O TREINAMENTO FÍSICO MELHORA SINALIZAÇÃO DA INSULINA E...
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE CLEBER DE MEDEIROS O TREINAMENTO FÍSICO MELHORA SINALIZAÇÃO DA INSULINA E A VIA mTOR/P70 S6K EM MIOCÁRDIO DE RATOS OBESOS CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2009
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
CLEBER DE MEDEIROS
O TREINAMENTO FÍSICO MELHORA SINALIZAÇÃO DA
INSULINA E A VIA mTOR/P70S6K EM MIOCÁRDIO DE RATOS
OBESOS
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2009
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CLEBER DE MEDEIROS
O TREINAMENTO FÍSICO MELHORA SINALIZAÇÃO DA
INSULINA E A VIA mTOR/P70S6K EM MIOCÁRDIO DE RATOS
OBESOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde para obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Teodoro de
Souza
3
Dedico esta dissertação a minha mãe Maria
Regina, a pessoa mais batalhadora que
conheço.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus;
Aos meus irmãos Joênio e Rodrigo que mesmo distantes nunca deixaram de me
apoiar;
Pâmela, minha namorada e querida companheira de todas as horas;
Aos meus colegas de trabalho, que se tornaram amigos Victor, Josete, Bárbara e
especialmente ao amigo e professor Joni Marcio;
Aos colegas de pós-graduação, Viviane, Marisa e Willians.
Ao professor e amigo Ricardo Pinho, mestre que me ensinou a dar os primeiros
passos na carreira acadêmica;
Ao meu orientador e amigo “De Souza” um verdadeiro “Doutor” na biologia
molecular, agradeço pelos ensinamentos.
A todas as pessoas que participaram de forma direta ou indireta para conquista
de mais um objetivo.
5
“O fundamental não é ser bom... mas sim, estar bem preparado”.
Bernardinho
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RESUMO
Introdução: A obesidade e a resistência a insulina vem aumentando os problemas de saúde publica. Estes distúrbios estão relacionados com muitas doenças, incluindo as doenças cardiovasculares. Atuando através da Akt / mTOR, insulina inativa fatores de transcrição FOXO, uma classe de proteínas altamente conservadas que tem numerosas e importantes funções fisiológicas, como a indução do crescimento e sobrevivência de muitos tipos de células além da hipertrofia cardíaca. A Obesidade e a resistência à insulina podem causar "hipertrofia patológica cardíaca”, no entanto, o exercício de treinamento é capaz de induzir a "Hipertrofia fisiológica cardíaca”, um fenômeno que parece estar relacionada com a via molecular da mTOR/p70. O presente trabalho visou avaliar os efeitos do treinamento físico sobre a sinalização da insulina e também a via mTOR/P70S6K em músculo cardíaco de ratos wistar obesos por dieta hiperlipídica.
Métodos e Resultados: Foram utilizados ratos wistar induzidos a obesidade por dieta hiperlipídica e submetidos a um protocolo de treinamento aeróbio (Natação) uma hora por dia, com uma freqüência de cinco vezes/semana durante 12 semanas. O treinamento físico reduziu o peso corporal, gordura epididimal, e a níveis séricos de insulina. As análises de Western blot mostraram que o exercício físico aumentou a atividade de moléculas envolvidas na sinalização intracelular da insulina; tais como IR, IRS-1, IRS-2, Akt e Foxo1. Além disso, foi verificou-se redução da atividade e expressão de proteínas envolvidas com redução da transdução do sinal insulínico, como JNK, PTP1B, PTEN, IkB�, NFkB e SOCS-3. Finalmente, o treinamento aumentou a atividade de moléculas envolvidas com a síntese de proteína, como mostrado pelo aumento da fosforilação Raptor, S6, p70S6K, 4E-BP1, associação da mTOR com Raptor e à redução da expressão atrogin-1.
Conclusão- Os resultados demonstram um papel fundamental do exercício físico na regulação de moléculas como a Akt/mTOR, que por sua vez, promove a hipertrofia cardíaca fisiológica.
Palavras chaves: Obesidade, Insulina, Treinamento Físico, Síntese protéica, Coração.
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ABSTRACT Background— Obesity and insulin resistance are rapidly expanding public health problems.
These disturbances are related to many diseases, including heart pathology. Acting through
the Akt/mTOR pathway, insulin inactivates Foxo transcription factors, a class of highly-
conserved proteins that have numerous and important physiological functions, such as the
induction of growth and survival of many cell types and cardiac hypertrophy. Obesity and
insulin resistance can cause “pathological” cardiac hypertrophy; however, training exercise is
known to induce “physiological” cardiac hypertrophy, a phenomenon that seems to be related
to the mTOR/p70 pathway in heart.
Methods and Results—To evaluate the effect of training exercise on physiological cardiac
hypertrophy in obese Wistar rats, we analyzed the effects of 12 weeks of swimming on
obese rats, induced by a high-fat diet. Training exercise reduced body weight, epididymal fat,
fasting serum insulin and plasma glucose disappearance. Western blot analyses showed that
training exercise increased the ability of insulin to phosphorylate intracellular substrates such
as IR, IRS-1, IRS-2, Akt and Foxo1. Moreover, reduced activity and expression of proteins
induced by high-fat diet in rats, such as JNK, phospho-c-jun, PTP1B, PTEN, phosphoIkB�,
NFkB and SOCS-3, were observed. Finally, exercise training increased the activity of
transduction pathways of insulin-dependent protein synthesis, as shown by increases in
Raptor phosphorylation, S6 phosphorylation, p70SK phosphorylation, 4E-BP1
phosphorylation, mTOR with Raptor association and reduction of atrogin-1 expression.
Conclusions— Results demonstrate a pivotal regulatory role of training exercise on the
Akt/mTOR pathway, which in turn promotes physiological cardiac hypertrophy while
antagonizing pathological hypertrophy, in the presence of insulin.
Key Words: Exercise training, insulin resistance, cardiac hypertrophy, mTOR/p70
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LISTA DE ABREVIATURAS
Akt (Protein Kinase B/Akt)
eIF4G
GSK-3
GLUT 4
IGF-1
IR (Insulin Receptor)
IRS (Insulin Receptor Substrate)
IKK (IkappaB kinase)
IL-1�
IL-6
NFkB (Nuclear Factor Kappa B)
mTOR (mammalian Target of Rapamicy)
PI3K
PTP-1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)
P70S6K
TNF-� (Tumor Necrosis Factor alfa)
Proteína quinase B
Fator de iniciação eucariotica
Glicogênio sintetase quinase 3
Transportador de glicose 4
Fator de crescimento semelhante a
insulina
Receptor de Insulina
Substrato receptor de insulina
Complexo enzimático com atividade
serina-quinase
Interleucina 1�
Interleucina 6
Fator de transcrição kappa B.
Proteína alvo de rapamicina
Fosfatidilinositol 3-quinase.
Proteína Tirosina Fosfatase 1B.
Proteína quinase ribossomal S6 de
70 kDA
Fator de necrose tumoral �.
9
4E-BP1
Inibidor do fator de iniciação da
tradução protéica.
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................11
1.1 Obesidade, Diabetes e Via de Sinalização da Insulina..................................11
1.2 Obesidade e Resistência a Insulina..................................................................17
1.3 Efeitos Moleculares do Exercício Físico Sobre a Síntese Protéica...............19
1.4 Aspectos Moleculares Envolvidos na Hipertrofia Cardíaca...........................21
2 OBJETIVOS............................................................................................................25
2.1 Objetivo Geral.....................................................................................................25
2.2 Objetivos Específicos........................................................................................25
3 ARTIGO………………………………………………………………………..........……26
4 DISCUSSÃO………............………………………………………………...........…….51
REFERÊNCIAS……………....……………………………………………………............62
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Obesidade, Diabetes e Via de Sinalização da Insulina.
A obesidade pode ser definida, de forma simplificada, como uma doença
caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal, conseqüência de uma
ingestão calórica excessiva e/ou reduzido gasto energético e que acarreta
repercussões à saúde (Organização Mundial de Saúde, 2008). Alguns estudos que
correlacionam aspectos genéticos à ocorrência de obesidade não têm sido capazes
de evidenciar a interferência destes em mais de um quarto dos obesos, fazendo com
que ainda se acredite que o processo de acúmulo excessivo de gordura corporal, na
maioria dos casos, seja desencadeado por aspectos sócio-ambientais (Bouchard,
1991; Stunkard, 2000, Bouchard, 2009). A obesidade está relacionada a prevalência
de várias doenças crônicas ou mesmo mortalidade (Stamler et al, 1986; Lissner &
Heitmann, 1986; Lenz et al, 2009). Caracterizada por sua incidência e prevalência
mundial, a obesidade é considerada um pandemia. Esse distúrbio está associado a
inúmeros problemas de morbidade e mortalidade e tem sido considerado um dos
mais preocupantes problemas de saúde nos países ocidentais (Ogden et al, 2006).
Estimativas de prevalências de sobrepeso e obesidade na população americana
entre 1999-2000 mostrou continuo aumento entre crianças e adultos. (Flegal et al,
2002; Ogden et al, 2002). No Brasil, mudanças demográficas, socioeconômicas e
epidemiológicas ao longo do tempo permitiram que ocorresse a transição dos
padrões nutricionais, com a diminuição progressiva da desnutrição e aumento da
obesidade (Monteiro et al, 1995).
No que concerne ao seu impacto, tem sido inclusive demonstrado que a
obesidade é o preditor mais potente para o aumento da hipertrofia cardíaca,
12
sobrepujando inclusive a hipertensão arterial. (de Simone et al, 1992; Verdecchia et
al, 1994). Desta forma, indivíduos obesos tendem a apresentar o aumento no
tamanho do coração quando comparados com indivíduos não obesos. (Crisostomo
et al, 1999; Chadha et al, 2009). Em 2004 Li e colaboradores realizaram um estudo
longitudinal acompanhando crianças obesas e analisaram a relação entre o risco
cardiovascular e a massa do ventrículo esquerdo até a idade adulta. Após anos de
estudo concluíram que crianças obesas tendem a ter o ventrículo esquerdo do
coração maior quando crescem, aumentando os riscos de doenças cardíacas. Estes
resultados demonstram que a obesidade no início da infância é um preditor
consistente no desenvolvimento da hipertrofia ventricular esquerda. Fatores
metabólicos e hemodinâmicos estão relacionados com a obesidade promovendo
mudanças na função e estrutura do miocárdio, resultando no aumento da parede do
ventrículo esquerdo. A função e a regulação do sistema cardiovascular tem
substancialmente demonstrado estar alterada na obesidade (Ribeiro et al, 2005), por
meio de vários mecanismos (Schunkert, 2002). A obesidade é a causa isolada de
11% dos casos de insuficiência cardíaca em homens e 14% dos casos em mulheres
nos Estados Unidos (Galinier et al., 2005).
Similar a obesidade, a prevalência do diabetes mellitus tipo 2 tem se
elevado vertiginosamente em muitos países do mundo, e se espera um incremento
ainda maior. Nos países em desenvolvimento, há uma tendência de aumento na
freqüência em todas as faixas etárias, especialmente nas mais jovens, cujo impacto
negativo sobre a qualidade de vida e a carga da doença aos sistemas de saúde é
imensurável (King et al, 1998; Roglic & Unwin, 2009). A relação entre obesidade e
diabetes tipo 2 é bem estabelecida. O diabetes tipo 2 resulta, em geral, de graus
variáveis de resistência à insulina e deficiência relativa de secreção de insulina. A
13
maioria dos pacientes tem excesso de peso e a cetoacidose. O diagnóstico, na
maioria dos casos, é feito a partir dos 40 anos de idade, embora possa ocorrer mais
cedo, mais raramente em adolescentes (Associação Americana de Diabetes, 2000).
