UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

O FUNGO Duddingtonia flagrans: CONTROLE BIOLÓGICO DE NEMATODEOS PARASITAS DE

BOVINOS À CAMPO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Marta Bañolas Jobim

Santa Maria, RS, Brasil, 2006

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O FUNGO Duddingtonia flagrans: CONTROLE BIOLÓGICO

DE NEMATODEOS PARASITAS DE BOVINOS À CAMPO

por

Marta Bañolas Jobim

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Santa

Maria (UFSM, RS), Área de Concentração em Medicina Veterinária Preventiva, como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Medicina Veterinária.

Orientador: Prof. Mário Luiz de la Rue

Santa Maria, RS, Brasil

2006

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Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado

O FUNGO Duddingtonia flagrans : CONTROLE BIOLÓGICO DE NEMATODEOS PARASITAS DE BOVINOS À CAMPO

elaborada por Marta Bañolas Jobim

como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária

COMISÃO EXAMINADORA:

Mário Luiz de la Rue, Dr. (Presidente/Orientador)

Janio Morais Santurio, Dr. (Doutor/UFSM)

Cybele Esteves Almeida (Doutora/UFSM)

Santa Maria, 16 de maio de 2006.

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AGRADECIMENTOS

À Coordenação do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa de estudo concedida.

À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária (PPGMV),

na pessoa de seu Coordenador, Prof. João Francisco de Oliveira, pela acolhida e auxílio.

Ao Prof. Mário Luiz de la Rue pelo privilégio de sua amizade, interesse e inestimável

orientação.

À equipe do Laboratório de Pesquisas Micológicas (LAPEMI/UFSM) e ao Prof. Jânio

Morais Santurio, pelo valioso auxílio e disponibilização do material para o experimento,

oportunizando a realização deste estudo.

À equipe do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Veterinário da UFSM, pela

ajuda incansável nas análises laboratoriais.

À equipe do Laboratório de Doenças Parasitárias (CCR/UFSM), pelas preciosas e

oportunas sugestões.

À equipe do Núcleo Integrado de Desenvolvimento em Análise Laboratorial

(NIDAL/UFSM), por franquear suas instalações.

Aos professores de estatística da UFSM, José Henrique Souza da Silva e Luis Felipe

Dias Lopes, pela valiosa ajuda na análise estatística do trabalho.

Ao estudante e bolsista em medicina veterinária Messias Ratslaff, pela incansável

ajuda na rotina do experimento.

Aos funcionários da propriedade Cerro da Cruz, Clarisse e Cláudio, pela dedicação e

ajuda no dia-a-dia do campo.

Aos meus pais, Gilberto, Gilcéia e Verinha, que possibilitaram e estimularam a busca

deste sonho.

E finalmente, ao meu esposo Gustavo, pela força e razão de meu desejo de vencer.

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RESUMO

Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Universidade Federal de Santa Maria

O FUNGO Duddingtonia flagrans: CONTROLE BIOLÓGICO DE NEMATODEOS PARASITAS DE BOVINOS À CAMPO

AUTORA: MARTA BAÑOLAS JOBIM

ORIENTADOR: MÁRIO LUIZ DE LA RUE Data e Local da Defesa: Santa Maria, 16 de maio de 2006.

O controle biológico é um método para diminuir a população de parasitas pela

utilização de antagonista natural. No presente estudo, testou-se a eficácia do fungo

nematófago Duddingtonia flagrans no controle de nematódeos parasitos gastrintestinais de

bovinos criados a campo no município de Julio de Castilhos. Utilizaram-se 20 bezerros,

distribuídos igualmente em duas áreas formadas por pastagem nativa. O grupo A foi tratado

com o fungo D. flagrans, cultivado em sorgo, numa concentração de 1x106clamidósporos/Kg

de peso animal, misturados em ração de manutenção, diariamente, durante oito meses. O

grupo B serviu como controle e não recebeu fungo, apenas ração. Foram coletadas amostras

para contagem de ovos por grama de fezes (OPG), semanalmente. Mensalmente foram

realizadas coprocultura para identificar as espécies de larvas de nematódeos, pesagem dos

animais, colheita de sangue para determinar contagem sanguínea de série vermelha e coleta de

pasto para contagem das larvas na pastagem. Dados de temperatura e índice pluviométrico

foram registrados diariamente. O OPG foi reduzido no grupo tratado, em média 56,84,% nos

últimos 3 meses de experimento, variando entre 40,44 a 67,14% no grupo tratado (P< 0,001).

A coprocultura demonstrou que os principais nematódeos encontrados foram dos gêneros

Cooperia e Haemonchus em uma percentagem de 47,9 e 35,3%, respectivamente. A

contagem de larvas na pastagem obteve um percentual de redução 77,05% no grupo tratado ao

final do experimento (P<0,01). Pôde-se concluir com este estudo, que o papel do fungo

Duddingtonia flagrans, é sem dúvida importante, principalmente na diminuição do OPG e na

redução significativa de larvas na pastagem. Portanto, este fungo nematófago é uma

ferramenta biológica eficaz para ser empregado em um controle integrado de nematódeos de

bovinos criados a campo.

Palavras-chaves: controle biológico, nematódeo de bovinos, Duddingtonia flagrans, fungo

nematófago, bovinos.

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ABSTRACT

THE FUNGUS Duddingtonia flagrans: BIOLOGICAL CONTROL OF NEMATODES PARASITES OF CATTLE IN THE FIELD

The biological control is an alternative method to reduce the population of parasites by

the use of natural antagonist. In the present study, the efficacy of nematophagous fungus

Duddingtonia flagrans was tested to control gastrointestinal nematodes parasites of cattle

livestock in the field. Twenty calves were used, distributed equally in two distinct plots

formed for native pasture. . Group A was treated with D. flagrans fungus, cultivated in

sorghum, in a concentration with 1x106 clamidospores/kg body weight, mixed with

maintenance ration, each day, during eight months. Group B served as a control and did not

receive the fungus. Samples for faecal egg count (FEC), were collected each week. There

were monthly counts in faecal cultures to identify the species of nematodes larvae, weight of

the animals, collection of blood to determine red cell counts and collection of pasture to the

counting of larvae. Temperature and rainfall data were registered daily. The FEC reduced

around 56,84% in the last 3 months of the experiment, with a variation between 40,44 and

67,14% in the treated group (P<0,001). The faecal cultures demonstrated that the main

nematodes been found were Cooperia and Haemonchus in a percentage of 47,9 and 35,3%,

respectively. The counting of larvae in the pasture showed a reduction percentage around

77,05% in the treated group at the end of experiment (P<0,01). It could be concluded with this

study, that fungus Duddingtonia flagrans is, without a doubt important, mainly in the

reduction of the FEC and the significant reduction of larvae in the pasture. Therefore, this

nematophagous fungus is efficient as a biological tool to be used in an integrated control of

nematodes of bovine raised in the fields.

