NOVOS DESAFIOS DA PESQUISA EMNUTRIÇÃO E PRODUÇÃO ANIMAL

Edição 2019

ORGANIZADORES

Prof. Dr. Paulo Henrique Mazza Rodriguês Profa. Dra. Cristiane Soares da Silva Araújo Profa. Dra. Angelica Simone Cravo pereira

Prof. Dr. Augusto Hauber Gameiro Prof. Dr. Marcio Antonio Brunetto

Prof. Dr. Cesar Augusto Garbossa Pospissil

Prof. Dr. Ricardo Vieira Ventura

Progama de Pós-Graduação em Nutriçãoe Produção Animal

ISBN: 978-85-60014-36-1

Edição: 2019

Direitos autorais

Os organizadores autorizam a reprodução total ou parcial deste trabalho, para qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

O conteúdo e revisão ortográfica são de inteira responsabilidade de seus autores.

EdiçãoEditora 5DRua João Wegmuller, 934 - Jardim BandeirantesPirassununga - SP - CEP: 13.631.660 - Tel:. 19 3561-4635contato@5dpublicidade.com.brwww.5dpublicidade.com.br

Capa e Editoração EletrônicaAlexandre RaisElaine MachadoAmanda Segobe

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO(Biblioteca Virnie Buff D’ Ápice da Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

Novos desafios da pesquisa em nutrição e produção animal / organização Rodriguês, Paulo Henrique Mazza.... [et al.]. - Edição 2019 - Pirassununga: 5D Editora, 2019.336 p. : il.

Pesquisa desenvolvida no Programa de Pós-graduação em Nutrição e Produção Animal do Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zooctecnia da Universidade de São Paulo.

ISBN: 978-85-60014-36-1

1. Nutrição animal 2. Produção animal I. Rodrigues, Paulo Henrique Mazza II. Araújo, Cristiane Soares da Silva III. Pereira, Angélica Simone Cravo IV. Gameiro, Augusto Hauber V. Brunetto, Marcio Antonio VI. Pospissil, Cesar Augusto Garbossa. VII. Ventura, Ricardo Vieira VIII. Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal. IX Universidade de São Paulo, Departamento de Nutrição e Produção Animal. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia.

APRESENTAÇÃO

A organização da Edição 2019 do livro “Novos Desafios da Pesquisa em Nutrição e Produção Animal” tem por objetivo divulgar os mais recentes avanços na pesquisa desenvolvida dentro do Departamento de Nutrição e Produção Animal (VPN) da FMVZ-USP, bem como apresentar a visão crítica dos pesquisadores sobre temas relevantes à nutrição e produção animal. A edição deste ano organizou a obra em 14 capítulos, onde os autores apresentam seus resultados de pesquisa e revisam, com visão abrangente e crítica, importantes temas de interesse da comunidade científica desta área de conhecimento. Todas estas contribuições são fruto de consolidação e do avanço de projetos científicos desenvolvidos por docentes, alunos e colaboradores do VPN, os quais tem resultado no avanço do conhecimento científico e na formação de recursos humanos altamente qualificados em nível de iniciação científca, mestrado e doutorado. Os organizadores acreditam que esta coletânea possa contribuir com a difusão do conhecimento científico, cujo conteúdo específico fica, muitas vezes, fragmentado em artigos publicados em revisstas especializadas. Desta forma, este livro é recomendado para todos que buscam aprofundamento científico em relação à fronteira do conhecimento sobre alguns dos grandes temas de importância para a Nutrição e Produção Animal.

OS ORGANIZADORES

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SUMÁRIO

CAPÍTULO I ........................................................................................................ 010MICROBIOMA EQUINO: O QUE SE SABE E PERSPECTIVAS PARA SUA MODULAÇÃO

CAPÍTULO II ........................................................................................................ 036INCLUSÃO DE BAGAÇO DE CEVADA COMO FONTE DE FIBRA DIETÉTICA PARA LEITÕES DESMAMADOS

CAPÍTULO III ....................................................................................................... 057INFLUÊNCIA DE BIOTIPOS BOS TAURUS CONTINETAL SOBRE ATRIBUTOS DE CARCAÇA E QUALIDADE DA CARNE

CAPÍTULO IV ...................................................................................................... 082SÍNTESE EMERGÉTICA PARA AVALIAÇÃO DA SUSTENTABILIDADE DA PRODUÇÃO ANIMAL INTEGRANDO FLUXOS DE CUSTOS FINANCEIROS E DE RECURSOS NATURAIS

CAPÍTULO V ........................................................................................................ 105EMPREGO DE BETA-GLUCANOS NA NUTRIÇÃO ANIMAL

CAPÍTULO VI ....................................................................................................... 132AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO BUMP FEEDING SOBRE O DESEMPENHO DA MATRIZ SUÍNA E DA LEITEGADA

CAPÍTULO VII ...................................................................................................... 152NUTRIÇÃO PROTEICA DE POEDEIRAS CRIADAS NO PISO

CAPÍTULO VIII ..................................................................................................... 171TEORES DE FIBRA EM DETERGENTE NEUTRO E INCLUSÃO DE NARASINA SOBRE O DESEMPENHO, FERMENTAÇÃO RUMINAL, MORFOLOGIA E HISTOLOGIA DAS PAPILAS RUMINAIS DE CORDEIROS

CAPÍTULO IX ...................................................................................................... 196EFEITOS DE MEIO E AVALIAÇÃO GENÉTICA PARA VARIÁVEIS CINEMÁTICAS DE ANDAMENTO EM EQUINOS MARCHADORES

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SUMÁRIO

CAPÍTULO X ....................................................................................................... 222PLASMA NA DIETA DE MARRÃS

CAPÍTULO XI ...................................................................................................... 242DIVERSIDADE GENOTÍPICA DE PATÓGENOS CAUSADORES DA MASTITE BOVINA

CAPÍTULO XII ..................................................................................................... 268PRÁTICAS ESTRATÉGICAS COM VISTAS À MITIGAÇÃO DOS GASES DO EFEITO ESTUFA NA PRODUÇÃO DE BOVINOS A PASTO

CAPÍTULO XIII .................................................................................................... 295ÁCIDOS ORGÂNICOS NA DIETA DE VACAS EM LACTAÇÃO

CAPÍTULO XIV .................................................................................................... 315FERRAMENTAS DE VISUALIZAÇÃO PARA VALIDAÇÃO DE DADOS GENÔMICOS SIMULADOS

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CAPÍTULO IMICROBIOMA EQUINO: O QUE SE SABE E PERSPECTIVAS PARA

SUA MODULAÇÃO

Júlia Rizzo de Medeiros Ferreira¹, Camila Bianconi², Ângelo Mateus Campos

Araújo Júnior¹, Filipe Lima Bastos¹, Flávia Vieira de Freitas¹, Henrique Costa

Filho¹, Alexandre Augusto de Oliveira Gobesso³

¹Pós-graduandos em Nutrição e Produção Animal/VNP - Universidade de São Paulo/ FMVZ-USP (julia.ferreira@usp.br)²Pós-graduanda em Medicina e Cirurgia Veterinárias - Universidade Federal de Minas Gerais/UFMG³Professor Associado da Universidade de São Paulo/FMVZ-USP pelo departamento

de Nutrição e Produção Animal/VNP

RESUMOO microbioma se refere à coleção de genomas de microrganismos que vivem em um ambiente onde interagem de forma benéfica ou não entre si e com o hospedeiro. É influenciado por características individuais e ambientais e vem sendo alvo de estudos por conta de seu impacto sobre a saúde dos animais. Os equinos, muito dependentes da microbiota para digestão da fibra, sofrem com distúrbios gastrointestinais, os quais impactam sobre seu bem-estar e desempenho. Quadros de disbiose estão diretamente relacionados ao desenvolvimento de doenças. Assim, entender o microbioma dos equinos pode permitir a modulação do mesmo para prevenção e tratamento de doenças e minimizar quedas de performance. O estabelecimento da microbiota se inicia no parto e varia bastante nos primeiros 60 dias de vida, estabilizando após esse período. Foi o observado em estudo com 16 potros que foram acompanhados desde o nascimento até 30 dias após o desmame e tiveram amostras de fezes coletas aos sete dias pós-nascimento, aos cinco meses no momento do desmame e aos seis meses, um mês após o desmame. Os filos Firmicutes e Bacteroidetes foram predominantes nos três momentos. Ainda, éguas em terço final de gestação que tiveram suas dietas ajustadas, sendo que parte delas foi suplementada com levedura viva protegida Saccharomyces Cerevisiae, apresentaram aumento da bactéria Phascolarctobacterium faecium, a qual está intimamente ligada à saúde digestiva em humanos e outros animais. É evidente a importância do estudo do microbioma para a espécie equina e a necessidade de mais estudos na área.

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INTRODUÇÃO O microbioma é um termo utilizado para se referir a uma coleção de genomas de microrganismos que vivem em um nicho específico com diferentes interações, sendo elas comensalidade, simbiose ou patogenicidade. Microbiota seria o próprio grupo de microrganismos. O crescente interesse sobre a relação destes grupos se deve ao fato do microbioma estar intimamente relacionado à saúde do ser humano e dos animais, ganhando, assim, destaque nas pesquisas recentes. A análise de genes 16S rRNA, genes 18S rRNA, ou outros genes marcadores e regiões genômicas amplificadas e sequenciadas de determinadas amostras biológicas trouxe uma nova perspectiva para a compreensão do mesmo e suas relações com o hospedeiro. A idéia é que, futuramente, seja possível traçar estratégias de controle e prevenção de doenças com base nessas informações. Para os cavalos, compreender essas relações é essencial, pois são animais extremamente dependentes da microbiota para realizar a degradação de fibra. Esses microrganismos produzem ácidos graxos de cadeia curta, os quais são convertidos em energia, e vitaminas K e do complexo B. Estão diretamente relacionados à imunidade dos equinos e os principais filos identificados na microbiota intestinal são Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Fibrobacteres e Actinobacteria. O desenvolvimento da microbiota se inicia quando o potro passa do ambiente estéril intrauterino e tem contato com os microrganismos do canal do parto e do ambiente. Essa microbiota é bastante variável nos primeiros 60 dias de vida, sendo comum encontrar os filos Firmicutes e Bacteroidetes. Fibrobacteres estão em baixas quantidades nos primeiros dias após o nascimento, aumentando gradualmente. Após esses 60 dias, a microbiota tende a estabilizar e fica bem parecida com a de animais adultos. Neste período, estão em maior abundância os microorganismos dos Filos Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Synergistetes, Spirochaetes, Fibrobacteres, Tenericutes, Planctomycetes e Euryarchaeota. Nos adultos, a estrutura e a composição microbiana varia de acordo com a região do trato gastrointestinal, o genótipo do indivíduo e a dieta. A forma que a alimentação impacta no microbioma equino depende tanto dos alimentos disponibilizados quanto da frequência e da quantidade de oferta dos mesmos. Os alimentos volumosos levam a uma maior estabilidade das comunidades de microrganismos, enquanto que os concentrados aumentam as populações de Lachnospiraceae, Bacteroidetes e grupos de Bacillus–Lactobacillus–Streptococcus. Estes produzem muito ácido láctico e gás, podendo levar a distúrbios gastrointestinais.

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Uma microbiota residente desregulada é um fator predisponente para o aparecimento de doença, pois ela é responsável pelo desenvolvimento epitelial e tem um papel chave nas respostas imunes. Disbiose está relacionada a alterações comportamentais, aumento de suscetibilidade à ação de toxinas e doenças como colites, disautonomia equina e síndrome metabólica. Maneiras de modular o microbioma e melhorar a resposta imune do hospedeiro vêm sendo estudadas. Pré e probióticos ganham destaque nas pesquisas, embora ainda sejam controversos seus efeitos em cavalos. Estudos que mostraram benefícios de seu uso foram realizados principalmente em animais com distúrbios gastrointestinais, mas os resultados são muito variáveis. O entendimento do microbioma mostra-se cada vez mais crucial para a compreensão do desenvolvimento de doenças e a definição de estratégias para melhorar o bem-estar e o desempenho dos equinos. A evolução nos últimos anos nesta área foi enorme e, provavelmente, com o barateamento das análises, será ainda maior.

HISTÓRIA DO MICROBIOMA Nos últimos anos, o interesse sobre o microbioma humano tem crescido bastante pelo fato de que os seres humanos são supra-organismos compostos também por células de microrganismos. Portanto, os humanos carregam dois conjuntos de genes, aqueles codificados em seu próprio genoma e aqueles codificados no genoma da microbiota (microbioma). Os genes das células humanas são cerca de 23.000, e os genes da microbiota são cerca de 3 milhões. Assim, como supra-organismos, os humanos herdam apenas 1% de seus genes de seus pais, e os 99% restantes são adquiridos principalmente no ambiente imediato quando nascem (Annalisa et al., 2014). O Prêmio Nobel, Dr. Joshua Lederberg, usou o termo microbioma para descrever um sistema ecológico de microrganismos comensais, simbióticos e talvez patogênicos que residem no corpo humano. Curiosamente, o microbioma não é exclusivo dos seres humanos, pois também é encontrado e estudado em outros animais e até em plantas. Hoje em dia, o termo microbioma normalmente se refere a uma coleção de genomas dos microrganismos que vivem em um nicho específico, e o próprio grupo de microrganismos, como bactérias, fungos, protozoários, vírus ou arqueias, é chamado de microbiota (Liu, 2016). Pode-se, então, dizer que o termo microbioma se refere ao número total de microrganismos e seu material genético e se usa em contraponto ao termo microbiota, que é a população microbiana presente nos diferentes ecossistemas do organismo (Sierra, 2014). Indiscutivelmente, o primeiro estudo de microbioma, conduzido por Antonie

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van Leewenhoek, com seus microscópios primitivos, foi relatado em 1673. Durante grande parte dos 300 anos seguintes, microbiologistas trabalharam duro para isolar e estudar organismos em cultura pura. Foram apenas nos últimos 30 anos que surgiu interesse no estudo de complexos sistemas microbianos, exigindo metodologias mais poderosas e novas abordagens. Estudos nos anos 90 investigando comunidades microbianas no meio ambiente levaram a uma tremenda explosão de trabalhos no microbioma humano, incluindo o Projeto Microbioma Humano, em 2008, e a noção do microbioma do animal como o “outro genoma” (Maciness et al., 2012). Métodos não baseados em sequenciamento (por exemplo, cultura) têm sido tradicionalmente usados para caracterizar as populações de microrganismos que são associados a espécies animais. Já a identificação dos microrganismos é estabelecida usando métodos moleculares que dependem predominantemente da análise de genes 16S rRNA, genes 18S rRNA, ou outros genes marcadores e regiões genômicas amplificadas e sequenciadas de determinadas amostras biológicas (Marchesi et al., 2015; Nelson, 2015). O desenvolvimento e expansão do sequenciamento de próxima geração (NGS, sigla em inglês) e do sequenciamento de alto rendimento (HTS, sigla em inglês) para geração de dados genômicos e o paralelo desenvolvimento de ferramentas informáticas para interpretar esses dados, resultou em uma expansão de estudos focados em comunidades de microrganismos associados a humanos, animais e meio ambiente em geral (Nelson, 2015).As primeiras pesquisas metagenômicas, em 2006, usaram o sequenciamento de Sanger como modelo. Isso foi substituído no final dos anos 2000 com a tecnologia 454, a primeira plataforma NGS disponível comercialmente. A tecnologia Illumina foi introduzido logo depois, começando com Solexa e, atualmente, as plataformas MiSeq e HiSeq parecem dominar o mercado de HTS em relação à geração de dados. Novas plataformas e atualizações tendem a ser anunciadas em média a cada 6 a 12 meses. Outras plataformas que mostraram potencial para estudos de microbiomas incluem os Sistemas PacBio, que usa molécula única de sequenciamento em tempo real e difere das outras tecnologias HTS na capacidade de resultar em longas leituras de até 20.000 pares de bases. Esta tecnologia tem potencial significativo para gerar grandes armações que abrangem genomas para fornecer conjuntos e segmentos contíguos maiores de DNA (Nelson, 2015). Estudos dos microbiomas de animais estão nos permitindo ampliar nossa compreensão do microbioma de mamíferos, as espécies de microrganismos que estão presentes e suas relações simbióticas com o hospedeiro, troca de nutrientes, importância desses microrganismos na alimentação animal, eficiência de conversão,

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microrganismos na interface animal-humano, e como esses microrganismos se relacionam com doenças infecciosas, incluindo estratégias de controle e prevenção. Além disso, modelos animais, como aqueles com furões e ratos, fornecem uma abordagem crítica para projetar experimentos cuidadosamente controlados que envolvam uma análise do microbioma para entender melhor as interações desse microbioma na saúde e na doença (Nelson, 2015). O microbioma intestinal desempenha um papel fundamental no metabolismo de humanos e animais. Os metabólitos produzidos pelas bactérias intestinais podem entrar na corrente sanguínea por absorção, circulação entero-hepática ou em função da barreira intestinal enfraquecida. Alguns metabólitos derivados da microbiota podem ter um impacto positivo no hospedeiro, incluindo aqueles com atividade anti-inflamatória, antioxidante ou de alívio da dor e aqueles que regulam a função da barreira intestinal, bem como aqueles que atuam como vitaminas ou fontes de energia (Annalisa et al., 2014). Há uma tendência de relacionar microbioma apenas às populações que existem no sistema gastrointestinal, mas existe microbioma em vários locais do corpo, como cabelo/pelos, narinas, pele, sistema reprodutor e cavidade oral. Esse microbioma demonstrou estar associado a condições como úlceras gástricas, eczema, cáries dentárias e até câncer (Liu, 2016). Ao longo da vida, a composição, e consequentemente o funcionamento do microbioma, pode sofrer influências de diferentes fatores: ambiente, alimentação, uso de antibióticos, doenças, senescência, entre outros. Modificações ambientais e alimentares constituem dois fatores externos e modificáveis que interferem na dinâmica de populações do microbioma (Van Haandel, 2016). Embora tenham sido feitos progressos consideráveis, especialmente nos últimos 15 anos, o que é necessário agora é um teste de hipóteses e não apenas estudos descritivos. É hora de colocar mais ênfase na compreensão da dinâmica de microrganismos benéficos, bem como os patogênicos (Maciness et al., 2012).

MICROBIOTA DO CAVALO Os equinos são animais que se alimentam de vegetais, sendo assim, herbívoros. Além disso, apresentam um único estômago, sendo classificados como monogástricos não ruminantes, devido ao fato de não possuírem rúmen, diferenciando-os de outras espécies (Brandi et al., 2009). O intestino delgado é a estrutura principal de digestão e absorção de carboidratos solúveis, além de gorduras e proteínas, promovendo fermentação em sua porção distal, realizada principalmente por bactérias gram-positivas anaeróbicas (Gobesso et al., 2008). Cavalos são categorizados como animais de ceco funcional, sendo este uma estrutura que se localiza na porção inicial do intestino grosso, e possui característica

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de um saco que em seu ápice ventral apresenta um fundo cego. É responsável pela fermentação microbiana com produção direta de gás (Dyce et al., 2010). Outra estrutura do intestino grosso, o cólon, apresenta, da mesma forma, capacidade de degradação de fibras vegetais com o auxílio de microrganismos fermentativos alojados no mesmo. Além disso, também se observa uma quantidade considerável de microrganismos anaeróbicos no local (Martin et al., 2017). A microbiota intestinal dos equinos é composta por bactérias, protozoários e fungos. Esta composição é influenciada por fatores como genética do hospedeiro, manejo nutricional, ambiente e alterações na homeostase do intestino (Martin et al., 2017). Em cavalos, a microbiota é essencial para a digestão da dieta fibrosa. Muitas das bactérias envolvidas neste processo não são caracterizadas, porém as espécies Firmicutes e Fibrobacteres são conhecidas por usar celulases para degradar a celulose, enquanto as espécies Bacteroidetes (por exemplo, Prevotella) podem degradar pectinas e usar processos sacarolíticos para degradar glicanos como hemicelulose. Este processo resulta na produção de ácidos graxos de cadeia curta, que são então convertidos em fontes de energia (Julliand et al., 2016). Estes ácidos graxos produzidos durante a fermentação incluem acetato, uma fonte de energia para reparação e regeneração de tecidos; butirato, uma fonte energética preferencialmente para colonócitos e epitélio intestinal; e propionato, sendo este precursor da gliconeogênese (Hoffman et al., 2001; Milinovich et al., 2010; Costa et al., 2012). O microbioma também é responsável pela produção de algumas vitaminas para o cavalo, especialmente a vitamina K, e algumas vitaminas do complexo B, como o folato (Julliand et al., 2016). No mesmo sentido, Hastie et al., 2008 descrevem que, as bactérias que povoam o ambiente digestório do equino são capazes de atuar na hidrólise do polímero de celulose (celulolíticas); degradação de proteínas (proteolíticas) e catabolismo de carboidratos, em especial glicose e amido (glicolíticas e amilolíticas). Como exemplo, as bactérias Lactobacillus e Streptococcus são classificadas como amilolíticas e atuam nos carboidratos não digeridos pelas enzimas do intestino delgado. Estão surgindo evidências de que a microbiota está envolvida em mais do que apenas digestão de alimentos. De fato, o microbioma e vários subprodutos metabólicos dos próprios organismos também interagem com o sistema imunológico, contribuindo para sua estimulação. Também participam de vários aspectos do metabolismo natural do animal, como o ciclo do ácido tricarboxílico, reciclagem de ácidos biliares, glicose e feedback de insulina (Martin et al., 2017), fortalece a proteção contra patógenos, neutraliza toxinas e regula a expressão gênica nos tecidos epiteliais do hospedeiro (Milinovich et al., 2010).

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Segundo Julliand et al. (2016) as bactérias são identificadas no intestino do equino utilizando técnicas de sequenciamento, e são classificadas por Filo, Classe, Ordem, Família e Gênero. Os principais filos identificados na microbiota intestinal dos equinos são: Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Fibrobacteres e Actinobacteria. Os filos são acompanhados de seus principais gêneros. Com isso, no filo Firmicutes encontramos Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus e Clostridium; no filo Bacteroidetes encontramos Prevotella; no filo Proteobacteria encontramos Serratia e Pseudomonas; no filo Spirochaetes encontramos Treponema; no filo Fibrobacteres encontramos Fibrobacter; e no filo Actinobacteria encontramos Bifidobacteria. As bactérias Lactobacillus e Streptococcus, são os gêneros mais encontrados no trato gastrointestinal de equinos (Silva et al., 2009; Moreau et al., 2014).

DESENVOLVIMENTO DA MICROBIOTA EQUINA Ao longo do nascimento, o potro tende a migrar do ambiente estéril intrauterino para um ambiente onde entrará em contato com uma diversificada microbiota residente no epitélio vaginal, períneo e pele da mãe. A partir deste momento, se inicia a colonização inicial do trato gastrointestinal do neonato, evento que permitirá uma modulação do sistema imune do animal e alterações na arquitetura tecidual do intestino (Russel et al., 2013), fornecendo condições adequadas para processamento do alimento a ser ingerido (Costa et al., 2016; Costa & Weese, 2018; Torre et al., 2019). No primeiro dia de vida do potro é comum que exista uma rica, diversificada e transitória microbiota intestinal, proveniente da exposição ambiental a que o neonato foi submetido. No entanto, esta diversificada microbiota apresenta curto tempo de permanência e em menor abundância no trato gastrointestinal destes animais e, frequentemente, auxilia na manutenção de um ambiente adequado para que os microorganismos colonizadores possam se desenvolver de maneira satisfatória (Costa et al., 2016). A identificação destes agentes nas primeiras 5 semanas de vida é dificultada devido ao fato da impossibilidade de cultivo em laboratório de algumas espécies (Kuhl et al., 2011). Além disso, não existe uma técnica padrão-ouro para identificação dos microorganismos, que também podem ter sua proporção variando de acordo com idade, escore de condição corporal, região de criação dos animais, tipo de alimentos ingeridos e características individuais (Dougal et al., 2012; Morrison et al., 2018). Estudos conduzidos com o objetivo de elucidar a organização da microbiota de potros desde o nascimento até o desmame, identificaram que no primeiro dia de vida é possível identificar, em amostras fecais, bactérias do Filo Proteobacteria,

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incluindo os gêneros Acinetobacter e Pseudomonas, além da família Moraxelleacea (Torre et al., 2019) e do Filo Fusobacteria (Costa et al., 2016). Em torno do sétimo dia de vida, estavam em maior abundância nas fezes Enterobacteriaceae (proveninente da coprofagia praticada pelos potros), Fusobacterium, Erysipelotrichaceae, Peptoestreptococcaceae e Bacteroidetes (apresenta valores crescentes após a introdução do alimento sólido) e Firmicutes, sendo este último o Filo mais importante em equinos. Em estudo realizado no Laboratório de Saúde Digestiva e Desempenho de Equinos (LabEqui) pertencente ao Departamento de Nutrição e Produção Animal da Universidade de São Paulo, Bianconi (2019) fez coletas de fezes por palpação digital em 16 potros com uma semana de vida, aos 5 meses, no dia do desmame, e aos 6 meses de idade, um mês após o desmame. O total de coletas por animal foi 3 e de amostras foi 48. A caracterização dos filos bacterianos em cada momento está discriminada na Figura 1.

Figura 1. Discriminação das populações bacterianas nas fezes de potros com 1 semana de vida, no momento do desmame aos 5 meses e 1 mês após o desmame aos 6 meses de idade pela técnica de sequenciamento 16S rRNA (Bianconi, 2019).

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incluindo os gêneros Acinetobacter e Pseudomonas, além da família Moraxelleacea (Torre et al., 2019) e do Filo Fusobacteria (Costa et al., 2016). Em torno do sétimo dia de vida, estavam em maior abundância nas fezes Enterobacteriaceae (proveninente da coprofagia praticada pelos potros), Fusobacterium, Erysipelotrichaceae, Peptoestreptococcaceae e Bacteroidetes (apresenta valores crescentes após a introdução do alimento sólido) e Firmicutes, sendo este último o Filo mais importante em equinos. Em estudo realizado no Laboratório de Saúde Digestiva e Desempenho de Equinos (LabEqui) pertencente ao Departamento de Nutrição e Produção Animal da Universidade de São Paulo, Bianconi (2019) fez coletas de fezes por palpação digital em 16 potros com uma semana de vida, aos 5 meses, no dia do desmame, e aos 6 meses de idade, um mês após o desmame. O total de coletas por animal foi 3 e de amostras foi 48. A caracterização dos filos bacterianos em cada momento está discriminada na Figura 1. Aos sete dias de vida, também foi observado um predomínio do filo Bacteroidetes e Firmicutes. Percebe-se ainda uma baixa prevalência de Fibrobacteres e Cyanobacteria, além de uma maior quantidade de Proteobacteria, Spirochaetes e Verrucomicrobia. Foram detectadas baixas quantidades de Fibrobacteres e maiores quantidades de Proteobacteria também. Diferentemente de Costa et al. (2016), Bacteroidetes foi encontrado em altas quantidades no presente estudo, correspondendo a aproximadamente 50% das bactérias contra menos de 10%. Uma limitação do estudo de Costa et al. (2016) foi o agrupamento de amostras por não terem conseguido coletar as mesmas em dias específicos como previamente estabelecido, já que os animais se encontravam em um haras e os funcionários eram responsáveis pela coleta. O agrupamento de amostras provê números adequados para análise, mas é necessário similaridade entre os grupos, fato que os autores não sabiam a priori. O estudo de Bianconi (2019) foi pontual nesse aspecto, coletando todos os animais nos tempos pré-estabelecidos e por equipe do grupo de pesquisa. Os Filos Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes e Proteobacteria representam os principais filos de importância para a saúde digestiva de equinos, sendo sua manutenção responsável pela quebra da fibra dos alimentos, modulação da resposta imune e síntese de ácidos graxos de cadeia curta. São imprescindíveis para a preservação da higidez de potros neonatos (Dougal et al., 2012; Costa et al., 2016). A partir dos sessenta dias de vida dos potros, a população bacteriana da microbiota tende a assumir relativa estabilidade de seus componentes, similar ao encontrado em equinos adultos. Neste período, estão em maior abundância

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os microorganismos dos Filos Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Synergistetes, Spirochaetes, Fibrobacteres, Tenericutes, Planctomycetes e Euryarchaeota (Torre et al., 2019). A abundância de Firmicutes e Bacteroidetes permanece alta mesmo no momento do desmame (Torre et al., 2019). Foi o mesmo encontrado por Bianconi (2019), além de ter observado um aumento das populações de Fibrobacteres, Cyanobacteria, Spirochaetes e Verrucomicrobia. Os animais ao desmame apresentaram uma maior quantidade de Bacteroidetes em relação aos outros momentos e uma queda em Proteobacteria. Foi o único momento em que a proporção Spirochaetes:Verrucomicrobia foi menor. Em equinos adultos, o estabelecimento da população microbiana varia de acordo com as diferentes regiões que compõem o trato gastrointestinal. A estrutura e composição da microbiota variam de acordo com o genótipo do indivíduo, mas o principal fator responsável pela variação é a dieta (Morrison et al., 2018). O estômago de equinos, tradicionalmente considerado desfavorável ao crescimento de microorganismos, abriga, de fato, uma variedade de bactérias anaeróbias. Os Filos Firmicutes (gêneros Lactobacillus, Streptococcus e Sarcina), Proteobacteria (gêneros Actinobacillus e Moraxella) e Bacteroidetes (gêneros Prevotella e Porphyromonas) são os mais abundantes na mucosa gástrica (Perkins et al., 2012; Costa et al., 2015), não havendo diferenciação entre as regiões glandular e aglandular do estômago (Ericsson et al., 2016). Acredita-se, ainda, que existam microorganismos com especificidade de hospedeiro, como L. salivarius, L. crispatus, L. reuteri, L.agilis, que são espécies não encontradas na mucosa gástrica de ratos (Yuki et al., 2000). Ao contrário do que se pensava originalmente, Helicobacter spp não está presente em abundância na mucosa gástrica de equinos hígidos (Perkins et al., 2012). Similar ao que ocorre no estômago, predominam Lactobacillus spp e Streptococcus spp no Intestino Delgado, o que pode estar associado à seleção de bactérias pelo pH e enzimas digestivas característicos desta região do trato gastrointestinal (Costa et al., 2015). O Intestino Grosso dos equinos compreende a maior diversidade da população microbiota no organismo, visto ser o principal compartimento de fermentação do alimento volumoso ingerido. O ceco e o cólon abrigam menos de 2% de microorganismos da classe Bacilli, enquanto a classe Clostridia representa mais de 85% destes. Além disso, ocorre um aumento das famílias Lachnospiraceae e Ruminococcaceae, relacionadas à saúde da mucosa gástrica, e do Filo Fibrobacteres. Os microorganismos mais abundantes correspondem às bactérias presentes nos Filos Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria e Verrucomicrobia,

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sendo a proporção de cada variável de acordo com as características de criação (alimentação, ambiente, características individuais de raça), além de diferenças entre técnicas metodológicas para identificação dos agentes (Ericsson et al., 2016). As informações acerca da população protozoária são limitadas, mas acredita-se que estes agentes têm alguma participação na digestão da celulose e da pectina (Dougal et al., 2012). Já os microorganismos do domínio Archaea são comumente encontrados no trato gastrointestinal de mamíferos e, dentre os de maior importância, destaca-se os metanogênicos, sendo representado pelo Methanobrevibacter smithii em um estudo conduzido por Dougal et al. (2012). A composição e diversidade fúngica ao longo do trato gastrointestinal ainda não estão totalmente elucidadas, embora já tenham sido identificados Phycomycetes (Orpin et al., 1981) e a espécie Piromyces citronii (Orpin, 1981; Julliand et al., 1999) no ceco de equinos. Os fungos também estão distribuídos ao longo do trato gastrointestinal, sendo o cólon ventral direito (Mura et al., 2018) e o cólon dorsal direito (Dougal et al., 2012) os locais de maior concentração de fungos anaeróbios e o cólon ventral esquerdo e reto os locais de menor predominância fúngica (Mura et al., 2018). No entanto, apesar de identificar alguns gêneros de fungos, os resultados do estudo conduzido por Mura et al., (2018) devem ser conduzidos com cautela, visto que foi utilizado apenas um animal, após eutanásia, no estudo, o que poderia não ser representativo de outros animais.

EFEITO DA ALIMENTAÇÃO SOBRE A MICROBIOTA O impacto da alimentação sobre a microbiota do trato gastrointestinal de equinos se deve tanto aos alimentos disponibilizados quanto à frequência e à quantidade de oferta dos mesmos. A microbiota, que pode ser muito diversa entre indivíduos, tem alta capacidade de resposta a alterações na dieta e percebe-se que a abundância de certas famílias e gêneros de bactérias varia de acordo com os componentes da mesma (Fernandes et al., 2014). Dietas utilizando apenas volumoso, quando alteradas de maneira abrupta para outro tipo de forragem de características similares, não apresentam impacto a curto e longo prazo sobre populações bacterianas fibrolíticas do ceco ou do cólon ventral direito. Inclusive, mesmo quando a troca foi relacionada ao processo de conservação, não houve diferença nos casos em que a planta utilizada era a mesma. Já nas mudanças de dietas com base volumoso para base concentrado, as alterações de microbiota são consideráveis (Julliand & Grimm, 2017). Os carboidratos hidrolisáveis são encontrados em altas quantidades nas dietas atuais de equinos com o uso de alimentos concentrados, embora estes não tivessem tanto acesso na vida selvagem. Esse fato leva a uma necessidade de

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adaptação da digestão dos mesmos e da absorção dos compostos formados no intestino delgado. Estudos sugerem que essa adaptação em cavalos é lenta, portanto eles teriam maior propensão a disfunções intestinais. Isto porque a sobrecarga de carboidratos hidrolisáveis acaba não sendo compensada e estes chegam ao intestino grosso, onde são utilizados por microrganismos (Shirazi-Beechey, 2008). A alimentação apenas com forragens de alta energia mostra maior estabilidade microbiana e redução de bactérias produtoras de ácido láctico quando comparada a uma dieta com inclusão de concentrado. Membros do complexo Streptococcus bovis/equinus aumentam com o uso de concentrado e estão relacionados a desordens gastrointestinais (Willing et al., 2009). Os alimentos concentrados levam a maiores quantidades de populações de Lachnospiraceae, Bacteroidetes e grupos de Bacillus–Lactobacillus–Streptococcus (BLS). Lachnospiraceae inclui microrganismos fibrolíticos e sacarolíticos como Clostridium spp., Butyrivibrio spp., Ruminococcus spp. e Eubacterium spp., enquanto que os Bacteroidetes são predominantemente sacarolíticos. Ambos os grupos têm grande adaptação a alterações dos substratos da dieta. Os grupos BLS se favorecem de substratos capazes de serem fermentados e produzem bastante ácido láctico e gás carbônico (Daly et al., 2012). O concentrado também gera picos de produção de ácidos graxos de cadeia curta pós-prandial, diminui a produção de acetato e aumenta de propionato no ceco. O pH do ceco também cai de maneira abrupta em 3 horas, o que não acontece no uso exclusivo de volumoso, o qual apresenta queda de forma constante (Hansen et al., 2015). Ainda, é normal que ocorram oscilações de curto prazo na população microbiana cecal de cavalos saudáveis em resposta à refeição (Hansen et al., 2013). O amido, base da maioria dos concentrados utilizados na alimentação de equinos, influencia a comunidade microbiana conforme a quantidade oferecida e a fonte utilizada. Altas quantidades aumentam o número de bactérias amilolíticas e diminuem o de celulolíticas (Harlow et al., 2016). Foi sugerido que a quantidade de amido por refeição deve ser limitada em 1-1,5 g/kg de peso corpóreo do equino para evitar distúrbios digestivos (Geor, 2010). Porém, deve-se ainda atentar à origem desse amido, pois quando se utiliza milho ao invés de aveia como fonte, por exemplo, o aumento de amilolíticas é muito maior e há diminuição de lactobacilli e aumento de cocos gram-positivos, principalmente streptococci. Assim, as enzimas digestivas têm menor ação sobre o amido do milho do que da aveia (Harlow et al., 2016). O processamento do grão também parece influenciar o comportamento das populações bacterianas. Animais que receberam grão de cevada moída tiveram menor pH, contagem de bactérias celulolíticas e taxa [(acetato+butirato)/

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propionato] quando comparados com aqueles que receberam os grãos peletizados ou floculados. Assim, processamentos termo-mecânicos poderiam limitar o impacto negativo do amido (Julliand & Grimm, 2017). A frequência e o tamanho da refeição foram avaliados por Venable et al. (2017), que utilizaram animais com fístula de ceco em três tratamentos com ração fornecida uma, duas ou três vezes ao dia, sendo que a quantidade por refeição foi diminuída conforme o aumento da frequência de fornecimento. O número de refeições não influenciou a variedade de espécies de microrganismos presentes no ceco. Contudo, junto à quantidade de alimento, a frequência afetou a composição e a abundância da microbiota. Streptococcus spp. se manteve mais estável no tratamento com 3 fornecimentos em comparação a apenas um arraçoamento diário, mostrando vantagem já que está relacionada à produção de ácido láctico e à ocorrência de laminite. S. bovis, muito associada à acidose no gado e laminite em equinos, apresentou um pico 6 horas pós-prandial no tratamento com apenas uma refeição, assim como Lactobaccilus spp. Maior número de refeições diminuiu os gêneros Prevotella e Coprococcus e aumentou YRC22 e Phascolarctobacterium (Venable et al., 2017).

MICROBIOTA X DOENÇAS A microflora residente regula o desenvolvimento epitelial e tem um papel chave nas respostas imunes. Quando ocorre disfunção da barreira e alteração da permeabilidade intestinal, pode ocorrer doença. Em certas condições, organismos normalmente simbióticos do TGI, que possuem potencial patogênico, podem ativar o sistema imune e levar à inflamação. Tem-se, nesses casos, um quadro de disbiose instalado, o qual leva à alteração dos metabólitos, detrimento das populações microbianas e alteração do ambiente luminal (Stewart et al., 2017). Dietas com altos teores de amido, como previamente apresentado, podem alterar a microbiota e levar a consequências locais e sistêmicas. Destrez et al. (2015) observaram alterações imunológicas e comportamentais em cavalos com cânulas em ceco recebendo dieta com altos níveis de amido. Os animais apresentaram aumento do número de granulócitos, caracterizando um quadro de estresse alimentar. Essa condição levou também à diminuição do tempo de alimentação e ao aumento do tempo em descanso. Foi possível correlacionar tempo de vigilância e neofobia a novos objetos às concentrações de bactérias amilolíticas. Além disso, o consumo de alimentos contaminados por micotoxinas também pode ocasionar mudanças no microbioma. As micotoxinas são muito nocivas para os animais e podem alterar funções intestinais normais, como o desempenho como

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barreira e a absorção de nutrientes. Em equinos, essas intoxicações são de extrema relevância, pois muitos animais vão a óbito após o aparecimento dos primeiros sintomas, sendo a toxina mais relevante para esta espécie produzida pelo fungo Fusarium moniliforme (Zain, 2011). Um fato observado é que ocorre uma interação das micotoxinas com a microbiota residente, sendo que alguns microrganismos conseguem metabolizar ou se ligar a elas. Micotoxicoses crônicas podem ocorrer pelo distúrbio da microbiota do trato gastrointestinal, ou seja, maiores quantidade destes compostos fúngicos podem estar mais ou menos biodisponíveis conforme a saúde do TGI. A administração de probióticos nesses casos pode favorecer positivamente o hospedeiro, diminuindo a severidade do quadro ao regular novamente o microbioma (Liew & Mohd-Redzwan, 2018). Desequilíbrios da microbiota podem levar ainda a outras situações, como o caso do desenvolvimento de colites. A colite em equinos sempre foi muito relacionada à proliferação de bactérias patogênicas como Clostridium difficile, Salmonella spp., Clostridium perfringens e Neorickettsia risticii, porém, na maioria dos casos, não ocorria identificação do agente. Atualmente, percebe-se que a disbiose parece ser realmente o fator determinante para o desenvolvimento do quadro. Animais saudáveis apresentam o filo Firmicutes como predominante (68,1%), seguido por Bacteroidetes (14,2%) e Proteobacteria (10,2%). Animais com colite tiveram como filo predominante Bacteroidetes (40%), seguido por Firmicutes (30,3%) e Proteobacteria (18,7%). A abundância de Actinobacteria e Spirochaetes é maior em animais saudáveis, enquanto que aqueles com colite apresentam Fusobacteria em maiores quantidades (Costa et al., 2012). Outra doença relacionada à microbiota do TGI é a Equine Grass Sickness (EGS) ou Disautonomia Equina. EGS é uma disautonomia, ou seja, uma doença neurológica com degeneração seletiva do sistema nervoso autônomo, que ocorreria em cavalos, aparentemente, pela presença de C. botulinum tipo C. Ocorre estase intestinal e o animal pode apresentar sintomas agudos, subagudos ou crônicos, resultando em óbito. A quantidade de bactérias aeróbias e anaeróbias presentes nesses animais aparece aumentada e o número de Clostridia também aumenta de forma proeminente (Garret et al., 2002). Recentemente, o desenvolvimento de EGS foi relacionado à disbiose pelo uso da técnica de sequenciamento 16S rRNA em fezes. Assim como na colite, os filos Bacteroidetes e Proteobacteria aparecem aumentados e Firmicutes, diminuído. Contudo, animais doentes apresentaram diminuição das ordens Clostridia e aumento de Fusobacteria. Além disso, os cavalos afetados têm menor diversidade bacteriana e maior variação das populações presentes. A menor diversidade leva a

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uma menor capacidade da microbiota residente em eliminar outros microrganismos por competição, favorecendo a proliferação de bactérias patogênicas (Leng et al, 2018). Por fim, alterações no metabolismo do hospedeiro impactam também no comportamento e equilíbrio dos microrganismos do TGI. A síndrome metabólica em equinos (SME) é caracterizada por aumento da adiposidade, hiperinsulinemia e resistência à insulina e está muito associada ao desenvolvimento de laminite (Frank, 2011). Cavalos com SME apresentam alterações na microbiota, assim como já havia sido relatado em humanos com síndrome metabólica. A diversidade microbiana é menor, a estrutura da comunidade é diferente e há menor quantidade de Fibrobacter (Elzinga et al., 2016).

MODULAÇÃO DA POPULAÇÃO MICROBIANA A microbiota intestinal equina tem trilhões de microrganismos. Avanços na compreensão da interação desses organismos têm o potencial de levar a uma profundidade sem precedentes e amplitude de informação sobre a natureza do microbioma intestinal, fatores que o influenciam, a relevância clínica das alterações do mesmo, e por fim, maneiras de aproveitar o microbioma intestinal para prevenção ou tratamento da doença (Costa et al.,2012). Estresse e medicamentos podem alterar as populações microbianas, levando à diminuição da saúde, além da dieta como previamente abordado neste capítulo (Barnhart, 2015). White e Prior (1982) não encontraram alterações com o uso de trimetoprim-sulfadiazina na contagem de coliformes fecais. Já a administração de oxitetraciclina foi rapidamente seguida por grandes aumentos na contagem de coliformes, espécies de Bacteroides e Streptococcus, desaparecimento de espécies de Veillonella e aparecimento de Clostridium perfringens “tipo A” em grandes quantidades. Entretanto, Gustafsson et al. (1999) estudaram o efeito de trimetoprim-sulfadiazina na população microbiana fecal e observaram influência mínima no número de estreptococos fecais, bacteroides e Veillonella, ao contrário da contagem de coliformes, que apresentou uma diminuição de 10 vezes. Em equídeos, os probióticos são utilizados para tentar estabelecer um equilíbrio desejável entre os microrganismos intestinais, principalmente aqueles benéficos. Atualmente, vários microrganismos são usados como probióticos, sendo os mais comuns os dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, além das leveduras vivas como Saccharomyces cerevisiae (Oiticica et al., 2007). O benefício do uso de probiótico para equinos foi observado através da redução de sintomas de enterocolite constatada em um grupo de animais que

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receberam Saccharomyces boulardiivivas, em comparação a um grupo de animais que receberam um placebo (Desrochers et al., 2005). Taran et al. (2016), avaliando a adição de quantidades crescentes de leveduras vivas de Saccharomyces Cerevisiae (0, 10, 20 e 30g/animal/dia) em dieta de equinos com relação volumoso:concentrado 70:30, detectaram efeito sobre a digestibilidade aparente de da matéria orgânica, proteína bruta, fibra detergente neutra e fibra detergente ácida. Foi sugerido que a levedura interfere na digestão de dietas de alto teor de concentrado, devido à maior disponibilidade dos componentes para a digestão microbiana. Porém, pouco se sabe das alterações causadas pelos probióticos na microbiota intestinal equina. A oligofrutose, um polímero de frutose com propriedades prebióticas, foi avaliada por Milinovich et al. (2008) que relataram resultados prejudiciais no seu uso. Crescentes quantidades de bactérias do gênero Streptococcus spp. foram detectadas momentos antes dos primeiros sinais de laminite em cavalos, causada pelo elevando nível de lactato decorrente da degradação de oligofrutose no ceco.Weese et al. (2005) e Schoster et al (2015) identificaram um impacto negativo dos probióticos em potros neonatos, levantando preocupações. Além disso, estudos com probióticos bem-sucedidos, frequentemente, envolveram distúrbios inflamatórios, não infecciosos. Schoster et al. (2016) ao investigarem os efeitos dos Lactobacillus spp na microbiota de potros durante e após a administração do probiótico, não observaram alteração de filo, ordem ou classe entre os grupos de tratamento em qualquer idade. A administração de probióticos não resultou em uma abundância relativa aumentada de lactobacilos ou bifidobactérias em qualquer lugar. Concluíram que lactobacilos e bifidobactérias utilizados para essa função tem um potencial limitado para modificação terapêutica da microbiota gastrointestinal. Bianconi (2019), em experimento no LabEqui, ao oferecer uma dieta individualizada e balanceada para éguas nos três meses anteriores à data prevista do parto, observou alteração na quantidade da bactéria Phascolarctobacterium faecium, conforme ilustrado na Figura 2. Ocorreu um aumento significativo após o ajuste da alimentação nos cinco dias antes da data prevista do parto, com uma queda após o desmame, mas ainda assim com valores superiores ao período pré-suplementação. Metade dessas éguas foram suplementadas com 10g de levedura viva protegida Saccharomyces Cerevisiae (Actisaf HR Plus Sc 47®) no terço final da gestação, mas não apresentaram diferença em relação às éguas do grupo controle.

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Figura 2. Quantidade da bactéria Phascolarctobacterium faecium em éguas gestantes antes de receberem alimentação individual e balanceada e serem divididas nos grupos controle e tratado com levedura viva protegida Saccharomyces Cerevisiae (01_PRE_SUP), 5 dias antes da data prevista do parto (02_PRE_PAR) e 3 dias após o desmame (03_POS_DESM) pela técnica de sequenciamento 16S rRNA (Bianconi, 2019).

Phascolarctobacterium é uma bactéria que utiliza succinato e pode produzir ácidos graxos de cadeia curta, incluindo acetato e propionato. É gram-negativa, anaeróbia estrita e não formadora de esporos, pertencente ao filo Firmicutes. Phascolarctobacterium faecium apresenta alta colonização e é abundante no TGI de humanos entre 1 e 60 anos, sendo que sua taxa de colonização pode variar de 43,33 a 93,33%. Menores quantidades desse microrganismo estariam relacionadas a doenças digestivas e metabólicas (Chumpitazi et al., 2014; Wu et al., 2017). Somado ao efeito benéfico dessa bactéria em humanos, distúrbios gastrointestinais que levam a quadros de cólicas são problemas importantes em éguas no pós-parto e alterações metabólicas e hormonais durante a gestação afetam as comunidades microbianas. A microbiota de éguas no terço final de gestação se mostra diferente daquela de animais não gestantes com alterações na estrutura e nos membros da comunidade, mas sem modificação do filo predominante. Além disso, éguas que desenvolveram cólica no pós-parto apresentaram abundância relativa de Firmicutes menor que 50% e aumento de Proteobacteria (Weese et al., 2015). Assim, o aumento de Phascolarctobacterium faecium após o balanceamento da dieta de éguas em terço final de gestação pode ser considerado benéfico, já que se trata de um membro do filo Firmicutes ligado à microbiota de indivíduos saudáveis (Bianconi, 2019).

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DESAFIOS E PERSPECTIVAS FUTURAS A integração de metagenômica e metabolômica tem sido uma ferramenta poderosa na tentativa de melhorar a eficiência alimentar em animais de produção, por exemplo, identificando espécies bacterianas relacionadas à maior produção de ácidos graxos de cadeia curta que podem ser convertidos em energia (Ogunade et al., 2018; Zhang et al., 2017) ou fenótipos que expressam caminhos relacionados ao melhor desempenho (Novais et al., 2019). À medida que o custo e a complexidade das análises diminuem, é provável que esses métodos se tornem muito mais comuns nos próximos anos. Além disso, os próprios metabólitos podem ser usados para melhorar a saúde intestinal (Costa & Weese, 2019). Em resumo, clínicos e pesquisadores devem estar cientes das limitações de cada um dos métodos disponíveis para estudos de microbiota e escolher cuidadosamente qual método é mais adequado para suas pesquisas. A falha mais frequente atualmente observada é o uso de NGS para classificação taxonômica, alegando que as espécies bacterianas são responsáveis pelas alterações observadas. É importante ter em mente que a grande maioria dos estudos utiliza tecnologias que não permite tais conclusões, pois fornece baixa resolução para classificação no nível de espécie (Costa & Weese, 2019). Além disso, o NGS fornece apenas resultados descritivos e, muitas vezes, uma causalidade não pode ser inferida para esses estudos. Isso também é muito importante para os leitores considerarem ao interpretar as declarações encontradas em vários estudos. Portanto, o NGS é adequado para a detecção de alterações que ocorrem em níveis taxonômicos mais altos e fornece tendências que podem justificar ensaios clínicos ou estudos posteriores usando metodologias mais específicas. A nova capacidade de caracterizar comunidades microbianas melhorou tremendamente nas últimas duas décadas. Os esforços agora devem se concentrar em como usar essas novas tecnologias para melhorar as estratégias de diagnóstico, prevenção e tratamento para melhorar o bem-estar e o desempenho dos animais (Costa & Weese, 2019).

CONSIDERAÇÕES FINAIS Os estudos deixam claros os impactos individuais e ambientais sobre o microbioma equino e como podem afetar a saúde do hospedeiro. A modulação do mesmo parece limitada em cavalos saudáveis, por conta de uma provável estabilidade. Contudo, o uso em animais jovens e doentes tem grande potencial, já que a microbiota encontra-se em estabelecimento ou alterada, devendo ser mais pesquisado. O bem-estar e o desempenho dos equinos podem ser aumentados com essas informações.

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AGRADECIMENTOS Agradecemos a toda equipe do Laboratório de Pesquisa em Saúde Digestiva e Desempenho de Equinos – LABEQUI: professores, pós-graduandos, alunos de iniciação científica, estagiários e funcionários pelo apoio durante o desenvolvimento dos experimentos; à agência financiadora CAPES, pelas bolsas concedidas; e à empresa Phileo Lesaffre – Animal Care pelo financiamento do projeto de Camila Bianconi e apoio.

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CAPÍTULO IIINCLUSÃO DE BAGAÇO DE CEVADA COMO FONTE DE FIBRA DIETÉTICA

PARA LEITÕES DESMAMADOS

Maitê V. Mendonça¹, Sofia N. S. Ramos¹, Denis H. Nakasone¹, Matheus P.

Martins¹, Ana C. Pedrosa¹, André F. C. Andrade¹, Simone M. M. K. Martins²

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga/SP²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo,

Pirassununga/SP

RESUMOOs leitões recém-desmamados apresentam reduzida digestibilidade de nutrientes pela falta de maturidade do sistema digestório frente à dieta sólida, levando à redução na absorção dos mesmos, e consequentemente diarreia e queda no desempenho. Na alimentação de animais não ruminantes, a suplementação de fibras dietéticas se torna cada vez mais comum, com o objetivo de modular a microbiota intestinal, sendo mais uma estratégia para mitigar os problemas relacionados ao desmame de leitões. A fibra dietética melhora a saúde intestinal dos leitões, potencializa a capacidade absortiva e por consequência o desempenho, além de ser uma alternativa pouco onerosa para os produtores de suínos. O principal atrativo para o uso dessas fibras nas dietas de leitões desmamados é o custo reduzido, contudo os estudos apresentam os resultados ainda são controversos, sendo necessário mais estudos sobre os efeitos da inclusão de fibras dietéticas na dieta de leitões desmamados sobre o desempenho e a frequência de dias com diarreia.

INTRODUÇÃO O consumo mundial de carne suína aumentou intensamente nas últimas décadas, e, sob uma perspectiva global, nota-se ainda um potencial de crescimento futuro. Espera-se que a economia global continue a crescer, consequentemente, a demanda por proteína de origem animal, em especial a carne suína irá aumentar na maioria dos países, conforme demonstrado pelo USDA (2018). Para atender essa crescente demanda é imprescindível que as criações de suínos se tornem mais eficientes, com melhores índices reprodutivos e produtivos. Essas melhorias podem ser obtidas por meio do avanço no manejo, no melhoramento genético, no bem-estar animal, no manejo sanitário e na nutrição.

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Dentre os custos de produção na suinocultura, destaca-se que aproximadamente 70% está relacionada a nutrição (ABCS, 2014), representando uma parcela com potencial de economia muito ampla, no qual pequenas alterações podem culminar em grandes resultados. Assim, é interessante que se avalie a possibilidade do uso de alimentos alternativos nas dietas de suínos, uma vez que os gastos com a nutrição impactam fortemente os custos de produção (Fialho, 2009). Neste cenário, os coprodutos industriais parecem ser altamente rentáveis, pois apresentam baixo valor de compra e grande potencial nutricional. Os alimentos industrializados destinados ao consumo humano que por algum motivo são descartados, por estarem quebrados, queimados, amassados ou fora do prazo de validade, são interessantes por serem constituídos de farinha de trigo, milho, açúcar e óleo vegetal, que são digeridos e absorvidos pelos suínos, contribuindo para a redução do impacto ambiental (Volpato et al., 2014). Os coprodutos industriais mais utilizados na alimentação dos animais de produção são provenientes das indústrias alimentícias, porém, diversas linhas de produção ainda não são totalmente exploradas. Alguns ingredientes fibrosos tem sido mais utilizados nas dietas de leitões desmamados, tais como farelo de alfafa, casca de cevada, fibra de batata, casca de leguminosa, casca de aveia, farelo de cereal, palha e celulose purificada, polpa de beterraba desidratada, polpa cítrica, farelo de aveia e inulina (Molist et al., 2014). As cervejarias possuem coprodutos que ainda são pouco destinados à alimentação animal, como por exemplo o bagaço de cevada, um produto fibroso de alto valor nutricional. Em ruminantes, a utilização do bagaço tem sido bem explorada, mas em monogástricos poucos estudos foram desenvolvidos. Esses coprodutos apresentam grande potencial, pois são produzidos em grande volume, podem ser adquiridos em qualquer época do ano e a baixo custo, além disso, podem resultar em impactos ambientais, quando são encaminhados indevidamente para a natureza (Ferrinho et al., 2013). Dessa maneira, o uso do bagaço de cevada proveniente das cervejarias representa uma alternativa sustentável que poderá proporcionar redução no custo da produção para suínos e aves ao substituir parcialmente o milho e a soja. Aliado a isso, a inclusão deste material na dieta de suínos pode favorecer melhor desempenho e saúde intestinal dos animais e contribuir para a redução do impacto ambiental.

LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS Após o desmame, os leitões sofrem mudanças intestinais fisiológicas, microbiológicas e imunológicas, caracterizando o período pós-desmame com alta

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incidência de diarreia e queda do desempenho, devido a fatores estressantes ambientais, nutricionais e psicológicos (Heo et al., 2013). Dentre os fatores estressantes, tem-se a interrupção abrupta da interação social com a mãe e a leitegada (Heo et al., 2013), mudança de espaço físico, mistura de lotes (Lalles et al., 2004), substituição do leite da porca (este possui fatores intrínsecos, tais como a imunoglobulina A, o fator de crescimento epidermal, as poliaminas e a glutamina), o consumo das dietas (Pluske et al., 1997), o tipo de processamento do alimento e a forma física da ração e a imaturidade imunológica (Li et al., 1990). As alterações do ponto de vista social, ambiental e nutricional decorrentes do desmame resultam em um período crítico de baixa ingestão de alimento, conhecido como anorexia pós-desmame, que ocasionam uma queda transitória na secreção de enzimas digestivas, seguido pela recuperação (Marion et al., 2003), durante o qual a digestibilidade e absorção de alimentos encontra-se diminuída. Associado a esse processo, o estresse provocado pelo desmame leva ao desequilíbrio da microbiota intestinal, podendo predispor ao crescimento exacerbado de bactérias oportunistas que podem produzir enterotoxinas ou se instalarem nos enterócitos presentes nas vilosidades intestinais, prejudicando ainda mais a digestão e a absorção dos nutrientes, levando a hipertonicidade na luz intestinal, a retenção de água e, consequentemente à diarreia (Lalles et al., 2004). Segundo Nabuurs et al. (1993), a altura das vilosidades atinge um patamar mais baixo entre 3 e 4 dias após o desmame, se restabelecendo entre 11 a 14 dias. Os efeitos da anorexia pós-desmame sobre a secreção de enzimas digestivas e a morfometria do epitélio intestinal são multifatoriais, e incluem privação de substratos luminais para o crescimento das células da mucosa epitelial, e redução da expressão de fatores de crescimento para os órgãos digestivos, tais como o peptídeo semelhante ao glucagon 2, o fator semelhante a insulina I (IGF-I) (Vente-Spreeuwenberg et al., 2003) e a colecistoquinina (Montagne et al., 2007). Assim, a digestibilidade e a absorção de nutrientes encontram-se diminuídas nessa primeira fase após o desmame. Por conseguinte, todas essas alterações a que leitões são submetidos ao desmame, aliadas à falta de maturidade do sistema digestório destes animais frente à nova dieta sólida, causam diminuição na ingestão e absorção dos alimentos, e inevitavelmente, queda no desempenho (Lalles et al., 2004). Ressalta-se ainda que as alterações adversas da morfologia intestinal incluem redução da altura e aumento da largura das vilosidades, aumento da profundidade de cripta e redução da capacidade de absorção e da atividade das enzimas digestivas da borda em escova. Com isso, a infecção bacteriana geralmente acompanha a fase do desmame dos leitões limitando o crescimento destes (McCracken et al.; 1999; Ma et al., 2015).

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Com relação à infecção bacteriana, ocorre aumento da adesão de bactérias patogênicas à camada mucosa, devido à falta de imunidade ativa e os danos na integridade intestinal, ocasionando a síndrome da diarreia pós-desmame e queda no desempenho. Dentre as bactérias, a E. coli, além de ser habitante natural do trato gastrointestinal, também é usualmente associada às diarreias pós-desmame, sendo a cepa E. coli enteropatogênica a mais frequente (Arantes et al., 2005). Esta bactéria determina sério impacto à suinocultura por se envolver no desenvolvimento das diarreias pós-desmame associadas à má absorção de nutrientes (Silva et al., 2015). Portanto, intervenções dietéticas que minimizem os prejuízos causados pela síndrome diarreica e queda do desempenho na fase do desmame se tornam essenciais no sistema de produção de suínos. De acordo com Pascoal et al. (2012), alguns ingredientes como derivados lácteos e ingredientes de origem animal podem ser utilizados na dieta de leitões para promover a saúde intestinal, porém possuem elevado custo financeiro. Além disso, com a restrição do uso de antimicrobianos como promotores de crescimento na produção animal, torna-se essencial a busca por alternativas que possam contribuir para uma atividade eficiente do trato gastrointestinal e desempenho dos animais. Nesse sentido, a suplementação com fibras dietéticas é uma estratégia importante desenvolvida para aliviar problemas de saúde de leitões desmamados (Flis et al., 2017).

carboidratos, a maior parte da energia é proveniente dos carboidratos de origem vegetal. De todos os carboidratos, apenas os monossacarídeos são absorvidos no intestino delgado dos suínos, devido a ação das enzimas digestivas nas ligações glicosídicas para a liberação dos monossacarídeos. No entanto, essas enzimas são capazes de atuar em uma quantidade limitada de ligações glicosídicas, não havendo a digestão enzimática de muitos carboidratos. Os carboidratos restantes podem sofrer fermentação microbiana no intestino delgado assim como no intestino grosso, resultando na produção e absorção de ácidos graxos de cadeia curta (NRC, 2012). Os carboidratos presentes nos ingredientes da dieta podem ser analisados por meio de diversos procedimentos, sendo obtidos diferentes componentes específicos (Figura 1). Os monossacarídeos geralmente podem ser analisados por meio de cromatografia líquida enzimática ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Já os dissacarídeos, oligossacarídeos e amido podem ser analisados por procedimentos enzimático-gravimétricos. E os polissacarídeos não amiláceos

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podem ser avaliados por diversos procedimentos diferentes (NRC, 2012).

A fibra dietética tem composição diversificada e pode ser encontrada nos cereais, tubérculos e coprodutos agroindustriais. Apesar de alguns efeitos adversos na digestibilidade de nutrientes e de energia, há um crescente interesse na inclusão das fibras nas dietas de animais monogástricos devido aos potenciais efeitos benéficos na saúde intestinal e imunológica, no bem-estar e no meio ambiente (Jha et al., 2019). Em suínos pode exercer efeito prebiótico, equilibrando a microbiota intestinal com controle da proliferação de microrganismos patogênicos e aumento de bactérias simbióticas. Esta mudança resulta em melhoria da saúde, potencializando a capacidade digestiva, absortiva e o desempenho. Contudo, a fibra dietética apresenta desafios em sua utilização, com melhores resultados sendo obtidos em determinados níveis de inclusão, o que demanda conhecimento e pesquisas antes de sua aplicação (Jha & Berrocoso, 2015).

Fonte: Adaptado de NRC (2012).