Segundo a Sociedade Brasileira de Diabetes (2006) a obesidade influencia no
desenvolvimento de diabetes ou intolerância à glicose. Segundo a Organização
Mundial de Saúde (2008) os riscos de doença cardiovascular e diabetes tipo 2
tendem a aumentar concomitantemente com a elevação do índice de massa
corporal (IMC). Em termos de morbidade, o diabetes mellitus atualmente representa
uma das principais doenças crônicas que afetam o homem contemporâneo,
acometendo indivíduos de países em todos os estágios de desenvolvimento
econômico-social (Rull et al, 1992)
Há tempos estudos demonstram uma intima relação entre obesidade,
diabetes tipo 2 e doenças cardiovasculares. (Ohlson et al, 1985; Björntorp, 1985;
Ohlson et al, 1988). Nos diabéticos com idades acima de 65 anos as complicações
incluem a duplicação das taxas de infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca
congestiva (Sloan et al, 2008)
Como a obesidade constitui-se num fator com relação direta com resistência à
insulina e com o desenvolvimento do diabetes tipo 2, inúmeras pesquisas vem
sendo realizadas, com a preocupação de entender as mais diversas alterações
moleculares que contribuem para a instalação da resistência periférica à ação da
insulina (De Souza et al, 2005a; De Souza et al, 2005b; Araújo et al, 2005; Ropelle
et al, 2006; Prada et al, 2006;). Além de estar freqüentemente relacionada com
anormalidades metabólicas e cardíacas, como hipertensão, dislipdemia,
aterosclerose e síndrome metabólica, a resistência à insulina leva a um defeito no
transporte da glicose no músculo esquelético, fator fundamental para o
14
desenvolvimento do diabetes tipo 2 (Reaven, 1988; Defronzo & Ferrannini , 1991;
Reaven, 1993, De Souza et al, 2005a; De Souza et al, 2005b;)
A sinalização intracelular da insulina começa com sua ligação a um receptor
específico de membrana, uma proteína heterotetramérica com atividade quinase,
composta por duas subunidades alfa e duas subunidades beta, denominado
receptor de insulina (IR) (Kasuga et al, 1982; Saltiel & Kahn, 2001). A ativação do IR
resulta em fosforilação em tirosina de diversos substratos, incluindo substrato do
receptor de insulina 1 (IRS-1) e 2 (IRS-2) (Haber et al, 2001). A fosforização das
proteínas IRSs cria sítios de ligação para outra proteína citosólica denominada
fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), promovendo sua ativação. A PI3K é importante na
regulação da mitogenese, diferenciação celular e efeitos metabólicos estimulada
pela insulina (Saad et al, 1993). A PI3K foi originalmente identificada como um
dímero composto de uma subunidade catalítica (p110) e uma subunidade regulatória
(p85). A fosforização dos sítios de tirosina das proteínas IRSs ao domínio SH2 da
subunidade p85 da PI3K ativa o sítio catalítico associado (Backer et al, 1992) A
enzima catalisa a fosforização dos fosfoinositídeos na posição 3 do anel de inositol
produzindo fosfatidilinositol -3 fosfato, fosfatidilinositol – 3,4 difosfato e
fosfatidilinositol -3,4,5 trifosfato. A ativação da PI3K aumenta a fosforização em
serina da proteína quinase B (Akt).
Uma importante função da Akt é fosforilar a FKHR, uma proteína da
superfamília dos fatores de transcrições Forkhead. Após diversos nomes e sistemas
de classificações na literatura, tem sido usada uma nova nomenclatura para essas
proteínas, como forkhead Box (fox), (Kaestner et al, 2000). Em mamiferos
acrescenta-se O (outros) à proteína Fox, indicando outras classes da superfamília
da Fox (Kaestner et al, 2000; Barthel et al, 2005), refletindo diferentes subfamílias da
15
família Fox devido a seqüências diferentes em seus domínios de DNA. A presença
de sítios de fosforilação da Akt nos domínios das Forhead são características
distintas das proteínas FoxO. Estudos genéticos em C elegans têm demonstram que
a ativação da via PI3K/Akt pela insulina ou fatores de crescimento como IGF-1,
suprime a atividade do fator de transcrição DAF-16, um ortólogo da proteína FoxO
em mamíferos (Kimura et al, 1997; Lin et al, 1997; Ogg et al, 1997). Três membros
da família Forkhead em mamíferos incluem a Foxo1 (FKHR), Foxo3a (FKHRL1) e
Foxo4 (AFX), e somente em humanos, a Foxo6 (Biggs et al, 1999; Brunet et al,
1999). A Foxo1 foi inicialmente identificado em C elegans como um fator de
transcrição ativado pela insulina e que se localiza distalmente a via da PI3K. Este
fator de transcrição é fosforilado pela Akt em três resíduos de serina e treonina;
Thr24, Ser256 e Ser319. A fosforilação desses três sítios da Foxo resulta em sua
extrusão nuclear e sua conseqüente inativação (Ogg et al, 1997, Barthel et al, 2001,
Biggs et al, 1999, Brunet et al, 1999).
As proteínas FoxO podem regular expressão de genes envolvidos em
apoptose, ciclo celular, reparo de DNA, estresse oxidativo, longevidade e controle de
crescimento. Foi identificado recentemente que a Foxo pode estar envolvida no
balanço entre hipertrofia e atrofia muscular por controlar a expressão da atrogina-1
de maneira dependente da insulina (via PI3K/Akt).
16
Figura 1 – Sinalização celular da insulina
A insulina aumenta a síntese e bloqueia a degradação de proteínas através
da ativação da mTOR. Esta molécula controla a translação de proteínas diretamente
através da fosforilação da p70 ribossomal S6 quinase (P70S6K), e culmina com
ativação da síntese ribossomal de proteínas através da fosforilação da proteína S6.
A mTOR também fosforila a PHAS1, que aumenta a síntese protéica via aumento da
translação de proteínas. ( Thomas & Hall,1997; Brunn et al, 1997; Miron et al, 2001).
Especificamente, a insulina promove a fosforilação da Akt, um regulador
upstream da mTOR, que é peça chave da iniciação da tradução e síntese protéica
devido sinalização de moléculas como 4E-binding protein 1 (4E-BP1) e ribossomal
S6 quinase 1 (S6K1) (Terada et al, 1994; Lin & Lawrence, 1996; Rhoads, 1999;
Wang & Proud, 2006,)
17
Figura 2 – Regulação da síntese protéica.
1.2 – Obesidade e Resistência a Insulina
O aumento de peso é inversamente proporcional a sensibilidade à insulina
(Steppan et al, 2001). A ingestão de dieta rica em lipídeos está associada com uma
redução na captação de glicose em diferentes tecidos, caracterizado pela diminuição
na sensibilidade à insulina. (Prada et al, 2006)
A obesidade está associada a uma resposta inflamatória crônica,
caracterizada pela produção anormal de adipocina e a ativação de algumas vias de
sinalização pró-inflamatórias, resultando na indução de vários marcadores biológicos
de inflamação (Hotamisligil et al, 1993; Bastard et al, 2002; Sartipy et al, 2003).
Inversamente, uma redução no peso corporal é acompanhada por uma diminuição
ou até mesmo uma normalização desses marcadores inflamatórios (van Dielen et al,
2004; Cottam et al, 2004). Estudos com modelos animais demonstraram que estes
processos inflamatórios têm uma relação direta com a obesidade e suas co-
morbidades, como a resistência à insulina, diabetes tipo 2 e doenças
cardiovasculares (Bastard et al, 2006)
18
Como já descrito anteriormente a obesidade pode levar a resistência a
insulina, sendo possível que essa menor responsividade à insulina esteja
relacionada com o maior acúmulo de tecido adiposo e aumento da produção de
citoquinas pro-inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-�) e
interleucinas (IL-1�, IL-6) (Jellema et al, 2004). Os níveis elevados de TNF-� e IL-6
modulam a resistência à insulina através de vários mecanismos distintos, incluindo
JNK1, fosforilação em serina no IRS-1, IKK, NF-KB e a indução e ativação de
SOCS-3 (Tilg & Hotamisligil, 2006). Desta forma, a ativação da resposta imune na
obesidade é mediada por vias de sinalização específica, com JNK e IKK. Estes os
eventos podem modificar a sinalização de insulina e resultar no desenvolvimento de
resistência à insulina (Karalis et al, 2009). Além do efeito direto do IKK� em fosforilar
o IRS-1 em resíduos de serina, ele pode ativar indiretamente o NF-KB, um fator de
transcrição que, dentre outros alvos, pode estimular a produção de vários
mediadores inflamatórios, incluindo o TNF-�. O NF-KB mantém-se seqüestrado no
citoplasma associado ao IkB. No entanto, a fosforilação do IKK� é capaz de fosforilar
e degradar o IB fazendo com que o NF-KB dirija-se até o núcleo onde promove a
transcrição gênica de proteínas inflamatórias. O NF-KB corresponde a uma família
de fatores de transcrição celulares envolvidos na expressão de uma grande
variedade de genes que regulam a resposta inflamatória (Baeuerle & Baltimore,
1996). O NF-KB encontra-se inativo no citoplasma celular. Na presença de estímulos
indutores, ele é ativado e transloca-se para o núcleo, onde se liga a genes
específicos que serão ativados. Este é o mais potente fator de transcrição gênica
pró-inflamatório. Liga-se a genes específicos, estimulando a produção e a liberação
das citocinas pró-inflamatórias (TNF-� e IL-6), moléculas de adesão,
imunomoduladoras, fatores ativadores de linfócitos T e B, LPS bacteriano, proteínas
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virais, fatores de crescimento e fatores indutores de estresse físico e fisiológico
como as radiações UV e gama, além de inúmeros agentes químicos (Brown et al,
1995; Carlsen et al,2002; Montera, 2007), a neutralização da ação do TNF-� em
ratos obesos resulta numa diminuição da resistência a insulina. (Hotamisligil et al,
1993). Estudando o TNF-� em tecido adiposo Kern (1996) demonstrou que
indivíduos obesos apresentam um aumento na expressão de TNF-�, e após a
redução de peso corporal consequentemente ocorre uma diminuição de TNF e
melhora da sensibilidade periférica à insulina.
1.3 - Efeitos Moleculares do Exercício Físico Sobre a Síntese Protéica
A insulina é considerada um hormônio anabólico que promove aumento na
síntese e no crescimento celular (Fujita et al, 2007; Bertrand, 2008). O controle da
síntese protéica pela insulina envolve a fosforilação/desfosforilação de fatores de
tradução e proteínas ribossomais (Proud, 2002; Hedhli et al, 2005), dentre elas
destaca-se a proteína alvo de rapamicina (mTOR), (Sartorelli & Fulco, 2004;
Harridge, 2007; Sandri, 2008; Kadi, 2008). Vários estudos mostram que a via Akt/
P70S6K, tem sido implicada na indução de respostas hipertróficas em ambos os
músculos esquelético e cardíaco (Baar & Esser, 1999; Bodine et al, 2001b; Haddad
& Adams, 2006). A mTOR também ativa a liberação da 4E-BP1 do eIF-4E (fator de
iniciação da tradução). Uma vez liberado da ligação com o 4EBP1, o eIF-4E liga-se
a um outro fator de iniciação o eIF-4G, e este por sua vez leva a iniciação da
tradução ribossomal (Cantley, 2002; Proud, 2004). Portanto, parece que a falta de
efeito pela ablação das S6K, pode ser devido a mTOR atuar na via da eIF-4E para
20
promover a hipertrofia. Numerosos estudos já demonstraram que a via da insulina
regula moléculas como a P70S6K, 4E-BP1 e eIF-4E no coração. (Pham et al, 2000;
Wang et al, 2000; Jonassen et al, 2001; Beauloye et al, 2001; Sharma et al, 2007;
O exercício físico, como já bem estabelecido, corresponde a um potente
agente trófico para a musculatura, o qual aumenta os níveis locais de IGF-1. Vários
estudos mostram que o treinamento físico aumenta a produção de IGF-1,
conduzindo para uma cascata de ativação seqüencial, ordenada por PI3K, PDK1 e 2
(quinase dependente de fosfoinositídeos-1 e 2) e Akt (Wojtaszewski et al, 1999;
Somwaret al, 2001; Huang et al, 2009).
