

119

Análises estatísticas 305

Os dados foram submetidos a da análise de variância, testes de normalidade (Shapiro Wilk) e 306

homocedasticidade (Bartellet) e ajustados [Sqrt (x +0,5)] quando necessário, para posterior 307

análise de variância, seguida de teste Tukey a 5% de probabilidade, através do pacote 308

estatístico LSmeans SAS (SAS Institute, 1988). As médias das variáveis CVT, NVA e ID 309

foram avaliadas a partir do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Uma matriz gerada para 310

os tratamentos (isolados de levedura) foi avaliada através do software PAST 3.1, o que 311

permitiu a construção de dendograma a partir de distância Euclidiana, para avaliar o 312

agrupamento dos isolados quanto ao potencial biocontrolador. 313

314

Resultados 315

316

Os tratamentos (leveduras) variaram significativamente (p<0,5) quanto ao potencial 317

bioncontrolador a vassoura de bruxa em mudas de cacaueiro (Tabela 1), para todas as 318

variáveis analisadas (incidência - INC, comprimento de vassoura terminal - CVT, número de 319

vassoura terminal maior que 1 cm – NVA e índice de doença (ID). 320

A análise de agrupamento (Figura 1), a partir da comparação de todas as variáveis 321

(sintomas) analisadas, permitiu inferir sobre a separação dos isolados de leveduras avaliados 322

em três grupos (clados), após corte na altura de θ = 12. O grupo 1, formado por tratamentos 323

com leveduras LEV 080, LEV 118, LEV 226, LEV 089, LEV 097, LEV 219, se distanciou 324

dos demais por proporcionarem as maiores médias de incidência e sintomas em plântulas de 325

cacaueiro, divergindo ainda da testemunha relativa, que foi inoculada apenas com 326

basidiósporos de M. perniciosa. Apesar da alocação, por dissimilaridade euclidiana, em um 327

terceiro grupo, as leveduras LEV 016, LEV 092, LEV 147, LEV 059, LEV 082, LEV 106, 328

LEV 206, LEV 140, LEV 201, além da testemunha inoculada, também não inibiram 329

significativamente o aparecimento e evolução do quadro sintomatológico da vassoura de 330

bruxa (VB). O grupo 2 reúne o maior número de tratamentos, entretanto se subdivide em 331

outros dois clados, um com características semelhantes ao grupo 3 (II.2), e outro se 332

destacando dentre todos os tratamentos avaliados, por proporcionarem os maiores níveis de 333

controle. Subdivisões abaixo do clado II.1 permitem selecionar leveduras ainda mais 334

promissoras (LEV 020, LEV 050, LEV 054, LEV 046, LEV 088, LEV 001, LEV 139, LEV 335

154, LEV 005, LEV 090, LEV 055, LEV 174, LEV 006, LEV 014, LEV 210, LEV 079). 336

Houve variações quanto ao comportamento das leveduras aplicadas em diferentes 337

tempos (Tabela 2). Plântulas tratadas com o isolado LEV 079 apresentaram menor incidência 338

120

de VB quando pulverizadas 7 e 14 dias antes da inoculação do patógeno (DAI), entretanto, 339

apenas o tratamento com aplicação 7 dias antes, diferiu estatisticamente da testemunha 340

inoculada quanto a INC. Para ID, o isolado LEV 079 proporcionou resultados semelhantes, 341

mas não se distanciaram estatisticamente (p<0.05) da testemunha. Todas as plântulas tratadas 342

com o isolado LEV 098 apresentaram menor incidência que a testemunha inoculada, 343

independente da época de aplicação, havendo destaque para aplicação do tratamento 7 DAI 344

(Tabela 2). O grupo de plântulas tratadas com LEV 098, diferiu significativamente (p<0,05) 345

da testemunha, para todas as variáveis com aplicação 1 DAI. O isolado LEV 162, quando 346

aplicado 1 DAI, proporcionou controle de 100% de controle, não diferindo (p<0,05) dos 347

resultados obtidos para o período de 14 DAI em relação à incidência. Todos os grupos de 348

plântulas tratadas com LEV 210 apresentaram incidência significativamente menor do que a 349

testemunha inoculada, independente da época de aplicação. Os melhores resultados para este 350

isolado foram obtidos quando as aplicações foram realizadas 14 DAI. O produto comercial 351

Agromós proporcionou 100% de controle independente do período de aplicação (Tabela 2). 352

Os tratamentos apresentaram diferenças significativas (p<0,05) quando comparados 353

dentro de cada período de aplicação (Tabela 2). O isolado LEV 162 apresentou controle 354

significativamente semelhante ao Agromós, quando aplicado somente 1 DAI, diminuindo a 355

incidência e o desenvolvimento de sintomas da vassoura de bruxa do cacaueiro, demonstrado 356

através do ID. O isolado LEV 098 apresentou o segundo menor ID para este período, 357

proporcionando resultados discrepantes dos isolados LEV 210 e LEV 079. Para o período de 358

2 DAI, apenas o isolado LEV 210 apresentou controle semelhante ao Agromós. Com 7 DAI, 359

os isolados de levedura testados não controlaram significativamente o patógeno. O tempo de 360

14 DAI permitiu que os isolados LEV 210 e LEV 162 proporcionassem os melhores controles 361

dentre os tratamentos e períodos avaliados. Mesmo o isolado 162 em 14 DAI não diferindo 362

estatisticamente (p<0,05) do LEV 210 para este período, este tratamento se destaca como 363

combinação que mais controlou a vassoura de bruxa em plântulas de cacaueiro seminais. 364

Os isolados de leveduras (LEV 079, LEV 162, LEV 027, LEV 007, LEV 210, LEV 365

193, LEV 207, LEV 098, LEV 074) quando avaliados separadamente e em conjunto com 366

outras leveduras e produtos comerciais, proporcionaram resultados discrepantes em relação à 367

incidência e desenvolvimento de sintomas da vassoura de bruxa do cacaueiro, com variação 368

de ID de 33,07 (LEV 207), à 83,27 (LEV 027 + LEV 207)), com exceção dos tratamentos 369

com fungicidas comerciais que controlaram 100% da doença (Tabela 3). 370

Plântulas tratadas com os fungicidas Folicur ® e Cobre Atar®, isoladamente e em 371

consórcio com leveduras, não apresentaram sintomas e, portanto, utilizados como padrão de 372

121

controle e comparação com demais tratamentos. Somente os isolados LEV 179 e LEV 207 373

apresentaram INC similares aos tratamentos com os fungicidas, mesmo não havendo 374

diferença significativamente em relação aos tratamentos LEV 162, LEV 210 e LEV 027 e a 375

combinação LEV 027 + LEV 207. Mesmo apresentando variação em relação ao número de 376

vassouras axilares menores que 1 cm (NVA), todos os tratamentos foram similares, não 377

diferindo estatisticamente. As variáveis CVT e ID também não proporcionaram diferenciação 378

estatística entre os tratamentos avaliados. 379

Quando os 10 isolados de levedura e combinações entre os mesmos foram avaliados 380

para a inibição da formação de basidiomas em “vassouras secas”, a maioria dos tratamentos 381

apresentaram resultados positivos, não diferindo da testemunha Tricovab® (Figura 2). Apenas 382

os tratamentos LEV 074 e LEV 193 diferiram significativamente (p<0,05) do Tricovab. O 383

número médio de basidiomas formados durante o período de avaliação variou de 0,37 (LEV 384