Figura 1. Categorias de carboidratos da dieta com base nos métodos analíticos

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Coprodutos das agroindústrias são as fontes de fibra mais populares. Os produtos fibrosos diferem no conteúdo de polissacarídeos não amiláceos que, juntamente com a lignina, compõem a fibra alimentar. No que diz respeito à sua atividade fisiológica no trato gastrointestinal de animais monogástricos, os alimentos fibrosos são classificados em grupos, dependendo de fornecerem principalmente fibras insolúveis ou solúveis (Flis et al., 2017), que diferem entre si quanto ao efeito exercido pela sua ingestão. As fibras dietéticas influenciam processos de digestão e absorção ao longo do trato gastrointestinal (Figura 2), fornecem substrato para a fermentação pela microbiota do intestino grosso (Knudsen, 2009) e possuem propriedades físicas como a capacidade de absorver e reter a água, a viscosidade e a solubilidade da digesta, consequentemente afetam a digestão, a saciedade e o tempo de trânsito intestinal (Jarrett & Ashworth, 2018). Nos diferentes segmentos do trato digestório dos suínos, as fibras solúvel e insolúvel podem apresentar diferentes efeitos como demonstrado na Tabela 1.

Fonte: Fonte: Autoria própria, adaptado de Knudsen (2009).

Figura 2. Influência das fibras dietéticas nos processos de digestão e absorção nos vários segmentos do trato gastrointestinal.

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Tabela 1. Principais efeitos da fibra solúvel e insolúvel nos diferentes segmentos do trato digestório dos suínos

- menor influência, + maior influência.Fonte: Adaptado de Wenk (2001), Knudsen (2001) e Pascoal & Watanabe (2014).

As fibras solúveis são fermentadas no cólon para produzir gases e coprodutos fisiologicamente ativos, como as pectinas, ‐-glucanos e hemiceluloses, que aumentam a viscosidade do sistema gastrointestinal e possuem maior fermentabilidade. A viscosidade do trato gastrointestinal limita a interação dos nutrientes com enzimas, criando uma superfície aquosa na mucosa que age como barreira física impedindo a total digestão e absorção destes nutrientes (Mariscal-Landin et al., 1995; Gallaher et al. 1999; Molist et al. 2013; Jha & Berrocoso, 2015). Em acréscimo, a viscosidade aumenta a proliferação das células epiteliais intestinais, altera a morfologia das microvilosidades da mucosa, ocasionando aumento da profundidade das criptas intestinais (Gee et al., 1996; Schmidt-Willing et al. 1996; Schiavon et al., 2004). Além disso, o aumento da viscosidade luminal prolonga o esvaziamento gástrico (Knudsen, 2009). Já as fibras insolúveis são metabolicamente inertes e fornecem volume à dieta, como a celulose e lignina, que aumentam a velocidade do fluxo de passagem do alimento no trato, possuem efeito laxativo e fornecem substrato que pode ser lentamente degradado pela microbiota do intestino grosso distal (Davidson & McDonald, 1998; Knudsen, 2001; Freire et al., 2000). Ainda há controversas sobre o melhor tipo de fibra dietética a ser fornecido para os animais. Para algumas linhas de pesquisa, a saúde intestinal pode se beneficiar mais de dietas contendo fibras solúveis do que insolúveis (Wellock et al., 2007). Outros autores sugerem que a digestão do material fibroso depende do

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tempo que este é exposto à fermentação, logo a propriedade laxativa das fibras insolúveis poderia prejudicar seu aproveitamento energético (Wilfart et al., 2007). Porém, Molist et al. (2013) demonstram os benefícios da inclusão de fibras insolúveis nas primeiras semanas após o desmame de leitões. Foi observado que o consumo das fibras reduziu a incidência de diarreia e modificou as propriedades físico químicas no trato gastrointestinal dos animais, resultando em aumento da capacidade fermentativa e bloqueio da adesão de bactérias patogênicas na mucosa. As fibras podem diminuir a prevalência de doenças como refluxo gastroesofágico e úlcera peptídica (Burkitt & Trowell, 1975; Otles & Ozgoz, 2014), podem aumentar a atividade de enzimas digestivas, como a lipase pancreática, dipeptídeo peptidase IV, N-aminopeptidase e fosfatase alcalina (Lizardo et al. 1997). E recentemente, uma nova característica da fibra dietética ganhou foco no meio científico, seu efeito prebiótico. Devido à baixa digestibilidade por não ruminantes, a fibra dietética ingerida fica disponível para fermentação por bactérias da microbiota gastrointestinal, podendo, portanto, influenciar quantitativa e qualitativamente os microrganismos ali encontrados (Awati et al. 2005). Uma dieta rica em fibras pode aumentar até 5,5 vezes a atividade microbiana intestinal (Knudsen et al. 1991), e diferentes tipos de carboidratos incluídos estimulam o crescimento de espécies bacterianas específicas, que colonizam o meio em detrimento de outras (Williams et al. 2001). Em estudo de Drew et al. (2002), foi demonstrado queda na população de Enterobacteria e aumento de Lactobacillus spp. no íleo de suínos alimentados com dieta rica em cevada. Tal resultado é positivo para a saúde intestinal dos animais, pois Enterobacterias incluem muitos patógenos para leitões desmamados, enquanto Lactobacillus são conhecidas como bactérias simbióticas. Resultado semelhante foi encontrado por Konstantinov et al. (2004), no qual foi observado aumento de Lactobacillus na dieta enriquecida com fibras. Porém, a inclusão de fibras para suínos deve ser estudada e controlada, pois substratos de má qualidade e em taxas de inclusão desequilibradas podem se tornar maléficas para a saúde do animal. Além disso, outra questão importante a ser estudada é a idade dos animais suplementados, pois à medida que os animais se desenvolvem o trato digestório passa por diversas mudanças anatômicas e fisiológicas, interferindo na forma que os componentes alimentares são digeridos e absorvidos. Suínos adultos apresentam trato gastrointestinal maior, com velocidade de trânsito alimentar menor e menos consumo de alimento por quilo de peso vivo, o que em conjunto confere uma maior capacidade digestiva que a de animais jovens (Shi & Noblet, 1993; Le Goff et al., 2002), e ainda, porcas adultas também apresentam maior capacidade de digerir fibras insolúveis em relação a leitões, enquanto que as fibras solúveis não

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apresentam diferenças na digestão dos animais (Jørgensen et al., 2007).

RESÍDUO DE CERVEJARIA COMO FONTE DE FIBRAS Entre as diversas fontes de fibras que podem ser fornecidas a animais de produção, algumas se destacam pelo seu baixo custo, como os coprodutos da indústria cervejeira. O bagaço de cevada – também chamado de bagaço de malte ou polpa úmida de cervejaria – é oriundo da extração do mosto de cerveja e é muito utilizado para alimentação de ruminantes devido ao seu teor de fibra e proteína bruta (Vieira & Braz, 2009). O uso dos coprodutos da indústria cervejeira desperta interesse devido ao seu potencial para reduzir o custo final da dieta utilizada para os leitões. Segundo Vieira & Braz (2009), uma substituição de 50% da matéria seca fornecida aos animais por MS de bagaço de cevada pode resultar em economia de até 45,96% no custo de produção, e mesmo uma inclusão menor (14,91%) já reduz em até 12,14% o preço final da criação dos leitões. Entretanto, o nível de inclusão ideal deve ser estudado e planejado, para que o seu uso beneficie economicamente o produtor (Braz, 2008). Os valores nutricionais do bagaço de cevada podem variar conforme sua origem e processamentos realizados durante seu aproveitamento na indústria cervejeira. De acordo com Vieira et al. (2013) foi possível observar variação 20 a 25% na matéria seca do bagaço de cevada. Os autores relataram que os valores de 22,96% de matéria seca, 22,23% de proteína bruta e 1223 Kcal/kg de energia bruta foram similares aos valores de Costa et al. (2006): 23,30% de matéria seca, 23,46% de proteína bruta e 1258 Kcal/kg de energia bruta. Quanto à fibra bruta presente no bagaço de cevada, foi obtido valor de 14,73% no estudo de Vieira et al. (2013), enquanto Gomes et al. (2004) relataram valor de 20% para a fibra bruta. Em suma, no estudo de Gomes et al. (2004) e Abreu et al. (2004), foi observado que o bagaço de cevada apresenta alto teor de umidade (aproximadamente 75%), de proteína bruta (valores em torno de 23%), energia, vitaminas e minerais e apresenta alto teor de nutrientes digestíveis totais (74%), características semelhantes às do farelo de trigo (Vieira; Braz, 2009). A cevada é uma fonte rica em fibra insolúvel, sendo em sua maioria polissacarídeos não-amiláceos, seguido pelo arabinoxilano e menores quantidades de ‐-glucanos, proporção que pode variar de acordo com a qualidade do grão (Weiss et al., 2015). Os benefícios do bagaço de cevada na dieta mostraram resposta quadrática, ou seja, ineficácia quando utilizado em menores quantidades e prejuízos quando utilizado em excesso. Em suínos de 90 kg, melhores resultados foram obtidos com a inclusão de

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7,5 e 15% de bagaço de cevada, com piora na capacidade digestiva em percentuais menores de suplementação (Vieira et al., 2010). Já em estudo de Braz (2008) foi observado em leitões de crescimento redução no consumo de ração e no ganho de peso e pior conversão alimentar para a suplementação acima de 25% da dieta com bagaço de cevada. Além da inclusão ideal, a falta de ajuste energético na dieta dos animais pode também contribuir para os resultados negativos obtidos por diversos estudos com base em fibras (Júnior Caramori et al., 2007). A cevada possui, em média 9,9% menos energia que o milho, o principal ingrediente energético fornecido a suínos (Fialho et al., 1992). Entretanto, a inclusão de fibras dietéticas para suínos de terminação pode trazer diversos benefícios, como redução de custos para a produção dos animais e melhoria da saúde gastrointestinal a partir de um efeito prebiótico. Mas ainda pouco se conhece sobre os efeitos nos leitões recém-desmamados. Deste modo, foi realizado um estudo visando averiguar os efeitos da inclusão de bagaço de cevada na dieta de leitões recém-desmamados, até os 63 dias de idade. Um estudo conduzido no Laboratório de Pesquisa em Suínos, pertencentes ao Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ-USP, Campus Pirassununga, utilizou 140 leitões recém desmamados, aos 21 dias de idade. Os animais foram alojados na unidade de creche constituída de 3 salas idênticas com 16 gaiolas de alvenaria suspensas com piso parcialmente ripado com metragem de 1,40 m2/5 leitões, composto de comedouro semiautomático e bebedouro tipo chupeta. O sistema de aquecimento da creche foi realizado por meio de lâmpadas infravermelhas visando assegurar o conforto térmico dos leitões. Os leitões foram blocados pelo peso e distribuídos em 4 tratamentos, com 35 animais por grupo. Os tratamentos consistiram na inclusão de bagaço de cevada, sendo 0, 3, 6 e 9% de inclusão. Avaliou-se o desempenho e a frequência de dias com diarreia dos 21 aos 63 dias de idade. O delineamento foi em blocos casualizados, sendo o peso considerado o bloco. E os dados foram analisados empregando-se o programa SAS (2010). As dietas experimentais foram isoproteicas e isoenergéticas e seguiram as recomendações de Rostagno et al. (2017). O bagaço de cevada foi obtido junto a cervejaria Campanária em Pirassununga, São Paulo. Imediatamente após o recebimento do bagaço, o mesmo foi congelado para interromper o processo de fermentação. Posteriormente, com o material já descongelado o mesmo foi espalhado em bandejas e mantido em estufa à 65 °C por 72 horas e, depois de seco foi moído por meio de um triturador antes de ser adicionado à ração. Durante a creche foram fornecidas as seguintes dietas: Pré-inicial (PB – 21,42%, lisina – 1,45%, EM – 3.400 kcal/kg) dos 21 aos 35 dias de idade; Inicial 1

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(PB – 19,87%, lisina – 1,35%, EM – 3.375 kcal/kg) dos 36 aos 49 dias de idade e Inicial 2 (PB – 20,55%, lisina – 1,28%, EM – 3.350 kcal/kg) dos 50 aos 63 dias de idade. A formulação dessas dietas foi semelhante para todos os tratamentos. As dietas e a água foram fornecidas ad libitum durante todo o experimento. Não houve interação para nenhuma das características de desempenho entre os tratamentos e os dias, assim como nenhuma característica de desempenho foi influenciada pelos tratamentos fornecidos (P > 0,05). Observou-se desenvolvimento dentro do esperado, considerado normal para os leitões (P < 0,05).

O estudo desenvolvido por Hermes et al. (2010) associando 2 tipos de cereais (arroz vs. cevada) e 2 níveis de fibra (baixo vs. alto, sendo considerado alto 2% de polpa de beterraba sacarina + 4% de farelo de trigo), verificou que a utilização das fibras não afetou o desempenho dos animais (P > 0,05). Os autores argumentam que existem vários estudos com melhores índices de desempenho obtidos em leitões alimentados com dietas à base de arroz em comparação com milho (Mateos et al., 2006). Ainda segundo os autores, o nível moderado de suplementação de fibra utilizada por eles não foi capaz de influenciar o desempenho dos animais. Nossos resultados mostraram que o desempenho dos animais foi similar

Tabela 2. Valores médios das variáveis do desempenho dos leitões dos 21 aos 63 dias de idade.

1 Médias dos dias; Trat – tratamento; CTR – controle; BC3 – dieta basal com inclusão de 3% de bagaço de cevada; BC6 - dieta basal com inclusão de 6% de bagaço de cevada; BC9 dieta basal com inclusão de 9% de bagaço de cevada.abcd Letras minúsculas diferentes na mesma coluna diferem entre si (P < 0,05)

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entre os tratamentos, e, deste modo, a inclusão do bagaço de cevada em qualquer um dos níveis testados (3, 6 e 9%) não prejudicou o desenvolvimento dos leitões durante a fase de creche, principalmente nos primeiros 14 dias após o desmame. Weber et al. (2008) também observaram desempenho similar dos leitões desmamados com a suplementação de 7,5% de grãos secos de destilaria com solúveis (DDGS), 7,5% de casca de soja ou 7,5% de polpa cítrica seca. Contudo, Flis et al. (2017), demonstraram que dietas contendo fibras dietéticas como lignocelulose, celulose pura, quantidade moderada de farelo de trigo, casca de aveia com palha moída, casca de soja e pólen de pinheiro elevam o consumo de ração médio diário de 4 a 54% em comparação com as dietas controles. Já estudos com dietas contendo pectina, polpa cítrica ou inulina apresentaram redução do consumo de ração médio diário em 7 a 28%. Hermes et al. (2009) verificaram que nos animais que receberam a associação de 20% de proteína bruta com 2% de polpa de beterraba sacarina e 4% de farelo de trigo houveram efeitos positivos no desempenho (aumento do GPMD e peso final), menor incidência de diarreia e intervenções com antimicrobianos. Dentre 35 estudos avaliados por Flis et al. (2017) com alimentos fibrosos, 14 destes apresentaram aumento significativo ou tendência para um maior ganho de peso médio diário, 6 resultaram em redução no ganho de peso médio diário e 15 não obtiveram efeito no ganho de peso médio diário de leitões, reforçando assim os resultados controversos encontrados na literatura. Os mesmos autores comentam que a suplementação com substratos fibrosos possui menor efeito na conversão alimentar em comparação aos efeitos no consumo de ração e no ganho de peso médio diário. Na análise da frequência de dias com diarreia foi utilizada a somatória dos escores fecais 2 e 3, considerando 1 = fezes sólidas (normal); 2 = fezes menos consistentes que normal (pastosa) e 3 = fezes líquidas (diarreia severa), e posteriormente, esse escore foi transformado em frequência de dias com fezes alteradas (Banzatto & Kronka, 1989). Nessa característica observou-se que os leitões apresentaram maior frequência de dias com diarreia no período dos 21 aos 35 dias (P < 0,05, Figura 3), seguido pelo período de 49 aos 63 dias de idade e com uma menor frequência entre 35 a 49 dias de idade. Não foi verificado efeito de tratamento (P > 0,05). É possível que a fonte e os níveis de fibra utilizados não tenham resultado em diferenças significativas entre os tratamentos para a frequência de dias com diarreia devido ao status sanitário do local em que o experimento foi realizado (Berrocoso et al., 2015). Já que a inclusão de fibras insolúveis em níveis moderados na dieta de leitões associado a condição sanitária ruim pode reduzir a incidência de

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diarreia durante as 2 primeiras semanas (Molist et al., 2014).Resultados similares ao nosso estudo foram obtidos por Pascoal et al. (2012) ao adicionarem 3% de casca de soja e 9% de polpa cítrica; Montagne et al. (2012) associaram 6% de polpa de beterraba sacarina com 2% de casca de soja e também não obtiveram resultados na redução da frequência de diarreia dos leitões desmamados (Flis et al., 2017). Esses resultados indicam que além do teor de fibra na dieta, outros fatores podem influenciar essa característica, tais como os ingredientes da dieta, a idade, o manejo e as condições de criação dos leitões podem modificar a frequência de diarreia (Berrocoso et al., 2015). Concordamos com Berrocoso et al., (2015) e acreditamos que a semelhança no desempenho dos animais que foram alimentados com diferentes níveis de bagaço de cevada obtido pelo nosso grupo seja devido ao local onde o estudo foi conduzido, ter uma baixa pressão de infecção, já que o vazio sanitário e a limpeza e desinfecção eram realizados regularmente.

Resultados contraditórios ao obtido pelo nosso grupo em relação a frequência de dias com diarreia, foi observado por Mateos et al., (2006) e Kim et al., (2008) utilizando casca de aveia; Hanczakowska et al., (2008) com lignocelulose e Pascoal et al., (2012) com celulose pura. A associação de farelo de trigo (4%) com

Figura 3. Frequência de dias com diarreia (%) dos leitões dos 21 aos 63 dias de idade.

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polpa de beterraba sacarina (2%) e 20% de proteína bruta (Hermes et al., 2009), bem como cascas de aveia (5%) juntamente com 10% de palha de trigo (Gerritsen et al., 2012) melhoraram o escore fecal e diminuíram a incidência da diarreia pós-desmame (Flis et al., 2017). Finalmente, ressalta-se que a fibra alimentar pode modificar a população de bactérias no intestino, principalmente pela fermentação da fibra dietética no trato gastrointestinal, no qual os metabólitos da fermentação e a interação da fibra com o ambiente intestinal afetam a morfologia intestinal (Jha et al., 2019), alteram a microbiota intestinal e promovem a saúde intestinal, resultando em impactos positivos ou negativos na saúde animal, dependendo da fonte da fibra alimentar e do estado fisiológico do leitão (Jarrett & Ashworth, 2018). A interação entre a microbiota intestinal e os componentes fibrosos dos ingredientes da dieta podem influenciar o desenvolvimento, maturação e manutenção das funções do trato gastrointestinal, que por sua vez influenciam a eficácia da barreira intestinal e do sistema imunológico (Molist et al., 2014).

CONSIDERAÇÕES FINAIS A inclusão de fibra dietética na dieta de suínos pode ser antecipada para a fase de creche, sem prejuízos ao desenvolvimento dos animais, diferentemente do que se preconizava, que era o uso em animais de terminação e reprodutores. Os leitões que receberam diferentes percentuais de bagaço de cevada na dieta apresentaram desempenho e frequência de dias com diarreia semelhantes entre os grupos, mostrando que a inclusão de bagaço em até 9% pode ser viável do ponto de vista zootécnico, bem como sustentável. Além disso, com base nas informações disponíveis na literatura pode-se concluir que a inclusão de fibra na dieta pode ser uma estratégia para melhorar a saúde intestinal dos leitões desmamados, o que será discutido em breve no nosso estudo, após a obtenção dos resultados sobre a avaliação da população microbiana presente nas fezes dos animais.

AGRADECIMENTOS À Capes e ao CNPq pelas bolsas concedidas e à Cervejaria Campanária.

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CAPÍTULO IIIINFLUÊNCIA DE BIOTIPOS BOS TAURUS CONTINETAL SOBRE ATRIBUTOS

DE CARCAÇA E QUALIDADE DA CARNE

Gabriella V. Moura², Adrielle M. Ferrinho², Taiane S. Martins1, Tamyres R.

Amorim², Julian A. Muñoz², Jéssica L. Gemelli², Pollyana L. M. Garbossa¹,

Ingrid H. S. Fuzikawa², Lenise F. Mueller² e Angélica S. C. Pereira¹

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil.²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga.

RESUMOO uso do cruzamento industrial aumentou nos sistemas de produção de carne bovina no Brasil, a fim de melhorar a qualidade da carcaça. Objetivou-se avaliar as características de carcaça e qualidade de carne de bovinos Bos indicus e cruzados Bos taurus continental x Bos indicus, terminados em confinamento. Foram utilizados 32 touros, com peso médio inicial de 280 kg ± 15 kg e 11 ± 2 meses de idade, alojados em baias, considerando um delineamento inteiramente casualizado. Os animais foram divididos de acordo com a raça: 16 Nelore (N) e 16 Rubia Gallega x Nelore (RGN), confinados por 120 dias e receberam duas dietas, de acordo com a fase da terminação (terminação 1 - 70% de concentrado; terminação 2 - 85% de concentrado). No abate foi determinado o peso de carcaça quente (PCQ) e o rendimento de carcaça (RC). Durante a desossa foram avaliados o pH, área do olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e cor no músculo Longissimus, entre a 12ª e 13ª costela. Foram coletadas amostras do mesmo músculo para a análise de perdas por cocção (PPC) e maciez objetiva (FC). Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), utilizando o proc MIXED do SAS versão 9.3, considerando P < 0,05. Houve diferença entre os grupos genéticos para PCQ, RC, AOL, EGS e FC (P < 0,05). O grupo RGN apresentou maior PCQ e RC do que o grupo N. A AOL do grupo RGN foi em média 13,75 cm2 maior e a EGS 2,78 mm menor que os animais do grupo N. A diferença foi significativa para a FC entre os grupos (P > 0,05) e observaram-se médias inferiores para RGN, em comparação ao N. O uso do cruzamento industrial pode ser promissor para produção de carne superior, devido a melhor qualidade da carcaça dos animais RGN, explicada pelo fenótipo de musculatura dupla.

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Palavras-chave: cruzamento industrial, dupla musculatura, gordura, maciez, Nelore, Rubia Gallega

INTRODUÇÃO A pecuária de corte é destaque no agronegócio brasileiro e de grande importância para a economia do país. Em 2018, o rebanho bovino brasileiro era de aproximadamente 232 milhões de cabeças de gado e produziu 9,9 milhões de toneladas equivalente carcaça (TEC) (Usda, 2019). Também, o Brasil foi considerado o maior exportador de carne bovina in natura do mundo, com volume aproximado de dois milhões de toneladas de carne em 2018 (Usda, 2019). Atualmente, a maior parte do rebanho bovino brasileiro é composto por raças zebuínas, principalmente a Nelore, representando importante participação na produção de carne do país, o que é justificado por essa raça apresentar baixo custo de produção, existência de genótipos adaptados ao clima tropical, resistência a parasitas, eficiência na conversão de gramíneas tropicais, longevidade e fertilidade e, também, pelo fato do Brasil contar com extensão territorial privilegiada (Arboitte et al., 2004; Koury Filho, 2005). Entretanto, os índices de produtividade do rebanho brasileiro são baixos, o que comprova a necessidade do uso de tecnologias apropriadas para o País (Pereira, 2000). E, ainda, são necessários avanços tecnológicos para melhorar a qualidade do produto final, bem como, a implantação de estratégias para conquistar e consolidar novos mercados. De acordo com a literatura, o uso de cruzamentos bem delineados pode melhorar os índices produtivos do rebanho brasileiro (Euclides Filho & Figueiredo, 2003). Em consonância, a pecuária de corte vem se adaptando para diminuir os custos de produção e aumentar a rentabilidade. Além disso, a demanda por produtos de origem animal de boa qualidade e saudáveis para o consumo humano tem aumentado nos últimos anos. A maciez é um dos atributos mais importantes para definir qualidade da carne e garantir aceitação e satisfação dos consumidores (Koohmaraie et al., 2002). Nesse contexto, o melhoramento genético constitui recurso para aumentar os índices de produção e a qualidade da carne (Weber et al., 2009). De acordo com Cruz et al. (2009), estratégias de intensificação da produção de carne, com utilização de grupos geneticamente melhorados e com redução da idade de abate dos animais, contribuem para elevar a taxa de desfrute da pecuária de corte brasileira. Desse modo, são crescentes os estudos e o interesse dos produtores em desenvolver e aplicar estratégias para melhorar o rendimento animal juntamente com

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a qualidade das carcaças produzidas. Assim, é maior a exigência dos consumidores que estão em busca de produtos de qualidade e que satisfaçam suas necessidades quanto à segurança higiênicossanitária, valor nutritivo e, principalmente, às características de qualidade da carne (SarcinellI et al., 2007). A ampla variação na qualidade da carne se refere principalmente à maciez (Buainain & Batalha, 2007). Esse aspecto pode ser justificado pela grande fração zebuína encontrada na base genética do rebanho brasileiro (Lage, 2012). Em geral, raças zebuínas apresentam carne menos macia quando comparadas com raças taurinas (Pereira, 2015). A maciez é um atributo que faz com que o consumidor adquira a carne e se disponha a pagar mais por ela (Koohmaraie et al., 2002). Porém, garantir a maciez da carne não é simples, o que faz os pesquisadores manterem o foco nessa característica. Assim, já foram estabelecidas importantes questões relacionadas às diferenças de maciez entre subespécies (Koohmaraie et al., 2006), sendo um exemplo a maior atividade inibitória da calpastatina sobre as calpaínas, com consequente redução do amaciamento, em animais Bos taurus indicus quando comparados aos animais Bos taurus taurus (Pringle et al., 1997; 1999). A fim de melhorar a produtividade e a qualidade do produto final, para produzir uma carne macia, o desenvolvimento de novos procedimentos e tecnologias vem sendo priorizado. Uma das estratégias para obter um produto superior é a utilização do cruzamento industrial (CI), realizado entre duas raças com características complementares. O cruzamento entre raças europeias (Bos taurus taurus) com uma raça adaptada ao clima tropical (Bos taurus indicus), como a Nelore, possibilita a geração de animais superiores em aspectos produtivos (ganho de peso, musculosidade, peso de carcaça, precocidade), e também aspectos qualitativos da carcaça e da carne, como melhor acabamento, conformação e maciez, o que agrega valor aos cortes comerciais. Diante disso, vem sendo utilizada a raça Rubia Gallega para cruzamento com animais Nelore, com o propósito de melhorar as características quantitativas e qualitativas da carcaça e intensificar a produção de carne de qualidade (Albertí et al., 2005). No entanto, há insuficiência de dados na literatura para caracterização do fenótipo das progênies F1, resultantes do cruzamento entre as raças Nelore e Rubia Gallega, visando a participação do Brasil em nichos de mercados mais exigentes em relação à qualidade da carne. Assim, pretende-se discutir e apresentar resultados parciais sobre os efeitos nas características de carcaça e qualidade de carne de bovinos Bos indicus e cruzados Bos taurus continental x Bos indicus confinados.

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REVISÃO DE LITERATURABos taurus continental

As raças bovinas de interesse para produção de carne no Brasil podem ser classificadas como raças europeias da subespécie Bos taurus taurus e raças indianas da subespécie Bos taurus indicus. As raças europeias podem ser divididas em: raças europeias adaptadas ao clima tropical, como Caracu; raças europeias britânicas, como a Angus e Hereford; e raças europeias continentais, como Charolês, Limousin, Piemontês e Rubia Gallega (Bradley et al., 1998). As raças continentais têm maiores taxa de crescimento, peso de abate e área de olho de lombo, indicando maior quantidade de carne na carcaça, porém são mais tardias para deposição de gordura do que as raças turinas britânicas (Morales et al., 2002). Essas características aumentam o interesse em produzir animais utilizando o CI entre raças europeias e raças zebuínas, visando melhorias da qualidade do produto final. Entretanto, a seleção do grupo genético a ser utilizado no CI depende de nichos de mercados específicos e tem sido amplamente estudada, como uma das ferramentas de melhoria na qualidade da carne, pois apresenta relação direta com o grau de acabamento da carcaça, taxa de crescimento, escore de marmorização, teor de solubilidade do colágeno e maciez da carne (Cattelam et al., 2009; Metz et al., 2009a). Dentre as raças citadas, a Rubia Gallega (RG) é a mais importante entre as raças taurinas continentais na Espanha (Acruga, 2018) e vem sendo explorada no cruzamento industrial com animais zebuínos. Essa raça originou-se do cruzamento de animais da raça de Gael, procedentes da zona céltica francesa, com animais existentes na Galícia (Gmg, 2009a). A raça RG é uma das mais importantes produzidas na Espanha, classificada como alta produtora de carne, com maturidade tardia, apresenta carcaças altamente musculosas, com elevada taxa de crescimento e baixo conteúdo de tecido adiposo, destacando-se também por sua longevidade e rusticidade e, por fim, pode adaptar-se em ambientes diversos (Albertí et al., 2005). No Brasil, a introdução da raça RG ocorreu no ano 2000, quando houve a primeira experiência com inseminação artificial de matrizes Nelore com sêmen de RG. Após análise comparativa de amostras de carne entre animais brasileiros e animais cruzados RGN, foi verificado acréscimo de 38% na produção de carne nobre (file mignon e picanha) e de 37% na carne de melhor valor agregado (Sanchez et al., 2005a). Em 2003, ocorreu o abate de animais com 13 meses de idade, quando foi encontrada média geral de rendimento de carcaça de 60,6% (Gmg, 2009).

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Os resultados acima citados são consequência do alto potencial genético dos RG por produzirem elevado rendimento de carcaça e de cortes comerciais da carne, bem como, maior rendimento de cortes nobres da carne (Oliete et al., 2006). Além do alto rendimento de cortes observado em animais cruzados Rubia Gallega x Nelore, os bovinos puros RG apresentam maturidade tardia com elevada taxa de crescimento e um baixo conteúdo de tecido adiposo, além disso, destacam-se por sua longevidade e rusticidade e, assim, adaptam-se em ambientes diversos (Albertí et al., 2005). Ademais, a raça RG pode apresentar fenótipo de dupla musculatura (DM), decorrente de mutações no gene da miostatina, que é uma proteína reguladora da miogênese, podendo provocar alterações na multiplicação celular (Matsakas & Patel, 2009; Lee et al., 2009). A DM ou hipertrofia muscular é uma condição hereditária em algumas raças bovinas, sendo Belgian Blue e Piemontês as raças mais estudadas que apresentam esse fenótipo, além de outras como a Asturiana de los Valles, Maine Anjou, Charolês, Limousin, Parthenaise e Rubia Gallega (Hanset, 1982; Arthur, 1995). O aumento da musculatura em indivíduos DM ocorre devido ao aumento do número de fibras musculares e ao acréscimo individual dessas fibras (hipertrofia e hiperplasia, respectivamente), quando comparado ao bovino que não possui DM (Arthur, 1995; Gagniere et al., 1997). Durante os primeiros dois terços da gestação, fase de maior multiplicação celular, o número de fibras é maior em feto que possui característica DM (Swatland & Kieffer, 1974; Arthur, 1995; Gagniere et al., 1997). Ao nascimento, bezerros DM têm cerca do dobro do número de fibras musculares brancas (Swatland, 1973; West, 1974). Logo, bovinos DM têm maior proporção de fibras brancas, além de menor quantidade de mioglobina dos músculos (BOCCARD, 1982). Especificamente, o fenômeno da DM é decorrente de mutações em um gene recessivo denominado GDF8 (Growth Differentiation Factor 8) conhecido também como miostatina (Han; Forrest & Hickford, 2013). A miostatina, provoca alteração na multiplicação celular, no caso de mutações genéticas, e sua função primária é atuar como reguladora negativa da miogênese. (Matsakas & Patel, 2009; Lee et al., 2009). Em estudos envolvendo análises moleculares, McPherron e Lee (1997) testaram ratos e demonstraram que com o bloqueio da atividade do gene GDF-8 ocorre um aumento significativo na massa muscular dos animais, tendo esses a quantidade de gordura reduzida. Esses mesmos autores compararam as sequências gênicas da miostatina em dez espécies diferentes, confirmando que a hipertrofia muscular é causada pela perda da função da proteína miostatina. O fenótipo de DM, característico da miogênese, é um passo fisiológico do

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crescimento animal, devido às modificações na formação do tecido muscular, o que diferencia a raça RG dos demais animais taurinos, tradicionalmente utilizados como modelos em estudos de base comparativa ao Nelore (Lee et al., 2009). A formação do tecido muscular é denominada miogênese e ocorre durante o desenvolvimento pré-natal, quando o processo de hiperplasia muscular (aumento em número das células musculares) se manifesta. Durante o desenvolvimento embrionário, células progenitoras miogênicas originam os mioblastos, células uninucleadas e ativas mitoticamente, que se diferenciam em célula muscular, mais comumente chamada de fibra muscular, a unidade estrutural essencial do músculo (Chargé & Rudnicki, 2004; Hossner, 2005). Para que ocorra crescimento ou acréscimo de músculo, a síntese proteica deve superar a degradação, ou seja, o turnover proteico corporal, que é um processo fisiológico dinâmico, energeticamente dispendioso e diretamente relacionado ao crescimento muscular. A síntese proteica ocorre em função do número de ribossomos e da taxa de produção de proteínas do tecido, enquanto a degradação é determinada por hormônios, como cortisol e glucagon, bem como, pelos processos proteolíticos corporais principais, tais como o proteossoma, enzimas cálcio-dependentes (calpaína/calpastatina) e lisossomais (catepsinas) (Delgado et al., 2001; Ouali et al., 2006). A deposição de músculo ocorre então quando há aumento na síntese ou redução na degradação. Ambos os fatores estão intrinsecamente relacionados à maciez da carne, que é modulada por condições físico-químicas, como pH e resfriamento, fruto da ação de enzimas proteolíticas dentre as quais tem sido dada atenção para as calpaínas, caspases, ou peptidases de serina, dentre outras, e é predita com maior acurácia pela quantidade e/ou atividade dos inibidores naturais dessas enzimas (Sentandreu, Coulis & Ouali, 2002). Diante do exposto, tem sido demonstrado que melhores resultados na qualidade da carcaça e eficiência produtiva de bovinos de corte podem ser encontrados no Brasil, quando se promove o cruzamento entre raças de clima temperado que detém a característica de DM, como a RG, com as raças de clima tropical. Assim, geram-se animais mais produtivos e resistentes, podendo ainda explorar os efeitos da heterose e a complementariedade das raças, que podem estar relacionados não só ao aspecto produtivo, como ganho de peso, musculosidade, peso de carcaça, precocidade, mas também ao aspecto qualitativo da carcaça, como melhor acabamento, conformação e maciez da carne (Hammound, Chase & Bowers, 1998).

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Características de Crescimento Animal Dentre os principais fatores considerados no processo de produção de carne, pode-se citar a taxa de crescimento animal, que é influenciada por genótipo e ambiente. Nesse processo, para a obtenção de eficiência biológica e econômica, é necessário oferecer aos animais condições para apresentarem satisfatório crescimento corporal, desde o nascimento até o momento do abate, possibilitando a máxima expressão do fenótipo (Moraes, 2001). Conforme Cruz et al. (2009) descreveram, estratégias de intensificação da produção de carne, com utilização de grupos geneticamente melhorados e com redução da idade de abate dos animais, contribuem para elevar a taxa de desfrute da pecuária de corte brasileira. A proporção dos tecidos na carcaça no momento do abate é o aspecto da composição corporal que mais importa ao produtor e indústria, portanto, determina em grande parte o valor econômico da carcaça (Berg & Butterfield, 1976). Em concordância, a raça, o sexo e a nutrição podem afetar o crescimento e a composição dos tecidos e, consequentemente, o peso ao abate. Esses são os fatores mais importantes que os produtores dispõem na tentativa de alterar a composição da carcaça, a fim de atingir um maior peso de carcaça e, assim, obter melhor retorno financeiro pelos frigoríficos. O crescimento é caracterizado pelo aumento da massa corporal em função do tempo, com a deposição de proteínas, gordura e minerais (Owens et al., 1995). No que se refere aos genótipos, animais puros ou com grau de sangue taurino (Bos taurus taurus) produzem carcaças mais pesadas, em contraste aos animais zebuínos (Bos taurus indicus), devido ao maior crescimento, sobretudo muscular, o que reflete nos índices zootécnicos relacionados ao desempenho ponderal (Morales et al., 2002). Portanto, a combinação entre genótipos taurinos e zebuínos pode promover superioridade para características de desempenho, se comparada ao genótipo zebuíno puro, por meio do ganho em heterose e complementariedade entre as raças (Climaco et al., 2011). Neste sentido, bovinos taurinos, como os da raça RG, vêm sendo introduzidos em cruzamentos com animais da raça Nelore, com o objetivo de melhorar as características quantitativas e qualitativas da carcaça. O genótipo de animais Bos taurus taurus provém produção de animais com elevadas taxas de crescimento e desempenho superior, até mesmo em seus cruzamentos, em comparação aos animais Nelore puros (Sanchez et al., 2005b; Taveira et al., 2013). Animais RG, por possuírem o fenótipo de DM, alteram o padrão de crescimento e desenvolvimento muscular, resultando em carcaças superiores, devido à maior produção de carne e maior proporção de cortes nobres (Oliete et al.,

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2006; Xavier, 2014). Além disso, animais DM tendem a apresentar carcaças com menor proporção de gordura (tanto subcutânea, quanto intramuscular) que animais sem tal característica, maior porcentagem de cortes nobres, cerca de 30% a mais na relação músculo:osso, menor porcentagem de ossos, maiores rendimentos de carcaça e área de olho de lombo. (Arthur, 1995). Ao analisarem sete raças de corte da Espanha quanto às características de carcaça, Albertí et al. (2005) observaram que a raça RG tendeu a produzir carcaças maiores, com pesos de abate mais elevados do que as outras raças. Os autores ainda qualificaram a raça RG como alta produtora de carne, com maturação tardia e carcaça curta, produzindo carcaças altamente musculosas e com baixa proporção de cobertura de gordura. Em estudo conduzido por Sanchez et al. (2005b), o qual avaliou bovinos machos cruzados Rubia Gallega x Nelore e bovinos da raça Nelore, abatidos com média de 22 meses de idade, observou-se diferença de 94 Kg no peso de carcaça entre os grupos genéticos, sendo maior para animais cruzados. Os bovinos cruzados apresentaram maior rendimento de carcaça (62,24%) e maior área de olho de lombo (95,80 cm²), valores superiores aos encontrados para Nelore puro (58,78% e 55,15%, respectivamente). Portanto, a produção de animais originados desse cruzamento possibilita elevada taxa de crescimento muscular, carcaças mais pesadas com maior rendimento de peças comerciais e baixo conteúdo de tecido adiposo.

Qualidade da carne O conceito de qualidade da carne é muito amplo e pode ser influenciado por diversos fatores que estão inter-relacionados dentro da cadeia de produção da carne, podendo esses serem afetados durante todas as etapas do processo produtivo, desde a concepção do animal até o consumo do produto final (Luchiari Filho, 2000). Segundo Koohmaraie et al. (2002), a qualidade da carne pode ser determinada a partir das propriedades físico-químicas, tais como maciez, sabor, cor, odor e suculência, determinadas por fatores inerentes ao indivíduo (genética, idade, sexo), ao local de origem (manejo alimentar, manejo geral), ao manejo pré-abate, abate e métodos de processamento da carcaça e da carne, como duração e temperatura de estocagem e, até mesmo, a forma de preparo. A maciez é a característica mais importante que influencia a satisfação do consumidor quanto à palatabilidade da carne bovina, sendo o primeiro atributo procurado pelo consumidor (Miller et al., 2001; Ouali et al., 2013). Existem três fatores preponderantes na determinação da maciez: dureza intrínseca (genética/

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enzimas proteolíticas e teor/solubilidade de colágeno), fase de endurecimento e fase de amaciamento. Enquanto as fases de endurecimento e amaciamento ocorrem durante período post mortem, a dureza intrínseca da carne já existe no momento do abate e não é alterada no decorrer do período post mortem (Koohmaraie & Geesink, 2006). A maciez da carne é influenciada por vários fatores, como raça, idade, conteúdo de gordura intramuscular, declínio do pH post mortem, tipo de fibra e tipo de músculo, além de outros fatores como quantidade e solubilidade do colágeno e ação de sistemas proteolíticos, que atuam na degradação de estruturas proteicas miofibrilares específicas (Wheeler, et al., 2001). De acordo com Hanset (1982), os músculos do bovino DM têm menor quantidade de colágeno (tecido conectivo), comprovada pela redução de cerca de 20 a 30% da quantidade de hidroxiprolina, o que implica diretamente na redução da resistência e, consequentemente, em carne mais macia (Uytterhaegen et al., 1994; Arthur, 1995). Autores relataram diferenças significativas na maciez da carne entre raças bovinas europeias e zebuínas (Shackelford et al., 1991; O’Connor et al., 1997). Crouse et al. (1993) e Sherbeck et al. (1995) observaram que a participação crescente de genes de Bos indicus em cruzamentos com Bos taurus diminui consideravelmente a maciez da carne. Essa variabilidade da maciez da carne entre as raças tem sido atribuída a diferentes níveis de enzimas proteolíticas encontradas nos músculos dos animais (Whipple et al., 1990), especialmente enzimas do sistema das calpaínas. Bos indicus, quando comparados a Bos taurus, possuem maior atividade de calpastatina, essa, por sua vez, apresenta efeito inibidor sobre as calpaínas, reduzindo a atividade proteolítica e evitando o amaciamento da carne (Goll et al., 1983). Oliete et al. (2006) constataram que a carne de animais Bos taurus apresentou intensa diminuição na força de cisalhamento a partir do primeiro dia até o 21º dia de maturação, como esperado. A diminuição da força de cisalhamento está associada ao aumento do índice de fragmentação miofibrilar (Mcdonagh et al. 2001), o que é devido principalmente à degradação enzimática de proteínas miofibrilares (Ouali, 1990) e proteínas associadas a estas (Koohmaraie,1996). Assim, há uma contribuição multienzimática na proteólise post mortem para o amaciamento da carne, com consequente degradação de proteínas miofibrilares como titina, desmina, nebulina, troponina e tropomiosina (Ouali et al.,2013). Sanchez et al. (2005b) avaliaram as características de qualidade das carcaças de animais F1 RGN, abatidos em média com 22 meses de idade. A carne dos animais cruzados apresentou menor força de cisalhamento (0,67 kg) e obteve

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menor perda por exsudação (1%) ao descongelamento. As cores da carne e da gordura foram mais claras e mais atrativas nos animais cruzados. As perdas por cocção (PPC) também afeta diretamente a qualidade da carne bovina, interferindo diretamente na sua suculência (Zeola, 2002). Em estudos realizados por Sanchez et al. (2005) e Silva (2011) avaliando machos F1 RGN abatidos aos 22 e 24 meses, os animais RGN apresentaram valores de PPC (30,41% e 25,57%, respectivamente) superiores aos animais Nelore, provavelmente devido às diferenças químicas da carne existentes entre esses dois grupos genéticos. A genética do animal pode influenciar a qualidade da carne. As raças bovinas se diferem quanto às curvas de crescimento dos tecidos e, consequentemente, na velocidade de deposição de gordura. A partição da deposição de gordura nos diferentes depósitos corporais segue uma ordem cronológica sendo a gordura perirrenal a primeira a ser depositada, seguida pela intermuscular, subcutânea e, finalmente, pela intramuscular (Sainz & Hasting, 2000). Os bovinos DM são animais de maturação tardia, caracterizados pelo baixo teor de gordura corporal, apresentando teor de gordura intramuscular inferior a 1%. A deposição de gordura gordura intramuscular pode interferir na percepção da maciez da carne, entretanto animais DM apresentam carne macia principalmente pelo baixo teor de colágeno (Wiener et al., 2009). A avaliação da cor da carne também é importante para avaliar se um produto é de qualidade. De acordo com Zeola et al. (2002) a cor da carne pode ser afetada por fatores como: tipo de músculo, raça, sexo, idade do animal e alimentação. Ainda segundo Felício (2015), em condições normais de conservação, a cor é o principal atrativo dos alimentos, já que reflete a quantidade e o estado químico da mioglobina (Mb). A cor da carne irá variar de acordo com cada músculo, pois ela depende da proporção de fibras vermelhas e brancas da carne. Em animais DM, é predominante um maior número de fibras brancas, caracterizando carne mais clara. Os resultados de estudos avaliando qualidade da carne de animais cruzados sugerem uma maior investigação da influência do uso de animais taurinos continentais em cruzamentos com zebuínos, em relação às diferenças na qualidade de carcaça e carne, visto que é um assunto ainda pouco explorado pela literatura. Com base nesses estudos espera-se que os animais cruzados Bos taurus continental x Bos indicus apresentem aspectos quantitativos e qualitativos da carne superiores, quando comparados aos animais Bos indicus. Assim, objetivou-se avaliar e comparar as características de carcaça e qualidade da carne de bovinos Nelore e cruzados Rubia Gallega x Nelore, terminados em confinamento.

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RESULTADOS PARCIAIS OBTIDOS NO LABORATÓRIO DE PESQUISA EM GADO DE CORTE (LPGC) E LABORATÓRIO DE CIÊNCIA DA CARNE (LCC) DA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - FMVZ/USP NO ESTUDO: “DESEMPENHO, CARACTERÍSTICAS DE CARCAÇA E QUALIDADE DE CARNE DE BOVINOS NELORE E CRUZADOS RUBIA GALLEGA X NELORE CONFINADOS”

Animais, Manejo e Dieta

Foram utilizados 16 bovinos Nelore (N) e 16 bovinos Rubia Gallega x Nelore (RGN), machos não castrados, com idade média de 11 meses e 280 kg ± 15 kg de peso corporal inicial, selecionados a partir do rebanho experimental da Prefeitura do Campus Fernando Costa da Universidade de São Paulo, em Pirassununga. Os animais foram alojados dois a dois em baias semicobertas providas de cochos e bebedouros, distribuídos de acordo com a raça. O delineamento experimental considerado foi inteiramente casualizado (DIC), com 16 repetições por tratamento, sendo a baia a unidade experimental. Os animais foram confinados por 120 dias nas instalações do Laboratório de Pesquisa em Gado de Corte (LPGC - FMVZ/USP) e as análises de qualidade da carne foram realizadas no Laboratório de Ciência da Carne (LCC - FMVZ/USP), ambos localizados em Pirassununga, SP. Os animais foram adaptados à dieta e à estrutura do confinamento por 21 dias. Durante esse período receberam alimento concentrado gradualmente, até atingir os níveis previstos de volumoso e concentrado definidos na dieta experimental. Os bovinos foram alimentados ad libitum com a mesma dieta. Primeiramente foi fornecida a dieta de terminação 1 por 40 dias, contendo 30% de volumoso e 70% de concentrado e, em seguida, foi fornecida a dieta de terminação 2 por 80 dias, contendo 15% de volumoso e 85% de concentrado na dieta (Tabela 1). Todas as dietas foram formuladas para atender às exigências nutricionais de bovinos em terminação, de acordo com as demandas nutricionais estimadas pelo sistema CNCPS (Versão 5), a partir do uso do software Ração de Lucro Máximo (RLM, ESALQ - USP, Piracicaba, SP, Brasil). Também foi utilizado no sistema CNCPS um banco de dados de animais com exigências semelhantes à de animais da raça Rubia Gallega. O ajuste da oferta de alimento foi realizado diariamente com base na avaliação das sobras do dia anterior, com uma oferta 5% superior ao consumo observado.

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Tabela 1. Composição das dietas experimentais (% MS)

¹Composição por quilograma de produto: cálcio (g) 188; cobalto (mg) 24; cobre (mg) 720; enxofre (g) 74; flúor (mg) 240; fósforo (g) 24; iodo (mg) 40; magnésio (g) 30; manganês (mg) 1500; selênio (mg) 8; sódio (g) 60; zinco (mg) 2080; monensina sódica (mg) 1820.²Oferecida entre 1º - 40° dias de confinamento. ³Oferecida entre 41º - 120º dias de confinamento. *Estimado pelo sistema CNCP (Fox et al., 2004) a partir do software RLM.

Abate, Coleta de Amostras e Análises Laboratoriais Após 120 dias de confinamento, os animais foram abatidos com 500 kg ± 20 kg de peso corporal final no Abatedouro Escola da Prefeitura do Campus Fernando Costa/PUSP - FC em Pirassununga, SP. Os procedimentos de abate foram realizados de acordo com o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Brasil, 2017). Durante o abate, as carcaças foram pesadas para obtenção do peso de carcaça quente (PCQ, kg) e cálculo de rendimento de carcaça (RC, %). Em seguida, foram conduzidas à câmara fria, permanecendo a uma temperatura de 0 a 2º C, por 24 horas. Posteriormente, as carcaças foram novamente pesadas, obtendo-se o peso de carcaça fria (PCF, kg) e avaliando-se o pH (pH 24 h). Durante a desossa foram avaliadas a área de olho de lombo (AOL, cm²), espessura de gordura subcutânea (EGS, mm) e a cor (L*, a* e b*) no músculo Longissimus, entre a 12ª e 13ª costelas. Amostras de 2,54 cm de espessura do

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mesmo músculo foram coletadas, identificadas, embaladas a vácuo individualmente e congeladas para posteriores análises de perdas por cocção (PPC, %) e maciez objetiva. Para análise de AOL foi utilizada régua quadriculada específica, com escala em cm2, pelo método de quadrante de pontos. A espessura de gordura subcutânea (EGS) foi avaliada utilizando um paquímetro digital 6” (mod. ZAAS Precision, marca Amatools). A análise de cor da carne foi realizada em bifes descongelados do músculo Longissimus, após exposição ao ambiente por 30 minutos para oxigenação da mioglobina dos mesmos (AMSA, 2012). A determinação da cor considerou o sistema CIELab (CIE, 1986) e foi realizada em três pontos distintos da amostra, utilizando um colorímetro (HunterLab®). Para os valores de cor (L*, a* e b*) foi calculada a média das três leituras. Para a análise de força de cisalhamento (FC, kg), os bifes foram assados em forno elétrico a 163 °C, até atingirem a temperatura interna de 71 °C, de acordo com os procedimentos propostos por Wheeler et al. (2015). Em seguida, foram retirados seis cilindros de 12 mm de diâmetro de cada amostra, com um vazador elétrico (WHEELER et al., 2001). A FC foi determinada com equipamento texturômetro Brookfield® CT-3 Texture Analyser (Brookfield, EUA), equipado com lâmina Warner-Bratzler. A perda por cocção (PPC) foi determinada pela diferença de peso antes (PI) e depois do cozimento (PF), segundo a equação PPC = (PI-PF)/PI, e expressa em %, conforme proposto por Honikel (1998). Para verificar o efeito da “raça” sobre as características avaliadas e abordagens uni e multivariadas, visando encontrar possíveis relações entre os valores dos grupos genéticos, realizou-se análise de variância (ANOVA) adotando-se ‐ = 0,05 e utilizando o proc MIXED do SAS‐ Versão 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Para as características de carcaça foi incluído no modelo o efeito fixo de tratamento (grupos genéticos) e para PCQ e RC, o PI foi usado como covariável.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Características de carcaça e qualidade da carne Houve diferença entre os grupos genéticos para PCQ e RC (P < 0,05), (Tabela 2). Para ambas as características, animais do grupo RGN apresentaram valores superiores ao grupo N, propiciando carcaças mais pesadas e com maior rendimento. Em termos numéricos, isto significou carcaças de RGN com 5,5% (PCQ) e 1,3% (RC) mais pesadas que grupo N. Este resultado era esperado devido ao grupo RGN apresentar a característica de DM. De acordo com Fiems (2012) os

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animais dupla musculatura podem ser 11% superiores quando comparados aos animais normais, devido ao maior teor de carne magra na carcaça. Cabe destacar que o PCQ dos animais do grupo RGN do presente estudo foram aproximadamente 15 kg superiores que os bovinos N, concordando com Wheeler et al. (2005) que reportam as raças continentais europeias como maiores produtoras de carne, com ganho de 10 a 20 kg de PCQ em relação as raças zebuínas e britânicas. Para a característica de RC, o valor observado para os bovinos RGN (57,46%) foi superior ao N (56,13%) e supera o RC obtido por Silva (2011), de 54,96%. O PCQ e RC estão diretamente relacionados ao maior ganho de peso e maior peso final do grupo genético RGN em comparação ao grupo genético N. Em consenso, segundo Oliete et al. (2006), RG possui maior taxa de crescimento, apresentando alto rendimento de carcaça e cortes comerciais. Não houve diferença entre os grupos genéticos (P > 0,05) para o pH do músculo Longissimus 24 horas post mortem. Bovinos N apresentaram média de pH de 5,63, enquanto RGN de 5,68 (Tabela 2). Esses valores estão dentro da faixa normal de 5,5 a 5,79 para a carne bovina, de acordo com Prieto et al. (2018). É importante salientar que os animais não permaneceram em jejum prolongado, não foram transportados por longa distância e não permaneceram por longo período de tempo no curral de espera. De acordo com Ferguson et al. (2008), quando os bovinos são acometidos por estresse pré-abate, a reserva de glicogênio dos músculos desses animais pode ser parcial ou totalmente esgotado impactando potencialmente no pH final e consequentemente afetando a qualidade da carne. Houve efeito dos grupos genéticos para a AOL (P < 0,05). O valor médio de AOL observado para os bovinos cruzados RGN foi superior (90,19 cm2) aos N (76,44 cm2), demonstrando o efeito positivo do cruzamento no aumento da musculosidade, como já era esperado, devido ao maior potencial de deposição de musculatura dos animais RG. Vale ressaltar, que a característica de AOL está diretamente relacionada à proporção de cortes na carcaça. Nesse sentido, esse resultado evidencia uma maior produção de músculo a favor dos animais cruzados em relação ao Nelore puros. Em estudo realizado por Suguisawa et al. (2006) com animais Simental, Angus cruzados com Nelore e Nelore puro, também se observou maior valor de AOL para animais Simental e Angus, cruzados com Nelore, quando comparados aos bovinos Nelore puros. Lopes et al. (2012) mencionaram que animais Bos taurus taurus apresentam maior taxa de crescimento tendo como consequência apresentar maior AOL que animais Bos taurus indicus. A EGS foi maior (P < 0,05) nos bovinos do grupo N (5,85 mm) do que os

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animais do grupo RGN (3,07 mm) (Tabela 2). Esse resultado era esperado, visto que animais RG apresentam baixa deposição de gordura e maior deposição de músculo (Oliete et al., 2006). De acordo com Salviano-Teixeira et al. (2006) animais com características de DM podem apresentar 3% menos gordura e 8% mais músculos que os animais normais. Também, Silva (2011) avaliou bovinos RGN com 24 meses de idade e obteve valores baixos de EGS (1,59 mm), inferindo que animais RGN apresentam deposição de gordura inferior. Enfatiza-se que as médias de EGS, independente do biotipo, atendem à espessura mínima de 3 mm exigida pelos frigoríficos, a fim de proteger o músculo contra o frio e evitar perdas na qualidade da carne (Luchiari Filho, 2000). De acordo Luchiari Filho (2000), maiores valores de AOL e menores de EGS são indicativos de maior rendimento muscular, maior proporção de cortes de carne utilizáveis e menor proporção de gordura corporal na carcaça, característico de carcaças de animais DM. A luminosidade (L*) e a intensidade de vermelho (a*) não foram influenciadas pelos grupos genéticos (P > 0,05) (Tabela 2), no entanto, o mesmo não ocorreu para intensidade de amarelo (b*) (P = 0,02890). Para essa característica, verificou-se efeito dos grupos genéticos (P = 0,02890). Bovinos N apresentaram carnes levemente mais amareladas (15,22) do que os bovinos RGN (14,29). Sugere-se que essa sutil diferença possa estar associada tanto ao baixo conteúdo de gordura intramuscular, quanto à maior proporção de fibras glicolíticas (fibras brancas), relatada em animais DM (Fiems, 2012). No entanto, os valores observados foram próximos aqueles citados por Muchenje et al. (2009), que definiram valores ideais para carne bovina entre 33,2 e 41 para L*, 11,1 e 22 para a* e valores entre 13,1 e 34,54 para b*. Para a característica PPC não foi observada diferença entre os grupos genéticos (P > 0,05) (Tabela 2). As médias de PPC foram de 30,22% e 29,58% para N e RGN, respectivamente. Ressalta-se que os valores encontrados no estudo são aceitáveis, segundo Muchenje et al. (2009), com PPC entre 13,1% e 34,54%, que são os valores considerados adequados para a carne bovina. Quanto a característica de FC, houve diferença (P < 0,05) entre os grupos genéticos, o menor valor observado no grupo RGN (7,34 kg) comparando-se ao N (8,53 kg), pode ser explicado devido à influência da dupla musculatura presente nesses animais. Segundo Boccard (1982), Bailey et al. (1982) e Gerrard et al. (1991) a carne de animais DM é relativamente mais macia que a de um bovino normal, por apresentarem menor quantidade de colágeno. Além disso, animais que possuem o fenótipo de DM podem apresentar mutações no gene miostatina (MSTN), resultando na inativação dessa proteína e, consequentemente, aumento da massa muscular,

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resultando em carnes mais macias, quando comparados aos demais (Fiems, 2012). Ainda assim, os resultados de FC do presente estudo, 7,34 kg para o grupo RGN, foi superior aos valores obtidos por Sanches el al. (2005b), de 5,38 kg, para animais cruzados Rubia Gallega x Nelore, sendo assim, para a característica de maciez, a carne pode ser considerada como dura para ambos os grupos genéticos estudados. De acordo com o Usda (2011), o valor de FC para a carne ser considerada macia deve ser menor ou igual a 4,4 kg. Contudo, os resultados obtidos no presente estudo podem ter sido em função da ausência de períodos de maturação, responsáveis pelo amaciamento da carne ao longo dos dias post mortem devido à atividade proteolítica. Sugere-se para se obter uma carne mais macia, de ambos os grupos genéticos avaliados, maturar as amostras de carne avaliando a proteólise ao longo do tempo.

CONSIDERAÇÕES FINAIS A estratégia do cruzamento industrial entre uma raça Bos taurus continental (Rubia Gallega) e Bos indicus (Nelore) pode ser utilizada a fim de potencializar a produtividade, proporcionando maior taxa de crescimento muscular e, consequentemente, maior rendimento de carcaça e de cortes de maior valor comercial, favorecendo toda rede produtiva (produtor e indústria). A utilização desse cruzamento influenciou na maioria das características relacionadas à qualidade da carne, como à maciez. Porém para se obter carne macia, sugere-se maturar as amostras de ambos os grupos genéticos avaliados. Vale ressaltar que a associação dos resultados de todas as características de qualidade

Tabela 2: Análise de variância das características de carcaça e qualidade da carne de animais Nelore e Nelore x Rubia Gallega confinados

¹PCQ: peso de carcaça quente; RC: rendimento de carcaça; AOL: área de olho de lombo; EGS: espessura de gordura subcutânea; L*: luminosidade; a*: intensidade de vermelho; b*: intensidade de amarelo; PPC: perdas por cocção; FC: força de cisalhamento. 2N: Nelore; RGN: cruzamento Rubia Gallega x Nelore.3EPM: erro padrão da média.

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de carne (quantificação de colágeno, análise do tipo de fibras musculares, lipídeos totais, comprimento de sarcômero e análise sensorial) esclarecerão a viabilidade do uso desse cruzamento racial. Assim, o uso da raça Rubia Gallega nesse cruzamento vem sendo realizado com o intuito de oferecer à um nicho de clientes mais exigentes em qualidade, uma carne superior e com menos gordura. AGRADECIMENTOSO presente trabalho foi realizado com apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Os agradecimentos se estendem também ao conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

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CAPÍTULO IVSÍNTESE EMERGÉTICA PARA AVALIAÇÃO DA SUSTENTABILIDADE DA

PRODUÇÃO ANIMAL INTEGRANDO FLUXOS DE CUSTOS FINANCEIROS E DE

RECURSOS NATURAIS

Luís Alberto Ambrósio, Beatriz Queiróz dos Reis, Rafael Araújo Nacimento,

Laya Kannan Silva Alves, Camila Raineri, Mirian Fabiana da Silva, Danny

Alexander Rojas Moreno, Gustavo Lineu Sartorello, Vanessa Theodoro

Rezende, Augusto Hauber Gameiro

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil

RESUMOOs sistemas de produção animal existem na interface entre o ambiente e a economia, e uma análise abrangente de suas dinâmicas requer um método que seja capaz de expressar os processos ambientais e econômicos em uma base comum. Ademais, do ponto de vista estritamente econômico clássico, a contribuição da natureza não é considerada nas análises das atividades econômicas por não apresentar transação monetária, com um fluxo de dinheiro em contracorrente ao fluxo de bens e serviços naturais. Este capítulo apresenta um conjunto de indicadores de sustentabilidade de um sistema de produção animal – ovinocultura de corte – mensurados com base no método chamado de Síntese Emergética (SE). Os resultados obtidos são comparados com outros três sistemas de produção ovina. Como principais conclusões, encontrou-se que o sistema considerado apresentou relativa baixa produção de energia líquida. Ademais, o impacto que ele exerce sobre o ambiente local é moderado. Os indicadores mostram que o sistema é bastante dependente das forças da economia e que para melhorar os índices emergéticos e a sustentabilidade é necessário diversificar a produção por meio, por exemplo, da plantação dos insumos alimentares mais utilizados, especialmente o milho e a soja.

CONCEPÇÃO DE SUSTENTABILIDADE DA PRODUÇÃO ANIMAL Após o Relatório Brundtland estabelecer em 1987 que o desenvolvimento sustentável deve atender às necessidades do presente sem comprometer a capacidade das gerações futuras de atender as suas próprias necessidades (CMMAD, 1991), esforços vêm sendo conduzidos para alinhar os sistemas de

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produção animal a este modelo de desenvolvimento. A sustentabilidade dos processos e sistemas de produção não possui definição de forma única e universalmente válida, existindo diversas abordagens contrastantes relacionadas à disponibilidade de recursos e capacidade de carga, eficiência no uso de recursos, equidade na participação de recursos, equidade intergeracional, dinâmica ambiental e restrições (Ulgiati & Brown, 1998). Os sistemas de produção animal mais sustentáveis seriam aqueles que se ajustariam aos limites físicos e éticos-sociais do crescimento econômico, considerando a interdependência entre economia, sociedade e ambiente. O estoque global de energia fóssil é um exemplo de que há um limite físico, mas outros limites são a diminuição da biodiversidade, o uso da água, terra arável, fosfatos e a capacidade da natureza em absorver os resíduos. O padrão de consumo de recursos limita o crescimento. Esses limites impõem um padrão pulsante dinâmico para os sistemas em todas as escalas, caracterizado pelos estágios de crescimento, estagnação, declínio e regeneração lenta (Odum & Odum, 2013). Na produção animal as escalas espaciais envolvem os níveis do planeta, biomas, bacias hidrográficas, fazenda, piquete de pastagem, organizados hierarquicamente e interdependentes. Para exemplificar, supõe-se a produção mundial de uma espécie animal, como a de ovinos (Figura 1), medida pelo crescimento do rebanho mundial, em função da força imperativa dos fatores limitantes, sua sustentabilidade não apresentaria um estado de equilíbrio estável, mas sim estados com características diferentes em cada estágio do ciclo pulsante.

