Pesquisa da DoenPesquisa da Doençça a Residual MResidual Míínima na nima na

Leucemia Leucemia PromielocPromielocííticaticaAgudaAguda

Eduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. RegoEduardo M. Rego

Faculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoFaculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Universidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São PauloUniversidade de São Paulo

Alterações Citogenéticas

um casoum casoum casoum casoSTAT5b/STAT5b/STAT5b/STAT5b/RARaRARaRARaRARaduplicaduplicaduplicaduplicaçççção intersticial ão intersticial ão intersticial ão intersticial da 17q21da 17q21da 17q21da 17q21----q23 q23 q23 q23

um casoum casoum casoum casoFIP1L1/FIP1L1/FIP1L1/FIP1L1/RARaRARaRARaRARat(4;17)(q12;q21)t(4;17)(q12;q21)t(4;17)(q12;q21)t(4;17)(q12;q21)

Um casoUm casoUm casoUm casoPRKAR1A/PRKAR1A/PRKAR1A/PRKAR1A/RARaRARaRARaRARa17 (17q24 )17 (17q24 )17 (17q24 )17 (17q24 )

< 1%< 1%< 1%< 1%NPM/NPM/NPM/NPM/RARaRARaRARaRARat(5;17)(q35;q21)t(5;17)(q35;q21)t(5;17)(q35;q21)t(5;17)(q35;q21)

< 1%< 1%< 1%< 1%NuMANuMANuMANuMA////RARaRARaRARaRARat(11;17)(q13;q21)t(11;17)(q13;q21)t(11;17)(q13;q21)t(11;17)(q13;q21)

~ 1%~ 1%~ 1%~ 1%PLZF/PLZF/PLZF/PLZF/RARaRARaRARaRARat(11;17)(q23;q21)t(11;17)(q23;q21)t(11;17)(q23;q21)t(11;17)(q23;q21)

> 98%> 98%> 98%> 98%PML/PML/PML/PML/RARaRARaRARaRARat(15;17)(q22;q21)t(15;17)(q22;q21)t(15;17)(q22;q21)t(15;17)(q22;q21)

FrequênciaFrequênciaFrequênciaFrequência EstimadaEstimadaEstimadaEstimadaGene HGene HGene HGene HííííbridobridobridobridoAlteraAlteraAlteraAlteraççççãoãoãoão

Pontos de Quebra

PMLExon 3

PMLExon 4

PMLExon 5

PMLExon 6

RARaExon 3

1264 1335 1479 1737 435

Bcr2 ~ 5%Bcr2 ~ 5%Bcr2 ~ 5%Bcr2 ~ 5%

1642

PMLExon 3

PMLExon 4

PMLExon 5

PMLExon 6

RARaExon 3

1264 1335 1479 1737 435

Bcr1 ~ 55%Bcr1 ~ 55%Bcr1 ~ 55%Bcr1 ~ 55%

4851690

PMLExon 3

PMLExon 4

PMLExon 5

PMLExon 6

RARaExon 3

1264 1335 1479 1737 435

Bcr3 ~ 40%Bcr3 ~ 40%Bcr3 ~ 40%Bcr3 ~ 40%

4851198

Frequência dos subtipos de bcrde acordo com a população

Ribeiro & Ribeiro & Ribeiro & Ribeiro & Rego, 2006Rego, 2006Rego, 2006Rego, 2006

DoeurDoeurDoeurDoeur etetetet al., al., al., al., 2003200320032003

40%40%40%40%8%8%8%8%52%52%52%52%Não Não Não Não ““““LatinosLatinosLatinosLatinos””””

(n=1429)(n=1429)(n=1429)(n=1429)

37.5%37.5%37.5%37.5%9.7%9.7%9.7%9.7%52.7%52.7%52.7%52.7%BrasileirosBrasileirosBrasileirosBrasileiros

(n=72)(n=72)(n=72)(n=72)

15%15%15%15%10%10%10%10%75%75%75%75%““““LatinosLatinosLatinosLatinos””””