Key words: biological control, bovine nematodes, Duddingtonia flagrans, nematophagous

fungus, cattle.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Fotografia 1 - O cocho do grupo A à esquerda e o cocho do grupo B à direita........................19

Fotografia 2 - Ração para a manutenção de peso misturada ao sorgo contendo o fungo D.

flagrans.....................................................................................................................................20

Fotografia 3 - Os 20 animais do experimento formando um grupo homogêneo......................21

8

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Teste T, ao nível de significância de 5% entre os grupos A (tratado) e B (controle)

dos principais parasitas.............................................................................................................29

Tabela 2: Análise de Variância, utilizando delineamento em medidas repetidas,

complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas de Tukey, ao nível de significância de

5%, entre o percentual de Hematócrito dos grupos A (tratado) e B (controle), no período de 6

meses.........................................................................................................................................33

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LISTA DE FIGURAS Figura 1 –Contagem de OPG obteve diferença estatística significativa pelo teste de Duncan

(P<0,002) entre os grupos: tratado (A) na coluna escura e controle (B) na coluna clara.

Houve diferença estatística também entre os meses (*) de experimento (P<0,01). A linha

pontilhada demonstra o percentual de redução (%) na contagem de OPG entre os

grupos.......................................................................................................................................26

Figura 2 – Contagem de OPG, excluindo o animal mais parasitado de cada grupo, obteve

diferença estatística significativa pelo teste de Duncan (P<0,001) entre os grupos: tratado (A)

na coluna escura e controle (B) na coluna clara. Houve diferença estatística também entre os

meses (*) de experimento (P<0,01). A linha pontilhada demonstra o percentual de redução

(%) na contagem de OPG entre os grupos, no período de oito meses.....................................26

Figura 3 - Contagem de larvas (L3) na pastagem por quilo de matéria seca obteve diferença

estatística significativa pelo teste de Duncan (P<0,01) entre os grupos: tratado (A) na linha

preta contínua (a) e controle na linha cinza (b). A linha pontilhada (c) demonstra a

percentagem de redução de larvas (L3) na pastagem, no período de oito meses....................28

Figura 4 - Temperatura máxima nas colunas escuras, temperatura mínima nas colunas claras

e o índice pluviométrico na linha contínua, durante o período de oito meses, na região de

Júlio de Castilhos (RS)............................................................................................................30

Figura 5 - Série histórica de temperatura máxima nas colunas escuras, temperatura mínima

nas colunas claras e o índice pluviométrico na linha contínua, dos meses de agosto a março,

no período de 1994 a 2003 , na região de Júlio de Castilhos (RS)..........................................31

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Figura 6 – Evolução da média do peso dos animais (Kg) entre o grupo tratado (A) em linha

contínua e o grupo controle (B) em linha interrompida, no período de oito meses de

experimento, não obteve diferença significativa pelo teste de Duncan (P>0,67)....................32

11

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................... 12

1.1Objetivos..........................................................................................................................13

1.1.1 Geral..............................................................................................................................13

1.1.2 Específicos....................................................................................................................13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................14

3 MÉTODOS E TÉCNICAS...............................................................................................18

3.1 Caracterização do local do experimento......................................................................18

3.2 Desenho experimental....................................................................................................18

3.3 Análises laboratoriais....................................................................................................21

3.3.1 Amostras de pastagem...................................................................................................21

3.3.2 Coprocultura..................................................................................................................22

3.3.3 Contagem de ovos nas fezes..........................................................................................22

3.3.4 Hemograma....................................................................................................................23

3.4 Pesagem...........................................................................................................................23

3.5 Dados meteorológicos.....................................................................................................23

3.6 Análise estatística............................................................................................................23

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................25

5 CONCLUSÃO....................................................................................................................33

REFERÊNCIAS....................................................................................................................34

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1 INTRODUÇÃO

Entre os fatores que interferem no desenvolvimento pleno da atividade pecuária, o

parasitismo gastrintestinal ocupa um lugar de destaque (MACRAE, 1993). Diversos

programas de controle vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de minimizar os efeitos

adversos das endoparasitoses na produção extensiva de bovinos. Entre eles, os que têm

enfocado a diminuição de larvas infectantes na pastagem através do uso de compostos anti-

helmínticos, que por sua vez, diminui a população de parasitas nos animais adultos.

Entretanto, apesar dos compostos anti-helmínticos serem utilizados como uma das principais

ferramentas, seu uso possui algumas limitações tais como: resíduos de drogas em produtos

animais (PADILHA, 1996), efeitos tóxicos em organismos não alvos no meio ambiente

(STRONG et al.,1996,) e a resistência anti-helmíntica (FAO, 2003 e KAPLAN, 2004).

Com o intuito de desenvolver outros métodos para minimizar o uso de anti-

helmínticos nas estratégias de controle dos nematódeos de ruminantes, especialmente em

sistemas de produção em pastoreio contínuo, o controle biológico parece ser uma realidade,

oferecendo uma alternativa eficiente e segura na redução da população de larvas infectantes

de nematódeos gastrintestinais nas pastagens (LARSEN, 1999 e MOTA et al., 2003).

O termo controle biológico se aplica a utilização de antagonistas naturais disponíveis

no ambiente, diminuindo a um limiar sub-clínico e economicamente aceitável numa

população, de um agente causador de perdas produtivas na atividade pecuária ou agrícola

(GRØNVOLD et al., 1996a). Desta forma, o uso de várias espécies de fungos nematófagos

que atacam as formas larvárias dos parasitas na pastagem tem sido muito estudadas, como

alternativa de controle biológico dos nematódeos de ruminantes (WALLER, 1998 e

SAUMELL & FERNÁNDEZ, 2000).