Figura 1. Estágios do ciclo pulsante dos sistemas sustentáveis (Adaptado de Grönlund, 2016).

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O desenvolvimento segue um ciclo de mudança, desde o rápido crescimento de recursos abundantes até o clímax e o declínio, à medida que os recursos atingem o pico e diminuem para reduzir o estado de energia, no qual os recursos são renovados (Odum & Odum, 2013). Neste ciclo de mudança, as necessidades humanas podem ser as mesmas de um estágio para o próximo, mas os recursos disponíveis para satisfazer as necessidades humanas em um estágio do ciclo podem ser muito diferentes daqueles que estarão presentes no próximo (Grönlund, 2016). Neste contexto, um dos desafios para os tomadores de decisão é o de administrar a produção animal integrando os múltiplos objetivos econômicos, sociais e ambientais ao nível da unidade de produção com a alocação dos recursos naturais e dos insumos adquiridos no mercado. Isto implica adotar estratégias considerando os diferentes estágios do ciclo pulsante.Diferentes ações de gerenciamento, atitudes humanas e padrões de interação são necessários para maximizar o bem-estar da sociedade em cada estágio do ciclo de mudança (Grönlund, 2016). Os sistemas de produção animal existem na interface entre o ambiente e a economia, e uma análise abrangente de suas dinâmicas requer um método que seja capaz de expressar os processos ambientais e econômicos em uma base comum. A avaliação da sustentabilidade é necessária para o planejamento e a execução das ações gerenciais nos sistemas de produção animal, em particular a avaliação da eficiência econômica e avaliação ambiental. A avaliação da eficiência econômica dos sistemas de produção animal contabiliza os custos de produção usando as quantidades compradas e os preços pagos pelos fatores de produção alocados durante um período, em geral anual, por unidade de área ou unidade animal. Esses custos são confrontados com a receita proporcionada pela venda de animais e seus produtos a preços de mercado. A avaliação ambiental, por sua vez, considera o impacto do sistema de produção animal na manutenção dos estoques de recursos naturais renováveis e não renováveis. A avaliação da sustentabilidade relevante para a tomada de decisão na unidade produtiva (fazenda) deve utilizar indicadores integrando as informações de eficiência econômica e ambiental e, em particular, com os índices zootécnicos que medem o desempenho do sistema. Deste modo, é possível obter respostas para as questões: O atual estado do sistema de produção animal é sustentável? Quão sustentável é o sistema? O que caracteriza sua sustentabilidade? Para responder estas questões é necessário avaliar, inicialmente, a sustentabilidade ao nível de unidade de produção animal (fazenda, granja). Diversos indicadores têm sido propostos na literatura em função dos atributos ambiental,

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econômico e social, das escalas espacial e de tempo, da disponibilidade e custo da coleta de dados, da diversidade das estruturas e funções dos sistemas de produção animal, entre outros fatores condicionantes. Assim, não se acredita que um único indicador possa captar a complexidade da sustentabilidade dos sistemas agropecuários. E, consequentemente, deve-se direcionar esforços para encontrar um conjunto eficaz de indicadores de sustentabilidade dos sistemas. Este capítulo apresenta um conjunto de indicadores de sustentabilidade de um sistema de produção animal mensurados com base no método chamado de Síntese Emergética (SE), desenvolvida por Odum (1996). Entende-se que tal método pode ser complementar aos estudos de custos de produção, propostos pela Teoria Econômica Neoclássica. Ambos os métodos são operacionalizados por meio da contabilização dos recursos alocados na produção utilizando dados obtidos a campo por meio de pesquisas que refletem os sistemas de produção representativos das atividades comerciais, e planilhas eletrônicas que compartilham as mesmas informações operacionais coletadas rotineiramente para controle zootécnico e gestão de diferentes tipos de propriedades. Nota-se, portanto, a complementaridade dos métodos propostos, uma vez que o primeiro (SE) tem uma base biofísica lastreada em energia; e o segundo, uma base financeira, lastreada em unidades monetárias utilizadas pela sociedade para a realização de trocas das mais diversas naturezas. A Figura 2 representa as principais relações sobre as quais desenvolvem-se as duas concepções metodológicas propostas.

Figura 2. Relações físicas e financeiras realizadas entre a fazenda (onde ocorre a produção animal) e a sociedade (representada pelo mercado).

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AMPLIAÇÃO DO CONCEITO ECONÔMICO INCLUINDO OS INSUMOS“GRATUITOS” DA NATUREZA Na alocação dos recursos na produção animal direcionada pelo conceito de sustentabilidade, o capital natural é considerado não-substituível pela produção de bens de consumo e pelo fornecimento de utilidade (Neumayer, 2003). Neste sentido, os estoques de capitais naturais e antrópicos (humano, físico, financeiro, social) são complementares na busca da sustentabilidade. Smith et al. (2001) argumentaram que o conceito emergente e ampliado de capital (natural, humano e produzido) representa a estrutura conceitual mais adequada para um sistema de informação visando o desenvolvimento sustentável. Isto se deve a existência de um conjunto de pensamento bem desenvolvido em torno do conceito dos cinco capitais (financeiro, físico, humano, natural e social) que fornece orientações claras sobre o que tal sistema de informação deve medir. Para tanto, é de suma importância a identificação e mensuração dos bens de capital (ou ativos) que fornecem os fluxos de serviços necessários para o desenvolvimento. Estes fundamentos da teoria econômica justificam a contabilização dos recursos naturais na análise econômica da produção animal. Para Odum (1994), do ponto de vista estritamente econômico clássico, a contribuição da natureza não é considerada nas análises das atividades econômicas por não apresentar transação monetária, com um fluxo de dinheiro em contracorrente ao fluxo de bens e serviços naturais (Figura 3).

Figura 3. Relações físicas e financeiras realizadas entre a fazenda (onde ocorre a produção animal) e a sociedade (representada pelo mercado), agora incluindo-se os recursos provenientes da natureza, geralmente não computados em termos financeiros pelos métodos de cálculo de custo de produção.

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Os insumos da natureza fluem para os sistemas rurais e da economia sem transação econômica. Para Odum (1996), a natureza por meio destes insumos realiza trabalho gratuito. Embora os insumos da natureza não sejam valorados monetariamente, existe um custo ambiental implícito no seu uso.

TRANSAÇÕES ECONÔMICAS E ANÁLISE DE CUSTO DE PRODUÇÃO Raineri (2012) argumenta que o cálculo do custo de produção é o ponto de partida para qualquer análise econômica aplicada à avaliação de processos, tecnologias e ações na Zootecnia; e que as estimativas dos custos de produção são importantes na administração da empresa agrícola para analisar a eficiência da produção da atividade ou de processos específicos indicando o sucesso da empresa no seu esforço de produzir. Este conceito está estritamente relacionado às decisões de alocação de insumos que influenciam a função de produção da empresa. Fundamentada na Teoria Econômica, Raineri (2012) classificou os componentes dos custos em três rubricas: custos variáveis, custos fixos operacionais e renda de fatores, conforme o tipo dos itens alocados durante um período de produção. A soma das três rubricas indica o custo total da atividade, que também pode ser expresso em termos de custo total unitário dividindo o custo total da atividade pela quantidade de animais vendidos. Os itens classificados como custos variáveis dos sistemas de produção animal foram aqueles diretamente relacionados com a quantidade de animais e o tamanho do rebanho, como alimentação, medicamentos, imposto e taxas variáveis (ICMS e GTA). Os custos fixos operacionais foram compostos por itens não relacionados diretamente à quantidade de animais ou tamanho do rebanho no curto prazo, tais como: mão-de-obra fixa, energia elétrica e combustível, depreciação, manutenção e conservação de máquinas e equipamentos, e impostos e taxas fixas (ITR e contribuição sindical). A renda dos fatores equivale à remuneração pelo uso do capital, calculada usando uma taxa de juros que incide sobre o montante de capital de giro e sobre o capital investido em ativos físicos e o valor da terra usada no sistema de produção, em determinado período. A apuração dos resultados econômicos do sistema de produção animal pode ser calculada a partir da receita total da atividade, que é a quantidade de animais vendidos multiplicada pelo preço unitário de cada animal, descontando-se o custo total. A importância dessas informações para a tomada de decisão na produção animal foi reconhecida pelos próprios produtores, em busca da eficiência econômica do sistema, que influenciou o Laboratório de Análises Socioeconômicas e Ciência Animal (LAE) a gerar informações mensais sobre os custos de produção de cordeiro

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no estado de São Paulo usando e aperfeiçoando esta metodologia em benefício da ovinocultura.

INTEGRAÇÃO ENTRE CONCEITOS ECONÔMICOS E RECURSOS NATURAIS: A SÍNTESE EMERGÉTICA Odum (1996) apresentou a metodologia de Síntese Emergética (SE), que reconhece que a biosfera por longo período de evolução acumulou estoques de capital natural na forma de biomassa florestal e marinha, petróleo, xisto, carvão, fosfato entre outros, que foram e continuam sendo consumidos pela sociedade em taxas maiores do que a capacidade de reposição destes recursos em um dado período, portanto de modo não renovável. O desenvolvimento sustentável requer que os sistemas de produção sejam ajustados aos estoques de recursos naturais não renováveis compatibilizando com as necessidades e bem-estar das gerações humanas atuais e futuras. Emergia é a energia disponível de um determinado tipo previamente usada para produzir um recurso, serviço ou produto. Trata-se, portanto, da “memória” de energia utilizada. Sua unidade é o emjoule (Odum, 1996). A metodologia de SE permite comparar sistemas de produção animal alternativos em busca do desenvolvimento sustentável. Para Vieira et al. (2005), a SE pode ser utilizada para avaliação de sustentabilidade por permitir a comparação do uso de diferentes recursos (naturais e não naturais), o que é importante na avaliação de tecnologias em termos de consumo dos recursos. A SE considera que a sustentabilidade de um sistema é determinada pela dependência de recursos renováveis para o seu funcionamento. Para avaliar este aspecto da sustentabilidade estima-se a fração renovável da emergia total que é usada pelo sistema (Campbell & Garmestani, 2012).

Figura 4. Relação entre as fontes de energia necessárias para o funcionamento da fazenda, considerando duas fontes de recursos, uma renovável e uma não renovável.

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A SE utiliza escalas espaciais e temporais amplas considerando os recursos naturais e econômicos nas diferentes formas de energia, materiais, trabalho humano e serviços econômicos em uma base comum, oferecendo maior potencial para explorar a interação entre meio ambiente e economia (Franzese et al., 2009). Os passos metodológicos da síntese emergética compreendem a construção de diagrama do sistema de energia, também chamado de modelo conceitual, elaboração de tabela de avaliação emergética e cálculo e avaliação de índices de sustentabilidade. Os diagramas de sistemas de energia usando a linguagem padronizada proposta por Odum (1996) ilustram quais são as forças direcionadoras principais dos processos em termos de fontes de energia, matéria e informação, bem como as interações entre os componentes do sistema (estoques internos, produtores e consumidores). No Anexo 1, são apresentadas mais informações sobre as ilustrações padronizadas por Odum (1996), para construção dos diagramas. Aplicando o princípio ecológico de cadeia alimentar, as forças motrizes e os componentes são desenhadas da esquerda para a direita em ordem crescente de “qualidade de energia”, aumentando a transformidade e diminuindo a energia disponível (exergia) a fim de fornecer uma imagem clara da hierarquia existente no sistema. O diagrama de sistema de energia representa o modelo conceitual do sistema construído com base no modelo mental dos modeladores. Então, no caso de produção animal, para ampliar a representatividade da avaliação é essencial que haja a participação das partes interessadas (zootecnistas, veterinários, produtores, entre outros) na modelagem. As informações sobre os fluxos de energia estão associadas ao inventário quantitativo de fluxos de entradas e estoques do sistema de produção animal avaliado. A tabela de avaliação emergética é construída contabilizando os fluxos de entradas para os sistemas de produção animal pelas quantidades – expressas em gramas (g) para massa, joules (J) para energia ou dinheiro ($) – de cada fluxo de fonte de energia que entra no sistema, em conformidade com o diagrama, as quais são convertidas para fluxo de emergia, expresso em Joules de energia solar equivalente (sej), multiplicando-as pelo valor emergético por unidade (UEV, expresso em sej/g, sej/J ou sej/$). O esquema de organização de uma tabela de avaliação dos fluxos de emergia é explicado no Anexo 2. Os subtotais da tabela de avaliação emergética formam os fluxos agregados de emergia dos tipos: Recursos renováveis da natureza (R), Recursos não renováveis da natureza (N), Materiais comprados da economia (M) e Serviços comprados da

¹“Transformidade” é uma forma de escrever resumidamente o conceito “fator de transformação de energia”. Este conceito representa quanta energia solar é necessária para gerar uma unidade do respectivo produto. Em termos gerias é denominada de Valor Emergético por Unidade (UEV- Unit Emergy Value).

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economia (S). A soma R + N formam as entradas da natureza (I, inputs) e M + S formam a retroalimentação da economia (F, feedback) e a emergia total usada (U) é a soma de I + F. Além disto, considera-se que M e S são compostos por frações renováveis (MR e SR) e não renováveis (MN e SN) conforme proposto por Ortega et al. (2002). Os fluxos agregados de emergia são usados para construir índices emergéticos que são indicadores da sustentabilidade do sistema. A razão entre a emergia total usada (U) e a quantidade de produto produzida formam o valor emergético por unidade (UEV) deste produto. Uma nova UEV calculada com base em um determinado sistema de produção animal pode ser usada na avaliação emergética em que o produto é um recurso inventariado para o sistema em estudo.

A sustentabilidade do sistema de produção está associada à eficiência dos fluxos econômicos ou monetários, ilustrada pelo símbolo de diamante (Figura 5), e pela eficiência no uso dos recursos renováveis e não renováveis. Estas associações são medidas por índices emergéticos de sustentabilidade e índices econômicos, como os indicados pela análise de custos de produção.

ÍNDICES EMERGÉTICOS Os índices emergéticos apresentados por Odum (1996) fornecem as informações sobre as relações entre os tipos de recursos usados no sistema de produção. Os índices utilizados neste texto, foram:

Figura 5. Relação entre os recursos renováveis e não renováveis da fazenda e sua interação com o comércio e com os insumos comprados da fazenda. Integração dos recursos do ambiente e da economia. Nos processos do sistema de produção da empresa rural os recursos da comprados na economia interagem com os recursos da natureza para gerar o produto (output do sistema). A entrada dos fluxos de recursos da economia ocorre como uma retroalimentação por meio dos fluxos monetários recebidos pela venda dos produtos e compra dos recursos.

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A) Transformidade: Tr = Y / EpA Transformidade é a emergia solar requerida para obter a energia de uma unidade de serviço ou produto expressa em Joules. É calculada como a relação entre a emergia total incorporada (Y) e a energia produzida (Ep). A transformidade é uma medida da eficiência do sistema de produção, quanto menor o seu valor, mais eficiente é o uso da energia. B) Razão de Rendimento Emergético: EYR = Y / F O índice EYR indica quanto de emergia da natureza foi incorporada na produção de um bem ou serviço. É calculada pela razão entre a emergia total incorporada e os recursos da economia (F). O valor da EYR estima a dependência do sistema aos recursos da economia e mostra a contribuição do capital natural para a economia regional. C) Razão de Carga Ambiental: ELR = (N + F) / RO índice ELR expressa a razão entre a soma dos recursos da natureza não renováveis (N) e os recursos da economia (F), e os recursos naturais renováveis (R), como o sol, o vento e a chuva. D) Índice de Sustentabilidade Emergética: ESI = EYR / ELRO ESI é uma medida da compatibilidade da economia (grande rendimento) e o ambiente (baixo estresse). ESI indicará maior sustentabilidade para um maior rendimento econômico (EYR) com uma menor carga ambiental (ELR). E) Renovabilidade: %R = (R / Y) * 100O índice de Renovabilidade (%R) mede a sustentabilidade dos sistemas, porque representa a proporção do uso da emergia de todos os recursos naturais renováveis em relação a emergia contida no produto. A Renovabilidade parcial (%Ren parcial) acrescenta as frações renováveis dos recursos da economia (MR e SR). F) Razão de Investimento de Emergia: EIR = F / IA Razão de Investimento de Emergia (EIR) mede o investimento da sociedade para produzir um determinado bem ou serviço em relação ao investimento da natureza. Mede a intensidade do desenvolvimento econômico e a carga sobre o ambiente. G) Razão de Intercâmbio Emergético: EER = Y / [$ * sej/$] O EER é obtido por meio da razão emergia/moeda, onde a emergia contabiliza todas as fontes energéticas usadas no país, em determinado ano, e moeda ($) é o valor monetário do produto nacional bruto (PNB) expresso em dólares na taxa média anual. A Razão de Intercâmbio Emergético indica as relações de troca entre a emergia do produto e a emergia da receita bruta. Assim valores acima de 1 indicam benefício, em termos de emergia, para o comprador do produto e valores menor que 1 indicam benefícios para o produtor. Sendo o valor de equilíbrio uma EER igual a 1. O EER poderia ser utilizado para estimar o “preço de equilíbrio”

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do produto agrícola, conforme Cuadra & Rydberg (2006). A Figura 6 ilustra os fluxos agregados de emergia usados nos cálculos dos índices emergéticos.

APLICAÇÃO DO MÉTODO: A PRODUÇÃO DE CORDEIROS NO ESTADO DE SÃO PAULO Ilustra-se a aplicação do método proposto usando os dados obtidos por Raineri (2012) em sua tese de doutorado, para a produção de cordeiros na região de São José do Rio Preto SP. Inicialmente, apresenta-se o diagrama do sistema de emergia da fazenda representativa, conforme consta na Figura 7.

Figura 6. Diagrama dos três braços mostrando os fluxos agregados de emergia da natureza (I = R + N), fluxos agregados de emergia da economia (F = M + S), com as respectivas frações renováveis e não renováveis, e o fluxo de emergia total usado (U = I + F) incorporado no produto. Estes fluxos agregados são usados para construir os índices emergéticos de sustentabilidade. Fonte: desenho baseado em Brown & Ulgiati (1997).

Figura 7. Modelo conceitual do sistema de ovinocultura de corte, de ciclo completo para a região de São José do Rio Preto SP.

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O modelo conceitual apresentado na Figura 7 foi construído com base em Raineri (2012), que avaliou os custos de produção de cordeiros. Ao lado dos limites direito e superior do diagrama estão alocados os fluxos dos principais insumos adquiridos no mercado e que compõem a estrutura do custo de produção. Esses fluxos ocorrem em ciclo de retroalimentação financeira, associados à venda de produtos, que no caso da propriedade estudada, se refere aos cordeiros, animais de descarte e os reprodutores, que a cada três anos sofrem reposição. Os fluxos financeiros de venda de produto e compra de insumos formam o estoque de capital financeiro da unidade de produção. A estrutura de custo de produção também considera o uso dos estoques internos, no período da avaliação econômica, dentre eles a infraestrutura (construções, máquinas equipamentos e suas respectivas depreciações), animais (reprodutores), áreas de terra de pastagem que formam o capital físico, e o capital humano formado pela mão de obra permanente (assalariada, fixa) e mão de obra diarista (de fora do sistema). Ao lado do limite esquerdo do diagrama são alocados os fluxos de energia de fontes da natureza (sol, vento, chuva e água de córrego) que formam o capital natural. Em geral, as fontes de energia da natureza são gratuitas (no caso da água de córrego pode estar sujeita ao pagamento pelo uso da água, conforme as normas da bacia hidrográfica). No lado do limite inferior do diagrama é representado o fluxo de saída de energia devido à entropia do sistema (degradação de energia que não produzirá trabalho). Como pode ser observado, o modelo conceitual identifica todas as relações entre os recursos obtidos de fora e dentro do sistema (representado pelo retângulo), bem como as relações internas. No diagrama, é possível identificar dois ciclos de retroalimentação auto catalítica: o de reciclagem de dejetos dos animais para o solo e outro de ciclagem de pastagem para o solo que são importantes para a sustentabilidade do sistema. A Tabela 1 traz os índices emergéticos para o sistema de produção considerado.

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Tabela 1. Índices Emergéticos para o sistema de produção de ovinos em São José do Rio Preto

UEV a (transformidade); EYR b (taxa de rendimento emergético); ELR c (razão de carga ambiental); ESI d

(índice de sustentabilidade emergética); %R e (renovabilidade); EIR f (razão de investimento de emergia); EER g (razão de intercâmbio emergético); %Renovabilidade parcialh (considera as frações renováveis dos materiais e bens de serviços do sistema); ELR parciali (considera no cálculo as frações renováveis de recursos de material e serviços).

A UEVs da ovinocultura de São José do Rio Preto foram calculadas em termos da quantidade total de emergia necessária para a produção de uma unidade) de energia produzida em joules/ha.ano (Transformidade, Tr) e por peso de animal produzido em kg/ha.ano (Emergia específica) de todos os produtos produzidos no sistema, sendo eles o cordeiro, as matrizes de descarte e os reprodutores de descarte. Os valores das UEVs encontrados para todo o sistema foram de 5,25E+05 sej/J e sej/kg sendo coerentes com a hierarquia de emergia dos materiais conforme Odum (1996). O valor encontrado para Renovabilidade (%R), sem considerar a fração renovável dos recursos da economia, para a produção de ovinos foi de 20,87%. A análise emergética considera que sistemas sustentáveis no longo prazo apresentem alta renovabilidade, principalmente devido à crescente carência de petróleo e seus derivados na produção, que é comum nos sistemas de produção agropecuária, particularmente os sistemas convencionais. Quando se inclui a fração renovável nos cálculos valorizam-se os recursos sustentáveis da economia, e %Ren parcial sobe para 38,31%. Nos próximos parágrafos, será apresentada uma análise comparativa nesse sentido. Segundo Brown & Ulgiati (2004), as atividades com rendimento Emergético (EYR) entre 1 e 2 produzem pequena emergia líquida. Os sistemas com rendimento emergético entre 2 e 5 contribuem em forma moderada ao crescimento da sociedade. Os processos de transformação com rendimento emergético maior que 5, são sistemas de produção que apresentam uma alta emergia líquida e contribuem significativamente para o crescimento econômico. O sistema de produção de ovinos

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considerado apresentou EYR de 1,27, indicando uma atividade com baixa produção de emergia liquida. O ELR, que indica a degradação ambiental sobre o local, foi de 3,79, sem considerar as frações renováveis, e igual 1,61 considerando as frações renováveis de cada insumo e serviço, indicando a longo prazo que o sistema produz impactos moderados no meio ambiente. Este resultado completa as informações encontradas nos indicadores EIR e ESI, de 3,77 e 0,33, respectivamente, que ressaltam mais uma vez a dependência de forças externas da economia. Para melhorar os índices emergéticos e a sustentabilidade da ovinocultura de SJRP é necessário diversificar a produção, por exemplo, pelo cultivo dos insumos alimentares mais utilizados na alimentação dos cordeiros, o milho e a soja. A Tabela 2 traz as forças ambientais e econômicas no sistema de ovinos, expressas tanto em fluxo de emergia quanto em valor financeiro da emergia (Emdólar).

Como discutido anteriormente, o sistema analisado é altamente dependente dos recursos econômicos. Isto fica claro quando se observa a representatividade de cada recurso na emergia total do sistema (Y). Os materiais e insumos (M) representam 64,94% de toda a emergia e, em termos de Emdólar equivale a um total de US$ 1.856,33/ha.ano. Quando se analisa quais itens mais contribuem para este valor, são encontrados os itens de alimentação: soja e milho utilizados na fabricação do concentrado dos cordeiros, com 15,87% e 11,19% de toda a emergia incorporada. Identificar e compreender quais itens contribuem para deixar o sistema mais sustentável, do ponto de vista da síntese emergética, é uma das grandes vantagens do método. A metodologia da síntese emergética permite o cálculo dos índices emergéticos já propostos por Odum (1996) e de novos indicadores. Por se tratar de uma metodologia ainda em adaptação para a produção animal, é possível criar indicadores específicos de interesse. A metodologia permite sua utilização em conjunto com outros indicadores de sustentabilidade e de eficiência econômica. A Tabela 3 permite comparar os resultados encontrados neste estudo com

Tabela 2. Forças ambientais e econômicas no sistema de ovinos, expressas em fluxo de emergia (sej/ha.ano), bem como porcentagens de contribuição para produção total de emergia (Y).

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outros resultados da literatura. Rodríguez-Ortega et al. (2017) realizaram estudo comparativo no mediterrâneo da Espanha comparando três sistemas de criação de ovinos: o primeiro sistema em regiões montanhosas altas, com pastagem nativa (SMP); o segundo sistema de produção caracterizado pela produção integrada de pastagens nativas e pastagens cultivadas, localizado nas áreas baixas das montanhas (SPC); e o terceiro, parcialmente possui um sistema integrado de pastagens e plantação e cereais, localizado em uma área de planície (SPP).

O sistema avaliado (SJRP) apresentou os índices semelhantes aos encontrados por Rodríguez-Ortega et al. (2017) no terceiro sistema, caracterizado por aquele de planície com integração parcial de pastagens e plantações. Para este sistema, as Transformidades apresentaram a mesma grandeza (E+05). Os sistemas SMP e SPC, que incorporam melhor os recursos da natureza, de forma sustentável, apresentaram maiores valores para o índice que mede a taxa rendimento emergético (EYR). Tais resultados condizem com aqueles para o índice de carga ambiental (ELR), que mede a pressão ambiental no sistema local. Por aproveitarem melhor os recursos naturais e dependerem menos dos recursos da economia, possuem uma menor pressão ambiental. Para este índice permanecer baixo (ideal) é necessário aumentar a contribuição dos recursos renováveis dentro do sistema. O índice de sustentabilidade (ESI), que avalia a relação da economia e a carga ambiental do sistema, sugere maior nível de sustentabilidade para os sistemas que utilizam mais racionalmente os recursos da natureza. Esta informação confirma os achados anteriores para os indicadores discutidos previamente. Quando se analisa a percentagem de renovabilidade dos sistemas, sem considerar a fração renovável dos recursos da economia, observa-se que, apesar de não apresentar uma alta porcentagem, o sistema de SJRP apresentou maior renovabilidade que o sistema de integração de pastagem e lavoura nas planícies do mediterrâneo da

Tabela 3. Comparação entre os índices emergéticos encontrados para a ovinocultura em São José do Rio Preto (SJRP) e resultados da literatura

¹SMP, sistema em regiões montanhosas altas, com pastagem nativas; ² SPE, sistema de produção integrada de pastagens nativas e pastagens cultivadas, em áreas baixas montanhosas, ³SPP sistema integrado de pastagens e plantação e cereais, localizado em uma área de planície. UEV a (transformidade); EYR b (taxa de rendimento emergético); ELR c (razão de carga ambiental); ESI d (índice de sustentabilidade emergética); % R e (renovabilidade); EIR f (razão de investimento de emergia); EER g (razão de intercâmbio emergético); % Renovabilidade parcial h (considera as frações renováveis dos materiais e bens de serviços do sistema); ELR parciali (considera no cálculo as frações renováveis de recursos de material e serviços).

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Espanha. Porém, quando se analisa o índice de rendimento econômico (EIR), o sistema de SJRP apresentou maior valor, ao ser comparado aos outros três sistemas. Isto porque o sistema é altamente dependente dos recursos da economia (materiais e serviços) e a natureza tem pouca contribuição, ou possui uma contribuição relativamente menor que os demais. No sistema no qual os animais são criados nas regiões com maiores altitudes das montanhas, e a natureza tem uma alta contribuição para ao sistema, este indicador é menor que 0, portanto o sistema é mais competitivo em termos de custos econômicos e mais sustentável, em índices emergéticos.

CONSIDERAÇÕES FINAIS E POSSIBILIDADES PARA FUTURAS PESQUISAS NA PRODUÇÃO ANIMAL Conforme Ortega & Soldera (2003), se há o interesse da sociedade em agregar valor aos produtos provenientes de sistemas de produção sustentável que têm os atributos de menor dependência de insumos comprados, capacidade de gerar empregos, menor uso de agrotóxicos, capacidade de preservar e aproveitar a biodiversidade, possibilidade de proteger nascentes e a paisagem, capacidade de reciclar, capacidade de auto-organização e de negociar preços justos, então a síntese emergética (SE) pode contribuir com indicadores apropriados. Este capítulo procurou apresentar o potencial da SE em estudos integrados com os custos de produção para a avaliação da sustentabilidade na produção animal.Acredita-se tratar de uma linha de pesquisa promissora não apenas em termos científicos, mas também em termos práticos, no sentido de contribuir com a orientação de técnicos e produtores. A seguir são apresentados alguns projetos de pesquisa que estão em desenvolvimento no Laboratório de Análises Socioeconômicas e Ciência Animal (LAE) e que apresentam potencial de utilizarem a Síntese Emergética em seus escopos. São eles:

1. Desenvolvimento de modelo de cálculo de custo de produção e de análise da sustentabilidade na bovinocultura de corte a pasto

A pecuária a pasto no Brasil é caracterizada por ser uma atividade repleta de particularidades e diversidades. Por esta razão, analisar e comparar sistemas de produção de bovinos a pasto é um desafio, principalmente do ponto de vista econômico. Quando se avalia a produção inserida em um contexto de demanda por sustentabilidade, em seu sentido mais amplo, o desafio é ainda mais significativo. Dentro deste contexto, há a necessidade de desenvolver estudos que

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busquem compreender as características das distintas fases de criação de bovinos a pasto, que possibilitem alcançar maior eficiência produtiva e econômica, sem deixar de considerar a sustentabilidade do sistema. O projeto de pesquisa tem por finalidade desenvolver um modelo de cálculo que permitirá estimar: a) o custo de produção de bovinos criados a pasto na fase de cria e; b) avaliar a sustentabilidade utilizando a síntese emergética. Posteriormente será possível por meio do modelo de cálculo de custo e da pesquisa de campo, desenvolver um Indicador de Custo de Produção e de Sustentabilidade de bovinos de corte na fase de cria no sistema extensivo de pastejo.

2. Avaliação econômica das práticas para mitigar a emissão de gases de efeito estufa em sistemas de pastagens no Sudeste brasileiro

A pecuária de corte no Brasil apresenta uma importante atividade econômica, mas a grande maioria destes sistemas tem uma dependência das pastagens, tornando-se principalmente sistemas de produção extensivos com pouca eficiência produtiva e índices de sustentabilidade negativos; sem embargo, neste sistema têm sido aplicadas diferentes metodologias de avaliação ambiental, como é o caso das pegadas ecológicas ou o ciclo de vida, entre outras, convertendo-se em ferramentas ambientais para a tomada de decisões (Rodríguez-Ortega, 2017). No entanto, estas metodologias não envolvem a totalidade do sistema nem o seu resultado econômico, gerando incertezas nos resultados obtidos após a sua aplicação. Nestes contextos a síntese emergética proposta por Odum (1996) pode tornar-se ferramenta útil para avaliar a sustentabilidade da pecuária de corte brasileira, considerando o impacto no ecossistema, além de permitir determinar o grau de uso de recursos renováveis e não renováveis, podendo auxiliar na toma de decisões mais assertivas. Tem-se buscado diferentes estratégias de produção mais eficientes, baseadas no manejo das pastagens ou a integração de outras atividades, tais como: o pastoreio rotacional, pastagens diferidas e sistemas integrados (lavora-pecuária-floresta). A aplicação da síntese emergética na avaliação e comparação destas estratégias torna-se uma ferramenta efetiva, permitindo conhecer a sustentabilidade dos sistemas produtivos por meio dos indicadores emergéticos (Bacic et al., 2010).

3. Desenvolvimento de modelo e de indicadores para análises econômicas e síntese emergética na produção de frangos de corte

Na produção avícola, as futuras pesquisas utilizando a síntese emergética

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visam aliar as ferramentas gerenciais de custo de produção a conceitos ecológicos e termodinâmicos, utilizando premissas da Teoria de Sistemas para buscar caminhos que possibilitem avaliar a sustentabilidade de seus sistemas produtivos de importância comercial (frango de corte, poedeiras comerciais etc.). Como visto neste capítulo, a metodologia permite comparar os indicadores de sustentabilidade de sistemas convencionais de produção (sistemas de produção intensivos) a sistemas alternativos (cage-free; antibiotic free) que vêm ganhando espaço no mercado nacional e mundial. Esta comparação, por sua vez, pode indicar gargalos e medidas produtivas mais sustentáveis que possam ser incorporadas ou extraídas dos sistemas, com o intuito de torná-los mais promissores. Outra contribuição que a síntese emergética tem a fornecer no estudo dos sistemas de produção avícola, bem como em todos os demais sistemas de produção animal, diz respeito ao fornecimento de ferramentas que permitam o desenvolvimento de indicadores e a criação de políticas públicas que objetivam eventual bonificação dos atores do processo produtivo, de acordo com seus índices emergéticos.

4. O efeito cascata do ciclo do nitrogênio na cadeia produtiva da soja brasileira destinada à produção animal na Europa

Na produção de soja, a Síntese Emergética agrega valor nas avaliações econômicas, sociais e ambientais do setor, já que a soja e seus derivados são importantes produtos para a balança comercial brasileira e têm crescimento expressivo em quantidade produzida e valores de exportação. Além disso, há uma crescente demanda internacional por produtos que são produzidos respeitando o meio ambiente e a sociedade. Neste sentido, a SE facilita a quantificação dos impactos ambientais e a comparação entre os sistemas de produção, por exemplo, sistemas orgânicos, sistemas com uso de transgênicos e sistemas com plantas convencionais. Pode-se também avaliar o fluxo de nutrientes e energia para o mercado externo, e o ciclo destes no sistema de produção do país importador do produto brasileiro, dando uma visão mais sistêmica dos impactos ambientais, sociais e econômicos da atividade. Outra contribuição da SE para a cadeia da soja, seria auxiliar a tomada de decisões políticas e gerenciais acerca do sistema, a partir de novas alternativas de produção mais sustentáveis e específicas para o país, facilitando assim o acesso dos produtos brasileiros aos mercados mais exigentes.

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Anexo 1. Símbolos propostos por Odum (1996) usados no diagrama do modelo conceitual do sistema.

Anexo 2. Tabela de avaliação emergética, conforme modelo proposto por Odum (1996).

Os recursos da natureza, materiais agrícolas e serviços introduzidos nos sistemas de produção estudados (representados pelas linhas curvas do diagrama) são convertidos em fluxos de emergia (medida como emjoules solar - sej) tendo

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como base as quantidades de materiais ou serviços de cada fluxo numa linha de cálculo da tabela de avaliação de emergia proposta por Odum (1996). A tabela de avaliação de emergia é organizada em 6 colunas, com os seguintes tópicos conforme na tabela abaixo:

Esquema de organização de uma tabela de avaliação dos fluxos de energia.

Fonte: Baseado em Odum (1996, pp 79). O exemplo da nota 26 foi extraído da Tabela de fluxo de emergia dos Estados Unidos, 1983, apresentado por Odum (1996, pp.187).

A coluna 1 indica o número do item (fluxo de energia) descrito na respectiva linha, o qual também é o número da nota-de-rodapé onde são citadas as fontes de dados e são mostrados os cálculos dos demais coeficientes. A coluna 2 indica o nome do item de entrada na tabela que também é mostrado como uma linha curva no diagrama do sistema de energia.A coluna 3 contém as quantidades do respectivo item, em unidades: joules, gramas ou monetários (dólares ou reais), derivados das várias fontes, evitando-se a dupla contagem. A coluna 4 contém o coeficiente de transformidade em emjoules solar por unidade (sej/J; sej/g; ou sej/$). A transformidade é a emergia de um tipo que é requerida para fazer uma unidade de energia de outro tipo. Os valores das transformidades para os diversos recursos naturais, materiais e serviços são obtidos de vários estudos publicados anteriormente e divulgados em forma de tabelas de transformidades, exemplo Ortega (2019). Odum (1996) apresenta os coeficientes de transformidades para diversos itens, os quais devem ser corrigidos por um fator de 1,68 em função de novos cálculos efetuados para a emergia solar global que passou de 9,44 E24 sej/ano para 15,83 E24 sej/ano, conforme Odum (2000).

Nota 26. Eletricidade total usada no ano de 1983: 2,31x1012kwh (fonte: EIA/DOE, 1984b, p195):(2,31x1012 kWh)(3,606x106 J/kWh) = 8,32x1018 J. Em$ calculado dividindo-se a coluna 5 por 2,4x1012sej/$ (valor de referência para se transformar emergia em Em$) para os USA ano base de 1983.

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A coluna 5 contém a contribuição do item (fluxo) em termos de emergia solar para o sistema. A coluna 5 é calculada pelo produto das colunas três e quatro. A coluna 6 é o valor em emdólares que estima a riqueza real, tendo como base a relação emergia/moeda agregando-se os principais recursos usados na economia de um país para formar o PIB em um determinado ano. O valor da coluna 6 é obtido dividindo a emergia na coluna 5 pela relação de emergia/moeda do país durante o ano selecionado. O valor do emdólar do PIB do Brasil foi calculado por Pereira (2012) em: 3,30E+12 sej/U$

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CAPÍTULO VEMPREGO DE BETA-GLUCANOS NA NUTRIÇÃO ANIMAL

Larissa Risolia¹, Milena Lacerenza², Rafael Zafalon¹, Mariana Rentas¹, Roberta

Rodrigues¹, Mariana Perini¹, Andressa¹, Raquel Pedreira¹, Daniela Machado¹,

Henrique Macedo¹, Thiago Vendramini¹, Marcio Brunetto¹

¹ Departamento de Nutrição e Produção Animal, FMVZ/USP, Pirassununga - SP² Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos - FZEA/USP, Pirassununga – SP

RESUMOBeta-glucanos são classificados como modificadores biológicos, pois podem alterar o metabolismo da glicose e lipídeos. Além disso, proporcionam aumento de saciedade nos animais, modulação de citocinas inflamatórias e efeitos prebióticos. O uso de beta-glucanos como coadjuvantes no tratamento da obesidade vem sendo cada vez mais pesquisado. A obesidade é uma das desordens nutricionais mais comuns em cães e gatos e está relacionada com o desenvolvimento de comorbidades crônicas, tais como a resistência insulínica e produção de citocinas pró-inflamatórias. Um estudo realizado pelo nosso grupo buscou avaliar os efeitos da suplementação de 0,1% de beta-glucanos no metabolismo da glicose e lipídios, citocinas inflamatórias e parâmetros de saciedade em cães obesos. Verificou-se melhor controle glicêmico, redução sérica de triglicérides e de colesterol, além do aumento da saciedade e redução de citocinas pró-inflamatórias. Em um segundo estudo, objetivou-se avaliar o efeito da utilização dos beta-glucanos na endotoxemia de equinos por meio da modulação da resposta inflamatória. Contudo, na dosagem utilizada (10mg/kg/dia) e nas condições de realização do estudo, o nutracêutico não resultou em alterações nos parâmetros bioquímicos, valores hematológicos e nas citocinas inflamatórias observadas, mas houve aumento de células macrofágicas. Desta maneira, os beta-glucanos possuem potencial para serem utilizados na nutrição animal com diversos intuitos, como modulação do metabolismo, saciedade, inflamação e imunidade.

INTRODUÇÃO1.1. O que são beta-glucanos Os beta-glucanos pertencem ao grupo dos polissacarídeos, por serem compostos por moléculas de glicose. Estruturalmente são compostos por monômeros de glicose ligados entre si por ligações beta glicosídicas (Guillon e Champ, 2000) e

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são os principais componentes estruturais da parede celular de leveduras, fungos e algumas bactérias. Os cereais como cevada e a aveia também contêm beta-glucanos como parte das células da parede celular de seu endosperma (Volman et al., 2008). As ligações podem apresentar-se nas formas beta 1,3; beta 1,4 ou beta 1,6. Essa diferença tem efeito na atividade metabólica dos beta-glucanos, pois altera o padrão e o grau de ramificação, a formação helicoidal, o peso molecular, a solubilidade em água e conformação do anel da estrutura (Daou & Zhang, 2012). Dependendo da fonte, existem diferenças na estrutura macromolecular dos beta-glucanos. Os que são provenientes de leveduras e fungos consistem de monômeros de glicose com ligações beta 1,3 ligados a pequenos resíduos ramificados constituídos por ligações beta 1,6 (Volman et al., 2008). Por outro lado, os beta-glucanos das paredes celulares de cereais como a aveia e a cevada são formados por monômeros de glicose de ligações beta 1,4 ligados de forma linear, porém alternados aos monômeros de glicose constituídos por ligações beta 1,3, enquanto que os beta-glucanos de origem bacteriana somente apresentam ligações beta 1,3 lineares entre seus monômeros (Estrada et al., 1997; Brown e Gordon, 2003; Brown et al., 2003). Os beta-glucanos são classificados como fibras solúveis (Jayachandran et al., 2018) pois possuem características relacionadas ao aumento de viscosidade do conteúdo presente no trato gastrintestinal. Com isso, ocorre a redução da taxa de passagem do alimento, redução da digestibilidade ocasionada por maior dificuldade de acesso das enzimas digestivas ao conteúdo alimentar, redução da velocidade com que os nutrientes são absorvidos pela corrente circulatória e aumento de tempo em que ocorre esta absorção. Esta última característica é muito interessante para alimentar pacientes com diabetes, resistência insulínica ou até mesmo obesidade, uma vez que promove redução do pico glicêmico e aumento do tempo de absorção de glicose, o que mantém mais tempo a supressão da liberação do hormônio glucagon e consequentemente pode aumentar a saciedade. Os mecanismos de ação destes efeitos serão descritos mais detalhadamente ao longo deste capítulo.

1.2. O uso dos beta-glucanos em animais obesos A obesidade em animais de companhia é um problema em expansão e o aumento de sua prevalência está intimamente relacionado aos hábitos dos animais, como redução do gasto energético e o fornecimento de alimento seco de forma ad libtum. O acúmulo excessivo de gordura pode levar ao aparecimento de comorbidades como lipidose hepática (nos gatos), doença do trato urinário inferior, alterações dermatológicas, resistência insulínica e diabetes (nos gatos). O status

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inflamatório ocasionado pela condição obesa parece ter influência direta sobre o aparecimento dessas condições. Além disso, animais obesos podem apresentar também dislipidemia já caracterizada como alterações no perfil de lipoproteínas e aumento de triglicerídeos e colesterol (Brunetto et al., 2011). A composição da dieta dos animais, bem como o uso de nutracêuticos pode beneficiar animais obesos com resistência insulínica e diabéticos. Neste sentido, os beta-glucanos podem promover possíveis benefícios, pois podem alterar o metabolismo da glicose (Vetvicka e Oliveira, 2014; De Oliveira Silva et al., 2015) e de lipídeos (Andrade et al., 2016, Ferreira, 2016). Os efeitos dos beta-glucanos no tratamento da obesidade e do sobrepeso são normalmente associados aos efeitos secundários do nutracêutico nas características de organismos obesos e, não diretamente sobre o emagrecimento propriamente dito (Ríos-Hoyo & Gutiérrez-Salmeán, 2016). Apesar disso, Aoe et al. (2017) demonstraram que o consumo de beta-glucanos de cevada levou a redução da gordura visceral em indivíduos obesos.

1.3. Beta-glucanos, obesidade e resistência insulínica Existem diversos mecanismos que podem justificar a influência da obesidade na indução de resistência insulínica. Um destes é a redução de receptores de insulina e defeitos nos receptores e pós-receptores envolvidos no metabolismo da glicose (Kolterman et al., 1981). Outra maneira que pode implicar em redução da sensibilidade insulínica é a secreção de adipocitocinas pelos adipócitos, dentre elas a resistina e a adiponectina, que estão correlacionadas à regulação da sensibilidade insulínica (Silha et al., 2015). Além disso, o excesso de tecido adiposo corporal pode resultar em redução da expressão do transportador GLUT4, que possui resposta rápida e eficiente frente à insulina (Brennan et al., 2004). Os efeitos dos beta-glucanos na secreção de insulina e na glicemia têm sido relacionados também à propriedade desse polissacarídeo de induzir alta viscosidade quando em solução e resultar em uma camada gelatinosa. Esta camada resiste aos efeitos convectivos das contrações intestinais e assim, influenciam na redução da absorção de açúcar pelos enterócitos (Mälkki, 2001; De Paula et al., 2005). A literatura aponta que mesmo uma pequena inclusão de beta-glucanos é capaz de reduzir glicemia e insulinemia (Ekstrom et al., 2017). Brockman et al. (2013) avaliaram em ratos obesos e hiperglicêmicos os efeitos do consumo de uma dieta rica em beta-glucanos sob o controle glicêmico, lipemia e marcadores de resistência à insulina. O grupo teste foi alimentado com dieta contendo 6,0% de beta-glucanos proveniente de farinha de cevada; o controle positivo recebeu dieta contendo 6,0% de celulose e um grupo de ratos magros (controle negativo) recebeu dieta igual ao controle positivo. Os resultados

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observados no grupo teste em relação ao controle positivo foram: menor área abaixo da curva durante o teste oral de tolerância a glicose; menor porcentagem de hemoglobina glicosada e maior concentração de adiponectina plasmática (que possui correlação negativa com a massa gorda e resistência insulínica), achado que embasa a hipótese de que o consumo dos beta-glucanos melhora a sensibilidade à insulina e o controle glicêmico. Além disso, especificamente houve aumento da viscosidade no conteúdo do intestino delgado dos ratos do grupo teste em relação aos dois grupos controles. Os autores questionaram se esses resultados foram atribuídos à viscosidade aumentada do conteúdo intestinal, relacionada ao maior tempo de esvaziamento gástrico, diminuição do acesso às enzimas digestivas e consequente redução da difusão da glicose às camadas epiteliais intestinais; e/ou a maior produção de ácidos graxos de cadeia curta pelo processo de fermentação dessa fibra, já que estes foram identificados como ativadores de receptores no tecido adiposo que inibem a lipólise e reduzem a liberação de ácidos graxos não esterificados, que podem se acumular no fígado e aumentar a resistência insulínica. Contudo, Battilana et al. (2001) apontaram existir indícios de que a alteração na glicemia ocorre antes que haja tempo necessário para a formação de produtos da fermentação no organismo. Em cães há apenas um trabalho que avaliou o efeito da ingestão de 15mg/kg de beta-glucanos no perfil glicêmico desses animais com hiperglicemia (induzida pela administração de estreptozootocina), que resultou em diminuição significativa da glicemia (Vetvicka & Oliveira, 2014).

1.4. Beta-glucanos e saciedade Em uma revisão de 33 artigos publicados entre 2000 e 2010 sobre o uso de beta-glucanos na dieta de pessoas, Cloetens et al. (2012) atribuíram o aumento da viscosidade intestinal como o possível mecanismo benéfico do uso dessas fibras na dieta como indutor do aumento da saciedade. Sessenta por cento dos estudos avaliados nesta revisão dosaram hormônios intestinais, como grelina, colecistoquinina e polipeptídeo Y (PYY); e demonstraram que os beta-glucanos possuem ação sobre o apetite. Ainda nesta revisão, a maioria dos estudos demonstrou que a administração dos beta-glucanos em humanos poderia diminuir as concentrações séricas de glicose e insulina em pessoas saudáveis e em indivíduos com desordens metabólicas (Cloetens et al., 2012). Pela avaliação das concentrações de hormônios intestinais, como grelina, colecistoquinina e PYY, Cloetens et al. (2012) relataram que os beta-glucanos possuem ação sobre o apetite, efeito considerado benéfico no tratamento da obesidade. Os autores ainda reportaram que a administração dos beta-glucanos em

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humanos pode diminuir as concentrações séricas de glicose e insulina em pessoas saudáveis e em indivíduos com desordens metabólicas. Acredita-se que o hormônio glucagon-like peptide-1 (GLP-1) seja responsável por reduzir a fome e aumentar a saciedade (Verdich et al., 2001; Edholm et al., 2010). Ele é liberado pelas células intestinais em resposta à ingestão de nutrientes e ocasiona o aumento da produção de insulina e assimilação de glicose (Asmar et al., 2011). Em um estudo com seres humanos em sobrepeso foi testada uma dieta contendo fibra solúvel proveniente dos beta-glucanos em comparação a outro grupo controle e, as pessoas que receberam a dieta teste reportaram maior sensação de saciedade no intervalo entre refeições (Kim et al., 2006). Além disso, este aditivo está associado à maior liberação de PYY (Vitaglione et al., 2009), hormônio relacionado com a saciedade e a sinalização de satisfação cerebral, que desempenha papel importante no controle da obesidade (Huang et al., 2011). Como mecanismos de ação propostos que resultam neste efeito além dos hormonais citados anteriormente, estão a o aumento da viscosidade do conteúdo intestinal que resulta na redução da taxa de esvaziamento e aumenta a saciedade entre refeições (Drzikova et al., 2005), e o efeito prebiótico do beta-glucano, que promove aumento das concentrações de acetato e butirato, metabólitos que atuam diretamente na regulação de apetite pelo sistema nervoso central (Psichas et al., 2015).

1.5. O uso de beta glucanos no controle de colesterol Em seres humanos, a redução das concentrações de colesterol foi associada ao menor risco de doenças coronárias (Andersson et al., 2010) e os beta-glucanos resultaram redução do colesterol plasmático. Em 1997, a FDA (US Food and Drug Administration) passou a recomendar a ingestão de 3g/dia de beta-glucanos com o intuito de reduzir o colesterol. Em um estudo que avaliou esta concentração, concluiu-se que esta dose pode ser usada como terapêutica para a redução de colesterol, principalmente de pacientes com diabetes mellitus do tipo II, uma vez que estes são mais propensos a desenvolverem doenças cardiovasculares (Liatis et al., 2009). O mecanismo exato para tal efeito ainda não foi muito bem definido, porém já existem algumas hipóteses. Atualmente, a hipótese mais aceita envolve a redução na capacidade absortiva de colesterol associada à sua maior excreção, na forma de sais biliares. Isso ocorre pelo aumento da viscosidade do conteúdo do trato gastrintestinal proporcionado pelos beta-glucanos (Gunness et al., 2012). A restrição da reabsorção de ácidos biliares resulta na redução do colesterol total no

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sangue, pois dessa forma mais colesterol é recrutado para a produção de novos ácidos biliares. Já a hipótese relacionada à redução da absorção envolve o fato da redução da transferência de lipídeos através da camada mucosa do intestino, o que levaria a menor reabsorção e maior período de absorção (Kerckhoffs et al., 2002). Ratos alimentados com dietas contendo aveia (a qual contem beta-glucanos na sua composição) apresentaram concentrações de acetato e de butirato maiores no conteúdo do cólon (Hu et al., 2013). Estes ácidos graxos de cadeia curta foram associados com a inibição da síntese de colesterol, o que pode contribuir com o efeito hipocolesteromiante da aveia em seres humanos e animais (Hara et al., 1999). No caso de hamsters, Tong et al. (2015) verificaram que os beta-glucanos reduziram a concentração de colesterol LDL pela promoção da excreção fecal de lipídeos e pela regulação das enzimas 3-hidroxi-3-metil gutaryl-coenzima A redutase e colesterol -7a-hidroxilase.

1.6. O uso de beta-glucanos como prebióticos Prebióticos são, por definição, ingredientes que quando fermentados de forma seletiva, permitem mudanças específicas na composição e/ou atividade da microbiota intestinal de maneira a proporcionar benefícios ao hospedeiro (Roberfroid, 2002). A fim de que tais substâncias alcancem a microbiota alvo e desempenhem o mencionado potencial, eles não podem ser digeridos pelas enzimas do intestino delgado e devem resistir à acidez gástrica estomacal. Além disso, não devem ser fermentados pelas bactérias orais e bactérias patogênicas do trato gastrintestinal, mas sim por bactérias benéficas, servindo de substrato para seu crescimento (Orel et al., 2014). Ao favorecerem a fermentação de bactérias benéficas e, consequentemente promoverem o aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta, os prebióticos podem reduzir o pH do microambiente intestinal e inibir o crescimento de bactérias patogênicas, as quais são beneficiadas pelo pH alcalino (Orel et al., 2014). Além disso, o butirato desempenha papel imprescindível na nutrição dos colonócitos, uma vez que contribui para o reparo tecidual após a injúria em casos de inflamação, por exemplo. Evidências demonstraram que este ácido graxo de cadeia curta pode agir diretamente como agente antinflamatório ao inativar o fator de transcrição intracelular NF-kB e atenuar a síntese de citocinas inflamatórias (Orel et al., 2014). A maioria das substâncias prebióticas são polissacarídeos não amiláceos que constituem as fibras dietéticas, indigeríveis pelas enzimas de humanos, cães e gatos, como os beta-glucanos. Hallert et al. (2003), em estudo controlado, introduziram pela primeira vez no tratamento clínico de humanos com colite ulcerativa, 60g de farelo de aveia (o qual contém beta-glucanos) por dia, durante 3

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meses. Os resultados indicaram aumento de 36% na concentração fecal de butirato, redução das dores abdominais e refluxo gastroesofágico após esta intervenção. Em um levantamento bibliográfico a respeito dos efeitos dos beta-glucanos na microbiota, Jayachandran et al. (2018) apontaram diversos estudos que evidenciaram o efeito modulatório da microbiota com este nutracêutico. Dentre eles, os autores encontraram como efeitos dos beta-glucanos provenientes da aveia e cevada a alteração na composição e metabolismo da microbiota, o que resultou em menor concentração de colesterol e como efeito da suplementação de beta-glucanos de Saccharomices cerevisae a alteração da população microbiana e imunomodulação.

1.7. Beta-glucanos e imunomodulação Em um recente trabalho realizado pelo centro de pesquisas em nutrologia de cães e gatos, Vendramini (2019) observou que cães obesos apresentaram menor taxa de linfoproliferação. Além dos animais obesos, animais convalescentes, com alguma doença ou debilitados imunologicamente poderiam se beneficiar de melhora imunológica. Neste contexto, os beta-glucanos apresentaram efeitos imunomodulatórios, por meio do aumento da fagocitose e da proliferação de células fagocíticas através de estímulo na medula óssea (Vetvicka, 2014). Como os beta-glucanos possuem apenas ligações beta, as quais não são digeridas pelo trato gastrintestinal superior, quando ingeridos por via oral, alcançam o intestino e são absorvidos pelos enterócitos e então são carreados pela corrente sanguínea pelos macrófagos. Uma vez no sangue, são direcionados para a medula óssea, onde exercem os efeitos de proliferação da produção de células fagocíticas. Em um estudo realizado em suínos infectados com E. coli suplementados com beta-glucanos derivados de algas, foram avaliados os efeitos em respostas imunes e verificou-se que houve melhora clínica dos animais (redução da frequência da diarreia), redução da permeabilidade intestinal, aumento da expressão de genes de barreira intestinal e aumento da produção de linfócitos T CD4 e T CD8 (Kim et al., 2019). Em outro estudo realizado pelo Centro de Pesquisas em Nutrologia de Cães e Gatos, foi verificado que a inclusão de 1% de um blend prebiótico que continha beta-glucanos na dieta de cães resultou em aumento do burst oxidativo e do índice de fagocitose dos animais (Rentas, 2018).

2 Resultados e discussãoConsiderando os efeitos benéficos relacionados aos beta-glucanos relatados anteriormente neste capítulo, o Centro de Pesquisas em Nutrologia de Cães e Gatos vem desenvolvendo pesquisas com o intuito de aprimorar a saúde, bem estar

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e longevidade dos animais com o uso deste nutracêutico. A seguir serão descritos e discutidos dois destes estudos que já foram concluídos.

2.1 Beta-glucanos de levedura para tratamento e prevenção da obesidade em cãesO primeiro estudo verificou o efeito da suplementação de beta-glucanos de levedura (Saccharomices cerevisae) no tratamento e prevenção de obesidade em cães. Este estudo foi idealizado ao se considerar que tanto a obesidade como o excesso de peso são as principais desordens nutricionais de cães e gatos (German, 2006; Bartges et al., 2017), sendo que se estima que até 60% da população de cães encontra-se nestas condições (Holmes et al., 2007; Courcier et al., 2010). Além disso, a obesidade acaba sendo mais grave por associar-se com afecções crônicas tais como endocrinopatias, aumento no risco de desenvolvimento de neoplasias e redução da expectativa de vida (German et al., 2010). O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da inclusão de 0,1% de beta-glucanos na dieta de cães obesos e avaliar marcadores de glicemia, insulinemia, triglicerídeos séricos, colesterol, citocinas inflamatórias e saciedade. O estudo contou com 3 grupos, sendo um obeso composto por 7 cães adultos com escore de condição corporal (ECC) 8 ou 9 (Laflamme, 1997) e que apresentavam resistência insulínica, determinada através do índice HOMA (homeostasis model assessment) de acordo com Xenoulis (2011). O segundo grupo também consistia de 7 animais adultos, porém em condição corporal ideal (ECC 5). O último grupo foi composto pelos mesmos animais obesos do grupo 1, após a ingestão de uma dieta com inclusão de 0,1 de Macrogard (Biorigin, São Paulo, Brasil) pelo período de 90 dias. Com o intuito de padronizar a alimentação no período pré-coleta basal, afim de não provocar influências dietéticas nos parâmetros avaliados, todos os animais foram submetidos a alimentação com uma dieta de manutenção por 15 dias. Após essa primeira coleta, os animais obesos passaram a constituir o grupo 3, ou seja, suplementado com beta-glucanos pelo período de 90 dias. A composição das dietas está descrita na tabela 1 e seguiu as recomendações da AAFCO (2016) para cães adultos. A quantidade de alimento fornecida aos animais foi suficiente para atender as recomendações de necessidade energética do NRC (2006) para cães adultos inativos. Para garantir manutenção da composição corporal ao longo do projeto, os animais foram pesados com uma frequência de 15 dias, afim de promover eventuais alterações na quantidade de alimento.

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Tabela 1. Composição das dietas experimentais1.

1Ingredientes: milho moído integral, arroz de cervejeiros, sorgo moído integral, farelo de subproduto de frango, farelo de arroz, polpa de beterraba, farinhas de carne e ossos, farelo de soja, gordura de frango, óleo de peixe, sabor hidrolisado do fígado, sal, pré-mistura Pettymeal® (MCassab, São Paulo, Brasil), antifúngico Amo Curb® (Kemin, São Paulo, Brasil), antioxidante Endox-5x® (Kemin, São Paulo, Brasil); 2MacroGard® (Biorigin, São Paulo, Brasil).

As análises bioquímicas e hormonais foram realizadas no T0 (após ingestão da dieta controle), e após os 90 dias recebendo o alimento contendo beta-glucanos (T90) para os animais do grupo 3. Os animais em jejum foram canulados com um cateter intravenoso periférico, dessa forma, foram coletadas amostras de sangue para avaliação de glicemia, insulina, amilina, glucagon, leptina, IL—6, proteína C-reativa, fator de necrose tumoral alfa, PYY, GLP-1, colesterol, triglicerídeos e funções renal e hepática. Além destas avaliações, também foi realizado um teste de tolerância à glicose intravenosa, descrito por Brunetto et al. (2011). Para isso, foi realizada infusão de 500mg de glicose por kg de peso corporal. Coletas de sangue para determinação da insulina sérica foram realizadas nos minutos 0; 2,5; 5,0; 7,5; 10; 15; 30; 45; 60; 90 e 120 após o término da infusão. Como estatística, para o teste de infusão de glicose utilizou-se a descrita por Carciofi et al. (2008) e Brunetto et al. (2011). A área abaixo da curva (referente à curva glicêmica pós- prandial) foi calculada pelo software Prisma (GraphPad Prism, version 5). A comparação entre os grupos foi realizada pelo teste T-student para as variáveis que atenderam a normalidade. Para as que não atenderam essa premissa utilizou-se o teste de Wilcoxon (P<0,05). Utilizou-se medidas repetidas no tempo para avaliar a concentração de glicose sanguínea, incremento de glicose, concentração sérica de insulina e incremento de insulina.

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2.1.1 Resultados e discussãoOs animais não apresentaram variação de peso ao longo do experimento. Em todos os grupos o pico glicêmico foi observado na primeira coleta após a infusão de glicose (Figura 1). Nos tempos 5; 7,5 e 10 minutos, os valores de glicose foram menores no grupo escore ideal do que no obeso, contudo, o grupo obeso suplementado não diferiu do grupo de animais em escore ideal. Em seres humanos saudáveis, o consumo de beta-glucanos melhorou o controle glicêmico e a resposta insulínica (Kaneko et al., 1997; Mosikanon et al., 2017), efeito também encontrado em pacientes humanos obesos e com diabetes mellitus do tipo 2 (Kim et al., 2009), semelhante aos resultados encontrados neste estudo.

Após 45 minutos, as concentrações de glicose sanguínea retornaram ao basal no grupo controle, porém isso não foi observado nos grupos obeso e suplementado obeso, mesmo após 120 minutos de teste. Nos demais tempos não foi observada diferença nos valores de glicemia entre os grupos. A concentração de insulina sérica foi maior nos animais obesos (com/sem

Figura 1. Efeito da ingestão dos beta-glucanos nas respostas glicêmicas e insulinêmicas. (a) curva glicêmica, (b) incremento de glicose, (c) curvas insulínicas, (d) incrementos de insulina dos grupos experimentais.

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suplementação) do que no grupo controle em todos os intervalos (P<0,05). A área abaixo da curva do incremento de glicose (AACIG) não diferiu entre os grupos, exceto no período de tempo entre 15 – 60 minutos (P<0,05) entre os grupos controle e obeso, suplementado e obeso (Figura 2). Com relação a área abaixo da curva do incremento de insulina (AACIIns), o único tempo de coleta em que não houve variação na secreção insulínica foi no intervalo entre 60-120 minutos. Por outro lado, todas as outras áreas abaixo da curva de insulina estavam maiores nos grupos obeso e obeso suplementado em comparação ao grupo controle (P<0,05).

Figura 2. Área abaixo da curva de incremento de glicose (a) e área abaixo da curva de incremento de insulina (b) obtidas durante o teste intravenoso de tolerância a glicose dos grupos experimentais.