(n=52)(n=52)(n=52)(n=52)

Bcr3Bcr3Bcr3Bcr3Bcr2Bcr2Bcr2Bcr2Bcr1Bcr1Bcr1Bcr1

Correlações Clínicas

� Subtipo bcr3Subtipo bcr3Subtipo bcr3Subtipo bcr3� Mais Mais Mais Mais frequentefrequentefrequentefrequente na variante na variante na variante na variante hipogranularhipogranularhipogranularhipogranular

� Sem caracterSem caracterSem caracterSem caracteríííísticas sticas sticas sticas imunofenotimunofenotimunofenotimunofenotíííípicaspicaspicaspicasparticularesparticularesparticularesparticulares

� Contagens de leucContagens de leucContagens de leucContagens de leucóóóócitos mais elevadascitos mais elevadascitos mais elevadascitos mais elevadas

� Pior prognPior prognPior prognPior prognóóóósticosticosticostico

� Maior Maior Maior Maior frequênciafrequênciafrequênciafrequência de sde sde sde sííííndrome ndrome ndrome ndrome retinretinretinretinóóóóideideideide

Doença Residual Mínima

� ““““MarcadoresMarcadoresMarcadoresMarcadores””””� EspecificidadeEspecificidadeEspecificidadeEspecificidade� SensibilidadeSensibilidadeSensibilidadeSensibilidade� Mais de fenMais de fenMais de fenMais de fenóóóótipo ou gentipo ou gentipo ou gentipo ou genóóóótipo tipo tipo tipo � MudanMudanMudanMudançççças ao longo do monitoramentoas ao longo do monitoramentoas ao longo do monitoramentoas ao longo do monitoramento

� ““““Protocolo de TratamentoProtocolo de TratamentoProtocolo de TratamentoProtocolo de Tratamento””””� Que combinaQue combinaQue combinaQue combinaçççção de tratamento ?ão de tratamento ?ão de tratamento ?ão de tratamento ?� Em que pontos serão colhidas as amostras ?Em que pontos serão colhidas as amostras ?Em que pontos serão colhidas as amostras ?Em que pontos serão colhidas as amostras ?� Sangue ou medula Sangue ou medula Sangue ou medula Sangue ou medula óóóóssea ?ssea ?ssea ?ssea ?� Qual o valor limQual o valor limQual o valor limQual o valor limíííítrofe (trofe (trofe (trofe (cutcutcutcut----offoffoffoff) ? valor progn) ? valor progn) ? valor progn) ? valor prognóóóósticosticosticostico

Tratamento

n.r.87/79 2anos952-74240AIDA

1757/547861-8432 (>60a)

687/819216-59101 (<60a)AMLCG 2003

6,4 (baixo risco)n.r.902-81426PETHEMA 2003

2072870-70+120 (ATRA+QT até CR)

3651700-70+119 (5d ATRA-QT)

MRC 1999

3968/60911-73214 (GB>5000)

963/608765-7755 (GB<5000)

1586/80967-63185 (ATRA+QT)

2377/74932-64122 (ATRA-QT)APL 93

Recaída em 4 anos (%)

OS/EFS 4 anos (%)

CR pós-indução

IdadeNEstudo

Terapia Padrão

INDUÇÃO

ATRA + Antracíclico

CONSOLIDAÇÃO

ATRA + Antracíclico

Adição de Citarabina ?

Papel do As 2O3 ?