Sabe-se que diferentes tipos de treinamento (endurance e resistido) utilizam
diferentes formas de regulação. Por exemplo, o treinamento resistido induz
fosforilação da enzima P70S6K, enquanto o treinamento de endurance não induz
essa modulação covalente e, portanto, deve recrutar outro mecanismo de regulação
da tradução do mRNA. A P70S6k especificamente, na forma fosforilada acelera a
tradução dos mRNA de proteínas contráteis, aumentando, assim, a síntese dessas
proteínas, induzindo a hipertrofia (Baar & Esser, 1999; Bodine et al, 2001b)
Estudos mais recentes mostram que parte dessa via é ativada com
treinamento físico aeróbico. Em 2005 Konhilas e colaboradores observaram que o
treinamento físico foi capaz de aumentar a fosforilação das moléculas Akt e P70S6K
no coração, concomitante com um aumento significativo da massa cardíaca.
Estudando a via molecular envolvida na hipertrofia cardíaca, Kemi e colaboradores
(2008) observaram ativação de mTOR após o treinamento físico com aumento na
expressão de seus substratos S6K1 e 4E-BP1. É possível que tanto a ativação de
S6K1, quanto de 4E-BP1 via Akt/mTOR estejam envolvidas no processo de
hipertrofia induzida pelo treinamento físico.
21
1.4 Aspectos Moleculares Envolvidos na Hipertrofia Cardíaca.
A hipertrofia do músculo pode ser definida como o aumento do tamanho do
músculo, ou seja, da área de secção transversa do músculo (Phillips, 2000; Eliasson
et al, 2006), e ocorre de duas formas: pelo aumento do diâmetro da fibra quando há
uma banda de terminação neuromuscular, e também, pelo aumento do comprimento
da fibra (aumento do número de fibras na área transversa) com duas bandas de
terminação neuromuscular (Rosenthal, 2002). Falando especificamente do coração,
as hipertrofias cardíacas são resultantes da adaptação do miocárdio a uma
sobrecarga fisiológica ou patológica e apresentam características fenotípicas e
funcionais diferentes, além de serem classificadas de modo geral como concêntricas
ou excêntricas. Em estados patológicos, a sobrecarga de pressão pode levar à
hipertrofia cardíaca, como ocorre na estenose aórtica ou na hipertensão arterial, que
está associada a um espessamento da parede ventricular esquerda e a uma
diminuição da dimensão interna, denominada hipertrofia ventricular esquerda
concêntrica. De modo geral, a hipertrofia patológica apresenta-se de forma irregular
ou assimétrica e está associada a um maior índice de morbidade e mortalidade
(Weber et al, 1991; Díez et al, 2005). Inversamente, a hipertrofia ventricular
esquerda excêntrica induzida pelo treinamento físico refere-se ao aumento de
massa muscular em resposta a sobrecarga de trabalho nas sessões de exercício
(Barbier et al,2006; Carreño et al, 2006). Esta hipertrofia é um mecanismo fisiológico
compensatório, caracterizado principalmente pelo aumento do comprimento e
diâmetro dos cardiomiócitos, desta forma sendo responsável pela manutenção da
tensão na parede ventricular em níveis fisiológicos (Longhurst & Stebbins, 1996;
22
Shephard, 1996; Colan, 1997; Urhausen & Kindermann, 1999). A hipertrofia cardíaca
fisiológica está associada com um número normal ou aumentado de capilares do
miocárdio, ao passo que a hipertrofia patológica está associada com uma redução
na densidade capilar (Hudlicka et al, 1992).
A hipertrofia do miocárdio ocorre em quase todas as doenças que
acometem o coração (Franchini, 2001), e constitui-se num dos principais
mecanismos de adaptação do coração em face de uma sobrecarga de trabalho, de
pressão ou de volume imposta ao coração em determinadas condições (Oliveira e
Krieger, 2002). Em resposta a ativação neuro-humoral, hipertensão ou outras lesões
no miocárdio, o coração inicialmente compensa com um aumento adaptativo da
massa ventricular (Ni et al, 2006). As conseqüências clínicas da hipertrofia cardíaca
incluem desenvolvimento de arritmias cardíacas, disfunção diastólica e insuficiência
cardíaca (Levy et al, 1990; Messerli, 1992). Há alguns anos tem sido descrito que o
desenvolvimento da hipertrofia cardíaca está associado à mudança na expressão
gênica dos cardiomiócitos e das proteínas contráteis fetais. (Nair et al, 1968; Izumo
et al, 1987).
Com o avanço da tecnologia, têm se estudado as vias moleculares na qual
está envolvido o aumento da massa ventricular, fazendo com que algumas
moléculas venham a ser investigadas no processo que envolve da hipertrofia
cardíaca. Em 1998, Schluter e colaboradores utilizando cardiomiócitos em meio de
cultura e inibindo a PI3K verificaram ausência de hipertrofia. No entanto, foi em 2001
que Cho e colaboradores, estudando Drosophila melanogaster, puderam comprovar
que essa é uma via fundamental para o crescimento celular. Essa idéia foi
recentemente confirmada em culturas de tecidos de vertebrados e em
camundongos. Na fase adulta, fatores fisiológicos (exercício físico) ou patológicos
23
(hipertensão arterial, doença valvular) levam a estimulação crônica da via PI3K/Akt
induzindo ao processo de hipertrofia do miocárdio (Proud, 2004; Heineke e
Molkentin, 2006).
O processo hipertrófico envolve duas cruciais moléculas independentes como
a mTOR e a GSK-3ß que são mediadas pela Akt. (Parkington et al, 2004; Léger et
al, 2006). Ativação da Akt em vários tecidos leva à ampliação do órgão, e em todos
os casos, o aumento do tamanho da célula é um dos principais contribuintes para o
fenótipo (DeBosch et al, 2006). No entanto, alguns estudos indicam que a insulina
estimula a síntese protéica e inibe sua degradação no coração (Brownsey et al,
1997; Bertrand et al, 2008).
Recentes estudos mostram que a mTOR é uma importante molécula na via
de ativação da P70S6K, uma proteína crucial para a síntese protéica e hipertrofia
(Browsey et al, 1997; Shiojima et al, 2002;). Animais Knockout para o receptor de
insulina específico para o coração têm massa cardíaca reduzida (Belke et al, 2002) e
ativação reduzida da Akt e da P70S6K (Shiojima et al, 2002). Por outro lado, a
superexpressão da Akt em cardiomiócitos isolados aumenta a síntese protéica
(Shiojima et al, 2002.), e camundongos com superexpressão da Akt têm maior
atividade da P70S6K e aproximadamente 2,3 vezes maior hipertrofia ventricular
(Matsui et al, 2002). Além disso, o tratamento com rapamicina previne a ativação da
P70S6K e hipertrofia ventricular após banding aórtico. O aumento cardíaco é em
grande parte atribuído ao alargamento dos cardiomiócitos, ocorrendo um aumento
de até quase 3 vezes no seu diâmetro durante o desenvolvimento da infância até a
fase adulta (Rakusan, 1984). DeBosch e colaboradores (2006) realizaram estudo
com o objetivo de analisar a ausência de Akt1 em camundongos e sua relação com
o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, em resposta a diferentes estímulos. Os
24
Animais foram divididos em dois grupos, um grupo realizou treinamento físico,
induzindo a uma sobrecarga de volume no coração, e outro grupo foi submetido uma
sobrecarga de pressão pela constrição transversa aórtica. Os resultados mostraram
que Akt estabelece uma regulação crucial na hipertrofia cardíaca fisiológica e
patológica. Anteriormente, Oh e colaboradores (1998) demonstraram em
cardiomiócitos que sobrecargas de pressão ativam a via PI3K/Akt na resposta
hipertrófica. Vários estudos evidenciam que o aumento da síntese protéica é um
elemento chave da hipertrofia cardíaca (Matsui, 2002; Hannan et al, 2003).
Entretanto, até o momento nenhuma investigação sobre as possíveis alterações da
expressão e atividade da via PI3K/Akt/mTOR/P70S6K foi realizada em músculo
cardíaco de animais tratados com dieta hiperlípidica; tampouco avaliações sobre os
efeitos do exercício físico nesta via de sinalização em músculo cardíaco de animais
resistentes a insulina por dieta rica em gordura.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
• Estudar os efeitos do exercício físico sobre as vias Akt/mTOR e
Akt/FOXO/ATROGINA-1 no músculo cardíaco de ratos obesos induzidos por dieta
hiperlipídica.
2.2 Objetivo Especificos
• Estudar os efeitos da dieta rica em gordura sobre a sinalização da insulina em
músculo cardíaco;
• Verificar os efeitos do exercício físico sobre a via de sinalização da insulina
em músculo cardíaco de ratos obesos;
• Verificar os efeitos do exercício físico sobre a expressão e atividade da
atrogina em músculo cardíaco de ratos obesos;
• Avaliar a expressão e atividade das moléculas pró-inflamatórias e proteínas
tirosinas fosfatases em músculo cardíaco de ratos obesos;
• Verificar os efeitos do exercício físico sobre expressão e atividade das
moléculas pró-inflamatórias e proteínas tirosinas fosfatases em músculo cardíaco de
ratos obesos.
26
3. ARTIGO
Exercise training reverses insulin resistance and up regulates the
mTOR/p70S6K pathway in cardiac muscle of diet-induced obesity
rats.
1Cleber Medeiros, 1Marisa JS Frederico, 1Gabrielle da Luz, 2José R. Pauli, 3Adelino
S.R. Silva, 1Ricardo A. Pinho, 4Lício A. Velloso, 4Eduardo R. Ropelle, *,1Cláudio T. De
Souza
1Exercise Biochemistry and Physiology Laboratory. Postgraduate Program in Health
Sciences. Health Sciences Unit. University of Southern Santa Catarina – Criciúma –
SC – Brazil.
2School of Physical Education, Federal University of São Paulo, Department of
Bioscience, UNIFESP, Santos, SP, Brazil.
3School of Physical Education and Sport of Ribeirão Preto, University of São Paulo
(USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil
4Departamento de Clínica Médica, FCM, Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas, SP, Brazil.
RUNNING HEAD: Exercise increases/induces mTOR/p70 pathway in diet-induced obesity rats. Keywords: mTOR/p70S6K, insulin resistance, exercise training, cardiac hypertrophy
* Please address correspondence to: Claudio Teodoro de Souza, PhD.
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma,
SC, Brazil. Fax: + 55 48 3431-2539
E-mail: [email protected]
27
ABSTRACT
Background— Obesity and insulin resistance are rapidly expanding public health problems.
These disturbances are related to many diseases, including heart pathology. Acting through
the Akt/mTOR pathway, insulin inactivates Foxo transcription factors, a class of highly-
conserved proteins that have numerous and important physiological functions, such as the
induction of growth and survival of many cell types and cardiac hypertrophy. Obesity and
insulin resistance can cause “pathological” cardiac hypertrophy; however, training exercise is
known to induce “physiological” cardiac hypertrophy, a phenomenon that seems to be related
to the mTOR/p70 pathway in heart.
Methods and Results—To evaluate the effect of training exercise on physiological cardiac
hypertrophy in obese Wistar rats, we analyzed the effects of 12 weeks of treadmill training on
obese rats, induced by a high-fat diet. Training exercise reduced body weight, epididymal fat,
fasting serum insulin and plasma glucose disappearance. Western blot analyses showed that
training exercise increased the ability of insulin to phosphorylate intracellular substrates such
as IR, IRS-1, IRS-2, Akt and Foxo1. Moreover, reduced activity and expression of proteins
induced by high-fat diet in rats, such as JNK, phospho-c-jun, PTP1B, PTEN, phosphoIkB�,
NFkB and SOCS-3, were observed. Finally, exercise training increased the activity of
transduction pathways of insulin-dependent protein synthesis, as shown by increases in
Raptor phosphorylation, S6 phosphorylation, p70SK phosphorylation, 4E-BP1
phosphorylation, mTOR with Raptor association and reduction of atrogin-1 expression.