Duddingtonia flagrans é um fungo que possui grande capacidade de produzir

clamidósporos. Estes permanecem viáveis depois de ingeridos pelos bovinos e são

13

eliminados pelas fezes, colonizando-as logo após a sua deposição no solo e predando os

nematódeos através de hifas adesivas (LARSEN et al., 1991; LARSEN et al., 1992 e

WAGHORN et al. 2003). Por isso o controle de nematódeos em bovinos, na última década,

tem atraído muita atenção e sido foco de inúmeras pesquisas (LARSEN et al., 1995;

NANSEN et al., 1995; FERNÁNDEZ et al., 1999a; SARKUNAS et al. 2000; FAEDO et al.,

2002; DIMANDER et al., 2003a e 2003b; EYSKER et al., 2005).

1.1 Objetivos

1.1.1 Geral

O presente estudo teve como objetivo geral avaliar a eficácia do fungo Duddingtonia

flagrans, fermentado em sorgo e administrado diariamente por via oral, como alternativa de

controle biológico de nematódeos em bovinos jovens criados à campo, nas condições

ambientais existentes no município de Júlio de Castilhos, Rio Grande do Sul, Brasil, pelo

período de 8 meses

1.1.2 Específicos

Avaliar a evolução da carga parasitária nos animais e no campo, após administração

do fungo D. flagrans, através de exames quantitativo e qualitativo de contagem de ovos nas

fezes e coprocultura, respectivamente, assim como a contagem de larvas nas pastagens.

Correlacionar a eficácia do fungo D. flagrans com os fatores climáticos de

temperatura e índice pluviométrico.

14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA O parasitismo gastrintestinal de nematódeos é um significativo fator limitante nos

sistemas de produção de animais criados a campo, no mundo todo (WAGHORN, 2003). Os

prejuízos estão associados a diminuição e ao retardo na produção, o elevado custo ocasionado

pelo uso de antihelmínticos nos tratamentos profilático e curativo e, em casos extremos, a

morte dos animais constituindo como alguns dos maiores problemas vinculados aos gastos

com o parasitismo gastrintestinal. O conhecimento sobre a disponibilidade de larvas no

ambiente, detecção de fontes de infecção, conhecimento sobre as exigências climáticas para

eclosão de ovos, viabilidade larvar e o sistema de produção são os requisitos mais importantes

no estabelecimento de um sistema de controle efetivo do parasitismo (MOTA et al., 2003).

Quando estas informações não são levadas em conta, o parasitismo aumenta e acarreta

diferentes patologias as quais interferem no ganho de peso, ingestão de alimentos e utilização

de matéria seca, retardo na idade reprodutiva, decréscimo na capacidade reprodutiva e

mortalidade em animais seriamente afetados (CHARLES, 1992).

Os programas de controle de endoparasitas gerados nas últimas décadas, são baseados

principalmente na informação epidemiológica de cada região e focados no uso de compostos

antihelmínticos com alta eficácia e baixa toxicidade. Estes programas têm encontrado

resultados eficientes mas ao mesmo tempo limitados, pois a resistência antihelmíntica já foi

detectada há algumas décadas (PRICHARD, 1990) assim como resíduos de drogas nos

alimentos (PADILHA, 1996) e sua ação em organismos não alvo (BIRD & HERD, 1995;

IGLESIAS, 1998), impedindo o avanço da tecnologia química. Por esses motivos o

desenvolvimento de métodos alternativos de controle têm sido bastante estimulados.

Para enfrentar os obstáculos da tecnologia química, muitos métodos alternativos têm

sido intensamente estudados no intuito de prevenir e controlar o parasitismo por nematóides

gastrintestinais de bovinos, como: o desenvolvimento de vacinas (EMERY & WAGLAND,

1991), a identificação de marcadores moleculares associados à resistência dos parasitos

(GASBARRE et al., 1990) e a utilização de microorganismos no controle das formas livres

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presentes no ambiente (GILL & LE JAMBRE, 1996). A utilização destes microorganismos

tais como fungos (BARRON, 1977), bactérias (STIRLING, 1985), protozoários (CANNING,

1973), artrópodes (LEHMAN & REID, 1993), entre outros, considerados como parasitas ou

predadores de nematódeos, têm sido descritos como métodos alternativos de controle

biológico.

Como regra de manutenção dos sistemas biológicos, toda a população é regulada por

antagonistas de forma espontânea na natureza. Na ausência de controladores naturais

disponíveis no ambiente, a população de um determinado organismo poderia aumentar

indiscriminadamente. Desta forma, o termo controle biológico é definido como um método

ecológico desenvolvido pelo homem para diminuir a população parasitária à densidades sub-

clínicas aceitáveis ou para conservar esta população em níveis não prejudiciais usando

antagonistas naturais vivos (GRØNVOLD et al., 1996a). Conforme MOTA (2003), na prática,

o controle biológico não atua sobre estágios internos de parasitas, contudo, concentra suas

ações sobre os hospedeiros intermediários, paratênicos, vetores e estágios larvais de vida

livre, diminuindo a fonte de infecção para os hospedeiros finais. Devido a isso, causa menos

efeitos negativos no ambiente que os métodos químicos.

Para ser selecionado como um eficiente controle biológico, os antagonistas naturais

necessitam possuir algumas qualidades, como: especificidade de ação, alta capacidade

reprodutiva e sobreviver às condições ambientais no local em que o controle é realizado, bem

como ser efetivo no controle do organismo alvo (GRØNVOLD et al., 1996b). Além disso, a

seleção de um agente antagonista está baseada na capacidade de produção em escala

industrial, nos custos relacionados na produção, na competitividade com as drogas

tradicionais e no tempo de sobrevivência do organismo em formulações comerciais. (MOTA,

2003).