193) à 0,00 (LEV 079, LEV 162, LEV 179, LEV 210 e as combinações LEV 27 + LEV 207, 385

LEV 79 + LEV 179). 386

Os isolados LEV 179 e LEV 207 destacam-se positivamente dentre os demais 387

tratamentos por apresentarem eficiência no controle da VB, com possibilidade de atuação 388

tanto nos estágios iniciais do quadro epidemiológico desse patossistema, como germinação, 389

infecção e colonização, como no processo de esporulação e disseminação. O isolado LEV 390

207, quando combinado com o LEV 027, conseguiu manter comportamento positivo em 391

relação ao controle da vassoura de bruxa em plântulas de cacaueiro, entretanto o padrão de 392

controle do LEV 179 não foi evidenciado quando este foi aplicado em consórcio com o LEV 393

079. 394

As concentrações 1 (0,6 mL/L), 2 (0,3 mL/L) e 3 (0,1 mL/L) de Folicur®, inibiram 395

100% o crescimento do isolado LEV 207 in vitro (Figura 2). As concentrações utilizadas in 396

vivo para os produtos comerciais Cobre Atar® e Agromós® (0,9 g/L e 0,5 mL/L, 397

respectivamente) não influenciaram na reprodução de células da levedura analisada, 398

entretanto a maior concentração destes dois produtos, foi capaz de inibir o crescimento do 399

LEV 207 totalmente (Cobre Atar – 1,8g/L) e parcialmente (Agromós – 10mL/L). 400

Observações de eletromicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura 401

(MEV) possibilitaram a investigação ultraestrutural da interação leveduras x cacaueiro x M. 402

perniciosa. Leveduras foram visualizadas em todas as amostras obtidas de folhas e 403

meristemas apicais de plântulas de cacaueiro, permanecendo nestes substratos vegetais desde 404

as primeiras horas à 10 dias após a pulverização de células de leveduras. Estas leveduras 405

permaneceram fortemente aderidas aos sulcos formados pela junção de uma célula epidérmica 406

122

e outra, e em irregularidades presentes nas nervuras abaxial e adaxial, pois mesmo as 407

plântulas estando sob turno de rega diário, as leveduras não foram lixiviadas (Figuras 3, 4 e 408

5). Mesmo visualizando maior densidade de células nas nervuras centrais (Figura 3A; Figura 409

4B, C, D, E; Figura 5D), as células se distribuem uniformemente pelo limbo foliar, havendo a 410

predominância na face abaxial, próximo a estômatos (Figura 3C; Figura 5C). 411

Na figura 3, observa-se a presença de células do isolado LEV 098 (C. saopaulonenis) 412

na face abaxial (B, C) e adaxial (A, F) do limbo foliar, bem como no meristema apical (D, E, 413

F) 10 dias após a pulverização da levedura. Nas mostras obtidas de plântulas pulverizadas 414

com o isolado LEV 162 (H. uvarum), é possível visualizar a presença de células de levedura 415

na base e aderidos à tricomas tectores (Figura 4B, C, D, E) e glandulares (Figura 4. B). 416

Células do LEV 210 também permaneceram aderidas ao limbo abaxial, adaxial, 417

meristema apical, base de tricomas e nervura (Figura 5), com formação de pseudomicélio 418

aderido a um tricoma tector (Figura 5B). 419

Os cortes transversais de folhas e meristema apical permitiram a observação de 420

possíveis canais de entrada e colonização de camadas epidérmicas e parenquimáticas (Figura 421

5A, B, E), além da provável formação de agregados citoplasmáticos de cálcio (Figura 5A). 422

Quando os isolados LEV 079, LEV 084, LEV 093, LEV 098, LEV 149, LEV 162, 423

LEV 168, LEV 170, LEV 206 e LEV 210 foram avaliados isoladamente e em conjunto 424

quanto a promoção do crescimento de plântulas seminais de cacaueiro (PS 1319), diferiram 425

para as variáveis analisadas, entre si e, para alguns isolados em relação ao número de 426

aplicações (1, 2 ou 3 vezes) da suspensão de células na parte aérea (Tabela 4). 427

Somente os isolados LEV 079, LEV 149, LEV 162, LEV 168, LEV 170 e 206 foram 428

influenciados pelo número de aplicações para manifestação da característica de promoção de 429

crescimento. Os isolados LEV 079 (variável DC), LEV 168 (variável CP e BRF) e LEV 170 430

(variáveis CP, DC e PSA) foram mais eficientes quando inoculados por três vezes, quantidade 431

de aplicação que diferiu significativamente (p<0,05) das demais para variáveis específicas. Os 432

isolados LEV 149 (variável DC), LEV 162 (variável CP) e LEV 168 (variável BRF) 433

proporcionaram melhores resultados quando inoculados uma ou duas vezes, diferindo do 434

tratamento com três aplicações. 435

O tratamento com LEV 093 proporcionou o maior comprimento da parte aérea (24,96 436

cm) dentre os demais isolados avaliados, quando inoculados apenas na semente (única 437

aplicação), entretanto só diferiu estatisticamente do LEV 170 (22,43 cm), tratamento que 438

apresentou comportamento semelhante à testemunha relativa (adubação mineral) e 439

testemunha absoluta, com 22,76 e 22,36 cm de comprimento, respectivamente. Quando foram 440

123

realizadas duas ou três aplicações, referentes a uma ou duas pulverizações de suspensões de 441

células na parte aérea, o LEV 210 se destaca dentre os demais em relação a variação CP, 442

gerando comprimento médio de 25,08 e 25,25 cm, respectivamente. Com estas doses reforço 443

(2 e 3 aplicações), as plântulas tratadas com LEV 149 e MIX apresentaram respectivamente 444

as menores médias. 445

O diâmetro médio do coleto das plântulas com apenas uma aplicação foi maior quando 446

estas foram inoculadas pelo LEV 149 (4,41 cm), diferindo apenas do LEV 079 (4,06 cm). O 447

comportamento destes dois isolados também foi evidenciado quando as plântulas foram 448

tratadas com duas aplicações de suspensão de células, com maior (4,63 cm) e menor (4,09 449

cm) média para DC. Dentre os tratamentos que receberam três aplicações, o LEV 210 450

destaca-se por apresentar o maior diâmetro médio (4,47 cm), entretanto não se diferencia 451

estatisticamente (p<0,05) dos demais. Todos os tratamentos (isolados de levedura) inoculados 452

uma, duas ou três vezes, influenciaram positivamente para a variável DC, pois todas 453

apresentaram médias maiores que as testemunhas, relativa (3,89 cm) e absoluta (3,85 cm). 454

A média de plântulas tratadas com LEV 210 foi maior para a variável PFA, com uma 455

(2,84 g) e 3 (2,94 g) aplicações, entretanto os resultados obtidos com este isolado nesta 456

variável não diferiu estatisticamente dos demais quando as plântulas receberam duas 457

aplicações. As menores médias para esta variável foram obtidas nos tratamentos LEV 170 458