MANUTENÇÃO

Ciclos alternados ATRA

MTX + 6MP

Fatores de mau prognóstico

� Sanz Sanz Sanz Sanz etetetet al (PETHEMA+GIMEMA) al (PETHEMA+GIMEMA) al (PETHEMA+GIMEMA) al (PETHEMA+GIMEMA) BloodBloodBloodBlood 2004; 2004; 2004; 2004; 103:1237103:1237103:1237103:1237----43434343� Baixo risco: GB<10.000/Baixo risco: GB<10.000/Baixo risco: GB<10.000/Baixo risco: GB<10.000/µµµµllll e e e e PltPltPltPlt>40.000/>40.000/>40.000/>40.000/µµµµllll� Alto risco: GBAlto risco: GBAlto risco: GBAlto risco: GB≥≥≥≥10.000/10.000/10.000/10.000/µµµµllll� Risco intermediRisco intermediRisco intermediRisco intermediáááário:rio:rio:rio:GB<10.000/GB<10.000/GB<10.000/GB<10.000/µµµµllll e e e e PltPltPltPlt<40.000/<40.000/<40.000/<40.000/µµµµllll

Risco de recaída

IC-APL

(Bcr3) – Primers BIOMED-1 PMLC2 – RARADTratado com Protocolo IC-APL1 - Positivo ao diagnóstico (05/06/2008);2- Positivo no final de indução (03/07/2008), mas em remissão hematológica com contagens normais no SP e sem alterações na avaliação da coagulação

Caso 1. Paciente FAS – RT PCR

M 100 pb

289pb

1 2

* *C+ PMLC2-RARaD

Qual a melhor conduta ?

� Prolongar o tratamento com ATRA mais 15 Prolongar o tratamento com ATRA mais 15 Prolongar o tratamento com ATRA mais 15 Prolongar o tratamento com ATRA mais 15 dias e repetir o examedias e repetir o examedias e repetir o examedias e repetir o exame

� Interromper o tratamento com ATRA e Interromper o tratamento com ATRA e Interromper o tratamento com ATRA e Interromper o tratamento com ATRA e apapapapóóóós 15 dias repetir o exames 15 dias repetir o exames 15 dias repetir o exames 15 dias repetir o exame

� Intensificar o tratamento (p.ex. HDAC)Intensificar o tratamento (p.ex. HDAC)Intensificar o tratamento (p.ex. HDAC)Intensificar o tratamento (p.ex. HDAC)

� Introduzir o Introduzir o Introduzir o Introduzir o TriTriTriTrióóóóxidoxidoxidoxido de Arsênicode Arsênicode Arsênicode Arsênico

� Ignorar o exame Ignorar o exame Ignorar o exame Ignorar o exame � Viu? Quem mandou colher o exame...Viu? Quem mandou colher o exame...Viu? Quem mandou colher o exame...Viu? Quem mandou colher o exame...

Estudo GIMEMA e AIEOP

� DiverioDiverioDiverioDiverio D D D D etetetet al.,al.,al.,al., Blood, Vol 92, No 3 (August 1), 1998: pp 784-789

� Análise prospectiva de 163 pacientes com LPA� RT-PCR� Sensibilidade 103 – 104

� Amostras de M.O. colhidas ao diagnóstico, após indução, após consolidação, a cada 3 m nos dois primeiros anos e a seguir a cada 6m

� Resultados� 60% dos pacientes tornaram-se RT-PCR negativos ao final da

indução� 96% dos pacientes tornaram-se RT-PCR negativos ao final da

consolidação� Não houve resistência primária

Estudo GIMEMA e AIEOP

� Dos 21 pacientes RTDos 21 pacientes RTDos 21 pacientes RTDos 21 pacientes RT----PCR + apPCR + apPCR + apPCR + apóóóós a s a s a s a consolidaconsolidaconsolidaconsolidaçççção 20 recaão 20 recaão 20 recaão 20 recaííííram (mram (mram (mram (méééédia 3m)dia 3m)dia 3m)dia 3m)

(Bcr3) – Primers BIOMED-1 PMLC2 – RARADTratado com Protocolo IC-APL1 - Positivo ao diagnóstico (05/06/2008);2- Positivo no final de indução (03/07/2008)3-Negativo no final da consolidação (07/08/2008)4-Negativo novembro de 2008 e fevereiro de 2009

Caso 1. Paciente FAS – RT PCR

M 100 pb

289pb

1 2

* *C+C+*

3

Conclusões

� O resultado positivo no final da induO resultado positivo no final da induO resultado positivo no final da induO resultado positivo no final da induçççção ão ão ão não tem significado prognnão tem significado prognnão tem significado prognnão tem significado prognóóóósticosticosticostico