Os valores de glicemia basal e média de glicemia foram maiores no grupo obeso em relação ao controle e obeso suplementado (P<0,05, Tabela 2). Resultados semelhantes foram obtidos para a concentração de insulina basal, embora o grupo suplementado obeso tenha apresentado valores intermediários (P<0,05, Tabela 2). Similar aos resultados encontrados, um estudo com ratos avaliou o efeito da inclusão moderada de beta-glucanos derivados de leveduras e demonstrou que os efeitos na glicemia não ocorrem em estado fisiológico, todavia, em animais com hiperglicemia induzida apresentaram redução significativa da glicemia (Vetvicka, 2014). Até o momento, foram encontrados apenas dois estudos que avaliaram os efeitos dos beta-glucanos na glicemia de cães; Vetvicka e Oliveira (2014) avaliaram o uso de duas diferentes fontes de beta-glucanos e observaram que em animais normais, 14 dias de suplementação dietética com beta-glucanos não resultou em efeitos significantes para a glicemia. Contudo, quando os animais foram induzidos a apresentar hiperglicemia, os beta-glucanos reduziram os valores glicêmicos para aqueles de referência (ou seja, encontrado em animais saudáveis), após 7 dias

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de suplementação. Ferreira et al. (2018) avaliaram os efeitos de beta-glucanos provenientes de plantas, na mesma dose do presente estudo. No período de 60 e 120 minutos após o consumo verificou-se efeito sobre o clearence de glicose após 28 dias de consumo.

A porcentagem de desaparecimento de glicose (K), meia vida de glicose (T½), o índice insulinogênico (‐I/‐G), o pico de resposta insulínica (PRI) e o pico do tempo de resposta insulínica (TRI) não apresentaram distribuição normal e foram avaliados pelo teste de Wilcoxon (Tabela 2). Esses resultados indicam que os grupos experimentais foram compostos por animais com tolerância à glicose diminuída de acordo com Kaneko (1997). Isso já era esperado uma vez que os animais foram selecionados por apresentarem resistência insulínica. É importante ressaltar que a resistência insulínica verificada no grupo obeso foi reduzida com a adição dos beta-glucanos. O K diferiu entre os 3 grupos (P<0,05) e o T½ e ‐I/‐G (P<0.05) do grupo controle foram diferentes em relação aos demais grupos. Contudo, o PRI e TRI (em minutos) não diferiram entre os grupos (P<0,05). As concentrações de colesterol e triglicerídeos foram maiores no grupo de animais obesos em relação ao controle, e o consumo de beta-glucanos afetou

Tabela 2. Valores (média ± erro padrão) de glicemia basal, insulina basal, glicemia mínima, glicemia máxima, glicemia média e valores medianos (mínimo-máximo) de K, T½, ΔI/ΔG, PRI e TRI observados nos grupos experimentais.

K: porcentagem de clearence de glicose; T½, tempo para glicemia reduzir pela metade; ΔI/ΔG, índice insulinogênico; PRI, pico de resposta insulínica; TRI, tempo do pico de resposta insulínica em minutos; A, B – médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas não diferem entre si pelo teste T-student (p < 0.05); A, B – Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas mesmas linhas não diferem pelo teste de Wilcoxon (p < 0.05).

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essas variáveis (Tabela 3). As fibras solúveis possivelmente retardam a absorção de triglicerídeos no intestino delgado (Reyna et al., 2003) e reduzem a taxa de absorção de glicose (Andrade et al., 2014). Além disso, outro mecanismo citado na literatura é a inibição direta da lipogênese pelas fibras solúveis (Brennan, 2005). Um estudo in vitro demonstrou que beta-glucanos de cevada e aveia inibiram a absorção de ácidos graxos de cadeia longa e de colesterol e, em ratos, suprimiu diversos genes envolvidos na lipogênese e no transporte lipídico (Liljeberg, 2000).

Não foram encontradas diferenças nas concentrações de amilina sérica e glucagon entre os grupos testados (Tabela 4). A concentração de leptina foi maior em animais obesos e nos animais obesos suplementados do que naqueles pertencentes ao grupo controle (p<0,05). Atualmente, o tecido adiposo é classificado como um tecido endócrino, pois produz diversos hormônios, citocinas, substâncias vasoativas e outros peptídeos (adipocinas), os quais se comunicam com o cérebro, leucócitos, células locais e tecidos periféricos (Drozdowski, 2010; Martin, 2010). Das adipocitocinas conhecidas, a leptina é a mais estudada. Embora a leptina seja secretada pelos adipócitos, o aumento da sua secreção é baseado no fluxo de energia nos adipócitos e as concentrações circulantes de leptina estão correlacionadas com a massa gorda (Trayhurn, 2005). Assim, conforme relatado na literatura, o grupo de animais obesos aumentou as concentrações séricas de leptina. Resultados semelhantes foram observados para as concentrações de proteína C reativa (Tabela 4). Apesar de não ter sido constatada diferença entre os grupos

Tabela 3. Concentrações plasmáticas de ALT, FA, creatinina, ureia, colesterol e triglicerídeos (média ± desvio padrão) nos grupos experimentais.

ALT: alanina aminotransferase; FA: fosfatase alcalina; A, B – Médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferem entre si pelo teste T-sudent (p<0.05).

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para IL-6, a suplementação de beta-glucanos resultou em concentrações mais baixas de TNF-alfa nos grupos controle e suplementado obeso em comparação ao obeso (P<0,05). Poucos estudos avaliaram como os polissacarídeos afetam os parâmetros de cães obesos, contudo, o aumento de IL-6, TNF e proteína C reativa foram bem documentados em cães obesos com resistência insulínica. Os beta-glucanos são capazes de exercer controle da inflamação, reduzindo esses fatores pró-inflamatórios. Sendo assim, é possível associar o seu efeito com o controle dessa alteração (German et al., 2012). O tecido adiposo sintetiza e libera fatores pró-inflamatórios, como TNF-‐, IL-6, IL-1 e proteína C reativa (Zoran, 2010). A alteração nas concentrações dessas adipocinas está direta ou indiretamente associada a alterações fisiológicas, metabólicas e imunológicas, o que resulta no aumento da produção e circulação de fatores relacionados à inflamação. Por exemplo, o TNF-‐, uma citocina conhecida por promover caquexia e produzida por macrófagos e adipócitos, e a IL-6, que possui função catabólica acentuada relacionada às reservas de energia orgânica, também estão envolvidas na resistência à insulina em diabéticos do tipo II (Khaodhiar et al., 2004). Os resultados do presente estudo corroboram os da literatura, onde as concentrações de adipocinas foram menores em animais em escore de condição corporal ideal do que em animais obesos. Contudo, os animais obesos apresentaram valores menores das concentrações de IL-6, proteína C reativa e TNF-alfa no grupo obeso suplementado do que no grupo obeso, e estes valores foram similares aos do grupo controle. A ingestão de beta-glucanos também foi capaz de alterar o hormônio GLP-1, responsável pela regulação do apetite (Tabela 4), sendo que os animais obesos que receberam a suplementação tiveram maior concentração do hormônio do que nos demais grupos (P<0,05). A saciedade é um dos fatores que atrapalha os programas de perda de peso (German, 2010). O GLP-1 é um hormônio envolvido no mecanismo de saciedade fisiológica (Mitsuhashi et al., 2013) e aumenta o tempo de esvaziamento gástrico e o tempo de transito intestinal (Beck et al., 2009). Esses efeitos podem levar a maior tempo de distensão gástrica com consequente sinalização de saciedade (Beck et al., 2009).

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Tabela 4. Concentração sérica (média ± erro padrão da media) de amilina, glucagon, leptina, adipocitocinas inflamatórias e hormônios reguladores de apetite nos grupos experimentais.

IL-6: interleucina 6; TNF-Δ: fator de necrose tumoral alfa; PYY: polipeptídeo Y; GLP-1: glucagon-like peptide-1; A, B – Médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferem entre si pelo teste T-student (P<0.05).

Por fim, concluiu-se que a suplementação com 0,1% de beta-glucanos na dieta de cães obesos reduziu a glicemia basal e média, insulina basal e a concentração de triglicerídeos e colesterol e, seus valores ficaram próximos aos de animais em escore de condição corporal ideal. Além disso, o nutracêutico resultou no aumento da concentração de GLP-1, indicativo de saciedade e reduzir as concentrações de TNF-alfa.

2.2) Efeito da utilização dos beta-glucanos na endotoxemia em equinosSabe-se que o desencadeamento da endotoxemia clínica nos equinos é frequente, em decorrência da elevada sensibilidade desta espécie aos lipopolissacarídeos (LPS) da membrana externa de bactérias gram-negativas, liberados para a circulação durante o processo de choque séptico. Em resposta a esta agressão, o organismo libera substâncias pró-inflamatórias, as citocinas, na corrente circulatória (Tilg & Moschen, 2006). Essa afecção está presente em grande parte dos casos de cólica equina, sendo responsável por piorar o prognóstico dos quadros clínicos, por gerar consequências como choques séptico e endotoxêmico, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, tromboflebite da jugular, laminite, íleo adinâmico, entre outros, além de retardar a recuperação dos animais e aumentar os índices

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de insucesso nos tratamentos de cólica (Cohen, 2002; Huttunen & Aittoniemi 2011; Chalupka & Talmor, 2012). Atualmente, os beta-glucanos provenientes de leveduras têm sido extensivamente utilizados como substância protetora contra infecções, devido sua capacidade de estimular o sistema imune, com potentes efeitos sobre a imunidade inata e adaptativa (Chen et al., 2013; Masuda et al., 2013). Tem-se sugerido também, que os beta-glucanos de grande peso molecular, que correspondem à maioria dos polímeros, podem ativar diretamente os leucócitos, estimulando suas funções fagocíticas, citotóxicas e atividade antimicrobiana, além de estimular a produção de mediadores pró-inflamatórios (Cloetens et al., 2012). Assim, acredita-se que os beta-glucanos advindos de leveduras que apresentam atividade moduladora de imunidade sistêmica poderiam ser benéficos no controle da endotoxemia em equinos, modulando a resposta inflamatória sistêmica. Portanto, os objetivos do estudo foram avaliar se a utilização de beta-glucanos por via oral exerce influência nos parâmetros físicos, valores hematológicos e na expressão de citocinas inflamatórias observados em equinos induzidos à endotoxemia experimental. Foram selecionados oito potros, machos e fêmeas, hígidos, com faixa etária de 18±3 meses, peso médio de 300±100kg, sem raça definida, os quais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos de quatro animais. Ambos os grupos foram submetidos à indução da endotoxemia, pela administração intravenosa de lipopolissacarídeos de E. coli (10mg/kg/dia). Durante 30 dias antes da indução da endotoxemia, os animais do grupo beta-glucanos (GB) receberam, por via oral, 10mg/kg/dia de beta-glucanos (MacroGard®, Biorigin) e os animais do grupo controle (GC) receberam, por via oral, 10mg/kg/dia de cloreto de sódio a 0,9%. Os equinos foram submetidos a exames físicos, avaliação hematológica, de líquido peritoneal e quantificação sérica das citocinas IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-‐. Os momentos de avaliação dos animais quanto ao exame físico, colheitas sanguíneas, colheita de líquido peritoneal ocorreram imediatamente antes da indução da endotoxemia (T0), imediatamente (T0+), e 15 (T15’), 30 (T30’), 60 (T60’), 90 (T90’), 120 (T2h), 180 (T3h), 240 (T4h), 360 (T6h), 480 (T8h), 600 (T10h) e 720 (T12h) minutos após indução da endotoxemia. Para a análise estatística foi realizado o teste t-Student para dados pareados, para as variáveis que atenderam as suposições de normalidade. As variáveis que não atenderam esta suposição foram analisadas pelo teste não paramétrico de Wilcoxon. Valores de P<0,05 foram considerados significativos. Foram observados diversos efeitos de tempo, característicos do processo adequado de indução da endotoxemia, a utilização de beta-glucanos por via oral resultou em modificações de AST (transaminase glutâmico oxalacética) (P=0,022),

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e GGT (gama glutamil transpeptidase) (P=0,001), proteína total (P=0,021), lactato (mmol/L) (P=0,026) sanguíneos, porém todas estas variáveis permaneceram dentro dos valores de referência para a espécie (Tabela 5). Tennant (1997) salientou que em todas as espécies domésticas a atividade da AST é alta no fígado, portanto, na lesão hepática aguda ou crônica, a atividade sérica de AST está elevada. Apesar dos equinos apresentarem aumento nos valores de AST em consequência de miopatia ou lesão hepática e, esta ser a principal razão para se incluir a AST no perfil bioquímico de equinos, como a tentativa de detectar doença hepatocelular (Stockham, 1995), os valores obtidos estão dentro do intervalo de referência para a espécie. De forma semelhante, a GGT elevada pode indicar lesões hepáticas, contudo, apesar de terem aumentado, ainda permaneceram dentro dos valores normais de referência (Kaneko, 2008). A hiperlactatemia após lesão e sepse pode ser o resultado de uma onda de adrenalina (James et al., 1999), mas apesar de aumentado, as concentrações de lactato estavam dentro do intervalo de referencia.

Tabela 5. Bioquímica sérica em função dos tratamentos experimentais que apresentaram alterações.

AST: aspartato transaminase; GGT: gama glutamil transpeptidase; BT: bilirrubina total; BI: bilirrubina indireta.No líquido peritoneal, além de densidade (p=0,011), lactato (p=0,003) e neutrófilos segmentados (%) (p=0,020), foram observados efeitos de tratamento para os macrófagos (%) (p=0,020) pressupondo a possível capacidade dos beta-glucanos de estimular o sistema imune (Tabela 6).

122

Tabela 06. Avaliação do líquido peritoneal em função dos tratamentos experimentais que apresentaram alterações.

Os leucócitos são atraídos para o foco da infecção através da quimiotaxia feita pelas citocinas. Dessa forma, ficam concentrados próximos às vênulas pós-capilares, onde passam através da barreira endotelial, chegando ao foco infecioso, num mecanismo denominado diapedese (quando os leucócitos ultrapassam as paredes dos vasos sanguíneos e vão em direção ao tecido afetado). É possível que tenha ocorrido leucopenia por recrutamento destas células para o foco infeccioso, com ocorrência de leucocitose compensatória após 120 minutos (processo fisiológico que ocorre em infecções) (Tizard et al., 2013). Não foram observados efeitos de tratamento nas citocinas avaliadas, apenas efeito de tempo para a interleucina 10 e o fator de necrose tumoral alfa (Tabela 7).

s

De acordo com os resultados obtidos pelo estudo, concluiu-se que a utilização de beta-glucanos por via oral na dosagem utilizada (10mg/kg/dia) e nas condições de realização do presente estudo exerceu pouca influência nos parâmetros bioquímicos, valores hematológicos e citocinas inflamatórias observadas em equinos induzidos à endotoxemia experimental, mas pode ter exercido efeitos na

Tabela 07. Citocinas em função dos tratamentos experimentais.

IL-6: interleucina- 6; IL-8: interleucina- 8; IL-10: interleucina- 10; TNF-alfa: fator de necrose tumoral alfa.

123

imunomodulação, com base no aumento de macrófagos. Novos estudos com tempo e doses maiores podem demonstrar outros possíveis efeitos.

Considerações finais Com base nas evidências apontadas neste capítulo, os beta-glucanos podem ser empregados em nutrição animal como possíveis moduladores do metabolismo, saciedade, processos inflamatórios e imunidade. AgradecimentosEm nome do Centro de Pesquisas em Nutrologia Pet, os autores agradecem as empresas Biorigin, pelo fornecimento do suplemento Macrogard® e Premier pet, pelo fornecimento dos alimentos industrializados.

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CAPÍTULO VIAVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO BUMP FEEDING SOBRE O DESEMPENHO DA

MATRIZ SUÍNA E DA LEITEGADA

Diego Feitosa Leal¹, Bruno Bracco Donatelli Muro¹, Bruno Braga Carnino¹,

Eduarda Buck Bernardes Guimarães¹, Emilye Izabele Cristina de Moraes¹,

Gabriela dos Santos Madella¹, Janaina Cristina da Silva Maciel de Souza¹, Laya

Kannan Silva Alves¹, Nicolas Carvalho Braga¹, Pedro Ventura Dibo¹, Rafaella

Fernandes Carnevale¹, Vitor de Oliveira Araújo¹, Cesar Augusto Pospissil

Garbossa¹

¹Laboratório de Pesquisa em Suínos (LPS), Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP

RESUMOO objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do aumento da quantidade de ração fornecida no terço final da gestação (bump feeding) sobre o desempenho da matriz suína e da leitegada, bem como, sobre a qualidade nutricional do colostro. Para tanto, 70 matrizes suínas de linhagem comercial híbrida foram selecionadas de acordo com histórico semelhante para o número de leitões nascidos por parto, escore de condição corporal e ordem de parto, e então foram distribuídas em dois grupos experimentais, totalizando 35 repetições por tratamento. Grupo 1: sem aumento da quantidade de ração fornecida no terço final da gestação (controle) e Grupo 2: aumento da quantidade de ração fornecida no terço final da gestação, a partir de 81 dias de gestação até o parto. Não houve diferença para o peso dos leitões ao nascimento, peso total da leitegada, número de nascidos totais, número de nascidos vivos, natimortos e eficiência placentária. Adicionalmente, os tratamentos não exerceram efeito sobre a qualidade nutricional do colostro. De acordo com os resultados do presente estudo, os benefícios do bump feeding são questionáveis, uma vez que nenhum efeito foi observado sobre o desempenho da matriz e da leitegada, bem como, sobre a qualidade nutricional do colostro.

Palavras chave: colostro, nutrição, leitegada, gestação, suínos, porca

133

INTRODUÇÃO A matriz suína hiperprolífica é o resultado do vigoroso melhoramento genético ocorrido nas últimas décadas. O seu potencial produtivo fica evidente quando se observa o grande número de leitões nascidos e desmamados por matriz por ano na atualidade (Ball et al., 2008; Koketsu et al., 2017; Figura 1). No entanto, o aumento da prolificidade da matriz suína veio acompanhado por alguns efeitos indesejáveis, dentre esses, a diminuição do peso médio dos leitões ao nascimento e o aumento da variabilidade de peso dentro da leitegada são apontados como um dos principais problemas a serem mitigados na produção de suínos, uma vez que interferem diretamente no desempenho produtivo do rebanho (Feldpausch et al., 2019; Schinckel et al., 2004; Milligan et al., 2002) além de comprometerem o bem-estar animal (Muns et al., 2016). De fato, para cada leitão adicional na leitegada há uma redução de 30 a 50 gramas no peso médio dos leitões ao nascimento (Opschoor et al., 2010). Deve-se ressaltar que existe correlação positiva entre baixo peso ao nascimento e taxa de mortalidade pré-desmame (Campos et al., 2011). Adicionalmente, leitões considerados com baixo peso ao nascer (< 1 kg) possuem menores chances de sobrevivência nas primeiras 72 horas de vida (Fix et al., 2010; Foxcroft et al., 2006; Quiniou et al., 2002). Parte disso ocorre em decorrência da menor ingestão de colostro (Amdi et al., 2013) e dificuldades de termorregulação (Theil et al., 2012). Da mesma maneira, os impactos negativos ocasionados pelo baixo peso ao nascer estendem-se além da fase de lactação, refletindo em menor ganho de peso diário e maior mortalidade nas fases produtivas subsequentes (Fix et al., 2010) e pior performance reprodutiva (Magnabosco et al., 2016). Cabe ressaltar, ainda, que a discrepância entre o elevado número de ovulações, o número de conceptos que sobrevivem após o período de implantação e a capacidade uterina após o dia 30 da gestação da matriz contemporânea estão entre os principais mecanismos fisiológicos que levam ao baixo peso ao nascimento em leitegadas numerosas (Foxcroft et al., 2006). Vários estudos vêm sendo realizados objetivando desenvolver estratégias para aumentar o peso dos leitões ao nascimento e a homogeneidade de peso dentro da leitegada, como a suplementação de matrizes gestantes com L-arginina e ractopamina (Garbossa et al., 2015), utilização de L-carnitina durante a fase inicial da gestação (Musser et al., 1999; Birkenfeld et al., 2006; Ramanau et al., 2008;), aumento dos níveis de lisina no terço final da gestação (Zhang et al., 2011; Greiner et al., 2016) e de L-glutamina (Zhu et al., 2018), suplementação com ‐-Hydroxy-‐-methylbutyrate (Parker & Knauer, 2017) e utilização da estratégia nutricional denominada bump feeding (Gonçalves et al., 2016). Esse último consiste

134

no aumento da quantidade de ração fornecida no terço final da gestação com o intuito de aumentar a taxa de crescimento dos fetos e, consequentemente, o peso dos leitões ao nascimento e incrementar o desempenho reprodutivo subsequente da matriz. No entanto, os resultados da utilização do bump feeding ainda são inconclusivos. De fato, alguns autores não observaram efeitos benéficos (Gonçalves et al.,2016b; Mallmann et al., 2018), enquanto outros reportaram efeitos positivos em estudos utilizando marrãs (Shelton et al., 2009; Soto et al., 2011). Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do aumento da oferta de ração no terço final da gestação (bump feeding) sobre o desempenho da matriz e da leitegada, e os efeitos desse manejo sobre a qualidade nutricional do colostro.

Figura 1. Evolução do número de desmamados/fêmea/ano do Brasil entre 2008 e 2017 (Adaptado de Agriness, 2018).

A GESTAÇÃO DA MATRIZ SUÍNA A gestação na espécie suína dura em média 114 dias, tendo início após a fecundação dos oócitos na junção ampola-istmo do oviduto. Em seguida à fecundação, os embriões entram em rápido processo de divisão celular e migram em direção ao útero, atingindo o ambiente uterino 72 horas após o início do estro no estágio embrionário de quatro células, tornando-se blastocisto por volta do dia cinco. O blastocisto esférico (0,5–1 mm de diâmetro) então rompe a zona pelúcida, entre os dias seis e sete, e se expande até atingir entre 2 e 6 mm no dia 10. A partir desse momento, o desenvolvimento dos embriões suínos apresenta características

135

que os distingue de outras espécies de mamíferos. De fato, por volta dos dias 11 e 12, após início do estro, os blastocistos iniciam o processo de expansão do seu trofectoderma de forma acelerada (0,25 mm/h), atingindo o tamanho de 1000 mm por volta do dia 16 da gestação (Bazer & Johnson, 2014). Na espécie suína, o estabelecimento da gestação dá-se entre os dias 11 e 12 após início do estro e a habilidade dos conceptos em produzirem e secretarem estrógenos (principalmente 17‐-estradiol) durante esse período é considerado como o sinal de reconhecimento materno da gestação, o qual resulta na extensão da fase luteínica e, em consequência, na manutenção de níveis elevados de progesterona (Waclawik, 2011). Antes da implantação os embriões se encontram livres no ambiente intrauterino e dependem do produto secretório do epitélio glandular uterino, denominado coletivamente como histotrofo, como suporte nutricional. O histotrofo, por sua vez, é constituído por diversos componentes, incluindo proteínas transportadoras, fatores de crescimento, íons, mitógenos, enzimas, hormônios, aminoácidos, vitaminas, glicose, frutose dentre outras moléculas regulatórias do desenvolvimento embrionário (Geisert & Schmitt, 2002). O processo de implantação tem início no dia 13 de gestação e por volta do dia 18 os embriões estão ligados intimamente ao endométrio. É nesse período que o processo de placentação tem início. A placenta tem a função primária de troca de gases respiratórios, micronutrientes e macromoléculas além de produzir hormônios que regulam o desenvolvimento fetal durante toda a gestação. O período de maior desenvolvimento placentário ocorre entre os dias 20 e 70 da gestação, quando então a placenta encontra-se completamente formada (em relação à quantidade total de aureolas). Nos suínos, a placenta é do tipo epiteliocorial e, dessa forma, o epitélio luminal uterino permanece intacto durante toda a gestação, não havendo contato direto entre a circulação sanguínea materna e fetal (Bazer & Johnson, 2014). O dia 30 de gestação marca o início da fase fetal, a qual é caracterizada pela organogênese e mineralização do esqueleto, é nesse período que ocorre a formação das fibras musculares. O último trimestre de gestação é marcado por intenso crescimento fetal e desenvolvimento do aparelho mamário. Nessa fase os fetos apresentam crescimento elevado, podendo chegar a 4,63 gramas por dia (Mcpherson et al., 2004). O amadurecimento do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal fetal marca o início da fase final da gestação, pois ocorre aumento na secreção de cortisol pelas glândulas suprarrenais fetais, estimulando a secreção de estrógenos, ocitocina, relaxina e prolactina, com aumento concomitante nos seus receptores, os quais são necessários para a expulsão dos leitões e para o início da lactação bem como para

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a expressão do comportamento materno.

A NUTRIÇÃO DA MATRIZ GESTANTE A nutrição desempenha um importante papel em todos os processos fisiológicos do organismo, provendo energia, aminoácidos, vitaminas, macro e micro minerais necessários para o adequado crescimento e desenvolvimento. O nível e qualidade da dieta afetam diretamente o desempenho dos animais, já os nutrientes oriundos da dieta atuam como moléculas sinalizadoras em um incontável número de vias metabólicas. Para fêmeas gestantes a nutrição torna-se ainda mais relevante, uma vez que além de utilizar os nutrientes da dieta para manter o funcionamento do próprio organismo, parte desses é utilizada para dar suporte ao crescimento do feto, o que para fêmeas multíparas, como a matriz suína, é ainda mais desafiador. Com relação à nutrição da matriz suína gestante, as dietas são formuladas de forma a atender às demandas metabólicas das diferentes fases da gestação, as quais são divididas em terços inicial, médio e final. O terço inicial de gestação é uma fase crítica em função da migração embrionária, reconhecimento materno da gestação, implantação e início da placentação (Foxcroft et al., 2006). Nessa fase, os planos nutricionais são montados com o objetivo de aumentar a sobrevivência embrionária, sendo então a quantidade de energia da dieta reduzida após inseminação, pois se acredita que o aumento no consumo nesse período aumentaria o fluxo sanguíneo hepático, resultando em maior metabolização da progesterona e em consequência em perda embrionária (Jindal et al., 1996; De et al., 2009). No entanto o tema é bastante controverso uma vez que trabalhos mais recentes demonstram não haver efeito deletério da ingestão de energia a cima do requerimento para mantença, durante a fase inicial da gestação, sobre a sobrevivência embrionária (Che et al., 2015; Athorn et al., 2013; Hoving et al., 2012; Leal et al., 2019). No terço médio da gestação tem início a organogênese e a maior parte da formação muscular dos fetos, sendo uma fase importante para o ajuste de condição corporal das matrizes. O terço final da gestação é a fase de maior crescimento fetal (Mcpherson et al., 2004) e, por esse motivo, é o período da gestação no qual comumente são aplicados os manejos nutricionais objetivando incrementar a qualidade dos leitões. Vale ressaltar que outro importante foco da nutrição durante a fase de gestação é evitar o ganho excessivo de peso; de fato, a excessiva deposição de gordura subcutânea durante a gestação está relacionada com o aumento do número de leitões nascidos com peso menor do que 800 gramas (Zhou et al., 2018), além de resultar em pior desempenho da matriz durante a lactação (Weldon et al., 1994).

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BAIXO PESO AO NASCIMENTO: BASES FISIOLÓGICAS E IMPLICAÇÕES PARA O DESEMPENHO DOS LEITÕES O crescimento e desenvolvimento fetal, além de serem controlados pela carga genética oriunda das linhagens paterna e materna, também são fortemente influenciados por vários fatores ambientais e uterinos. Dentre esses, a capacidade uterina e o status nutricional da matriz (baixo ou excessivo plano alimentar e desbalanço de nutrientes) constituem os principais fatores que impactam o crescimento/desenvolvimento fetal (Wu et al., 2006). Com relação à capacidade uterina, antes do dia 35 da gestação os embriões estão distribuídos pelos cornos uterinos de forma uniforme. Após esse período, a capacidade uterina torna-se limitante para o crescimento fetal, mesmo que esses estejam distribuídos de forma relativamente uniforme pelo espaço intrauterino (Yuan et al., 2015). Isso demonstra que o desenvolvimento dos fetos suínos sofre a influência tanto da sua localização quanto da densidade desses no útero, dessa forma, fetos localizados próximos à junção útero-tubárica apresentam maior peso quando comparados àqueles localizados próximos à cérvix (após o dia 70 de gestação; Wise et al., 1997). Todavia, fetos de baixo desenvolvimento podem ser encontrados em qualquer região uterina, sendo esses influenciados principalmente pelo tamanho e eficiência placentária. De fato, há uma associação entre leitegadas numerosas e o baixo fluxo sanguíneo uteroplacentário por feto (Reynolds & Redmer, 2001). Sabe-se que existe relação entre o status nutricional da matriz sobre o desenvolvimento embrionário e fetal. Isso é ainda mais relevante para as linhagens hiperprolíficas, as quais possuem uma elevada exigência nutricional, pois necessitam atender as próprias demandas metabólicas e de um grande número de fetos em crescimento acelerado, assim, com aumento das exigências nutricionais à medida que a gestação progride (Kim et al., 2005). Kim et al. (2009) observaram grande variabilidade no peso de fetos principalmente após os 45 dias de gestação, o que pode estar relacionado, em parte, ao não atendimento das exigências nutricionais para o adequado crescimento fetal. Dessa forma, fetos de matrizes submetidas a manejos nutricionais inadequados apresentam crescimento retardado e baixo peso ao nascimento, aumentando, dessa forma, a variabilidade de peso dentro da leitegada (Campos et al., 2012). Ainda, nesse sentido, os achados de Noblet et al. (1985) demonstram haver efeito direto entre a nutrição materna e o crescimento fetal, uma vez que no experimento realizado por esses autores a redução de 28% no consumo de ração, após o dia 80 de gestação, comprometeu o crescimento dos fetos. Há uma relação inversamente proporcional entre peso ao nascimento e taxa

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de mortalidade pré-desmame. De fato, leitões com peso ao nascimento > 1,8 kg apresentam taxa de sobrevivência de 90%, por outro lado, os nascidos com 700 gramas apresentam apenas 33% de taxa de sobrevivência (Chris et al., 2012). Outrossim, o peso corporal influencia fortemente a habilidade de termorregulação, um importante indicador de sobrevivência de leitões. Leitões considerados leves possuem uma alta relação superfície/volume o que resulta em maior susceptibilidade para perda de calor corporal e hipotermia (Herpin et al., 2002). Adicionalmente, leitões leves precisam de mais tempo para chegar aos tetos, além de não conseguirem competir com leitões mais pesados e, dessa forma, ingerem colostro de forma insuficiente para uma adequada absorção de imunoglobulinas (Muns et al., 2016), o que os torna menos capazes de lidar com alterações ambientais e patógenos, em decorrência de um sistema imune deficiente (Zhong et al., 2012). Outra consequência decorrente da baixa ingestão de colostro por leitões leves são problemas relacionados à absorção intestinal, uma vez que, além de ser fonte de energia, imunoglobulinas e nutrientes para o neonato, o colostro também possui uma grande variedade de moléculas que atuam na maturação do epitélio intestinal (Yuan et al., 2015). Ainda nesse sentido, leitões que sofrem restrição no desenvolvimento intrauterino e, por esse motivo, nascem abaixo do peso considerado ideal, apresentam alterações na expressão gênica no intestino delgado, resultando em alta morbidade e mortalidade no período pós-natal imediato (Wang et al., 2010). No que tange ao aspecto produtivo, leitões leves ao nascimento requerem 12 dias a mais para atingir o mesmo peso ao abate do que leitões pesados, prejudicando o uso das instalações (Gondret et al., 2005). Também, a qualidade de carcaça é influenciada de forma negativa pelo baixo peso ao nascimento (Wu et al., 2006), possivelmente em decorrência de menor quantidade de fibras musculares totais e primárias formadas (Quiniou et al., 2002), o que prejudica o retorno financeiro da atividade. Não restam dúvidas de que o peso do leitão ao nascimento determina sua sobrevivência nas primeiras horas de vida e o seu desempenho nas fases produtivas subsequentes, impactando, em última instância, a rentabilidade e sobrevivência na atividade. Dessa forma, estratégias que melhorem o peso individual dos leitões e uniformidade da leitegada são de extrema valia para melhorar a eficiência produtiva da suinocultura.

MATERIAL E MÉTODOSDELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O experimento foi realizado em uma granja comercial no município de

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Paragominas, Pará, Brasil (02º59’45”S47º21’10”W). Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os padrões legais e éticos do Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Rural da Amazônia, sob o protocolo número 029/2016. Foram utilizadas 70 fêmeas suínas híbridas comerciais gestantes (PIC Comborough), selecionadas de acordo com o histórico reprodutivo (pelo menos 12 leitões nascidos vivos por parto), mesmo escore de condição corporal, peso semelhante, ordens de partos similares e todos os animais utilizados no experimento receberam o mesmo número de inseminações artificiais, com sêmen proveniente dos mesmos machos reprodutores. A matriz e sua respectiva leitegada foram consideradas a unidade experimental e, então, distribuídos em dois tratamentos em blocos casualizados, nos quais a ordem de parto foi considerada como o bloco (ordem de parto 1, 2, 3 e > 4). Todos os animais foram submetidos ao mesmo manejo sanitário durante toda a fase de gestação. O manejo nutricional foi idêntico para todos os animais até o dia 80 de gestação (2,4 kg/dia de dieta de gestação) e a partir do dia 81 de gestação as fêmeas foram alocadas em um dos seguintes tratamentos: fêmeas alimentadas com 2,4 kg/dia de dieta para fêmeas em gestação até o fim do período gestacional (Controle; n = 35); fêmeas alimentadas com 3,0 kg/dia de dieta para fêmeas em gestação até o fim do período gestacional (Bump feeding; n = 35). A dieta de gestação (Tabela 1) utilizada no experimento foi a mesma dieta rotineiramente utilizada para fêmeas gestantes na granja. Foram coletadas amostras da dieta para análise da composição centesimal, de acordo com a metodologia descrita por AOAC (2005). Todos os animais tiveram acesso ad libitum à água durante todo o período experimental.

Tabela 1. Composição centesimal e nutricional da dieta de gestação utilizada durante o experimento

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*Conteúdo/kg de produto: 9000 UI/kg de retinol, 1500 UI/kg de colecalciferol, 60 mg/kg de acetato de dl-Δ-tocoferol, 3 mg/kg de vitamina K, 25 mg/kg de vitamina B12, 40 mg/kg de niacina, 20 mg/kg de ácido pantotênico, 2,6 mg/kg de ácido fólico, 0,27 mg/kg de biotina, 336 mg/kg de colina, 4 mg/kg de piridoxina, 6 mg/kg de riboflavina, 1,3 mg/kg de tiamina, 45 mg/kg de cobre, 275 mg/kg de ferro, 8,5 mg/kg de fósforo, 85 mg/kg de flúor, 1,75 mg/kg de iodo, 125 mg/kg de manganês, 0,75 mg/kg de selênio, 4,9 mg/kg de sódio, 275 mg/kg de zinco, 0,5 mg/kg de cromo, 100 mg/kg de bacitracina de zinco.

ALOJAMENTO E COLETA DE DADOS As fêmeas foram alojadas em baia com alimentadores eletrônicos (ESF-CallMatic 2, Big Dutchman, São Paulo, Brasil) com capacidade para 50 animais. Antes do início do experimento, foi realizada a calibração da quantidade de alimento fornecida em cada estação de alimentação automática. Todas as fêmeas eram identificadas com um chip auricular individual, sendo reconhecidas pelo ESF e o consumo de cada fêmea controlado pelo software do ESF. A alimentação foi realizada em pequenas porções de ração (100 g), liberadas lentamente, para evitar desperdícios e garantir a ingestão diária pré-determinada. A alimentação era interrompida quando as fêmeas atingiam o limite da ingestão diária.As fêmeas foram pesadas no início do período experimental (80 dias de gestação) e, posteriormente, no momento da transferência para a maternidade. Para isso, foi utilizada uma balança digital com capacidade para 500 kg e divisão de 100 g (CM-1015, Celmi, Paraná, Brasil). Para avaliar o peso dos leitões ao nascimento e o peso da leitegada, todos os animais foram pesados individualmente ao nascer, utilizando uma balança com capacidade de 15 kg e divisão de 2 g (POP-S 15/5, Urano, Urano, Rio Grande do Sul, Brasil). A primeira equação foi utilizada para determinar o coeficiente de variação do peso (CV). Para avaliar a eficiência placentária, a placenta foi pesada imediatamente após sua expulsão natural. A segunda equação foi usada para

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determinar a eficiência placentária:

Adicionalmente, os dados sobre o número de nascidos vivos, natimortos e mumificados foram coletados para análises.

COLETA DAS AMOSTRAS DE COLOSTRO As amostras de colostro foram coletadas de um total de 10 fêmeas por grupo (três fêmeas de ordem de parto 1, três fêmeas de ordem de parto 2 e quatro fêmeas de ordem de parto 3). Sessenta minutos antes da coleta, os leitões foram separados das fêmeas e, no momento da coleta, foram injetados 0,025 mg de carbetocina na veia marginal da orelha da fêmea, com o objetivo de aumentar a eficiência da ejeção do leite. As amostras de colostro (60 mL coletadas dos primeiros pares de tetos torácicos) obtidas de cada matriz foram imediatamente identificadas e armazenadas a -20 °C até que fossem submetidas à análise.

ANÁLISE BROMATOLÓGICA DO COLOSTRO O extrato etéreo, o conteúdo proteico e a quantidade de lactose foram determinados pelos métodos de extração de Soxhlet (método 920.39; AOAC, 2005), Kjeldahl (método 2001.11; AOAC, 2005) e Lane Eynon (Lane; Eynon, 1923), respectivamente. O teor de cinzas foi determinado por carbonização e incineração de amostras em uma mufla a 550 °C por 6 horas (método 942.05; AOAC, 2005). A determinação dos valores de cálcio, zinco e fósforo foi realizada pelo método de espectrometria de absorção atômica, no qual a proteína presente no colostro é precipitada utilizando ácido tricloroacético, com posterior filtração. O filtrado foi analisado por espectrometria de absorção atômica, utilizando uma curva padrão para cada componente analisado. O conteúdo mineral foi obtido após o aquecimento da amostra a uma temperatura de 600 ° C por quatro horas. Os valores de energia bruta das amostras de colostro foram obtidos através da oxidação total das amostras, medida em bomba calorímetrica (Sakomura & Rostagno, 2007). As análises de cada amostra foram realizadas em triplicata de

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acordo com os métodos recomendados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005).

ANÁLISE ESTATÍSTICA Todas as variáveis avaliadas foram testadas quanto à normalidade pelo teste Shapiro-Wilk e quaisquer variáveis que não seguiram uma distribuição normal foram transformadas pelo procedimento RANK do SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). O procedimento PROC RANK com a opção NORMAL foi usado para produzir uma variável transformada normalizada. Todos os dados foram analisados utilizando o procedimento MIXED do SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) com um delineamento em blocos casualizados (ordem de parto). A fêmea e sua leitegada foram consideradas como a unidade experimental. O efeito dos tratamentos foi comparado pelo teste F. Todos os dados foram descritos como médias dos quadrados mínimos e os maiores erros padrão das médias (EPM) foram reportados. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.

RESULTADOS E DISCUSÃO A qualidade do leitão produzido é de extrema importância para que o produtor de suínos obtenha lucratividade e permaneça na atividade. Diante disso, vários estudos vêm12sendo realizados objetivando desenvolver estratégias nutricionais para melhorar o peso dos leitões ao nascimento, uma vez que essa variável é uma forte preditora da vida produtiva do leitão. Dentre essas, o aumento da oferta de ração no terço final da gestação, denominado bump feeding, pode ser uma ferramenta para melhorar o peso do leitão ao nascimento e o desempenho da matriz suína. No presente estudo, a aplicação do manejo de bump feeding não aumentou o peso das matrizes (P > 0,05) no momento da transferência para a maternidade, como mostra a Tabela 2. Esse resultado está em desacordo com os achados de Gonçalves et al. (2016a), os quais observaram aumento de 7 kg de peso corporal em matrizes que receberam 1 kg de ração adicional no terço final da fase de gestação. No entanto, vale ressaltar que o aumento excessivo de peso durante a gestação não é desejável, pois matrizes que chegam acima do peso ideal na fase de lactação apresentam pior desempenho produtivo, consequência da excessiva mobilização das reservas corporais. o que resulta em diminuição do consumo voluntário de ração e perda de peso (Weldon et al., 1994). A redução do consumo de ração e perda de condição corporal excessiva (> 12%) durante a fase de lactação, por sua vez, comprometem o desempenho reprodutivo subsequente da matriz, porém não é determinante pra diminuir o peso

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dos leitões ao desmame, possivelmente por um efeito compensatório relacionado à mobilização das reservas corporais da matriz (Campos et al., 2012).

Tabela 2. Desempenho produtivo de fêmeas suínas submetidas ou não ao bump feeding a partir do 81 de gestação.

O aumento da oferta de ração no terço final da gestação também não exerceu efeito (P > 0,05) sobre o número total de leitões nascidos, de nascidos vivos, mumificados e natimortos. O peso da leitegada, o peso médio dos leitões nascidos, o coeficiente de variação do peso da leitegada e a eficiência placentária também não foram afetados pelo incremento de ração no terço final da gestação (P > 0,05), corroborando com os achados de outros experimentos (Nissen et al., 2003; Shelton et al., 2009; Soto et al., 2011, Greiner et al., 2016; Mallmann et al., 2018), nos quais a utilização do bump feeding resultou em nenhum efeito ou apenas efeitos modestos sobre o peso dos leitões ao nascer. De acordo com Père & Etienne (2018) uma possível explicação para a ausência de efeito do bump feeding sobre o peso dos leitões diz respeito ao fato das fêmeas modernas possuírem um limite na transferência de nutrientes para o feto, possivelmente por apresentarem um limite de resistência à insulina. Não houve efeito (P > 0,05) do bump feeding sobre a qualidade nutricional do colostro (proteína bruta, lactose, extrato etéreo e energia bruta) como pode ser observado na Tabela 3. A quantidade de cinzas e a composição mineral (cálcio, fósforo e zinco) do colostro também não diferiram. Há uma tendência para um melhor desempenho lactacional das porcas com maior desenvolvimento do complexo mamário, melhorando a qualidade do colostro e do leite fornecidos aos leitões

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(Mellagi et al., 2010). No entanto, no presente estudo, os resultados não corroboram com essa afirmação em relação à qualidade do colostro. Da mesma forma, a afirmação de que o aumento dos níveis de energia na dieta pode aumentar o nível de gordura no colostro e no leite (Noblet et al., 1985) também não foi confirmada, uma vez que não foram observadas diferenças para a composição nutricional do colostro das porcas.

Tabela 3. Composição bromatológica do colostro de fêmeas suínas submetidas ou não ao bump feeding a partir do dia 81 de gestação

Ainda nesse sentido, a lactose presente no colostro é um dos nutrientes que sofre menos variabilidade, dependendo da dieta das porcas (Atwood & Hartmann, 1992). Mesmo o uso de dietas de gestação com uma quantidade significativamente maior de energia através da inclusão de óleo (Leis et al., 2009), ou pela adição de ácido linoleico conjugado (Krogh et al., 2012), não influenciou o conteúdo de lactose no colostro. Essa afirmação corrobora com os resultados encontrados no presente estudo, em que o aumento da quantidade de ração não teve efeito sobre a lactose e o conteúdo energético do colostro. Com base nos resultados do presente estudo e das informações disponíveis na literatura, a utilização bump feeding parece ser, devido à falta de efeito sobre o desempenho das matrizes e leitões, contraproducente. O manejo nutricional de matrizes de acordo com o período gestacional e ordem de parição demandaria maior uso de mão de obra, em grande parte devido às instalações de gestação, as quais são comumente equipadas com apenas um silo de alimentação e, para tentar aumentar o manuseio da alimentação, seria necessário aumentar o número de silos, usar linhas de alimentação adicionais ou até alterar o sistema de alimentação, o que pode gerar um custo adicional de produção, não sendo vantajoso do ponto de vista econômico.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

O uso da estratégia nutricional denominada bump feeding a partir do dia 81 de

gestação até o parto, nas condições estudadas durante este experimento, não é vantajoso

do ponto de vista produtivo, uma vez que não houve melhorias no desempenho da matriz, da

leitegada ou na qualidade nutricional do colostro. O tema requer mais estudos para avaliar

quais os possíveis impactos econômicos da utilização do bump feeding, bem como, identificar

quais componentes da dieta poderiam ser manipulados de forma pontual para melhorar o

peso dos leitões ao nascimento e a qualidade do colostro produzido.

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CAPÍTULO VIINUTRIÇÃO PROTEICA DE POEDEIRAS CRIADAS NO PISO

Mylena Tückmantel Dias1, Brunna Garcia de Souza Leite2, Fabricia Arruda

Roque2, Carlos Alexandre Granghelli1, Paulo Henrique Pelissari1, Vito

Andrade3, Maria Estela Gaglianone Moro2, Rachel Santos Bueno Carvalho2,

Lucio Francelino Araujo2, Cristiane Soares da Silva Araujo1

1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo2Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo3Centro Universitário Fundação de Ensino Octávio Bastos

RESUMOFavorável e em expansão, o nicho de mercado de ovos oriundos de galinhas criadas livres de gaiola apresenta significativa demanda, uma vez que os consumidores têm se tornado mais preocupados quanto ao bem-estar animal. Embora mais explorado na Europa, no Brasil as grandes empresas já anunciaram que somente utilizarão ovos provenientes de criações que considerem respeitar o bem-estar das aves a partir de 2025, de modo que as granjas já estão se estruturando a fim de atender tal modelo de criação. Visto que proporciona às aves a possibilidade de realizarem comportamentos inatos, se deve salientar fatores que podem prejudicar a qualidade de vida e a produção de modo geral, tais como possibilidade de fraturas e maior incidência de canibalismo. Ademais, elevada atenção deve ser dada quanto às questões sanitárias, ambientais e econômicas, uma vez que, segundo especialistas, o custo de produção é mais alto comparado ao sistema convencional. Embora seja uma tendência de criação, ainda não há uma consolidação quanto às exigências nutricionais dessas aves nesse modo alternativo de criação. Para tanto, foi conduzido um experimento com o objetivo de avaliar os requisitos de proteína bruta necessários para manutenção e produção de ovos de galinhas poedeiras criadas no sistema livre de gaiola. Um total de 540 aves de uma linhagem comercial foram alocadas em uma instalação experimental, onde foram capazes de expressar comportamentos intrínsecos à espécie. Para identificar se os níveis propostos atendiam às necessidades das aves, o desempenho produtivo e a qualidade dos ovos foram avaliados ao final de um ciclo de 28 dias. A redução dos níveis nutricionais da dieta para 14% de proteína bruta não prejudica o desempenho, a produção e a qualidade dos ovos de poedeiras criadas no sistema livre de gaiola.

153

INTRODUÇÃO Mediante os avanços obtidos na genética e nutrição, aliado às melhorias nos aspectos sanitário e de ambiência, a cadeia produtiva de ovos registra, cada vez mais, crescimento constante nos índices produtivos (VIEIRA et al., 2014). Para Joly (2010), as linhagens atuais de poedeiras são capazes de atingir elevados níveis produtivos com longos períodos de persistência de pico de postura, as tornando mais exigentes nutricionalmente, de modo que as formulações atendam as necessidades aminoacídicas para garantir a expressão de todo o potencial genético. A intensificação da produção dos últimos 20 anos resultou em questionamentos, ao nível ético e econômico, acerca do bem-estar de poedeiras, levando a diversificações no sistema. Mais difundido e utilizado no Brasil é o sistema de bateria em gaiolas, o qual possibilita maior número de aves por metro quadrado e, consequentemente, maior número de ovos por galpão. Caracteriza-se por possuir várias gaiolas alocadas em fileiras, dispostas em andares, cuja densidade empregada varia de 350 a 450 cm²/ave. Esse modo de criação permite maior controle sobre a produção, manejo e sanidade das aves, bem como reduz a necessidade de mão de obra e facilita a remoção do esterco, importante fator ambiental. O reduzido espaço das gaiolas, o qual impossibilita a inclusão de caracteres de enriquecimento ambiental, contribui para a formação de um senso crítico quanto ao impacto deste tipo produtivo sobre as aves (ALVES, 2006). Alternativo ao convencional, o sistema de criação em piso, cage-free ou livre de gaiola, permite que as aves tenham acesso a ninhos, experienciem comportamentos intrínsecos à espécie, como ciscar e empoleirar-se. Podendo ser conduzido em qualquer tipo de instalação que permita a locomoção total da ave, tal sistema não necessariamente requer uma área destinada ao pastejo. Embora apresente bons resultados, os aspectos relacionados à sanidade e ao manejo têm sido alvo de preocupação, visto que há maior dificuldade no controle de desordens parasitárias, canibalismo, consumo alimentar e perda de ovos, como também elevados níveis de poeira e amônia (QUEIROZ, 2017). Outro aspecto importante é o aumento da ocorrência de fraturas devido à maior liberdade de movimento (APPLEBY, 2010). Vários aspectos podem influenciar a produtividade e a qualidade dos ovos de poedeiras, sendo que a nutrição é um dos pontos críticos nestes aspectos, já que a carência de nutrientes pode levar à uma queda no desempenho do animal (RUTZ, 2002). Assim como outros animais, as aves possuem uma exigência proteica diária para manter suas funções vitais, reprodutivas e produtivas, sendo que o ajuste no nível de aminoácidos na dieta é essencial, devido à grande demanda destes

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nutrientes para a síntese do ovo, albúmen e gema (HIRAMOTO, MURAMATSU & OKUMURA, 1990). Segundo Sakomura et al. (2002), a produção e o tamanho dos ovos são dependentes da ingestão proteica sendo, portanto, de fundamental importância o conhecimento das exigências proteicas para poedeiras em fase produtiva. Além disso, a proteína deve ser bem balanceada e de alta qualidade, a fim de que a ave possa maximizar sua produção de modo economicamente viável (SILVA et al, 2010). Para Leeson & Summers (2005), as recomendações presentes em tabelas nutricionais e manuais de produção muitas vezes estão defasadas ou não são aplicáveis, fatores que justificam o aumento das pesquisas na área de nutrição. Há poucos estudos na literatura acerca das exigências nutricionais e de outros aspectos relacionados às criações alternativas, tanto cage-free quanto free-range (SANTOS et al., 2014).

PROTEÍNAS Segundo Santana et al. (2018), entre os custos de produção no setor avícola, se observa que a alimentação participa com, aproximadamente, 75% e que a energia e a proteína são as parcelas mais representativas desses custos. Dessa forma, um dos principais desafios da nutrição de monogástricos, de modo geral, é fornecer aos animais alimentos capazes de atender as necessidades do organismo, garantindo o crescimento, a saúde e o bem-estar com máxima eficiência e mínimas perdas de nutrientes para o ambiente (SILVA et al., 2014). Para otimizar o custo de produção, as dietas das poedeiras devem conter quantidades suficientes de todos os nutrientes necessários, particularmente proteína bruta, com o propósito de obter um ótimo desempenho considerando as questões ambientais (TORKI et al., 2014). Nutricionistas têm utilizado o conceito de proteína ideal para que a exigência aminoacídica de poedeiras seja atendida, visando fornecer a quantidade exata de aminoácidos, evitando excessos ou deficiências, possibilitando que dietas sejam formuladas com menores teores de proteína bruta sem que haja redução no desempenho das aves (COSTA et al., 2001). Além de sua importância econômica, a proteína é um importante componente na nutrição animal, uma vez que possui relação direta com a conversão alimentar, produção, ganho de peso e qualidade da carcaça dos animais (WIJTTEN, LEMME & LANGHOUT, 2005). Abundantes na natureza, as proteínas são moléculas presentes em todas as células e organelas celulares. São substâncias complexas, de natureza coloidal e de elevado peso molecular. Funcionam como constituintes de elementos estruturais, participam do processo de contração muscular e algumas exercem atividade de transporte e armazenamento de gorduras e minerais. Compostas por 20

155

aminoácidos, classificados em essenciais e não essenciais, os quais se rearranjam em combinações e sequências diferentes, originando moléculas como enzimas, hormônios e anticorpos, transportadores moleculares, fibras musculares, penas, unhas, pelos, são agentes tamponantes e proteínas do ovo (NELSON & COX, 2004). Em situações de privação alimentar de fontes energéticas convencionais, as proteínas podem ser usadas como forma alternativa para o fornecimento de energia ao organismo animal (SILVA et al., 2014). Digestão e absorção são processos que possibilitam que a proteína seja utilizada pelos animais. A digestão de proteínas em monogástricos inicia-se no estômago, onde ocorre a secreção de ácido clorídrico e de pepsinogênio pelas células pépticas e principais. Ao chegar no lúmen do estômago, o pepsinogênio apresenta-se desativado e então ocorre o rompimento de uma determinada porção de sua molécula, transformando-o na forma ativa, pepsina, por ação do ácido clorídrico e de moléculas de pepsina ativadas anteriormente. A digestão peptídica ocorre preferencialmente na moela. Já o processo de digestão promovido pelo suco gástrico e pela ação mecânica, as proteínas passam para o intestino delgado, onde recebem as secreções pancreáticas e intestinais. A enteroquinase, substância mais importante da secreção intestinal para a digestão proteica, ativa o tripsinogênio pancreático em tripsina, responsável pela ativação das demais enzimas proteolíticas secretadas pelo pâncreas. Durante a digestão há participação de diferentes enzimas que atuam sobre proteínas, peptídeos e aminoácidos possibilitando sua absorção (ARAÚJO et al., 2019). Devido à composição de aminoácidos, substâncias que apresentam pelo menos um grupo amino e um grupo carboxila, as proteínas diferem umas das outras (BERTECHINI, 2006). Embora existam mais de 700 aminoácidos na natureza, apenas 23 participam da formação das moléculas proteicas (SALGUEIRO et al, 2014). A eficiência quanto à utilização de proteínas relaciona-se à disponibilidade dos aminoácidos, o que justificam as atuais formulações de dietas para monogástricos com o objetivo de atingir as necessidades aminoacídicas e não mais utilizando o conceito de proteína bruta (PESSOA et al., 2012). Segundo Andrade et al. (2004), mediante a suplementação de aminoácidos, é possível reduzir o teor de proteína na dieta. Quanto ao consumo de ração, este não é controlado pelo nível proteico (COSTA et al., 2004). Entretanto, para Baker (1993), há um aumento no consumo alimentar em rações com baixo nível proteico. Além disso, níveis elevados de proteína bruta aumentam a carga de calor a ser dissipado, comprometendo o desempenho das aves (COSTA et al., 2004). As exigências proteicas e aminoacídicas variam conforme o tamanho

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e linhagem da poedeira, temperatura ambiente, produção de massa de ovos, instalações, densidade, consumo de água, estado sanitário e teor energético da dieta. Os principais critérios para estabelecer o nível dietético proteico de poedeiras são os aspectos produtivos, massa de ovos e mantença A taxa de crescimento, empenamento e formação do esqueleto são os principais critérios para estabelecer o nível proteico na dieta de aves jovens, enquanto que a produção, massa de ovos e mantença são os principais fatores que devem ser considerados para aves em fase produtiva (ROSTAGNO, 2017). A qualidade do ovo relaciona-se diretamente ao nível proteico da dieta, uma vez que, para a formação do albúmen e da gema, são necessárias grandes quantidades e, devido à capacidade limitada de estocagem proteica das poedeiras, a concentração de proteína e o consumo de ração devem ser adequados a fim de garantir boa produção (PESTI, 1992). A metionina é o principal aminoácido que influencia o tamanho do ovo (LEESON & SUMMERS, 2001). Segundo Jordão Filho (2004), em condições normais, dietas formuladas à base de milho e farelo de soja apresentam deficiências em metionina e lisina, o que pode afetar a síntese proteica durante a fase de postura (NRC, 1994). Quando alimentadas com níveis ótimos de proteína, observam-se maiores taxas de síntese proteica nos principais órgãos de síntese proteica dos ovos quando comparado às poedeiras alimentadas com níveis subótimos (MURAMATSU, et al., 1987). Para Barros (2004), o fornecimento dos níveis adequados de proteína é favorável tanto para as aves, que potencialmente desempenharão suas funções metabólicas, quanto para os produtores, uma vez que poderão maximizar os recursos financeiros por meio da economia com fontes proteicas. Da Silva et al. (2006) consideram ser economicamente inviável o excesso de proteína na ração, uma vez que eleva a excreção de nitrogênio e, consequentemente, a poluição ambiental. Segundo Waibel et al. (2000), os principais recursos para a redução da excreção de nitrogênio e otimização do custo com alimentação são redução proteica e a suplementação com aminoácidos sintéticos. Já a redução dos níveis sem que ocorra a suplementação de aminoácidos, reduz o consumo e a produção de ovos, levando também a alterações no comportamento social das aves (PEGANOVA & EDER, 2003).

SISTEMAS DE ALOJAMENTO Iniciado na década de 1970, o sistema convencional com aves em gaiolas permitiu a criação intensiva em escala industrial (ROCHA et al., 2008), uma vez que técnicas foram desenvolvidas para alcançar a melhor produtividade ao menor custo. Esse tipo de sistema proporciona, além de facilidades no manejo e menores

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custos produtivos, melhor higiene e sanidade, pois os ovos e as aves não têm acesso às excretas, o que, consequentemente, leva a uma menor incidência de doenças infecciosas (HESTER, 2005) (Figura 1). Entretanto, para Augusto (2007), com o aumento de produtividade, devido ao elevado número de aves em um mesmo espaço, cresce também a preocupação com a destinação correta dos dejetos gerados. As críticas a esse sistema se embasam, também, na dificuldade de as aves manifestarem seu comportamento natural de bater as asas, empoleirar-se e ciscar (APPLEBY, 1998), além da possibilidade de desenvolvimento de doenças metabólicas (MAZZUCO, 2006).

Figura 1. Sistema convencional de alojamento. Fonte: Dias, M.T. (2019).

Em 2012 uma regulação europeia baniu o uso de gaiolas tradicionais para criação de aves de postura (EUROPEAN COMISSION, 1999) e, desde então, há uma tendência mundial dos países se ajustarem aos sistemas alternativos aos convencionais visando, sobretudo, o nicho de mercado em expansão, favorável para a produção de ovos oriundos de aves criadas livres de gaiola e disposto a pagar por um produto que agrega valores conceituais (SOSSIDOU & ELSON, 2009). Já se nota, no Brasil, uma crescente parcela de consumidores que busca por alimentos produzidos por sistemas convencionais, ainda que o valor destes seja quase o triplo daqueles produzidos de modo convencional (AVAL, 2016). Deve-se salientar que a produção de ovos nos sistemas alternativos implica em maiores investimentos com instalações e mão de obra, de modo que o setor teria que se adaptar a novos preços de mercado (QUEIROZ, 2017).

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Por não oferecerem restrições ao movimento e permitirem que as aves expressem comportamentos naturais, os sistemas em piso com cama e as gaiolas enriquecidas são as atuais alternativas à criação convencional. No sistema cage-free, as aves têm acesso a poleiros e ninhos, o que se relaciona diretamente ao comportamento das aves quanto à postura de ovos (BARBOSA FILHO, 2004). Uma vez proporcionado um ambiente de qualidade, a responsabilidade quanto à segurança alimentar da população estará mantida. Embora tenha alcançado resultados satisfatórios tanto econômico quanto etologicamente, estratégias visando melhorias em questões sanitárias desse sistema ainda precisam ser exploradas (HAUSER & FÖLSH, 1993). Quando bem projetada, a criação em piso com camas pode equivaler quanto ao aspecto produtivo e de qualidade dos ovos ao modo convencional. Segundo Elson (1968), a qualidade e conservação da cama é de suma importância e tem direta influência sobre as condições dos ovos, uma vez que quando postos na cama, há maior risco de contaminação por micro-organismos. Carvalho et al. (2017) consideram que os métodos de criação alternativos às gaiolas apresentam benefícios em comparação com os sistemas convencionais, essencialmente por disponibilizarem que as aves apresentem atividades pertinentes à espécie. Entretanto, necessitam de atenção especial no manejo com o intuito de não prejudicarem a sanidade das aves e a integridade química, física e microbiológica dos ovos.

BEM-ESTAR ANIMAL As atitudes humanas em relação às aves de produção estão, cada vez mais, semelhantes àquelas em relação aos mamíferos domésticos. Historicamente, o bem-estar animal tem sido definido pela ausência de experiências negativas, como doença, fome, sede, estresse ou redução da capacidade física (BRACKE; HOPSTER, 2006). Há um crescente interesse e pesquisa sobre a experiência de estados positivos de bem-estar em animais (HEMSWORTH et al., 2015). As Cinco Liberdades foram desenvolvidas pelo Conselho de Bem-Estar dos Animais de Produção do Reino Unido e lançadas em 1979, as quais têm sido altamente influentes no desenvolvimento e escopo de padrões de bem-estar internacionalmente. Um bom bem-estar envolve uma combinação de nutrição adequada, ambiente apropriado, saúde ideal, a expressão de comportamentos normais e a saúde mental positiva. Sem dúvidas, o ambiente tem impactos significativos no bem-estar animal (HARTCHER & JONES, 2017). Segundo o relatório do Comitê Científico Veterinário para Saúde e Bem-estar Animal (2001), a produtividade, saúde e doença, fisiologia e comportamento, são abordagens que, quando combinadas, determinam o bem-estar animal. Visto

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como insensível, o conceito de produtividade considera que se o animal se reproduz e produz em quantidades ótimas, seu bem-estar é aceitável. Relacionado ao tipo de sistema produção, condições de doença comprometem o bem-estar, assim como a aparência externa e as condições de empenamento, cujo aspecto tem considerável impacto na interpretação do bem-estar e, quando de má qualidade, o consumo de ração eleva-se devido às perdas de calor e mudanças metabólicas (TAUSON et al., 2006). Mediante fatores estressantes, elevadas taxas de frequência cardíaca, corticosterona plasmático e alterações nos hormônios reprodutivos são algumas das alterações fisiológicas observadas nas aves. Respostas confiáveis quanto ao bem-estar podem ser obtidas mediante a observação do comportamento animal. Comportamentos inatos ou “normais” são aqueles inerentes aos animais, geralmente conduzidos por fatores internos e regulados fisiologicamente (HUGHES & DUNCAN, 1988). Acredita-se que seja um dos componentes do funcionamento biológico e necessários para evitar o estresse. O nível de satisfação que esses comportamentos proporcionam e a quantidade de frustração causada por sua inibição podem ser avaliados cientificamente (BRACKE & HOPSTER, 2006). A frustração é um estado aversivo que surge quando os animais são impedidos de realizar um comportamento. O sistema de alojamento pode criar problemas de bem-estar quando causa frustração (FRASER et al., 2013). Segundo Broom (2010), as necessidades das galinhas incluem o funcionamento biológico básico e os meios para atingi-lo por meio da realização de uma variedade de atividades, da resposta a certos estímulos e da manutenção de certos estados fisiológicos. A maioria das galinhas realmente aproveita a oportunidade de andar, bater as asas, ciscar, bicar e interagir socialmente quando criadas livres de gaiola e é evidente que os problemas de bem-estar podem ser reduzidos a um nível muito baixo pela acomodação na qual estarão sujeitas. Para Queiroz (2017), assegurar que os animais estejam sob circunstâncias ideais é uma tarefa complexa, uma vez que o conceito de bem-estar está em constante formulação. A indústria tem se adequado aos novos modelos de demanda, uma vez que aumentaram, ao nível mundial, as correntes de questionamento quanto aos métodos de produção animal (AHAMMED et al., 2014). Estudos já evidenciaram que, no Brasil e na Europa, existe um nicho de mercado que procura produtos que tenham formas alternativas de produção como valor agregado (PASIAN & GAMEIRO, 2007; PARKER; BRUNSWICK; KOTEY, 2013).