Os fungos nematófagos possuem uma grande variedade e diversidade. Eles são

habitantes naturais do solo (GRAY, 1987) e das fezes dos animais (SAUMELL, 1999), sendo

o seu padrão de colonização influenciado pelas condições climáticas (FERNÁNDEZ, et al.,

1999b; SAUMELL, 1998). Os fungos nematófagos possuem várias vantagens, como: alta

atividade reprodutiva e ciclo de vida curto; algumas espécies produzem esporos o que

aumenta sua resistência dentro e fora dos animais; mantém-se em fase saprofítica na ausência

do hospedeiro e, principalmente, não são patógenos para os animais.(LARSEN, 1999)

As espécies de fungos Arthrobotrys robusta, Duddingtonia flagrans, Monacrosporium

sinense e M. thaumasium são identificadas como nematófagas (BARRON, 1977) e têm sido

estudadas quanto ao seu potencial como agentes controladores biológicos de helmintos

16

gastrintestinais de bovinos (ALVES et al., 2003; ARAÚJO et al., 1993, 1998, 1999;

DIMANDER et al., 2003a e 2003b; GOMES et al., 1999; LARSEN et al., 1995).

O fungo Duddingtonia flagrans é a espécie mais estudada no controle das

nematodioses gastrintestinais de animais domésticos (EYSKER et al., 2005; LARSEN, 1999;

MOTA et al., 2003). Uma das características deste fungo que os diferencia dos demais fungos

nematófagos é que este suporta a passagem pelo trato gastrintestinal (TGI) dos ruminantes

devido à produção de grande número de estruturas de resistência esféricas (clamidósporos) de

parede grossa (LARSEN et al.,1991; LARSEN et al.,1992). Após passar pelo TGI, os fungos

nematófagos em geral, produzem estruturas em forma de anéis constritores e não constritores,

hifas, botões e redes tridimensionais adesivas ao longo do micélio. Os clamidósporos de D.

flagrans ao serem eliminados juntamente com as fezes, se diferenciam e podem dar origem a

hifas, conidióforos e conídios (BARRON, 1977). As hifas apresentam formatos variando

entre elíptica e ovóide com um septo mediano e morfologia de 25-50 µm de comprimento por

10-15µm de largura (COOKE & GODFREY, 1964). O aprisionamento do nematódeo às redes

tridimensionais é seguido pela penetração destas hifas na cutícula do nematóide, ocorrendo

dentro da larva, a digestão dos conteúdos internos (MOTA et al., 2003). Na fase inicial deste

processo, o nematóide se mantém aderido ao fungo por meio de uma substância fibrilar

adesiva rica em fosfatase ácida, que também é responsável pela degradação da cutícula. O

processo de penetração acontece em uma hora e após desaparece, e está associado à presença

de corpos densos ricos em enzima que atuam como peroxissomos (JANSSON &

NORDBRING-HERTZ, 1988). A fase final de penetração da cutícula parece ser resultado de

força mecânica (VEENHUIS et al., 1985). Então, quanto maior a motilidade dos nematóides

no bolo fecal, maior o estímulo ao fungo para a produção destas armadilhas (NANSEN et al,

1988).

No Brasil, os primeiros estudos de controle biológico in vitro com fungos nematófagos

avaliaram a eficácia de Arthrobotrys spp. e Monacrosporium ellipsosporum no controle de

larvas de Haemonchus placei de bovinos (ARAÚJO et al., 1992; ARAÚJO et al., 1993).

Somente estudos mais recentes foram descritos utilizando o fungo D. flagrans no Brasil.

GARCIA (2000) estudou a incorporação e armazenamento em suplementos alimentares de

ruminantes dos fungos Arthrobotrys musiformis e Duddingtonia flagrans. Já SANTOS

(2000) coletou, isolou, identificou e produziu, em escala massal, fungos nematófagos em 3

regiões brasileiras diferentes e avaliou as características biológicas do fungo D. flagrans.

Entretanto, não há descrição publicada de experimentos desenvolvidos in vivo sobre a eficácia

do fungo D. flagrans em bovinos jovens nas condições climáticas da região sul do Brasil. É

17

importante salientar que as condições climáticas de cada região brasileira possuem

características distintas e que podem influenciar tanto na eficácia deste fungo como no ciclo

biológico dos parasitas. A formação das redes de aprisionamento do fungo tem sido melhor a

30ºC, produzindo de 700-800 armadilhas/cm2/2 dias, quando induzidos por 20

nematóides/cm2 em agar, conforme experimento de GRØNVOLD (1996b).

A dosagem de esporos do fungo D. flagrans administrada para determinar um

adequado controle é bastante diversificada nos diferentes experimentos realizados em várias

partes do mundo, e depende da espécie de ruminantes a ser estudada (LARSEN et al., 1995;

NANSEN et al., 1995; WOLSTRUP et al., 1994). Já SARKUNAS et al. (2000) concluíram

que a dosagem do fungo D. flagrans para bovinos com 106 clamidósporos/kg de peso de

animal vivo, diariamente, resultou em significativa redução da infectividade de larvas na

pastagem e conseqüentemente infecção leve nos animais. Contudo, outros estudos realizados

a fim de comparar o efeito de diferentes doses fúngicas, mostraram que para aplicar

corretamente o controle biológico, deve se levar em conta, não somente a dose fúngica a ser

usada, mas também outros fatores tais como o nível de carga inicial de larvas na pastagem e

carga animal (FERNÁNDEZ et al., 1999a).

18

3 MÉTODOS E TÉCNICAS 3.1 Caracterização do local do experimento

O experimento foi realizado em uma propriedade rural no município de Júlio de

Castilhos, região central do Estado do Rio Grande do Sul, localizado na longitude de 53,69°W

e latitude de 29,19°S, a 514 metros de altitude. A vegetação natural do município foi

classificada como savana gramínea-lenhosa com floresta de galeria. Estes campos nativos são

compostos por Paspalum notatum; P. plicatulum; Eryngium ciliatum; E. horridum;

Andropogon ternatus; Choloris polydactyla; Schizachyrium microstachyum; Aristida laevis;

Piptochaetiu montevidensis e Erianthus sp. (BANDINELLI et al., 2005).