Conclusions— Results demonstrate a pivotal regulatory role of training exercise on the
Akt/mTOR pathway, which in turn promotes physiological cardiac hypertrophy while
antagonizing pathological hypertrophy, in the presence of insulin.
Key Words: Exercise training, insulin resistance, cardiac hypertrophy, mTOR/p70
28
INTRODUCTION
Exercise training is a key intervention for prevention and therapy of obesity and
insulin resistance/diabetes. Exercise increases caloric expenditure and glucose
uptake, primarily1, and exercise training induces physiological hypertrophy associated
with improved cardiac function1. For instance, cardiovascular diseases and type 2
diabetes are among the diseases associated with a history of obesity. Altered insulin
action has been described as an important link between such diseases and obesity.
Whilst total body insulin resistance has been documented frequently in obesity2, the
extent and mechanisms associated with myocardial insulin resistance in obesity not
has been clarified. Significant advances have been made over the last 20 years in the
understanding of the signal transduction elements involved in these insulin effects.
Insulin participates in the regulation of long-chain fatty acid uptake, protein synthesis,
and vascular tonicity. Among these molecular mechanisms, the phosphatidylinositol 3-
kinase/protein kinase B (Akt) pathway is thought to play a crucial role. Under
pathological conditions, such as type-2 diabetes, myocardial ischemia, and cardiac
hypertrophy, insulin signal transduction pathways and their actions are clearly
modified.
Insulin can be considered as an anabolic hormone promoting protein synthesis
and cell growth. The control of protein synthesis by insulin involves
phosphorylation/dephosphorylation of several translation factors and ribosomal
proteins. PKB/Akt is a pivotal element of this complex regulation. PKB/Akt induces
Rheb activation, which, in turn, induces the phosphorylation and activation of the
mammalian target of rapamycin (mTOR)3. The mammalian target of rapamycin
(mTOR)3 is a large (289 kDa) and evolutionarily conserved member of the
phosphatidylinositol kinase-related kinase family. mTOR appears to have multiple
biological functions. In fact, the most well characterized area is its control of cellular
growth and proliferation via the regulation of protein translational machinery.
Insulin has been clearly shown to regulate the Akt/mTOR pathway in
cardiomyocytes.4 Once activated, mTOR mainly regulates two targets involved in the
regulation of protein translation, the 4E-binding protein-1 (4E-BP1) and the p70
ribosomal S6 protein kinase (p70S6K)5. The mTOR-mediated phosphorylation of 4E-
BP1 prevents its inhibitory action on the eukaryotic initiation factor 4E (eIF-4E),
allowing this factor to bind the mRNA cap and stimulate the initiation step of protein
synthesis. Activated p70S6K phosphorylates the S6 ribosomal protein involved in the
regulation of the translation of the 50TOP mRNAs that encode several translation
factors and ribosomal proteins. Therefore, S6 phosphorylation increases both
translation factor content and translational capacity by increasing ribosomal
29
biogenesis. The eukaryotic elongation factor-2 (eEF2) kinase (eEF2K) is another
p70S6K substrate. eEF-2K is a dedicated calcium and calmodulin-dependent kinase
that controls the phosphorylation and inactivation of eEF-2. The insulin-dependent
inactivation of eEF-2K leads to the stimulation of protein elongation. Numerous studies
have already demonstrated the insulin-mediated regulation of 4E-BP16-8,
p70S6K/S66,9,10,8 and eEF-2K/eEF-2 in the heart or in cardiomyocytes.
A key feature of cardiomyocyte hypertrophic growth is the significant increase in
protein synthesis. Previous pharmacological mTOR inhibitor (rapamycin) studies have
inhibited the cardiomyocyte hypertrophic response and the activation of protein
synthesis induced by insulin4 in cultured cardiomyocytes. Furthermore, several studies
have demonstrated that rapamycin may attenuate or regress pressure overload, and
constitutively active Akt-induced cardiac hypertrophy11, suggesting that mTOR is an
important regulator of cardiac hypertrophy.
Conversely, experimental evidence indicates that muscle proteolysis in
catabolic conditions is linked to insulin resistance and, specifically, to defects in the
insulin receptor substrate (IRS)-1–associated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt
pathway11,12. In addition, defective PI3K/Akt signaling reduces the level of the PI3K-
generated product, phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate (PIP3), with a subsequent
decrease in Akt activation. This, in turn, leads to the activation of both caspase-3 and
forkhead transcription factors (FOXO). The former leads to actomyosin cleavage, while
the latter response increases atrogin-1/MAFbx expression and stimulates the
breakdown of muscle proteins.
The process of protein synthesis involves the activation of specific genes, its
transcription and translation. The mammalian target of rapamycin (mTOR) is a key
regulator for cell growth, modulating components of the translation machinery13,5 and
one of its key downstream targets; however the effect of physical training on the
P70S6K molecule in the heart has not yet been studied. The regulation of cell size by
Akt is thought to be mediated by its phosphorylation and by the subsequent
downstream phosphorylation of mTOR on the serine 2448 residue. The latter leads to
increased protein synthesis via phosphorylation of the downstream targets, p70S6K and
4E-BP16.
Therefore, it may be hypothesized that physical training improves the resistance
to insulin action in cardiac muscle, and that activation of this signaling pathway
increases the ribosomal activity and the rate of protein synthesis.
30
MATERIALS AND METHODS
Experimental animals and diet
Thirty-two male Wistar rats from the University of Campinas Central Animal
Breeding Center were used in the investigation. All experiments were approved by the
Ethics Committee of the State University of Campinas (UNICAMP). The 4-week-old
Wistar rats were divided into four groups: control rats (C; n=8) fed on standard rodent
chow (Table 1), control rats submitted to 8-week endurance training with workload
(C+ET; n=8), obese rats fed on an obesity-inducing diet for 2 months (DIO; n=8)
(Table 1), and DIO rats submitted to 8-week endurance training with workload
(DIO+ET; n=8). The control rats were maintained sedentary throughout the
experimental period and the trained rats were submitted to 1 hour of swimming daily,
in water at 32°C, with an attached weight corresponding to 5% of body weight.
Training occurred on 5 days/week for 12 weeks. The rats were allowed free access to
standard rodent chow or high-fat diet and water. No acute bout of exercise preceded
tissue collection.
Sacrifice of the animals
At 24 hours after the last session of the endurance training protocol, the rats
were anesthetized with an intraperitoneal (i.p.) injection of sodium thiopental (40 mg.kg
body weight−1). In all experiments, the appropriateness of anesthesia depth was tested
by evaluating pedal and corneal reflexes, throughout the experimental procedure.
Following the experimental procedures, the rats were killed under anesthesia
(thiopental 200 mg.kg−1), following the recommendations of the NIH publication n�85–
23.
Fasting glucose, insulin tolerance test (ITT), serum insulin quantification
At 24 hours after the last session of the endurance training protocol, the rats
were submitted to an insulin tolerance test (ITT; 1.5 U/kg body weight of insulin).
Briefly, 1.5 IU/kg of human recombinant insulin (Humulin R) from Eli Lilly (Indianapolis,
IN, USA) was injected intraperitoneally in anesthetized mice and blood samples were
collected at 0, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 minutes from the tail for serum glucose
determination. The rate constant for plasma glucose disappearance (Kitt) was
calculated using the formula 0.693/biological half life (t1/2).14 Plasma glucose level was
determined by a colorimetric method using a glucose meter (Advantage, Boehringer
Mannheim, USA). Plasma was separated by centrifugation (1100 g) for 15 min at 4�C
and stored at -80�C until assay. Radioimmunoassay (RIA) was employed to measure
serum insulin, according to a previous description.15
31
Protein analysis by immunoblotting
As soon as anesthesia was assured by the loss of pedal and corneal reflexes,
the abdominal cavity was opened, the cava vein exposed, and 0.2 ml of normal saline
(-) or insulin (10-6 mol.L-1) (+) were injected. After insulin injection, cardiac muscle
(ventricle left) was excised. The tissue was pooled, minced coarsely and homogenized
immediately in extraction buffer (mM) (1% Triton-X 100, 100 Tris, pH 7.4, containing
100 sodium pyrophosphate, 100 sodium fluoride, 10 EDTA, 10 sodium vanadate, 2
PMSF and 0.1 mg of aprotinin/ml) at 4 ºC with a Polytron PTA 20S generator
(Brinkmann Instruments, Westbury, New York, New York, USA) operated at maximum
speed for 30s. The extracts were centrifuged at 11 000 rpm and 4°C in a Beckman
70.1 Ti rotor (Palo Alto, CA, USA) for 40min to remove insoluble material, and the
supernatants of these tissues were used for protein quantification, using the Bradford
method.16 Proteins were denatured by boiling in Laemmili17 sample buffer containing
100 mM DTT, run on SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose membranes.
Membranes were blocked, probed and developed, as described previously.18 The
phospho IRS1ser307, phosphor JNK, phosphor c-jun, PT1B, PTEN, phospho IkB�, NFkB
and SOCS3 antibodies were immunoblotted in myocardium of rats that had not
received previous insulin infusion in the cava vein. Antibodies used for immunoblotting
were anti-IR, anti-IRS1, anti-IRS2, anti-Phosphotyrosine (PY), anti- PI 3K, anti-Akt,
anti-phospho-Akt, anti Foxo1, anti-phospho-Foxo1, anti-phospho- IRS1ser307, anti-
phospho-JNK, anti-phospho-c-jun, anti-PTP1B, anti-PTEN, anti-phospho- IkB�, anti-
NFkB, anti-SOCS3, anti-phospho-Raptor, anti-phospho-mTOR, anti-phospho-S6, anti-
phospho-p70S6K, anti-phospho-4E-BP1, anti-Atrogin and anti-β-actin (Santa Cruz
Biotecnology, Santa Cruz, CA, USA). Chemiluminescent detection was performed with
horseradish peroxidase-conjugate secondary antibodies. Visualization of protein bands
was performed by exposure of membranes to RX-films.
Statistical analysis
The results were expressed as the means ± standard error of mean (SEM).
Differences between the studied groups were evaluated using one-way analysis of
variance (ANOVA). When ANOVA indicated significance, a Tukey post hoc test was
performed.
32
RESULTS
Physiological and metabolic parameters
Table 2 shows comparative data regarding control, diet-induced obesity (DIO)
rats, when sedentary and after training exercise. The DIO group demonstrated a
significant increase in body weight, epididymal fat and fasting serum insulin, but not
fasting glucose, than age-matched rats from both control groups (sedentary or training
exercise). Significant variations were found in body weight, epididymal fat and fasting
serum insulin, but not in fasting glucose, of the DIO rats after training exercise, when
compared with sedentary DIO rats. In addition, the rate constant for plasma glucose
disappearance was increased in the exercise training group by 50% (1.93-fold),
demonstrating a great improvement in the insulin sensibility in this group after exercise
training.
Training exercise improves insulin signaling in the cardiac tissue of DIO rats.
The effects of in vivo i.v. insulin injection on IR, IRS1 and 2 phosphorylation,
Akt serine phosphorylation and Foxo1 phosphorylation were examined in the cardiac
muscle of lean control, DIO rats and control and DIO rats submitted to the exercise
protocol (C+ET and DIO+ET). The cardiac tissues were immunoprecipitated with anti-
IR antibody and then blotted with anti-phosphotyrosine antibody. In myocardium,
insulin induced increases in IR tyrosine phosphorylation, in both C and C+ET groups,
of 3.16-fold and 3.58-fold, respectively, when compared to saline injection (Fig 1A). In
the DIO group, IR tyrosine phosphorylation was reduced after insulin injection by 2.11-
fold, when compared with the respective control group (Fig 1A). In the DIO+ET group,
IR tyrosine phosphorylation increased by 2.3-fold in the cardiac tissue, compared to
respective obese sedentary rats (Fig 1A). There was no difference in basal levels of IR
tyrosine phosphorylation between the groups (data not shown). The IR protein levels
were not different between the groups (Fig 1A -lower panels).