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DESEMPENHO PRODUTIVO E QUALIDADE DE OVOS DE POEDEIRAS ALIMENTADAS COM DIFERENTES NÍVEIS DE PROTEÍNA BRUTA E CRIADAS NO SISTEMA CAGE-FREE Embora existam modelos para determinar os requerimentos nutricionais das diferentes categorias de aves, muitos não são apropriados para as criadas livres de gaiolas. É possível que, com a liberdade de movimento possibilitada pelos sistemas alternativos, a taxa metabólica seja mais intensa e a necessidade proteica dessas aves difira das exigências preconizadas para as criadas no sistema convencional. Este trabalho objetivou determinar a exigência de proteína bruta de poedeiras comerciais criadas no sistema livre de gaiola. Foram utilizadas 540 poedeiras da linhagem Hy-Line Brown (Figura 2), com 25 semanas de idade no período de março a abril de 2019, completando um ciclo de 28 dias. As aves foram distribuídas aleatoriamente em seis repetições de dezoito aves cada e alojadas em boxes (2,4m x 1,6m x 2,1m) equipados com cama de maravalha, ninho, poleiro, comedouro tubular e bebedouro automático tipo copo (Figura 3) em um galpão experimental da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos campus Fernando Costa (Figura 4). Os tratamentos consistiram no fornecimento de cinco dietas isocalóricas, isonutritivas, entretanto os níveis de proteína bruta (PB) foram crescentes (14, 15, 16, 17 e 18%). As dietas foram formuladas de acordo com as recomendações de Rostagno et al. (2017), com exceção dos níveis de PB. O fornecimento de água e ração foram ad libitum.

Figura 2. Poedeira da linhagem Hy-Line Brown. Fonte: Dias, M.T. (2019).

161

Figura 3. Boxes equipados com cama de maravalha, ninho, poleiro, comedouro tubular e bebedouro automático tipo copo. Fonte: Dias, M.T. (2019).

Figura 4. Galpão experimental da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos campus Fernando Costa. Fonte: Dias, M.T. (2019).

162

Foram avaliados, ao final do ciclo, o desempenho produtivo (percentual de produção de ovos, consumo de ração, conversão alimentar por dúzia e massa de ovos e percentual de ovos inviáveis) e a qualidade dos ovos (peso, coloração de gema, espessura de casca, resistência à quebra e unidade Haugh), por meio da máquina Digital Egg Tester (DET6000, Nabel Co.)(Figura 5) e, para tanto, foram coletados dois ovos por repetição em dois dias consecutivos. As análises estatísticas foram realizadas por meio do software SAS (versão 9.4) e as estimativas dos níveis de PB foram estabelecidas por modelos de regressão polinomial, ao nível de significância de 5%.

Figura 5. Máquina Digital Egg Tester. Fonte: Dias, M.T. (2019).

163

Resultados e discussão As características de desempenho, produção e de qualidade de ovos não foram influenciadas significativamente pelos níveis de PB (Tabela 1).

Tabela 1. Efeito dos níveis de proteína bruta sobre o desempenho, produção e qualidade de ovos.

Resultados semelhantes foram observados por Moustafa et al. (2005), que constataram que o consumo de ração foi insignificativamente afetado pelos níveis de PB em dietas de poedeiras, assim como o aumento de PB não melhorou a unidade Haugh nem a espessura da casca. Redução linear de consumo mediante níveis de 18, 16 e 14% de proteína bruta foi observado por Novack et al. (2006). Embora Bartov (1979) e Hurwitz et al. (1998) tenham observado elevação no consumo à medida em que foi reduzida a proteína bruta. Por outro lado, Bunchasak et al. (2005), aves que receberam 14% de PB tiveram baixa produção de ovos, menor peso e massa de ovos do que aquelas que receberam 16 ou 18%. Assim como Almeida et al. (2008), que observaram redução na produção de ovos quando reduzida de 18% para 15% de proteína bruta. Já Bouyeh & Gevorgian (2011) observaram que a produção diária de ovos após o período de pico foi afetada pelos diferentes níveis de PB, sendo que os maiores valores de produção e massa de ovos foram obtidos com 14% de PB. Segundo Souza (2009), mesmo com todo o conhecimento acerca do conceito de proteína ideal e da exigência aminoacídica, a formulação de dietas com níveis reduzidos de proteína para poedeiras ainda apresentam resultados controversos. Leeson & Summers (2009) observaram que é notável a piora nas

164

taxas de postura e tamanho dos ovos em dietas com níveis reduzidos.Em concordância com Alagawany & Abou-Kassem (2014), se pode afirmar que a otimização da concentração de nutrientes da dieta é preferível à maximização quando se objetiva a viabilidade econômica. Ademais, a poluição por amônia é uma questão importante para a indústria avícola e pode ser diminuída pela redução do nível de PB da dieta (ALAGAWANY et al., 2016).

Considerações finais A redução dos níveis de proteína bruta não impacta negativamente no desempenho, na produção e qualidade de ovos de poedeiras criadas no sistema cage-free.

Agradecimentos Ao Laboratório de Pesquisa em Aves do Departamento de Produção e Nutrição Animal (VNP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ USP) pela infraestrutura fornecida às pesquisas e pela equipe de funcionários, estagiários, alunos de graduação e pós-graduação. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa de estudos.

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171

CAPÍTULO VIIITEORES DE FIBRA EM DETERGENTE NEUTRO E INCLUSÃO DE NARASINA

SOBRE O DESEMPENHO, FERMENTAÇÃO RUMINAL, MORFOLOGIA E

HISTOLOGIA DAS PAPILAS RUMINAIS DE CORDEIROS

Lairana Aline Sardinha¹, Ariany Faria de Toledo², Arnaldo Cintra Limede¹,

Thamires Ubices Sturion², Rhaíssa Garcia de Assis², Alexandre Arantes

Miszura¹, José Paulo Roman Barroso¹, André Storti Martins¹, Janaina

Socolovski Biava2, Evandro Maia Ferreira², Alexandre Vaz Pires¹,², Daniel

Montanher Polizel¹,²

¹ Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ/USP² Departamento de Zootecnia, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – ESALQ/USP

RESUMOO objetivo do estudo foi avaliar dois teores de fibra em detergente neutro (FDN) na dieta de cordeiros, com a inclusão ou não de narasina. Foram utilizados 44 cordeiros em delineamento experimental de blocos completos casualizados, com quatro tratamentos e onze repetições. O arranjo de tratamentos foi um fatorial 2 × 2, sendo o fator I dietas contendo 20 ou 25% de FDN (na MS) e o fator II a inclusão ou não de 13 mg de narasina/kg de MS. Os cordeiros foram confinados por um período 112 dias. A pesagem dos animais foi realizada após jejum alimentar de 14 horas, nos dias 0 e 112 dias, sendo calculado o ganho médio diário (GMD). Ao fim do período de confinamento os animais foram abatidos. Após a evisceração foi realizada a colheita do fluido e epitélio ruminal. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Proc Mixed do SAS 9.0, e considerado significativo quando P ≤ 0,05. Dietas contendo 25% de FDN resultaram em aumento no consumo de matéria seca (CMS) dos cordeiros e redução na eficiência alimentar (EA), sem alterar o GMD. Não houve efeito da narasina sobre o desempenho dos cordeiros. A inclusão de 25% de FDN assim como a inclusão de narasina resultou em aumento no pH ruminal. A utilização de 25% de FDN resultou em maior número de papilas no epitélio ruminal e reduziu a espessura de queratina. Já a inclusão da narasina aumentou a altura das papilas, a área das papilas, a área absortiva por cm² e reduziu a espessura de queratina. Em conclusão, os teores de FDN dietéticos afetam o

172

desempenho, o processo de fermentação e a morfologia do epitélio ruminal. Por outro lado, a inclusão de narasina na dieta apesar de não alterar o desempenho, otimizou o processo de fermentação e alterou positivamente as características do epitélio ruminal de cordeiros.

INTRODUÇÃO Desde o início da civilização, o homem e os ruminantes dividem uma longa história de produção, sendo agora baseada na utilização de novas tecnologias, principalmente em relação aos aspectos nutricionais. O manejo nutricional, seja utilizando dietas com maior inclusão de concentrado ou volumoso, altera o processo de fermentação ruminal, modifica a população de microbiana, a motilidade do trato gastrintestinal e a absorção dos nutrientes. Dessa forma, a qualidade, a fonte e o processamento dos ingredientes utilizados na dieta e a manipulação da microbiota podem resultar em efeitos positivos na produção, uma vez que a fermentação ruminal está intimamente ligada à eficiência produtiva. A redução nos teores de forragem na dieta de cordeiros confinados está sendo cada vez mais comum devido à dificuldade de produção, manejo operacional e armazenamento adequado de volumoso em determinadas localidades e épocas do ano. Consequentemente, a redução nos teores de fibra em detergente neutro (FDN) resulta em maior densidade energética das dietas, o que pode refletir positivamente no desempenho animal, com aumento no ganho de peso e eficiência alimentar (EA). Por outro lado, a redução no teor de fibra pode acarretar na ocorrência de distúrbios metabólicos, como acidose, que por sua vez pode causar efeitos deletérios a saúde do epitélio ruminal, comprometendo a absorção dos produtos da fermentação ruminal. Nesse sentido, a inclusão de teores adequados de fibra na dieta de cordeiros é de grande importância afim de conciliar a saúde ruminal e o desempenho animal. Uma das maneiras mais estudadas e utilizadas para manipular o processo de fermentação ruminal é pelo uso de aditivos alimentares. O aumento na retenção de energia, no ganho de peso, na EA, e a redução na ingestão de matéria seca, na produção de metano e na ocorrência de distúrbios metabólicos são algumas das consequências do uso de aditivos em dietas de ruminantes (Tedeschi, 2003; Duffield et al., 2012; González et al., 2012). Em dietas contendo elevado teor de concentrado, principalmente quando o milho é o principal ingrediente energético, a utilização de aditivos alimentares é de grande importância para otimizar os processos positivos (produção de propionato) e minimizar a ocorrência dos processos negativos (metanogênese). Nesse sentido é de grande interesse o amplo entendimento sobre os efeitos da manipulação da dieta, como teores de inclusão de fibra e utilização de aditivos

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alimentares, sobre os processos fisiológicos dos ruminantes, como os processos de fermentação, o desenvolvimento do epitélio ruminal, e consequentemente, os efeitos sobre o desempenho animal.

CARACTERIZAÇÃO DO EPITÉLIO RUMINAL Ao nascerem, os ruminantes apresentam o retículo-rúmen pouco desenvolvido e não funcional, representando 30% do total dos quatro compartimentos (rúmen, retículo, omaso e abomaso). As principais mudanças em termos de desenvolvimento vão ocorrer no retículo-rúmen, o qual será colonizado por diferentes tipos de microrganismos e terá sua musculatura e parede interna (papilas) desenvolvida. O desenvolvimento ruminal envolve o aumento de volume e musculatura do órgão, a capacidade de ruminação, o desenvolvimento de populações microbianas capazes de degradar os carboidratos ingeridos, produzindo ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), consequentemente, aumentando a capacidade absortiva (Khan et al., 2008). Com o desenvolvimento do rúmen, as proporções relativas dos compartimentos do trato digestório anterior se alteram, assemelhando-se à anatomia de um animal adulto. Esse desenvolvimento se deve a uma sucessão de fatores; como a disponibilidade de água e principalmente a presença de alimentos sólidos no rúmen, permitindo que haja colonização por microrganismos, promovendo o aumento da capacidade absortiva do epitélio ruminal, através do desenvolvimento de papilas saudáveis (Quigley, 1996). Dietas contendo diferentes proporções de forragens e concentrado resultam em alterações marcantes no rúmen-retículo e omaso. O desenvolvimento anatômico (volume ruminal) é conseguido com a presença de alimentos grosseiros (volumosos), apesar de não afetar o desenvolvimento de papilas. Já a capacidade absortiva (epitélio absortivo), que inclui tanto o desenvolvimento de papilas quanto a capacidade de metabolizar produtos finais da fermentação, está associado à presença de AGCC provenientes da fermentação dos alimentos com alto teor de amido (Bittar e Ferreira, 2011). Muitos fatores, como a natureza dos ingredientes sólidos oferecidos e a quantidade ingerida, podem afetar o desenvolvimento ruminal induzindo um estabelecimento precoce do ecossistema microbiano (Baldwin et al., 2004), aumentando os produtos de fermentação ruminal, como AGCC, e desencadeando o desenvolvimento do epitélio ruminal, proporcionando maior área de troca entre o conteúdo ruminal e a corrente sanguínea, permitindo com que o ruminante seja capaz não só de fermentar os alimentos sólidos como também utiliza-los como fonte de energia, que será utilizada para manutenção e crescimento. Dietas que promovem a produção de AGCC, especialmente o butírico

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e o propiônico, estimulam o desenvolvimento do epitélio ruminal e aceleram a maturação deste órgão (Bittar et al., 2002). O epitélio ruminal é do tipo estratificado pavimentoso queratinizado formado por quatro camadas de celular distintas: basal, espinhosa, granulosa e córnea ou queratinizada (Lavker et al., 1969). A proliferação desse tipo de epitélio ocorre a partir da camada basal, onde as células entram em divisão mitótica conforme a necessidade de suprimento celular do epitélio. Estas, por sua vez, sofrem diferenciação e migram para as demais camadas do epitélio até alcançar a camada córnea e descamar para dentro do lúmen ruminal (Lavker e Matoltsy, 1970). O tamanho e o formato das papilas são completamente dinâmicos, sujeitos às mudanças da dieta (Cunninghan, 1992) e são responsáveis pelo aumento da área absortiva, pois a maior parte da absorção de AGCC e outros metabólitos ocorrem em nível de papilas ruminais, sendo que os AGCC servem como estimuladores do desenvolvimento das papilas (Cunninghan, 1992). Com isso, pode-se explicar o fato de que em áreas de maior absorção, há um maior desenvolvimento de papilas ruminais. Sakata et al. (1980) descreveram que o rúmen se adapta ao aumento da ingestão de rações contendo elevada energia através da hiperplasia das células epiteliais, e que os AGCC, provenientes da fermentação ruminal, estimularam a mitose do epitélio ruminal em carneiros. No entanto, em estudos in vitro, os autores identificaram que a proliferação celular foi inibida, provavelmente devido à ausência de insulina, que parece ser o mediador da proliferação in vivo. Resende Júnior et al. (2006), concluíram que o aumento do índice mitótico, reflete em maior desenvolvimento de papilas e consequentemente uma maior área de absorção. Além disso, as papilas devem se desenvolver com ausência de lesões e ruminite.As dietas contendo elevado teor de concentrado geralmente favorecem as bactérias fermentadoras de amido no rúmen e tendem a resultar em maiores proporções molares de butirato e propionato (Schwartzkopf-Genswein et al., 2003). Em contraste, a ingestão de forragem promove o crescimento microbiano celulolítico e resulta em maiores proporções molares de acetato no rúmen (Žitnan et al., 1998). A fonte de amido, o teor de inclusão na dieta, a quantidade de amido ingerido, o tamanho do grânulo de amido (1 a 38 μm), o formato (lenticular, poliedro ou esférico) e a interações entre amilose e compostos superficiais podem alterar a taxa de digestão enzimática dos cereais, consequentemente afetando a concentração de AGCC produzidos durante a fermentação ruminal. O processamento de grãos (por exemplo: laminação a vapor, laminação a seco e trituração) podem quebrar o pericarpo do grão, romper a matriz proteíca e aumentar a área de superfície para ação enzimática, aumentando a taxa de fermentação (Huntington, 1997), com

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provável redução no pH ruminal (Lesmeister e Heinrichs, 2004). Quando o suprimento de carboidratos não fibrosos é aumentado abruptamente, os AGCC produzidos pelos microrganismos no rúmen e a proporção de ácido lático, aumentam como resultado da maior taxa de fermentação. O lactato não está geralmente presente no rúmen em altas concentrações, no entanto, quando o rúmen é abruptamente suprido com elevadas quantidades de carboidratos não fibrosos, o acúmulo de ácido lático ocorrerá (Owens et al., 1998). O lactato apresenta maior pKa (constante de dissociação) e, assim sendo, possui maior capacidade de reduzir o pH ruminal que AGCC (acetato, propionato e butirato; Dawson et al., 1997). Dessa forma, embora o uso de concentrados estimule de forma mais acentuada o desenvolvimento do tecido epitelial, o acúmulo de produtos finais de fermentação ruminal, por sua vez, aumenta a osmolalidade, causando a queda acentuada do pH ruminal e a morte de certas bactérias, podendo comprometer a ingestão e, por fim, o desempenho dos animais (Carter e Grovum, 1990). Como resultado, o desenvolvimento da mucosa ruminal é afetado positivamente pelas concentrações de AGCC no rúmen, mas negativamente pelas concentrações de lactato ruminal, incluindo outros efeitos negativos como à agregação de papilas, acidose, ruminite e paraqueratose do epitélio ruminal (Kay et al., 1969; Castells et al., 2013). Geralmente, o pH do fluido ruminal é influenciado pela taxa de fermentação e absorção do AGCC, que, por sua vez, são afetadas pela taxa de passagem da digesta e pela capacidade de tamponamento do conteúdo ruminal (Williams et al., 1987). O pH baixo tem implicações importantes para a composição da população microbiana, resultando frequentemente em mudança populacional indesejada e digestão ineficiente de alimentos (Penner e Oba, 2009). Consequentemente, o pH baixo também diminui a motilidade ruminal (Krause e Oetzel, 2006) e aumenta a queratinização das papilas (Bull et al., 1965), resultando em diminuição do fluxo sanguíneo para a mucosa ruminal e redução da absorção de AGCC (Hinders e Owen, 1965), podendo causar, em situações extremas, danos permanentes na parede do rúmen. A inclusão de forragem ou de materiais fibrosos que não fermentem rapidamente (por exemplo, cascas de soja) pode ser benéfica no aumento e estabilização do pH no rúmen. A fibra dietética tamponiza o trato gastrointestinal através do efeito estimulador na ruminação e salivação (McBurney et al., 1983). Por esta razão, o estudo da histologia do epitélio ruminal, bem como sua capacidade de absorção, tende a auxiliar no esclarecimento de distúrbios metabólicos, como a acidose, decorrentes do fornecimento de dietas de alta energia.

TEOR DE FDN EM DIETAS PARA CORDEIROS O confinamento é utilizado como umas das principais estratégias para

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intensificar a terminação de cordeiros que serão destinados a produção de carne. Este tipo de criação permite produção mais eficiente, sendo uma vantagem desse sistema o crescimento rápido dos animais quando comparados a criação em pastagem (Notter et al., 1991), uma vez que animais confinados e alimentados com dieta contendo elevado teor de concentrado se desenvolvem e atingem o peso de abate mais rapidamente, encurtando assim o ciclo de produção. No entanto, o consumo mínimo de fibra pelo animal deve ser levado em consideração na formulação da dieta, para que a saúde do ruminal não seja prejudicada. O aumento da concentração de carboidratos não fibrosos na dieta, que são rapidamente fermentados no rúmen, associados à baixa quantidade de fibra fisicamente efetiva, podem reduzir o pH ruminal e a digestão da fração fibrosa, comprometendo a saúde ruminal e, consequentemente, prejudicando o desempenho do animal. A utilização de dietas com maiores inclusões de volumoso podem levar a uma regulação física do consumo devido ao efeito físico de enchimento provocado pelo teor de fibra (Mertens, 1997), desta maneira, pode afetar negativamente o consumo de nutrientes e o desempenho animal. Geralmente, cordeiros alimentados com dietas contendo elevado teor de volumoso apresentam baixo ganho médio diário (GMD), sendo relatado ganhos abaixo de 100 g/animal/dia (Poli et al., 2008). Portanto, estudos que avaliem a eficiência do uso de diferentes relações volumoso:concentrado poderão contribuir com a busca da eficiência produtiva e econômica da terminação de cordeiros em confinamento. Alguns sistemas nutricionais utilizados para formulação de dietas de pequenos ruminantes estabelecem requisitos mínimos para os teores de FDN (20 e 24,5%), sendo que abaixo do valor de 20% a fermentação e os microrganismos seriam prejudicados, assim como, a síntese de proteína microbiana. Kozloski et al. (2006) ao avaliar dietas com diferentes níveis de FDN na dieta para cordeiros confinados (20% e 40%) não encontraram efeito da dieta sobre o pH ruminal. Gallo et al. (2019) ao avaliar dietas contendo 15, 20 e 25% de FDN para cordeiros em confinamento também não encontraram efeito da dieta sobre o pH ruminal e a concentração de AGCC. Além disso, os autores observaram que a inclusão de 25% de FDN aumentou o consumo de matéria seca (CMS), entretanto, não houve efeito sobre o GMD e peso final dos cordeiros após 50 dias de confinamento. Estes estudos mostram que dietas com 15% de FDN não resultam em efeitos prejudiciais ao processo de fermentação ruminal. Com isso, o possível aumento na quantidade de concentrado na dieta e diminuição nos teores de FDN poderiam trazer benefícios na produção de cordeiros. Entretanto, é importante ressaltar que existem poucos trabalhos avaliando os efeitos dos teores de FDN em dietas contendo elevado teor

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de concentrado sobre a morfologia e a histologia do epitélio ruminal.

NARASINA NA NUTRIÇÃO DE OVINOS A narasina é um antibiótico ionóforo de classe não compartilhada, produzida pelas bactérias Streptomyces aureofaciens (Berg e Hamill, 1978), com capacidade de alterar os gradientes iônicos e potenciais elétricos nas membranas celulares, prejudicando as funções e o metabolismo de células microbianas. Assim como outros ionóforos (monensina, lasalocida e salinomicina), a narasina é eficaz no controle da população de bactérias Gram-positivas, resultando em maior proporção molar de propionato, redução no acetato e, consequentemente, redução na relação acetato:propionato, além de aumentar a concentração total de AGCC no fluido ruminal (Polizel et al., 2018), o que resulta em ganhos energéticos no processo de fermentação. Nagaraja et al. (1987) demonstraram que baixas doses de inclusão de narasina resultaram em aumento na concentração de propionato quando comparado a monensina e lasalocida, além de apresentar maior capacidade de inibir a produção de ácido lático quando comparados a outros aditivos ionóforos e não ionóforos. A narasina possui capacidade coccidiostática, característica muito importante quando se trata de nutrição de animais jovens, por serem mais susceptíveis a ocorrência de coccidiose. Pesquisas avaliando a utilização de narasina para ovinos ainda são escassas, entretanto, os dados existentes na literatura mostram que a molécula possui grande potencial para uso nos mais diferentes estágios produtivos, como lactação, recria e terminação. A começar pelos efeitos da molécula sobre o processo de fermentação e digestibilidade dos nutrientes, trabalhos têm demonstrado que a inclusão de narasina aumentou a concentração ruminal de AGCC (Polizel et al., 2016a) e a digestibilidade aparente da FDN (Polizel et al., 2016b) em ovinos alimentados com dietas contendo elevado teor de volumoso de baixa qualidade (8,8% de PB). Por outro lado, Oliveira (2018) relatou que em dietas contendo elevado teor de forragem de alta qualidade (16% de PB) a inclusão de narasina além de aumentar a concentração total de AGCC no fluido ruminal, aumentou a proporção molar de propionato e reduziu a relação acetato:propionato. Em relação a dietas contendo elevado teor de concentrado (90% na MS) para cordeiros confinados, a inclusão de narasina aumentou a proporção molar de propionato e reduziu a relação acetato:propionato de maneira similar a monensina (Polizel et al., 2016c). Além disso, a narasina aumentou a digestibilidade da MS, matéria orgânica, PB, extrato etéreo e carboidratos não fibrosos (Polizel, 2017). Esses resultados demonstram que a narasina possui a capacidade de manipular os processos de fermentação no ambiente ruminal e alterar a digestibilidade dos nutrientes no trato gastrintestinal.

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A nutrição das matrizes e dos cordeiros durante a fase de cria (período de lactação) é de grande importância para o sucesso da ovinocultura, uma vez que define o potencial de crescimento dos cordeiros na fase inicial de desenvolvimento. Dois trabalhos avaliaram os efeitos da inclusão de narasina (13 mg/kg de MS) em dietas para ovelhas durante o período de lactação. Martins et al. (2018) relataram que a inclusão de narasina não afetou o CMS das ovelhas e aumentou em 22,2% na produção de leite. Além disso, os autores observaram que a narasina não afetou a porcentagem de gordura, lactose e sólidos totais do leite, entretanto, a narasina reduziu o teor de proteína do leite. Sardinha et al. (2018) também relataram que a inclusão de narasina não afetou o CMS e o aumento na produção de leite foi de 24,5%. Além disso, os autores relataram aumento na produção de gordura, proteína, lactose e sólidos totais. Nesse sentido, manejos nutricionais que aumentem a produção de leite da ovelha resultam em maior disponibilidade de nutrientes para os cordeiros, o que pode tornar o sistema produtivo mais viável por melhorar importantes índices zootécnicos, como a taxa de desmame e o peso corporal ao desmame. Em muitos sistemas de criação a terminação de cordeiros é realizado em confinamento, com dietas contendo elevado teor de concentrado, tendo como principal ingrediente energético o milho moído. A utilização de aditivos alimentares que modulem o processo de fermentação e aumente a retenção de energia por parte dos animais é de grande interesse para aumentar a economicidade do sistema. Polizel et al. (2016d) observaram que a inclusão de 5, 10 e 15 mg de narasina/kg de MS em dietas contendo 90% de concentrado resultou em aumento linear no GMD, EA e peso final dos cordeiros ao final dos 56 dias de confinamento. Além disso, os autores observaram que os cordeiros alimentados com narasina apresentaram desempenho superior quando comparado aos cordeiros alimentados com dietas contendo monensina (25 mg/kg de MS). A nutrição de animais de reposição durante a fase de recria geralmente é realizada em pastagem, ou seja, dietas contendo elevado teor de fibra. Alterações no processo de fermentação que otimizem a digestão da fração fibrosa podem resultar em ganhos produtivos, por isso, a utilização de aditivos pode ser uma das maneiras de otimizar fase de recria. Oliveira et al. (2018) avaliaram a inclusão de narasina (13 mg/kg de MS) e a frequência de fornecimento (diário, a cada dois dias ou a cada três dias) sobre o desempenho de cordeiros (as) alimentados com dietas contendo 95% de volumoso (11,2% de PB). Os autores relataram que o fornecimento diário de narasina ou a cada dois dias não afetou o CMS, entretanto, aumentou o GMD e a EA dos cordeiros (as), resultando em animais mais pesados ao final do período experimental (105 d).

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Os resultados apresentados demonstram que a narasina é um aditivo com grande potencial de utilização para otimizar a produção de ovinos nas mais diferentes fases de criação. Entretanto, ainda existem margens para novas pesquisas sobre o uso da molécula, como, por exemplo, os efeitos sobre a produção de metano, características de carcaça, composição da carne e desenvolvimento do epitélio ruminal.

MATERIAIS E MÉTODOS O experimento foi conduzido nas instalações do Sistema Intensivo de Produção de Ovinos e Caprinos (SIPOC) do Departamento de Zootecnia da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Universidade de São Paulo, localizada na cidade de Piracicaba - SP- Brasil. Foram utilizados 44 cordeiros machos não castrados, confinados em sistema de tie stall, ao abrigo de chuva e luz solar direta, com piso ripado, providos de bebedouro e cocho para fornecimento de ração e sal mineral. O delineamento experimental foi de blocos completos casualizados, com quatro tratamentos e onze repetições, em arranjo fatorial 2 × 2, sendo o fator I dietas contendo 20 ou 25% de FDN (na MS) e o fator II a inclusão ou não de 13 mg de narasina/kg de MS. Desta maneira, os tratamentos experimentais foram: I: dieta com 20% de FDN sem inclusão de narasina; II: 20% de FDN com a inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS; III: dieta com 25% de FDN sem inclusão de narasina e IV: 25% de FDN com a inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS. Os animais foram agrupados por idade e grupo genético e os blocos definidos pelo peso no início do experimento. O experimento teve duração de 112 dias. Os cordeiros foram pesados após jejum alimentar de 14 horas, nos dias 0 e 112 dias, sendo calculado o GMD do período total.As dietas experimentais foram formuladas através do programa “Small Ruminant Nutrition System 6.0” (Tabela 1). A composição química das dietas está descrita na Tabela 1. O feno foi moído utilizando triturador (Nogueira® DPM – 4, Itapira, São Paulo, Brasil), provido de peneira com crivos de 10 mm. Posteriormente foram misturados o farelo de soja, milho, feno, ureia, calcário, cloreto de amônio e mistura mineral. Após a adição ou não da narasina (Zimprova, Elanco Animal Health, São Paulo, Brasil), a ração foi homogeneizada utilizando-se misturador horizontal com capacidade de 500 kg (Lucato®, Limeira, São Paulo, Brasil) durante 10 minutos. A cada batida de ração uma amostra foi colhida e conservada a -18°C para posterior análise. As dietas experimentais foram fornecidas ad libitum, permitindo sobra entre 5 e 10% em relação ao ofertado. As sobras foram recolhidas e pesadas a cada 14

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dias, para determinação do CMS. A EA foi calculada com base no GMD e CMS. As sobras foram compostas por tratamento, amostradas (10%) e armazenadas a -18°C. Foram realizadas análises bromatológicas das amostras de oferta e sobra, sendo os procedimentos adotados de acordo com AOAC (1990) e Van Soest et al. (1991). As análises foram realizadas no Laboratório de Nutrição e Reprodução Animal (LNRA), do Departamento de Zootecnia da ESALQ/USP, Piracicaba /SP.

Tabela 1. Proporção e composição química dos ingredientes das dietas experimentais (% na MS).

20FDN= dieta contendo 20% de FDN na MS; 25FDN = dieta contendo 25% de FDN na MS; N0 = dieta sem a inclusão de narasina; N13 = inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS. MS = matéria seca, MN = matéria natural; MO = matéria orgânica, PB = proteína bruta, FDN = fibra insolúvel em detergente neutro, FDA = fibra insolúvel em detergente ácido.

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Ao final de 112 dias de confinamento os animais foram abatidos. Após a evisceração, o rúmen foi separado e seccionado para a colheita do fluído. O conteúdo amostrado foi filtrado em tecido de nylon de 150 mícrons para obtenção de aproximadamente 100 mL de líquido ruminal, sendo então feita a determinação do pH em pHmetro digital (DIGIMED DM20). Para determinação de AGCC foram pipetados 1,6 mL de líquido ruminal, 0,4 mL de solução metafosfórica 3:1 a 25% com 98-100% de ácido fórmico e 0,2 mL de solução de ácido etil butírico (100 mM). As amostras foram centrifugadas a 15.000 g por 60 minutos a 4°C. Posteriormente, o extrato sobrenadante (± 1,2 mL) de cada amostra foi transferido para o vial cromatográfico. A partir deste extrato, foram injetados automaticamente pelo sistema injetora, 1 μL em cromatógrafo a gás (CG HP 7890A; Injetor HP 7683B, tecnologias agilent) equipado com coluna capilar HP-FFAP (1909-112; 25M; 0,32 MM; 0,5 ‐l, JeW Agilent Technologies). O gás de arraste utilizado foi H2, mantido em fluxo de 31,35 ml/min. A temperatura do detector de injector foi de 260° C. O tempo total de análise cromatográfica foi de 16,5 minutos, dividido em três rampas de aquecimento: 80 ° C (1 min), 120°C (20°C/3min) e 205°C (10°C/min, 2 min). A concentração de AGCC (mM) foi determinada com base em uma curva de calibração externa previamente estabelecida. Após a colheita do conteúdo ruminal, foi realizada a remoção do excesso de tecido conjuntivo circundante, o esvaziamento do conteúdo e a lavagem do compartimento. Posteriormente, um fragmento de 5 cm² de epitélio foi colhido do saco cranial do rúmen. As amostras do rúmen de cada animal foram imediatamente colocadas em um recipiente contendo uma solução de álcool 70% previamente separadas e identificadas e posteriormente refrigeradas por cerca de 24 horas para a realização das mensurações morfológicas macroscópicas da parede do rúmen. Foi cortado um quadrado de 1 cm² do fragmento, coletado do saco cranial do rúmen, onde foram obtidos o número médio de papilas por cm² da parede (NMP), área média de papilas por cm² (AMP), área total de superfície absortiva por cm² de parede (ASA) e a representatividade das papilas na superfície absortiva em (%; RPSA). O número médio de papilas por cm² foi a quantidade de papilas inseridas em cada fragmento contada manualmente por 3 avaliadores, onde o valor final foi a média das 3 contagens. A área média das papilas foi mensurada através da digitalização das imagens das papilas por meio do programa na análise de imagens UTHSCSA Image Tool, em que cada fragmento foi analisado a área de 12 papilas retiradas aleatoriamente da base do fragmento. A AMP será determinada pela média da área das 12 papilas. Os fragmentos colhidos foram removidos do álcool 70% e submetidos a

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análise histológica segundo metodologia descrita por Odongo et al. (2006). Para análise histológica foi utilizado o programa Analisador Imagens Leica Qwin, contido no microscópio eletrônico de luz Leica. Foram analisadas altura, largura, área de papilas e espessura de epitélio queratinizado. As variáveis foram mensuradas em 10% do total das papilas obtidas na morfologia, sendo utilizado a média dessas observações para análise dos dados. A altura da papila foi definida como sendo uma linha reta traçada da base ao ápice da papila. Para a mensuração da largura e espessura de queratina foram traçadas retas em quatro lugares distintos da papila e a média será considerada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Procedimento MIXED do SAS (2002). Todos os dados foram analisados quanto à normalidade dos resíduos pelo teste de Shapiro Wilk, homogeneidade das variâncias através do teste de Levene e retirada dos outliers com base no valor do r de student. Para análise dos dados foram considerados como efeito fixo o teor de FDN das dietas, a inclusão de narasina e a interação entre os fatores. O bloco foi adicionado no modelo como efeito aleatório. Para todas as variáveis respostas as médias foram obtidas através do comando LSMEANS. Durante a interpretação e discussão dos resultados foi adotado como efeito significativo quando P ≤ 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Não houve interação entre teores de FDN na dieta e a inclusão de narasina para as variáveis relacionadas ao desempenho dos cordeiros (Tabela 2). Os teores de FDN nas dietas não afetaram o GMD (P = 0,27), resultando em mesmo peso ao final do período experimental (P = 0,33). Entretanto, dieta contendo 25% de FDN resultou em aumento no CMS dos cordeiros (P = 0,04) e, consequentemente, reduziu a EA (P < 0,01) quando comparado a dieta com 20% de FDN. A inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS não afetou as variáveis relacionadas ao desempenho dos cordeiros (P > 0,33). O consumo de alimento, é regulado e limitado tanto pelas exigências metabólicas como fisiológicas dos animais (Van Soest, 1994). O maior CMS pelos cordeiros alimentados com dietas contendo 25% de FDN pode ter sido influenciado pelo menor nível de energia na dieta, visto que o aumento na inclusão de feno ocorreu em decorrência da redução na inclusão do milho (diminuição de aproximadamente 13%). Turino et al. (2007) observaram aumento no CMS conforme o aumento na inclusão de fibra na dieta e afirmaram que isso ocorre devido ao efeito de diluição da energia da dieta. Essa compensação no CMS pode acontecer desde que não haja limitação física para o consumo (Mertens et al., 1994). Além disso, a maior inclusão de fibra torna a dieta mais segura do ponto de

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vista de fermentação ruminal, pois há maior estímulo para o processo de ruminação, resultando em maior salivação e, consequentemente, elevação do pH ruminal (Mendes et al., 2010). Avaliando o efeito da narasina sobre o desempenho de cordeiros, Polizel et al. (2016d) utilizando concentrações crescentes de narasina (5, 10 e 15 mg/kg de MS), controle (sem ionóforo) e 25 mg de monensina/kg de MS em dietas contendo elevado teor de concentrado, concluíram que a narasina aumentou linearmente o GMD, peso corporal final e a EA dos cordeiros. Além disso, a narasina apresentou resultados superiores quando comparado a monensina. Entretanto, no presente estudo, não foi observado o efeito da narasina sobre as variáveis relacionadas a desempenho.

Tabela 2. Desempenho de cordeiros alimentados com dietas contendo diferentes teores de FDN com a inclusão ou não de narasina.

120FDN = dieta contendo 20% de FDN na MS; 25FDN = dieta contendo 25% de FDN na MS; N0 = dieta sem a inclusão de narasina; N13 = inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS.2F = efeito dos teores de FDN; N = efeito da inclusão da narasina; F×N = efeito da interação entre teores de FDN e inclusão de narasina

Houve interação entre teor de FDN da dieta e a inclusão de narasina para a proporção molar de propionato (P = 0,02), isovalerato (P = 0,01) e relação acetato:propionato (P < 0,01). A inclusão de narasina aumentou o propionato em dietas contendo 25% de FDN, entretanto, não houve efeito da narasina em dietas contendo 20% de FDN. Consequentemente, a utilização de 13 mg de narasina reduziu a relação acetato:propionato nas dietas contendo maior teor de FDN, entretanto, não foi observado efeito nas dietas contendo 20% de FDN. Além disso, a

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inclusão de narasina reduziu a proporção molar de isovalerato em dietas com 25% de FDN, não havendo efeito nas dietas contendo 20% de FDN (Tabela 3). As dietas contendo 20% de FDN apresentaram menor proporção molar de acetato (P < 0,01), isobutirato (P = 0,01) e menor pH ruminal (P = 0,04), entretanto, aumentaram a proporção molar de valerato (P = 0,01) em relação a 25FDN. Não houve efeito dos teores de FDN sobre as demais variáveis (Tabela 3). A inclusão de narasina reduziu a proporção de acetato (P < 0,01), não sendo observado efeito nos demais AGCC. Além disso, a narasina aumentou a concentração total de AGCC (P < 0,01) e o pH ruminal (P = 0,05) (Tabela 3).

Tabela 3. Parâmetros de fermentação ruminal de cordeiros alimentados com dietas contendo diferentes teores de FDN com a inclusão ou não de narasina.

120FDN = dieta contendo 20% de FDN na MS; 25FDN = dieta contendo 25% de FDN na MS; N0 = dieta sem a inclusão de narasina; N13 = inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS.2F = efeito dos teores de FDN; N = efeito da inclusão da narasina; F×N = efeito da interação entre teores de FDN e inclusão de narasina

O aumento da proporção de acetato e da relação acetato:propionato com o aumento no teor de FDN na dieta ocorre uma vez que as bactérias fibrolíticas produzem mais acetato, enquanto as amilolíticas tendem produzir mais propionato (Blaxter, 1962). Em geral, quando se diminui a proporção volumoso:concentrado, também diminui a relação acetato:propionato no fluido ruminal (Annison e Armstrong,

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1970). Assim como no presente estudo, Fuller e Johnson (1981) também relataram diminuição na relação acetato:propionato com a adição de ionóforos em dietas com alto teor de concentrado. Os ionóforos (monensina, lasalocida, salinomicina e narasina) são moléculas lipofílicas que atuam sobre a membrana de bactérias (Pressman, 1976) reduzindo a atividade e a população de bactérias Gram-positivas (McGuffey et al., 2001), protozoários e inibindo fungos (Bergen e Bates, 1984). O efeito gerado pelo uso destes ionóforos é a alteração no processo de fermentação ruminal, sendo relatado o aumento na produção de propionato, queda no butirato (Ellis et al., 2012), diminuição na população das bactérias produtoras de lactato, aumento na estabilidade do pH ruminal (Coe et al., 1999) e diminuição na produção de metano (Russel e Strobel, 1989). Ácidos graxos de cadeia ramificada (AGCR) (isobutírico, isovalérico) são compostos essenciais para os microorganismos que degradam a fibra e também para aqueles que degradam carboidratos não fibrosos (Bryant, 1995). No presente estudo, o aumento nas proporções do isovalérico e isobutírico nas dietas com maiores teores de FDN pode ser um indicativo de aumento da eficiência das bactérias fibrolíticas na degradação da fibra. Cline et al. (1966) observaram o aumento na digestão da celulose em carneiros que receberam AGCR. Alguns trabalhos têm demonstrado a capacidade da narasina em aumentar a concentração total de AGCC no fluido ruminal em animais alimentados com dietas contendo elevado teor de volumo (Polizel et al., 2016a; Polizel et al., 2018; Miszura et al., 2018). Esse efeito pode ser associado a maior eficiência do processo de fermentação dos carboidratos da dieta. Pelo nosso conhecimento, o presente estudo foi um dos primeiros a relatar aumento nos AGCC totais em dietas contendo elevado teor de concentrado. Dietas contendo elevado teor de amido resultam em maior taxa de fermentação fazendo com que ocorra queda no pH ruminal, favorecendo o desenvolvimento de bactérias produtoras de ácido lático, resultando em aumento na concentração de ácido lático no ambiente ruminal (Owens et al., 1998). O lactato apresenta maior capacidade de acidificação do meio quando comparado com os AGCC comumente produzidos no rúmen, promovendo assim maior efeito na redução do pH ruminal (Dawson et al., 1997). Nesse sentido, o aumento na quantidade de carboidratos fibrosos, que estimulem a ruminação, resulta em elevação no pH ruminal, minimizando os riscos de ocorrência de acidose (Owens et al., 1998). No presente estudo foi possível observar que o aumento nos teores de FDN resultou em elevação no pH ruminal. Além disso, a inclusão de narasina também resultou em alterações no processo fermentativo e, consequente, aumento no pH do fluido

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ruminal. Quando adicionados à dieta, os ionóforos diminuem a população das bactérias produtoras de lactato e aumentam a estabilidade do pH ruminal (Coe et al., 1999). Nagaraja et al. (1987) observaram que a narasina foi mais eficaz na inibição da produção de ácido lático em relação à monensina e lasalocida. Deste modo, a narasina se torna uma importante alternativa na nutrição de ruminantes quando se tem como objetivo o controle da microbiota ruminal e manipulação da fermentação ruminal Não houve interação entre teores de FDN da dieta e a inclusão de narasina sobre as variáveis relacionadas a morfologia e histologia das papilas ruminais dos cordeiros (Tabela 4). A utilização de dietas contendo 25% de FDN resultou em maior número de papilas no epitélio ruminal por cm² (P = 0,04) e reduziu a espessura de queratina (P = 0,05). Não houve efeito do teor de FDN sobre as demais variáveis analisadas.

Tabela 4. Morfologia e histologia das papilas ruminais de cordeiros alimentados com dietas contendo diferentes teores de FDN com a inclusão ou não de narasina.

120FDN = dieta contendo 20% de FDN na MS; 25FDN = dieta contendo 25% de FDN na MS; N0 = dieta sem a inclusão de narasina; N13 = inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS.2F = efeito dos teores de FDN; N = efeito da inclusão da narasina; F×N = efeito da interação entre teores de FDN e inclusão de narasina

A inclusão de 13 mg de narasina/kg de MS não afetou o número médio de papilas por cm², a largura das papilas e a espessura do tecido absortivo. Entretanto, a inclusão da narasina aumentou a altura das papilas (P = 0,04), a área das papilas (P = 0,04), a área absortiva por cm² (P = 0,04) e a representatividade da área

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das papilas em relação a área total absortiva (P = 0,02). Além disso, a inclusão de narasina reduziu a espessura de queratina (P = 0,02; Tabela 4). Segundo Costa et al. (2003) os alimentos oferecidos exercem grande influência tanto macroscopicamente quanto microscopicamente, interferindo no desenvolvimento das papilas do rúmen. Uma vez que os AGCC produzidos são influenciados pela composição da dieta, é importante atentar-se que dietas contendo maiores inclusões de concentrado (principalmente amido) estimulam a produção de propionato e maiores inclusões de volumoso (fibra) estimulam a produção de acetato. Ou seja, a composição da dieta tem relação direta com questões morfológicas e histológicas do epitélio ruminal. Dietas com alta taxa de fermentação proporcionam maior espessura de camada de queratina no rúmen, devido a maior vacuolização observada nas células do estrato queratinizado do rúmen, provocando um efeito abrasivo sobre a queratina da mucosa ruminal. Deste modo, maior vacuolização celular, ou seja, o aumento do tamanho das células mortas que compõem a camada, fato que ocorre quando a taxa de morte é superior a taxa de regeneração tecidual. A camada queratinizada configura deste modo uma importante barreira protetora, que dificulta a entrada de microorganismos invasores e a ação de substâncias agressoras ao epitélio. Pode-se observar no presente estudo a diminuição da espessura de queratina nas dietas com maior teor de FDN, ou seja, mostrando que este tipo de dieta para cordeiros em confinamento torna o rúmen um ambiente menos agressivo ao epitélio ruminal. A utilização de narasina também fez com que a espessura de queratina fosse reduzida, devido ao fato de que a molécula apresenta a capacidade de manter o pH ruminal mais elevado em situações de mudança abruptas nas dietas como relatado por Polizel et al. (2017). A altura, a espessura e o formato das papilas dependem da composição energética da alimentação. Para que ocorra um crescimento na altura das papilas, é exigido uma demanda grande de energia, que deve ser consumida através do alimento oferecido (Cavalcanti, 2014). Como a inclusão do ionóforo proporcionou maior quantidade de propionato, pode-se inferir que houve maior disponibilidade de substrato para o crescimento das papilas. De acordo com Lesmeister e Heinrichs (2004), a altura das papilas pode ser utilizada como o principal parâmetro de desenvolvimento do epitélio do rúmen, sendo o fator que melhor representa o efeito do tratamento no desenvolvimento ruminal. A área de superfície das papilas, juntamente com o número de papilas por cm², determinará a área absortiva total. O aumento desta, resultará em maior capacidade de absorção do epitélio ruminal, resultando em menor acúmulo de AGCC no rúmen e maior estabilidade do pH (Wang et al., 2009). Nesse sentido,

188

a utilização de aditivos alimentares que aumentem a área total absortiva é de grande interesse, especialmente em dietas contendo elevado teor de concentrado, resultando em efeitos benéficos ao ambiente ruminal, assim como, ao metabolismo energético do animal.

CONSIDERAÇÕES FINAIS O teor de FDN incluído em dietas para cordeiros confinados exerce importante efeito sobre o desempenho animal, fermentação ruminal, morfologia e histologia das papilas. Ambos os teores avaliados resultaram em mesmo peso final aos 112 dias de confinamentos, entretanto, com maior EA quando utilizado 20% de FDN. Por outro lado, a inclusão de 25% de FDN garantiu elevação do pH ruminal, o que pode conotar uma fermentação mais segura. Tal fato foi comprovado com a menor espessura de queratina das papilas quando utilizado maior teor de FDN nas dietas. Em relação à inclusão de narasina, apesar de não ter sido observado efeito sobre o desempenho animal, esse foi o primeiro trabalho a avaliar os efeitos da molécula sobre a morfologia e histologia das papilas. Os resultados observados mostraram que a alteração causada pela narasina no processo de fermentação ruminal favoreceu o desenvolvimento e a saúde das papilas, sendo observado maior altura, área absortiva, e menor espessura de queratina. Essas alterações são de grande importância para cordeiros alimentados com dietas contendo elevado teor de concentrado, especialmente em confinamentos de longa duração.

189

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CAPÍTULO IXEFEITOS DE MEIO E AVALIAÇÃO GENÉTICA PARA VARIÁVEIS CINEMÁTICAS

DE ANDAMENTO EM EQUINOS MARCHADORES

Fernando de Oliveira Bussiman¹, José Bento Sterman Ferraz²,

Rachel Santos Bueno Carvalho³, Joanir Pereira Eler², Elisângela Chicaroni

Mattos², Júlio Cesar de Carvalho Balieiro¹

¹ Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo (VNP-FMVZ/USP), Pirassununga, São Paulo, Brasil;² Departamento de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo (ZMV-FZEA/USP), Pirassununga, São Paulo, Brasil.³ Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo (ZAB-FZEA/USP), Pirassununga, São Paulo, Brasil;

RESUMOA morfologia dos equinos tem sido usada como parâmetro indireto à seleção do andamento, entretanto, o conhecimento dos parâmetros genéticos e dos efeitos de meio influenciando os diversos aspectos dos andamentos equinos, se faz necessário para uma correta seleção dos animais. Foram analisados 75 cavalos (machos e fêmeas) das raças Mangalarga, Mangalarga Marchador e Campolina. Os animais foram filmados em pista plana de 10m de comprimento, a uma velocidade de aquisição dos vídeos de 120 fps, em uma resolução de 10 MP. Todos os animais tiveram suas medidas morfométricas coletadas em estação, com auxílio de hipômetro próprio. Os dados foram analisados via modelo linear misto e os parâmetros genéticos foram obtidos por um modelo linear multicaracterística misto em algoritmo REML. Foram encontradas diferenças significativas (P < 0,05) nas variáveis morfométricas dentro dos grupos raciais e diferenças nas variáveis biodinâmicas para o tipo de marcha. As estimativas de herdabilidade variaram de 0,24 a 0,64 para suspensão e dissociação, respectivamente. Foram observados efeitos do ginete e do uso de sela sobre as características de andamento. Os resultados encontrados, suportam o uso de características cinemáticas e biodinâmicas para a seleção de animais com mérito genético superior para aspectos de andamento.

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INTRODUÇÃO No mundo todo são cerca de 113 milhões de equídeos, dos quais, 58 milhões são equinos (Almeida & Silva, 2010; FAO, 2017). Deste total (58 milhões), 57% encontram-se nas Américas (Almeida and Silva, 2010), evidenciando assim, a importância da equideocultura neste continente. Petersen et al. (2013a, 2013b) afirmam que os equinos possuem importância como animais de transporte, trabalho e lazer, além da importância econômica. No Brasil são cerca de 5,5 milhões de cabeças (IBGE, 2015; MAPA, 2016), colocando o país em 4º lugar na classificação dos maiores rebanhos equinos do mundo. O País possui, atualmente, reconhecidas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), 12 raças de equídeos, das quais 6 são de animais marcadores (Araújo, 2013). Em número de animais, o destaque é para o Mangalarga Marchador, seguido do Nordestino e do Quarto de Milha (MAPA, 2016). A equideocultura brasileira movimenta, anualmente alto volume de recursos e, sua maior importância se dá no âmbito de manejo da pecuária de corte (Coelho & Oliveira, 2008). De acordo com a Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil (CNA, 2004), o rebanho equino se movimenta junto ao bovino, apresentando uma correlação entre as quantidades de animais de 0,74. Com contribuição decisiva nas demais criações animais, os cavalos desempenham diversas funções, em diferentes atividades. Seu uso vai desde o militar, até o lazer, passando, inclusive, pela lida com animais de produção e pelo esporte equestre (Kist et al., 2017). Anualmente são movimentados mais de R$ 7 bilhões pelo complexo agronegócio do cavalo no Brasil, empregando mais de 3 milhões de pessoas, possuindo, portanto, importância não só econômica, mas social (Lima et al., 2006). Recentemente, diversos estudos foram conduzidos utilizando biotecnologias na experimentação com equinos (Oliveira, 2010), tais estudos culminaram com a descoberta de genes relacionados ao andamento, ou influenciando na determinação do tipo de andamento (Andersson et al., 2012; Bussiman, 2018; Bussiman et al., 2019; Fonseca et al., 2017; Patterson et al., 2015; Promerová et al., 2014). Outros estudos, trabalhando com analise de videoimagens, mostraram que atributos de qualidade dos andamentos equinos apresentam variabilidade genética aditiva, suficiente para a seleção (Molina et al., 2008; Novoa-Bravo et al., 2018; Solé et al., 2014). Entretanto, os estudos que avaliam aspectos qualitativos em equinos nacionais são poucos até o presente momento. Além disso, os animais nacionais apresentam, em algumas raças, mais de uma marcha, sendo ambos os tipos herdáveis, o que dificulta a aplicação dos resultados de pesquisas feitas no

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exterior. De acordo com Bussiman et al. (2019), os cavalos Mangalarga Marchador apresentam dois tipos de andamentos que se classificam como andamentos a quatro tempos e quatro batidas, dissociados e que diferem na proporção de apoios laterais e diagonais.

ANDAMENTOS DO CAVALO Os andamentos dos cavalos podem ser divididos em naturais e artificiais (Ensminger, 1990). Por andamentos naturais entende-se todo andamento que a maioria dos animais é capaz de executar sem treinamento, já os artificiais, além de requererem treinamento, são andamentos especializados para determinadas competições equestres, exigindo alto grau de equitação do cavaleiro e alto grau de treinamento do cavalo. De acordo com Andrade (1986) os andamentos naturais são, ainda, reclassificáveis em outras duas categorias: saltados e não saltados. O primeiro andamento natural dos cavalos é o passo, sendo o andamento de menor velocidade e feito por todas as raças (Toledo, 2006). O passo é um andamento simétrico, por isso os pares de membros contralaterais são igualmente espaçados no tempo e espaço, permitindo uma movimentação dissociada (Clayton & Hobbs, 2017). Mesmo este sendo o andamento de menor velocidade dos cavalos, Barrey (2013) o classifica como sendo o andamento mais complexo dos cavalos. Não havendo suspensão neste andamento, o animal sempre está em contato com o solo e a cobertura de terreno fica dependente do alcance dos membros (Moore, 2010). De acordo com Clayton, (2016) e Clayton & Hobbs (2017), a propulsão dos movimentos inicia-se pelos membros posteriores, o que promove o deslocamento do centro de massa do animal e faz com que inicie-se, assim, a locomoção. Desta forma se o animal inicia a propulsão com o membro pélvico direito, a sequência de movimentos seria: membro pélvico direito, membro torácico direito, membro pélvico esquerdo e, por fim, membro torácico esquerdo. Todos esses movimentos de apoio, elevação e avanço seguem uma cadência de quatro tempos e quatro batidas, na qual cada membro está em um diferente tempo (Barrey, 2013; Moore, 2010). Seguindo a escala de velocidade, o próximo andamento natural dos cavalos, após o passo, é o trote. Se o passo é um andamento a quatro tempos e dissociado, o trote é o oposto, apresentando dois tempos e duas batidas, por isso o chamamos de associado. Trata-se, também, de um andamento simétrico, no qual o animal se desloca fazendo duas fases de apoio diagonais e duas de suspensão (Moore, 2010). A simetria no trote faz com que os pares de membros diagonais desloquem-se no mesmo intervalo de tempo, resultando, assim, em uma alta associação destes membros (Barrey, 2013; Brown et al., 2015; Clayton, 2016; Clayton & Hobbs, 2017),

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o que confere ao trote grande estabilidade (Hobbs et al., 2014; Toledo, 2006). Os cavalos ainda apresentam, outros dois andamentos, o cânter e o galope, sendo o último uma variante do primeiro em velocidade levando à corrida (Barrey, 2013; Roberts, 1995). O cânter é um andamento a três tempos, mais rápido que trote médio (Toledo, 2006), assimétrico, no qual o membro predominante (último a deixar o solo) está do mesmo lado nos pares pélvicos e torácicos (Barrey, 2013; Clayton and Hobbs, 2017). No cânter a cobertura de terreno depende não só da amplitude da passada do cavalo, mas do comprimento do corpo do animal em relação à altura. Comparando o galope ao cânter, a evolução em velocidade faz com que este andamento seja dissociado a 4 tempos, com a fase de apoios diagonais dissociadas (ao contrário do cânter) (Barrey, 2013; Harris, 1993), por outro lado o centro de massa do animal, neste andamento, é menos sujeito a oscilações verticais do que no cânter (Geser-von Peinen et al., 2013). Até aqui podemos, então, dizer que o trote é um andamento intermediário ao passo e ao cânter/galope, mas existe outro andamento, o qual animais que o fazem não executam trote, chamado andadura. A andadura é um andamento análogo ao trote, desclassificatória no Brasil para a concessão de registro genealógico, exceto para animais que competem no surke. Neste andamento o deslocamento é totalmente lateral, alternando os pares direitos e esquerdos com momentos de suspensão (de Andrade, 2009; Toledo, 2006). Se imaginarmos os andamentos em um diagrama, posicionando os diversos tipos de apoios e velocidades, a marcha se insere entre o trote e a andadura, reunindo rendimento elevado com alta comodidade à montada (Andersson et al., 2012; Andrade, 1986, 1984; Toledo, 2006). Trata-se de um deslocamento dissociado, de forma que cada membro se encontra em um tempo diferente das fases de apoio, elevação e avanço. Além disso o tempo de duração para cada uma dessas fases é diferente para cada membro, bem como os tempos de apoios diagonais e laterais (Lage, 2001; Nascimento, 1999; Toledo, 2006). O resultado da dissociação é um maior (senão constante) contato com o solo pelos membros do animal, o que não ocorre no trote. Este constante contato com o solo é responsável pelas maciez e comodidade do cavalo de marcha (Procópio, 2004; Toledo, 2006). Por definição, a marcha é “um andamento dissociado e cômodo, alterando apoios diagonais e laterais, intercalados por momentos de tríplice apoio” (Bussiman, 2018a). Se enquadram nesta definição dois tipos de andamentos: a Marcha Batida (MB) e Marcha Picada (MP). A MB apresenta um diagrama similar ao passo, com quatro batidas e oito momentos de apoios (Hussni et al., 1996; Seidel, 1989). A variação natural da MB seria ente 6 a 8 momentos de apoio (Jung, 1998), com predominância dos apoios diagonais (Hussni et al., 1996; Nicodemus & Clayton, 2003).

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Mesmo tratando-se de um andamento a 4 tempos, ao ouvir-se um animal marchado o som das batidas no solo se aproximam duas a duas, isso ocorre, pois, a dissociação da MB não é tão elevada e a dissociação lateral é maior do que a diagonal (Andrade, 1984), desta forma, uma maneira simples de reconhecer a MB é ouvir um som de “pra-pra” quando o animal marcha. A MP também é um andamento a 4 tempos e com 8 apoios (Hussni et al., 1996), o qual já foi chamado de “marcha propriamente dita” por Chieffi (1943), por apresentar momentos de tríplice apoio intercalados com apoios diagonais e laterais bem definido (Jung, 1998; Wi‐dorf, 1990; Wi‐dorf & Severin, 1992). Na MP o deslocamento do animal é predominantemente lateral (Nicodemus & Clayton, 2003), com maior tempo de elevação dos membros dianteiros, fato que reduz o rendimento do animal (Andrade, 1984; de Andrade, 2009). Se na MB as batidas apresentavam-se próximas a duas a duas, na MP as batidas são quase que igualmente separadas, o que decorre da elevada dissociação deste andamento, levando a uma sonorização do andamento como “taca-taca-taca” (Araújo, 2013).Um outro andamento, apresentado por alguns animais de raças específicas é a Marcha Trotada (MT). A MT é um andamento com duas batidas e seis momentos de apoio (Chieffi, 1943), simétrico e a dois tempos (Hussni et al., 1996), aproximando-se da MB, sem apresentar apoios laterais, sendo estes substituídos por apoios monopedais, pélvicos e torácicos (Wi‐dorf, 1990). A MT apresenta dissociação muito menor do que a MB ou MP, o que a aproxima do trote, sendo por alguns com ele confundida, todavia, não possui suspensão o que não a classifica como trote (Procópio, 2004; Simões, 1983; Toledo, 2006).

MORFOLOGIA A conformação dos cavalos foi influenciada pelo meio, de modo que a forma do cavalo se prestasse à função que dela o cavalo retirasse (Giannoni, 1988). Desta forma existiria uma ligação entre a função desempenhada pelo cavalo e sua forma, levando a crença de que “forma prediz função” (Giannoni, 1988), o que na verdade nem sempre se verifica, uma vez que o desempenho funcional dos equinos se deve, ainda, a fatores fisiológicos, psíquicos e de ambiente, logo a forma é apenas um indicativo de aptidão zootécnica. Desta forma, seria razoável dizer que a conformação predisporia um animal à determinada função, mas não garantiria o desempenho. Assim, padrões foram criados, unificando os animais em tipos biológicos mais predispostos a determinadas atividades (Andrade, 1986, 1984; Edwards, 1994). O resultado da soma do movimento de cada vértebra individualmente é o movimento do cavalo (Mieiro, 2013), restrito ainda a todas as estruturas que rodeiam essas vértebras e

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que pode ser estudado através da biomecânica. O pescoço dos cavalos tem diversas funções, dentre elas, ele contribui para o apoio da postura, oscilações dos membros e o posicionamento da cabeça (Gellman & Bertram, 2002). O dorso por sua vez está relacionado com a amplitude da passada, de tal forma que quanto maior a lateroflexão da região lombar e maior a amplitude de movimento flexor na região caudal, maior a amplitude da passada (Johnston et al., 2002). Todavia a morfologia e a anatomia dos animais não são algo estático, o posicionamento tanto da cabeça, como dos membros, bem como, ainda, do cavaleiro durante a montada pode influenciar no desempenho do animal (Mieiro, 2013). Rhodin et al. (2005) observaram que em posição de cabeça elevada, os cavalos mostraram redução na capacidade de flexão e lateroflexão da região lombar, ao passo que em posições mais baixas não houve alterações. A conformação tornaria então o animal não somente belo, mas funcional, de modo que cavalos mais harmônicos, isto é, possuindo uma morfologia equilibrada, bem como com uma correta equitação, apresentam um movimento uniforme, propulsionado e elástico. De acordo com Andrade (1986, 1984), uma outra função primordial da morfologia correta de um animal é posicionar o seu centro de massa, favorecendo, assim, o movimento.