3.2 Desenho experimental

Foram utilizados para o estudo, 20 bezerros machos não castrados, com idades entre 9

e 11 meses e peso médio de 144 Kg. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois

grupos com 10 indivíduos em cada, denominados grupos A (tratamento) e B (controle). Cada

grupo foi introduzido em um potreiro com 4 hectares perfazendo um total de 0,8 unidade

animal (360 Kg) por hectare. Os potreiros contíguos foram cercados e divididos por cerca

elétrica, tendo à disposição água e pastagem nativa. A pastagem diferida foi semeada a lanço

com azevém, antes do início do experimento. Foi colocado um cocho em cada potreiro. O

cocho do grupo A foi subdividido em dez compartimentos, com espaços de 50 cm, para que

cada animal se alimentasse individualmente e recebesse a mesma quantidade de massa

fúngica (Fotografia 1).

19

Fotografia 1 - O cocho do grupo A à esquerda e o cocho do grupo B à direita.

O fungo utilizado foi Duddingtonia flagrans, cepa ARSEF 5701 (Collection of

Entomopathogenic Fungal Cultures), obtido no Laboratório de Pesquisas Micológicas

(LAPEMI), da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Após processo de fermentação

a seco em sorgo estéril, o fungo atingiu concentração de 1,6x106 clamidósporos/grama de

sorgo. Para os animais do grupo A, foram fornecidos 1 x 106 clamidósporos/ Kg de peso

animal, diariamente, misturados a uma ração para a manutenção de peso, sendo a dose do

fungo ajustada mensalmente conforme o aumento da média de peso dos animais. A ração era

composta de 44% de triguilho/aveia, 20% de milho, 35% de resíduos de soja e 1% de melaço.

O tipo e a quantidade de ração foram igualmente fornecidos para ambos os grupos, durante

todo o experimento (Fotografia 2).

20

Fotografia 2 - Ração para a manutenção de peso misturada ao sorgo contendo o fungo D. flagrans administrados ao grupo tratado (A).

Os animais, 15 dias antes de serem divididos em grupos, foram pesados e avaliados

clinicamente quanto ao escore de condição corporal (ECC) proposto por WILDMAN et al.

(1982) e EDMONSON et al. (1989) que varia de 1 a 5. A média do ECC de ambos os grupos

resultou em 2,5 (Fotografia 3). Na mesma ocasião os animais foram tratados com ivermectina

injetável (Ivomec®)1 a 1% na dose de 1ml/50 kg de peso vivo.

1 Merial Saúde Animal Ltda – Rua Barão de Jaraguá, 901, 14° andar, Campinas, São Paulo, CEP: 13015-001.

21

Fotografia 3 - Os 20 animais do experimento formando um grupo homogêneo.

3.3 Análises laboratoriais

3.3.1 Amostras de pastagem

Mensalmente as amostras eram colhidas em padrão de “zigue-zague” em toda a

extensão dos dois potreiros (WRIGHT et al. 2003), procurando sempre colhe-las até as 10

horas da manhã. Cerca de 80% do material foi coletado perto do bolo fecal (a menos de 20

cm) e 20% longe (cerca de 1m) e colocados em sacos plásticos.As amostras eram

encaminhadas imediatamente ao laboratório e refrigeradas. Parte do pasto colhido, em torno

de 100g, era seco em estufa a 55°C durante 72 horas, no Núcleo Integrado de

Desenvolvimento em Análise Laboratorial (NIDAL/UFSM), para análise de matéria seca

parcial. Na outra parte, pesou-se entre 600 a 800 gramas de pasto, e foram adicionadas de 5 a

22

7 litros de água com 10 ml de detergente não iônico (sabão neutro) e levemente friccionado

por 5 minutos, repedindo-se a ação a cada 30 minutos, durante 3 horas. Após, o pasto era

separado do líquido, primeiramente por uma peneira grossa (1 mm) e novamente, por uma

peneira fina de 38µm onde eram retidas as larvas. O sedimento retido era retirado da peneira

por jatos moderados de água e colocado em papel filtro sobre um cálice contendo água, por 24

horas em temperatura ambiente. No dia seguinte, o papel filtro era retirado e parte do

conteúdo sobrenadante era desprezada, restando 30 ml de líquido com o sedimento no fundo.

Este foi colocado em tubos de ensaio. Ao examinar, foram separadas 3 alíquotas de 0,5 ml do

conteúdo do fundo do tubo e procedeu-se à contagem de larvas. O resultado encontrado foi

transformado em número de larvas por kg de matéria seca (MOLENTO, 2001).

3.3.2 Coprocultura

A cada mês, foram coletadas fezes da ampola retal dos animais, separados

individualmente em potes, identificados e armazenados sob refrigeração. As amostras eram

encaminhadas ao laboratório para realização de coprocultura. Porções de fezes de cada animal

do grupo A eram misturadas com serragem, umidificadas e mantidas em estufa para cultivar

por 14 dias em temperatura constante de 27ºC. Após era realizada a recuperação de larvas

infectantes (L3) segundo a técnica de ROBERTS & O’SULLIVAN (1950). As larvas foram

preservadas com formol em 10% e posteriormente, quantificadas e identificadas de acordo

com os critérios estabelecidos por UENO & GONÇALVES (1998).

3.3.3 Contagem de ovos nas fezes

Foram coletadas de cada animal, semanalmente, amostras de fezes da ampola retal,

cujas amostras foram identificadas e mantidas sob refrigeração até o momento do exame

laboratorial, que ocorria geralmente em 24 a 48 horas. A técnica utilizada foi a de GORDON

& WHITLOCK (1939) modificada por LIMA (1989), para determinar a contagem de ovos

por grama de fezes (OPG).

23

3.3.4 Hemograma

As amostras de sangue total foram colhidas da veia jugular em tubo com

anticoagulante (EDTA). Estas amostras foram imediatamente encaminhadas ao laboratório de

Análises Clínicas do Hospital Veterinário da UFSM, para análise de hemograma. O

hematócrito foi estabelecido mediante técnica do micro hematócrito e os resultados se

expressaram em percentual. Foram coletadas amostras mensalmente, durante 6 meses.

3.4 Pesagem

Mensalmente, o peso dos bovinos era mensurado individualmente. A pesagem dos

animais serviu tanto para verificar a evolução do peso de cada animal de ambos os grupos,

como para ajustar a dose do fungo no grupo A, através da média de peso do grupo tratado.