In cardiac muscle, Akt activation is largely controlled by both IRS-1 and IRS-2
during insulin action. Thus, changes in IRS-1 or -IR2 are associated with PI3K and
directly influence Akt phosphorylation and, ultimately, protein metabolism. The cardiac
tissues were immunoprecipitated with anti-IRS1 antibody and then blotted with anti-
phosphotyrosine antibody. IRS1 phosphorylation in the cardiac tissue was increased
after insulin injection in both C and C+ET groups (4.4-fold and 4.5-fold, respectively)
when compared with the control without insulin (Fig 1B). Similar results were observed
in IRS2 tyrosine phosphorylation; insulin induced increases in both C and C+ET
groups by 3.8-fold and 4.66-fold, respectively, when compared to saline injection (Fig
1C). In the DIO group, IRS1 tyrosine phosphorylation was reduced by 1.87-fold, and
33
IRS2 phosphorylation was reduced by 2.3-fold, when compared with the respective
control group (Figs 1B and C respectively). In the DIO+ET group, IRS1
phosphorylation increased by 1.86-fold and 1.83- fold for IRS2 phosphorylation in the
cardiac tissue, compared to the respective obese sedentary group (Figs 1B and C).
There was no difference in basal levels of IRS1 and IRS2 tyrosine phosphorylation
between the groups (data not shown). The IRS1 and IRS2 protein levels were not
different between the groups (Figs 1B and C -lower panels).
The association of IRS1 and IRS2 with PI 3K is related to increased insulin
sensitivity. Therefore, we immunoprecipitated cardiac muscle with anti-IRS1 and IRS2
antibodies and then blotted with anti-PI 3K antibody. Insulin induced increases in
IRS1/PI 3K association in both C and C+ET groups, of 5.1-fold and 6.1-fold,
respectively, when compared with saline injection (Fig 1D). Similar results were
observed in IRS2/PI 3K association, where insulin increased the expression of this
association in both the C and C+ET groups, by 5.3-fold and 5.2-fold, respectively,
when compared with saline injection (Fig 1E). In the DIO group, the IRS1/PI 3K
association was reduced by 1.9-fold, and the IRS1/PI 3K association was reduced by
2.3-fold, when compared with the respective control group (Figs 1E and F
respectively). In the DIO+ET group, the IRS1/PI 3K association increased by 1.86-fold
and 1.83-fold for the IRS2/PI 3K association, when compared to the obese sedentary
group (Figs 1E and FC). There was no difference in basal levels of IRS1 and IRS2
between the groups (data not shown). The PI 3K protein levels were not different
between the groups (Figs 1D and E -lower panels).
The phosphorylation of Akt and Foxo1 is a marker of the insulin signaling
pathway. Insulin induced increases in Akt serine phosphorylation by 5.0-fold and 5.2-
fold in both the C and C+ET groups, respectively, when compared to saline injection
(Fig 1F). Similar results were observed for Foxo1 phosphorylation, where insulin
induced increases of 10.1-fold and 10.2-fold in both the C and C+ET groups,
respectively, when compared to saline injection (Fig 1G). In the DIO group, Akt
phosphorylation was reduced by 3.37-fold and Foxo1 phosphorylation by 2.13-fold,
respectively, when compared with the respective control group (Figs1F and G). In the
myocardium of DIO+ET, Akt phosphorylation increased by 2.3-fold and Foxo1
phosphorylation increased by 1.7-fold, respectively, compared to respective obese
sedentary rats (Figs 1F and G). There was no difference in the basal levels of Akt and
Foxo1 phosphorylation between the groups (data not shown). The Akt and Foxo1
protein levels were not different between the groups (Figs 1F and G -lower panels).
Exercise training reduces transduction pathways induced by high-fat diet in rats.
34
A high-fat diet can activate several transduction pathways that lead to
resistance to insulin and can interfere in protein synthesis. Thus, we analyzed the
expressions of phosphoJNK, phospho-c-jun, PTP1B, PTEN, phosphoIkB�, NFkB and
SOCS-3. Obesity activates the two principal inflammatory pathways (JNK and IkBα/
NF-kB). Both JNK and NF-kB pathways induce inhibitory serine 307 (Ser307)
phosphorylation of IRS-1, causing resistance to insulin.19,20 We investigated JNK and
IkB� phosphorylation, NF-kB expression and IRS ser 307 phosphorylation in cardiac
tissue. The high-fat diet induced an increase in IRSser307 phosphorylation in cardiac
tissue of 2.3-fold in DIO rats, when compared with control rats (Fig 2A). In the DIO+ET
group, IRSser307 phosphorylation decreased by 1.5 –fold, when compared with the
DIO group, at 24 hours after the last exercise session (Fig 2A).
JNK activation was determined by monitoring phosphorylation of JNK. The
high-fat diet induced an increase in JNK phosphorylation of 2.1-fold in DIO rats when
compared with control rats (Fig 2B). After exercise training, JNK phosphorylation
decreased by 1.9-fold in the obese group, when compared with the DIO group (Fig
2B). A similar reduction (2.5-fold) in c-jun phosphorylation was observed in the obese
exercise-trained group, when compared with the obese and sedentary rats (Fig 2C).
No difference was seen in basal levels of JNK and c-jun phosphorylation between the
groups (data not shown). The JNK and c-jun protein levels did not differ between the
groups (Figs 2B and C -lower panels).
Protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) has been implicated in the negative
regulation of insulin signaling. The tumor suppressor, PTEN, is a lipid phosphatase
that dephosphorylates the D3 position of PIP321. Thus, PTEN lowers the levels of the
PI3K product, PIP3, within the cells and antagonizes PI3K mediated cellular signaling.
PTP-1B and PTEN participate in the resistance to insulin in cardiac muscle. The high-
fat diet induced increases in PTP1B and PTEN expressions of 2.2-fold and 2.4-fold,
respectively, in DIO rats when compared with control rats (Fig 2D and E, respectively).
In the exercise-trained obese group, both PTP1B and PTEN expression decreased by
1.5-fold and 1.1-fold, respectively, when compared with the DIO group (Fig 2D and E,
respectively).
We examined the IKK/NF-�B pathway, an important regulator of inflammation,
in obesity and inflammation-induced insulin resistance. The main function of the IKK
complex is the activation of NF-�B through phosphorylation and degradation of
I�B�.19,22 The high-fat diet increased NF-�B expression in cardiac tissue by 2.2-fold in
obese rats, when compared to the lean control (Fig 2G). On the other hand, exercise
training decreased NF-�B expression in obese rats by 1.6-fold, when compared with
35
sedentary obese animals (Fig 2G). Thus, to assess NF-�B activation, we observed
I�B� degradation. Obesity led to an increase in I�B� phosphorylation in cardiac tissue
of 2.2-fold, compared to control lean rats (Fig 2F). However, in DIO+ET rats, I�B�
degradation was decreased by 1.5-fold, when compared to obese sedentary rats (Fig
2F).
SOCS-3 is a suppressor of cytokine signaling, an intracellular modulator of
proinflammatory signaling that is induced by a number of cytokines and hormones that
employ the JAK/STAT signaling system.27 SOCS3 deficiency increases insulin-
stimulated insulin receptor substrate (IRS)-1 and -2 phosphorylation, IRS-associated
phosphatidylinositol 3 kinase activity, and insulin-stimulated glucose uptake. Moreover,
SOCS-3 is required for tumor necrosis factor-alpha full inhibition of insulin-stimulated
IRS-1 and -2 phosphorylation, phosphatidylinositol 3 kinase activity, and glucose
uptake. As such, we analyzed the expression of SOCS3 in our study. A high-fat diet
induces an increased SOCS3 expression. In our results, obese and sedentary rats
demonstrated an increase in SOCS3 expression of 3.3-fold, when compared to the
lean control (Fig 2H). In the DIO+ET group, SOCS-3 expression decreased by 2.4-
fold, when compared with the sedentary obese group (Fig 2G). In figures 2A, D, E, G
and H, the membranes were stripped and immunoblotted with anti-βactin as a loading
protein.
Exercise training increases the activity of transduction pathways of insulin- dependent
protein synthesis.
Recent work has shown that the mTOR (mammalian target of rapamycin)
pathway is an integral cell growth regulator. The mTOR pathway participates in a
functional complex, TORC1, which has been defined by its association with raptor, and
sensitivity to short-term rapamycin inhibition. Raptor is a regulatory-associated protein
of mTOR. In the present study, we evaluated the effect of exercise training on Raptor
activity in the myocardium of obese animals. A single dose of insulin induced
remarkable increases in Raptor phosphorylation of both the C and C+ET groups, of
4.5-fold and 4.6-fold respectively, when compared to saline injection (Fig 3A). In the
DIO group, Raptor phosphorylation was reduced after insulin injection by 2.25-fold,
when compared with the respective control group (Fig 3A). In the DIO+ET group,
Raptor phosphorylation increased by 1.7-fold in the cardiac tissue, compared to the
respective obese sedentary group (Fig 3A). There was no difference in basal levels of
Raptor phosphorylation between the groups (data not shown). The Raptor protein
levels did not differ between the groups (Fig 3A -lower panels).
36
Is well established that, in the presence of insulin, the physical association of
mTOR and Raptor promotes the access of mTOR to specific downstream targets,3
including 4E-BP1 and p70S6K. Accordingly, we measured mTOR-associated Raptor, as
assessed by co-immunoprecipitation. As shown in Fig 3B, insulin increased the
association of mTOR and Raptor in both the C and C+ET groups by 5.0-fold and 6.1-
fold respectively, when compared to saline injection (Fig 3B). In the DIO group, this
association was reduced after insulin injection by 2.7 -fold, when compared with the
respective control group (Fig 3B). In DIO rats submitted to the training protocol, mTOR
and Raptor association increased by 2.0-fold in the cardiac tissue, compared to
respective DIO groups (Fig 3B). There was no difference in basal levels of mTOR
between the groups (data not shown). Raptor protein levels were not different between
the groups (Fig 3B-lower panels).
In addition to S6K, p70S6K is also a major target of Raptor/mTOR signaling.3 As
the phosphorylation of both S6 and p70S6K plays a critical role in promoting protein
synthesis,28 we next examined whether training exercise increased the activities of
both S6 and p70SK in obese rats. As shown in Fig 3C, insulin induced increases in S6
phosphorylation in both the C and C+ET groups of 3.3-fold and 4.2-fold, respectively,
when compared to saline injection (Fig 3A). Similar results were observed for p70S6K
phosphorylation, where insulin increased p70S6K phosphorylation in both the C and
C+ET groups, by 4.5-fold and 4.6-fold, respectively, when compared to saline injection
(Fig 3D). In the DIO group, both S6 and p70S6K phosphorylation was reduced after
insulin injection by 2.2-fold and 2.6-fold, respectively, when compared with the
respective control group (Fig 3C and D, respectively). In the DIO+ET group, both S6
and p70S6K phosphorylation increased by 1.6-fold and 1.9-fold, respectively, in the
cardiac tissue, compared to the respective DIO groups (Fig 3C and D, respectively).
There were no differences in basal levels of S6 and p70S6K phosphorylation between
the groups (data not shown). The S6 and p70S6K protein levels did not differ between
the groups (Figs 3C and D -lower panels).