PARÂMETROS GENÉTICOS PARA MOROFOLOGIA E ANDAMENTO EM EQUINOS NACIONAIS Segundo Regatieri & Mota (2012), devido a qualidade da tropa nacional e da implementação das tecnologias atuais, o melhoramento genético de equinos apresenta grande potencial. Entretanto, há problemas, como por exemplo, os baixos coeficientes de herdabilidade, ou a baixa correlação genética das características funcionais com conformação, primeiro e maior objetivo de seleção dos criadores. Na raça Mangalarga, a altura de cernelha apresenta herdabilidade de 0,47 (Mota et al., 2006), valor um pouco mais alto do encontrado por Bussiman et al. (2018b) em cavalos Campolina (0,43). Richard et al. (2000), trabalhando com médias de diversas raças, encontraram coeficientes de herdabilidade variando de 0,20 a 0,50 para a altura de cernelha, já Zamborlin et al. (1996) encontraram herdabilidade de 0,49 na raça Mangalarga Marchador. A correlação genética entre a altura de cernelha e o deslocamento na raça Mangalarga é de 0,47 (Mota et al., 2006), porem, na raça Campolina foi observado correlacao entre marcha e altura de cernelha de -0,32 (Bussiman et al., 2018b). Considerando a pontuação de andamento no momento do registro genealógico do animal, Mota et al. (2006) e Mota & Prado (2005), trabalhando com animais

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da Mangalarga, encontraram um coeficiente de herdabilidade de 0,27, ao passo que para a mesma característica Bussiman et al. (2018b), em cavalos Campolina, encontraram o valor de herdabilidade de 0,07. Segundo Mota & Gianoni (1994), a herdabilidade média observada dos aspectos que compõe a conformação em animais puros foi de 0,27. Já o comprimento da passada ao trote possui herdabilidade de 0,63 (Mota & Giannoni, 1994), mostrando que, por vezes, características funcionais podem ser mais herdáveis do que características lineares em cavalos. Ainda pensando na relação entre morfologia e andamento, a conformação da cabeça apresenta herdabilidade de 0,24 e correlação genética com o deslocamento de 0,57 (Mota et al., 2006; Prado & Mota, 2008). Entretanto, o maior coeficiente de correlação entre morfologia e andamento está na conformação dos membros que, possui uma correlação genética com andamento de 0,60 (Prado & Mota, 2008a; 2008b). Bussiman et al. (2018b) observaram que a pontuação de andamento em cavalos Campolina possui correlação genética positiva, mas desprezível, com o comprimento do dorso-lombo e com a razão entre altura de cernelha e altura de garupa. Por outro lado, Bussiman et al. (2018d) encontraram uma relação favorável entre andamento e harmonia geral.

OBJETIVOS Este trabalho visou avaliar em equinos das raças Mangalarga, Mangalarga Marchador e Campolina: 1) O efeito do tipo de andamento e de raça sobre variáveis morfológicas; 2) O efeito do tipo de andamento e de raça sobre parâmetros qualitativos de andamento obtidos via analise de videoimagens; 3) Processar avaliação genética para variáveis de andamento equino via modelo multicaracterística.

MATERIAL E MÉTODOS6.1. ANIMAIS E COLETA DE DADOS Foram coletados 44 animais Mangalarga Marchador, 26 Mangalarga e 5 Campolina, totalizando 75 animais, sendo 44 fêmeas e 31 machos em 10 diferentes cidades do interior de São Paulo e Minas Gerais. Todos os animais foram filmados em pista plana, a uma velocidade de aquisição dos vídeos de 120 fps. Após as filmagens, os animais foram mensurados em estação para as seguintes características morfológicas: a) Altura de Cernelha (m); b) Altura de Garupa (m); c) Comprimento Corporal (m); d) Comprimento do Dorso-lombo (m);

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e) Comprimento da Espádua (m); f) Perímetro Torácico (m); g) Ângulo da Paleta (graus); h) Ângulo da Garupa (graus). Todas as medidas foram feitas com um hipômetro confeccionado em tubos de PVC conforme Oliveira et al. (2012) e, para a aferição das medidas angulares, foi utilizado um angulador com nível de bolha. O processamento das análises de vídeo se deu como proposto por Bussiman et al. (2018c). Nesta técnica o movimento é decomposto sob um plano cartesiano, cada membro é tratado com um ponto de massa independente e são estudadas as coordenadas de cada membro ao longo da trajetória. Os membros foram marcados, para este experimento, como A – membro dianteiro direito, B – membro posterior direito, C – membro dianteiro esquerdo e D – membro posterior esquerdo. Após o processamento dos vídeos foram obtidas 24 variáveis biodinâmicas a saber:a) Dissociação (ms); b) Dissociação Lateral (ms); c) Dissociação Diagonal (ms); d) Rendimento (m); e) Elevação (m); f) Amplitude (m); g) Frequência (passos/min); h) Velocidade (Km/h); i) Duração da Passada (ms); j) Apoio do Membro A (ms); k) Apoio do Membro B (ms); l) Apoio do Membro C (ms); m) Apoio do Membro D (ms); n) Avanço do Membro A (ms); o) Avanço do Membro B (ms); p) Avanço do Membro C (ms); q) Avanço do Membro D (ms); r) Apoio Monopedal (ms); s) Apoio Bipedal (ms); t) Apoio Bipedal Lateral (ms); u) Apoio Bipedal Diagonal (ms); v) Apoio Tripedal (ms); w) Suspensão (ms); x) Coeficiente de Lateralidade (%). Para todos os animais a informação de pedigree foi obtida na sessão livre dos sites das respectivas associações de criadores e o pedigree foi composto até que se desconhecessem todos os ancestrais dos animais. Desta forma, o arquivo de pedigree foi composto de 1.704 animais.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

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7. RESULTADOS E DISCUSSÃO7.1. Efeitos de Meio A Tabela 1 apresenta a estatística descritiva das variáveis estudadas. É possível inferir que a altura de garupa e de cernelha possuem a mesma média, o que mostra que os animais deste experimento se aproximam do padrão internacional do cavalo de sela, cujas alturas de cernelha e garupa são as mesmas (Andrade, 1986; Giannoni, 1988; Ribeiro, 1988; Simões, 1983). Não foi observado efeito de raça (P > 0,05) na maioria das variáveis de andamento, por outro lado, houve efeito (P < 0,05) do tipo de andamento sobre as variáveis de andamento. Isso mostra que o padrão de locomoção está mais ligado ao tipo de andamento do que a raça do animal (Tabela 2). Isso pode ser explicado pela presença de dois tipos de marcha nas raças Mangalarga Marchador e Campolina (Carneiro et al., 1991; Costa et al., 2004; De Assis et al., 2009). Houve efeito do grupo racial (P < 0,04) apenas para o tempo de apoio monopedal e, por consequência nos tempos de apoio e avanço de alguns membros isoladamente (Tabela 2). Mesmo que não hajam diferenças significativas entre as marchas MB e MP em cavalos Mangalarga Marchador e Campolina, os animais Mangalarga apresentam apenas um tipo de andamento (Simões, 1983; Toledo, 2006), desta foram, este efeito já era esperado.

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Quase todos os tempos de avanço de cada membro foram influenciados pelo grupo racial (P < 0,05), desta forma é possível pensar em uma tendência de o grupo racial influenciar também o tempo de suspensão (P = 0,09). É possível que, a medida em que mais animais fossem coletados, essas diferenças raciais no tempo de suspensão fossem significativas.

Tabela 1. Análise descritiva das variáveis morfológicas e biodinâmicas analisadas neste estudo.

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Tabela 1. Análise estatística do efeito de Raça sobre as variáveis que descrevem o andamento marchado dos equinos.

Médias seguidas de uma mesma letra, em uma mesma linha, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P > 0,05).EP = Erro Padrão.CV = Coeficiente de Variação.

O tipo de andamento parece influenciar de maneira mais importante as variáveis de andamento (Tabela3) o que já era esperado uma vez que os tipos de andamento possuem diferenças, não somente na sequência de apoios, mas também no tempo de cada tipo de apoio. Não foi observado efeito (P > 0,05) do tipo de andamento sobre a dissociação, com exceção da dissociação lateral. Segundo de Andrade (2009) e Procópio (2004), diferentes tipos de marcha possuiriam, também, diferenças na dissociação, o que não foi observado neste experimento em função do número de animais e ao grande coeficiente de variação

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forçado quando se comparam amostras discrepantes (raças e marchas). Em adição, este efeito do tipo de andamento sobre a dissociação lateral indica que marchas mais laterais possuem, também, maior dissociação lateral (Andrade, 1986, 1984; Hussni et al., 1996; Toledo, 2006).

Tabela 2. Análise estatística do efeito de Marcha sobre as variáveis que descrevem o andamento marchado dos equinos

Médias seguidas de uma mesma letra, em uma mesma linha, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P > 0,05).EP = Erro Padrão.CV = Coeficiente de Variação.

Observou-se efeito do tipo de andamento (P < 0,05) no rendimento da passada, que foi maior para os animais de deslocamento diagonal (MT e MB). Tal fato mostra que, tão maior o tempo de apoio diagonal do animal, maior também será o rendimento por passada (Procópio, 2004). Efeito semelhante foi observado

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na amplitude da passada. A velocidade do andamento é proporcional ao seu rendimento (Toledo, 2006), já Procópio (2004) afirmou que a maior amplitude leva a uma maior velocidade. Como consequência direta dessas relações, a velocidade do andamento foi maior, nos andamentos de maiores rendimento e amplitude. Houve efeito do tipo de andamento (P < 0,01) sobre os tempos de apoios laterais, diagonais e tripedais. Os apoios laterais foram maiores na marcha picada, que também apresentou o maior tempo de apoios tripedais, por outro lado os apoios diagonais foram maiores nas marchas batida e trotada, não diferindo entre si. Esses resultados já eram esperados de certa forma, pois, a marcha picada tem predominância de deslocamentos laterais e a marcha batida, por sua vez, tem predominância de deslocamentos diagonais (de Andrade, 2009; Procópio, 2004; Toledo, 2006). Foi observado efeito de sexo na morfologia dos animais, o que já era esperado, pois, machos e fêmeas apresentam ligeiro dimorfismo sexual (Costa et al., 1998; Mcmanus et al., 2005; Zamborlin et al., 1996). Desta forma, as alturas de cernelha e garupa e, o comprimento da espadua foram maiores (P < 0,05) para machos. Houve efeito do grupo racial (P < 0,01) sobre as variáveis morfológicas (Tabela 3), o que pode ser explicado pela conformação mais pesada dos animais Campolina e pelo maior “frame size” dos animais Mangalarga. Não foi observado efeito (P > 0,09) do tipo de andamento sobre as variáveis morfológicas, desta forma não seria esperado encontrar diferenças em medidas lineares causadas por diferentes andamentos (Tabela 4).

Tabela 4. Análise estatística do efeito de Marcha sobre as características morfométricas.

Médias seguidas de uma mesma letra, em uma mesma linha, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P > 0,05).MT = Marcha Trotada; MB = Marcha Batida; MP = Marcha Picada.EP = Erro Padrão.CV = Coeficiente de Variação.

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A análise de cluster revelou similaridade entre as marchas batida e trotada, o que foi observado na análise de variância também. Tal fato sugere que andamentos de deslocamento diagonal são mais similares do que andamentos de deslocamento lateral (Figura 1), contudo esses resultados devem ser levados em conta com cautela uma vez que a proporção de variância explicada pelos dois primeiros componentes principais juntos foi de 65,91% da variância total dos dados.

Figura 1. Análise de cluster para o tipo de andamento de acordo com as variáveis biodinâmicas de cada andamento.

Avaliação Genética As estimativas de herdabilidade para as características analisadas variaram de 0,24 a 0,64 (Tabela 5), mostrando que, quando analisado de maneira mais objetiva o andamento apresenta herdabilidades suficientes para a seleção. Contudo os erros padrão das estimativas foram bastante elevados, fruto do reduzido número de animais utilizado nestas análises prospectivas.

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Tabela 5. Herdabilidades (diagonal em negrito), correlações genéticas (acima da diagonal) e correlações residuais (abaixo da diagonal) para as características estudadas.

Diss. = Dissociação; Dur. = Duração da Passada; Mono. = Tempo de apoios Monopedais; Bi. = Tempo de apoios bipedais; Lat. = Tempo de apoios bipedais laterais; Diag. = Tempo de apoios bipedais diagonais; Tri. = Tempo de apoios tripedais; Susp. = Tempo de suspensão.

As correlações genéticas entre as variáveis indicam que a Dissociação está desfavoravelmente relacionada com o tempo de apoios monopedais, uma vez que esse tipo de apoio não é tão desejável pelos criadores no Brasil (Andrade, 2009; Procópio, 2004; Toledo, 2006). A correlação genética entre o tempo de Suspensão com as demais características mostra que a seleção para maiores apoios triplos não interferirá no tempo de suspensão. Por outro lado, a seleção para maiores apoios laterais e diagonais reduziria o tempo de suspensão, o que é favorável uma vez que a suspensão torna o animal desconfortável à montada. O grau de associação genética entre o tempo de apoios bipedais diagonais e a dissociação, mostra que a dissociação pode ser reflexo genético de uma maior proporção de apoios diagonais, além de que a seleção para animais mais dissociados levaria, a longo prazo, a animais com uma maior proporção de apoios diagonais. Como o tempo de apoios diagonais e a duração da passada foram geneticamente correlacionados, esta seleção para maior dissociação, implicaria em animais com menor frequência de passos por unidade de tempo, uma vez que se aumentaria o tempo de duração da passada. A correlação genética entre o tempo de apoios laterais e a duração da passada mostra que a animais de marcha lateralizada, selecionados para maior proporção de apoios laterais, possuiriam uma passada mais rápida e, por consequência possuem uma maior frequência de passos. Por outro lado, a seleção para animais com maior proporção de apoios triplos, levaria a animais com maior

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proporção de apoios laterais, o que impactaria também a duração da passada. Os efeitos ginete (Tabela 6), dados como proporção da variância fenotípica, variaram de 2,86% a 41,32% para tempos de apoios bipedais e tempos de apoios triplos, respectivamente. A proporção de apoios triplos, apesar de ser herdável, seria muito influenciada pelo cavaleiro que monta o animal, de tal forma que animais mais treinados, bem como melhores cavaleiros, resultariam em um aumento desta proporção. Por outro lado, o cavaleiro tem pouco efeito sobre a proporção de apoios bipedais e bipedais diagonais, sendo estas variáveis mais influenciadas pela genética do animal. A influência da presença, ou não, de sela (Tabela 6) no animal pode ser analisada pela proporção da variância fenotípica que é explicada por este efeito; essas estimativas variaram de 0,01% a 34,04%, para duração da passada e tempo de suspensão, respectivamente. Isso mostra que se deve tomar atenção na fenotipagem para que todos os animais sejam fenotipados na mesma condição, pois, do contrário, a seleção fica prejudicada para características de andamento, uma vez que esses efeitos podem explicar boa parte da variância fenotípica das características.

Tabela 6. Proporção da variância fenotípica que é explicada pelos efeitos aleatórios de ginete e sela (diagonal) e correlações entre esses efeitos (acima da diagonal) para as características estudadas.

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Diss. = Dissociação; Dur. = Duração da Passada; Mono. = Tempo de apoios Monopedais; Bi. = Tempo de apoios bipedais; Lat. = Tempo de apoios bipedais laterais; Diag. = Tempo de apoios bipedais diagonais; Tri. = Tempo de apoios tripedais; Susp. = Tempo de suspensão.

CONCLUSÕES As diferenças entre as variáveis de andamento equino, obtidas por análise de videoimagens, parecem acontecer devido ao tipo de andamento, mas não se devem a diferenças raciais dos animais. Andamentos diagonais apresentam maiores semelhanças biodinâmicas entre si e a morfologia parece ser condicionada pela raça e pelo sexo dos animals, não tendo grande influência sobre variáveis de andamento. Ginete e presença de sela podem responder por importante porção da variação fenotípica das variáveis biodinâmicas, sendo necessário cuidado no momento da fenotipagem para esses fenótipos. Variáveis biodinâmicas de andamento apresentaram herdabilidades de moderadas a alta e, variâncias genéticas aditivas suficiente para serem incluidas em processos de seleção. Sugere-se estudos com maior número de animais avaliados para validação das variáveis biodinâmicas, em modelos animais multicaracterísticas.

AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Núcleo de Apoio a Pesquisa e Grupo de Melhoramento Genético Animal e Transgenia (NAP-GMABT) da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos por todo o suporte possibilitando as análises desenvolvidas. Agradecemos ainda a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo Nº: 2015/06803-3) bela bolsa de estudos que financiou esta pesquisa.

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CAPÍTULO XPLASMA NA DIETA DE MARRÃS

FREITAS, B.V¹; SARTORE, Y. G. A²; PELISSARI, P. H²; NACIMENTO, R. A²; LEITE,

B. G. S¹; ARAUJO, C. S. S²; ARAUJO, L. F¹;

¹Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo,Pirassununga – SP²Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga - SP

RESUMOA nutrição das reprodutoras suínas é um fator que influência diretamente o seu desempenho. Portanto tona-se necessária a utilização de ingredientes que otimizem os resultados produtivos. O Plasma Sanguíneo Desidratado (PSD) é um componente de alta qualidade proteica e funcional, que atua beneficamente promovendo melhor consumo e produtividade. Devido a essas propriedades benéficas, objetivou-se avaliar o efeito da utilização de PSD no desempenho e produtividade das marrãs e as implicações de seu uso sobre sua progênie. Foram utilizadas 56 fêmeas, de mesma idade de parição, distribuídas em blocos ao acaso, tomando como critério para a formação do bloco o peso dos animais, com 4 tratamentos (0, 0.5, 1.0 e 2.0% de inclusão de plasma desidratado), 14 repetições, onde a unidade experimental foi uma porca. Foi avaliado o desempenho e produtividade de porca, número de leitões, peso desmame, intervalo desmame/cio. A variável retorno ao estro foi significativa para o tratamento apresentando efeito quadrático (P=0.01). Quanto ao número de leitões desmamados, houve efeito cúbico de tratamento (P=0.03). Em relação aos demais parâmetros não houve efeito significativo. Em conclusão, com a adição de 0 e 2.0% de plasma nas dietas de primíparas durante as fases de flushing, lactação e gestação, podemos diminuir o período de entrada ao estro, assim como a adição de 0.5% e 2.0% de plasma, é possível aumentar o número de leitões desmamados por fêmeas.

INTRODUÇÃO A tecnificação da produção de suínos e hiperprolificidade das matrizes tem tornado necessária a busca por componentes nutricionais que supram as necessidades da fêmea e possibilitem um desempenho produtivo efetivo. O aumento

223

da prolificidade tem gerado uma grande heterogeniedade entre os leitões e reduzido o peso dos mesmos ao nascer, o que propicia um desenvolvimento deficitário até o momento do desmame (Silva, 2010). Melhorar o desempenho da matriz e da sua progênie tem sido um dos objetivos que se almeja na produção de suínos. O grande do número de leitões nascidos trouxe consigo um aumento na competição fetal, a qual limitou a quantidade de nutrientes disponíveis aos fetos que prejudica a uniformidade e o peso médio ao nascimento, o que acarreta um desempenho deficitário e uma leitegada desuniforme ao desmame (Zindove et al., 2013). O peso ao desmame é um fator determinante para um desenvolvimento efetivo dos leitões, principalmente devido a precocidade do desmame, considerando que até os 28 dias os leitões não possuem enzimas digestíveis especializadas para a digestão de vegetais o que prejudica a metabolização dos nutrientes fornecidos na alimentação sólida podendo ocasionar diarreia e perda de peso (Dritz, 2004). Leitões saudáveis e com pesos superiores a 5kg ao desmame têm um potencial de crescimento maior no período pós-desmame (whittemore, 1998), uma vez que possui maior capacidade de disputar o alimento o alimento e menor risco de desenvolver doenças entéricas (Cranwell et al., 1995; Madec et al., 1998). O PSD é um componente de alto valor proteico e funcional, que possui a capacidade de prolongar atividade das propriedades protetivas do leite, pós desmame, favorecendo o desenvolvimento dos leitões e favorecendo a saúde e o bem-estar dos animais. (Polo, 2014).A alta qualidade proteica do PSD faz com que ele tenha alto valor nutricional na dieta, devido a relação de aminoácidos e o nível elevado de proteínas globulares (incluindo as imunoglobulinas) responsáveis por atuar no desempenho estimulando o crescimento e consumo de ração pós desmame Cromwell, (2006). Tem efeito também sobre a redução da estimulação do Sistema immune e da inflamação, e devido a essas propriedades tem sido utilizado nas fases de gestação e lactação com objetivo de melhorar o peso e uniformidade da leitegada ao nascer e ao desmame e também favorecendo uma condição corporal adequada da matriz ao desmame e reduzindo o intervalo desmame- estro (Rangel, 2014). O PSD é considerado um produto eficiente na estimulação do consumo de matrizes em período de gestação e lactação devido a sua alta palatabilidade, colaborando com o bom desenvolvimento e desmame de leitões.

CONSIDERAÇÕES SOBRE OS SUÍNOS Já é sabido que a produtividade das fêmeas suínas aumentou muito nos últimos anos devido aos manejos, avanços genéticos baseados em parâmetros

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como: tamanho de leitegada, intervalo desmama-estro e eficiência na lactação. A seleção genética balanceada trouxe maior capacidade reprodutiva das fêmeas, vigor e sobrevivência dos leitões, favorecendo assim a produção de leitegadas com maiores números de leitões, sem aumentar a mortalidade. A estimativa é de que até 2020 tenha-se de 15 a 16 leitões nascidos vivos/leitegadas ou 33 desmamados/fêmea/ano. Entretanto não existam evidencias que este patamar esteja no seu máximo melhoramento (SILVA, 2010). Embora os avanços genéticos tenham tornado as fêmeas mais produtivas, tem-se gerado animais mais exigentes nutricionalmente e menos resistentes aos desafios nutricionais. As necessidades nutricionais das fêmeas modernas e a disponibilidade de nutrientes de suas dietas são pouco conhecidas em comparação ao conhecimento que se tem dos suínos em fase de crescimento e terminação (SILVA, 2010). O número de pesquisas publicadas durante os últimos 40 anos com fêmeas suínas, de acordo com o Commonwealth Agricultural Bureau, equivale a menos de 1% de todas as publicações referentes a suínos (BALL, 2008). A produtividade dos genótipos modernos aumentou de forma extremamente rápida nos últimos 20 anos, entretanto, os níveis nutricionais adotados para estes animais ainda são baseados em resultados de pesquisas feitas entre a década de 70 e o começo dos anos 90 (AGRICULTURAL RESEARCH COUNCIL-ARC, 1981 e NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1998). Além disso, grande parte das recomendações nutricionais adotadas para as fêmeas em reprodução são extrapolações não verificadas de pesquisas realizadas com suínos em terminação (BALL et al., 2008). O estado energético da fêmea gestante pode influenciar diretamente seu desempenho na lactação. O excesso de energia pode causar obesidade ao parto, o que resulta em um consumo voluntário reduzido, resultando em perdas corporais elevadas durante a lactação (SILVA et al., 2009b; KIM, et al., 2000a). Uma deficiência severa de energia poderá resultar em porcas magras ao parto, podendo acarretar em problemas durante o parto e lactação com redução na capacidade de produção de leite e no peso da leitegada ao desmame. Para controlar de forma mais eficiente o consumo de energia pela fêmea gestante, o uso da alimentação restrita e/ou controlada é realizada. Porém, essa restrição poderá tornar-se um fator limitante para ingestão de proteínas, causando deficiências, especialmente durante o terço final da gestação. Assim, considerando um fornecimento limitado de ração para restringir o consumo de energia, torna-se importante fornecer uma dieta que permita uma elevada eficiência de utilização da proteína. Para que o crescimento fetal e o desenvolvimento do tecido mamário ocorram de forma rápida durante a fase final da gestação, as necessidades de

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aminoácidos tendem a se tornar maiores nesta fase, particularmente em primíparas. Portanto, o crescimento muscular deve ser considerado nas fêmeas mais jovens como parte de suas necessidades reprodutivas. A análise de estudos recentes com fêmeas de genótipos modernos, tem apresentado uma atenção, em particular, ao crescimento fetal (MCPHERSON et al. (2004), desenvolvimento das glândulas mamárias (JI et al, 2006) e crescimento materno (JI et al, 2005). Os resultados obtidos por estes autores indicam um crescimento cúbico, tanto do tecido mamário quanto dos fetos, principalmente a partir dos 70 dias de gestação. Resultados, estes, superiores aos observados em estudos similares nas décadas de 80 e 90. De acordo com MCPHERSON et al. (2004) e KIM et al. (2009), um feto ganha 17,5g de proteína corporal do dia 0 ao 70 (0,25g de proteína/dia) e 203,7g de proteína do dia 70 ao 114 (4,63g de proteína/ dia). Se considerarmos uma fêmea com 16 fetos, são 4,0 e 74,1g/dia de ganho proteico para o início e final da gestação, respectivamente. Isto equivale a uma diferença de 70,1g/dia ou um aumento de 18,5 vezes na taxa de ganho proteico entre as fases inicial e final da gestação. Com base nos resultados das recentes pesquisas tem-se estimulado o estabelecimento de programas nutricionais baseados em mais de uma fase, e não mais uma única dieta durante todo o período de gestação (MCPHERSON et al. (2004). Embora CLOWES et al. (2003a) não tenham encontrado benefícios produtivos e reprodutivos para fêmeas alimentadas com três níveis de proteína durante a gestação, os autores recomendam tal prática pela redução da excreção total e emissão de amônia, o que pode contribuir para maior produtividade animal e atendimento da legislação ambiental. A nutrição durante a gestação deve maximizar a retenção proteica e garantir uma adequada deposição de gordura. A seleção genética para maior prolificidade alcançou bons resultados, aumentando o tamanho da leitegada. Assumindo que a capacidade do útero em manter o número de fetos inteiramente formados até o parto é limitada, é aceitável que se estabeleça uma correlação negativa entre o aumento do número de fetos e o seu crescimento individual. Sendo assim, vários autores observaram aumentos na desuniformidade do peso dos leitões dentro de uma mesma leitegada, bem como a redução do peso médio da leitegada, devido à seleção genética para tamanho de leitegada (LUND et al., 2002; TRIBOUT et al, 2003; FOXCROFT, 2007). O peso ao nascimento e sua variação dentro da leitegada representam um fator de interesse, uma vez que tem sido mostrado que estão positivamente correlacionados com a mortalidade pré- desmame (WOLF et al, 2008). Em leitegadas com grandes variações na uniformidade ao nascimento, os leitões menores são excluídos do acesso aos tetos funcionais e produtivos, devido à desvantagem em competir com os leitões maiores pelos melhores tetos. Estes leitões apresentam menor

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ingestão de colostro e de leite, o que leva à menor aquisição de imunidade passiva, acarretando em um estado nutricional baixo (QUINIOU et al, 2002). Diante disso, os leitões menores são comprometidos fisiologicamente em termos de reservas de energia, sendo mais susceptíveis à hipotermia (WOLF et al, 2008). Em adição, leitegadas com maior variação no peso ao nascimento também apresentam maiores variações de peso ao desmame. Este fato, como não é desejado, resulta em um manejo mais complicado. Leitões que nascem com pesos abaixo da média apresentam índices de crescimento mais lentos e idade mais avançada ao abate (GONDRET et al, 2005). O não atendimento das exigências nutricionais das fêmeas durante a gestação, associado às necessidades nutricionais elevadas para suportar mais fetos no útero, pode ser correlacionado ao fenômeno denominado restrição do crescimento intrauterino (IUGR) e, por consequência, afetar negativamente o desempenho da leitegada por meio do aumento na desuniformidade e redução do peso de nascimento dos leitões. Fêmeas em lactação exigem energia para sua mantença e produção de leite. Tais exigências dependem de seu peso, produção e composição de seu leite e das condições ambientais sob as quais estão alojadas. Embora a mensuração dessas exigências seja difícil, segundo AHERNE e FOXCROFT (2000), de 25% a 80% das exigências energéticas das fêmeas lactantes são destinadas à produção de leite, e os 25% restantes, à mantença. O consumo inadequado de energia durante a lactação faz com que a matriz mobilize nutrientes de diferentes tecidos corporais, levando a uma significativa perda de peso. Para que a fêmea suporte um número crescente de leitões durante a lactação, torna-se extremamente importante mantê-las em uma condição corporal adequada. Geralmente, o consumo de ração durante a lactação não é suficiente para sustentar uma produção de leite adequada e manter leitegadas grandes (NOBLET et al, 1997; EISSEN et al, 2000). Se uma maior demanda por energia não pode ser atendida via consumo extra, as matrizes são obrigadas a mobilizar suas reservas corporais. Níveis excessivos de mobilização podem tornar-se um problema para a longevidade da fêmea (CLOWES,et al., 2003a; 2003b). Como resultado da seleção para suínos mais magros e com maior eficiência alimentar, o consumo de ração tende a diminuir, pois a alta deposição muscular e a eficiência alimentar são negativamente correlacionadas com o apetite (EISSEN et al, 2000). Em sistemas de manejo convencionais, leitões recém-nascidos são capazes de atingir somente uma fração do seu real potencial de crescimento durante a fase de amamentação (HARRELL et al, 1993). Nos últimos anos, este fato tem levado pesquisadores a focarem na importância dos nutrientes; em particular os aminoácidos, para aperfeiçoar o potencial das glândulas mamárias

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durante a lactação (KIM e WU, 2008). O crescimento da glândula mamária durante a lactação afeta a quantidade de leite produzido pelas fêmeas e, por consequência, o crescimento dos leitões (KIM et al, 2000a). Desta forma, o manejo nutricional adotado durante a lactação deverá priorizar o máximo crescimento mamário. KIM et al. (1999b) demonstraram que o crescimento mamário é afetado pelo consumo de aminoácidos e de energia durante a lactação. Quando fêmeas não recebem quantidades adequadas de aminoácidos na dieta, proteínas do tecido materno, particularmente proteínas musculares esqueléticas, são mobilizadas para atender à produção de leite. A mobilização excessiva de proteína materna geralmente resulta em falhas na atividade reprodutiva subsequente (JONES e STAHLY, 1999). Portanto, estabelecer os requerimentos de aminoácidos ideais para fêmeas em lactação não só maximiza a produção de leite para os leitões, mas também auxilia na mantença da condição corporal para garantir uma boa longevidade (KIM et al., 1999b). Na fase pré-desmame, as vilosidades intestinais são largas, bem estruturadas e muito eficientes na absorção de nutrientes. No entanto, alguns dias após o desmame precoce aos 21 dias de idade, o tamanho delas pode reduzir com concomitante aumento da profundidade nas criptas de Lieberkühn (VAN DIJK et al., 2002 a e b). Isto se deve principalmente devido ao estresse psicológico e o desafio imunológico gerado com o desmame. Até os 28 dias de idade o sistema digestivo do leitão não produz quantidades suficientes de amilases, lipases e outras enzimas para degradarem os nutrientes contidos nas matérias primas de origem vegetal, visto que o desenvolvimento do sistema enzimático se completa até a oitava semana de idade dependendo do tipo de dieta usada (PLUSKE et al., 1997). Por isso, com desmames precoces, inferiores a 35 dias de idade, pode haver aumento de alimento não digerido no lúmen e este alimento pode servir de substrato para as bactérias patogênicas e facilitar a ocorrência de diarreia nesta fase (PLUSKE et al., 1997). Por este motivo as dietas para leitões desmamados precocemente devem conter ingredientes ou alimentos de alta digestibilidade e isentas de substâncias com características antinutricionais que possam agravar este processo, como glicinina e __- conglicinina presentes no farelo de soja (DONZELE et al., 2002).

PLASMA SANGUÍNEO DESIDRATADO (PSD) O sangue é considerado um subproduto de baixo valor nutricional pelas industrias frigorificas, uma vez que o seu processo de desidratação convencional através de rolos secadores ou tambores, o produto obtido era inconsistente quanto à qualidade. Sabendo disso, vários estudos proporcionaram o surgimento do processo de “spray-dried” (SDP do inglês spray-dried plasma, ou plasma sanguíneo desidratado) aliado a maiores cuidados na manipulação, melhorou substancialmente

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a qualidade do produto e, consequentemente, a utilização das proteínas sanguíneas na alimentação dos leitões (Kats et al., 1994). O processo de desidratação por “spray-drier” é composto por três etapas: inicialmente, o ingrediente é submetido a um pré-aquecimento por 25 minutos a 95°C; depois ocorre uma desidratação por um a dois minutos a 207°C e por último, vaporização da mistura por um a dois minutos novamente a 93°C, resultando em um pó fino e seco (Goodband et al., 1998). Trata-se de um ingrediente único em rações animais por sua alta qualidade proteica e funcional. Sua utilização é frequente na suinocultura, especialmente na ração de leitões desmamados, promovendo melhor consumo, crescimento e produtividade (POLO et al 2010). O PSD é amplamente utilizado em granjas com alta exposição a patógenos, seja para reduzir o efeito da síndrome multissistêmica do definhamento de suínos (PMWS), associado ao circuvírus suíno tipo -2 (PCV-2) de ampla distribuição mundial, seja em granjas que sofrem a síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRS em inglês), da qual o Brasil está oficialmente livre. O plasma foi à primeira proteína de origem animal aprovada para uso na alimentação de suínos na Europa, pelo fato de ter sido considerada fonte inerentemente segura. O uso de proteínas de origem animal na nutrição foi proibido para animais destinados ao consumo humano devido a Encefalopatia Espongiforme Bovina, popularmente conhecida como “Mal da Vaca Louca”. (Regulamento CE n. 1293/2005). O plasma desidratado caracteriza-se pela coloração marrom-clara, sendo um pó fino contendo em torno de 78% de proteínas, e as células desidratadas, apresentam-se com uma coloração vermelho-escura, também na forma de um pó fino contendo aproximadamente 92% de proteínas (CAMPBELL et al., 1998). A quantidade de globulinas no plasma varia entre 20% e 30% e dentro das globulinas, as imunoglobulinas do tipo G constituem a fração funcional mais importante. Os outros tipos de imunoglubulinas, IgM, IgA, IgD e IgE, existem em menores quantidades (Bosi et al., 2001). A proteína oriunda do plasma é deficiente em isoleucina e metionina, entretanto é rica em lisina, triptofano e treonina,. Segundo o NRC (1998), a metionina se torna o primeiro aminoácido limitante em dietas que tenham quantidades superiores de 6,0% de plasma. Dessa forma, respostas positivas no desempenho dos leitões foram obtidas com utilização de altas concentrações de plasma, quando a quantidade de metionina sintética suficiente foi adicionada às dietas (Owen et al., 1993; Kats et al., 1994). Principalmente pós desmame, os leitões são muito sensíveis à quantidade e qualidade da proteína, por isso, sofrem alguns problemas para obterem boas

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taxas de absorção desta, assim, é necessário que as proteínas utilizadas nas dietas sejam de alta taxa de digestibilidade e palatabilidade e que sejam isentas de fatores antinutricionais como antiproteases, aminas biogênicas e fatores alergênicos (Barbosa et al., 2007). O plasma sanguíneo poderia atuar como fator anti-estressante, alterando os níveis de ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) dos leitões e possibilitando melhores respostas aos desafios, em decorrência do estresse do desmame (Gatnau e zimmerman¸1994). Estudos comprovaram que o fornecimento de plasma sanguíneo a leitões desmamados aos 21 dias possibilita o aumento da secreção de enzimas digestivas, melhoria da integridade do epitélio intestinal e aumento da digestão, absorção e utilização dos nutrientes (Campbell, 2010).

TECNOLOGIA DE OBTENÇÃO O método utilizado para produzir o PSD pelo processo de spray-drier. O procedimento se inicia com a sangria do animal e a adição de anticoagulante ao sangue. Geralmente é usado o citrato de sódio. Após a coleta, o sangue é centrifugado para separar os eritrócitos e resfriado a 4°C até posterior processamento. RUSSEL e WEAVER (1996). A fração plasmática é, então, submetida a um processo de ultrafiltragem ou osmose reversa para remover água, concentrar e remover minerais (no caso da ultrafiltragem). Finalmente o plasma é desidratado pelo processo de spray-drier. Esse processo consiste em micronizar o plasma em gotas de 10 a 100 μ m, através da passagem rápida por uma torre em alta pressão (200 atm) e temperatura (FIKOVÁ, 1987). GATNAU et al. (1989) demonstraram que o processo de fabricação do PSD preserva a atividade das imunoglobulinas. Utiliza-se somente sangue fresco, proveniente de abatedouros oficialmente controlados e inspecionados, com equipamentos de coleta e processamento esterilizados, visando evitar qualquer tipo de contaminação. Análises rotineiras devem ser efetuadas para detectar qualquer presença de micro-organismos, ou qualquer agente contaminante comprometedor da qualidade do produto (CERQUEIRA, 2011). A atividade biológica do plasma é facilmente danificada quando esse é exposto a altas temperaturas. Cuidados devem ser tomados quando as rações são processadas, não podendo exceder a temperatura máxima de 70º C. A extrusão não é recomendada para produtos com plasma. O produto final pode ser processado e misturado, como qualquer outro ingrediente da ração (CAMPBELL; WEAVER; RUSSELL, 2003).

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PLASMA SANGUINEO DESIDRATADO NA NUTRIÇÃO DE MARRÃS Foram utilizadas 56 fêmeas primíparas, híbridas da linhagem Topigs T20, (215 ± 9.46 dias e 130 ± 8.0 kg) distribuídas em blocos ao acaso, de acordo com o peso corporal, com quatro tratamentos (0, 0.5, 1.0 e 2.0% de plasma sanguíneo) e 14 repetições, onde considerava-se uma fêmea por unidade experimental. As fêmeas foram selecionadas de acordo com os padrões ideias de peso e idade para início da vida reprodutiva. Antes de começar a receber a dieta de flushing, as marrãs eram pesadas. Estando aptas quanto ao peso (±130kg) e idade (±215 dias), seguiam para o galpão de marrãs, para o início do experimento. As fêmeas foram identificadas e distribuídas em gaiolas unitárias. As dietas foram formuladas de acordo com as recomendações de Rostagno et al (2011), apresentada na tabela 1, tendo como base milho e farelo de soja. A adição do plasma se deu de forma “on op” A sobra dos tratos (ao longo do dia) eram pesadas e descartadas.

Tabela 1: Composição Alimentar das dietas fornecidas na fase de flushing, gestação e lactação (kg/Ton).

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¹Flushing e Lactação: Sódio 0.2200%; Cobre 100.0000 ppm; Ferro 140.0000 ppm; Iodo 1.7500 ppm; Manganês 78.0000 ppm; Selênio 0.8000 ppm; Zinco 190.0000 ppm; Vitamina A 11000.0000 UI/G; Vitamina D3 2000.0000 UI/G; Vitamina E 65.0000mg; Vitamina K3 4.0000 mg; Ácido Fólico 4.0000 mg; B-1 (Tiamina) 6.0000 mg; B-2 (Riboflavina) 7.0000 mg; Acido Pantotênico 35.0000 mg; B-6 (Piridoxina) 7.5000 mg; B-12 (Cianocobalamina) 35.0000 mcg; Niacina 50.0000 mg; Biotina 800.0000 mcg; Colina 1800.0000 mg. 2Gestação: Sódio 0.2200%; Cobre 100.0000 ppm; Ferro 140.0000 ppm; Iodo 1.7500 ppm; Manganês 78.0000 ppm; Selênio 0.6500 ppm; Zinco 170.0000 ppm; Vitamina A 15400.0000 UI/G; Vitamina D3 2800.0000 UI/G; Vitamina E 75.0000mg; Vitamina K3 5.7000 mg; Ácido Fólico 5.0000 mg; B-1 (Tiamina) 8.0000 mg; B-2 (Riboflavina) 9.0000 mg; Acido Pantotênico 45.0000 mg; B-6 (Piridoxina) 9.0000 mg; B-12 (Cianocobalamina) 50.0000 mcg; Niacina 75.0000 mg; Biotina 800.0000 mcg; Colina 1600.0000 mg.

As gaiolas utilizadas para flushing e gestação possuíam dimensões de 2,00m x 0,55m, tamanho específico para marrãs. O galpão apresentava medida de 60m x 10m com sistema de climatização artificial com placas evaporativas. O flushing era fornecido por um período de 14 dias ou até que a marrã entrasse em estro. Todos os dias, o plasma era pesado em diferentes quantidades, obedecendo à quantidade de ração diária ingerida em cada período de vida das fêmeas (flushing, gestação e lactação) a ser testado, juntamente com o nível de plasma correto (Tabela 2).

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Tabela 2: Quantidade de plasma regulada de acordo com a ingestão diária de ração.

Todos os dias, as 6h00, as fêmeas recebiam a primeira fração de ração com o plasma, na quantidade de 1 kg. As 9h00, era fornecida a segunda fração com aproximadamente 0,5 kg, a terceira fração às 12h30 e a quarta fração as 16h00, ambas com 1kg cada, somando 3,5kg de ração diários/animal. Esse alto número de arraçoamento diário foi feito no intuito de estimular uma ovulação mais potente. Após a identificação do estro, feita pela presença matutina diária de um macho reprodutor, as fêmeas eram levadas para a balança para pesagem e inseminadas uma vez ao dia, durante 3 dias seguidos; e direcionadas para o recebimento da dieta de gestação, a qual era fornecida apenas uma vez ao dia. Quando a data programada de parição estava próxima (114 dias), as fêmeas eram encaminhadas para a sala de maternidade, onde eram monitoradas. O sistema de ventilação era individual por baia, com tubulação própria para cada animal, que jogava ventilação na região do flanco quando a temperatura ideal de conforto estava alta, de acordo com o sistema eletrônico de controle. Após o nascimento, todos os leitões foram pesados individualmente, brincados com cores diferentes de acordo com o nível de plasma em que a mãe era suplementada e colocados para mamar o colostro. A pós o desmame, todas as fêmeas foram pesadas individualmente e tiveram medidas como desempenho, produtividade, número de leitões, peso ao desmame, intervalo desmame/estro e peso da placenta; coletadas individualmente

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RESULTADOS E DISCUSSÃO a. Influência da utilização do plasma nas variáveis de produção. Para a variável peso corporal ao desmame (PCD) houve diferença significativa entre os tratamentos (P = 0,03) e efeito linear (P = 0,005) como podemos observar (Tabela 3), indicando que os animais suplementados com o maior nível de plasma desidratado (2,0%). Geralmente, o consumo de ração durante a lactação não é suficiente para sustentar uma produção de leite adequada e manter leitegadas grandes (NOBLET et al, 1997; EISSEN et al, 2000). Se uma maior demanda por energia não pode ser atendida via consumo extra, as matrizes são obrigadas a mobilizar suas reservas corporais perdendo assim maior peso corporal durante a lactação, Níveis excessivos de mobilização podem tornar-se um problema para a longevidade da fêmea e também para os partos subsequentes (CLOWES,et al., 2003a). Para a variável média do consumo de ração (MCR) das fases avaliadas, os tratamentos não se diferiram entre si, ou seja, a inclusão do plasma não diferenciou a média da quantidade de dieta consumida pelas fêmeas, mantendo o consumo entre elas(tabela 3). Para as variáveis ganho de peso total (GPT), consumo de ração total (CRT) e conversão alimentar total (CAT) não houve diferença entre os tratamentos, o nível de inclusão de plasma não alterou esses resultados, mantendo o desempenho dos animais iguais.

Tabela 3: Inclusão de plasma sanguíneo na dieta sobre as variáveis de produção

a,b Letras diferentes sobrescritas dentro da mesma linha diferem entre si em P ≤ 0.05. 1 Erro padrão da média agrupado.2 Resultados representam efeitos das fases

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entre tratamentos. Peso Corporal ao Desmame (PCD), Média do Consumo de Ração (MCR), Ganho de Peso Total (GPT), Consumo de Ração Total (CRT), Conversão Alimentar Total (CAT), Ganho de Peso Flushing (GPF), Conversão Alimentar (CAF) e Dias em Flushing (DF).

O mesmo foi observado para os resultados apresentados somente para a fase de flushing, a qual a inclusão do plasma não apresentou efeito sobre o ganho de peso (GPF) e conversão alimentar (CAF). Porém, houve efeito linear (P=0.05) para a variável dias em flushing (DF), que demostrou menor tempo de consumo do flushing para os animais que receberam o maior nível de plasma na dieta (2.0%). Segundo COSGROVE & FOXCROFT, (1996) o DF pode estar relacionado a diversos fatores, linhagem das marrãs, estro considerado, além do regime alimentar. b. Desempenho reprodutivo de marrãs suplementadas com plasmaRANGEL (2014) relatou que o PSD é cada vez mais empregado na dieta de porcas devido à redução do intervalo desmame-estro, principalmente em primíparas.

Tabela 4: Inclusão de plasma sanguíneo na dieta sobre variáveis de reprodução.

a,b Letras diferentes sobrescritas dentro da mesma linha diferem entre si em P ≤ 0.05.1 Erro padrão da média agrupado Retorno ao Estro (RE, d), Número de Leitões Nascidos Totais (NLNT), Número de Leitões Nascidos Vivos (NLNV), Número de Natimortos (NNT), Números de Mumificados (NM), Peso Total de Leitões ao Nascimento (PTLN), Peso Total da Leitegada Nascida Viva (PTLNV), Média de Peso dos Leitões Nascidos Vivos (MPLNV), Peso da Placenta (PP), Número de Leitões Desmamados (NLD), Média de Peso dos Leitões ao Desmame (MPLD).

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Para a variável de retorno ao estro, ou seja, o total de dias que as fêmeas levaram para repetir o cio após o desmame, repercutiu significativo para o tratamento (P=0.01) apresentando um efeito quadrático (P=0.001) para essa variável. Os tratamentos com níveis de inclusão de 0% e de 2.0% não apresentaram diferença estatística entre si, demonstrando um menor período de tempo para o retorno ao estro, o que é de grande valia para a produção, que considera melhor quando esse número é menor. Os níveis de 0.5% e 1.0% não apresentaram diferença entre si, somente entre os demais níveis. BORTOLOZZO E WENTZ (2004), dissertam que 80 % das fêmeas entram em cio até o sexto dia pós-desmame. Tais estudos corroboram com os resultados encontrados nesse trabalho a qual a média de retorno ao cio ficou entre quatro e cinco dias, não apresentando diferenças significativas entre os tratamentos com inclusão (2.0%) e sem a inclusão de plasma, porém houve diferença estatística nos níveis de inclusão de 5.0% e 1.0%. Resultados diferentes foram encontrados por WILSON e DEWEY (1993), onde explicam que o intervalo desmame-estro pode ser influenciado pela ordem de parto, sendo que, de modo geral, este é mais longo em fêmeas primíparas do que em multíparas. Nas primíparas, a probabilidade de evidenciar cio de sete a dez dias pós-desmame é três vezes maior, e a probabilidade de repetir um intervalo desmame-estro semelhante no parto seguinte é duas vezes maior do que nas multíparas, considerando, como ideal, seis dias de intervalo. Os resultados podem ser explicados por RANGEL (2014), o qual relatou que o PSD é cada vez mais empregado na dieta de porcas devido à redução do intervalo desmame-estro, principalmente em primíparas, como foi mostrado nos resultados independentes dos níveis de plasma utilizados em comparação com a média dos estudos. O número de leitões nascidos totais, nascidos vivos e mumificados foram semelhantes aos observados por Lima et al. (2012), a qual os números não apresentaram efeito significativo entre os tratamentos,( P=0.31), assim como número de leitões nascidos vivos (P=0.41), número de leitões nascidos mortos (P=0.63), múmias fetais (P=0.82), peso total da leitegada ao nascimento (P=0.86), peso total da leitegada nascida viva (P=0.99), média de peso dos leitões nascidos vivos (P=0.35) e peso da placenta (P=0.89). Outros estudos com porcas em lactação alimentadas com dietas contendo 0.5% de plasma atomizado demonstraram uma melhora no peso da leitegada e um aumento no peso médio do leitão na desmama CRENSHAW et al., (2007). Resultados diferentes foram observados por LIMA et al (2012), onde não observaram diferença estatística para leitões desmamados com a adição de 0.5% de plasma na dieta de porcas em gestação e lactação; se igualando aos resultados desse trabalho, onde

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não houve diferenciação de peso da leitegada. Porém, foi observado o aumento do peso médio no desmame entre os tratamentos, embora não tenha apresentado diferença estatística. CAMPBELL et al (2006) avaliaram os registros produtivos de uma granja com PRRS instável (5.500 porcas) utilizando um sistema de controle estatístico de processo que permitiu identificar as mudanças em aspectos produtivos devido a inclusão de PSD em dietas de gestação e lactação. Tais resultados indicam que a inclusão de PSD melhora o número de leitões desmamados pois reduz a severidade dos danos produtivos associados ao PRRS em granjas de suínos, consequentemente desmamando maior quantidade de leitões. Resultados semelhantes foram obtidos nesse trabalho com a suplementação de 0.5% de plasma gerou um maior número de leitões desmamados (NLD) (P=0.03) com efeito cúbico (P=0.003) por fêmea, não apresentando diferença com a suplementação de 2.0% de PSD.

CONCLUSÃO Como conclusão, observamos que a inclusão de 0 e 2.0% de plasma sanguíneo das dietas de primíparas durante a fase de gestação, flushing e lactação, pode diminuir o período de entrada ao estro. Já com a adição de 0.5% e 2.0% de plasma é possível aumentar o número de leitões desmamados por fêmea. Tornando-se assim uma excelente alternativa para melhorar índices zootécnicos.

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CAPÍTULO XIDIVERSIDADE GENOTÍPICA DE PATÓGENOS CAUSADORES DA

MASTITE BOVINA

Bruna Gomes Alves, Gustavo Freu, Juliano Leonel Gonçalves, Tiago Tomazi,

Carlos Eduardo Fidelis, Marcos Veiga dos Santos

Laboratório Qualileite, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, Pirassununga/SP

RESUMOStaphyloccoccus aureus e Streptococcus uberis estão entre as principais causas de mastite clínica (MC) e subclínica (MSC) no Brasil, mas a dinâmica das infecções causadas por estes patógenos não é totalmente conhecida. Sendo assim, este capítulo aborda a caracterização genotípica de S. aureus isolados de mastite de rebanhos brasileiros e de outros países e a diversidade genotípica e fatores de virulência de S. uberis isolados de infecções intramamárias no Brasil. No experimento 1, 120 isolados de S. aureus provenientes de oito países foram genotipados por RS-PCR e investigados em relação a 26 fatores de virulência. Foi observada alta variabilidade genotípica de S. aureus, com padrão genotípico específico de acordo com cada país e, dentre os fatores de virulência estudados, os genes fmtB, cna, clfA e leucocidinas foram os mais frequentes. Apenas dois isolados foram MRSA (Alemanha e Itália), indicando a baixa frequência de S. aureus resistente à meticilina isolados de mastite bovina. No experimento 2, 44 isolados de S. uberis foram caracterizadas quanto à diversidade genotípica por hibridização de DNA pela metodologia dot blot. Foram identificados os principais fatores de virulência descritos na literatura, bem como nove padrões de dot blot, indicando alta heterogeneidade dos isolados de S. uberis. Sendo assim, há ampla diversidade genética de S. aureus e S. uberis entre rebanhos e regiões, o que sugere a necessidade de diferentes estratégias de controle destes agentes causadores de mastite.

INTRODUÇÃO A mastite bovina é uma inflamação da glândula mamária (GM) causada principalmente por infecções intramamárias (IIM) bacterianas (BRADLEY, 2002). Apesar de grandes avanços no controle e prevenção da mastite, esta ainda é a doença mais comum nos rebanhos leiteiros (STEVENS; PIEPERS; DE VLIEGHER, 2016). A mastite pode ser classificada de acordo com a forma de apresentação em

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clínica (MC) e subclínica (MSC). Na MC ocorrem alterações visíveis no aspecto do leite e/ou do úbere, tais como a presença de: grumos, sangue ou pus, vermelhidão e inchaço; e em algumas situações pode haver alterações clínicas sistêmicas. Na MSC não há alteração visível do leite ou úbere da vaca, mas há alteração da permeabilidade vascular e da composição do leite. Em resposta à infecção, as células do sistema imune migram para o interior da GM, o que resulta em aumento da contagem de células somáticas (CCS) (VIGUIER et al., 2009). S. aureus e S. uberis são os patógenos causadores de mastite mais frequentemente isolados de rebanhos leiteiros, o que resulta em grandes prejuízos econômicos à atividade leiteira devido à redução na produção e qualidade do leite (aumento da CCS e CBT), custos com tratamento e aumento do risco de descarte de vacas com infecções crônicas. Além disso, S. aureus e S. uberis apresentam inúmeros fatores de virulência associados à aderência e à internalização na GM, danos ao tecido mamário e evasão do sistema imune. Com a disponibilidade de técnicas de diagnóstico mais precisas (ferramentas moleculares) foi possível ampliar o conhecimento sobre os reservatórios, similaridade genética e vias de transmissão dos patógenos causadores de mastite, o que permite caracterizar as cepas transientes ou persistentes, advindas do ambiente ou com perfil de transmissão vaca-vaca durante a ordenha, respectivamente (LEVIN; LIPSITCH; BONHOEFFER, 1999). Estudos epidemiológicos associados às ferramentas moleculares podem ser usadas para identificar cepas mais resistentes aos antimicrobianos e a expressão de genes codificantes de fatores de virulência. Tais genes seriam responsáveis por aumentar a patogenicidade das cepas e assim dificultar o controle destes agentes. A dinâmica de IIM causadas por S. uberis foi avaliada por PFGE (Eletroforese em Gel de Campo Pulsado), o que permitiu a identificação de 62 estirpes diferentes de um total de 138 isolados avaliados, sugerindo transmissão a partir do ambiente (PHUEKTES et al., 2001). No entanto, a observação de IIM persistentes ocasionadas por cepas oriundas de quartos mamários da vaca e/ou de vacas dentro de rebanho, indicaram comportamento contagioso de transmissão de algumas cepas. Diante disso, no caso de S. uberis, pode-se perceber que as medidas de controle da mastite convencionais, como higiene de ordenha e práticas de manejo (desinfecção dos tetos, antibioticoterapia, descarte de vacas com mastite crônica) não são eficientes para a sua eliminação do rebanho. Embora estudos anteriores caracterizaram a variabilidade genotípica de S. aureus e S. uberis com métodos de genotipagem (KHORAMROOZ et al., 2016; REINOSO; LASAGNO; ODIERNO, 2015), a epidemiologia destes agentes não foi bem definida. Diante do exposto, os objetivos do presente capítulo foram: (1) determinar

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a variabilidade genotípica de S. aureus e S. uberis isolados de MC e MSC em diferentes regiões do Brasil e de outros países, e (2) determinar fatores de virulência associados com os isolados de S. aureus e S. uberis causadores de mastite.

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA MASTITE A mastite é a doença que mais acomete vacas leiteiras no mundo (RUEGG, 2017). Essa enfermidade é caracterizada por um processo inflamatório na glândula mamária que geralmente é causado por bactérias. Após adentrar a glândula mamária via canal do teto, as bactérias utilizam os substratos disponíveis no leite, se multiplicam (HOGAN e SMITH, 2003), e podem liberar toxinas que estimulam respostas inflamatórias (PHILPOT e NICKERSON, 2000). A intensidade da resposta inflamatória da glândula mamária durante a infecção pode resultar em sintomatologias restritas ao úbere ou comprometer sistemicamente a saúde das vacas. Com base nisso, é possível classificar didaticamente a mastite de acordo com a forma de apresentação: em clínica (MC) e subclínica (MSC), e de acordo com o tipo de agente causador e perfil de transmissão em contagiosa e ambiental. Na MC ocorrem alterações visíveis no aspecto do leite e/ou do úbere, tais como: grumos, sangue ou pus, vermelhidão e inchaço; e em alguns casos pode haver alterações clínicas e comportamentais (e.g., febre, letargia e desidratação) em razão do processo inflamatório (FOGSGAARD; BENNEDSGAARD; HERSKIN, 2015). As alterações visíveis facilitam o diagnóstico da MC, especialmente durante a retirada dos primeiros jatos de leite no momento da ordenha. Por outro lado, na grande maioria das vezes, as infecções intramamárias (IIM) não causam nenhuma alteração visível no leite, o que caracteriza a mastite subclínica (BRADLEY, 2002). Na MSC há alteração da permeabilidade vascular e da composição do leite, sendo que em razão da resposta inflamatória, as células do sistema imune migram para o interior da glândula mamária, levando ao aumento da contagem de células somáticas (CCS) do quarto mamário afetado (VIGUIER et al., 2009). Valores acima de 200.000 células/mL indicam a ocorrência de MSC, em amostras compostas dos quartos mamários (ROYSTER e WAGNER, 2015). De acordo com o perfil de transmissão, os microrganismos causadores de mastite podem ser classificados em ambientais ou contagiosos. O reservatório principal dos patógenos contagiosos é a glândula mamária (GM), uma vez que estes estão adaptados a se multiplicar no úbere (CERVINKOVA et al., 2013). Os patógenos contagiosos apresentam potencial de disseminação entre vacas ou entre quartos mamários e o principal momento de transmissão ocorre durante a ordenha, por meio das teteiras, mãos dos ordenhadores e toalhas para limpeza e secagem dos tetos (KEEFE, 1997). Flutuações de vácuo do equipamento de ordenha também

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podem contribuir para a entrada dos patógenos contagiosos na glândula mamária, especialmente nos rebanhos que o equipamento se encontra em inadequado estado de funcionamento. A mastite contagiosa manifesta-se principalmente de forma subclínica e geralmente é acompanhada de altos valores de CCS por períodos de longa duração de inflamação (BRADLEY, 2002). Os principais patógenos causadores de mastite contagiosa são: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium bovis e Mycoplasma spp. Os patógenos ambientais encontram-se principalmente no ambiente em que a vaca vive, destacando-se os coliformes (e.g., Escherichia coli e Klebsiella spp.) e os estreptococos ambientais (Streptococcus uberis e Streptococcus dysgalactiae; OLIVER e MURINDA, 2012). Estes microrganismos são descritos como oportunistas da GM, capazes de migrar do ambiente contaminado via canal do teto e causar imediata resposta inflamatória. A mastite ambiental pode ocorrer tanto na forma MC quanto MSC, de acordo com as características da vaca, do agente causador ou do ambiente (OLIVEIRA et al., 2015). Entretanto, as técnicas de diagnóstico mais precisas (ferramentas moleculares) permitiram avaliar as características epidemiológicas dos microrganismos causadores de mastite. Com isso, a distinção clássica entre agentes contagiosos e ambientais parece ter cada vez menos sustentação (ZADOKS et al., 2011). As ferramentas moleculares, quando empregadas no diagnóstico da mastite bovina, permitem determinar a origem dos microrganismos, a similaridade genética e as vias de transmissão, além dos fatores de virulência e de resistência bacteriana aos antimicrobianos (LEVIN; LIPSITCH; BONHOEFFER, 1999). Estudos prévios baseados em técnicas moleculares para diagnóstico da mastite bovina sugerem que algumas bactérias causadoras de mastite apresentam potencial de transmissão tanto contagioso quanto ambiental (Figura 1; ZADOKS; SCHUKKEN, 2006; COBO-ÁNGEL et al., 2018).

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Figura 1. Escala comparativa dos patógenos causadores de mastite de acordo com o perfil de transmissão (contagioso e/ou ambiental). A diagonal indica o quanto cada espécie se comporta como patógeno contagioso ou ambiental. S. agalac. = Streptococcus agalactiae; S. aur. = Staphylococcus aureus; S. dysgalc. = Streptococcus dysgalactiae; S. uberis = Streptococcus uberis; E. coli = Escherichia coli. Adaptado de (ZADOKS; SCHUKKEN, 2006).

Outra classificação dos patógenos causadores de mastite pode ser realizada de acordo a intensidade a resposta inflamatória e dos danos causados ao tecido mamário. Patógenos maiores como S. aureus, S. uberis, S. dysgalactiae e coliformes causam MC com maior frequência, acompanhados de grande intensidade de inflamação da GM e aumento da CCS. Estes patógenos permanecem na GM por longos períodos de tempo e terapias estendidas de antibiótico podem ser necessárias para o controle da doença. Por outro lado, patógenos menores como Corynebacterium spp. e Estafilococos não-aureus (ENA) geralmente causam inflamações mais brandas, com menor CCS (REYHER et al., 2012). Diante do crescente aumento da incidência de mastite causada por patógenos maiores e dos danos causados à saúde das vacas, estudos epidemiológicos avaliaram a prevalência de cepas mais resistentes aos antimicrobianos, como também a expressão de genes codificantes de fatores de virulência. Tais genes estão associados ao aumento de patogenicidade das cepas, o que dificulta o controle destes agentes. A correta identificação dos patógenos causadores de mastite é

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de fundamental importância para o apropriado tratamento antimicrobiano, como também para as medidas de prevenção. Neste contexto, as técnicas moleculares são ferramentas úteis para o entendimento dos perfis de transmissão dos patógenos causadores de mastite. A frequência de isolamento de patógenos causadores de mastite varia entre países e rebanhos, (GAO et al., 2017). Na Nova Zelândia, Zadoks et al. (2003) avaliaram a dinâmica de IIM de Streptococcus uberis isolado de MSC por meio da técnica de DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). Foi observada grande diversidade genotípica entre as cepas isoladas, o que é consistente com a hipótese de que o ambiente abriga ampla variedade de cepas e atua como reservatório da infecção. Por outro lado, quando vários quartos da mesma vaca foram infectados, as infecções foram causadas principalmente por um tipo de cluster-RAPD predominante, sugerindo que Streptococcus uberis também pode apresentar comportamento contagioso com transmissão entre quartos e vacas. Adicionalmente, um estudo australiano avaliou a dinâmica de infecção de Streptococcus uberis usando Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE; PHUEKTES et al., 2001). De 138 isolados de Streptococcus uberis provenientes de quatro rebanhos, foram encontradas 62 estirpes diferentes, o que sugere reservatórios ambientais. No entanto, a observação de IIM persistentes ocasionada por cepas predominantes oriundas de quartos diferentes da mesma vaca e/ou de vacas dentro de rebanho, indicaram comportamento contagioso de transmissão de algumas cepas (PHUEKTES et al., 2001). Devido à importância de S. dysgalactiae como causa de mastite bovina, um estudo epidemiológico sueco explorou a variação genotípica de S. dysgalactiae (n = 164) pelo método de PFGE. Pulsotipos idênticos foram encontrados em múltiplos rebanhos, indicando comportamento contagioso de transmissão entre vacas infectadas, apesar de S. dysgalactiae ser oriundo predominantemente do ambiente (LUNDBERG et al., 2014, LUNDBERG et al., 2016). Por muitos anos, S. agalactiae foi considerado um patógeno exclusivo da GM. No entanto, estudo recente desenvolvido na Colômbia reportou isolamento de Streptococcus agalactiae de origem ambiental (COBO-ÁNGEL et al., 2018). Por meio dos resultados alcançados via técnica por Multi Locus Sequence Typing (MLST), foi possível inferir isolamento de S. agalactiae de amostras de leite (de tanque e em nível de vaca), fezes e do ambiente, sugerindo o isolamento de cepas causadoras de MSC de fontes extra mamárias. Diante disso, estes resultados indicam que adequadas medidas de controle das IIM causadas por S. agalactiae dependem do tipo de cepa predominante. De forma similar, Klebsiella pneumoniae e S. aureus também foram descritos pela capacidade de transmissão contagiosa e ambiental. Zadoks e Schukken

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(2006) relataram que dependendo das condições de manejo e da cepa envolvida na infecção, S. aureus pode originar-se de fontes ambientais ou ser transmitido de forma contagiosa. Para K. pneumoniae, investigações epidemiológicas foram realizadas devido a dois surtos de mastite clínica (MUNOZ et al., 2007). No primeiro surto, K. pneumoniae oriundo de amostras de leite e fezes, e isolados do ambiente foram comparados por meio de RAPD e perfis idênticos foram encontrados em amostras de diferentes vacas, sugerindo possível transmissão contagiosa ou fonte de contaminação ambiental em comum (MUNOZ et al., 2007). Entretanto, no segundo surto, o mesmo rebanho apresentou cepas distintas de K. pneumoniae, o que sugeriu infecção oportunista de origem ambiental. Dentre os patógenos maiores, S. aureus e S. uberis se destacam pela alta frequência de isolamento nos rebanhos leiteiros, o que causa efeitos negativos sobre a produção e a qualidade do leite (aumento da CCS e CBT do tanque). Além disso, ambos apresentam inúmeros fatores de virulência associados a aderência e internalização na GM, danos ao tecido mamário e evasão do sistema imune.