3.5 Dados meteorológicos

Os dados meteorológicos de índice pluviométrico, temperatura máxima e mínima

foram obtidos da base de dados da estação de São Martinho da Serra, a 20 quilômetros de

distância do experimento. Esta base de dados pertence ao Centro de Previsões do Tempo e

Estudos Climáticos (CPTEC, 2005) do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais ligado ao

Ministério da Ciência e Tecnologia. Os dados foram verificados diariamente e foram

reagrupados para ter como base valores mensais de temperatura máxima e mínima expressos

em Cº (centígrados) e de índice pluviométrico expressos em mm (milímetros).

3.6 Análise estatística

Os dados de OPG, número de larvas recuperadas da pastagem e de meteorologia foram

correlacionados e, logo após, aplicada análise de variância ANOVA utilizando delineamento

24

inteiramente casualizado. Os valores de OPG foram transformados (logaritimizados) com o

objetivo de equalizarem os dados (DIMANDER et al., 2003a). Os resultados foram

interpretados estatisticamente por meio de análise de variância (teste F) em nível de

significância de 5% e através da regressão linear simples. As médias dos fatores qualitativos

foram comparadas pelo teste de Duncan.

Os dados de peso, hematócrito e coprocultura foram analisados através de variância

ANOVA, utilizando o delineamento em medidas repetidas, complementada pelo teste de

comparações múltiplas de Tukey, ao nível de significância de 5%.Os dados estatísticos foram

analisados pelo programa SAS (Statistical Analysis System), versão 8.02.

A eficácia dos resultados de OPG e larvas na pastagem foi determinada pelo

percentual de redução entre o grupo tratado e o não tratado através da fórmula:

% redução = X - Y x 100

X

onde X é o dado do grupo controle (B) e Y o dado do grupo tratado (A), sendo que X deve ser

maior (>) que Y e diferente de zero (0), de acordo com a fórmula utilizada por TERRILL et

al. (2004).

25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste estudo optou-se pela a dosagem de 1x106 clamidósporos/ kg de peso animal por

ser a concentração da cepa ARSEF 5701, disponibilizada pelo laboratório e por esta ser uma

concentração eficaz nos experimentos realizados in vivo mas em condições climáticas

distintas ao do local deste estudo. A concentração do fungo administrada em diferentes

estudos é variável, mas conforme DIMANDER et al. (2003b) e FERNÁNDEZ et al. (1999a),

a dosagem de 1x106 clamidósporos por quilo de peso vivo, em bovinos, demonstrou

significativa redução no número de larvas na pastagem. Da mesma forma, outros estudos, em

diferentes espécies, utilizando várias dosagens distintas, tiveram resultados significativos.

TERRILL et al. (2004) utilizaram em caprinos, dosagens de fungo com 5 x 104, 1 x 105, 2,5 x

105 e 5 x 105 clamidósporos/kg de peso animal e obtiveram resultados significativos que

variaram de 60,8 a 93,6% de redução de larvas na pastagem. PEÑA et al. (2000) reportaram

redução de larvas de Haemonchus contortus entre 76,6 e 100% em culturas de fezes de ovelha

contendo 5 concentrações diferentes de clamidósporos de D. flagrans, que variaram de 2,5 x

104 a 5 x 105 clamidósporos/ kg de peso animal. Apesar das doses serem variáveis nas

diferentes espécies, para que o controle biológico seja corretamente aplicado, deve-se levar

em conta também o nível inicial de larvas nas pastagens e carga animal (FERNÁNDEZ et al.,

1999a) assim como as condições climáticas (EYSKER et al., 2005).

A contagem de OPG, ao longo do estudo, teve uma diferença significativa entre os

dois grupos (P<0,002). Na análise de percentual de redução entre o grupo A e B, pôde-se

observar que o OPG, nos últimos 3 meses de experimento, diminuiu em média 56,84,% na

quantidade de ovos, variando entre 40,44 a 67,14%, como mostra a Figura 1. DIMANDER et

al. (2003a e 2003b) obtiveram resultados semelhantes, onde o OPG reduziu cerca de 50% em

bovinos tratados com o mesmo fungo e na mesma dosagem.

26

Figura 1 – Contagem de OPG obteve diferença estatística significativa pelo teste de Duncan (P<0,002) entre os grupos: tratado (A) na coluna escura e controle (B) na coluna clara. Houve diferença estatística também entre os meses (*) de experimento (P<0,01). A linha pontilhada demonstra o percentual de redução (%) na contagem de OPG entre os grupos.

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Percentual de redução de OPG

(%) .

Figura 2 – Contagem de OPG, excluindo o animal mais parasitado de cada grupo, obteve diferença estatística significativa pelo teste de Duncan (P<0,001) entre os grupos: tratado (A) na coluna escura e controle (B) na coluna clara. Houve diferença estatística também entre os meses (*) de experimento (P<0,01). A linha pontilhada demonstra o percentual de redução (%) na contagem de OPG entre os grupos.

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AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR

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N°

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Percentual de redução de OPG

(%)

* * * * * * *

* * * * * * * *

27

Na Figura 1, pode-se observar que no 4° mês de uso do fungo na alimentação dos

bezerros (novembro), o OPG diminuiu em ambos os grupos em relação ao mês anterior. Da

mesma forma, o percentual de redução de OPG chegou próximo a zero (0%) pela diferença do

grupo A e B ser quase a mesma. Entretanto, este resultado não era esperado. Em uma nova

análise do banco de dados foi verificado que um único animal do grupo tratado (A) possuía

carga parasitária 10 vezes maior que os demais indivíduos do mesmo grupo. Ao excluir das

análises estatísticas este indivíduo do grupo e o indivíduo com a maior carga parasitária do

grupo controle (B), e realizando-se novamente o cálculo de percentual de redução observamos

uma mudança significativa (P>0,001), onde o percentual sobe para 59% no mês de novembro,

conforme mostra a Figura 2. Isto se deve provavelmente, a resistência individual ao

parasitismo. Conforme MORALES (2001) existem animais dentro de um rebanho que são

caracterizados como respondedores, resilientes e sensíveis ou acumuladores de parasitas.