The eukaryotic initiation factor 4E (eIF-4E) binding protein-1 (4E-BP1) contains
at least six phosphorylation sites, including two (Thr37/46) that are hierarchical
regulatory sites activated by mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling. In
response to Akt activation, mTOR forms a complex with the regulatory-associated
protein of mTOR (Raptor), a 150-kDa polypeptide,3 and then phosphorylates 4E-
BP129. In the absence of insulin or growth factors, 4E-BP1 is hypophosphorylated and
4E-BP1 association with eIF4E serves to repress translation. When phosphorylated,
4E-BP1 dissociates from eIF-4E and allows translation initiation.30 Here, in our study,
37
insulin induced remarkable increases in 4E-BP1 phosphorylation in both the C and
C+ET groups of 8.2-fold and 8.4-fold, respectively, when compared to saline injection
(Fig 3E). In the DIO group, 4E-BP1 phosphorylation was reduced after insulin injection
by 2.1-fold, when compared with the respective control group (Fig 3E). In the DIO+ET
group, 4E-BP1 phosphorylation increased by 1.4-fold, compared to sedentary obese
rats (Fig 3E). There were no differences in basal levels of 4E-BP1 phosphorylation
between the groups (data not shown). The 4E-BP1 protein levels did not differ
between the groups (Fig 3E -lower panels).
MAFbx (atrogin-1), an F-box protein, promotes skeletal muscle protein
degradation31,32 and contributes to muscle atrophy by targeting proteins for
ubiquitination and proteasomal degradation33. In cardiac tissue, injection of insulin
induced decreased atrogin-1 expression by 2.0-fold in the C group, when compared to
saline injection (Fig 3F). Surprisingly, insulin markedly reduced atrogin-1 expression
in the C + ET group, by 6.0-fold, when compared to saline injection (Fig 3F). In the
DIO group, atrogin-1 expression was increased after insulin injection by 3.5-fold, when
compared with the respective control group (Fig 3F). In the DIO+ET group, atrogin-1
expression was reduced by 2.1-fold in the cardiac tissue, compared to respective
sedentary obese animals (Fig 3F). The membrane was then stripped and
immunoblotted with anti-βactin as a loading protein (Fig 3F -lower panels).
DISCUSSION
High-fat diets trigger obesity and insulin resistance.2 Obesity, if uncorrected,
leads to cardiac hypertrophy and compromised myocardial function and energy
metabolism, contributing to enhanced cardiac morbidity and mortality. Pathological
hypertrophy is initially a compensatory response that eventually leads to
decomposition resulting in left ventricle dilation, myocyte loss, increased interstitial
fibrosis, and heart failure34 in obese individuals.35 To date, a plethora of cellular
signaling pathways have been shown to participate in the hypertrophic response,
including the tonic activation of the serine-threonine kinase Akt in response to growth
factors, angiotensin II, mechanical stress, oxidative stress, and calcineurin and
reduced degradation of terminally misfolded proteins by the ubiquitin-proteasome
system.36,37,738 However, Akt can also be activated by the signaling pathway of insulin,
which is deficient in these animals.39 It is well established that exercise can improve
insulin resistance by sensitizing muscle to insulin-mediated glucose metabolism, and
exercise has been successfully used to treat or prevent obesity and type 2 diabetes in
patients. While increased wall stress can lead to pathological cardiac hypertrophy,
38
increased demand for cardiac output can also cause a physiological increase in cell
size, as commonly seen in endurance athletes.40 In addition, exercise alleviates
peripheral insulin resistance, diminishing activation of Akt, for instance.
Akt may regulate a wide variety of signaling molecules involved in the
hypertrophic response, such as the mammalian target of rapamycin,4 eukaryotic
initiation factor 4E-binding proteins,37 p70S6k 41,37 and forkhead transcriptional factors.42
Moreover, the activity of Akt is also under the control of PTEN;43 however, little
information is available regarding the effect of the physical training on the cardiac
hypertrophic response that results from diet-induced obesity. Thus, in the present
study, we evaluated the effects of physical training on the molecular pathway of insulin
via the mTOR.
High-fat diet intake triggers dyslipidemia, insulin resistance, obesity, and type 2
diabetes.2 However, in our animal model, Wistar rats became obese and insulin
resistant, as this strain does not have a genetic predisposition for the development of
type 2diabetes. This is supported by our current findings of elevated plasma insulin,
glucose levels and increased body weight. In our study, training exercise improved
biochemical and physiological parameters of animals. Moreover, 12 weeks of training
exercise improved insulin signaling in the cardiac tissue of DIO rats, as may be
observed by the increased ability of insulin to phosphorylate intracellular substrates
such as IRS-1, IRS-2, Akt and Foxo1 in the cardiac tissue of DIO rats submitted to
training exercise. Our study was the first to observe the mechanisms of the
improvement in insulin signaling that is induced by physical exercise in the cardiac
tissue of obese mice.
Obesity has been strongly associated with the expression of a proinflammatory
program of gene expression including IKK/NF-�B and JNK.19,20 Increased activation of
proinflammatory pathways such as inhibitor of NF-�B (I�B) kinase/NF-�B (IKK/NF-
�B)19,44 and JNK20 results in an aberrant cascade of cellular events that ultimately leads
to impaired insulin signaling and skeletal muscle insulin resistance. Moreover,
activation of these proinflammatory pathways has direct catabolic effects on skeletal
muscle.45 TNF-� impairs muscle protein synthesis46 and increases muscle protein
degradation23 while IL-6 increases muscle protein degradation.24 Schenk and
Horowitz25 showed that a single session of exercise improves insulin sensitivity via a
reversal in the activation of these proinflammatory pathways in muscle skeletal. In
addition, exercise training has been shown to reverse excessive activity of the
IkappaB/NFkappaB pathway in subjects with type 2 diabetes.19 We, herein, show for
the first time, that training exercise reduces activation of both the NF-�B and JNK
pathways in the cardiac tissue of DIO rats. This effect is responsible for the decreased
39
inhibitory serine 307 (Ser307) phosphorylation of IRS-1, leading to a decreased
resistance to insulin.
In addition, we evaluated some proteins induced by high-fat diet, such as
PTP1B, PTEN and SOCS3. This protein has been reported to bind to the insulin
receptor and prevent the coupling of IRS-1 with the insulin receptor, thereby inhibiting
IRS-1 phosphorylation and downstream insulin signaling.26,27,21 In our study, 12 weeks
of training exercise reduced the expression of both phosphatase and SOCS3. These
results show that exercise training decreases the expression of factors that can lead to
insulin resistance. Results suggest that this may be one of the mechanisms by which
physical training increases protein synthesis in the myocardium.
As previously mentioned, insulin not only enhances glucose uptake, but also
regulates tissue growth via the mTOR signaling pathway.3,47 Thus, one mechanism by
which exercise training could increase cardiac physiological hypertrophy may be by
increasing the insulin sensitivity in cardiac tissue of obese rats. In support of this idea,
deletion of the insulin receptor in the heart during early postnatal life has been shown
to result in a small heart.48 PI3K activity is essential for both basal cell growth and
adaptive (physiological) hypertrophy. Thus, PI3K inhibitors attenuate basal rates of
protein synthesis and abolish increases in protein synthesis induced by insulin in
neonatal cardiomyocytes.38 Hu and colleagues26 found that increased PTEN
expression reduced PIP3 formation and, thus, protein degradation is increased. In
addition, Wang and colleagues 49 found that insulin resistance accelerates muscle
protein degradation through activation of the ubiquitin-proteasome pathway by defects
in muscle cell signaling. These studies and our study may explain how reduced
expression of factors that can lead to insulin resistance such as PTEN, PTP1B,
SOCS3 and proinflammatory pathways by exercise training can lead to increased
insulin sensitivity and, in turn, activate insulin-dependent pathway protein synthesis.
In addition, the mTOR pathway has been implicated in growth by the activation
of protein synthesis and ribosomal biogenesis. However, protein synthesis and
ribosomal biogenesis are energy-requiring processes, and the ability of mTOR to
sense glucose may allow cells to detect adequate nutrient availability prior to
stimulating growth. Training exercise increases reuptake of glucose in cardiac muscle
and consequently provides energy to energy-requiring processes.
Raptor acts as an essential scaffolding protein for mTOR3,50 and, in the
presence of insulin and nutrients, the Raptor-mTOR complex phosphorylates and
inhibits 4E-BP1 from binding to eIF4E. Suppressing the binding of 4E-BP1 to eIF4E
allows the formation of the eIF4F complex and subsequent initiation of translation.29,51
In the present study, training exercise in the presence of insulin induced remarkable
40
increases in 4E-BP1 phosphorylation in obese rats. Other studies show that, in the
presence of reduced fully functional mTOR, increased levels of 4E-BP1 may interact
with Raptor and further limit the ability of mTOR-Raptor complexes to signal to other
downstream targets, including p70S6 kinase. Interestingly, the mTOR-catalyzed
phosphorylation of 4E-BP1 in vitro is entirely dependent on the presence of Raptor,51,29
whereas the mTOR-mediated phosphorylation of p70S6K (another downstream target
of mTOR signaling essential for anabolism) in vitro is less dependent on the presence
of Raptor.51 In our study, training exercise was not found to activate p70S6K,
independently of the presence of Raptor. Interestingly, Ohanna and colleagues52
suggested the presence of an mTOR-independent pathway that acts in concert with
p70S6K to mediate Akt-induced growth, and hypothesized that inhibition of Foxo1 could
fulfill such a function. Although Southgate and colleagues42 reported that Foxo proteins
might exert p70S6K-independent effects on growth and data indicated that Foxo
proteins may also play an important role in regulating the phosphorylation (and,
therefore, function) of p70S6K phosphorylation. Furthermore, the increase in
phosphorylation of Foxo1 decreases the expression of atrogin-1/MAFbx and reduces
proteolysis in the ubiquitin-proteasome system. Some studies have shown that low
phosphorylation of Akt leads to activation of caspase-3 and an increased expression of
atrogin-1/MAFbx; the latter response results from a decrease in Akt–dependent
phosphorylation of Foxo.47,50 In our study, we showed that training exercise improves
insulin signaling through increased phosphorylation of Foxo1 and Akt, thereby
increasing mTOR-associated Raptor expression, phosphorylation of S6K, p70S6K and
4E-BP1. Finally training exercise also reduces expression of atrogin-1, an effect
associated with the phosphorylation of Foxo1 and improvement in insulin pathways.
These results suggest that 12 weeks of training exercise increase Akt/mTOR
activity or expression and may promote physiological growth of the heart, while
antagonizing pathological growth in the presence of insulin. These results suggest the
usefulness of therapeutic exercise training for obese and insulin-resistant individuals
with acquired pathological cardiac hypertrophy and increased protein catabolism.
Moreover, training exercise may therefore have therapeutic utility in the treatment of
hypertensive heart disease and congestive heart failure. It may be postulated that it
will be possible to convert pathological cardiac hypertrophy to a more adaptive,
physiological form.
41
ACKNOWLEDGMENTS
This study was supported by grants from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). We thank Dr Nicola Conran for
English language editing.
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46
Table 1. Components of high fat and chow diet
IngredientsStandard chow
(g/Kg)Kcal/Kg
High fat diet(g/Kg)
Kcal/Kg
Cornstarch (Q.S.P) 397,5 1590 115,5 462Casein 200 800 200 800Sucrose 100 400 100 400Dextrinated starch 132 528 132 528Lard - - 312 2808Soybean Oil 70 630 40 360Cellulose 50 - 50 -Mineral Mix 35 - 35 -Vitamin Mix 10 - 10 -L-cystine 3 - 3 -Choline 2,5 - 2,5 -Total 1000 3948 1000 5358
TABLE 2. Physiological and metabolic parameters.