� Ao contrAo contrAo contrAo contráááário do final da consolidario do final da consolidario do final da consolidario do final da consolidaçççção. ão. ão. ão. CutCutCutCut----offoffoffoff: positivo : positivo : positivo : positivo

� Os estudos na literatura avaliaram Os estudos na literatura avaliaram Os estudos na literatura avaliaram Os estudos na literatura avaliaram M.O.M.O.M.O.M.O.� A sensibilidade do teste deve ser aferida A sensibilidade do teste deve ser aferida A sensibilidade do teste deve ser aferida A sensibilidade do teste deve ser aferida (10(10(10(10----4444))))

� Controles sempre devem ser incluControles sempre devem ser incluControles sempre devem ser incluControles sempre devem ser incluíííídosdosdosdos� Falsos positivos não são incomunsFalsos positivos não são incomunsFalsos positivos não são incomunsFalsos positivos não são incomuns

Conclusões

� DefiniDefiniDefiniDefiniçççção de 3 termosão de 3 termosão de 3 termosão de 3 termos� Remissão MolecularRemissão MolecularRemissão MolecularRemissão Molecular

� Persistência MolecularPersistência MolecularPersistência MolecularPersistência Molecular

� RecaRecaRecaRecaíííída Molecularda Molecularda Molecularda Molecular

Exigem a repetição do exame em segunda amostracolhida após 15 dias

Real-Time PCR

� Exame mais sensExame mais sensExame mais sensExame mais sensíííívelvelvelvel

� Avalia a fase inicial da amplificaAvalia a fase inicial da amplificaAvalia a fase inicial da amplificaAvalia a fase inicial da amplificaççççãoãoãoão

� Melhor avaliaMelhor avaliaMelhor avaliaMelhor avaliaçççção dos genes controle ão dos genes controle ão dos genes controle ão dos genes controle ((((housekeepinghousekeepinghousekeepinghousekeeping))))

� Permite o estudo da cinPermite o estudo da cinPermite o estudo da cinPermite o estudo da cinééééticaticaticatica

Quociente de Normalização

� SantamarSantamarSantamarSantamaríííía C. a C. a C. a C. etetetet al.,al.,al.,al., HaematologicaHaematologicaHaematologicaHaematologica 2007 vol. 92, 2007 vol. 92, 2007 vol. 92, 2007 vol. 92, pppppppp: 315: 315: 315: 315----322322322322

� GabertGabertGabertGabert J. J. J. J. etetetet al., al., al., al., LeukemiaLeukemiaLeukemiaLeukemia 2003 vol. 17, 2003 vol. 17, 2003 vol. 17, 2003 vol. 17, pppppppp: 2157: 2157: 2157: 2157----2318231823182318

� CassinatCassinatCassinatCassinat etetetet al. al. al. al. LeukemiaLeukemiaLeukemiaLeukemia ResResResRes 2009200920092009

� GallagherGallagherGallagherGallagher RE RE RE RE etetetet al., al., al., al., BloodBloodBloodBlood 2003 vol. 101, 2003 vol. 101, 2003 vol. 101, 2003 vol. 101, pppppppp: 2521: 2521: 2521: 2521----2528252825282528

� DiluiDiluiDiluiDiluiçççções seriadas de ões seriadas de ões seriadas de ões seriadas de plasmplasmplasmplasmíííídeosdeosdeosdeos contendo PML/contendo PML/contendo PML/contendo PML/RARaRARaRARaRARa(bcr1, bcr3)(bcr1, bcr3)(bcr1, bcr3)(bcr1, bcr3)

� DiluiDiluiDiluiDiluiçççções seriadas de ões seriadas de ões seriadas de ões seriadas de plasmplasmplasmplasmíííídeosdeosdeosdeos contendo o gene contendo o gene contendo o gene contendo o gene endendendendóóóógeno (geno (geno (geno (AblAblAblAbl----1, GUS, B2M, GAPDH)1, GUS, B2M, GAPDH)1, GUS, B2M, GAPDH)1, GUS, B2M, GAPDH)