Possivelmente este animal era um acumulador ou sensível, pois vinha apresentando este perfil

desde o início do experimento.

Por outro lado, houve uma queda significativa no OPG de ambos os grupos nos meses

de outubro/novembro. Isto se deve possivelmente, a redução do percentual de larvas na

pastagem entre o mês de setembro e outubro (Figura 3), levando os animais a ingerirem

menos larvas e, portanto, eliminarem menos ovos, bem como foi observado por DIMANDER

et al. (2003 b). Outra hipótese a ser relatada é o fenômeno de autocura que os animais sofrem

após o advento de um período de chuvas intensas, quando as contagens de ovos de vermes nas

fezes caem, em virtude da eliminação da maior parte da carga de vermes adultos

(URQUHART et al., 1996). Ao ingerem grande quantidade de larvas, como o ocorrido nos

meses de outubro para novembro (Figura 3), o organismo sofre uma reação de

hipersensibilidade tipo imediata a antígenos derivados das larvas em desenvolvimento. As

larvas acabam sendo destruídas e conseqüentemente chegam poucas larvas na fase adulta que

eliminarão os ovos.

Novamente a contagem de OPG voltou a crescer em dezembro possivelmente pelas

condições climáticas de temperatura e de índice pluviométrico adequadas para o

desenvolvimento do ciclo (Figura 2).

28

Figura 3 - Contagem de larvas (L3) na pastagem por quilo de matéria seca obteve diferença estatística

significativa pelo teste de Duncan (P<0,01) entre os grupos: tratado (A) na linha preta contínua (a) e controle na linha cinza (b). A linha pontilhada (c) demonstra a percentagem de redução de larvas (L3) na pastagem entre os grupos, no período de oito meses.

A coprocultura demonstrou que o percentual dos principais nematódeos encontrados

ao longo do estudo, em média, no grupo A e B, foram respectivamente: Cooperia sp. com

47,89 e 41,89% e Haemonchus sp. com 35,33 e 46,11%. Outras espécies encontradas em

menor quantidade no grupo A e B respectivamente, foram: Oesophagostomum sp.(10,56 e

7,56%), Ostertagia sp. (5,33 e 3,11%), Nematodirus sp. (0,44 e 0,56%), Trichostrongylus sp.

(0,33 e 0,56%), Strongyloides sp.(0,11 e 0,22%). Para os principais parasitas, Cooperia sp. ,

Haemonchus sp., Oesophagostomum sp. e Ostertagia sp. verificou-se através do Teste T

(Tabela 1), ao nível de significância de 5%, não haver diferença significativa na proporção de

parasitas em relação aos grupos até o final do experimento. Estudo realizado por ARAÚJO et

al. (2004), demonstraram que o fungo D. flagrans não é seletivo para um determinado gênero

de parasitas, confirmando os resultados obtidos.

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Redução de L

3 na pastagem (%

) .

a

b

c

29

Tabela 1: Teste T, ao nível de significância de 5% entre os grupos A (tratado) e B (controle) dos principais parasitas.

Grupo A (tratado) B (controle) Parasita Média Desvio

Padrão Média Desvio

Padrão

p

Cooperia sp. 47,89 15,87 41,89 18,57 NS Haemonchus sp. 35,33 12,56 46,11 17,85 NS Oesophagostomum sp. 10,56 11,16 7,56 6,62 NS Ostertagia sp. 5,33 4,36 3,11 4,04 NS

p = nível mínimo de significância do Teste T NS= não significativo

O fungo D. flagrans aprisiona os helmintos às redes tridimensionais e logo após

segue-se a penetração das hifas na cutícula do nematóide onde ocorre o crescimento destas

hifas e a digestão dos conteúdos internos (MOTA et al., 2003). Devido ao seu modo de ação,

vários trabalhos têm demonstrado que D. flagrans é bastante eficaz para reduzir o número de

larvas na matéria fecal e, como conseqüência, na pastagem. Assim, sob diferentes condições

de estudo, a eficácia de D. flagrans na redução de larvas na pastagem observada por

GRØNVOLD et al. (1993), foi de 74-85% em bovinos. Já BIRD & HERD (1995)

demonstraram 83% de eficácia do fungo em bovinos, ovinos e eqüinos e FERNÁNDEZ et al.

(1999c) apresentaram resultados de 55-64% e 78-94% em bovinos com 2 isolados diferentes

do fungo D. flagrans. A recuperação de larvas na pastagem obteve um percentual de redução

de 77,05% ao final do experimento, como demonstrado na Figura 3, sendo este resultado

significativo (P<0,01) entre os grupos no teste de Duncan. Por outro lado, no 4° e 5° mês de

estudo (novembro e dezembro), o percentual de redução caiu, ou seja, o número de larvas

recuperadas na pastagem aumentou em ambos os grupos, conforme se observa na Figura 3,

provavelmente pelo aumento do índice pluviométrico neste período (Figura 4). D. flagrans se

desenvolve melhor entre 20 a 25°C e um índice pluviométrico entre 15 e 60mm por semana

conforme GRØNVOLD et al. (1996b). Além disso, segundo DIMANDER et al. (2003b), com

o aumento das chuvas sobre os bolos fecais recém eliminados no campo ocorre uma rápida

desintegração do esterco e, portanto, a separação física entre os esporos fúngicos e os estágios

larvais pré-parasíticos, não permitindo a ação do fungo. Mesmo com o aumento de

recuperação de larvas na pastagem dos dois grupos, pode-se observar que o número de larvas

do grupo A (tratado) manteve níveis semelhantes ao início do experimento, diferente do grupo

30

B (controle) que atingiu seu nível máximo triplicando o número de larvas no mês de

novembro, contrariando o estudo de DIMANDER et al. (2003b) que com chuvas em excesso

não observou diferença entre o grupo tratado e o controle. Da mesma forma, EYSKER et al.

(2005) obtiveram resultados pouco promissores na redução de larvas na pastagem em

períodos de seca utilizando uma dosagem de 5x105 clamidósporos/kg de peso animal.

Figura 4 - Temperatura máxima nas colunas escuras, temperatura mínima nas colunas claras e o índice pluviométrico na linha contínua, durante o período de oito meses, na região de Júlio de Castilhos (RS).