DIAGNÓSTICO POR BIOLOGIA MOLECULAR As técnicas de biologia molecular aplicadas no diagnóstico da mastite, além de proporcionar elevada acurácia de identificação, possibilitam determinar a ocorrência de genes de virulência (GURJAR et al., 2012). A maioria das técnicas de genotipagem são baseadas na amplificação e separação eletroforética de fragmentos de DNA, que podem ser utilizados para rastrear genes de transmissão microbiana ou outros genes de virulência (ZADOKS; SCHUKKEN, 2006). Brevemente, o DNA amplificado do gene alvo é submetido a restrição por enzimas específicas, o que possibilita a quebra da fita em fragmentos. Esses fragmentos de DNA são observados pelo perfil de bandas em gel após corrida eletroforética, já que o DNA possui carga negativa e acaba sendo impulsionado por campo elétrico. Os perfis de bandas distintas sugerem alta diversidade de cepas dentro do rebanho. A restrição pode ser combinada com métodos convencionais, que oferecem algumas vantagens como rapidez de execução e especificidade em curto período de tempo (BRITTEN, 2012). Por outro lado, alguns fatores como os custos por análise e o tempo necessário para a conclusão do diagnóstico variam com a técnica de biologia molecular adotada, o que vai depender também de recursos laboratoriais e de mão-de-obra qualificada (GURJAR et al., 2012). A PFGE tem como diferencial, frente outras técnicas de restrição, separar fragmentos maiores em corrida eletroforética de maior tempo de execução (MAGALHÃES et al., 2005). Na PFGE, o genoma bacteriano permanece mais estável do que os marcadores de proteínas, e esta técnica possui bom poder discriminatório

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entre as cepas analisadas e facilidade de interpretação, permitindo a detecção de DNA com alto grau de polimorfismo (BANNERMAN et al., 1995). Sendo assim, a comparação de estirpes entre laboratórios é facilitada, e torna-se possível melhor investigação genômica de determinados patógenos (PHUEKTES et al., 2001) e rápida detecção de mudanças genéticas, que permitem visualizar as alterações epidemiológicas a curto tempo (ABUREEMA et al., 2014). Entretanto, pela necessidade de campos elétricos específicos para separação de grandes fragmentos, a técnica pode ser limitante em sua disponibilidade e execução pelos laboratórios de diagnóstico (ZADOKS; SCHUKKEN, 2006). Além disso os resultados de PFGE dependem da composição e da concentração correta de agarose, da solução tampão na qual o gel é imergido, da voltagem da corrente elétrica, do tempo de pulso e do tempo de corrida. A uniformidade do DNA amplificado, bem como sua integridade e a temperatura da corrida também podem afetar a resolução da técnica (MAGALHÃES et al., 2005). A hibridação dos ácidos nucléicos é outra técnica molecular utilizada para avaliar possíveis combinações de sondas de DNA contra amostras-alvo, determinando o grau de semelhança genética entre essas combinações. Para se comparar o DNA das amostras com as sondas, faz-se a extração e clivagem do DNA em pequenos fragmentos, que após incubação, há a separação das cadeias de DNA originais e a formação de um DNA híbrido. São várias as técnicas de biotecnologia que utilizam a hibridação como princípio do método, como por exemplo o Dot-blot. A técnica Dot-blot é baseada na aplicação direta do DNA da amostra alvo em uma membrana, que é fixado e hibridizado com a sonda conhecida e após processos de lavagem e detecção, há a formação de pontos específicos correspondentes à combinação sonda e amostra-alvo.

Staphylococcus aureus

S. aureus é um importante agente etiológico causador de IIM em vacas leiteiras, que se manifesta tanto na forma MC quanto MSC (VASUDEVAN et al., 2003). No Brasil, já foi descrita prevalência de S. aureus em amostras individuais de vacas de até 70,9% do total de amostras analisadas (SCAPIN; ZANETTE; ROSSI, 2010). Este patógeno causa grandes prejuízos econômicos à atividade leiteira devido à redução de produção e qualidade do leite, custos com tratamento, além do aumento do risco de descarte de vacas com infecções crônicas (CREMONESI et al., 2013). Embora tenha primariamente transmissão contagiosa, dependendo das condições de manejo ou das cepas envolvidas no processo infeccioso, casos de transmissão ambiental (ambiente-vaca) de S. aureus já foram relatados (ZADOKS; SCHUKKEN, 2006).

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O conhecimento das cepas de S. aureus mais patogênicas pode facilitar a identificação de diferenças quanto à forma de transmissão (e.g., de forma mais lenta ou mais rápida; SOMMERHÄUSER et al., 2003). S. aureus pode apresentar variados fatores de virulência, tais como proteínas de superfície e adesão e propriedades de evasão do sistema imune, como produção de biofilmes, endotoxinas e exotoxinas (CREMONESI et al., 2013). Estes fatores interferem na manifestação, capacidade de transmissão e no potencial de cura da doença, uma vez que algumas cepas podem ser mais sensíveis ao tratamento do que outras (ZAFALON et al., 2007). Além disso, S. aureus tem habilidade de sobreviver no interior de neutrófilos, formando pequenas colônias, e micro abcessos, as quais contribuem para que a antibioticoterapia não tenha sucesso (KEEFE, 2012). Para avaliar fatores de virulência associados com a cronicidade de S. aureus nos rebanhos leiteiros foi realizado um estudo objetivando detectar genes associados à produção de biofilmes e endotoxinas. Seis genes de adesão foram associados à produção de biofilmes (icaD, icaA, fnbA, bap, clfA e cna) e cinco genes de endotoxinas (sea, seb, sec, sed e see), sendo que a maioria dos isolados de S. aureus foram capazes de produzir biofilme (KHORAMROOZ et al., 2016). Outro estudo da Suécia avaliou a presença de genes de virulência em 70 isolados de vacas com MC aguda e os correlacionou com características fenotípicas e genotípicas. Os fatores de virulência mais prevalentes foram os genes codificantes de hemolisinas (alfa, beta, delta e gama), componentes de leucocidina, fatores de aglutinação A e B, proteína de ligação ao fibrinogênio e proteína de ligação à fibronectina A (ARTURSSON et al., 2016). O operon femA, que atua como gene regulador e é fator específico da estrutura da parede celular bacteriana, indica expressão da resistência a meticilina por S. aureus. Além disso, as estirpes de S. aureus resistente à meticilina também podem ser identificadas pela PCR via amplificação do gene mecA. Estudo com 251 amostras de leite cru de tanque foi realizado por meio de PCR Biplex identificou 278 isolados de S. aureus pela presença do gene femA (positivos em 100% dos isolados testados, dos quais 11 amostras apresentaram o gene mecA (TEIXEIRA et al., 2014). Estudo recente objetivou genotipar S. aureus isolados de búfalas (leite de tanque, leite de quarto mamário e tecido do úbere) e leite de quarto mamário de pequenos ruminantes (CREMONESI et al., 2013). Foi realizada amplificação da região intergênica do rRNA 16S-23S, capaz de identificar diferentes genótipos de S. aureus, além dos genes relacionados aos fatores de virulência. Houve associação de endotoxinas específicas entre S. aureus de búfalas e entre àquelas ligadas aos pequenos ruminantes, permitindo assim a compreensão da epidemiologia do

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patógenos sobre estas espécies. Amostras de leite de vacas com MSC de rebanhos brasileiros foram submetidas aos testes de PCR pela mesma amplificação da região intergênica em 77 isolados de S. aureus e os resultados revelaram a ocorrência de 9 padrões genotípicos diferentes (FERREIRA et al., 2006). Ainda, os resultados deste estudo indicaram alta heterogeneidade genética deste patógeno dentro do rebanho avaliado. Essa diversidade de padrões genotípicos deve ser estudada para aprimorar os programas de controle da mastite. Com o objetivo de avaliar as características de transmissão e patogenicidade, Fournier et al. (2008) analisaram cepas de S. aureus isoladas de IIM quanto aos genes de virulência e genótipos, obtidos por amplificação PCR da região intergênica 16S-23S. Foram encontrados 17 genótipos diferentes associados com alguns dados epidemiológicos e clínicos de 26 rebanhos, que demonstraram alta associação com os genes de virulência. Além disso, o método teve alto desempenho, facilidade de execução e economia. Rabello et al. (2005) avaliaram a susceptibilidade aos antimicrobianos e os padrões genotípicos de 107 isolados de S. aureus de vacas com MSC em rebanhos brasileiros. A diversidade genotípica foi analisada por PFGE, o qual identificou 16 tipos e 24 subtipos do patógeno. Dois tipos (A e C) e 5 subtipos (A1, A2, A4, A12 e C2) corresponderam a 39,3% dos isolados, enquanto 60,7% representaram tipos e subtipos de isolados de somente um dos rebanhos. Ao final do estudo, todos os isolados foram agrupados com 52% de padrão de similaridade (RABELLO et al., 2005). Outro estudo com 25 isolados de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) de vacas com MC foi realizado em 17 rebanhos leiteiros da Alemanha, no qual foram investigadas as relações genéticas entre os isolados, a resistência antimicrobiana e os fatores de virulência. Por meio de PFGE foram identificados vários genes de resistência e 16 diferentes tipos dentre os isolados MRSA com alto padrão de variabilidade. Isto indica a disseminação de vários tipos de MRSA nos rebanhos, bem como a existência de um tipo específico para cada rebanho, o que dificulta a aplicação de medidas de controle da mastite (FEßLE et al., 2010). Também com isolados de S. aureus oriundos de 50 fazendas, um estudo analisou 150 amostras de leite de tanque coletadas durante três estações do ano (primavera, verão e outono). Foi observadaa alta prevalência de MRSA (84%) em um total de 93 isolados, no qual o gene spa (codificante da proteína A encontrada na parede celular de Staphylococcus aureus) foi também identificado. Portanto, é altamente recomendado o monitoramento da dinâmica de IIM causada por S. aureus dentro do rebanho (HARAN et al., 2012).

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CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE Staphylococcus aureus

ISOLADOS DE MASTITE DE REBANHOS BRASILEIROS E DE OUTROS PAÍSES Um experimento foi conduzido por grupo de pesquisa em colaboração com pesquisadores da Universidade de Milão com o objetivo de caracterizar genotipicamente isolados de S. aureus obtidos em 8 países (Brasil, Itália, Alemanha, Argentina, Colômbia, África do Sul, Estados Unidos da América e Tunísia) quanto à presença de genes codificadores de fatores de virulência. Os isolados de S. aureus do Brasil foram obtidos da Coleção de Isolados Bacterianos do Laboratório Qualileite – FMVZ/USP, criopreservados em solução BHI a -80°C. Foram selecionados aleatoriamente 94 isolados oriundos de MC e 52 de MSC, inoculados em placas de ágar sangue para isolamento das colônias puras e confirmação em MALDI-TOF-MS. Foram selecionados aleatoriamente 35 isolados de MC e 35 isolados de MSC para envio à Universidade de Milão, dos quais possuíam informações quanto à data de isolamento, quarto mamário, país de origem, forma de manifestação de mastite, tipo de sistema de produção, número de lactações, data do parto e dias em lactação. O conjunto de isolados de S. aureus oriundos dos diversos países (n = 120; Tabela 1) foi ressuspendido e incubados aerobicamente a 37°C para a extração do DNA e genotipagem. A extração de DNA foi realizada segundo Cremonesi et al., (2006) e a quantidade de DNA foi avaliada com o auxílio de um espectofotômetro Nano Drop ND-1000 (Nano-Drop Technologies Inc., Wilmington, DE) e posteriormente armazenadas a -20 °C até a utilização. A caracterização molecular das amostras foi realizada por PCR do espaço intergênico 16S-23S rRNA (RS-PCR), e cada reação (25 μL) foi composta por 800 nM de cada primer, 30 ng de DNA dos isolados e o mix HotStarTaq Master (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). A amplificação foi realizada em termociclador, com um ciclo de 95°C por 15 min, seguido de 27 ciclos a 94ºC por

1 minuto, anelamento por 7 min (55°C) e extensão a 72°C por 2 minutos.

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Tabela 1. Países participantes, isolados totais analisados por país, número de isolados de mastite clínica ou amostras com alto número de CCS e tipo de coleta para Staphylococcus aureus.

CCS: contagem de células somáticas; C: amostra composta dos 4 quartos mamários; Q: amostra individual de quarto mamário.Fonte: Monistero et al., (2018)

Foram investigados 26 fatores de virulência relacionados à S. aureus, sendo 12 genes que codificam enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, sef, seg, seh, sei, sej, sek e sel), 4 leucocidinas (lukE, lukSF-PV, lukE-lukD, lukM), gene de resistência à meticilina (mecA), 5 genes relacionados à invasão do hospedeiro (clfA, fmtB, cna, eta, etb) e 4 relacionados a fatores interferentes dos mecanismos de defesa do hospedeiro (tsst, scn, chp, sak). As sequências de DNA obtidas foram comparadas com sequências 16S rRNA em bancos de genes (GenBank) e os perfis genéticos foram inseridos no BioNumeric 5.0 software package (Applied Maths, Kortrjik, Bélgica), utilizando o Método de Associação Média (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages – UPGMA) para as análises de agrupamento segundo Paster; Dewhirst (1988). Novos genótipos foram observados para isolados da África do Sul e Tunísia, enquanto para os outros países foram observadas novas variantes de genótipos existentes. Os clusters CLR e CLC foram observados em toda a América, Europa e África, sendo que o CLR (contém 13 variantes) foi detectado em todos os países, exceto no Brasil (Figura 2). Os clusters de CLA e CLR de S. aureus parecem ser específicos de bovinos leiteiros e sua disseminação pode ter sido iniciada com a disseminação do gado proveniente da Europa. Entre os genes de fatores de virulência, fmtB, cna, clfA e leucocidinas foram os mais frequentes. Os genes sea e sei estavam presentes em sete dos oito países; o seh mostrou alta frequência em países da América do Sul (Brasil,

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Colômbia, Argentina), enquanto o sel foi encontrado especialmente em um país do Mediterrâneo (Tunísia). Os genes etb, seb e see não foram detectados em nenhum dos isolados, enquanto apenas dois isolados foram MRSA (Alemanha e Itália) confirmando a baixa difusão do microrganismo de resistência à meticilina entre os isolados de mastite bovina.

Figura 2. Representação esquemática dos genótipos de S. aureus e suas variantes encontrados em oito países agrupados em clusters (MONISTERO et al., 2018).

Streptococcus uberis S. uberis é um dos principais patógenos ambientais, que está associado com as duas formas de manifestação da mastite, MC e MSC, podendo persistir na GM e causar quadros crônicos da doença (ZADOKS et al., 2003). Embora algumas medidas de controle baseadas na higiene no momento da ordenha e na antibioticoterapia na secagem sejam recomendadas para grande parte dos patógenos causadores da mastite bovina, elas podem surtir pouco ou nenhum efeito para controle de mastite causada por S. uberis. Parte disso ocorre pela alta variabilidade genotípica entre

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os isolados e pela presença de diferentes genes associados a fatores de virulência (LANG et al., 2009). Um dos critérios usados para classificar S. uberis como patógeno ambiental é que medidas de controle específicas contra a mastite contagiosa não conseguem erradicá-lo. Entretanto, Zadoks et al. (2003) analisaram molecularmente cepas de S. uberis, e observaram que as infecções causadas por este patógeno também podem ter transmissão contagiosa. Foi identificado um tipo único (clones) de cepas em cada rebanho analisado, o que pode ser resultado de falhas na discriminação de cepas relacionadas ou pode denotar a infecção de múltiplas vacas de uma fonte comum. Outro estudo observou que dentre 62 cepas diferentes de S. uberis foram identificados tipos idênticos em diferentes quartos da mesma vaca e de algumas vacas do mesmo rebanho, sugerindo também a transmissão direta de quartos infectados para quartos sadios, possivelmente durante a ordenha (PHUEKTES et al., 2001). A taxa de novas infecções de S. uberis, assim como de outros agentes ambientais, é maior durante o período seco e, durante a lactação, o risco de infecção é maior nos primeiros 75 dias de lactação. Em estudos com infecção experimental, S. uberis é encontrado predominantemente no lúmen do tecido alveolar e entre ductos, indicando que grande parte do crescimento bacteriano ocorre em áreas residuais e de leite recém-sintetizado (ZADOKS et al., 2003). Com relação à epidemiologia da mastite causada por S. uberis, foi realizado um estudo com 138 isolados de quatro rebanhos, e por meio de PFGE foram encontradas 62 estirpes diferentes. Observou-se infecção persistente com a mesma cepa dentro da mesma lactação, embora este alto número de estirpes encontradas pudesse estar associado com contaminação de fonte ambiental. A infecção persistente e a existência de cepas predominantes em alguns rebanhos, além da presença de cepas idênticas em diferentes quartos da mesma vaca indicam que a epidemiologia de S. uberis pode ter transmissão contagiosa (PHUEKTES et al., 2001). Relações genotípicas entre 40 isolados de S. uberis oriundos de MSC foram avaliados por PFGE. Os resultados indicaram 17 padrões de PFGE, sendo que cepas diferentes também foram encontradas dentro e entre os rebanhos, porém houve baixo número de isolados do mesmo rebanho com padrões idênticos de PFGE. Além disso, nenhuma associação foi encontrada com os perfis de virulência, embora o aparecimento de cepas específicas possa indicar que algumas são mais virulentas que outras (REINOSO; LASAGNO; ODIERNO, 2015). Por fim, as análises por PFGE podem ser comparadas com outras técnicas

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moleculares a fim de obter maior precisão dos resultados. Perrig et al. (2015) determinaram as relações clonais entre 137 isolados de S. uberis de leite com mastite (clínica ou subclínica), e avaliaram a prevalência dos genes pauA e sua, relacionados com a virulência da infecção. Os isolados foram genotipados pela técnica de RAPD e por PFGE. Na primeira, foram encontrados 25 perfis diferentes, ao passo que pelo PFGE foram encontrados 61 tipos diferentes de S. uberis. A prevalência dos genes sua e pauA foram de 97,8% e 94,9%, respectivamente. Outro estudo sobre a epidemiologia molecular de S. uberis foi realizado com 30 isolados coletados durante um ano e examinados por duas técnicas, PFGE e MLST. Os 30 isolados foram agrupados em 18 tipos obtidos por PFGE, sendo que três deles apresentaram dominância em quase metade dos isolados avaliados (46,6%); o que denotou o potencial de transmissão vaca-a-vaca. Por MLST, os isolados foram agrupados em 14 tipos, sendo que 5 foram agrupados em complexos clonais. As estirpes mais virulentas foram associadas a pulsotipos únicos de PFGE e não associadas com clones (RATO et al., 2008). Um estudo objetivou avaliar 12 marcadores de DNA específicos em 50 isolados de Streptococcus spp., S. agalactiae e S. uberis com a técnica Dot-blot (ALMEIDA et al., 2013). Esses pesquisadores observaram especificidade de marcadores para as três categorias, além de marcadores relacionados à fatores de virulência, que revelaram padrões específicos de cepas de S. agalactiae e S. uberis. Os derivados do operon de frutose (FO1 e FO3) foram específicos para S. agalactiae enquanto os marcadores operon de nisina (NU1 e NU3) foram capazes de discriminar isolados de S. agalactiae e S. uberis. Outro estudo, também com metodologia Dot-blot, objetivou avaliar a estrutura populacional de S. uberis e compará-la com a análise de sequência multilocus (MLSA) (ALBUQUERQUE et al., 2017). Esses autores puderam confirmar a identidade dos isolados como Streptococcus uberis usando marcadores taxonômicos específicos e determinar a presença de genes relacionados à resistência a antibióticos e virulência. Além disso o mesmo estudo observou que com MLSA foi possível identificar complexos clonais mais prevalentes de S. uberis em ambos os rebanhos (7 clusters).

DIVERSIDADE GENOTÍPICA E FATORES DE VIRULÊNCIA DE Streptococcus uberis ISOLADOS DE INFECÇÕES INTRAMAMÁRIAS DE VACAS LEITEIRAS NO BRASIL Um estudo de nosso grupo de pesquisa avaliou a diversidade genotípica de S. uberis isolados de mastite bovina em duas diferentes regiões do Brasil por meio da hibridização Dot-blot e identificar os fatores de virulência associados (Alves et al., dados não publicados).

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Os isolados de S. uberis foram obtidos da coleção de isolados bacterianos do Laboratório Qualileite – FMVZ/USP, os quais foram criopreservados em solução BHI a -80°C. Foram selecionados 50 isolados oriundos de MSC e 94 isolados de MC, obtidos por coleta individual de quarto mamário. Após inoculação em ágar sangue e TSA, um total de 18 isolados foram excluídos do estudo por contaminação (n = 3) ou ausência de crescimento após 24 horas de incubação (n = 15). Todas os isolados foram avaliados por testes de CAMP, esculina e bile esculina para confirmação de S. uberis segundo metodologia descrita pelo National Mastitis Council (NMC, 1999).O DNA de 126 isolados de Streptococcus uberis foi extraído de acordo com metodologia adaptada de Fan; Kleven; Jackwood, (1995), pelo método de fervura direta seguida de resfriamento rápido. Após o procedimento de extração, as amostras de DNA foram quantificadas com o auxílio do Qubit 2.0 Fluorometer HS Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e enviados à Universidade do Porto para as análises de Dot-blot. Para os ensaios de Dot-blot, 44 amostras de S. uberis obtidas de 31 vacas, foram selecionadas com base no histórico de MC, número de casos, concentração de DNA, relação 260/280 e maior número de rebanhos analisados. A análise de Dot-blot foi realizada de acordo com ALBUQUERQUE et al., (2017), com auxílio do equipamento Bio-Dot (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e para cada ensaio foi construída membrana de nitrocelulose, submetidas a hibridação em sondas de DNA com marcadores taxonômicos e relacionados a fatores de virulência de S. uberis (Tabela 2). Após a hibridação, as membranas foram submetidas a etapas de lavagem e detecção, de acordo com as instruções do fabricante, os pontos hibridizados com a sonda foram detectados por reagente quimioluminescente (CDP-Star; Roche Diagnostics, Basileia, Suíça) e as imagens Dot-blot foram capturadas utilizando o sistema Molecular Imager ChemiDoc (BioRad, Hercules, CA).

Tabela 2. Sondas de DNA utilizadas para hibridização de DNA em amostras de Streptococcus uberis isolados de rebanhos brasileiros

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A análise dos pontos foi realizada segundo Caridade et al., (2015), no qual um número foi atribuído para calcular a probabilidade de cada ponto representar um sinal de hibridação positivo para a combinação de DNA das amostras de S. uberis e a sonda de DNA conhecida. Dez marcadores de DNA foram analisados no presente estudo, sendo dois marcadores taxonômicos (U1 e U2, específicos para S. uberis) para a confirmação da identidade dos isolados; dois marcadores de operon nisina (NU1-nsuR e NU3-nsuI) e seis marcadores associados com genes responsáveis para a expressão de fatores de virulência (V1-hasC, V2-gapC, V3-oppF, V4-sua, V6-pauA e V7-hasA; Figura 3). Valores de probabilidade acima de 0,5 foram considerados positivos e possibilitaram a confirmação da identidade de 79,5% dos isolados analisados (35/44) para S. uberis, através da resposta observada nas sondas taxonômicas U1 ou U2. O marcador de operon nisina, identificado pelas sondas NU1 e NU3, responsáveis pela regulação dos genes nsuR e nsuI, respectivamente, foi identificado em metade dos isolados, sendo que o gene nsuI teve maior prevalência do que o gene nsuR. Somente dois isolados (26su e 51tsu) tiveram resultado positivo para ambos marcadores, sendo o primeiro isolado de MSC e o segundo de MC. Das seis sondas responsáveis pela regulação de fatores de virulência, cinco responderam no mínimo para 50% dos isolados analisados com significado positivo. A sonda V4, responsável por regular o gene sua esteve presente em 34 dos 44 isolados analisados (77,2%) ao passo que a sonda V7, marcadora do gene hasA foi observada em somente 18% dos isolados. No entanto, a sonda V2 responsável pela marcação do gene gapC foi identificada em 88,8% dos isolados confirmados como S. uberis, indicando atividade da enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, que atua no mecanismo de adesão deste patógeno. Com base na resposta aos marcadores utilizados foram criados padrões de Dot-blot de acordo com a quantidade de hibridização para as sondas, os quais foram atribuídos diferentes perfis para cada isolado. Desta forma, foram criados nove padrões para os 44 isolados de S. uberis (A - I), indicando alta heterogeneidade, embora a maioria deles tenha sido isolada no mesmo rebanho ou em regiões geográficas vizinhas. Oito isolados não foram atribuídos padrões porque a resposta às sondas foi negativa. Apenas um isolado entre todos os avaliados foi correspondente com todos os marcadores de virulência, dois marcadores de operon de nisina e pelo menos um marcador de taxonomia. O padrão de Dot-blot D apresentou maior frequência de expressão entre os isolados (25%), correspondente a sete das dez sondas de DNA analisadas, dentre fatores taxonômicos, fator nisina e fatores de virulência.

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Figura 3. Hibridização Dot-blot em dez sondas de DNA e DNA genômico de 44 isolados de Streptococcus uberis (Dados não publicados)

CONSIDERAÇÕES FINAIS

I. Há ampla diversidade genética de S. aureus entre os isolados avaliados, entretanto com perfis específicos dentro de cada rebanho. Entre os fatores de virulência, os genes fmtB, cna, clfA e leucocidinas foram os mais frequenteente observados. Apenas dois isolados de S. aureus, um da Alemanha e outro da Itália, apresentaram resistência à meticilina, pela confirmação do gene mecA, o que indica baixa difusão de resistência à meticilina entre os isolados de S. aureus causadores de mastite bovinaII. Nove padrões de Dot-blot foram observados nos isolados de S. uberis, o que indica alta heterogeneidade deste agente. Além disso, foi encontrada presença dos principais fatores de virulência descritos na literatura.

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AGRADECIMENTOSOs autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de estudos (FAPESP - Processo 2017 / 02414-8).

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268

CAPÍTULO XIIPRÁTICAS ESTRATÉGICAS COM VISTAS À MITIGAÇÃO DOS GASES DO EFEI-

TO ESTUFA NA PRODUÇÃO DE BOVINOS A PASTO

Guilherme Acácio de Sene²; Alice Helena Peres Marques Assumpção²; Gabri-

ela Bagio Oliveira¹; Analisa Vasques Bertoloni²; Willian Rufino Andrade¹; Mu-

rilo Trettel²; Ana Laura Januário Lelis²; Cristiane Barbosa Tropaldi¹; Gabriele

Voltareli da Silva²; Rolando Pasquini Neto¹; Flávio Perna Junior¹; Fábio Luís

Henrique³; Rosana Ruegguer Corte¹; Patrícia Perondi Anchão Oliveira³; Paulo

Henrique Mazza Rodrigues¹.

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade de São Paulo²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – Universidade de São Paulo³Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Pecuária Sudeste

RESUMONo Brasil, as pastagens desempenham importante papel na alimentação dos bovinos. Porém, o sistema de criação extensivo é severamente criticado por contribuir com o aumento da emissão de gases de efeito estufa, principalmente o metano (CH4), proveniente da fermentação entérica e dos dejetos orgânicos. A produção deste gás torna-se um problema não somente ambiental, mas também produtivo, pois sua formação implica em reduções da eficiência energética da dieta, problema este que é acentuado devido ao tipo de gramíneas cultivadas no país, e à estacionalidade de produção, reduzindo a produtividade e qualidade das pastagens durante a época seca. A combinação destes fatores diminui a digestibilidade da fibra, reduzindo o aporte de nutrientes disponíveis para os animais e, consequentemente, seus índices zootécnicos, resultando em baixa produtividade por unidade de área e baixos índices reprodutivos. Levando-se este cenário em consideração, objetivou-se apresentar técnicas capazes de minimizar estes efeitos, tendo como base a adoção de diferentes práticas de manejo das pastagens e estratégias nutricionais para os animais, visando melhorar a qualidade do pasto, a produtividade animal e, consequentemente, reduzir o impacto do CH4 sobre este sistema.

INTRODUÇÃO A pecuária de corte é um dos setores mais importantes do agronegócio brasileiro, representado 8,7% (597,22 bilhões de reais) do Produto Interno Bruto (PIB). No ano de 2018 o Brasil possuía o segundo maior rebanho bovino do mundo,

269

com aproximadamente 214,69 milhões de cabeças, sendo o maior exportador de carne bovina, com dois milhões de toneladas por ano, e o segundo maior produtor de carne, com onze milhões de toneladas por ano, valor que representa 15% da produção mundial (ABIEC, 2019), ocupando assim uma posição de destaque na indústria pecuária mundial. O sistema de produção de bovinos a pasto é considerado o mais representativo no país, com aproximadamente 158,6 milhões de hectares de pastagens (naturais e plantadas), o que corresponde a 45% do total de terras utilizadas na produção agropecuária (IBGE, 2017). Do volume total de abate nacional, 87,4% correspondem a animais oriundos de pastagens. Esse sistema de produção baseia-se, quase na sua totalidade, no uso de forrageiras tropicais com os índices médios: taxa de ocupação de 1,32 cab/ha, taxa de lotação de 0,93 UA/ha e idade ao abate de 36 meses (ABIEC, 2019). No entanto, esse cenário da pecuária extensiva nacional é duramente criticado por contribuir para as emissões de gases de efeito estufa (GEE), principalmente metano (CH4), monóxido de carbono (CO), óxido nitroso (N2O) e óxidos de nitrogênio (NOx) (Boeira et al., 2001). O CH4 se destaca dentre os outros gases como fonte de maior emissão para a pecuária em escala global, o qual é produzido via fermentação entérica e fermentação dos dejetos orgânicos (USEPA, 2000), possuindo capacidade de captar 23 vezes mais calor quando comparado ao CO2 (Berndt, 2010). Ainda segundo dados do IPCC (2014), analisando as emissões não CO2, a fermentação entérica de ruminantes é a principal emissora e responsável por cerca de 30 a 40% das emissões agropecuárias, seguida pela emissão dos dejetos depositados em pastagens, sendo esta responsável por 15% das emissões agropecuárias. Segundo Berchielli et al. (2012), o rebanho bovino brasileiro é responsável por aproximadamente 3,3% do CH4 produzido mundialmente pelas atividades humanas, ou seja, 11,3% do CH4 entérico produzido no mundo. Entretanto, quando comparamos o desempenho dos dez maiores exportadores de carne bovina do mundo, entre 1988 e 2007, o Brasil apresentou as maiores taxas de crescimento nas estimativas anuais de emissão de CH4 (2,12% ao ano); no entanto, a pecuária de corte brasileira também apresentou a maior taxa de crescimento da produção de carne bovina (4,01/ano), resultando no maior valor negativo (-1,82/ano) do aumento líquido da taxa de emissões de CH4 por unidade de produto (kg de metano/kg de carne bovina) quando comparado a outros países. Portanto, esses dados sugerem que as emissões de CH4 por unidade de produto diminuíram até 29,4% no Brasil durante esses 20 anos, enquanto no mesmo período aumentou em 1,9% na União Europeia (Millen et al., 2011).

270

A eficiência do sistema de produção está relacionada com a redução da emissão de CH4 por quilograma de alimento ingerido ou por quilograma de produto. Conforme estimativas realizadas por Barioni et al. (2007), o aumento da taxa de natalidade de 55% para 68%, a redução na idade de abate de 36 para 28 meses e a redução na mortalidade até 1 ano de 7% para 4,5%, permitiria que em 2025 as emissões de CH4 em relação ao equivalente carcaça produzido fossem reduzidas em 18%. Isso seria possível mesmo com o aumento estimado em 25,4% na produção de carne. Ainda, o aumento no desempenho dos animais resulta em menor permanência do animal no sistema, reduzindo a produção de CH4 durante o ciclo de vida (Moss & Givens, 2002). O CH4 produzido através da metanogênese e da fermentação de dejetos não está relacionada somente aos problemas ambientais, mas também a fatores relacionados à perda de eficiência na produtividade animal (Moumen et al., 2016). O acúmulo de H+ inibe os sistemas enzimáticos (NADH + H+ ‐ NAD+) e a regulação do pH ruminal. Dessa forma, há necessidade de drenar as moléculas de H2 produzidas, sendo a produção de CH4 a principal via (Kozloski, 2011). Desse modo, a metanogênese é um processo natural, intrínseco aos ruminantes e essenciais para o metabolismo ruminal. Apresenta assim relação direta com a eficiência da fermentação ruminal, representando perda energética para o sistema e influenciando consequentemente o desempenho animal. Segundo Buddle et al. (2011), de 5% a 9% da energia bruta da dieta é perdida na forma de CH4. Acredita-se que o incremento da qualidade da alimentação e a alteração na população de microrganismos ruminais permitem maior retenção de energia, diminuindo as perdas por CH4, proporcionando melhor desempenho animal e menor produção de CH4 por unidade de produto (Berndt, 2010). As emissões de CH4 provenientes da fermentação ruminal dependem de alguns fatores como: o animal, nível de ingestão de alimentos, quantidade de grãos na dieta, tipos de carboidratos presentes, tamanho da partícula, da digestibilidade dos alimentos e adição de aditivos (Cottle et al., 2011). Em relação ao animal, diferentes quantidades de CH4 podem ser produzidas por zebuínos, taurinos e seus cruzamentos e estas alterações podem estar relacionados às diferenças características dos animais, tais como volume do rúmen, capacidade de seleção de alimentos, tempo de retenção dos alimentos no rúmen e as associações de fatores que conduzem a maior ou menor capacidade de digestão da fibra dos alimentos (Lassey, 2002). Segundo Pedreira et al. (2009), a produção de CH4 variou em função da categoria animal e sistemas de produção. Os autores verificaram que animais da raça holandesa produziram mais CH4 (299,3 g/dia) que as mestiças (264,2 g/dia). Observaram também que vacas

271

secas e novilhas produziram menos CH4 (268,8 e 222,6 g/dia, respectivamente) que vacas em lactação (353,8 g/dia), e animais da raça holandesa, com maior potencial de produção leiteira, perderam menos CH4 por unidade de matéria seca ingerida (19,1 g/kg) que as mestiças (22,0 g/kg). Em análise sob pastejo, a produção de CH4 pode ser influenciada tanto para mais ou para menos de acordo com o estágio de maturidade, método de conservação e processamento físico do volumoso. De modo geral, sua produção tende a aumentar quanto maior for o estágio de maturação da planta ingerida (Sundstol, 1981). De acordo com Kurihara et al. (1999), a produção de CH4 foi maior em forragens tropicais do que para forragens temperadas. Assume-se que essa maior taxa de conversão de CH4 em animais alimentados com forragem tropical está relacionada com os altos níveis de fibra e lignina e os baixos níveis de carboidratos não fibrosos (Van Soest, 1994). Dietas contendo maiores proporções de concentrado levam a menor pH ruminal do que dietas que contenham maior percentagem de forragem, diminuindo assim a proporção acetato:propionato, o que altera quantidade de H2 disponível no rúmen, devido à baixa produção deste pelas bactérias amilolíticas e pela intolerância das arqueas metanogênicas ao pH baixo (Vans Kessel & Russel, 1995). Portanto, para diminuir a participação da bovinocultura de corte no aquecimento da temperatura global é necessário o aumento da produtividade. Desse modo, esse capítulo apresentará alternativas que visem a mitigação de CH4 com o objetivo de melhorar a eficiência de bovinos em sistema de pastejo e reduzir impactos ambientais causados pela bovinocultura.

LIMITAÇÕES DOS SISTEMAS DE PRODUÇÃO NOS TRÓPICOS Como mencionado anteriormente, o Brasil possui uma área total de pastagens de 158,6 milhões de hectares. Por estar localizado na região dos trópicos, proporciona condições climáticas favoráveis para que espécies forrageiras do tipo C4 expressem elevado potencial produtivo. Destacam-se como gêneros mais utilizados o Panicum, Pennisetum, Brachiaria e Cynodon (Euclides, 1995). A Brachiaria brizanta, por exemplo, apresenta elevado potencial de produção de massa, atingindo até 36 toneladas de massa seca por hectare/ano (Ghisi e Pedreira, 1987), proporcionando às pastagens um importante papel na alimentação de bovinos. A alta produtividade destas forragens está ligada à suas características morfológicas, tornando-as mais adaptadas à elevada intensidade luminosa e altas temperaturas, condição encontrada em clima tropical nesta condição. Forragens tropicais ( com ciclo de Carbono C4) nesta situação utilizam menos de 400 gramas

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(g) de água para produzir 1 g de matéria seca (MS) vegetal, enquanto forragens temperadas e leguminosas (C3) utilizam de 400 a 1000 g de água para produzir a mesma 1 g de MS (Valente et al., 2011). Porém, apesar da maior produção de massa por hectare das gramíneas tropicais, quando comparadas com as gramíneas temperadas e leguminosas, possuem menor quantidade de carboidratos solúveis, açúcares e amido, e maior conteúdo de parede celular, celulose e lignina, o que dificulta a colonização e degradação da fibra pelos microrganismos ruminais, e consequentemente diminui a digestibilidade da fibra, podendo variar de 0% a 100% de acordo com sua deposição (Rodrigues & Gobbi, 2004). Wilson et al. (2004) avaliaram a influência da estrutura anatômica das plantas sobre a digestibilidade da folha de 28 espécies de Panicum, sendo dezoito do tipo C4, sete do tipo C3 e três intermediárias de C3/C4. Os autores relatam que as espécies C3 apresentaram maior digestibilidade da matéria seca e menor quantidade de conteúdo de parede celular. As espécies C3/C4 foram intermediárias e as C4 obtiveram menor digestibilidade e maior proporção de parede celular. As médias para C3, C3/C4 e C4 foram de 76, 70 e 69%, respectivamente, para a digestibilidade da matéria seca e 33, 42 e 50% para o conteúdo de parede celular. Outro fator limitante das pastagens tropicais está relacionado com a concentração de aproximadamente 80% de sua produção na estação chuvosa e quente, sendo acentuada a queda da produtividade na estação seca ou fria do ano. Fatores ambientais, como redução da precipitação, baixa temperatura e menor luminosidade, acentuam o efeito da estacionalidade, afetando assim o valor nutritivo das pastagens e ocasionando também baixo desempenho do rebanho manejado sob condição de pastejo. Nesse sentido, Euclides (1995) relatou um acréscimo de 27% na proteína bruta (PB) e 7% na digestibilidade in vivo da matéria seca (DIVMS) de folhas de capim-Marandu na estação das águas comparativamente com a seca. Kaybeia et al. (2002), durante o período seco, descreveram redução significativa no valor nutritivo de Brachiaria brizantha em relação ao período chuvoso, chegando a 3,9% de PB e 51,3% de DIVMS em amostras de forragem colhidas por meio de simulação de pastejo. A estacionalidade de produção das forrageiras tropicais, juntamente com o sistema extensivo de produção, se apresentam como os grandes responsáveis pelos baixos índices produtivos e reprodutivos no Brasil, uma vez que, no período seco, a baixa qualidade das forrageiras tropicais acaba por reduzir a degradabilidade ruminal da dieta, reduzindo o CMS e promovendo queda no desempenho animal e até mesmo perda de peso do rebanho, resultando em baixa produtividade por unidade de área e baixos índices reprodutivos.

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Segundo ABIEC (2018), no Brasil são encontrados valores de índices médios de taxa de natalidade de 60 %, taxa de mortalidade até a desmama de 8 %, taxa de desmama de 55 %, idade ao primeiro parto de 20 meses, intervalo entre partos de 20 meses, idade ao abate de 4 anos, rendimento de carcaça de 53%, lotação de 9 ua/ha, peso médio de carcaça de 210 kg. Esses são parâmetros que devem ser levados em conta no sistema de produção. Como estratégia de produção, torna-se viável o uso de animais de alto potencial genético para maximizar o ganho de peso, obter maior rendimento de carcaça e precocidade de abate. Evidentemente, os objetivos das atuações zootécnicas, que resultam em intensificação dos sistemas de produção, é reduzir a produção de CH4 por kg de peso vivo através do aumento do ganho de peso diário dos animais. Um animal que se desenvolve mais rápido atingirá o peso de abate em uma idade mais jovem. Nessa condição, menos alimento é utilizado na manutenção do animal e as emissões totais de metano ao longo do ciclo de vida também serão reduzidas, o que resulta em menos CH4 por kg de peso vivo ou por kg de carne bovina produzida. Ao diminuir as exigências de manutenção, a relação entre CH4 emitido por peso final em kg de carcaça também diminui, em termos absolutos e relativos, quando comparados à idade no abate (Berchielli et al., 2012). Resultados encontrados por Perna Junior (2018) mostram o potencial fermentativo dos zebuínos comparado aos animais taurinos, sendo que a fermenta;’ao ruminal em animais zebuínos foi mais intensa, produzindo mais acetato (17,1%), AGCC total (20,2%) e CH4 (18%) por unidade de MS de conteúdo ruminal. Essa diferença também foi encontrada por Carvalho (2018), em que os animais zebuínos passavam mais tempo ingerindo, ruminando ou mastigando do que os animais taurinos.

PRÁTICAS ESTRATÉGICASMELHORAMENTO GENÉTICO DAS PLANTAS FORRAGEIRAS O melhoramento genético das plantas forrageiras é por definição a arte de alterar geneticamente as plantas, de modo que atendam às necessidades produtivas dos animais, direcionando, dessa forma, obter uma planta mais eficiente dependendo da finalidade de seu uso, com base nas características morfoanatômicas e fisiológicas para pastejo, corte e biomassa, já que o produto final de importância econômica não está na planta, e sim no animal (Assis, 2010). O melhoramento de plantas forrageiras para uso em pastos consorciados é bem mais complexo do que o convencional, que visa a seleção de materiais genéticos para uso em estandes puros, desprezando uma possível interação entre as espécies. Isso acontece, porque genótipos com alta habilidade produtiva, necessária para um

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alto desempenho em monocultura, não necessariamente possuem alta habilidade de combinação, que é o atributo determinante do desempenho de um genótipo em consórcio (Andrade et al., 2015a). Nas gramíneas, a maior ênfase vem sendo dada à produção de matéria seca de folhas, por estas apresentarem maior qualidade nutricional do que os colmos, com maior teor de PB, menor teor de FDN e, consequentemente, maior digestibilidade (Assis, 2010). Devido ao processo de metanogênese, a melhoria na qualidade do alimento com maior concentração de PB, menores teores de FDN e elevada digestibilidade proporcionam uma alteração na população de microrganismos ruminais, aumentando a retenção de energia e favorecendo o aproveitamento dos nutrientes ingeridos pelo animal, refletindo na eficiência de produção, e, consequentemente, reduzindo a emissão de CH4 entérico por unidade de produto, já que uma quantidade menor de H2 deve estar disponível. Neste contexto, o uso de aditivos (probióticos, ionóforos, leveduras, óleos essenciais, taninos e plantas ricas em saponinas) na dieta, como técnicas de manejo nutricional que vêm sendo empregadas como alternativas para a diminuição da produção de metano, tem mostrado potencial significante (Berndt et a., 2013).

DIFERIMENTO A importância das pastagens na produção de bovinos no Brasil é incontestável e reconhecida, fato relacionado, entre outros fatores, ao baixo custo de produção e disponibilidade forrageira. Porém, em razão do fenótipo das forrageiras tropicais e das condições climáticas no decorrer do ano, a produção de forragem é estacional, o que resulta na sazonalidade da produção animal. O diferimento é uma estratégia, que consiste em vedar determinada área de pasto e excluí-la do pastejo. Geralmente esse procedimento é feito no fim do verão e/ou, no outono. Assim, é possível garantir estoque de forragem para ser pastejada durante o período de sua escassez e, com isso, minimizar os efeitos da sazonalidade de produção forrageira (Santos et al., 2009). É considerada uma estratégia simples, de baixo custo e fácil aplicação (Sousa et al., 2012), e permite ganho de peso elevado. Silva et al. (2016), em estudo de desempenho de bovinos de corte em pastos diferidos de Brachiaria, reportaram ganhos variando de 490 a 725 gramas/animal/dia. Já Garcia et al. (2014) obtiveram desempenho maiores, chegando à 840 gramas/animal/dia em pastagem diferida com suplementação. Para atingir ganhos superiores faz–se necessário o uso de suplementação. O diferimento permite desempenho modesto ou simplesmente mantêm

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o peso corporal dos animais (Santos et al., 2004), pois a forragem diferida é, geralmente, de baixa qualidade. Portanto, quando se almeja maior desempenho animal, pode-se adotar a estratégia de suplementação para complementar o valor nutritivo da forragem disponível (Euclides & Medeiros, 2005).

PASTEJO ROTATIVO OU ROTACIONADO O pastejo rotacionado, consiste em uma área que é dividida em piquetes que são submetidos a períodos alternados de pastejo e descanso. A grande vantagem deste método é proporcionar um maior controle sobre o pasto, permitindo definir quando e por quanto tempo as plantas estarão sujeitas à desfolha. Assim o pastejo tende a ser mais uniforme e a eficiência de pastejo mais elevada (Balsalobre, 2004). Cintra et al. (2018), ao compararem a produção de bovinos de corte na fase de recria em pastejo rotacionado com suplementação e pastejo extensivo, relataram que foi possível obter taxa de lotação de 8,4 UA/ha, ganho de peso 665 g/dia, alcançando margem produtiva de 50,1 arrobas/ha, num período de 203 dias na época das águas no pastejo rotacionado. Enquanto que no sistema extensivo com 300 animais machos não castrados, taxa de lotação 2,3 UA/ha, ganho de peso 325 g/dia, a produtividade alcançada foi de 6,88 arrobas/ha num período de 203 dias. O máximo desempenho animal neste sistema é alcançado quando se tem uma baixa pressão de pastejo e/ou alta produção forrageira (Costa, 2007). As médias de ganhos de peso para bovinos com suplementação mineral em pastejo rotacionado de Brachiaria é de 740 g/dia (Euclides, 2005).

IRRIGAÇÃO DE PASTAGENS A irrigação é uma estratégia utilizada durante o veranico, que visa atender à necessidade hídrica forrageira, permitindo o aumento da produção forrageira e, consequentemente, produção animal. Para a implantação da irrigação, deve-se inicialmente verificar a temperatura, luminosidade, disponibilidade de água da propriedade. As áreas devem ser recuperadas e bem formadas, adubadas com nitrogênio e manejadas por método de pastejo rotacionado a fim de se assegurar maior eficiência de colheita da forragem e, viabilidade econômica (Balsalobre, 2003). A viabilidade econômica deste sistema é determinada por um conjunto de variáveis, dentre as quais algumas são mais relevantes, como o clima, a relação entre os preços de compra e venda de animais e o manejo de pastagem (Balsalobre, 2003).Diversos trabalhos em pastagens irrigadas obtiveram resultados de ganho de peso entre 492 e 541 g/dia (Penati, 2002). A irrigação possibilita uma melhoria na produção e qualidade forrageira por área. Consequentemente permite melhor desempenho

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animal, maior taxa de lotação (UA/ha) e proporciona índices satisfatórios de lucratividade.

CONSÓRCIO COM LEGUMINOSAS O consórcio é uma prática que permite associar mais de uma espécie vegetal numa mesma área e ao mesmo tempo. Na conjuntura atual, a necessidade eminente de redução dos impactos causados ao meio ambiente e, concomitantemente, relacionados a um arranjo sustentável dos sistemas de produção, tem como um dos pilares o uso de gramíneas e leguminosas forrageiras bem adaptadas, produtivas e que sejam capazes de fornecer aos animais os nutrientes necessários para uma produção economicamente viável (Andrade et al., 2015a). O estado de equilíbrio ocorre quando há a habilidade de duas espécies com alto grau de compatibilidade crescerem juntas em torno de um ponto de equilíbrio, independente do ponto de partida, se mantendo em níveis satisfatórios, com capacidade de recuperação de eventuais desequilíbrios causados por estresses bióticos ou abióticos e produzirem alta quantidade de forragem, com uma quantidade de leguminosa suficiente para otimizar os benefícios da fixação biológica de nitrogênio, cerca de 80%, e da qualidade da forragem (Andrade, 2015b). Na pecuária brasileira, os principais exemplos de consórcios compatíveis, com alta estabilidade e harmonia, são os pastos consorciados com os gêneros estilosantes (Stylosanthes spp.), o amendoim forrageiro (Arachis pintoi) e o guandu (Cajanus cajan) com diversas gramíneas em regiões do bioma Cerrado e Mata Atlântica (Andrade, 2015b). Oliveira et al. (2017) utilizaram, como uma solução tecnológica, o plantio consorciado do guandu com enfoque na recuperação de pastagens degradadas. O objetivo era desempenhar duas funções principais durante a seca, em que a primeira consistiu no fornecimento de alimento, guandu, com alto teor proteico, dispensando o uso de suplemento mineral proteinado, pois este possui alta taxa de retenção de folhas somente após o seu florescimento, processo que ocorre na época seca. E a segunda, como adubo verde no final da estação, pois o resíduo que não foi consumido é roçado e depositado sobre a superfície das pastagens, disponibilizando mais de 200 kg/ha de N à pastagem. Os resultados estão apresentados na Tabela 1 mostram que a consorciação na renovação de pastagens Brachiaria permitiu aumentos nos ganhos de peso individual e por área, aumento da lotação animal e reduzindo a idade ao abate de novilhas Nelore acima de 360 kg. A sua persistência é de aproximadamente de três anos, permitindo o equivalente de duas roçadas. Ao final desse período é necessário um novo plantio, retirando as plantas velhas e uniformizando a área.

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Além do aumento da produtividade, existe o potencial da leguminosa em diminuir a emissão de metano entérico, o que está sendo foco de estudos atuais.

Tabela 1. Desempenho de novilhas terminadas em diferentes condições de pastagens e safra.

GPM: ganho médio por área (ha); NNov: número de novilhas por área (ha); PF: peso final em kg; CON: pastagem consorciada; DEG: pastagem degradada; REC: pastagem recuperada; EMP: erro padrão médio; P: efeito de fator de tratamento; S: efeito de fator safra; P*S: interação entre tratamento e safra.

SOBRESSEMEADURA Em consequência das baixas temperaturas e do período luminoso mais curto na época seca do ano, as pastagens tropicais sofrem restrição de oferta de forragem, mesmo quando são irrigadas. Para minimizar tal situação, pode ser utilizada a estratégia de sobressemeadura de aveia, que pode suportar de 4 a 6 UA/ha, enquanto que a pastagem apenas com Brachiaria suporta de 2,5 a 3,5 UA/ha no mesmo período, ainda que sob irrigação. A principal vantagem dessa tecnologia é a redução de custos. Seu uso possibilita menor necessidade de suplementação com concentrados e redução do uso de alimentos volumosos conservados, pois a aveia é uma forragem de alta qualidade. No entanto, deve ser implantada em regiões que apresente irrigação ou inverno chuvoso, fato que ocorre em áreas isoladas, no sul do estado de São Paulo e a região Sul do país, como forma de melhorar a pastagem natural (Oliveira et al., 2005). Genro et al. (2017) avaliaram a intensidade das emissões de CH4 sobre o consumo e o desempenho de novilhos de corte em terminação em pastagens naturais com diferentes níveis de intensificação: pastagem natural (PN), pastagem natural fertilizada com nitrogênio (PNF) e pastagem natural fertilizada com nitrogênio e sobressemeada com espécies hibernais exóticas, azevém, Lolium multiflorum, e trevo vermelho, Trifolium pratense, (PNS). Os autores observaram, conforme descrito na Tabela 2, que para melhorar o desempenho animal e diminuir a intensidade da emissão de CH4, pode-se adotar a adubação nitrogenada e a introdução de gramíneas de inverno, servindo para o sequestro do carbono.

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Tabela 2. Consumo, desempenho e emissões de metano de novilhos terminados em pastagem natural, pastagem fertilizada e pastagem sobressemeada.

CMS, %PV: consumo de matéria seca em percentagem do peso vivo; GMD: ganho médio diário; GPV: ganho de peso vivo por área (GPV/ha) de novilhos terminados em pastagem natural (PN), pastagem natural fertilizada (PNF) e pastagem natural com fertilização e sobressemeadura de espécies hibernais exóticas (PNS).

Fonte: Genro et al. (2017)

RECUPERAÇÃO DE PASTAGENS DEGRADADAS Apesar de possuir 158,6 milhões de hectares de pastagens (IBGE, 2018), alguns autores relatam que 80% das pastagens cultivadas no Brasil estão estabelecidas em solos degradados (Barcellos et al., 2001; Kluthcouski & Adair, 2003). O manejo inadequado das plantas forrageiras, a exaustão da fertilidade e a falta de conservação do solo são considerados as principais causas da degradação das pastagens (Oliveira, 2007). Dessa maneira, umas das consequências do manejo inapropriado das pastagens é a emissão de gases de efeito estufa (GEE), especialmente pela exaustão da matéria orgânica do solo durante o processo de degradação que emite CO2 (Lal, 2001). Um dos aspectos mais importante para a mitigação das emissões de GEE nos sistemas de produção animal é o sequestro de carbono, realizado pelas pastagens recuperadas e intensificadas e pelas culturas eventualmente integradas nos sistemas de produção (Oliveira, 2015). Dependendo do manejo, essas áreas podem se tornar tanto fonte como dreno de GEE para a atmosfera, o que torna fundamental a adoção de práticas adequadas às áreas cultivadas (Ferreira et al., 2014). Segundo Oliveira (2007), recuperar uma pastagem é mais barato do que estabelecê-la novamente, porque envolve menor quantidade de operações agrícolas. Portanto, além de ser interessante do ponto de vista ambiental por evitar

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o desmatamento de novas áreas para a formação de pastagens, a recuperação, quando possível adotá-la, é uma prática viável, tanto técnica quanto economicamente (Oliveira, 2007). Para o estabelecimento de uma pastagem é necessário eliminar a população de plantas existentes em determinada área, por meio de preparo do solo ou por meio de herbicidas dessecantes, quando se visa implantar nova espécie forrageira, quer via plantio direto, semeadura convencional ou mesmo plantio por mudas. Já a recuperação da pastagem elimina os gastos com o preparo do solo e aquisição de sementes, pois consiste em “aproveitar” a população de plantas existentes e empregar técnicas que promovam a recuperação daquela pastagem degradada (Oliveira, 2007). O emprego de técnicas adequadas nos sistemas de pastagens pode evitar a necessidade da abertura de novas áreas e, consequentemente, evitar o desmatamento de florestas. Ainda permite a diversificação das propriedades pecuárias, aumentando a disponibilidade de áreas para agricultura e agroenergia, promove a colocação de produtos pecuários mais próximos dos centros consumidores, além de melhorar a imagem nacional e internacional da pecuária brasileira, desgastada especialmente por sua associação com o desmatamento, emissão de GEE e mudanças climáticas (Oliveira, 2015). O uso do sistema Voisin, o plantio de leguminosas nas áreas degradadas, a utilização de grade pesada, a ressemeadura da planta forrageira associada com plantio de uma cultura anual, a vedação por longos períodos de tempo, a integração lavoura-pecuária e a recuperação direta das pastagens são algumas das técnicas que têm sido indicadas para a recuperação dos pastos degradados. Todavia, algumas dessas técnicas não mudam ou não solucionam as causas da degradação dos pastos, que são o manejo inadequado da lotação animal, a escolha da forragem utilizada e a fertilidade do solo, criando condições de respostas passageiras (Oliveira, 2007). Das técnicas mencionadas, as que realmente promovem a recuperação de pastagens com sustentabilidade são a recuperação direta e a intensificação dos sistemas produtivos, o uso de sistemas integrados (ILP, ILPF, IPF) e os consorciados com leguminosas.

MANEJO INTENSIVO DE PASTAGENS Além da degradação das pastagens, outro entrave técnico dos sistemas de produção a pasto é a sazonalidade da produção de forragem que ocasiona o vazio forrageiro na época seca do ano. Os sistemas de produção a pasto são dependentes de elevadas precipitações para que, juntamente com a luminosidade e temperatura, influenciem em maior solubilidade dos nutrientes no solo, favorecendo

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o crescimento foliar (Teixeira et al., 2011). Se considerado, por exemplo, a produção anual de forrageiras, cerca de 20% desse total ocorre durante o período da seca, ao passo que 80% da produção total ocorre durante as águas (Esteves et al., 1998). Tal constatação demonstra que é imprescindível que a pecuária de corte a pasto conduzida nos trópicos adote métodos mais intensivos de produção para amortizar essa deficiência quanto à disponibilidade de material verde durante o período da seca. Dentre as ferramentas que podem ser utilizadas com intuito de elevar a produtividade destacam-se a correção de solo, adubação, manejo adequado da planta forrageira, diferimento de pastagem, irrigação e adoção de suplementação proteica durante o período seco. Um dos grandes entraves na produção forrageira é adequar a fertilidade do solo à necessidade produtiva da forragem, e, portanto, a realização da calagem é de fundamental importância (Esteves et al., 1998; Oliveira et al., 2008). Segundo Oliveira et al., (2008) o uso de calagem em sistemas intensivos de manejo de pastagem em que se adota elevadas doses de fertilizante é imprescindível para maximizar a eficiência do uso dos nutrientes dos fertilizantes aplicados, além de ter papel importante quanto à reversão da acidificação dos solos ocasionado pelo uso de fertilizantes. Oliveira et al., (2007) demonstraram efeitos benéficos do uso da calagem com aumento da produção de forragem em sistema de pastejo intensivo de 9,7 para 11,3 de MS t/ha.ano-1. Tal efeito se deve à habilidade do calcário em corrigir o pH do solo e disponibilizar nutrientes para que sejam utilizados pelas plantas (Oliveira et al., 2008). A adubação com fontes de nitrogênio (N), fósforo, potássio, enxofre e micronutrientes são imprescindíveis para a manutenção da fertilidade do solo e para produção de massa forrageira. As forragens tropicais tendem a ser responsivas a elevadas doses de N, com aumentos significativos de produção forrageira (Esteves et al., 1998). Teixeira et al. (2011) mostraram que pastos formados com Brachiaria decumbens adubados com 100 kg ha-1 de N no final do verão apresentaram produção de 7.785 kg ha-1 de MS durante o diferimento de pastagem no outono, com valores médios de 9% de proteína bruta na MS. A rotação e o diferimento de pastagens tem sido estratégias que permitem uso racional do material forrageiro disponível. Porém, nem sempre estão associadas a ganhos médios diários (GMD) muito elevados (Silva et al., 2016; Euclides et al., 2018). Sugere-se que, associado ao diferimento e ao sistema de pastejo rotacionado, seja feito o uso de suplementação proteica como estratégia de intensificação durante a seca para que seja possível obter resultados de produtividade satisfatórios. Euclides et al. (2001) observaram redução de até 6 meses do tempo de abate de novilhos, F1 Angus-Nelore mantidos em pastagem formada com B. decumbens

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e recebendo suplementação, permitindo incremento nos valores médios de taxa de lotação, variando de 24 a 30%. Itavo et al. (2017) obtiveram GMD variando entre 0,680 e 0,760 kg/dia, para bovinos Nelore terminados em sistema de pastejo diferido na seca recebendo e com suplementação proteica. Em experimento conduzido em parceria com o grupo de pesquisa, Oliveira et al. (2018) avaliaram o desempenho de novilhas Nelore em sistemas intensificados em que foram adotados sistema de pastejo degradado (PD), pastejo irrigado com elevada taxa de lotação (PIEL), pastejo sequeiro com elevada taxa de lotação (PSEL) e pastejo sequeiro com moderada taxa de lotação (PSML). Estes demonstraram que a adoção de intensificação de pastejo promoveram resultados satisfatórios quanto ao desempenho animal (Tabela 3).

Tabela 3. Desempenho médio de bovinos Nelore submetidos a sistemas intensificados de manejo de pastagem.

PI: peso inicial; PF: peso final; TL: taxa de lotação; GMD: ganho médio diário; C: carcaça; EPM: erro padrão médio; ab: letras diferentes na mesma linha diferem entre si a P<0,05.