(2,27 g) e MIX (2,32 g), com uma e três aplicações, respectivamente. 459

A variável PSA não foi responsável pela variação existente entre os tratamentos, pois 460

estes proporcionaram resultados semelhantes entre si e em comparação com a testemunha 461

relativa (0,61). Todos os tratamentos influenciaram positivamente no desenvolvimento da 462

parte aérea, pois o peso médio da parte aérea em plântulas da testemunha absoluta foi 463

aproximadamente 1/3 menor (0,20 g). 464

Os tratamentos não diferiram estatisticamente (p<0,05) entre si para PFR com apenas 465

uma aplicação. Entretanto, quando avaliados com duas ou três aplicações, os isolados LEV 466

093 (0,66 g) e LEV 084 (0,75 g) proporcionaram as maiores médias, respectivamente. Os 467

menores PFR foram observados nos tratamentos LEV 168 (0,52 g) quando as plântulas foram 468

tratadas com duas aplicações e o LEV 079 (0,54 g) quando houve três aplicações de células 469

da levedura. 470

Assim como para a variável PSA, o PSR não gerou variação entre os tratamentos à 5% 471

de probabilidade pelo teste de Tukey. 472

473

Discussão 474

124

475

O controle químico ainda é o recurso mais utilizado para o controle de doenças de 476

plantas, mas para o patossistema cacaueiro x M. perniciosa, existem vários fatores que 477

induzem à uma grande variabilidade na eficiência desta técnica, principalmente quando 478

utilizada isoladamente. A variabilidade genética do patógeno tem sido expressa através da 479

observação da plasticidade fisiológica no crescimento micelial em meios de cultura, tipos de 480

reação em alguns testes bioquímicos, compatibilidade somática e patogenicidade ao cacaueiro 481

e a outros hospedeiros (Bartley, 1977; Bastos, 1986; Mcgeary & Wheeler, 1988). Dessa 482

forma, a variação do patógeno até mesmo com referência à sensibilidade a fungicidas, pode 483

eventualmente explicar a eficácia das recomendações de controle da doença em determinadas 484

situações. 485

A combinação de diferentes métodos consiste na forma mais eficiente e econômica de 486

controle, cada um deles com diferentes modos de ação, reduzindo progressivamente o 487

desenvolvimento da doença (Pereira & Valle, 2012). Atualmente o Manejo Integrado de 488

Pragas (MIP) recomendado pela CEPLAC (Comissão Executiva do Plano da Lavoura 489

Cacaueira) aos agricultores brasileiros é constituído de quatro a seis aplicações de fungicidas 490

cúpricos, duas a quatro podas fitossanitárias das vassouras por ano e também aplicações do 491

fungo Trichoderma stromaticum (Tricovab) como medida de biocontrole (Rudgard & Buttle, 492

1987; Almeida et al., 2003; Medeiros et al, 2010). No entanto, pode-se constatar que tais 493

medidas não são amplamente adotadas pelos agricultores, visto o seu alto custo de 494

implementação e retorno a longo prazo (Midlej & Santos, 2007). 495

Esforços têm sido voltados para a busca de medidas alternativas para o controle 496

efetivo da VB, incorporando ao MIP, novos agentes e práticas que possam atuar desde a 497

racionalização do uso dos fungicidas cúpricos (ainda muito caros) a redução da frequência de 498

realizações do saneamento vegetal (Costa et al., 2009; Medeiros et al., 2010). Apesar dos 499

estudos relacionados ao controle biológico da VB concentrar-se na interação T. cacao x 500

Trichoderma x M. perniciosa, a mistura de organismos benéficos, buscando conjuntamente 501

efeitos antagônicos, protetores e/ou antiesporulante dos patógenos, deve ser realizada visando 502

promover um sistema integrado de biocontrole (Elad, 2003). 503

O controle biológico é um importante componente no manejo integrado de doença de 504

plantas, devido a possibilidade de associação a outros métodos de controle e uma alternativa à 505

diminuição do uso de defensivos agrícolas e práticas com menor impacto ambiental 506

(Valdebenito-Sanhueza, 2000). 507

125

A comunidade microbiana residente na superfície de órgãos vegetais tem sido 508

estudada, objetivando determinar biodiversidade existente e os mecanismos de interação entre 509

os micro-organismos presentes neste habitat e as plantas (Berghofer et al., 2003; Laca et al., 510

2006). Nestes substratos são identificados micro-organismos que interagem simbioticamente 511

com as plantas, utilizando nutrientes requeridos para seu crescimento e reprodução, e em 512

contrapartida controlando a densidade populacional de agentes patogênicos às plantas (Lima 513

et al., 2000). 514

Diversos relatos têm demonstrado o efeito de leveduras nativas na inibição do 515

crescimento micelial do patógeno de várias espécies vegetais (Cabral et al., 2009; Lutz et al., 516

2013; Nutaratat et al., 2014). Lutz et al. (2013) relataram o efeito antagônico de leveduras 517

nativas de Pyrus communis L. à Penicillium expansum e Botrytis cinerea, micro-organismos 518

responsáveis por podridões pós-colheita em frutos de várias espécies vegetais, destacando 519

assim, a importância da obtenção e seleção de micro-organismos biocontroladores que co-520

habitem o mesmo nicho ecológico. 521

Apesar da preferência por ambientes ricos em carboidratos, como a superfície de 522

frutos, florese sementes, as leveduras também estão presentes na superfície de folhas, atuando 523

por mecanismos diversos como produção de enzimas hidrolíticas, toxinas killer, inibição da 524

germinação de esporos fúngicos (Lutz et al., 2013), produção de fitohormônios (Sun et al., 525

2014), indução de resistência (Lu et al., 2013) e formação de biofilmes (Li et al., 2015), 526

possibilitando a sua estabilização em ambientes hostis, expostos a variações de temperatura, 527

umidade relativa. A distribuição espacial das leveduras aplicadas em folhas e meristema 528

apical de plântulas de cacaueiro, demonstraram que a anatomia e morfologia dos órgãos 529

vegetais, como estômatos, nervuras, e apêndices na superfície, incluindo tricomas e 530

hidatódios, podem afetar a disponibilidade de nutrientes na filosfera, contribuindo assim para 531

o estabelecimento de micro-organimos nestes substratos (Leveau & Lindow, 2001). 532

As variáveis utilizadas para comparação entre a severidade em mudas tratadas com 533

leveduras e produtos comerciais não proporcionaram resultados que permitissem a 534

diferenciação estatística (p<0,05) das médias, pois após a penetração e colonização do tecido 535

vegetal, os isolados de levedura utilizados não foram capazes de retardar ou impedir o 536

crescimento do patógeno e desenvolvimento dos sintomas. A penetração de M. perniciosa em 537

tecidos meristemáticos de cacaueiro acontece através de aberturas naturais e estômatos, além 538

de lesões na base de tricomas (Sena et al., 2014), desta forma, é essencial a colonização ou 539

presença de micro-organimos antagonistas nestes ambientes, como evidenciado nas 540

eletromicrografias presentes na Figuras 3, 4 e 5. A anatomia e morfologia dos órgãos 541