Diferente do que foi encontrado por esses autores, no presente estudo ocorreu um

período de estiagem de dezembro a março se comparada a série histórica do mesmo período

(Figura 5), e, mesmo assim, atingiu bons resultados. Neste caso, a dosagem do fungo sugere

relação com as condições climáticas. Por esse motivo, é adequada a suspensão da oferta do

fungo aos animais, até que o intenso período de chuvas diminua e logo seja reiniciada a

administração, sob pena de estar administrando desnecessariamente o produto.

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mm

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FONTE: Estação de Júlio de Castilhos da Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária/FEPAGRO (Comunicação Pessoal)

Figura 5 - Série histórica de temperatura máxima nas colunas escuras, temperatura mínima nas colunas claras e o

índice pluviométrico na linha contínua, dos meses de agosto a março, no período de 1994 a 2003 , na região de Júlio de Castilhos (RS).

A média de peso dos animais entre os dois grupos não foi estatisticamente

significativa (P>0,67). Contudo numericamente, ao final do experimento, o grupo A (tratado)

teve um incremento médio de 11,5 Kg a mais que o grupo B (Figura 6). O quadro de estiagem

nos últimos 3 meses de estudo, pode ter afetado neste resultado, devido à baixa

disponibilidade de alimento. Em um estudo realizado por DIMANDER et al. (2003a) em

bovinos, não houve diferença de peso entre grupo tratado com D. flagrans e o controle, mas

observou-se significativa diferença entre o grupo tratado com ivermectina e o controle (P <

0,0001) que aumentou em média 38Kg. Até o momento, não há relato de que o fungo

influencie no ganho de peso de bovinos, de forma direta e significativa. Contudo,

CHANDRAWATHANI et al. (2004) obtiveram um resultado significativo (P=0.054) no peso

de ovinos com a administração de D. flagrans. Pode-se deduzir também que o parasitismo

mensurado pelo OPG não influenciou no ganho de peso dos animais, da mesma forma como

os resultados encontrados por NICOLAU et al. (2002) em que os coeficientes de correlação

entre ganho de peso e contagem de OPG foram próximos a zero. Entretanto, tais achados

divergem das correlações negativas e significativas observadas por PLOEGER &

KLOOSTERMAN (1993) em novilhas de raças leiteiras, e por O'KELLY et al. (1988) em

novilhas de corte.

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Figura 6 – Evolução da média do peso dos animais (Kg) entre o grupo tratado (A) em linha contínua e o grupo

controle (B) em linha interrompida, no período de oito meses de experimento, não obteve diferença significativa pelo teste de Duncan (P>0,67).

Na análise de sangue (Tabela 2), realizada através da análise de variância, utilizando

delineamento em medidas repetidas, complementada pelo teste de comparações múltiplas de

Tukey, ao nível de significância de 5%, verificou-se não haver interação significativa entre

grupo e mês. Quanto aos efeitos principais, somente mês foi significativo, ou seja,

independente do grupo, os meses de agosto, dezembro e janeiro apresentaram as menores

médias de hematócrito não diferindo entre si, mas sendo significativamente menores do que

os meses de setembro, outubro e novembro. Para todos os meses, não houve diferenças entre

os grupos. Mesmo com os resultados de hematócrito demonstrados, não foi possível

estabelecer uma correlação negativa com o número de ovos encontrados nas fezes dos animais

(P>0,62). Estes achados diferem dos encontrados por MORALES et al. (2001) em que os

valores do hematócrito dos animais estudados foram influenciados pelo nível de infecção

parasitária, correspondendo os valores mais elevados de hematócrito aos animais negativos ou

com infecções leves. Segundo MORALES et al. (1996), esta correlação negativa entre a carga

parasitária e o valor do hematócrito tem sido vinculado à presença de parasito hematófago

como o do gênero Haemonchus, nos animais. Entretanto no presente estudo, não foi

encontrada esta correlação ainda que um dos principais parasitas encontrados tenham sido os

do gênero Haemonchus (Tabela 1). É possível que esta correlação negativa não tenha sido

observada devido ao curto período de tempo que os animais encontravam-se parasitados, pois

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AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR

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Kg

221 kg

209,5 kg

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conforme GENNARI et al. (1991) a maior conseqüência do parasitismo é o caráter crônico da

infecção.

Tabela 2: Análise de Variância, utilizando delineamento em medidas repetidas, complementada pelo Teste de Comparações Múltiplas de Tukey, ao nível de significância de 5%, entre o percentual de Hematócrito dos grupos A (tratado) e B (controle), no período de 6 meses.

Grupo A (Tratado) B (Controle)

Total

Mês Média Desvio Padrão

Média Desvio Padrão

Média Desvio Padrão

Agosto 31,90 5,86 32,40 3,57 32,15 b 4,73 Setembro 35,30 4,97 35,50 3,03 35,40 a 4,01 Outubro 38,78 3,15 35,90 3,25 37,26 a 3,45 Novembro 36,20 4,61 34,60 2,07 35,40 a 3,57 Dezembro 32,00 4,40 31,80 3,46 31,90 b 3,85 Janeiro 30,40 3,57 30,00 3,06 30,20 b 3,24 Total 34,02 5,21 33,37 3,67 33,69 b 4,49

“a” e “b”: letras iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)

34

5 CONCLUSÃO

Os resultados deste estudo demonstraram que o fungo Duddingtonia flagrans tem

capacidade nematofágica significativa em bovinos jovens alimentados com pastagem nativa e

suplementação com ração de manutenção, em uma carga animal no campo que iniciou com

0,8 unidade animal/hectare e terminou com 1,2 unidade animal/hectare, principalmente em

relação à redução de larvas na pastagem.

Portanto, mesmo em condições climáticas adversas, como a seca ocorrida no Rio

Grande do Sul no período de dezembro a março de 2004/2005 e o excesso de chuvas em

outubro de 2005, houve uma redução significativa de larvas na pastagem e conseqüentemente

do OPG dos animais, o que permite afirmar que o emprego deste fungo na produção extensiva

de bovinos é eficaz como uma ferramenta de controle biológico de nematódeos.

35

REFERÊNCIAS

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