Oliveira et al. (2018) mostraram ainda que quanto maior o nível de intensificação adotado, maior foi a taxa de lotação. Resultados como estes reforçam a importância da adoção de técnicas e meios de intensificação que possibilitem maior produtividade em menor área e tempo útil. De fato, reflexos diretos da adoção de sistemas intensivos de pastagem podem ser analisados em aspectos que envolvem o componente ambiental desse sistema, uma vez que há uma maximização da área a ser utilizada, além da possibilidade de terminar mais precocemente o rebanho, implicando em menores custos e, consequentemente, em menor impacto de cunho ambiental diretos e indiretos. Em termos de emissões de GEE e balanço de C, Oliveira et al. (2019) demonstraram que os sistemas de produção PD, PIEL, PSEL e o PSML, apresentaram emissões anuais de GEE de 2,28; 10,43; 6,92 e 5,28 tCO2eq.ha-1 (±0,65; P<0,05) e balanço anual de -6,23; -13,40; 0,14 e 1.3 tCO2eq.ha-1 (±1,90; P<0,05), respectivamente, evidenciando que tanto no sistema degradado quanto no

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irrigado, o mais intensificado, as emissões de GEE foram maiores que as remoções (sequestro de C no solo). Comparando esses dois extremos de intensificação, como a produtividade de carcaça (kg/ha/ano) foi mais alta no sistema irrigado (570,6 kg/ha/ano) comparado ao degradado (124,6 kg/ha/ano), a intensidade de emissão por kg de carne foi menor no sistema irrigado (Corte et al., 2016).

SUPLEMENTAÇÃO PROTEICO-ENERGÉTICA A maior dificuldade para a produção de carne a pasto, em condições tropicais e subtropicais, é a ocorrência da estacionalidade de produção das plantas forrageiras. Isto reflete em oscilações na produtividade e na qualidade das forrageiras durante o ano (Manella, 2002). Desta forma, existe a necessidade da utilização de algumas estratégias para manter o desempenho de animais à pasto em um nível satisfatório, já que essas oscilações estacionais causam diminuição do consumo voluntário e na digestibilidade da dieta. Esses fatores reduzem o desempenho dos animais e contribuem para aumentar as emissões de metano entérico (Archimède et al., 2011), uma vez que a qualidade nutricional da planta diminui. Nessa situação, a suplementação proteico-energética pode resultar na ingestão de maior quantidade de matéria seca e maior eficiência na digestão (Neto, 2009). A suplementação com compostos nitrogenados, principalmente nas estações mais secas, busca aumentar o consumo de forragem, melhorar a degradação da parede celular e acelerar a passagem dos componentes indesejáveis da dieta pelo rúmen (Porto, 2011). Porém, o aumento no desempenho animal deve-se não só por meio do maior consumo de forragem, mas a mudanças na digestibilidade ou na eficiência de utilização dos nutrientes (Sampaio et al., 2009). A ureia é a principal fonte de nitrogênio não proteico (NNP) fornecida para os ruminantes. Porém, outras fontes de NNP pouco convencionais, as quais apresentam maior redução da emissão de GEE, estão sendo avaliadas para utilização comercial (Richardson et al., 2019). A ingestão de MS e a composição da dieta são de extrema importância para determinação da produção de CH4 no rúmen. Desta forma, a suplementação proteica nas dietas aumentou a digestibilidade dos nutrientes e diminuiu significativamente a produção de CH4 no rúmen (Mehra et al., 2006). A maneira mais eficaz de reduzir a emissão de metano por unidade de produto, seja na produção de carne, leiteira ou em taxas reprodutivas, é através da intensificação dos sistemas produtivos (Johnson et al., 2000). Assim, é possível afirmar que a utilização de proteico-energéticos, principalmente em períodos onde a pastagem apresenta um déficit de qualidade e quantidade, é uma estratégia interessante, tanto para melhorar a produtividade dos animais, quanto para mitigação de metano por kg de ganho em peso por área. Além

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desta estratégia é possível à adoção de outras ferramentas nutricionais, como o uso de aditivos moduladores da fermentação ruminal.

ADITIVOS ALIMENTARES COMO FERRAMENTA DE INTENSIFICAÇÃO E SUSTENTABILIDADE AMBIENTAL A utilização de aditivos manipuladores da fermentação ruminal está sendo cada vez mais empregada, visando principalmente aumentar a eficiência alimentar e a produtividade animal, reduzir as perdas durante a fermentação ruminal e minimizar o impacto ambiental da atividade agropecuária. Conforme mencionado anteriormente, a metanogênese apresenta relação direta com a eficiência da fermentação ruminal, podendo representar perdas de 2 a 12% da energia consumida pelos ruminantes (Morais et al., 2006). Dentre as alternativas para reduzir ou desviar a formação de CH4 ruminal, destacam-se aditivos que apresentam ação direta sobre os microrganismos metanogênicos e/ou produtores de H2, aditivos que inibam reações que liberem H2 no ambiente ruminal ou por meio de aditivos que promovam reações alternativas que consomem H2 (Beach et al., 2015). Neste sentido, uma grande variedade de aditivos alimentares podem ser utilizados para manipular o ambiente ruminal. No entanto, a utilização de tais aditivos depende da correta ingestão da dose diária, o que é facilitado, em condições de pastejo, pela suplementação proteico energética, a qual estimula o consumo diário do suplemento e desta forma facilita a ingestão correta do aditivo pelo animal (Garcia, 2014). Dentre os aditivos que manipulam a fermentação ruminal por ação direta sobre os microrganismos produtores de H2, destacam-se os ionóforos que podem reduzir a produção de metano em até 25% (Tedeschi et al., 2003). Estes aditivos afetam o crescimento de bactérias produtoras de H2 no rúmen e acabam favorecendo, por diminuição da competição pelo substrato, o crescimento das bactérias que sequestram H2 para a produção de propionato (Morais et al., 2006). A utilização de tais aditivos em condições de pastejo podem incrementar a IMS em até 15% e aumentar o GMD em 16% (Potter et al., 1974).Dentre os aditivos que promovem reações que consomem H2, destacam-se os nitratos, por serem receptores de elétrons, atuam como inibidores da metanogênese ruminal, uma vez que, dentro do rúmen, o nitrato (NO3-) é reduzido a nitrito (NO2-), que por sua vez é convertido a amônia (NH3), consumindo 8H+ (Leng & Preston, 2010) e auxiliando na redução de até 32% do CH4 em experimentos in vitro (Van Zijderveld et al., 2010). Tal aditivo se mostra especialmente promissor por se caracterizar sobretudo como fonte de NNP, podendo ser utilizado em substituição à

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ureia ou em associação, principalmente no período seco do ano, trazendo múltiplos benefícios ao sistema de produção. Diante do exposto, este grupo de pesquisa testou ao longo dos últimos anos o efeito dos aditivos mencionados, sendo os dados apresentados na tabela 4. Tabela 4. Efeito dos aditivos monensina sódica e nitrato de cálcio sobre a fermentação ruminal de bovinos.

abc: letras diferentes na mesma linha diferem entre si a 5%.

A adição de monensina proporcionou resultados variáveis na produção de CH4 ruminal, indicando desde elevação de 12,69% (Escribano, 2018), manutenção dos níveis de produção (Sene et al., 2019), até reduções de 9,66 e 10,66% obtidas por Assumpção et.al. (2019) e Perna Jr et al. (2017) respectivamente, além de proporcionar aumento de 39,4% na produção de ácido propiônico (Perna Jr et al. 2017), enquanto os demais trabalhos não observaram efeito da monensina sobre a produção de AGCC. Já a utilização de nitrato de cálcio proporcionou reduções acentuadas de 18,37% e 19,89% na produção de CH4 ruminal, as quais foram observadas por Escribano (2018) e Assumpção et. al. (2019), respectivamente. No

285

entanto, enquanto Assumpção et al. (2019) não observaram alterações na produção de AGCC, Escribano (2018) observou uma redução de 17,10% na produção de ácido butírico.

CONSIDERAÇÕES FINAIS A utilização de diferentes ferramentas com a intenção de melhorar a eficiência da produção animal traz grande avanço à bovinocultura, contribuindo para a desmitificação que engloba este segmento. Portanto, com simples práticas de manejo e bom planejamento do sistema de produção a ser utilizado, pode-se obter bons resultados produtivos com reduzido ou nulo impacto ambiental, principalmente no Brasil onde a bovinocultura é baseada no uso de pastagens.

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CAPÍTULO XIIIÁCIDOS ORGÂNICOS NA DIETA DE VACAS EM LACTAÇÃO

Mauro Sérgio da Silva Dias1*, Larissa Schneider Gheller1, Guilherme Gomes

da Silva1, Lucas Ghedin Ghizzi1, Nathália Trevisan Scognamiglio Grigoletto1,

Tássia Barrera de Paula e Silva1, Alanne Tenório Nunes1, Rodrigo Garavaglia

Chesini1, Paulo César Vittorazzi Júnior1, Paula de Freitas Curti1, Francisco

Palma Rennó1

¹Departamento de Nutrição e Produção Animal – VNP, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ/USP.*mauro.dias@usp.br#francisco.renno@usp.br

RESUMOConsiderando que a produtividade de vacas leiteiras está diretamente relacionada à qualidade do alimento consumido, tem-se estudado a utilização de aditivos capazes de evitar perdas nutricionais dos alimentos, possibilitando o aumento da eficiência produtiva. Nesse cenário, a utilização de aditivos capazes de conservar os alimentos, como é o caso dos ácidos orgânicos (ACO), tem recebido destaque na nutrição de ruminantes. Em estudo desenvolvido no Laboratório de Pesquisa de Bovinos de Leite (LPBL) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, foi avaliada a utilização de conservantes contendo ácidos orgânicos na TMR sobre o consumo e digestibilidade aparente total dos nutrientes, índice de seleção alimentar, fermentação ruminal, produção e composição do leite, balanço de nitrogênio, síntese de proteína microbiana, perfil metabólico, comportamento alimentar e temperatura da TMR. Foi observado que ácidos orgânicos aumentaram o consumo de matéria seca (MS; 23,6 e 24,4 kg / d para ACO) e reduziram a seleção de partículas entre 8-19 mm e menores que 4 mm. Os ACO, no entanto, diminuíram a concentração total de ácidos graxos voláteis (AGV) e aumentaram o pH do líquido ruminal. Vacas alimentadas com ACO na TMR tiveram maior produção de leite corrigida (PLC) pela gordura e teor de proteína do leite em comparação com o controle. Além disso, ácidos orgânicos retardaram o aumento da temperatura da TMR. Ácidos orgânicos, independentemente de sua composição, podem melhorar a estabilidade da TMR e o desempenho de vacas leiteiras. Recentemente, o grupo de pesquisa do LPBL avaliou o efeito do uso de ácidos orgânicos na dieta completa

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e frequência de alimentação sobre o desempenho produtivo de vacas em lactação. Palavras-chave: ácidos orgânicos, conservação de alimentos, desempenho produtivo, deterioração de alimentos.

INTRODUÇÃO O desempenho produtivo de vacas em lactação está diretamente relacionada à quantidade e qualidade do alimento consumido, portanto, para que suas exigências nutricionais sejam atendidas é de fundamental importância que recebam alimentos de excelente qualidade (NRC, 2001). A produção e o fornecimento de alimentos para vacas leiteiras está cada vez mais criterioso para que o alimento produzido seja de boa qualidade mantendo adequados valores nutritivos (Schingoethe, 2017). Sendo assim, mudanças na forma de fornecimento e utilização de novos aditivos estão sendo avaliadas, buscando-se evitar perdas nutricionais dos alimentos e, consequentemente, melhorar a eficiência produtiva (Chen et al., 2017). Como a produtividade dos animais está diretamente relacionada com a qualidade do alimento que é fornecido (Bernardes et al., 2018), minimizar perdas nutricionais ocasionadas pela deterioração dos alimentos em decorrência da multiplicação microbiana pode permitir aumento na eficiência produtiva em vacas leiteiras (Ashbell et al., 2002). Uma das alternativas estudadas e estabelecidas no início da década de 60 é o fornecimento do volumoso e o concentrado na forma de dieta total (TMR), que foi associada com aumento na produção de leite, ingestão de matéria seca e teor de gordura no leite (Mccoy et al., 1966; Schingoethe, 2017, NRC, 2001). Com a utilização de TMR, espera-se que o fluxo de chegada dos nutrientes ao trato digestório dos animais seja homogêneo ao longo do dia, evitando quedas acentuadas no pH ruminal, sincronizando a disponibilidade de nutrientes e maximizando o aproveitamento dos alimentos ingeridos (Devries et al., 2005). Neste sentido, a qualidade do alimento, forma de armazenamento e fornecimento pode influenciar os nutrientes que serão ingeridos pelos animais até a chegada ao trato digestório. A variação da temperatura do ambiente pode interferir na qualidade nutricional do alimento, fazendo com que haja perda da estabilidade aeróbica favorecendo o aquecimento, que pode estar associado à multiplicação microbiana no mesmo, intensificando o processo de deterioração (Ashbell et al., 2002). A deterioração da TMR quando exposta ao ar é inevitável e se deve principalmente à ação de fungos, leveduras e algumas bactérias que metabolizam o ácido lático, o qual é degradado em dióxido de carbono e água, resultando em excessiva produção de calor e perdas de nutrientes. Aliado a isso, ocorre perda de

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nutrientes e efeitos negativos sobre o desempenho dos animais (Woolford, 1990; Taylor et al., 2002; Pahlow et al., 2003; Kung Jr, 2010). A partir do momento em que a TMR é exposta ao ar e se inicia o processo de deterioração, ocorre uma “taxa de aquecimento” mais rápida. Atualmente, a utilização de aditivos para conservação de alimentos durante o fornecimento, como, por exemplo, ácidos orgânicos, tem recebido destaque e interesse nas pesquisas por reduzir processos de deterioração, com fortes propriedades antifúngicas (Auerbach, 1996), assegurando melhora na estabilidade aeróbica, reduzindo a proliferação de microrganismos e produção de toxinas (Auerbach et al., 2012). Os aditivos utilizados em silagens são adicionados com objetivo de garantir rápida produção de ácido lático e diminuição do pH, de maneira a ser evitada a fermentação por clostridios e reduzir populações de leveduras, a fim de melhorar a estabilidade aeróbica da silagem e o desempenho dos animais (Badhan et al., 2014; Raffrenato et al., 2017). Os ácidos orgânicos têm sido utilizados comercialmente com a finalidade de maximizar a atividade inibitória sobre a ação de microrganismos indesejáveis (Muck et al., 2018), pois possuem capacidade de conservação de grãos, forragens e rações durante o armazenamento e de melhoria na estabilidade aeróbica da TMR. Quando os ácidos orgânicos são adicionados à TMR, podem atuar controlando o aumento da temperatura dos alimentos fornecidos às vacas e inibir a multiplicação de microrganismos indesejáveis capazes de alterar as características físicas e sensoriais dos alimentos. Dessa forma, as vacas podem ter acesso a dieta com alimentos frescos ao longo do dia, o que pode favorecer a atratividade das vacas pelo alimento e a garantir a ingestão de alimentos não deteriorados (Kung, Jr. et al., 1998). A adição desses produtos tem como objetivo conservar as características dos alimentos melhorando a estabilidade aeróbica; sua atuação ocorre na forma não dissociada, inibindo diretamente a ação de leveduras e bolores (Kung, Jr. et al., 1998). Os ácidos orgânicos são classificados de acordo com o tipo de cadeia de carbono (alifático, alicíclico, aromático e heterocíclico), tipo de insaturação (saturada e insaturada), e número de grupos funcionais (monocarboxílico, dicarboxílico). São compostos orgânicos com propriedades ácidas caracterizadas por um grupo carboxila (-COOH), que em sua estrutura química é composta de carbono (Quitmann et al., 2014). Devido ao seu alto poder de conservação e de inibição da multiplicação microbiana (Zaki et al., 2015); Mohan; Pohlman, 2016), os ácidos orgânicos têm sido amplamente utilizados na indústria alimentícia como aditivos alimentares e conservantes para evitar a deterioração e prolongar a vida útil dos alimentos (Cheng, 2010; Jurado-Sánchez et al., 2011).

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Além da atividade antimicrobiana, os ácidos orgânicos também atuam reduzindo o pH dos alimentos tendo a capacidade de inibir o crescimento bacteriano (Dziezak, 1990; Kleinschmit et al., 2005; Queiroz et al., 2013). A sua ação é pela forma não dissociada, que é capaz de atravessar a membrana da célula e liberar H+, acidificando o citoplasma e promovendo a inibição da multiplicação dos microrganismos, minimizando a ocorrência de processos relacionados à deterioração dos alimentos (Auerbach et al., 2012; Hinton Jr, 2006). De acordo com Lambert & Stratford (1999), o que faz com que a célula reduza seu tamanho ou pare de crescer, é a redução do pH citoplasmático ou o uso de ATP para resistir ao declínio do pH e manter a homeostase. Dentre os ácidos orgânicos conhecidos, todos atuam como agentes conservantes químicos devido ao amplo espectro de atividades antimicrobianas e enzimáticas, tais como os ácidos: benzoico, fórmico, propiônico e sórbico (Brul; Coote, 1999; Theron; Lues, 2007; Anyasi et al., 2015).

USO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NA NUTRIÇÃO DE RUMINANTES: RESULTADOS DE PESQUISAS De modo geral, os ácidos orgânicos foram utilizados com o objetivo de inibir o crescimento fúngico, no entanto, sua utilização baseia-se na conservação de alimentos protegendo-os da deterioração por microrganismos, aumentando assim a conservação e durabilidade (Haque et al., 2009). Kung & Muck (1997) afirmam que a utilização de ácidos orgânicos em silagens melhora a conservação dos nutrientes, prolonga a estabilidade aeróbica e melhora o desempenho animal. A utilização dos aditivos na silagem tem por objetivo geral inibir o crescimento de microrganismos indesejáveis, evitando a deterioração dos alimentos minimizando as perdas de nutrientes e energia (Seppälä et al., 2016). Kung, Jr. et al. (1998) estudaram os efeitos da adição de conservantes comerciais na TMR e não observaram nenhuma alteração em relação ao desempenho das vacas leiteiras. No entanto, a utilização de ácidos orgânicos diretamente na TMR de vacas em lactação foi eficaz na prevenção do aumento do pH e temperatura da TMR após 24 horas no cocho devido à sua forte propriedade antifúngica, assegurando sua estabilidade aeróbica e reduzindo a proliferação de microrganismos e a produção de toxinas (Kung, Jr. et al. 1998). Segundo o estudo de Felton & Devries (2010), o aumento da temperatura dos alimentos horas após o fornecimento da alimentação foi maior em ambientes com temperaturas mais altas, podendo ser indicativo de deterioração dos alimentos no cocho, o que pode resultar em redução do consumo de matéria seca pelos animais, de forma a ser destacada a importância de se tentar reduzir ou inibir o aumento temperatura da TMR.

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USO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NA NUTRIÇÃO DE RUMINANTES: RESULTADOS DE PESQUISAS DO LABORATÓRIO DE PESQUISA EM BOVINOS DE LEITE (LPBL -FMVZ/USP) Recentemente dois projetos de pesquisa foram desenvolvidos em nosso grupo de pesquisa. O primeiro projeto de pesquisa foi desenvolvido Gueller (2019), dando origem ao artigo Gheller et al. (2019), que avaliaram a adição de formulações diferentes de ácidos orgânicos na dieta de vacas em lactação. O segundo projeto de pesquisa foi desenvolvido por Dias et al. (2019) (dados em análise), e avaliaram os efeitos da adição de ácidos orgânicos na dieta associada a diferentes frequências de alimentação sobre o desempenho produtivo de vacas em lactação.

ADIÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NA DIETA DE VACAS EM LACTAÇÃO Avaliou-se a adição de ácidos orgânicos junto à TMR de vacas em lactação (Gheller et al., 2019). Vinte e cinco vacas da raça Holandesa foram utilizadas, sendo dez delas canuladas no rúmen, com 147,4 ± 87,9 de dias em lactação (DEL), 668,7 ± 78,5 kg de peso corporal (PC) e 34,4 ± 4,2 kg de leite/dia (média ± DP) no início do experimento. As vacas foram distribuídas em cinco quadrados latinos 5x5 de acordo com a produção de leite, dias em lactação, peso corporal e presença/ausência de cânula ruminal. Todas as vacas receberam a mesma dieta experimental (relação concentrado:volumoso de 52:48), servida na forma de TMR e formulada de acordo com as recomendações propostas pelo NRC (2001) para vacas em lactação, com 52 meses de idade, 620 kg de peso corpóreo, 3,5% de gordura no leite, 140 dias em lactação, 35 kg/d de produção diária de leite e 3,3% de proteína no leite (Tabela 1). As vacas foram distribuídas aleatoriamente para os seguintes tratamentos: (1) controle, sem adição de aditivos (CON); (2) ProMyr TMR Special® (SP); (3) ProMyr TMR Solid® (SO); (4) ProMyr TMR Performance® (P); (5) ProMyr TMR Flexible® (F; Tabela 2; Perstorp Waspik BV, Waspik, Holanda). Para os aditivos líquidos (Tratamentos 2, 4 e 5) foi utilizada a dose de 4 mL/kg de matéria natural (MN), enquanto que para o sólido (Tratamento 3) foi utilizada dose de 4 g/kg de MN. Diariamente, a dose do aditivo foi ajustada de acordo com o consumo do dia anterior, e misturada manualmente junto à TMR antes do fornecimento aos animais, de manhã e à tarde.

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Tabela 1. Ingredientes e composição da dieta experimental.

1Composição bromatológica média durante período experimental: 30,0 % MS, 7,2 % PB, 2,2 % EE, 51,1 % FDN, 34,0 % FDA, 36,0 % CNF e 62,9 % de NDT;2 Farelo de soja Bypass (Soypass®, Cargill, Uberlândia, Brasil); 3 Cada kg continha: 235 g de Ca, 60 g de P, 20 g de Mg, 70 g de Na, 20g S, 15 mg de Co, 700 mg de Cu, 10 mg de Cr, 40 mg de I, 600 mg de Fl, 1600 mg de Mn, 20 mg de Se, 2500 mg de Zn, 200000 UI de Vitamina A, 50000 UI de Vitamina D3, e 1500 UI de Vitamina E;4 Estimado segundo Hall (2000);5 Proteína indigestível em detergente neutro; 6 Proteína indigestível em detergente ácido.

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Tabela 2. Composição dos ácidos orgânicos.

Os dados foram analisados utilizando o PROC MIXED do SAS 9.3 (SAS Institute, Cary, NC). As diferenças entre os tratamentos foram analisadas de acordo com contrates ortogonais: C1: efeito da adição de ACO [controle vs tratamentos (SP + SO + P + F)]; C2: efeito do ACO utilizado [ácido fórmico (F + SO) vs ácido propiônico (P + SP)]; C3: efeito da adição de ácido fórmico (F vs SO); C4: efeito da adição de ácido propiônico (SP vs P). O nível de significância foi considerado quando P ≤ 0,05 e tendência quando 0,05 ≥ P ≤ 0,10. A produção de leite (kg/dia), teor de gordura do leite, nitrogênio ureico no leite e a eficiência produtiva não foram influenciadas (P=0,104; Tabela 3) pela adição de ácidos orgânicos na TMR. A utilização de ácidos orgânicos na TMR aumentou (P ≤ 0,046) a produção corrigida para 3,5% de gordura e o teor de proteína do leite. Além disso, a adição de ácidos orgânicos tendeu a aumentar (P ≤ 0,081) a produção de gordura, proteína e o teor de lactose no leite. A adição de ácidos orgânicos na dieta de vacas em lactação tendeu a aumentar (P=0,093; Tabela 4) o consumo de nitrogênio (g / d). Além disso, não houve nenhuma alteração (P ≥ 0,191) em relação à excreção de nitrogênio fecal, urinário e do leite. Não foram encontradas alterações (P ≥ 0,203) no balanço de nitrogênio e na síntese de proteína microbiana.

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Tabela 3. Produção e composição do leite, nitrogênio ureico do leite e eficiência produtiva de vacas em lactação alimentadas com adição de ácidos orgânicos na TMR.

1 CO: Controle; F: Flexible; SO: Solid; SP: Special, e P: Performance. 2 Erro padrão da média. 3 Probabilidades para efeitos de tratamento utilizando contrastes ortogonais: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3: ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (SP) vs ácido propiônico 2 (P). 4 Produção de leite corrigida para 3,5% de gordura. 5 Nitrogênio ureico do leite. 6Relação entre produção de leite e consumo de matéria seca. 7 Relação entre PLC a 3,5% e consumo de matéria seca.

Foi observado maior consumo de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO) e carboidratos não fibrosos (CNF) para as vacas que receberam ácidos orgânicos no TMR (P ≤ 0,039; Tabela 5), enquanto que foi observada tendência de aumento do consumo de proteína bruta (PB) (P= 0,094), sem, no entanto, afetar o consumo de extrato etéreo (EE) (P=0,179). Foi observado aumento (P ≤ 0,028) do consumo de MS e fibra em detergente neutro (FDN) em relação ao peso corporal dos animais. Em relação à digestibilidade dos nutrientes, a adição de ácidos orgânicos não demonstrou nenhum efeito (P ≥ 0,496; Tabela 5). Ao receber ácidos orgânicos na dieta os animais diminuíram (P ≤ 0,028) a seleção de partículas de alimentos entre 8 – 19 mm e aquelas menores que 4 mm. Além disso, a adição de ácido fórmico tendeu a reduzir (P ≤ 0,069) a seleção de partículas entre 8 – 19 mm e menores que 4 mm. O tratamento contendo ácido hexanoico (P) tendeu a diminuir (P=0,082) a seleção de pequenas partículas (<4 mm) em relação àquele que apresentava maior quantidade de ácido propiônico (SP).

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Tabela 5. Consumo de matéria seca e nutrientes, digestibilidade aparente total, e índice de seleção de vacas em lactação alimentadas com adição de ácidos orgânicos na TMR.

1CO: Controle; F: Flexible; SO: Solid; SP: Special, e P: Performance. 2 Erro padrão da média. 3 Probabilidades para efeitos de tratamento utilizando contrastes ortogonais: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3: ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (SP) vs ácido propiônico 2 (P). 4 Carboidratos não-fibrosos. 5 Fibra em detergente neutro. 6 Relação entre consumo de matéria seca e peso corporal.7 Relação entre consumo de fibra em detergente neutro e peso corporal.

A adição de ácidos orgânicos na TMR diminuiu (P=0,038; Tabela 6) a concentração ruminal de acetato e tendeu a diminuir (P=0,061) a concentração total de AGV no rúmen, elevando (P=0,016; Figura 1) o pH ruminal. A adição de ácidos orgânicos que continham maior proporção de ácido propiônico (SP e P) aumentou (P = 0,041) a concentração de propionato ruminal e diminuiu (P ≤ 0,001) a relação acetato: propionato.

Tabela 6. Perfil de ácidos graxos voláteis (AGV) ruminais, pH e concentração de NH3-N em vacas leiteiras em lactação alimentadas com adição de ácidos orgânicos na TMR.

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1CO: Controle; F: Flexible; SO: Solid; SP: Special, e P: Performance. 2 Erro padrão da média. 3 Probabilidades para efeito de tratamento (TRAT), tempo (TEMPO), interação TRAT x TEMPO, contrastes ortogonais: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3: ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (SP) vs ácido propiônico 2 (P). 4 Ácidos graxos de cadeia ramificada.5 Nitrogênio amoniacal. 6 Relação acetato:propionato. Todas as variáveis tiveram efeito de tempo <0,001 e não teve nenhum efeito de interação <0,005.

Figura 1. Efeito da adição de ácidos orgânicos sobre o pH ruminal.Contrastes: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (FL +SO) vs ácido propiônico (PF + SP); C3:ácido fórmico 1 (FL) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (PF) vs ácido propiônico (SP).Probabilidades (P): Tempo: P = < 0,001; Tratamento vs Tempo: P = 0,888; C1: P = 0,016; C2: P = 0,294; C3: P = 0,646, e C4: P = 0,663.

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Em relação ao comportamento alimentar as vacas que receberam ácidos orgânicos na sua dieta apresentaram tendência a aumentar (P = 0,083; Tabela 7) o tempo de ócio. A adição de ácido propiônico na TMR de vacas em lactação aumentou (P = 0,040) o tempo de descanso das vacas em relação àquelas que receberam ácido fórmico na TMR. Não houve alterações pela adição de ácidos orgânicos na TMR sobre as atividades de beber, comer e ruminação (P ≥ 0,148). A adição de ácidos orgânicos na TMR foi capaz de manter (P=0,003; Tabela 8) a temperatura da TMR estável por mais tempo em relação à TMR que não recebeu adição de ácidos orgânicos (figura 2).

Tabela 7. Comportamento alimentar de vacas em lactação alimentadas com adição de ácidos orgânicos na TMR.

1CO: Controle; F: Flexible; SO: Solid; SP: Special, e P: Performance. 2Erro padrão da média. 3Probabilidades para efeitos de tratamento utilizando contrastes ortogonais: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3: ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (SP) vs ácido propiônico 2 (P). 4Ócio = 24 h – (água + comendo + ordenha). 5Mastigação = comendo + ruminando.

Tabela 8. Temperatura média da TMR adicionada de ácidos orgânicos.

1CO: Controle; F: Flexible; SO: Solid; SP: Special, e P: Performance. 2Erro padrão da média. 3Probabilidades para efeitos de tratamento utilizando contrastes ortogonais: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3: ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (SP) vs ácido propiônico 2 (P).

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Figura 2. Variação da temperatura da TMR adicionada de ácidos orgânicos ao longo de 24 h exposta ao ar.Probabilidades (P): Tempo: P = < 0,001; Tratamento vs Tempo: P = < 0,001; C1: P = 0,003; C2: P = 0,638; C3: P = 0,184, e C4: P = 0,253;Contrastes: C1: controle vs ácidos orgânicos; C2: ácido fórmico (F +SO) vs ácido propiônico (P + SP); C3:ácido fórmico 1 (F) vs ácido fórmico 2 (SO); C4: ácido propiônico 1 (P) vs ácido propiônico (SP).

EFEITOS DA ADIÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS NA DIETA COMPLETA E FREQUÊNCIA DE ALIMENTAÇÃO SOBRE O DESEMPENHO PRODUTIVO DE VACAS EM LACTAÇÃO Recentemente em nosso grupo de pesquisa, Dias et al. (2019) desenvolveu projeto de pesquisa sobre o uso de ácidos orgânicos (Mold-Zap®, AllTech Inc.®, Knoxville, KY, EUA) na dieta completa associado a diferentes frequências de alimentação sobre o desempenho produtivo de vacas em lactação (Dados parciais).Foram utilizadas 24 vacas da raça Holandesa em lactação, sendo 4 delas canuladas no rúmen, com 247±109 (média ± desvio padrão) dias em lactação (DEL), 672±71,6 kg de peso corporal (PC) e 31,1±5,37 kg de produção diária de leite (PL). As vacas foram alojadas em estábulo tipo “free-stall”, em baias individuais com 17,5 m2, contendo cama de areia, ventilação forçada e livre acesso a água e alimentos.

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A hipótese do estudo é que a utilização de ácidos orgânicos adicionado diretamente à dieta total seja capaz de minimizar a deterioração dos alimentos e permitam reduzir a frequência de fornecimento da dieta total, podendo influenciar positivamente o desempenho produtivo de vacas em lactação. O delineamento experimental utilizado foi em quadrados latinos replicados, balanceados e contemporâneos. De acordo com a produção de leite, dias em lactação e parição, as vacas foram distribuídas em 6 quadrados latino 4 x 4, seguindo esquema fatorial 2 x 2 e atribuídas aleatoriamente a uma das quatro sequências de tratamentos, sendo elas: 1) controle 1 (CO1), dieta basal, ofertada uma vez ao dia, pela manhã; 2) Ácidos orgânicos (Mold-Zap®) 1, (MZ1), dieta basal associada aos ácidos orgânicos (Mold-Zap®), ofertada uma vez ao dia, pela manhã; 3) controle 2 (CO2), dieta basal, ofertada duas vezes ao dia, pela manhã e no início da tarde; e 4) Ácidos orgânicos (Mold-Zap®) 2, (MZ2), dieta basal associada aos ácidos orgânicos (Mold-Zap®), ofertada duas vezes ao dia, pela manhã e no início da tarde. Os ácidos orgânicos (Mold-Zap®) foram adicionados manualmente na dieta total, imediatamente após ser ofertada no cocho, diluídos em 10% de água destilada diariamente nos tratamentos (MZ1) e (MZ2), na dose de 500 mL da solução de ácidos orgânicos (Mold-Zap®) a 10% para cada 100 kg de matéria natural (MN) ofertada. Já os tratamentos (CO1) e (CO2) receberam solução placebo de água destilada equivalente ao volume do aditivo ofertado. O aditivo utilizado apresenta em sua composição o ácido propiônico (55%) e o hidróxido de amônia (12%) como ingredientes ativos. O alimento foi oferecido uma ou duas vezes ao dia, de acordo com o tratamento definido, somente às 07h00 ou às 07h00 e às 13h00. O consumo de matéria seca foi registrado e a oferta ajustada diariamente visando manter a porcentagem de sobras entre 5 e 10% da quantidade total de MN ofertada. A dieta total foi fornecida de maneira manual, da mesma maneira foram adicionados os ácidos orgânicos (Mold-Zap®) nos tratamentos (MZ1) e (MZ2) e a água destilada nos tratamentos (CO1) e (CO2) e misturados manualmente. Além disso, foi realizada re-mistura dos alimentos presentes no cocho de forma manual, todos os dias, às 13h00, e no final da tarde, às 17h00. Todos os animais foram ordenhados mecanicamente às 06h00 e às 16h00. A dieta experimental foi formulada de acordo com as recomendações do NRC (2001), tabela 9, na proporção volumoso:concentrado de 48:52, preparadas individualmente e fornecidas manualmente na forma de dieta total. Cada período experimental teve duração de 21 dias, sendo 14 dias destinados à adaptação aos tratamentos e 7 dias às coletas de dados e amostras. As análises bromatológicas e de composição do leite foram realizadas no Laboratório de Bromatologia do LPBL. As demais análises serão realizadas nas dependências

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do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia Animal (LBFA) do Departamento de Nutrição e Produção Animal (VNP). Os dados foram submetidos à análise de variância utilizando o PROC MIXED SAS 9.4 (Statistical Analysis for Windows - Institute Inc., Cary, NC, EUA). O nível de significância foi estabelecido em P ≤ 0,05 e a tendência foi considerada 0,05 <P ≤ 0,10.

Tabela 9. Ingredientes e composição química estimada da dieta experimental.

mg F, 40mg I, 20g Mg, 1600mg Mn, 20mg Se, 70g Na, 200000 UI Vit A, 50000 UI Vit D3, 1500 UI Vit E, 2500 mg Zn. 2Estimado pelo modelo NRC (2001), para vacas em lactação, 52 meses de idade, 620 kg de peso corpóreo, 3,5% de gordura no leite, 220 dias em lactação, 35,0 kg/d de produção diária de leite e 2,98% de proteína verdadeira no leite.

Como resultados parciais deste experimento, foi observado que a produção de leite, e a produção de proteína e lactose no leite aumentaram (P<0,005; Tabela 10) com a presença de ácidos orgânicos nas dietas. Também, a utilização de ácidos orgânicos resultou em tendência de aumento na produção de leite corrigida para 3,5 % de gordura (P=0,078). Entretanto, não foram observados efeitos dos ácidos orgânicos na ingestão de matéria seca, eficiência produtiva e teor de gordura, proteína e lactose no leite. A frequência de alimentação não teve efeito em nenhuma variável avaliada.

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Tabela 10. Consumo de matéria seca, produção e composição do leite e eficiência produtiva de vacas leiteiras alimentadas com ácido orgânico para evitar o calor da TMR e diferentes frequências alimentares.

Ácidos orgânicos nas dietas. 2Mold: efeito de ácidos orgânicos; Trato: efeito da frequência de alimentação; Int: interação entre ácidos orgânicos e frequência de alimentação.

CONSIDERAÇÕES FINAIS O fornecimento de alimentos na forma de dieta total ou completa é método consolidado para fornecimento de volumoso e concentrado de maneira homogênea para vacas em lactação. A utilização de ácidos orgânicos apresentou resultados promissores, pois ficou demonstrado que pode ser maneira eficaz de controlar a deterioração e aumento da temperatura dos alimentos, podendo resultar em melhorias no desempenho produtivo de vacas em lactação.

AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Laboratório de Pesquisa em Bovinos de Leite (LPBL) do Departamento de Produção e Nutrição Animal (VNP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ USP) pela infraestrutura fornecida às pesquisas e pela equipe de funcionários, estagiários, alunos de graduação e pós-graduação. Ainda, agradecemos pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), da

310

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), da AllTech Inc.® (Knoxville, KY, EUA) e da Perstorp Animal Nutrition (Waspik BV, Waspik, Holanda).

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CAPÍTULO XIVFERRAMENTAS DE VISUALIZAÇÃO PARA VALIDAÇÃO DE DADOS

GENÔMICOS SIMULADOS

Lucas Tassoni Andrietta ², Wecksley Leonardo de Souza ¹, Diógenes Lodi

Pinto¹, Júlio César de Carvalho Balieiro ¹, Lígia Garcia Mesquita ¹, Ricardo

Vieira Ventura ¹

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga – SP.²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga – SP

RESUMOO crescente volume de dados oriundos de avaliações genômicas implicam na necessidade de desenvolvimento e implementação de ferramentas que permitam a visualização de conjuntos de dados densos e complexos, de forma eficiente e como resultado de um processo em tempo real. O objetivo do presente capítulo é apresentar sugestões de ferramentas visuais que poderiam ser utilizadas para fins de validação de dados genômicos, gerados por meio de simulação, técnica amplamente utilizada em estudos na área de Melhoramento Genético Animal. Genótipos, fenótipos e estrutura populacional completa foram simulados de forma a mimetizar três grupos genéticos via software QMSim. A principal metodologia de validação dos resultados baseou-se na compreensão do desequilíbrio de ligação (LD), abordagem convencional em estudos relacionados a dados genômicos. Considerou-se nesta abordagem decréscimo médio do LD, e uso estudo de metodologias de agrupamento para o controle de qualidade. Adicionalmente, análises de componentes principais (PCA) foram realizadas para avaliar para estratificação populacional e identificar os grupamentos genéticos criados via simulação. Como passo complementar, procedeu-se com o estudo de Admixture (nível de mistura) da população, de forma a verificar a existência de populações e subpopulações, conforme planejado no processo de simulação. Diferentes estratégias de visualização são demonstradas no presente estudo, permitiram a compreensão e validação dos dados simulados. Recomenda-se a aplicação destes procedimentos em estudos que envolvam simultaneamente, genótipos de animais de diferentes grupos genéticos e animais oriundo de cruzamentos para serem avaliados.

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CAPÍTULO XIVFERRAMENTAS DE VISUALIZAÇÃO PARA VALIDAÇÃO DE DADOS

GENÔMICOS SIMULADOS

Lucas Tassoni Andrietta ², Wecksley Leonardo de Souza ¹,

Diógenes Lodi Pinto ¹, Júlio César de Carvalho Balieiro ¹,

Lígia Garcia Mesquita ¹, Ricardo Vieira Ventura ¹

¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga – SP.²Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga – SP

RESUMOO crescente volume de dados oriundos de avaliações genômicas implicam na necessidade de desenvolvimento e implementação de ferramentas que permitam a visualização de conjuntos de dados densos e complexos, de forma eficiente e como resultado de um processo em tempo real. O objetivo do presente capítulo é apresentar sugestões de ferramentas visuais que poderiam ser utilizadas para fins de validação de dados genômicos, gerados por meio de simulação, técnica amplamente utilizada em estudos na área de Melhoramento Genético Animal. Genótipos, fenótipos e estrutura populacional completa foram simulados de forma a mimetizar três grupos genéticos via software QMSim. A principal metodologia de validação dos resultados baseou-se na compreensão do desequilíbrio de ligação (LD), abordagem convencional em estudos relacionados a dados genômicos. Considerou-se nesta abordagem decréscimo médio do LD, e uso estudo de metodologias de agrupamento para o controle de qualidade. Adicionalmente, análises de componentes principais (PCA) foram realizadas para avaliar para estratificação populacional e identificar os grupamentos genéticos criados via simulação. Como passo complementar, procedeu-se com o estudo de Admixture (nível de mistura) da população, de forma a verificar a existência de populações e subpopulações, conforme planejado no processo de simulação. Diferentes estratégias de visualização são demonstradas no presente estudo, permitiram a compreensão e validação dos dados simulados. Recomenda-se a aplicação destes procedimentos em estudos que envolvam simultaneamente, genótipos de animais de diferentes grupos genéticos e animais oriundo de cruzamentos para serem avaliados.

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INTRODUÇÃO O crescente aumento no volume de dados, proporcionado pelo uso de diferentes tecnologias ômicas, têm acarretado em novas possibilidades investigativas na área do Melhoramento Genético Animal. Porém, devido à dimensão dos datasets gerados, em decorrência da heterogeneidade e complexidade de informações, metodologias de estatística descritiva anteriormente empregadas, não são suficientes para compreensão fidedigna do conteúdo sob análise. Portanto, o desenvolvimento e emprego de novas abordagens, com intuito de auxiliar na compreensão da estrutura dos dados, tornam-se necessárias (Wijk, 2005). Como complemento à metodologia usual, buscando aumentar o entendimento de um conjunto de informações, considera-se a visualização de dados como ferramenta crucial na compreensão e interpretação dos resultados obtidos, além de ser também categorizada como método de análise. Datasets distintos podem apresentar propriedades estatísticas semelhantes via análises exploratórias simplificadas, porém, apresentar dissimilaridades notórias quando comparados visualmente, o que justifica a importância em se empregar abordagens envolvendo análise visual (Anscombe, 1973). Recomenda-se a aplicação destes procedimentos em estudos que envolvam simultaneamente, genótipos de animais de diferentes grupos genéticos e animais oriundo de cruzamentos para serem avaliados. Como resultado da necessidade de representações visuais cada vez mais eficientes, impulsionados pelos avanços computacionais, diferentes abordagens têm sido apresentadas em outras áreas do conhecimento, tais como no setor econômico e financeiro, por meio do desenvolvimento de linguagens computacionais e softwares dedicados à análise visual, como observado em tecnologias do tipo BI Tools - Business Intelligence Tools (Negash et al., 2008) e bibliotecas específicas de desenvolvimento em linguagem R e Python (R Core Team, 2014; Python Core Team, 2015), tais como ggplot2, Plotly e Matplotlib (Hunter, 2007; Plotly, 2015; Wickham, 2016). Após a inclusão recente de dados moleculares como parte das avaliações genômicas em programas de Melhoramento Animal, o aumento expressivo no volume de dados foi observado, situação justificada pelas informações obtidas estarem na escala das dezenas e centenas de milhares de ocorrências por animal, oriundas de marcadores moleculares do tipo Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Considerando tamanha dimensão dos dados, torna-se essencial a adoção de ferramentas visuais, em busca de uma maior compreensão da estrutura populacional, além da possibilidade de detecção de resultados espúrios (Cole et al., 2010; Cole et al., 2012).

317

No ambiente universitário e empresarial, a obtenção de dados para pesquisa, desenvolvimento e uso de novas tecnologias pode ser bastante oneroso, representando grandes impactos financeiros. Quando levados em consideração dados empregados em programas de melhoramento genético animal, nem sempre as abordagens inicialmente planejadas são viáveis de serem executadas, tendo em vista os custos relacionados. Portanto, buscando compreender e testar metodologias que exigem um grande número amostral, abordagens que utilizam simulação são extremamente atraentes. Tais medidas possibilitam o reteste de diferentes metodologias em replicatas com baixo custo associado, possibilitando abordar diferentes estratégias de seleção genômica e os respectivos impactos no mérito genético em diferentes gerações, condição normalmente inviável em situações reais, devido ao tempo e custo relacionados (Daetwyler et al., 2013).

SIMULAÇÃO Como referência aos softwares destinados a simulação de dados empregados na área de Melhoramento Animal, destaca-se o QMSim, aplicação computacional eficiente, capaz de mimetizar genótipos e fenótipos em larga escala, além de estruturas complexas de pedigree. Tal software apresenta funcionamento dependente a dois passos principais, sendo o primeiro restrito a formação de uma população histórica e o segundo relacionado à formação de populações recentes, com maior nível de detalhamento e passível a ajustes mais complexos, - Taxa de Mutação, Desequilíbrio de Ligação, Expansão Populacional e Intensidade de Seleção - passíveis de alteração (Sargolzaei & Schenkel, 2009), possuindo uma gama de opções que podem ser alteradas via cartão de parâmetros. Na Tabela 1, pode ser observado um cartão de parâmetros para simulação de uma população cruzada, que será utilizada ao longo deste capítulo, proveniente de outras duas populações distintas, conforme detalhado no Figura 1. Após o processamento computacional, de acordo com os parâmetros selecionados, faz-se necessária a validação dos resultados via comparação com padrões biológicos encontrados na literatura da respectiva população que se busca mimetizar. Para compreensão do conjunto de dados gerados, adota-se normalmente diferentes estratégias, desde análises preliminares, como o entendimento da organização populacional via pedigree e principalmente pelo uso de metodologias de análise visual. O objetivo destas análises é entendimento da estrutura populacional e de outros pontos para validação da população simulada. Para a avaliação dos dados relacionados aos genotípicos, destacam-se metodologias que permitem a análise da curva de Linkage Disequilibrium - LD -(Desequilíbrio de Ligação) (Meuwissen et al., 2002), compreensão de mistura entre indivíduos - Admixture -

318

(Skotteet al., 2013) e da estrutura populacional baseada no grau de similaridade entre os indivíduos por meio metodologias de representação visual (Scatter Plots e Heatmaps). Tais metodologias são fundamentais por permitirem a compreensão da diversidade molecular e fenotípica de indivíduos de uma população (Pritchard & Rosenberg, 1999).

Tabela 1. Parâmetros adotados para simulação de uma população cruzada.

319

Figura 1. Representação esquemática dos passos simulados.

MÉTODOS Com auxílio do software QMSim version 2.0 (Sargolzaei & Schenkel, 2009; 2018), simulou-se dados com o intuito de se mimetizar três populações de bovinos de corte, gerando-se toda a estrutura populacional (pedigree), informações fenotípicas e genotípicas para centenas de milhares de indivíduos, de acordo com os parâmetros apresentados na Tabela 1 e passos presentes na Figura 1. Em relação aos parâmetros, foram considerados 29 cromossomos autossomos com comprimento de 900 cM cada e 70 Quantitative Trait Loci (QTL) com herdabilidade de 0,05 distribuídos aleatoriamente. Tais parâmetros foram adotados em busca da otimização do tempo computacional, tendo em vista que se trata apenas de uma abordagem da metodologia proposta. Como padrão do software, permite-

320

se considerar apenas uma única característica produtiva. Foi atribuída a esta característica herdabilidade de 0,3 e variância fenotípica igual a 1,0. Ou seja, apenas 17% dos efeitos foram atribuídos aos QTLs enquanto 83% foram considerados relativos a efeitos poligênicos. Em relação a taxa de mutação não-recorrente considerada, tanto para marcadores, quanto para QTLs, foi adotado 2,5x10-5 para todas as gerações. Como relatado anteriormente, exige-se a criação de uma população histórica (PH), estruturada com tamanho inicial de 60.000 indivíduos com decréscimo para 12.000 indivíduos no decorrer de 3.000 gerações, de forma a criar desequilíbrio de ligação (LD) e estabelecimento do equilíbrio mutação-deriva na gerações históricas (Brito et al., 2011; Santos et al., 2019). Estes pontos podem ser observados na Figura 2. Como segundo passo, iniciou-se a formação de duas linhagens (R1 e R2, respectivamente) fundadoras e oriundas da mesma população histórica (n=12.000), onde na linhagem R1 foram escolhidos de forma aleatória 2.400 fêmeas e 150 machos e, para linhagem R2, 2.600 fêmeas e 200 machos. Considerou-se como método de seleção para ambas linhagens apenas a informação fenotípica, sendo que foram consideradas 1.000 gerações para R1 e 950 gerações para R2, com acasalamentos ocorrendo apenas intra-linhagens, mimetizando a formação de duas raças distintas. O terceiro e último passo consistiu na formação de uma nova linhagem (R3) oriunda do cruzamento entre fêmeas de R1 (n=500) e machos de R2 (n=60), escolhidos de forma aleatória. Após o cruzamento inicial, indivíduos oriundos da F1 foram acasalados entre si por 20 gerações, mimetizando a formação de uma raça sintética, e parâmetros fenotípicos foram mantidos como critérios de seleção. Como resultado da simulação, obteve-se informação de pedigree (animal, pai e mãe) de todos os indivíduos, desde a formação das linhagens puras (R1 e R2) até o último indivíduo da linhagem cruzada (R3). Já em relação aos dados genotípicos, apenas as últimas gerações de todas as linhagens foram consideradas, totalizando 11.000 indivíduos (R1:5.200, R2:5.300, R3:500 indivíduos, respectivamente de cada linhagem) densidade gerada referente a 29.000 marcadores cada animal.

RESULTADOS4.1 Validação de dados simulados4.1.1 Linkage Disequilibrium (Desequilíbrio de Ligação) Implementou-se via utilização da linguagem R, um gráfico utilizando o pacote ggplot2, levando em consideração informações sobre correlações entre todos os marcadores moleculares do tipo SNP, dentro de um mesmo cromossomo. Tal figura baseou-se no entendimento do conceito conhecido como Linkage

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Disequilibrium (LD), definido classicamente como a associação não-aleatória de alelos em dois loci separados e localizados no mesmo cromossomo (Jorde, 1995). Associação está, passível de influência por diversos fatores. Entre eles, destacam-se a seleção, mutação ao longo das gerações, linkage genético, estrutura populacional e deriva genética (Slatkin, 2008). Considera-se o LD como principal metodologia para validação de dados genômicos, sejam eles reais ou simulados, especialmente em populações de animais de produção, tendo em vista a estrutura populacional normalmente favorável para este tipo de análise devido às maiores distâncias de LD encontradas nessas espécies (Daetwyler et al., 2015; Farnir et al., 2000; Meuwissen et al., 2002). Tamanha importância se deve ao fato de que o nível de LD é crucial para o fine-scale mapping ou “mapeamento em escala fina”, pois baseados nos níveis de LD, torna-se possível o relacionamento entre SNPs e os respectivos QTLs em desequilíbrio, possibilitando assim ganhos genéticos quando levadas em consideração metodologias de Seleção Genômica. Neste caso, a seleção indireta de QTLs espalhados pelo genoma, via uso de marcadores moleculares densamente distribuídos possibilitaram a detecção de regiões associados à características de interesse econômico (Hayes et al., 2009). Este fato, permite ainda, sob certas circunstâncias, o aumento de acurácia em programas de Melhoramento Genético apenas via análise de marcadores do tipo SNP. Com relação à abordagem exclusivamente para fins de validação de dados genômicos simulados, o LD apresenta extrema importância, pois a análise visual dos resultados do software QMSim, somada a interpretação dos valores numéricos, possibilita a comparação com dados genômicos reais referentes a LD encontrados na literatura (Brito et al. 2011; ; De Ross et al., 2008; Espingolan et al.; 2013; Larmer, 2012; Mokry et al., 2014) e, portanto, validar os resultados obtidos ou até mesmo refazer a simulação, alterando parâmetros específicos em busca de maior proximidade com os dados reais utilizados como referência. Observa-se na Figura 2, o resultado do exemplo de simulação proposto neste capítulo. É possível observar que, considerando a média de todos os cromossomos, houve o decaimento de LD ao considerar regiões mais distantes do cromossomo, resultado que junto aos resultados numéricos, apresenta perfil desejável e que valida a simulação realizada.

322

Figura 2. Curva de decréscimo de LD na população simulada neste capítulo.

4.1.2 Agrupamento (ou Clusterização) Outra abordagem usual, junto ao conjunto de dados genômicos de extrema importância para compreensão da organização e estrutura populacional, é a utilização de técnicas multivariadas de análises de agrupamento (comumente chamadas de clusterização devido ao nome da técnica em inglês: clusters analysis). Para fins de Melhoramento Genético, podem ser utilizadas diferentes métricas, de acordo com a finalidade de estudo e a estrutura populacional sob análise (Jain; Murty; Flynn, 1999). Como metodologia de controle de qualidade, emprega-se a análise de componentes principais (PCA (Chung et al., 2017) como forma de se detectar a estratificação populacional via retenção de variação explicada ao se reduzir de um espaço p-dimensional para um espaço bi ou tri dimensional. Uma vez satisfeita a condição de redução da dimensionalidade a formação de grupamentos poderá ser realizada, via análise visual. Considerando alternativas para se processar computacionalmente a Análise de Componentes Principais, empregou-se como software de eleição o FlashPCA2 (Abraham et al., 2017). Desenvolvido e otimizado via utilização de bibliotecas em C++ de alta performance, apresenta capacidade de processamento de grandes datasets com baixa exigência computacional, em curto período de tempo (2 GiB de RAM para 1 milhão de indivíduos com genótipos na densidade de 100 mil SNPs

323

cada, apresentando tempo de processamento inferior a 12 horas em um computador com apenas um núcleo) e ainda mantendo baixíssimos níveis de erros associados quando comparados a outros softwares concorrentes como o PLINK 1.9 (Purcell et al., 2007) e o FastPCA (Galinsky et al., 2016). Considerando os genótipos simulados sendo oriundos de três linhagens (R1, R2, R3), originárias de uma mesma população histórica, e com cruzamentos posteriores a consolidação de novas linhagens (R1 x R2 = R3) durante o processamento da simulação, é fundamental a compreensão da estrutura populacional para validação dos dados simulados. Considerou-se subsets referentes aos genótipos possuindo o mesmo número de indivíduos cada (R1 = R2 = R3 = 500 genótipos) e posteriormente foi realizada uma PCA buscando o grupamento de indivíduos via graus de similaridade, apresentando os resultados observados na Figura 3. A conformação obtida é esperada, sabendo que a linhagem R3 foi originada pelo cruzamento entre as linhagens R1 e R2 que apresentavam graus de dissimilaridade genética ocasionado pelo processo de simulação, no qual mimetizou a formação de diferentes raças. O uso de técnicas de visualização via ferramenta ‘plotly’ (Linguagem R) permite explorar dimensões adicionais como forma de apresentação, conforme ilustrado na Figura 4. Dados anteriormente plotados em uma estrutura bidimensional, podem ser visualizados via gráfico de três eixos, o que possibilita uma rotação completa de toda a estrutura. Dessa forma, os clusters formados pelas dissimilaridades entre indivíduos podem ser melhor identificados. Como forma de se comparar os resultados dos dados simulados com dados biológicos e oriundos de populações reais de bovinos, considerou-se três diferentes grupos de animais, disponibilizados pela plataforma WIDDE (Web-Interfaced next generation database dedicated to genetic diversity) (Sempéré et al., 2015), vinculada ao INRA – Institut National de la Recherche Agronomique, França. Dados genômicos estes oriundos respectivamente de animais taurinos, zebuínos e cruzados, em busca se de analisar o comportamento via representação gráfica quando submetidos ao mesmo procedimento realizado com os dados simulados em busca de observar os padrões de clusterização. Como pode ser observado na Figura 5, quando submetidas ao mesmo processo de validação, pode ser constatado que o comportamento entre as formas de clusterização entre as linhagens simuladas e as populações reais apresentam alta similaridade. Justifica-se o comportamento de clusterização observado pelo processo de formação das raças pioneiras ter ocorrido em situações diferentes, e compreende-se que as populações cruzadas se encontram mais centralizadas justamente por compartilharem trechos genômicos em comum às duas linhagens/raças fundadoras. Estes achados corroboram com os resultados obtido na simulação, demonstrando a alta similaridade com os padrões biológicos usuais. A Figura 6

324

explora de forma tridimensional o processo de clusterização das populações reais.

Figura 3. Representação gráfica bidimensional dos dados oriundos de simulação obtidos na PCA considerando genótipos de três diferentes grupos de animais (R1, R2, R3).

325

Figura 4. Representação gráfica tridimensional dos dados oriundos de simulação obtidos na PCA considerando genótipos de três diferentes grupos de animais (R1, R2, R3).

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Figura 5. Representação gráfica dos dados oriundos do WIDDE obtidos na PCA considerando genótipos de três diferentes grupos de animais (da esquerda para direita: taurinos, cruzados e zebuínos).

Figura 6. Representação gráfica tridimensional dos dados oriundos do WIDDE obtidos na PCA considerando genótipos de três diferentes grupos de animais.

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4.1.3 Admixture (Mistura) O processo de Admixture ou “Mistura”, ocorre quando diferentes populações que permaneceram isoladas geneticamente por diversas gerações, compartilhando material genético e gerando descendentes oriundos de uma mistura de segmentos cromossomais das populações formadoras. Tal processo é corriqueiramente observado quando há cruzamento entre diferentes raças, como por exemplo animais compostos por diferentes grupos genéticos (animais multirraciais). De forma simplificada, estudos de Admixture ou “Mistura” podem proporcionar estimativas da composição racial de um indivíduo ou de uma população, tomando-se como base dados genotípicos. Tal análise promove a comparação dos segmentos genômicos entre indivíduos de diferentes grupos, resultando na predição da composição racial de animais oriundos de cruzamentos (Skotte et al., 2013; Bray et al., 2009). Baseando-se apenas em estimativas de composição racial via métodos tradicionais (pedigree), assume-se que indivíduos com graus de parentesco iguais compartilham, em média, os mesmos trechos genômicos, o que pode levar a erros em estudos de associação. Esta situação não acontece quando dados genotípicos com maior densidades são utilizados, pois a identificação e comparação de trechos específicos ocorre a nível de marcadores moleculares, diminuindo as chances em se aceitar valores errôneos (Marchini et al., 2004; Clayton et al., 2005). De maneira adicional às abordagens visuais anteriormente adotadas, pode-se considerar que quando envolvidos dados de animais cruzados, métodos de predição da composição racial, buscam compreender não somente a estrutura populacional, mas também os trechos de material genético compartilhado entre indivíduos. Para emprego de tal análise, há possibilidade de uso do software ADMIXTURE que, via comparação de trechos genômicos, estima similaridades e dissimilaridades de acordo com as populações adotadas como referência (Alexander, et al., 2009). Ao considerarmos a população simulada neste capítulo, tem-se que o grupamento genético mais recente (R3) possui características que se enquadram, teoricamente, em uma população cruzada, pois há “mistura” do material genético de duas linhagens formadoras como demonstrado na Figura 3. Neste caso, há possibilidade de se empregar métodos de estimação da composição racial desse grupo, tomando como “puras” as populações ancestrais (R1 e R2). Pode ser observado do estudo de Admixture, apresentado na Figura7, que a população R3 (em destaque) apresenta diferentes níveis de mistura, uma vez que foi originada a partir de duas populações distintas. Mais uma vez mostrando a utilidade em sem empregar abordagens visuais para compreensão e validação dos resultados oriundos de estudos de simulação.

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Figura 7. Representação gráfica do estudo de Admixture. Em destaque a linhagem R3, e os representantes das linhagens R1 e R2 (à esquerda e à direita, respectivamente), utilizados para estimação da composição racial de R3.

4.1.4 Heatmaps Dentre as abordagens visuais complementares para avaliação dos dados “ômicos”, os heatmaps ou “Mapas de Calor”, são amplamente utilizados pela facilidade de interpretação. Tais representações gráficas buscam demonstrar de maneira simples e intuitiva as correlações entre pontos ou diferenças grupos comparativos em análises de expressão gênica, abundância de peptídeos, perfil de metilação e inclusive o grau de correlação genômica entre indivíduos de uma população (Eisen et al., 1998; Sturm et al., 2012). Os heatmaps apresentam interpretação simples tendo por base a intensidade da coloração, ou seja, considerando as cores associadas a representação gráfica, quanto mais forte a coloração, maior a correlação entre os pontos na respectiva intersecção (Wilkinson et al., 2009). Nesta abordagem, considerando os dados genômicos simulados, como

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primeira medida, foi considerado um subset contendo os genótipos referentes a 1500 indivíduos, sendo 500 de cada linhagem respectivamente (R1, R2 e R3). Após o preparo do conjunto de dados, realizou-se uma PCA via FlashPCA2. Considerou-se apenas os dois primeiros componentes principais, por explicarem maior porção de variação retida e, posteriormente, estes componentes foram então utilizados para obtenção da Matriz de Distância Euclidiana (EDM) (Dokmanic et al., 2015). Posteriormente os resultados obtidos foram plotados utilizando a metodologia de heatmap. Como o mesmo conjunto de genótipos foi considerado, nota-se novamente a segmentação das linhagens mais próximas com a representação baseada em cores mais forte (ou quentes) e os indivíduos menos relacionados com coloração fraca (ou mais fria), proporcionando uma visualização que facilita a compreensão dos dados.

Figura 6. Heatmap resultante da distância dos dois primeiros componentes principais obtidos por meio de matriz de distância euclidiana (EDM).

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CONSIDERAÇÕES FINAIS O trabalho procurou apresentar diferentes abordagens para avaliação, interpretação, visualização e validação de dados genômicos, associadas a um baixo custo computacional. As diferentes abordagens visuais podem ser implementadas por meio de linguagens de programação R, além do uso complementar de softwares/metodologias já existentes e utilizados no meio científico. Os resultados obtidos, empregando tal união de metodologias, proporcionam entendimento de forma prática e rápida, sendo extremamente útil na compreensão de dados em larga escala. Inúmeras possibilidades são disponibilizadas e futuramente, com os avanços tecnológicos, espera-se que novas abordagens de metodologias visuais para compreensão de conjuntos de dados estejam disponíveis, devido principalmente ao aumento da densidade, interligação e complexidade das informações disponíveis nos Sistemas de Produção Animal. O uso de ferramentas voltadas para a simulação de estruturas de relacionamento populacional e dados genômicos, verifica-se constante evolução e tentativas de desenvolvimento de novas metodologias na área de melhoramento animal principalmente relacionada a seleção genômica. Esta área de pesquisa exige vasta e complexa estrutura populacional, normalmente associada a grande volume de informações genômicas. Neste contexto, a utilização de simuladores que mimetizam cenários mais próximo possível de situações biológicas reais são de suma importância para eficiência do setor produtivo. Espera-se, a curto prazo, com os avanços, evoluções significativas a área da simulação.

AGRADECIMENTOS Agradecemos a toda equipe do Laboratório de Bioinformática e Melhoramento Animal - BioMa: Professores, Funcionários, Alunos de Doutorado, Mestrado, Iniciação Científica e Estagiários pelo envolvimento e desenvolvimento dos projetos. Também agradecemos a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) processo de número: 2016/19514-2 e 2018/14035-4), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES-Finance Code 001) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas concessões de bolsas de estudos.

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