126

vegetais, podem afetar a disponibilidade de nutrientes na filosfera, contribuindo assim para o 542

estabelecimento de micro-organimos nestes substratos (Leveau & Lindow, 2001). 543

Fungos leveduriformes preferencialmente colonizam ambientes ricos em carboidratos, 544

como a carposfera, espermosfera e antosfera, mas também estão presentes na superfície de 545

folhas, atuando por mecanismos diversos como produção de enzimas hidrolíticas, toxinas 546

killer, inibição da germinação de esporos fúngicos (Lutz et al., 2013), produção de 547

fitohormôios (Sun et al., 2014), indução de resistência (Lu et a., 2013) e formação de 548

biofilmes (Li et al., 2015), possibilitando a sua estabilização em ambientes hostis, expostos a 549

variações de temperatura, umidade relativa. 550

Apesar do pequeno número de produtos comerciais biocontroladores no mercado, 551

quando comparados com a quantidade de produtos químicos sintéticos comercializados, 552

diversos produtos a base de leveduras têm demonstrado eficiência no controle de doenças em 553

várias culturas, a exemplo do Aspire®, cujo composto ativo são células da espécia Candida 554

oleophila (Droby et al., 2003). A eficiência do controle é dependente de variáveis como 555

época, doses, intervalo e formas de aplicação (Oliveira, 2004a), além da capacidade de tolerar 556

condições ambientais adversas, seja por variações climáticas ou plasticidade da concentração 557

de compostos ativos em determinados substratos. A velocidade de crescimento e estabilização 558

dos micro-organimos nos substratos colonizados é variável, sendo portanto, essencial o 559

conhecimento a cinética microbiana, bem como os mecanismos de biocontrole e tempo para 560

expressão de características de interesse envolvidas no biocontrole, como secreção de enzimas 561

hidrolíticas, toxinas, colonização de ferimentos e indução de resistência. 562

Em diversas pesquisas realizadas na região cacaueira da Bahia, constatou-se que o 563

fungicida sistêmico tebuconazole (Oliveira, 2004a) e outros do grupo estrubilurinas (Oliveira, 564

2004b), com destaque para a azoxystrobina, apresentaram os melhores resultados para o 565

controle da VB tanto em viveiros quanto em campo (Oliveira & Luz, 2005), entretanto esta 566

classe de fungicidas também impedem o crescimento de fungos leveduriformes benéficos que 567

habitam o mesmo ambiente, como as leveduras. A capacidade da associação de leveduras a 568

fungicidas protetores (Valdebenito-Sanhueza, 2000) foi reiterada por este trabalho (Figura 2), 569

entretanto novos testes devem ser realizados para determinação de dosagens, concentrações e 570

isolados de levedura tolerantes a tais condições. A concentração (0,9g/L) do fungicida cúprico 571

Cobre Atar® utilizado para os testes em plântulas, não inibiu o crescimento in vitro de um 572

representante do gênero Hannaella sp., mas os tratamentos da utilização de levedura e 573

fungicida em consórcio não diferiu do tratamento somente com o fungicida, proporcionando 574

100% de controle da VB. Destaca-se a importância da prospecção e associação de leveduras 575

127

com fungicidas a base de cobre que promovam níveis satisfatórios de controle, pois apesar 576

desta classe de fungicidas serem menos seletivos que os sistêmicos, apresentam menor 577

impacto ambiental. 578

Organismos envolvidos no controle de doenças de plantas podem atuar através de 579

características relacionadas diretamente aos processos de germinação, penetração, 580

colonização e esporulação, ou contribuírem para o melhor desenvolvimento vegetal, 581

promovendo o crescimento de plantas através da solubilização de fosfatos, fixação de 582

nitrogênio, produção de fitohormônios (Altomare et al., 1999; Oliveira et al., 2010; Oliveira et 583

al., 2012). Os resultados alcançados pelo presente trabalho, através da avaliação de leveduras 584

nativas do cacaueiro na promoção do crescimento de plântulas, corroboram com as 585

informações citadas por Nutaratat et al. (2014), que identificaram leveduras nativas epifíticas 586

e endofiticas (Hannaella sinensis, Cryptococcus flavus, Rhodosporidium paludigenum, 587

Torulaspora globosa), com alta capacidade de produção do fitohormônio ácido indol-acético 588

(AIA) e por consequência promotoras do crescimento de plantas. 589

Alguns isolados estudados neste trabalho (Hannaella sp. Hanseniaspora sp., Candida 590

sp. e Rhodosposporidium sp.) apresentaram resultados positivos para o controle da VB, 591

proporcionando as menores incidências em plântulas tratadas com suspensões de células 592

destas leveduras e inibição da formação de basidiomas em vassouras secas, além da promoção 593

do crescimento de plântulas seminais de cacaueiro. O presente trabalho ressalta a importância 594

da busca por micro-organismos que habitem e colonizem o sitio de infecção e tecidos vegetais 595

do hospedeiro, que podem atuar na manifestação do caráter de resistência a doenças de 596

plantas em condições de cultivo e ambientes naturais, e apresenta novos agentes de 597

biocontrole para o manejo integrado da VB. Ressalta-se ainda a necessidade do conhecimento 598

e elucidação dos mecanismos de biocontrole envolvidos, bem como as condições que mais 599

favorecem a estabilização destes micro-organismos no tecido hospedeiro. 600

601

Conclusões 602

603

1. Leveduras nativas são potenciais agentes de biocontrole da vassoura de bruxa do 604

cacaueiro, atuando na diminuição dos sintomas em plântulas seminais e inibição da produção 605

de basidiomas. 606

2. Há possibilidade de integração de Cobre Atar® com leveduras nativas para o 607

manejo da vassoura de bruxa do cacaueiro. 608

128

3. O período de aplicação da suspensão de células de leveduras é preponderante para a 609

manifestação do biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro. 610

4. Leveduras nativas que apresentam potencial biocontrolador a vassoura de bruxa, 611

podem atuar como promotoras de crescimento de plântulas seminais do cacaueiro, havendo 612

variações intraespecíficas e em relação ao número de aplicações na manifestação desta 613

característica. 614

5. O produto comercial AgroMós pode atuar e agir em concomitância com leveduras 615

como indutores de resistência à vassoura de bruxa do cacaueiro 616

617

Agradecimentos 618

619

À Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), através da Fundação Pau Brasil 620

(FUNPAB) e Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), 621

à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e a Fundação de 622

Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) por concessão de bolsas e recursos. 623

624

Referências 625

626

AFSAH-HEJRI, L. Saprophytic yeasts: effective biocontrol agents against Aspergillus flavus. 627

International Food Research Journal, v.20, n.6, p.3403-3409, 2013. 628

ALMEIDA, L.C.C.; COSTA, A.Z.M.; MENDONÇA, R.C.S. Efeito do número de remoções 629

de partes doentes do cacaueiro e número de aplicações de óxido cuproso no controle da 630

vassoura de bruxa na Bahia. Agrotrópica, Itabuna, n.15, p.79-84, 2003. 631

ALTOMARE, C.; NORVELL, W.A.; BJORKMAN, T.; HARMAN, G.E. Solubilization of 632

phosphates and micronutrients by the plant-growth-promoting and biocontrol fungus 633