� NQ: 1 cNQ: 1 cNQ: 1 cNQ: 1 cóóóópia PML/pia PML/pia PML/pia PML/RARaRARaRARaRARa / 1 c/ 1 c/ 1 c/ 1 cóóóópia Abl1 ou GUS, mas pia Abl1 ou GUS, mas pia Abl1 ou GUS, mas pia Abl1 ou GUS, mas para 100 cpara 100 cpara 100 cpara 100 cóóóópias do B2Mpias do B2Mpias do B2Mpias do B2M

Real-Time PCR para PML/RARa

Proporção de falsos positivos: ~10%Proporção de falsos negativos: 0%

Gabert J. et al., Leukemia2003 vol. 17, pp: 2157-2318

Diferentes Controles e Tecidos

Ao Diagnóstico

Gabert J. et al., Leukemia2003 vol. 17, pp: 2157-2318

PETHEMA

� NQ: PML/NQ: PML/NQ: PML/NQ: PML/RARaRARaRARaRARa/ABL x 10/ABL x 10/ABL x 10/ABL x 104444

� 1064 amostras de 1064 amostras de 1064 amostras de 1064 amostras de M.O.M.O.M.O.M.O. e 145 de e 145 de e 145 de e 145 de S.P.S.P.S.P.S.P.

� Durante manutenDurante manutenDurante manutenDurante manutençççção e apão e apão e apão e apóóóós o final do tratamentos o final do tratamentos o final do tratamentos o final do tratamento

� NCN mNCN mNCN mNCN méééédia ao dia ao dia ao dia ao diagndiagndiagndiagnóóóóstico ~stico ~stico ~stico ~ 3000 c3000 c3000 c3000 cóóóópiaspiaspiaspias

� ComparaComparaComparaComparaçççção RQ ão RQ ão RQ ão RQ vsvsvsvs RTRTRTRT----PCRPCRPCRPCR

Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp: 315-322

Indução

Nem a carga tumoral ao diagnóstico nem a cinética de redução pós indução correlacionaram-se a SLD.

Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp: 315-322

Manutenção

� 19/19 pacientes com NCN > 10 reca19/19 pacientes com NCN > 10 reca19/19 pacientes com NCN > 10 reca19/19 pacientes com NCN > 10 recaííííram ram ram ram todos RTtodos RTtodos RTtodos RT----PCR positivosPCR positivosPCR positivosPCR positivos

� 6/18 pacientes com NCN 16/18 pacientes com NCN 16/18 pacientes com NCN 16/18 pacientes com NCN 1----10 reca10 reca10 reca10 recaííííram, 8 ram, 8 ram, 8 ram, 8 eram RT positivos, com 3 falsos positivos e eram RT positivos, com 3 falsos positivos e eram RT positivos, com 3 falsos positivos e eram RT positivos, com 3 falsos positivos e 1 falso negativo)1 falso negativo)1 falso negativo)1 falso negativo)

� 0/101 pacientes com NCN < 1 reca0/101 pacientes com NCN < 1 reca0/101 pacientes com NCN < 1 reca0/101 pacientes com NCN < 1 recaííííram, 2 ram, 2 ram, 2 ram, 2 eram RT positivos (falsos positivos)eram RT positivos (falsos positivos)eram RT positivos (falsos positivos)eram RT positivos (falsos positivos)

Estratificação de Risco Segundo o NCN

Após o Tratamento Na Manutenção

Santamaría C. et al., Haematologica 2007 vol. 92, pp: 315-322

Sangue ou Medula?