Groups
(n=8)
Body weight
(g)
Epididymal fat (g)
Plasma glucose (mg. dL-1)
Insulin (ng.ml-1)
Kitt (%.min-1)
C (lean) 407.8 ± 23.1 5.18 ± 0.65 79.4 ± 5.3 2.46 ± 0.4 4.71 ± 0.21
C+ET 399.2 ± 16.8 4.91 ± 0.79 83.4 ± 4.2 2.31 ± 0.6 4.87 ± 0.17
DIO 509.5 ± 31.5* 13.96 ± 1.4* 102.7 ± 5.8 7.95 ± 0.79* 2.2 ± 0.2*
DIO+ET 437.6 ± 28.9# 8.91 ± 1.2# 91.4 ± 6.5 3.58 ± 1.5# 4.66 ± 0.3#
*p < 0.05, DIO rat at rest versus C and C+ET and #p < 0.05, DIO+ET versus DIO rat at rest.
47
Figure legends
Figure 1. Insulin signaling in the cardiac tissue of controls and DIO sedentary rats or DIO rats after an 12-week swimming training program. Cardiac extracts from rats injected with saline or insulin were prepared, as described in Methods. A, B and C, tissue extracts were immunoprecipitated (IP) with anti-IR�, IRS1 or IRS2 antibodies, respectively, and blotted (IB) with anti-PY antibody (upper panels, respectively) or anti-IR�, -IRS1 or -IRS2 antibodies (lower panels, respectively). D and E, tissue extracts were IP with anti-IRS-1 or –IRS2 antibodies (upper panels, respectively) and IB with anti-PI 3K antibody (lower panels, respectively). F, cardiac extracts were IB with anti-phospho Akt or anti-Akt antibodies (upper and lower panels, respectively). G, cardiac extracts were IB with anti-phospho Foxo1 or anti-Foxo1 antibodies (upper and lower panels, respectively). The results of scanning densitometry are expressed as arbitrary units. Bars represent means ± S.E.M. of n = 5 or 6 rat. *p < 0.05, control versus exercise-trained rats. # p < 0.05, control sedentary versus sedentary DIO rats and § p < 0.05, exercised DIO group versus sedentary DIO rat.
Figure 2. Effects of training exercise on inflammatory pathways in cardiac tissue of DIO rats. Cardiac extracts from rats were prepared, as described in Methods. A, cardiac extracts were IB with anti-phospho IRS1ser307 or -�-actin antibodies (upper and lower panels, respectively). B and C, cardiac extracts were IB with anti-phospho-JNK or -p-c-jun antibodies, (upper panels, respectively) and anti-JNK or –c-jun antibodies (lower panels, respectively). D and E, cardiac extracts were IB with anti-PT1B or –PTEN antibodies (upper panels, respectively) and anti-�-actin antibody (lower panels, respectively). F and G, cardiac extracts were IB with anti-phospho-IkB� or anti-NFkB antibodies (upper panels, respectively) and anti-IkB� or -�-actin antibodies (lower panels, respectively). H, cardiac extracts were IB with anti-SOCS3 or -�-actin antibodies (upper and lower panels, respectively). The results of scanning densitometry are expressed as arbitrary units. Bars represent means ± S.E.M. of n = 5 or 6 rats. *p < 0.05, control versus exercise-trained rats. # p < 0.05, sedentary control versus sedentary DIO rats and § p < 0.05, exercised DIO group versus sedentary DIO rats.
Figure 3. Effects of training exercise on transduction pathways of insulin-dependent protein synthesis.. Cardiac extracts from rats were prepared as described in Methods. A and B, cardiac extracts were IB with anti-phospho-Raptor or –mTOR antibodies, (upper panels, respectively) and anti-Raptor or –mTOR antibodies (lower panels, respectively). C and D, cardiac extracts were IB with anti- phospho-S6 or –p70SK antibodies (upper panels, respectively) and anti-S6 or –p70SK antibodies (lower panels, respectively). E and F, cardiac extracts were IB with anti- phospho-4E-BP1 or anti-Atrogin 1 antibodies (upper panels, respectively) and anti-4E-BP1 or –anti-�-actin antibodies (lower panels, respectively). The results of scanning densitometry are expressed as arbitrary units. Bars represent means ± S.E.M. of n = 5 or 6 rat. *p < 0.05, control versus exercise-trained rats. # p < 0.05, sedentary control versus sedentary DIO rats and § p < 0.05, exercised DIO group versus sedentary DIO rats.
48
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2000.0
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C IB: pS6
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51
4. DISCUSSÃO
A prevalência de sobrepeso e obesidade é um grave problema de saúde
publica. (Healthy People 2010, 2000; Ogden et al; 2006, Salihu et al, 2009).
Estimativas da prevalência de obesidade entre a população dos Estados Unidos em
1999-2000 mostraram aumentos contínuos entre crianças e adultos (Flegal et al;
2002, Ogden et al; 2002). A obesidade está relacionada ao desenvolvimento de
diabetes ou intolerância à glicose (Sociedade Brasileira de Diabetes, 2005). Os
riscos de doença cardiovascular e diabetes tipo 2 tendem a aumentar
concomitantemente com o aumento do índice de massa corporal (IMC) (Organização
Mundial de Saúde, 2008). O impacto negativo do aumento da quantidade de gordura
corporal sobre a sensibilidade à insulina pode ser claramente demonstrado na
maioria dos indivíduos, assim como a redução da resistência à insulina observada
com a perda de peso e o exercício físico (Goodyear & Kanh, 1998)
O exercício físico tem sido apontado por muitos autores como promotor de
bem estar e saúde aos seus praticantes, contribuindo favoravelmente com o sistema
circulatório, respiratório, imunológico, entre outros, e reduzindo os fatores deletérios
ao organismo relacionados ao sedentarismo (Pate et al; 1995; Hardman, 1996;
Boule et al, 2003; Swain & Franklin, 2006; Haskell et al, 2007; Nelson, 2007).
Fatores hemodinâmicos e metabólicos podem contribuir para melhora da
homeostasia da glicose após uma sessão aguda de exercício físico em indivíduos
com resistência a insulina (Henriksen, 2002, Ropelle et al, 2006). Esses benefícios
fazem com que o exercício físico seja considerado uma das pedras angulares tanto
do tratamento como da prevenção do diabetes do tipo 2. Neste contexto o presente
52
estudo demonstrou que ratos submetidos a uma dieta hiperlipídica mostraram
aumento do peso corporal total e apresentou resistência a insulina, como já
descritos em estudos anteriores (Ropelle et al, 2006; Pauli et al, 2007, De Souza et
al, 2007).
A descoberta do substrato do receptor de insulina (IRS) e do seu papel de
ligar os receptores da superfície celular para as cascatas de sinalização intracelular
é um passo fundamental para a compreensão da ação da insulina e do fator de
crescimento semelhante a insulina (IGF). Além disso, as proteínas IRS coordenam
as vias de sinalização da insulina/IGF por receptores de atividade tirosina quinase
com aqueles gerados por nutrientes e citocinas pró-inflamatórias (White, 2002). As
funções fisiológicas do IRS-1/2 foram recentemente estabelecidas através da
produção de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2). O camundongo que não expressa
IRS-1 apresenta resistência à insulina e retardo de crescimento, mas não é
hiperglicêmico. Foi demonstrado que o IRS-2 poderia compensar parcialmente a
ausência de IRS-1, o que explicaria o fenótipo de resistência à insulina sem
hiperglicemia do camundongo knockout de IRS-1. (Araki et al, 1994).
Recentemente, Gollisch e colaboradores (2009) concluíram em seu estudo
que o treinamento físico leva a uma melhora na tolerância à glicose em animais
treinados quando comparados a sedentários e obesos por dieta hiperlipídica.
Algumas revisões estabelecem que o treinamento físico seja peça chave no controle
da homeostasia da glicose em quadro de resistência a insulina. (Zierath, 2002;
Kirwan & del Aguila, 2003; Ivy, 2004).
O presente estudo demonstrou um aumento na fosforilação dos receptores
de insulina (IR/IRS1-2) e na associação dos substratos receptores de insulina com a
53
PI3K no grupo de animais treinados. Resultados encontrados neste estudo são
semelhantes a estudos anteriores, mostrando que o treinamento físico aumenta a
fosforilação dos receptores de insulina em ratos obesos. (Hevener et al, 2000;
Saengsirisuwan et al, 2004). Em 2002, Luciano e colaboradores analisaram os
efeitos do treinamento de endurance sobre a primeira etapa da via de sinalização
insulina no músculo de ratos eutróficos. Os resultados demonstraram que
treinamento físico foi suficiente para melhorar a sensibilidade à insulina, aumentando
a fosforilação do IRS-1/2, bem como a associação dessas proteínas com a PI3K em
animais estimulados com insulina quando comparados aos animais controles.
Segundo Franke e colaboradores (1997), a associação do IRS1-2 com a PI3K leva a
ativação da Akt, uma serina quinase com ação pleiotrópica em vários tecidos. A Akt
é uma molécula que está envolvida tanto no crescimento quanto no metabolismo
cardíaco (Matsui & Rosenzweig, 2003; Abel, 2004; Dorn & Force, 2005;), além de
estar envolvida na hipertrofia fisiológica e patológica (Matsui et al, 2002; Shioi et al,
2002; Taniyama et al, 2005, DeBosch et al, 2006; Muslin & DeBosch, 2006). No
presente estudo foi analisado a fosforilação da Akt, que demonstrou estar
aumentada nos grupos de animais controle e obesos submetidos ao treinamento
físico, quando comparados aos animais sedentários. Os mecanismos moleculares
envolvidos na melhora da captação de glicose com o treinamento têm sido
atribuídos à expressão aumentada e a atividade das principais proteínas de
sinalização envolvidas na regulação da absorção e metabolismo da glicose.
Dados epidemiológicos demonstram que os efeitos antiinflamatórios do
exercício podem ser um mecanismo importante para explicar os efeitos
cardioprotetores do exercício físico. (Hamer & O’donovan, 2009). Em 1999,
Gonçalves e Luciano mostraram, em ratos Wistar, que o exercício físico atenuou a
54
resposta inflamatória, podendo interferir na recuperação tecidual. O tecido adiposo
secreta ativamente diversas citocinas pró-inflamatórias. Assim, a associação entre o
grau da obesidade e a inflamação é esperada. A origem desse conceito apoia-se no
fato de que o nível circulante de muitas citocinas e proteínas que estão associadas à
inflamação apresentam-se elevadas em pacientes obesos. Os adipócitos secretam
várias citocinas e proteínas de fase aguda que, direta ou indiretamente, elevam a
produção e circulação de fatores relacionados com a inflamação. (Trayhurn, 2007)
A Obesidade é caracterizada pela ativação de um processo inflamatório em
locais metabolicamente ativos, tais como tecido adiposo, fígado e células do sistema
imunológico. A conseqüência dessa resposta é um grande aumento nos níveis
circulantes de citocinas pró-inflamatórias, adipocinas e outros marcadores
inflamatórios. Ativação da resposta imune na obesidade é mediada por vias de
sinalização específica, como JNK (c-jun N-terminal kinase) e IKK (Ikappa kinase).
Estas moléculas podem modificar a sinalização da insulina e resultar no
desenvolvimento da resistência a insulina. (Karalis et al, 2009)
Os resultados do presente estudo demonstraram que o treinamento físico
diminuiu a fosforilação da JNK em ratos obesos. A ativação dos substratos
intermediários da via de sinalização do TNF-�, como a serina quinase JNK, pode
interferir na funcionalidade dos substratos do receptor de insulina, o IRS-1 e IRS-2.
Uma vez fosforilados em serina pela JNK, a possibilidade de serem fosforilados em
tirosina pelo receptor de insulina fica comprometida, o que contribui para a
resistência à transdução do sinal da insulina através dessa via (Pauli et al, 2009)
A concentração do nível de TNF-� no tecido adiposo foi superexpresso em
diferentes modelos animais de obesidade, sendo considerada uma das moléculas
que faz a ligação entre a inflamação e a obesidade (Bastard et al, 2002).
55
Inversamente a redução do peso corporal leva uma diminuição dos níveis de TNF-�.