Trichoderma harzianum Rifai 1295-22 C. Applied and Environmental Microbiology, 634

Washington, v.65, n.7, p.2926-2933, 1999. 635

ANDEBRHAN, T. et al. Molecular fingerprinting suggests two primary outbreaks of witches’ 636

broom disease (Crinipellis perniciosa) of Theobroma cacao in Bahia, Brazil. European 637

Journal of Plant Pathology, Dordrecht, v.105, n.2, p.167-175, 1999. 638

BARTLEY, B. G. D. The genetic diversity of cacao and its utilization. Cambridge, CABI 639

Publishing, 2005 341p. 640

BASTOS, C.N. Comparação morfológica e patológica de isolados de Crinipellis perniciosa 641

(Stahel) Singer. In Belém, CEPLAC/ DEPEA. Informe Técnico. p.45-49, 1986. 642

129

BERGHOFER, L.K.; HOCKING, A.D.; MISKELLY, D. JANSSON, E. Microbiology of 643

wheat and flour milling in Australia. International Journal of Food Microbiology, 644

Amsterdam, v.85, p.137-149, 2003. 645

BRUCE, A.; VERRALL, S.; HACKETT, C.A.; WHEATLEY, R.E. Identification of volatile 646

organic compounds (VOCs) from bacteria and yeast causing growth inhibition of sapstain 647

fungi. Holzforschung, Berlin, v.58, p.193-198, 2004. 648

CABRAL, A.S. Killer yeasts inhibit the growth of the phytopathogen Moniliophthora 649

perniciosa, the causal agent of witches’ broom disease. Brazilian Journal of Microbiology, 650

São Paulo, v.40, p.108-110, 2009. 651

COSTA, J.C.B. et al. Controle biológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro da Bahia, Brasil. 652

In: BETTIOL, W. Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna: 653

Embrapa meio ambiente, 2009, p.245-266. 654

COSTA, J. C. B. et al. Controle biológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro da Bahia, 655

Brasil. In: BETTIOL, W. Biocontrole de doenças de plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna: 656

Embrapa meio ambiente, 2009, p.245-266. 657

DICKSTEIN, E.R.; PURDY, L.H.; FRIAS, G.A. Crinipellis perniciosa, the cacao witches’ 658

broom fungus: Inoculum production and storage. Phytopathology, Saint Paul, v.77, p.1747, 659

1987. 660

DROBY, S.; WISNIEWSKI, M.; EL GHAOUTH, A.; WILSON, C. Influence of food 661

additives on the control of postharvest rots of apple and peach and efficacy of the yeast-based 662

biocontrol product Aspire. Postharvest Biology and Technology, v.27, p.127-135, 2003. 663

ELAD Y. Biocontrol of foliar pathogens: mechanisms and application. Communications in 664

Agricultural and Applied Biological Sciences, v.68, p.17-24, 2003 665

FAO. Prodution Yearbook. v.54. Roma. 2002. 666

HU, H.; XU, Y.; LU, H.; XIAO, R.; ZHENG, X.; YU, T. Evaluation of yeasts from Tibetan 667

fermented products as agents for biocontrol of blue mold of Nashi pear fruits. Journal of 668

Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology), v.16, n.4, 275-285, 669

2015. 670

JANISIEWICZ, W.J.; KURTZMAN, C P.; BUYER, J.S. Yeasts associated with nectarines 671

and their potential for biological control of brown rot. Yeast, Davis, v.27, p.389–398, 2010. 672

LACA, A.; MOUSIA, Z.; DIAZ, M.; WEBB, C.; PANDIELLA, S.S. Distribution of 673

microbial contamination within cereal grains. Journal of food engineering, Essex, v.72, 674

p.332-338, 2006. 675

130

LEVEAU, J.H, LINDOW, S.E. Appetite of an epiphyte: quantitative monitoring of bacterial 676

sugar consumption in the phyllosphere. Proceedings of the national academy of sciences, 677

Washington, v.98, p.3446-3453, 2001. 678

LI, X.; YU, V.Y.; LIN, Y.; CHOMVONG, K.; ESTRELA, R.; PARK, A.; LIANG, J.M.; 679

ZNAMEROSKI, E.A.; FEEHAN, J.; KIM, S.R.; JIN, Y; GLASS, N.L.; CATE, J.H.D. 680

Expanding xylose metabolism in yeast for plant cell wall conversion to biofuels. Elife, v.4, 681

p.1-16, 2015. 682

LIMA, L.H.C.; DE MARCO, J.L.; FELIX, C.R. Enzimas hidrolíticas envolvidas no controle 683

biológico por micoparasitismo. In: Melo, I.S.; Azevedo, J.L (Ed.). Controle Biológico. 684

Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2000. v.2, p.263-304. 685

LU, L.; LU, H.; WUC, C.; FANGD, W.; YUA, C.; YEA, C.; SHIA, Y.; YUA, T.; ZHENGA, 686

X. Preharvest application of antagonistic yeast Rhodosporidium paludigenum induced 687

resistance against postharvest diseases in mandarin orange. Biological Control, Maryland 688

Heights, v.67, n.2, p.130–136, 2013. 689

LU, H.; LU, L.; ZENG, L.; FU, D.; XIANG, H.; YU, T.; ZHENG, X. EFFECT of chitin on 690

the antagonistic activity of Rhodosporidium paludigenum against Penicillium expansum in 691

apple fruit Postharvest Biology and Technology, Amsterdam, v.92, p.9-15, 2014. 692

MASIH, E.I.; PAUL, B. Secretion of beta-1,3-glucanase by the yeast Pichia membranifaciens 693

and its possible role in the biocontrol of Botrytis cinerea causing mold disease of the 694

grapevine. Current Microbiology, New York, v.44, p.391-395, 2002. 695

MCGEARY, F.M.; WHEELER, B.E.J. Growth rates of and mycelial interaction betwenen 696

isolates of Crinipellis perniciosa from cocoa. Plant Pathology, London, v.37, p. 489-498, 697

1988. 698

MEDEIROS, F. H.V.; POMELLA, A.W..; SOUZA, J.T.; NIELLA, G.R.; VALLE, R.; 699

BATEMAN, R.P.; FRAVEL, D.; VINYARD, B.; HEBBAR, P.K. A novel, integrated method 700

for management of witches’broom disease in Cacao in Bahia, Brazil. Crop Protection. 701

Guildford, n.29, p.704-711, 2010. 702

MEINHARDT, L.W.; RINCONES J.; BAILEY, B.A.; AIME, M.C.; GRIFFITH, G.W.; 703

ZHANG, D.; PEREIRA, G.A. Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches’ broom 704

disease of cacao: what’s new from this old foe? Physiological and Molecular Plant 705

Pathology, London, v.9, n.5, p.577-588, 2008. 706

MIDLEJ, R. R.; SANTOS, A. M. Economia do Cacau. In: VALLE, R. R. (org). Ciência, 707