� CassinatCassinatCassinatCassinat etetetet al.al.al.al.� Outro Outro Outro Outro housekeepinghousekeepinghousekeepinghousekeeping (PBGD) (PBGD) (PBGD) (PBGD) –––– gerou 3 faixas de gerou 3 faixas de gerou 3 faixas de gerou 3 faixas de NCN <10, 10NCN <10, 10NCN <10, 10NCN <10, 10----100 e > 100100 e > 100100 e > 100100 e > 100

� Baseado em anBaseado em anBaseado em anBaseado em anáááálise em duplicadas/triplicataslise em duplicadas/triplicataslise em duplicadas/triplicataslise em duplicadas/triplicatas� Maior nMaior nMaior nMaior núúúúmero de amostras de sangue foram mero de amostras de sangue foram mero de amostras de sangue foram mero de amostras de sangue foram estudadasestudadasestudadasestudadas

� Para amostras com NCN>10, 7Para amostras com NCN>10, 7Para amostras com NCN>10, 7Para amostras com NCN>10, 7----SP e 17SP e 17SP e 17SP e 17----MOMOMOMO� 4 amostras pareadas: 2 falsos negativos no SP4 amostras pareadas: 2 falsos negativos no SP4 amostras pareadas: 2 falsos negativos no SP4 amostras pareadas: 2 falsos negativos no SP� No estudo do PETHEMA em 7 pacientes que No estudo do PETHEMA em 7 pacientes que No estudo do PETHEMA em 7 pacientes que No estudo do PETHEMA em 7 pacientes que recairamrecairamrecairamrecairam houve uma diferenhouve uma diferenhouve uma diferenhouve uma diferençççça de 24 a 35 dias a de 24 a 35 dias a de 24 a 35 dias a de 24 a 35 dias entre a conversão na MO e no SPentre a conversão na MO e no SPentre a conversão na MO e no SPentre a conversão na MO e no SP

Caso 1

1

10

100

1000

10000

Diag Indução Consol Manut 1

NC

N P

ML/R

AR

a/ A

BL

Br Br

Br

Br Br** Br *Br C+ C+ C+ C+*

PMLC2-RARD

289pb

M10

0pb

M10

0pb

PML-PMLRARa-RARa PML/RARa

1 2a 2b 2c

Br Br Br BrX * * * C+C+C+ X Y Z

3 4 5

PMLC2-RARE3’PMLC2-RARD PMLC2-RARD

289pb 289pb

545pb

246pb576pb720pb

253pb 355pb

Diagnóstico Consolidação

Manutenção 4

3 meses após resgate com arsênico ~6 meses após resgate com Mylotarg

Caso 2. CP

1

10

100

1000

10000

Dia

gIn

duçã

o

Cons

olMan

ut 1

Man

ut 2

Man

ut 3

Man

ut 4

Extra 5

Extra 6

NC

N P

ML/R

AR

a/ A

BL

Conclusões

� A pesquisa da DRM deve ser feita apA pesquisa da DRM deve ser feita apA pesquisa da DRM deve ser feita apA pesquisa da DRM deve ser feita apóóóós s s s consolidaconsolidaconsolidaconsolidaçççção ão ão ão

� A tA tA tA téééécnica de RQcnica de RQcnica de RQcnica de RQ----PCR possui menor PCR possui menor PCR possui menor PCR possui menor variabilidade e maior sensibilidade, mas variabilidade e maior sensibilidade, mas variabilidade e maior sensibilidade, mas variabilidade e maior sensibilidade, mas exige a normalizaexige a normalizaexige a normalizaexige a normalizaççççãoãoãoão

� As evidências sugerem que o estudo da As evidências sugerem que o estudo da As evidências sugerem que o estudo da As evidências sugerem que o estudo da M.O.M.O.M.O.M.O. éééé superiorsuperiorsuperiorsuperior

� ÉÉÉÉ possivelpossivelpossivelpossivel distinguir 3 grupos de pacientes distinguir 3 grupos de pacientes distinguir 3 grupos de pacientes distinguir 3 grupos de pacientes com progncom progncom progncom prognóóóósticos distintos com base no sticos distintos com base no sticos distintos com base no sticos distintos com base no NCNNCNNCNNCN

Obrigado.