(Jellema et al, 2004). Desta forma, os níveis de TNF-� diminuem a sensibilidade à
insulina, enquanto que o TNF-� ou ratos sem este receptor (receptor-null mice) tem
uma sensibilidade aumentada em resposta a insulina (Uysal et al, 1998). Assim, é
provável que o aumento nos níveis de TNF-� em modelos animais obesos contribui
para a resistência à insulina. Hotamisligil e colaborares (1993) demonstraram em
modelos animais que o TNF-� está diretamente associado com resistência à
insulina, fator que leva o envolvimento com a fisiopatologia da obesidade induzida
pela resistência à insulina. A tentativa de interpretação e analogia pode ser
reforçada por experimentos com humanos, em que a sessão aguda de exercício
físico se mostrou eficiente na redução da fosforilação da JNK e no bloqueio da via
IKK/NFKB após perfusão de ácidos graxos. O bloqueio da via IKK/NF-kB também foi
observado no músculo de pacientes diabéticos, e esse bloqueio ocorreu pela menor
taxa de degradação do IKB� e do I�B�, impedindo que o fator de transcrição KB
(NF�B) iniciasse a transcrição de proteínas pró-inflamatórias para o mecanismo de
resistência à insulina. Dessa forma, o exercício físico foi responsável pela diminuição
na sinalização desta via inflamatória reduzindo os níveis séricos de TNF-� nesses
pacientes. (Sriwijitkamol et al, 2007). A ativação dos substratos intermediários da via
de sinalização do TNF-�, como a serina quinase JNK, pode interferir na
funcionalidade dos substratos do receptor de insulina, o IRS-1 e IRS-2. Uma vez
fosforilados em serina pela JNK, a possibilidade de serem fosforilados em tirosina
pelo receptor de insulina fica comprometida, o que contribui para a resistência à
transdução do sinal da insulina através dessa via. Essa via pode ser ativada pelo
TNF-�, mas também por outras citocinas pró-inflamatórias como IL-1� (interleucina
1�). A ativação do IKK promove a dissociação do complexo IKB/NFKB, mas também
56
pode induzir a fosforilação em serina dos IRS, que compromete a transdução do
sinal da insulina através dessa cascata. (Shoelson et al, 2003; Milanski et al, 2009)
O exercício físico aumenta a sensibilidade à insulina, além de diminuir a
expressão de TNF-� no músculo esquelético, o que resulta em aumento na
sensibilidade em obesos. Essas observações ressaltam a complexidade das
adaptações celulares e moleculares para o exercício. Entender essas adaptações, é
essencial para estabelecer as recomendações do exercício físico como uma
intervenção terapêutica para a redução da resistência à insulina e do diabetes tipo 2.
(Kirwan & del Aguila, 2003).
Halle e colaboradores (2004) observaram, em um estudo transversal
controlado, com crianças obesas e não obesas aptas fisicamente ou não, que houve
uma associação negativa entre os marcadores inflamatórios IL-6 e TNF-� e aptidão
física. Crianças obesas, não aptas fisicamente, tiveram níveis mais altos de
inflamação sistêmica (IL-6). As crianças aptas, mesmo estando obesas,
manifestaram níveis de inflamação tão baixos quanto as não obesas. Os autores
sugeriram, então, que a citocina TNF-� seria fortemente influenciada por aspectos
da aptidão física, tendo importante papel como reguladora autócrina e parácrina das
funções do adipócito. As altas concentrações de TNF-� e IL-6 também parecem
influenciar a resistência à insulina e as desordens metabólicas. A atividade física
regular é reconhecida como um tratamento não-farmacológico da obesidade e do
diabetes tipo II, com base nos efeitos "antiinflamatórios" do exercício. (Martin-
Cordero et al, 2009)
A ação da insulina também é atenuada por proteínas fosfatases de tirosina,
que catalisam a rápida desfosforilação do receptor de insulina e de seus substratos.
Várias proteínas fosfatases de tirosina foram identificadas dentre essas se destaca a
57
PTP1B. Camundongos knockout para PTP1B têm aumento da fosforilação em
tirosina do receptor de insulina e das proteínas IRS no músculo, conseqüentemente
apresentam aumento da sensibilidade à insulina (Elchebly et al, 1999; Koren &
Fantus , 2007).
A PTP1B atua como um regulador fisiológico negativo de sinalização de
insulina por desfosforilar os resíduos fosfotirosina do receptor de insulina e IRS-1, e
a expressão PTP1B é maior nos tecidos periféricos de humanos obesos e diabéticos
(Nieto-Vazquez et al, 2008). Entretanto, a inibição da função PTP1B pode ser uma
eficaz estratégia para o tratamento de diabetes e obesidade (Elchebly et al. 1999).
Os resultados da presente pesquisa mostraram que o treinamento físico foi eficiente
na redução da PTP1 quando comparados a animais sedentários.
Ropelle e colaboradores (2006) mostraram diminuição da atividade e
expressão de PTP1B em ratos obesos por dieta hiperlipídica após uma única sessão
de exercício. Além disso, a redução da atividade PTP1B em ratos submetidos a
exercício agudo foi acompanhada por um aumento da sensibilidade à insulina em
músculo esquelético, correlacionando-se com aumento da fosforilação do IR, IRS-1
e IRS-2 e com a redução do IR-PTP1B e IRS-1-PTP1B. Os supressores de
sinalização de citocina (SOCS) são uma família de proteínas intracelulares, muitos
dos quais emergiram como principais reguladores fisiológicos das respostas das
citocinas, incluindo aqueles que regulam o sistema imunológico. As proteínas SOCS
parecem regular a transdução de sinal através da combinação de interação direta
inibitória com os receptores de citocinas e proteínas de sinalização com um
mecanismo genérico de alvejar proteínas associadas à degradação. A evidência
está emergindo para o envolvimento de proteínas SOCS nas doenças do sistema
imunológico humano, o que levanta a possibilidade de estratégias terapêuticas que
58
se baseiam na manipulação de atividade SOCS poderia ser de benefício clínico
(Alexander, 2002). Os resultados do presente estudo demonstraram que o exercício
físico aumentou a ativação da via de síntese protéica no miocárdio de ratos obesos
submetidos ao treinamento quando comparados ao grupo de animais obesos
sedentários.
A insulina é um hormônio anabólico que promove a síntese protéica e o
crescimento celular. Estudos têm mostrado que a insulina pode induzir um aumento
na síntese de proteínas, decréscimo na degradação ou combinação de ambos (Biolo
et al, 1995; Rooyakers & Nair 1997). A Hipertrofia de cardiomiócitos difere de acordo
com a tensão exercida sobre o miocárdio. O treinamento físico promove um
aumento na hipertrofia fisiológica do coração, melhorando a função inotrópica. (Kemi
et al, 2008). A insulina tem sido claramente demonstrada na regulação da via
Akt/mTOR em cardiomiócitos. (Rolfe at al, 2005). Uma vez ativada, a mTOR regula
principalmente duas moleculas envolvidas na regulação da tradução de proteínas,
P70S6K e a 4E-BP1. (Proud, 2007). A mTOR ativa a molécula 4E-BP1 e impede a
sua ação inibitória sobre a fator de iniciação eucariótico eIF-4E, permitindo que este
ligar-se ao mRNA, estimulando a síntese de proteínas. A molécula P70S6K fosforila a
proteína ribossomal S6 que está envolvida na regulação da tradução de mRNAs que
codificam vários fatores de tradução de proteínas ribossomais. Portanto, fosforilação
S6 aumenta tanto o conteúdo como fator de tradução e de capacidade de
translação, aumentando biogênese ribossomal. (Proud, 2002; Bertrand et al, 2008).
Os resultados do presente estudo mostraram um aumento nas moléculas da
via de síntese protéica em ratos obesos submetidos ao treinamento físico. Apesar
da complexidade nas vias de sinalização que ativam a hipertrofia cardíaca, são
reconhecidas duas variáveis independentes que provocam distintas manifestações
59
de hipertrofia. A primeira ocorre em resposta a estímulos como a sobrecarga de
pressão e estímulos adrenérgico que ativam a calcineurina, via de sinalização
dependente, resultando na chamada “hipertrofia patológica" que está associada com
fibrose, dilatação da câmara cardíaca e descompensação hemodinâmica (Wilkins et
al, 2004). A segunda é ativada pelo exercício ou insulina/IGF-1 que mediam a
sinalização hipertrofia do coração em condições fisiológicas que ocorrem durante o
desenvolvimento ou através da pratica regular de exercícios físicos. Esta forma de
hipertrofia fisiológica depende da ativação da Akt, molécula que coordena a síntese
de proteínas e os genes que estão envolvidos no aumento do tamanho dos
cardiomiócitos e conseqüentemente da massa cardíaca. O processo de síntese
protéica envolve a ativação dos genes específicos, sua transcrição e tradução. O
treinamento físico, por sua vez, modula esses processos de forma específica ao tipo
de estímulo empregado. (Zoppi, 2005). Uma única sessão de exercício pode
aumentar a síntese de proteína por 48 horas após a sessão; entretanto, a
degradação protéica também está aumentada, mas em menor grau, levando ao
aumento no balanço protéico (Biolo et al, 1997), esse aumento é mediado pela
ativação da via Akt/mTOR/P70S6K. Em adição, resultados com animais experimentais
(Haddad e Adams, 2002) mostraram que contrações isométricas podem ampliar o
efeito sobre a P70S6K. Em 2005, Konhilas e colaboradores mostraram em
camundongos treinados níveis mais elevados das moléculas Akt e P70S6K, quando
comparadas com o grupo de animais controles. O aumento destas moléculas foi
associado com um aumento significativo da massa cardíaca. A sinalização da Akt,
mTOR e Foxo1 está envolvida na hipertrofia e atrofia do músculo esquelético
humano (Léger et al, 2006). Desta forma, a estreita correlação entre a ativação da
60
P70S6K e o aumento da hipertrofia sugere que esta molécula pode ser um bom
marcador para alterações que caracterizam este aumento.
A atrogina é uma proteína atuante no processo de degradação protéica e
sua presença caracteriza quadro de atrofia independente da causa (Lecker et al,
1999; Bodine et al, 2001a). Os resultados do presente estudo mostram que o
exercício físico foi eficiente para diminuir a expressão desta molécula em ratos
obesos. Em situações de atrofia, a regulação da sinalização da Akt permite a
transcrição de atrogina, promovendo a ubiquitinização levando a atrofia muscular
(Sandri et al, 2004; Latres et al, 2005). Recentemente, descobriu que atrogina
bloqueia a hipertrofia patológica in vivo e in vitro através da ligação a calcineurina A
e induzindo a uma degradação. (Li et al, 2004). Em situações de atrofia muscular
ocorre uma redução da atividade Akt, acreditando que esta molécula também esteja
envolvida neste processo. (Burgering & Medema, 2003; Sandri et al. 2004). Léger e
colaboradores (2006) submeteram um grupo de homens a um protocolo de
treinamento de treinamento resistido durantes 8 semanas. Os resultados
demonstraram um aumento significativo na atividade da Akt e mTOR concomitante
com uma redução na via de degradação protéica. No presente estudo o treinamento
aeróbio promoveu as mesmas modificações nessas moléculas, entretanto no
músculo cardíaco. Dados semelhantes ao presente estudo foram publicados
recentemente por Gwag e colaboradores (2009). Os resultados mostraram que o
treinamento aeróbio em ratos aumenta a ativação das moléculas Akt e S6K em
músculo esquelético, associando a uma diminuição na ativação da via proteolítica,
fator que contribui para o aumento da massa muscular.
Nossos resultados demonstram que o treinamento físico reverte a
resistência à insulina no miocárdio de ratos obesos, possivelmente por reduzir a
61
expressão e atividade de fosfatases, serinas quinases e moléculas da via pró
inflamatória. Finalmente, maior sinalização da insulina resultou em maior ativação da
via envolvida com síntese protéica (mTOR/P70s6K), via sabiamente envolvida com
hipertrofia.
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