Tecnologia e Manejo do Cacaueiro. Brasília: Ceplac, 2012. p.655-672. 708

MIDLEJ, R.R.; SANTOS, A.M. Economia do cacau. In: VALLE, R. (Ed.). Ciência, 709

131

Tecnologia e manejo do cacaueiro. CEPLAC, Ilhéus, Brasil, 2007, p.422458. 710

MILLER, W.G.; BRANDL, M.T.; QUINONES. B.; LINDOW, S.E. Biological sensor for 711

sucrose availability: relative sensitivities of various reporter genes. Applied and 712

Environmental Microbiology, v.67, p.1308-1317, 2001. 713

NUTARATAT, P.; SRISUK, N.; ARUNRATTIYAKORN, P.; LIMTONG, S. Plant growth-714

promoting traits of epiphytic and endophytic yeasts isolated from rice and sugar cane leaves 715

in Thailand. Fungal biology, v.118, n.8, p.683-194, 2014. 716

OLIVEIRA, A.G.; CHAGAS JUNIOR, A.F.; SANTOS, G.R.; MILLER, L.O.; CHAGAS, 717

L.F.B. Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA por Trichoderma spp.. 718

Revista Verde, v.7, n.3, p.149-155, 2012. 719

OLIVEIRA, J.R.G.; MORAES, T.A.L.; MELO, N.F.; MELO, A.M.Y. Fungos micorrízicos 720

arbusculares e rizobactérias promotoras de crescimento na aclimatização de Zingiber 721

spectabile. Bragantia, v.69, n.3, p.687-694, 2010 722

OLIVEIRA, M. L. Eficácia de fungicidas triazóis no controle da vassoura-de-bruxa do 723

cacaueiro causada por Crinipellis perniciosa. Fitopatologia Brasileira, v.29, p.149, 2004a. 724

__________. Estrobilurinas: novo grupo de fungicidas com eficácia contra a vassoura-de- 725

bruxa do cacaueiro. Fitopatologia Brasileira, v.29, p.285, 2004b. 726

OLIVEIRA, M. L.; LUZ, E. D. M. N. Vassoura-de-bruxa. In:__________. Identificação e 727

manejo das principais doenças do cacaueiro no Brasil. Ilhéus, CEPLAC/CEPEC/SEFIT, 728

2005, p. 1533. 729

PEREIRA,J.L.; VALLE, R.R. Manejo Integrado da vassoura de bruxa do cacaueiro. In: 730

VALLE, R.R. Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro. Brasília: 731

CEPLAC/CEPEC/SEFIS. 2ed. p.11-30, 2012. 732

PLATANIAA, A.; RESTUCCIAB, C.; MUCCILLIB, S.; CIRVILLERIA, G. Efficacy of 733

killer yeasts in the biological control of Penicillium digitatum on Tarocco orange fruits 734

(Citrus sinensis). Food Micrrobiology, v.30, n.1, p.219-225, 2012. 735

QUEIROZ, V. T. et al. Identification of a major QTL in cocoa (Theobroma cacao L.) 736

associated with resistance to witches’ broom disease. Plant Breeding, v. 122, n. 3, p. 268-737

272, 2003. 738

RUDGARD, S.A.; BUTLER, D.R. Witches' broom disease on cocoa in Rondonia, Brazil: pod 739

infection in relation to pod susceptibility, wetness, inoculum, and phytosanitation. Plant 740

Patholology. n.36, p.512-522, 1987. 741

SAS Institute Inc (1989) SAS/STAT User´s Guide, version 6.4 ed. Cary, SAS Institute, North 742

Caroline State University. 846 p. 743

132

SCARPARI, L. M.; MEINHARD, L.M.; MAZZAFERA, P.; POMELLA, A.W.V.; 744

SCHIAVINATO, M.A.;CASCARDO, J.C.M.; PEREIRA, G.A.G. Biochemical changes 745

during the development of witches’ broom: the most important disease of cocoa in Brazil 746

caused by Crinipellis perniciosa. Journal Experimental Botany, p. 113, 2005. 747

SENA, K.; ALEMANNO, L.; GRAMACHO, K.P. The infection process of Moniliophthora 748

perniciosa in cacao. Plant Pathology, 2014. 749

SILVA, S.D.V.M.; LUZ, E.D.M.N.; PIRES, J.L.; YAMADA, M.M.; SANTOS FILHO, L.P. 750

Cacao resistance to Crinipellis perniciosa: diallelic crosses increase genes for resistance. 751

In: 8th International Congress of Plant Pathology, Christchurch Addendum to Abstracts of 752

Offered Papers, Christchurch, p.8, 2003. 753

SUI, Y.; WISNIEWSKI, M.; DROBY, S.; LIUA, J. Responses of yeast biocontrol agents to 754

environmental stress. Applied and environmental microbiology, v.81, n.9, p.2968-2975 755

2015. 756

SUN, P.; Fang, W.; SHIN, L.; WEI, J.; FU, S.; CHOU, J. Indole-3-acetic acid-producing 757

yeasts in the phyllosphere of the carnivorous plant Drosera indica L. Plos one, p.1-22, 2014. 758

URQUHART, E.J.; PUNJA, Z.K. Hydrolytic enzymes and antifungal compounds produced 759

by Tilletiopsis species, phyllosphere yeasts that are antagonists of powdery mildew fungi. 760

Canadian Journal of Microbiology, v.48, n.3, p.219-229, 2002. 761

VALDEBENITO-SANHUEZA, R.M.V. Leveduras para o biocontrole de fitopatógenos. In: 762

MELO, I.S; AZEVEDO, J.L. (Ed.). Controle biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio 763

Ambiente. p.41-56, 2000. 764

ZHANG, H. Y. et al. Postharvest biological control of gray mold decay of strawberry with 765

Rhodotorula glutinis. Biological Control, v.40, p.287-292, 2007. 766

767

768

769

133 Tabela 1. Análise de variância (ANOVA) dos tratamentos/leveduras avaliadas

para o biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro, através das variáveis:

comprimento da vassoura terminal (CVT), número de vassouras axilares maiores

que 1 cm (NVA), incidência (INC) e índice de doença (ID).

VARIÁVEIS* FONTE DE

VARIÇÃO GL SQ QM F P

CVT

TRAT 99 6196,3 62,5886 21,45 0,0000

ERRO 7235 21110,3 2,91780

TOTAL 7334 27306,6

NVA

TRAT 99 141,108 1,42534 14,74 0,0000

ERRO 7235 699,595 0,09670

TOTAL 7334 840,703

INC

TRAT 99 57,568 0,58149 18,7 0,0000

ERRO 7235 225,032 0,03110

TOTAL 7334 282,6

ID

TRAT 99 5969,8 60,3009 20,99 0,0000

ERRO 7235 20788,2 2,87330

TOTAL 7334 26758,0 *Os dados foram corrigidos para efeito de ensaio e transformados √x+0,5.

134 Tabela 2. Incidência (INC) e índice de doença (ID) em mudas de cacaueiro (CATONGO), tratadas (TRAT) com leveduras nativas (LEV 079, LEV

162, LEV 098, LEV 210) e Agromós, e comparadas entre si e quanto a aplicação em cada um dos diferentes períodos (1, 2, 7, 14 dias) que

antecederam a inoculação com suspensão de basidiósporos de M. perniciosa na gema apical

TRAT

ÉPOCAS DE APLICAÇÃO (dias) TEST

1 2 7 14

INC ID1 INC ID INC ID INC ID INC ID

LEV 079 0,89 aA 57,85 aA 0,81 abA 48,64 abA 0,48 cAB 34,92 bA 0,65 bcA 30,89 bA 0,81 ab 46,48 ab

LEV 098 0,26 cdB 18,50 bB 0,54 bB 49,82 aA 0,24 cC 38,67 abA 0,48 bcA 41,31 abA 0,81 a 46,48 a

LEV 162 0,00 cC 0,00 cC 0,50 bB 25,24 bB 0,54 bA 45,62 aA 0,06 cB 35,00 abA 0,81 a 46,48 a

LEV 210 0,43 bB 51,48 aA 0,17 cC 59,00 aA 0,28 bcBC 54,87 aA 0,11 cB 37,83 aA 0,81 a 46,48 a

AGROMÓS 0,00 bC 0,00 bC 0,00 bC 0,00 bC 0,00 bD 0,00 bB 0,00 bB 8,33 bB 0,81 a 46,48 a 1ID – índice de doença = VT+VA (0,5*CVT)+NVA. Os dados foram transformados por Sqrt (x+0,5). Médias na coluna seguidas pela mesma letra

minúscula na linha e maiúscula na coluna não diferem significativamente (p<0,05) entre si pelo teste de comparação de médias de Tukey para a

variável INC e Kruskal-Wallis.

135

Tabela 3. Incidência (INC), comprimento de vassouras terminais (CVT),

número de vassouras axilares maiores que 1 cm (NVA) e índice de doença

(ID) em plântulas de cacaueiro (CATONGO) tratadas com leveduras

nativas (pulverização da parte aérea), mistura de duas leveduras, mistura de

10 leveduras (MIX) e produtos comerciais, 24 h antes da inoculação com

suspensão de basidiósporos de M. perniciosa na gema apical, 30 dias após

a inoculação.

TRAT PLÂNTULAS

INC CVT (mm) NVA ID1

LEV 007 0,81 ab 45,48 a 2,72 a 46,34 a

LEV 027 0,41 defg 44,69 a 1,45 a 44,62 a

LEV 074 0,91 a 48,10 a 2,28 a 49,70 a

LEV 079 0,91 a 57,69 a 2,48 a 58,76 a

LEV 098 0,81 ab 40,00 a 2,00 a 40,56 a

LEV 162 0,47 cdefg 55,50 a 2,21 a 53,87 a

LEV 179 0,25 fgh 40,71 a 1,43 a 35,88 a

LEV 193 0,68 abcde 39,90 a 3,75 a 41,29 a

LEV 207 0,22 gh 39,83 a 1,40 a 33,07 a

LEV 210 0,56 bcdef 48,82 a 2,13 a 48,00 a

193+210 0,75 abc 42,00 a 2,32 a 41,24 a

27+207 0,34 efg 27,81 a 2,36 a 83,27 a

7+74 0,66 abcde 50,48 a 2,11 a 52,59 a

79+179 0,91 a 42,68 a 2,39 a 40,78 a

98+162 0,91 a 50,93 a 2,72 a 51,52 a

MIX 0,69 abcd 45,64 a 2,63 a 45,27 a

COBRE 0,00 h 0,00 0,00 0,00

FOLICUR 0,00 h 0,00 0,00 0,00

MIX/FOLICUR 0,00 h 0,00 0,00 0,00 1ID – índice de doença = VT+VA (0,5*CVT)+NVA. 2Os dados foram

transformados por Sqrt(x+0.5). Médias na coluna seguidas pela mesma letra

não diferem significativamente (P<0,05) entre si pelo teste de comparação

de médias de Tukey para a variável INC e Krukal-Wallis para as variáveis

CVT, NVA e ID.

136 Tabela 4. Crescimento de plântulas seminais de cacaueiro (PS 1319) submetidas a tratamentos com suspensões de células de levedura em diferentes

dosagens/aplicações (APL), e avaliadas quanto ao comprimento (CP), diâmetro do coleto (DC), peso fresco da parte aérea (PFA), peso seco da parte aérea (PSA),

peso fresco da raiz (PFR) e peso seco da raiz (PSR), 60 dias após a semeadura.

V1 APL TRATAMENTOS

TR2 TA3 CV4

MIX LEV 079 LEV 084 LEV 093 LEV 098 LEV 149 LEV 162 LEV 168 LEV 170 LEV 206 LEV 210

CP

1 22,98 abA 24,87 aA 24,16 abA 24,96 aA 24,04 abA 23,34 abA 24,80 aA 24,18 abAB 22,43 bB 23,71 abA 24,55 abA

22,76 22,36 6,08 2 24,04 aA 24,13 aA 23,96 aA 24,95 aA 24,16 aA 24,40 bA 23,07 aAB 23,35 aB 23,52 aAB 24,67 aA 25,08 aA

3 22,71 bA 24,32 abA 24,09 abA 24,84 abA 24,53 abA 24,70 abA 24,64 abB 24,88 abA 24,41 abA 23,22 abA 25,25 aA

DC

1 4,11 a abA 4,06 bB 4,29 abA 4,42 aA 4,21 abA 4,41 aAB 4,40 aA 4,38 abA 4,16 abAB 4,41 aA 4,27 abA

3,89 3,85 4,3 2 4,31 abcA 4,09 cB 4,42 abcA 4,35 abcA 4,20 bcA 4,63 aA 4,52 abA 4,41 abcA 4,11 cB 4,34 abcA 4,25 bcA

3 4,18 aA 4,39 aA 4,33 aA 4,42 aA 4,36 aA 4,36 aB 4,44 aA 4,33 aA 4,43 aA 4,47 aA 4,36 aA

PFA

1 2,48 abA 2,75 aA 2,63 abA 2,68 abA 2,68 abA 2,55 abA 2,66 abA 2,71 abA 2,27 bA 2,49 abA 2,84 aA

2,76 2,40 25,17 2 2,53 aA 2,65 aA 2,74 aA 2,85 aA 2,80 aA 3,25 aA 3,46 aA 2,67 aA 2,41 aA 2,78 aA 2,71 aA

3 2,32 bA 2,62 abA 2,69 abA 2,69 abA 2,75 aA 2,70 abA 2,73 abA 2,79 aA 2,63 abA 2,55 abA 2,94 aA

PSA

1 0,56 aA 0,58 aA 0,57 aA 0,59 aA 0,58 aA 0,54 aB 0,57 aA 0,61 aA 0,52 aB 0,55 aB 0,62 aA

0,61 0,20 18,40 2 0,58 aA 0,59 aA 0,61 aA 0,60 aA 0,60 aA 0,59 aAB 0,54 aA 0,61 aA 0,58 aAB 0,64 aA 0,61 aA

3 0,56 aA 0,56 aA 0,58 aA 0,56 aA 0,61 aA 0,61 aA 0,59 aA 0,59 aA 0,59 aA 0,54 aB 0,62 aA

PFR

1 0,63 abA 0,66 abA 0,69 aA 0,66 aA 0,60 abA 0,65 abA 0,67 abA 0,64 aA 0,53 aA 0,67 aA 0,59 aA

0,62 0,46 8,24 2 0,72 abA 0,58 abcA 0,63 abcA 0,75 aA 0,59 abcA 0,67 abcA 0,57 abcA 0,52 cB 0,53 bcA 0,68 abcA 0,55 bcA

3 0,57 abA 0,54 bA 0,75 aA 0,66 abA 0,61 abA 0,64 abA 0,63 abA 0,56 abAB 0,61 abA 0,64 abA 0,63 abA

PSR

1 0,15 aA 0,15 abAB 0,19 aA 0,17 abA 0,14 abA 0,17 aA 0,16 abA 0,15 abA 0,15 abA 0,19 aA 0,14 abA

0,17 0,13 3,36 2 0,17 aA 0,17 aA 0,16 aA 0,21 aA 0,17 aA 0,16 aA 0,14 aA 0,14 aA 0,19 aA 0,19 aA 0,17 aA

3 0,18 aA 0,14 aB 0,19 aA 0,16 aA 0,14 aA 0,18 aA 0,16 aA 0,15 aA 0,19 aA 0,14 aA 0,14 aA 1Variáveis analisadas; 2Testemunha relativa (adubo MAP 5mL/planta); 3Testemunha absoluta; 4Coeficiente de variação. Médias seguidas por letras minúsculas na linha e maiúsculas

na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

137

Figura 1. Dendrograma de análise de agrupamento obtido pelo método de

UPGMA (distância Euclidiana), a partir das medidas de dissimilaridade entre 100

isolados de leveduras nativas do cacaueiro avaliadas quanto ao potencial

biocontrolador vassoura de bruxa do cacaueiro. Grupos formados após corte na

altura de θ = 12: I, II, III.

138

Figura 2. Número médio de basidiomas em vassouras secas (ramos de Theobroma cacao infectados com

Moniliophthora perniciosa) tratadas com leveduras nativas (pulverização), mistura de duas leveduras, mistura

de 10 leveduras e produtos comerciais, avaliadas durante 60 dias após incubação em câmaras climáticas

(gabinetes/vassoureiro). T1 – LEV 007; T2 – LEV 027; T3 – LEV 074; T4 – LEV 079; T5 – LEV 098; T6 –

LEV 162; T7 – LEV 179; T8 – LEV 193; T9 – LEV 207; T10 – LEV 210; T11 – MIX 193 + 210; T12 – MIX

027 + 207; T13 – MIX 007 + 074; T14 – MIX 098 + 162; T15 – MIX TOTAL; T16 – Cobre Atar®; T17 -

Tricovab®; T18 – Testemunha.

139

Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura da superfície abaxial (LAb) e adaxial (LAd) do limbo foliar,

nervura central (NCAd e NCAb) e meristema apical (MA) de plântulas de cacaueiro, pulverizadas com a

levedura LEV 098 (Candida sp.), inoculadas com basidiósporos de Moniliophthora perniciosa., e coletadas 2 h

(2hA) e 10 dias (10dA) após a aplicação da levedura. Inoculação do patógeno 7 dias após a pulverização da

levedura. Detalhes estômato (Et), grãos de amido (Ad).

2hA

Et

br

Et

Et Et

Et

Et

NCAd

br

40 µm 20 µm

5 µm 50 µm

10 µm 5 µm

MA NCAd

MA NCAd

10dA

LAb

LAd

2hA

LAb

10hA

140

Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura da superfície adaxial (LAd) do limbo foliar,

nervura central (NCAd e NCAb) e meristema apical (MA) de plântulas de cacaueiro,

pulverizadas com a levedura LEV 162 (Hanseniaspora sp.), inoculadas com basidiósporos

de Moniliophthora perniciosa e coletadas 2 h (2hA) e 10 dias (10dA) após a aplicação da

levedura. Inoculação do patógeno 7 dias após a pulverização da levedura. Tricomas tectores

(tt) e glandulares (tg)

tt

tg

br

10 µm 50 µm

20 µm 40 µm

20 µm 10 µm

10 µm 10 µm

br

NCAd NV

NCAd

LAd

NCAd

NCAd

MA NCAd

MA NCAd

MA

10dA NCAd

10dA NCAd

10dA NCAd

10dA NCAd

10dA NCAd

10dA NCAd

2hA

2hA

2hA 2hA

tt

tt

tt

tt

141

Figura 5. Microscopia eletrônica de varredura da superfície abaxial (LAb) e adaxial (LAd) do limbo foliar,

nervura central (NCAd e NCAb) e meristema apical (MA) de plântulas de cacaueiro, pulverizadas com a

levedura LEV 210 (Hanseniaspora sp.), inoculadas com basidiósporos de Moniliophthora perniciosa, e

coletadas 2 h (2hA) e 10 dias (10dA) após a aplicação da levedura. Inoculação do patógeno 7 dias após a

pulverização da levedura. Detalhes células epidérmicas (CEp), células parênquima paliçádico (CPp), estômato

(Et), grãos de amido (Ad), pseudohifa (PsH).

LAb

2hA

NCAd

2hA

LAd

2hA

LAd 2hA

LAd 2hA

NCAb

10dA NCAd

CEp

CPp

Et

Et

CEp

Ad

br

br

PsH

10 µm

10 µm

10 µm 10 µm

10 µm

10 µm

142

CAPÍTULO 5

Conclusões Gerais

143

CONCLUSÕES GERAIS

- São apresentadas progênies que carregam genes de resistência à VB oriunda de fontes

diversas, além da incorporação de genes de resistência à monilíase, praga quarentenária A1.

- A microbiota epifítica residente em folhas, flores e frutos de cacaueiro abriga uma

diversidade de fungos leveduriformes, até então não citados na literatura.

- Leveduras nativas do cacaueiro são produtoras de compostos difusíveis e voláteis que atuam

na inibição da germinação de basidiósporos e crescimento micelial de M. perniciosa.

- Na superfície de diferentes órgãos vegetais de cacaueiros selecionados como resistentes à

vassoura de bruxa e monilíase, existem uma diversidade de fungos leveduriformes que podem

estar atuando de forma positiva na inibição de M. perniciosa e evolução do quadro

sintomatológico.

- Leveduras nativas são potenciais agentes de biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro,

atuando na diminuição dos sintomas em plântulas seminais e inibição da produção de

basidiomas.

- Há possibilidade de integração do controle químico com fungicidas cúpricos e controle

biológico com leveduras nativas para o manejo da vassoura de bruxa do cacaueiro.

- O período de aplicação da suspensão de células de leveduras é preponderante para a

manifestação do biocontrole da vassoura de bruxa do cacaueiro.

- Leveduras nativas colonização do cacaueiro colonizam prováveis sítios de infecção de

Moniliophthora perniciosa, como estômatos, bases de tricomas e nervuras foliares.

- Leveduras nativas que apresentam potencial biocontrolador a vassoura de bruxa, podem

atuar como promotoras de crescimento de plântulas seminais do cacaueiro, havendo variações

intraespecíficas e em relação ao número de aplicações na manifestação desta característica.

NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO DA VASSOURA DE …

Documents

Transcript of NOVOS COMPONENTES PARA O MANEJO DA VASSOURA DE …